本發(fā)明涉及利用微生物生產阿洛酮糖的方法。

背景技術：

阿洛酮糖(d-psicose)為果糖(d-fructose)的3號碳的差向異構體(epimer)，雖然像普通糖類一樣具有甜味，但由于無法在人體內代謝，因而屬于因卡路里幾乎為零而對糖尿病及肥胖患者而言可作為代替白糖的功能性甜味劑來使用的功能性糖。并且，具有通過抑制在肝臟參與脂質合成的酶的活性來減少腹部肥胖的功能，是當前作為糖尿病和動脈硬化治療劑來進行研究的糖。

像這樣，隨著阿洛酮糖作為甜味劑備受矚目，在食品產業(yè)領域，研發(fā)可有效生產阿洛酮糖的方法的必要性逐漸增加。由于在天然物質內的糖蜜處理過程或葡萄糖異構化反應過程中存在非常少量的阿洛酮糖，因而以往的阿洛酮糖生產主要通過化學過程來實現(xiàn)。比利克(bilik)等人曾研發(fā)利用鉬酸(molybdicacid)離子的催化作用來由果糖生產阿洛酮糖的技術。麥克唐納(mcdonald)通過對1,2:4,5-二-o-丙酮縮甘油-β-d-果糖(1,2:4,5-di-o-isopropylidene-bata-d-fructopyranose)進行三步驟化學處理過程來生產了阿洛酮糖。并且，多納(doner)通過對乙醇、三乙胺及果糖一同進行加熱的方法生產了阿洛酮糖。但是，這些通過化學方法生產阿洛酮糖的方法花費很多費用，相反，存在生產效率低、產生大量副產物的問題。

作為基于生物學方法實現(xiàn)的阿洛酮糖生產方法，肯·伊茲莫里(kenizumori)等人證實了可利用微生物細胞反應來從半乳糖醇(galacitol)、d-塔格糖(d-tagatose)或d-塔羅糖醇(d-talitol)等生產阿洛酮糖。但是，這些基質屬于自然界中非常稀缺的糖或糖醇，具有成本高的缺點。

酶轉換方法有在重組大腸桿菌生產并提煉分離微生物菊苣假單胞菌st-24(pseudomonascichoriist-24)的d-塔格糖-3-差向異構酶(d-tagatose-3-epimerase)來使果糖酶轉換成阿洛酮糖的方法，伊茲莫里等人曾利用固定d-塔格糖-3-差向異構酶的反應系統(tǒng)來以約25％的轉換率生產了阿洛酮糖。

根據(jù)這種現(xiàn)有技術，為了由果糖生產阿洛酮糖，以往以通過提煉酶、固定所提煉的酶來提高阿洛酮糖生產性的方向進行了研究。但這種酶提煉過程實際需要很多時間和費用。

因此，需要一種可通過省略酶提煉步驟來使制造成本變低并以高效率生產阿洛酮糖的菌株及利用其來生產阿洛酮糖的方法。

在韓國公開專利第2006-125971號公開了基于阿洛酮糖差向異構化酶的阿洛酮糖的生產方法。

現(xiàn)有技術文獻

專利文獻

韓國公開專利第2006-125971號

非專利文獻

choijg,juyh,yeomsjandohdk(2011),improvementinthethermostabilityofd-psicose3-epimerasefromagrobacteriumtumefaciensbyrandomandsite-directedmutagenesis,applenvironmicrobiol77(20):7316-20

技術實現(xiàn)要素：

要解決的問題

本發(fā)明的目的在于提供可明顯改善阿洛酮糖的生產量及生產速度的阿洛酮糖的生產方法。

解決問題的方案

根據(jù)本發(fā)明的一實施方式，所提供的阿洛酮糖的生產方法包括在微生物內使作為基質的果糖和其差向異構酶在40℃以上的反應溫度下發(fā)生反應的步驟。

本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，若在40℃以上的溫度下使作為基質的果糖和其差向異構酶進行反應，則可明顯增加阿洛酮糖的生產量及生產速度，隨著溫度的增加，阿洛酮糖的生產量及生產速度也隨之增加，由此研究出本發(fā)明。

另一方面，差向異構酶等的酶通常在40℃以上的高溫下產生熱變性，由此失去活性，但本發(fā)明在微生物內執(zhí)行上述反應，因而與以酶的狀態(tài)露出于外部的情況相比，在外部環(huán)境下受到保護，因此能夠以即使在高溫下也不會產生變性的方式執(zhí)行上述反應。

由于阿洛酮糖的生產能力隨著反應溫度的增加而增加，因此，只要在40℃以上且在不使微生物因熱量而受損或不使蛋白質或糖變性的范圍內，則反應溫度不受特殊限制。例如，反應溫度可在40℃至50℃、40℃至60℃、40℃至70℃、40℃至80℃、40℃至90℃、45℃至60℃、45℃至70℃、45℃至80℃、45℃至90℃、50℃至70℃、50℃至80℃、50℃至90℃、55℃至60℃、55℃至70℃、55℃至80℃、55℃至90℃、60℃至70℃、60℃至80℃、60℃至90℃、70℃至80℃、70℃至90℃等。優(yōu)選地，從使上述阿洛酮糖的生產能力極大化的方面出發(fā)，反應溫度的下限可以是50℃以上，從抑制熱損傷及變性的方面出發(fā)，反應溫度的上限可以是90℃以下。

本說明書中的術語“微生物”可以是可在液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)的細胞。

上述微生物可內在性表達上述差向異構酶或借助形質轉換來表達上述差向異構酶。在此情況下，可通過在微生物內生成差向異構酶來借助上述果糖與差向異構酶的微生物內反應連續(xù)執(zhí)行阿洛酮糖的生產。

在上述微生物被形質轉換成編碼有差向異構酶的基因來表達差向異構酶的情況下，編碼上述差向異構酶的基因可以是編碼源于序列1的根癌土壤桿菌(agrobacteriumtumefaciens)的阿洛酮糖-3-差向異構酶的基因或編碼源于序列2的糞厭氧棒狀菌(anaerostipescaccae)的阿洛酮糖-3-差向異構酶的基因。

源于根癌土壤桿菌的阿洛酮糖-3-差向異構酶可具有序列3的氨基酸序列，源于糞厭氧棒狀菌的阿洛酮糖-3-差向異構酶可具有序列4的氨基酸序列。

優(yōu)選地，從差向異構酶具有更優(yōu)秀的高溫穩(wěn)定性方面出發(fā)，編碼差向異構酶的基因可以是編碼序列5的阿洛酮糖-3-差向異構酶的氨基酸序列的基因。

上述序列5的氨基酸序列為源于根癌土壤桿菌的阿洛酮糖-3-差向異構酶的氨基酸序列中的第33個氨基酸被亮氨酸取代或第213個氨基酸被半胱氨酸取代的序列，在參考文獻1中指出，熱穩(wěn)定性優(yōu)秀。

本發(fā)明的發(fā)明人確認了源于梭菌屬的阿洛酮糖-3-差向異構酶具有優(yōu)秀的熱穩(wěn)定性，參照圖7，在熱穩(wěn)定性高的源于梭菌屬的阿洛酮糖-3-差向異構酶中，一個氨基酸具有與之相對應的序列，或具有所有如上所述的兩個序列。

因此，不僅是源于根癌土壤桿菌的阿洛酮糖-3-差向異構酶，源于其他菌株的阿洛酮糖-3-差向異構酶也被確認到與源于上述根癌土壤桿菌的阿洛酮糖-3-差向異構酶的氨基酸序列的第33個氨基酸、第213個氨基酸相對應的氨基酸序列為對提高熱穩(wěn)定性非常重要的序列。

這種氨基酸序列的具體例可有在序列6的氨基酸序列中第32個氨基酸被亮氨酸取代或第196個氨基酸被半胱氨酸取代的序列。序列6為對圖7中的用方框所標注的序列進行排列的序列，是在本發(fā)明中所使用的根癌土壤桿菌、糞厭氧棒狀菌、鮑氏梭菌、源于海氏梭菌(clostridiumhylemonae)的阿洛酮糖-3-差向異構酶氨基酸序列(序列3、序列4、序列9、序列10)的共同堿基序列。因此，上述微生物可以是被編碼上述氨基酸序列的基因取代的，但是并不限定于此。

并且，同樣，從優(yōu)秀的高溫穩(wěn)定性、阿洛酮糖的生產能力方面出發(fā)，差向異構酶可以是源于梭菌屬的阿洛酮糖-3-差向異構酶，編碼其的基因可以是編碼源于序列7的鮑氏梭菌(clostridiumbolteae)的阿洛酮糖-3-差向異構酶的基因，或可以是編碼源于序列8的海氏梭菌(clostridiumhylemonae)的阿洛酮糖-3-差向異構酶的基因。優(yōu)選地，從使高溫穩(wěn)定性極大化的方面出發(fā)，可以是編碼源于序列8的海氏梭菌的阿洛酮糖-3-差向異構酶的基因。

源于鮑氏梭菌的阿洛酮糖-3-差向異構酶可具有序列9的氨基酸序列，源于海氏梭菌的阿洛酮糖-3-差向異構酶可具有序列10的氨基酸序列。

在所例示的上述阿洛酮糖-3-差向異構酶中，源于糞厭氧棒狀菌的阿洛酮糖-3-差向異構酶、具有在序列6的氨基酸序列中的第32個氨基酸被亮氨酸取代或第196個氨基酸被半胱氨酸取代的序列的阿洛酮糖-3-差向異構酶、源于鮑氏梭菌的阿洛酮糖-3-差向異構酶及源于海氏梭菌的阿洛酮糖-3-差向異構酶等的表示最佳活性的ph為7以下，是較低的。

上述微生物為原核細胞或真核細胞，可在液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，并可在上述的高溫溫度下進行培養(yǎng)。例如，上述微生物可以是細菌、霉或它們的組合。細菌可以是革蘭氏陽性細菌、革蘭氏陰性細菌或它們的組合，優(yōu)選地，從提高阿洛酮糖生產率方面出發(fā)，可以是革蘭氏陽性細菌。革蘭氏陰性細菌可以是埃希氏菌屬(escherichia)。革蘭氏陽性細菌可以是芽孢桿菌屬、棒狀桿菌屬、放線菌屬、乳酸菌或它們的組合。霉可以是酵母、克魯維酵母屬或它們的組合。

在本發(fā)明的阿洛酮糖的生產方法中，果糖和差向異構酶的反應可在40℃以上的溫度執(zhí)行，優(yōu)選地，微生物可以是熱穩(wěn)定性高的高溫型微生物(thermophiles)。例如，可以是棒狀桿菌屬、放線菌屬，更優(yōu)選為谷氨酸棒狀桿菌，最優(yōu)選為向谷氨酸棒狀桿菌atcc13032導入編碼上述差向異構酶的基因的微生物。

埃希氏菌屬微生物可以是大腸桿菌，具體地，可以是向dh5α、mg1655、bl21(de)、s17-1、xl1-blue、bw25113或它們的組合導入編碼差向異構酶的基因的微生物。

并且，上述大腸桿菌可以是編碼內在性6-磷酸果糖激酶的基因及由阿洛糖代謝操縱子(allosemetabolicoperon)構成的一個區(qū)域形成非活性化的菌。

編碼上述6-磷酸果糖激酶的基因可有具有序列11的核苷酸序列的，6-磷酸果糖激酶可以是具有序列12的氨基酸序列的。

構成上述阿洛糖代謝操縱子的基因為rpib、alsr、alsb、alsa、alsc、alse及alsk，可以是其中的一個以上的基因形成非活性化的。

上述rpib、alsr、alsb、alsa、alsc、alse及alsk基因可有分別具有序列13、序列14、序列15、序列16、序列17、序列18及序列19的核苷酸序列的。

上述rpib、alsr、alsb、alsa、alsc、alse及alsk基因可以是分別編碼序列20、序列21、序列22、序列23、序列24、序列25及序列26的氨基酸序列的。

術語“非活性化”意味著上述基因的表達減少或未形成表達的情況。上述“非活性化”可通過本領域公知的方法實現(xiàn)。例如，可通過同源重組(homologuousrecombination)來形成非活性化。上述同源重組的例有轉位子突變(transposonmutagenesis)或p1轉導。

棒狀桿菌屬微生物可以是谷氨酸棒狀桿菌，具體地，可以是向谷氨酸棒狀桿菌atcc13032導入編碼差向異構酶的基因的。

棒狀桿菌屬微生物可以是將內在性d-果糖轉換成d–果糖1-磷酸鹽并使作為向菌體內進行輸送的pts輸送系統(tǒng)的ptsf(eii^fru、frua、ncgl1861、gi:19553141、ec2.7.1.69)基因缺損或形成非活性化的。

ptsf基因可以是具有序列27的核苷酸序列的，也可以是編碼序列28的氨基酸序列的。

由于阿洛酮糖由d-果糖生成，因而若使上述基因缺損或形成非活性化，則可抑制果糖的磷酸化，從而可明顯改善阿洛酮糖的生成效率。

并且，棒狀桿菌屬微生物可以是使編碼甘露醇2-脫氫酶(mannitol2-dehydrogenase)的mtld(ncgl0108、gi:19551360、ec1.1.1.67)基因缺損或形成非活性化的。

mtld基因可以是具有序列29的核苷酸序列的，也可以是編碼序列30的氨基酸序列的。

上述果糖和其差向異構酶的反應在微生物內執(zhí)行，因而可在包含果糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物。

上述培養(yǎng)基可以是2yt培養(yǎng)基、lb培養(yǎng)基、tb培養(yǎng)基等的包含酵母提取物和氮源的營養(yǎng)培養(yǎng)基。

培養(yǎng)基所包含的果糖的濃度不受特別限制，例如，可形成1％(w/v)至80％(w/v)的濃度，在以上范圍中，例如可形成1％(w/v)至35％(w/v)、10％(w/v)至80％(w/v)、20％(w/v)至80％(w/v)、30％(w/v)至80％(w/v)、40％(w/v)至80％(w/v)等的范圍。優(yōu)選為1％(w/v)至50％(w/v)。

并且，培養(yǎng)基可以是包含碳源、氮源、必要金屬離子、維生素等的在本領域通常使用的規(guī)定(defined)培養(yǎng)基，碳源包括葡萄糖、甘油等，氮源包括氨、尿素(urea)等，必要金屬離子包括鈉、鉀、鈣、鎂、錳、鈷等。

上述培養(yǎng)可以是連續(xù)、半連續(xù)或批量(batch)形式的培養(yǎng)。

上述微生物可在包含果糖的培養(yǎng)基中以使菌體的濁度(在600nm吸光度下測定的測定值，以下稱為od600)達到0.01至300的濃度接種，例如，菌體的濁度可達到1至300、10至300、20至300、5至300或者40至300。通過使用包含高濃度酶的菌體，可在包含高濃度果糖的培養(yǎng)基中使果糖有效地轉換成阿洛酮糖。

上述培養(yǎng)可通過還添加用于誘導編碼差向異構酶的基因的表達的物質來執(zhí)行。

用于誘導基因的表達的物質并不受特殊限制，可以是在本領域通常使用的物質。

在本發(fā)明的阿洛酮糖的生產方法中，可在僅包含作為基質的果糖和用于供給輔助因子的無機鹽的培養(yǎng)基中執(zhí)行果糖和差向異構酶的反應。上述無機鹽可舉錳鹽或鈷鹽。從更加得到改善的阿洛酮糖的生產速度方面出發(fā)，優(yōu)選地使用鈷鹽，從可將所生產的阿洛酮糖安全地用作食品等的方面出發(fā)，優(yōu)選地使用錳鹽。

僅包含果糖和無機鹽的培養(yǎng)基可以是果糖和無機鹽溶解于溶劑的液體培養(yǎng)基。例如，溶劑可以是水。

在通過利用微生物生產阿洛酮糖時，除阿洛酮糖之外，培養(yǎng)基中還會生成微生物的有機酸等的代謝物，因而培養(yǎng)基有可能逐漸被酸性化。由于本發(fā)明的僅包含果糖和無機鹽的培養(yǎng)基并不包含緩沖溶液，因而更加優(yōu)選地，使用最佳活性ph值低的(例如ph達到7以下)阿洛酮糖-3-差向異構酶。

上述微生物的培養(yǎng)物包含阿洛酮糖，回收阿洛酮糖的方法不受特殊限制，可采用本領域公知的方法，例如，可采用離心分離、過濾、結晶化、離子交換色譜法等方法。

具體地，通過對培養(yǎng)物進行離心分離來從微生物中分離培養(yǎng)液，可通過上述回收方法從培養(yǎng)基中分離出阿洛酮糖。

本發(fā)明的阿洛酮糖的生產方法還可在上述果糖和差向異構酶發(fā)生反應之前包括在未包含上述果糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述微生物來以使上述微生物具有休眠細胞的方式進行誘導的步驟。

以具有上述休眠細胞的方式進行的誘導可通過在未包含果糖的培養(yǎng)基中將上述微生物培養(yǎng)到靜止期(stationaryphase)來實現(xiàn)。

在本說明書中，休眠細胞(restingcell)意味著處于不再進行增殖的狀態(tài)的培養(yǎng)細胞。在本說明書中，靜止期意味著在培養(yǎng)細胞的過程中經過生長期(exponentialphase)后使細胞的分裂及增殖停止來不再呈現(xiàn)出細胞個體數(shù)量的增加并使細胞成分的合成和分解達到均衡的狀態(tài)。

因此，本發(fā)明的休眠細胞意味著處于結束生長并使細胞內的差向異構酶的表達達到充分的狀態(tài)的細胞，在以使微生物具有休眠細胞的方式進行誘導的情況下，差向異構酶的表達量達到最大值，從而可使阿洛酮糖的生產達到極大化。

除了不包含果糖，未包含果糖的培養(yǎng)基可以是與上述的包含果糖的培養(yǎng)基相同的培養(yǎng)基。

并且，本發(fā)明還可包括在上述果糖和其差向異構酶的反應之后回收上述微生物來重新用于使其他基質轉換成阿洛酮糖的步驟。

本發(fā)明中，在微生物內執(zhí)行果糖和其差向異構酶的反應，即使暴露在高溫下，也可使差向異構酶得到微生物的保護，因此仍然呈現(xiàn)出酶活性，因而可重新進行使用。

即，可在上述反應之后通過回收上述微生物來重新用于使其他基質轉換成阿洛酮糖的步驟。

若在可使所分離的微生物的生育得到維持的環(huán)境中執(zhí)行反應，則再使用次數(shù)不受限制，可達到數(shù)百次以上、數(shù)千次以上。

在還包括再使用微生物的步驟的情況下，微生物多次暴露在高溫下，因而優(yōu)選地使用熱穩(wěn)定性高的高溫型微生物(thermophiles)，以使再使用時的酶活性達到很高水平。

在上述的例示內容中，優(yōu)選為棒狀桿菌屬、放線菌屬，更優(yōu)選為谷氨酸棒狀桿菌，最優(yōu)選為向谷氨酸棒狀桿菌atcc13032導入編碼上述差向異構酶的基因的。

發(fā)明的效果

通過本發(fā)明的方法，可明顯改善阿洛酮糖的生產量及生產速度。

通過本發(fā)明的方法，可通過回收微生物來反復用于使果糖轉換成阿洛酮糖的轉換過程，從而可明顯改善工序收益率。

附圖說明

圖1為對在導入阿洛酮糖-3-差向異構酶的谷氨酸棒狀桿菌形質轉換體中基于休眠細胞轉換反應(使果糖和差向異構酶發(fā)生反應的阿洛酮糖的生產反應)的反應溫度來由作為基質的果糖生產阿洛酮糖的生產量進行測定并示出的圖。

圖2為對在導入阿洛酮糖-3-差向異構酶的大腸桿菌mg1655形質轉換體中基于休眠細胞轉換反應的反應溫度來由作為基質的果糖生產阿洛酮糖的生產量進行測定并示出的圖。

圖3為對通過利用導入阿洛酮糖-3-差向異構酶的谷氨酸棒狀桿菌和大腸桿菌mg1655形質轉換體來在60℃的溫度下進行3個小時的阿洛酮糖生產休眠細胞轉換反應后重新回收菌體并在相同反應條件下進行反應而得的阿洛酮糖的生產量進行測定并示出的圖。

圖4為示出基于在導入阿洛酮糖-3-差向異構酶的谷氨酸棒狀桿菌形質轉換體的休眠細胞轉換反應所使用的阿洛酮糖生產反應培養(yǎng)基的組成變化的由果糖生產阿洛酮糖的生產量的圖。

圖5為示出在導入阿洛酮糖-3-差向異構酶的谷氨酸棒狀桿菌形質轉換體的休眠細胞轉換反應時的基于阿洛酮糖-3-差向異構酶的來源菌株及阿洛酮糖生產反應培養(yǎng)基組成的阿洛酮糖的生產量的圖。

圖6為示出在導入阿洛酮糖-3-差向異構酶的谷氨酸棒狀桿菌形質轉換體的休眠細胞轉換反應時的基于阿洛酮糖-3-差向異構酶的來源菌株及加熱時間的阿洛酮糖的生產量的圖。

圖7為對源于多種菌株的阿洛酮糖-3-差向異構酶的氨基酸序列進行比較的圖。

圖8為示出基于導入源于梭菌屬的阿洛酮糖-3-差向異構酶的谷氨酸棒狀桿菌的再使用次數(shù)的阿洛酮糖的生產量的圖。

具體實施方式

以下，為了更具體地說明本發(fā)明，通過實施例來對本發(fā)明進行說明。

實施例

實施例1.利用谷氨酸棒狀桿菌菌株來由果糖生產阿洛酮糖的過程中基于溫度的阿洛酮糖生產速度及生產量變化

(1)重組菌株的制備

通過使作為大腸桿菌-棒桿菌穿梭載體的pces208(j.microbiol.biotechnol.,18:639-647,2008)發(fā)生變形來制作插入有終止子(terminator)和lac啟動子的psgt208穿梭載體來進行使用。

為了由谷氨酸棒狀桿菌生產阿洛酮糖，阿洛酮糖-3-差向異構酶通過將根癌土壤桿菌(agrobacteriumtumefaciensstr.c58；taxid:176299；genbanknid:nc_003062,atcc33970)的dpe基因(agr_l_260,gi:15890243,序列1)導入到已制作的上述psgt208穿梭載體來進行使用。

詳細地，利用序列31的引物1和序列32的引物2，來在根癌土壤桿菌基因使dpe基因擴大，使用限制酶kpni和bamhi來進行切割，并向psgt208穿梭載體的相同部位進行插入，從而制作了包含阿洛酮糖-3-差向異構酶的ps208-dpe重組穿梭載體。

之后，為了在谷氨酸棒狀桿菌中增加阿洛酮糖-3-差向異構酶的表達量，在ps208-dpe中將lac啟動子替換成源于ptrc99a的trc啟動子，并將其命名為ps208ct-dpe。

將包含所制作的上述阿洛酮糖

-3-差向異構酶的重組載體ps208-dpe、ps208ct-dpe和作為其陰性對照組的psgt208載體導入到野生型谷氨酸棒狀桿菌atcc13032來進行形質轉換，將其利用到由果糖生產阿洛酮糖的過程當中。形質轉換法采用handbookofcorynebacteriumglutamicum(lothareggeling等,isbn0-8493-1821-1,2005bycrcpress)中的方法。

(2)重組菌株的培養(yǎng)基利用其的阿洛酮糖的生產

為了確保高濃度菌體，將在上述中制備的谷氨酸棒狀桿菌形質轉換體接種到包含20μg/ml卡那霉素的5ml的lb培養(yǎng)基(difco)來在30℃的溫度、250rpm條件下進行種培養(yǎng)，之后接種到包含10g/l葡萄糖及20μg/ml卡那霉素的最小培養(yǎng)基(每1l包含1g的k2hpo4、10g的(nh4)2so4、0.4g的mgso47h2o、20mg的feso47h2o、20mg的mnso45h2o、50mg的nacl、2g的urea、0.1mg的biotin、0.1mg的thiamine)進行了本培養(yǎng)。本培養(yǎng)在具有槽的500ml三角燒瓶以100ml體積在30℃的溫度、180rpm條件下進行12個小時，誘導出充分的菌體量并使蛋白質充分表達。

通過對所得到的培養(yǎng)液進行離心分離來去除上層液并回收菌體，在包含作為基質的40％(w/v)果糖的與上述相同的最小培養(yǎng)基中以使菌體濃度達到40od600的方式進行重新懸浮之后，在25℃、30℃、37℃、50℃、60℃或70℃的溫度、180rpm的條件下進行了休眠細胞轉換反應。

利用高性能液體色譜(hplc)測定了果糖及阿洛酮糖的濃度。高性能液體色譜使用了設置有kromasil5nh2柱(4.6mm×250mm)的scl-10a(日本島津公司，shimadzu)，移動相通過利用75％乙腈來在以1.5ml/分鐘流下并在40℃的溫度下分離后利用反射指數(shù)(ri，reflectiveindex)檢測器來進行了分析。在上述條件下，果糖的保留時間(retentiontime)為5.5分鐘，阿洛酮糖的保留時間為4.6分鐘。

圖1示出了測定結果。參照圖1，使導入psgt208ct-dpe穿梭載體的谷氨酸棒狀桿菌atcc13032菌株在包含40％果糖的培養(yǎng)基進行轉換反應的結果，反應溫度越高，阿洛酮糖的生產速度越快、生產量越增加。尤其，在50℃、60℃、70℃的溫度下發(fā)生反應的實驗組大約在3個小時的時間內使阿洛酮糖-3-差向異構酶達到酶的反應平衡，生產了約120g/l的阿洛酮糖，這可被視為阿洛酮糖-3-差向異構酶的由果糖轉換成阿洛酮糖的轉換速度及生產量依賴于溫度。

生產量以50℃的溫度為起點來急劇增加，這屬于比正常酶反應所需的溫度明顯高的溫度，判斷在該溫度下，酶和基質之間的反應的狀態(tài)發(fā)生變化。

實施例2.在利用大腸桿菌由果糖生產阿洛酮糖的過程中的基于溫度的阿洛酮糖生產速度及生產量變化

根據(jù)在韓國專利授權號第10-1106253號中的實施例1中所記載的方法，制備了使用向ptrc99a載體導入源于根癌土壤桿菌的阿洛酮糖-3-差向異構酶的ptpe質體進行形質轉換的e.colimg1655(δpfka,als2)菌株。

為了阻斷阿洛酮糖分解路徑，利用了pfka(序列11)和als2(序列14、序列15、序列16、序列17、序列18及序列19)基因缺損的大腸桿菌mg1655。

為了確保高濃度的菌體，將在以上所制備的上述大腸桿菌mg1655形質轉換體接種到包含100μg/ml的氨比西林的5ml的lb培養(yǎng)基(difco)并在37℃的溫度、250rpm條件下進行種培養(yǎng)，之后接種到包含10g/l葡萄糖及100μg/ml的氨比西林的2yt培養(yǎng)基進行了本培養(yǎng)。本培養(yǎng)在具有槽的500ml三角燒瓶以100ml體積在37℃的溫度、180rpm條件下進行12個小時，誘導出充分的菌體量并使蛋白質充分表達。

通過對所得到的培養(yǎng)液進行離心分離來去除上層液并回收菌體，在包含作為基質的40％(w/v)果糖的大腸桿菌最小培養(yǎng)基m9培養(yǎng)基(每1l包含11.3g的m9minimalsalts(difco)、0.1ml的1mcacl2、2ml的1mmgso4、1ml的100mmmnso45h2o)中以使菌體濃度達到40od600的方式進行重新懸浮之后，分別在37℃、60℃或70℃的溫度、180rpm的條件下進行了休眠細胞轉換反應。果糖及阿洛酮糖的濃度根據(jù)在上述實施例1中所記載的方法進行了分析。圖2示出測定結果。

參照圖2，使導入ptpe載體的大腸桿菌mg1655(δpfka,als2)菌株在包含40％果糖的培養(yǎng)基進行轉換反應的結果，也是反應溫度越高，阿洛酮糖的生產速度越快，生產量越增加。尤其，與棒狀桿菌的實驗同樣地，在60℃、70℃的溫度下發(fā)生反應的實驗組大約在2個小時的時間內使阿洛酮糖-3-差向異構酶達到酶的反應平衡，生產了約120g/l的阿洛酮糖。

這重新證明了阿洛酮糖-3-差向異構酶的由果糖轉換成阿洛酮糖的轉換速度及生產量依賴于溫度。

以作為代表性的革蘭氏陽性菌的棒桿菌和作為代表性的革蘭氏陰性菌的大腸桿菌作為對象來在高溫下進行休眠細胞轉換反應實驗的結果，作為糖轉換酶的阿洛酮糖-3-差向異構酶在細胞內在極寒外部環(huán)境中受到保護，因而與單純的酶的狀態(tài)相比，可在高溫下不產生熱變性并能夠以更快的速度生產阿洛酮糖。這種細胞轉換反應的優(yōu)點也可適用于大部分微生物。

實施例3.谷氨酸棒狀桿菌形質轉換菌體通過在休眠細胞轉換反應中的菌體回收及再使用來實現(xiàn)的由果糖的阿洛酮糖的連續(xù)生產

在上述實施例1及實施例2的結果中可知，在將阿洛酮糖-3-差向異構酶導入棒桿菌和大腸桿菌形質轉換體內并在50℃以上的高溫條件下進行轉換反應時，在3小時以內使阿洛酮糖的生產量達到最大值之后并不再增加。

即，為了確認阿洛酮糖-3-差向異構酶在達到使阿洛酮糖的生產量達到最大值的反應平衡的3個小時之后還殘留多少使果糖轉換成阿洛酮糖的活性，通過回收在存在果糖的條件下通過3個小時的休眠細胞轉換反應來用于阿洛酮糖生產的菌體，來重新用于阿洛酮糖生產用休眠細胞轉換反應中。

上述菌體的再使用休眠細胞轉換反應在60℃的溫度下反復進行了3次。最初的休眠細胞轉換反應標為r0，從之前的反應液中回收菌體來進行第一次再使用的休眠細胞轉換反應標為r1，進行第二次再使用的休眠細胞轉換反應標為r2，進行第三次再使用的休眠細胞轉換反應標為r3。培養(yǎng)條件及分析方法與實施例1相同。圖3示出其結果。

參照圖3，即使在60℃的高溫糖轉換反應中也可再使用菌體。但是，越是再使用菌體，酶的活性的一定部分減少。并且，在高溫下再使用菌體方面，作為革蘭氏陽性菌的谷氨酸棒狀桿菌菌株的殘留酶活性高于作為革蘭氏陰性菌的大腸桿菌mg1655菌株的殘留酶活性。

實施例4.在多種休眠細胞轉換反應培養(yǎng)基中由果糖生產阿洛酮糖

在上述實施例1中的在谷氨酸棒狀桿菌中由果糖生產阿洛酮糖的轉換反應中，使用了包含40％果糖的最小培養(yǎng)基(每1l包含1g的k2hpo4、10g的(nh4)2so4、0.4g的mgso47h2o、20mg的feso47h2o、20mg的mnso45h2o、50mg的nacl、2g的urea、0.1mg的biotin、0.1mg的thiamine)。通過使用于該轉換反應的培養(yǎng)基的結構成分最小化來制備更加經濟、簡便的培養(yǎng)基，執(zhí)行了與在實施例1中使用的培養(yǎng)基之間的阿洛酮糖生產性比較。

參照圖4，即使使用包含40％果糖和0.1mmmnso4的磷酸鹽緩沖液(phosphatebuffer)(ph7)培養(yǎng)基，即使更加簡便地僅使用僅包含40％果糖和0.1mmmnso4的培養(yǎng)基，也在最終生產的阿洛酮糖的生產量方面沒有太大差別。上述狀態(tài)在30℃和60℃的反應溫度下均同樣被觀察到。在未將0.1mmmnso4作為阿洛酮糖-3-差向異構酶的輔助因子來進行添加的情況下，得到了生產量減少的結果。

在上述實施例中，可知用于阿洛酮糖生產用休眠細胞轉換反應的培養(yǎng)基的成分僅有作為基質的果糖和作為阿洛酮糖-3-差向異構酶的輔助因子的mnso4即可。

實施例5.包含編碼有源于多種菌株的阿洛酮糖-3-差向異構酶氨基酸序列的多核苷酸的重組谷氨酸棒狀桿菌的制備

從德國微生物菌種保藏中心(dsmz)購買了糞厭氧棒狀菌(anaerostipescaccaedsm14662；taxid:411490)的整體基因。將所購買的整體基因作為模具，以包含阿洛酮糖-3-差向異構酶推定基因(apendonuclease；sequenceid:gb|edr98778.1|；gi:167654649；序列4)的方式將序列33及序列34的引物對作為引物來執(zhí)行了第一次聚合酶鏈式反應(pcr)。以擴大的聚合酶鏈式反應產物作為模具，將與阿洛酮糖-3-差向異構酶基因特殊結合的序列35及序列36的引物對用作引物，來執(zhí)行了第二次聚合酶鏈式反應。

通過使用限制酶bamhⅰ和xbaⅰ來將所得到的聚合酶鏈式反應的產物插入到ps208ct-dpe(在韓國專利申請?zhí)?0-2013-0060703的實施例1中所記載的載體)的相同酶部位，來制備了重組載體ps208ct-acdpe。

將所制備的ps208ct-acdpe載體導入野生型谷氨酸棒狀桿菌atcc13032來進行形質轉換，并將其用于由果糖生產阿洛酮糖的生產過程。形質轉換法采用在handbookofcorynebacteriumglutamicum(lothareggeling等,isbn0-8493-1821-1,2005bycrcpress)中記載的方法。

所得到的重組谷氨酸棒狀桿菌菌株在-80℃的溫度下得到保管后用于培養(yǎng)。

包含鮑氏梭菌(clostridiumbolteaeatccbaa-613；taxid:411902)的阿洛酮糖-3-差向異構酶推定基因(hypotheticalproteinclobol_00069；sequenceid:gb|edp19602.1|；gi:15844190；序列9)的質體從韓國益力多乳品有限公司購得。將與阿洛酮糖-3-差向異構酶基因特殊結合的序列37及序列38的引物對用作引物來執(zhí)行了聚合酶鏈式反應。

通過使用限制酶kpnⅰ和xbaⅰ來將所得到的聚合酶鏈式反應的產物插入到ps208ct-dpe(在韓國專利申請?zhí)?0-2013-0060703的實施例1中所記載的載體)的相同酶部位，來制備了重組載體ps208ct-cbdpe。

通過與上述的內容相同的方法將所制備的重組載體ps208ct-cbdpe載體導入野生型谷氨酸棒狀桿菌atcc13032來進行形質轉換，并將其用于由果糖生產阿洛酮糖的生產過程。所得到的重組谷氨酸棒狀桿菌菌株在-80℃的溫度下得到保管后用于培養(yǎng)。

從德國微生物菌種保藏中心(dsmz)購買了海氏梭菌(clostridiumhylemonaedsm15053；taxid:553973)的整體基因。將所購買的整體基因作為模具，以包含阿洛酮糖-3-差向異構酶推定基因(dolicholmonophosphatemannosesynthase；sequenceid:ref|wp_006442985.1|；gi:225161759；序列10)的方式將序列39及序列40的引物對作為引物來執(zhí)行了第一次聚合酶鏈式反應。以擴大的聚合酶鏈式反應產物作為模具，將與阿洛酮糖-3-差向異構酶基因特殊結合的序列41及序列42的引物對用作引物，來執(zhí)行了第二次聚合酶鏈式反應。

通過使用限制酶bamhⅰ和xbaⅰ來將所得到的聚合酶鏈式反應的產物插入到ps208ct-dpe(在韓國專利申請?zhí)?0-2013-0060703的實施例1中所記載的載體)的相同酶部位，來制備了重組載體ps208ct-chdpe。

通過與上述的內容相同的方法將所制備的ps208ct-chdpe載體導入野生型谷氨酸棒狀桿菌atcc13032來進行形質轉換，并將其用于由果糖生產阿洛酮糖的生產過程。所得到的重組谷氨酸棒狀桿菌菌株在-80℃的溫度下得到保管后用于培養(yǎng)。

實施例6.利用導入源于多種菌株的阿洛酮糖-3-差向異構酶的重組谷氨酸棒狀桿菌菌株由果糖生產阿洛酮糖

利用在上述實施例5中所制備的谷氨酸棒狀桿菌形質轉換體來確認了由高濃度果糖生產阿洛酮糖。

將在上述中制備的形質轉換體接種到包含20μg/ml卡那霉素的2yt培養(yǎng)基來在30℃的溫度、250rpm條件下進行種培養(yǎng)，之后重新將形質轉換體接種到包含20μg/ml卡那霉素的2yt培養(yǎng)基來進行本培養(yǎng)。本培養(yǎng)在具有槽的300ml三角燒瓶以60ml體積在30℃的溫度、180rpm條件下進行7個小時，誘導出充分的菌體量并使蛋白質充分表達。

通過對所得到的培養(yǎng)液進行離心分離來去除上層液并回收菌體，在包含20μg/ml卡那霉素、作為基質的40％(w/v)果糖和濃度為0.1mm的作為阿洛酮糖-3-差向異構酶的主輔助因子的錳或鈷的簡單的轉換反應培養(yǎng)基中，在55℃的溫度下進行了休眠細胞轉換反應。果糖和阿洛酮糖的濃度采用在上述實施例1中所記述的方法相同的方法來進行測定。圖5示出其結果。atdpe是指當前使用的根癌農桿菌的阿洛酮糖-3-差向異構酶。

參照圖5，在所有導入多種阿洛酮糖-3-差向異構酶的重組菌株中，與將錳作為輔助因子相比，當將鈷作為輔助因子時，阿洛酮糖的生產速度更快。

導入源于厭氧棒狀菌屬和土壤桿菌屬的阿洛酮糖-3-差向異構酶的重組谷氨酸棒狀桿菌的阿洛酮糖生產量在6個小時時達到平衡，但導入源于梭菌的阿洛酮糖-3-差向異構酶的重組谷氨酸棒狀桿菌的阿洛酮糖生產量在將錳作為輔助因子的情況下，在3個小時時達到平衡。

因此，不僅可確認到源于梭菌的阿洛酮糖-3-差向異構酶可實現(xiàn)由果糖生產阿洛酮糖，阿洛酮糖的生產速度比源于土壤桿菌屬的阿洛酮糖-3-差向異構酶更快。

實施例7.導入源于多種菌株的阿洛酮糖-3-差向異構酶的重組谷氨酸棒狀桿菌菌株的高溫下的阿洛酮糖持續(xù)生產活性維持

在上述實施例1、實施例2的結果中，確認到在以50℃以上的高溫條件進行轉換反應時，所有阿洛酮糖生產在3個小時以內完成。像這樣，在高溫條件下，由果糖生產阿洛酮糖的生產速度快，因而需要即使再使用菌體的情況下也能夠在長時間的高溫條件下維持穩(wěn)定的阿洛酮糖-3-差向異構酶。因此，確認了源于多種菌株的阿洛酮糖-3-差向異構酶在高溫條件下將活性維持到什么程度。

使通過上述實施例1中的技術方法得到的菌體在2yt中進行浮游，來利用振蕩培養(yǎng)器在0小時、3小時、6小時、9小時、12小時、24小時的時間內持續(xù)施加60℃的熱量。在按各種時間施加熱量之后，回收菌體并在僅包含20μg/ml卡那霉素、0.1mm錳及40％(w/v)果糖的簡單轉換反應培養(yǎng)基中進行浮游，重新在60℃的溫度下進行3個小時的休眠細胞轉換反應。果糖和阿洛酮糖的濃度通過與上述實施例1中的技術方法相同的方法進行了測定。圖6示出其結果。

參照圖6，導入以往使用的源于土壤桿菌屬的阿洛酮糖-3-差向異構酶和源于厭氧棒狀菌屬的阿洛酮糖-3-差向異構酶的重組谷氨酸棒狀桿菌在受到3個小時的60℃的熱量之后，幾乎無法進行阿洛酮糖生產。相反，導入源于梭菌屬的阿洛酮糖-3-差向異構酶的重組谷氨酸棒狀桿菌在受到24個小時的熱量后也能夠維持阿洛酮糖生產，因而與源于土壤桿菌屬的阿洛酮糖-3-差向異構酶相比，更加有利于高溫條件下的阿洛酮糖的生產。

當對于源于根癌土壤桿菌的阿洛酮糖-3-差向異構酶的熱穩(wěn)定性起到重要作用的序列(參考文獻1)中的第33個氨基酸或第213個氨基酸分別被亮氨酸、半胱氨酸取代時，在50℃的溫度下的酶的半壽命分別達到3.3倍、7.2倍，在兩個均被取代時，達到29.9倍。

源于根癌土壤桿菌的阿洛酮糖-3-差向異構酶的氨基酸序列與源于梭菌屬的阿洛酮糖-3-差向異構酶的氨基酸序列之間的比較在圖7中示出，參照圖7，熱穩(wěn)定性高的源于梭菌屬的阿洛酮糖-3-差向異構酶使得一個氨基酸具有與之相對應的序列或具有所有兩個序列。

實施例8.導入源于梭菌屬的阿洛酮糖-3-差向異構酶的重組谷氨酸棒狀桿菌菌體通過在休眠細胞轉換反應中的菌體回收及再使用來實現(xiàn)由果糖生產阿洛酮糖

由于在上述實施例7中確認到源于梭菌屬的阿洛酮糖-3-差向異構酶在高溫中具有高穩(wěn)定性，因而在導入源于梭菌屬的阿洛酮糖-3-差向異構酶的兩個重組菌株中使代表性地導入海氏梭菌的阿洛酮糖-3-差向異構酶的重組谷氨酸棒狀桿菌菌體在高溫下進行休眠細胞轉換反應之后，確認了菌體再使用效果。

在使通過與在上述實施例3中所記述的方法相同的方法得到的菌體在60℃的溫度下進行3個小時的休眠細胞轉換反應之后，重新回收菌體來實施相同的休眠細胞轉換反應，菌體共被再使用3次(與上述實施例3中的條件相同的條件進行實驗)。最初的休眠細胞轉換反應標為r0，從之前的反應液中回收菌體來進行第一次再使用的休眠細胞轉換反應標為r1，進行第二次再使用的休眠細胞轉換反應標為r2，進行第三次再使用的休眠細胞轉換反應標為r3。圖8示出其結果。

參照圖8，在高溫條件下多次再使用菌體的過程中，導入梭菌屬的阿洛酮糖-3-差向異構酶來制備的菌體以阿洛酮糖生產量沒有任何減少情況的方式維持規(guī)定量?？山Y合上述實施例7的結果來確認到，酶本身的熱穩(wěn)定性在高溫條件下持續(xù)進行糖轉換反應，在菌體的再使用過程中也非常有利。

<110>慶尚大學校產學協(xié)力團

<120>阿洛酮糖的生產方法

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<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>32

gctggatccttagccaccaagaacgaagcggg32

<210>33

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>33

ccacggaactttcggctgttttg23

<210>34

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>34

cttccgtaggtgccacaatatc22

<210>35

<211>44

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>35

cgaggatccaggaggtaataatatgaaaaataaattcggagttg44

<210>36

<211>28

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>36

gtctagattatatctcagcagcgatggc28

<210>37

<211>53

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>37

cggtaccaggaggtaataatatgaaatatggtatttattttgcttattggacg53

<210>38

<211>32

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>38

ctctagattagataccaaacacatgcctgcag32

<210>39

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>39

cggactatctgaacgaactgacgg24

<210>40

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>40

ctccataagcatcctcctcatcc23

<210>41

<211>45

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>41

cgaggatccaggaggtaataatatgaaacatggtatctattatgc45

<210>42

<211>27

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>42

gtctagattacttccactccagcatat27