本發(fā)明涉及一種使用緩沖液作為預處理溶劑以從瓊脂中酶促產生單糖來改善單糖例如3,6-脫水-l-半乳糖和半乳糖的生產產率的方法。

背景技術：

海藻與目前在各種領域中使用的木質纖維素或草本生物質相比，具有低含量的不適用的組分例如木質素等，因此能夠轉化為單糖，其是用于更容易生產生物能源和生物化學的原材料。此外，由于海藻不使用生物質資源，因此它們也沒有由于生物質資源的增能而引起的問題。由于這樣的原因，海藻作為生物化學以及替代能量的生產中的重要生物質已經受到關注(wi等,bioresourtechnol,100(2009),第6658-6660頁)。

特別地，已經報道紅藻(例如，蒼耳(gelidiumamansii))是用于產生這樣的生物能和生物化學物質的來源，并且還高度適用于醫(yī)療和化妝品領域，因為其成分瓊脂低聚糖具有優(yōu)異的生理特性，例如抗氧化、抗炎癥、抗癌、抗過敏、美白、保濕活性等(tomono等，美國專利no.76622291(2009),enoki等，美國專利no.691143282(2005),chen等，foodtechnolbiotechnol.43(1)第29-36頁(2005),chen等，nutj.5(31)第1-12(2006))。紅藻具有瓊脂糖作為主要成分，其是由α-1,3鍵連接3,6-脫水-l-半乳糖和d-半乳糖作為基本單元的新瓊脂二糖的聚合物，其通過β-1,4鍵相互連接。

發(fā)明人通過實驗證明，包括新瓊脂二糖的瓊脂低聚糖的生理功能是由3,6-脫水-l-半乳糖引起的(yun等，applmicrobiolbiotechnol.97(7)第2961-70頁(2013))。此外，通過溫和的化學預處理代替化學處理來生產3,6-脫水-l-半乳糖和d-半乳糖的方法(jol等，analbiochem.268,第213-222頁(1999),kim等，bullkoreansoc.31(2)第511-514頁(2010))，其在3,6-脫水-l-半乳糖的生產中具有非常低的產率和容易過度降解的問題，并且已經報道了酶糖化(韓國專利公開號2013-0085017)。

瓊脂低聚糖通過aga50d降解為主要反應產物即新瓊脂二糖和新瓊脂三糖(d-半乳糖-β-1,4連接-3,6-脫水-l-半乳糖-α-1,3連接-d-半乳糖)，所述aga50d是在化學預處理后處理的外切型瓊脂酶。之后，新瓊脂二糖通過α-新瓊脂二糖水解酶sdnabh最終水解成3,6-脫水-l-半乳糖和d-半乳糖(韓國專利公開號2010-0108241)。在該方法中，雖然預處理對于提高aga50d的反應性是必要的，但是目前使用的用弱酸的溫和化學預處理方法需要中和或凍干以用于隨后的酶反應，從而產生大量的中和中產生的鹽以及相當數量的處理費用。此外，當進行化學預處理時，主要降解3,6-脫水-l-半乳糖和d-半乳糖之間的α-1,3鍵，并且當處理外切型β-瓊脂酶時，最終保留瓊脂三糖，而不降解成3,6-脫水-l-半乳糖和d-半乳糖，這也成為降低單糖的生產產率的原因。此外，到目前為止，在3,6-脫水-l-半乳糖和d-半乳糖的生產中，瓊脂糖已經用作初始底物，并且通過重復數次的分離和純化過程由紅藻產生，因此是昂貴的。

因此，需要開發(fā)能夠簡化整個過程、降低整個過程的成本并提高單糖的生產產率的工藝技術。

技術實現要素：

[技術問題]

本發(fā)明的目的是提供一種通過使用瓊脂作為底物來提高單糖例如3,6-脫水-l-半乳糖和半乳糖的生產產率的方法，以簡化生產過程并降低生產的單位成本，并且適當地使用預處理溶劑和在酶水解中使用的水解酶。

[技術方案]

為了實現該目的，本發(fā)明提供了一種用于提高3,6-脫水-l-半乳糖和半乳糖的生產產率的方法，其包括：用ph6至9的緩沖液預處理瓊脂；以及用瓊脂酶、瓊脂糖分解β-半乳糖苷酶(agarolyticβ-galactosidase)和α-新瓊脂二糖水解酶順序地水解經預處理的瓊脂。

[有益效果]

本發(fā)明具有有效地提高單糖例如3,6-脫水-l-半乳糖和半乳糖的生產產率的效果，其通過使用比瓊脂糖便宜的瓊脂作為初始底物和使用緩沖液作為預處理溶劑，并且依次應用瓊脂酶、瓊脂糖分解β-半乳糖苷酶和α-新瓊脂二糖水解酶作為酶水解所用的酶，大大減少了在預處理瓊脂的中和中產生的鹽的量，降低了生產的單位成本并簡化了生產工藝。

附圖說明

圖1顯示了作為底物的預處理瓊脂和通過與酶反應獲得的產物的薄層色譜(tlc)結果：std是標準，使用3,6-脫水-l-半乳糖(ahg)、新瓊脂二糖(dp2)、半乳糖(gal)和瓊脂三糖(dp3)，道1是預處理的瓊脂，道2是用瓊脂酶(aga50d)處理預處理瓊脂獲得的產物，道3是用瓊脂糖分解β-半乳糖苷酶(abg)處理瓊脂酶產物獲得的產物，道4是用α-新瓊脂二糖水解酶(nabh)處理瓊脂糖分解β-半乳糖苷酶產物獲得的產物，道5是用nabh而沒有用abg處理瓊脂酶產物獲得的產物。

圖2顯示了使用瓊脂糖分解β-半乳糖苷酶(abg)通過高效液相色譜法(hplc)獲得的3,6-脫水-l-半乳糖的生產產率的定量分析結果。

圖3顯示了使用瓊脂糖分解β-半乳糖苷酶(abg)通過hplc獲得的d-半乳糖的生產產率的定量分析結果。

具體實施方式

下面將詳細描述本發(fā)明的構造。

在說明書中描述數值范圍時，術語“至”應當被理解為包括每個數值范圍的閾值。例如，應當注意，ph6至9是包括ph6和ph9的數值范圍。

本發(fā)明涉及一種提高3,6-脫水-l-半乳糖和半乳糖的生產產率的方法，其包括：用ph6至9的緩沖液預處理瓊脂；以及用瓊脂酶、瓊脂糖分解β-半乳糖苷酶和α-新瓊脂二糖水解酶順序地水解經預處理的瓊脂。

根據本發(fā)明的用于提高3,6-脫水-l-半乳糖和半乳糖的生產產率的方法的特征在于，通過使用比瓊脂糖便宜的瓊脂作為初始底物，用緩沖液作為預處理溶劑預處理底物，并使經預處理的瓊脂與外切型瓊脂酶例如aga50d、瓊脂糖分解β-半乳糖苷酶和α-新瓊脂二糖水解酶順序地反應，從而由水解產物獲得單糖例如3,6-脫水-l-半乳糖和半乳糖的高生產產率。

下面將逐步詳細描述根據本發(fā)明的用于提高3,6-脫水-l-半乳糖和半乳糖的生產產率的方法。

第一步是用緩沖液預處理瓊脂。

緩沖液用于滿足瓊脂的酶水解的最佳要求，并且當被預處理時，即用水作為預處理溶劑加熱時，由于膠凝效應難以實現酶水解。因此，將緩沖液加入到瓊脂中以防止這種膠凝效應，并且作為緩沖液，可以使用特別地ph6至9的溶液，更特別地ph7至8的一種或至少兩種中性溶液，例如tris-hcl、乙酸鈉、檸檬酸鈉、磷酸鈉、甘氨酸-naoh等。

瓊脂在緩沖液中的濃度優(yōu)選為0.1至5％。例如，當緩沖液為20ml時，可以加入0.02至1g的瓊脂。在上述范圍內，可以有效地從瓊脂中生產瓊脂低聚糖。

為了有效地從瓊脂中生產瓊脂低聚糖，用緩沖液的預處理可以在100至200℃下進行1分鐘至1小時。

此外，根據本發(fā)明的用于提高3,6-脫水-l-半乳糖和半乳糖的生產產率的方法可以還包括對預處理瓊脂的中和。

中和是為了滿足酶水解的最佳條件，或換句話說，使預處理產物的ph為中性，即滴定至ph6至8。作為滴定溶劑，可以使用naoh、氫氧化銨或鹽酸(hcl)等，但本發(fā)明不限于此。

在根據本發(fā)明的用于提高3,6-脫水-l-半乳糖和半乳糖的生產產率的方法中，第二步是通過對經預處理的瓊脂進行酶水解來產生單糖。

酶水解的特征在于使經預處理的瓊脂與瓊脂酶、瓊脂糖分解β-半乳糖苷酶和α-新瓊脂二糖水解酶順序地反應。

通過預處理，用外切型瓊脂酶使瓊脂降解成瓊脂低聚糖，其降解成例如新瓊脂二糖和瓊脂三糖(d-半乳糖-β-1,4連接-3,6-脫水-l-半乳糖-α-1,3連接-d-半乳糖)，并且新瓊脂二糖最終被α-新瓊脂二糖水解酶水解成3,6-脫水-l-半乳糖和d-半乳糖。在此，在用α-新瓊脂二糖水解酶處理之前，當僅作用于瓊脂三糖非還原端的半乳糖部分的瓊脂糖分解β-半乳糖苷酶與瓊脂酶反應產物反應時，可以有效地釋放半乳糖。因此，本發(fā)明的方法能夠通過依次處理瓊脂酶、瓊脂糖分解β-半乳糖苷酶和α-新瓊脂二糖水解酶來提高3,6-脫水-l-半乳糖和d-半乳糖的生產產率。

水解可以在20至40℃的溫度范圍內在0至200rpm下進行30分鐘至7天。

將在下面詳細描述酶。

首先，降解瓊脂低聚糖以產生新瓊脂二糖和瓊脂三糖的瓊脂酶可以是用于裂解瓊脂糖的3,6-脫水-l-半乳糖和d-半乳糖之間的β-1,4-糖苷鍵的酶(以下稱為“aga50d”)。

瓊脂酶可以包括序列號1所示的氨基酸序列和相對于序列號1的序列具有80％以上、85％以上、90％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上的序列同一性的氨基酸序列。

瓊脂酶可以源自糖酵母降解(saccharophagusdegradans)2-40，但本發(fā)明不特別限于此。

可以使用dna片段轉錄和翻譯瓊脂酶，所述dna片段即參與包括各個編碼片段之間以及酶編碼區(qū)之前和之后的區(qū)域之間的插入序列的多肽生產的編碼基因。例如，瓊脂酶可以表示為序列號2的序列，但是本發(fā)明不限于此。

隨后，作為用于從瓊脂低聚糖中釋放半乳糖的瓊脂糖分解β-半乳糖苷酶，本發(fā)明的酶的范圍包括序列號3所示的氨基酸序列，并且還包括具有水解瓊脂低聚糖活性的蛋白質作為來自具有一個或多個取代、缺失、轉移和添加的酶的突變蛋白，并且優(yōu)選地包括相對于序列號3所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上的序列同一性的氨基酸序列(以下稱為“vejabg”)。

瓊脂糖分解β-半乳糖苷酶可以僅作用于瓊脂低聚糖例如瓊脂三糖的非還原端的半乳糖部分，并且可以來自弧菌屬(vibriosp.)菌株ejy3。

可以使用dna片段轉錄和翻譯瓊脂糖分解β-半乳糖苷酶，所述dna片段即參與包括各個編碼片段之間以及酶編碼區(qū)之前和之后的區(qū)域之間的插入序列的多肽生產的編碼基因。例如，瓊脂糖分解β-半乳糖苷酶可以表示為序列號4表示的序列，但是本發(fā)明不限于此。

最后，作為能夠將通過酶反應產生的新瓊脂二糖降解為d-半乳糖和3,6-脫水-l-半乳糖的α-新瓊脂二糖水解酶，本發(fā)明的酶的范圍可以包括序列號5所示的氨基酸序列，并且還包括具有水解新瓊脂二糖的活性的蛋白質作為具有酶的取代、缺失、轉移和添加中的至少一種的突變蛋白，并且優(yōu)選地包括相對于序列號3所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、90％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上的序列同一性的氨基酸序列(以下稱為“sdnabh”)。

α-新瓊脂二糖水解酶可以來自糖酵母降解2-40，但本發(fā)明不特別限于此。

α-新瓊脂二糖水解酶可以是dna片段，所述dna片段即參與包括各個編碼片段之間以及酶編碼區(qū)之前和之后的區(qū)域之間的插入序列的多肽生產的編碼基因。例如，α-新瓊脂二糖水解酶可以表示為序列號6所示的序列，但本發(fā)明不特別限于此。

在本發(fā)明中，句子“多肽相對于另一序列以特定比率(例如，80％、85％、90％、95％或99％)具有序列同一性”是指，當兩個序列比對時，序列以上述比率具有相同的氨基酸殘基。比對和百分比同源性或同一性可以使用本領域已知的任何合適的軟件程序來確定，例如在文獻[currentprotocolsinmolecularbiology(f.m.ausubel等(eds)1987supplement30section7.7.18)]。作為優(yōu)選的程序，可以使用gcgpile-up程序、fasta(pearson等，1988proc.natlacad.sciusa85:2444-2448)和blast(blastmanual,altschul等,natl.cent.biotechnol.inf.,natllib.med.(ncibnlmnih),bethesda,md和altschul等，1997nar25:3389-3402)。另一個優(yōu)選的比對程序是alignplus(科學和教育軟件，pa)，優(yōu)選地使用默認參數。本文使用的另一個序列軟件程序是可以在序列軟件包版本6.0(遺傳學計算機組，威斯康星大學，麥迪遜，wi)中使用的tfasta數據搜索程序。

本文使用的術語“蛋白質”和“多肽”可互換地用于本發(fā)明中。本發(fā)明使用常規(guī)的單字母或三字母代碼用于氨基酸殘基。

在本發(fā)明中，關于細胞、核酸、蛋白質或載體使用的術語“重組”是指通過引入異源核酸或蛋白質或改變原始核酸或蛋白質來修飾細胞、核酸、蛋白質或載體，或所述細胞衍生自由此修飾的細胞。也就是說，例如，重組細胞表達在原始(非重組)形式的細胞中不存在的基因、異常表達基因或表達根本不表達的原始基因。

本文中使用的術語“核酸”包括單鏈或雙鏈dna、rna及其化學變體。術語“核酸”和“多核苷酸”可以在本發(fā)明中互換使用。由于遺傳密碼簡并，至少一個密碼子可用于編碼特定氨基酸，并且本發(fā)明包括編碼特定氨基酸序列的多核苷酸。

用于描述核酸序列插入細胞中的術語“引入”是指“轉染”、“轉化”或“轉導”，包括將核酸序列整合入真核或原核細胞的描述，其中核酸序列整合到細胞(例如染色體、質粒、質體或線粒體dna)的基因組中、轉化成自主復制子或暫時表達。

瓊脂酶可以從糖酵母降解培養(yǎng)物的上清液中分離和純化，并且可以根據遺傳工程重組技術使用除了糖酵母降解以外的其它菌株或人工化學合成方法來產生和分離。

瓊脂糖分解β-半乳糖苷酶可以從弧菌屬(vibriosp.)菌株ejy3的培養(yǎng)物的上清液中分離和純化，并且可以根據基因工程重組技術使用除了弧菌屬(vibriosp.)菌株ejy3以外的菌株或人工化學合成方法來產生和分離。

α-新瓊脂二糖水解酶可以從糖酵母降解培養(yǎng)物的上清液中分離和純化，并且可以根據基因工程重組技術使用除弧菌屬(vibriosp.)菌株ejy3以外的菌株或人工化學合成方法來產生和分離。

當使用重組技術時，可以使用用于促進常規(guī)重組蛋白(例如抗生素抗性基因或可用于親和柱層析的報告蛋白或肽)表達的因子，這種技術對應的范圍可以通過本領域普通技術人員實現。

瓊脂酶、瓊脂糖分解β-半乳糖苷酶和α-新瓊脂二糖的水解中的每一個可以在20至40℃的溫度以及0至200rpm的速度的反應條件下進行30分鐘至7天。更具體地，反應可以在25至35℃下進行10至24小時。

在酶水解之后，接著可以用aminexhpx-87h柱(bio-rad，richmond，ca)的hplc(agilent1100，agilent，waldbronn，德國)對3,6-脫水-l-半乳糖和d-半乳糖進行定量。

當使用緩沖液作為預處理溶劑預處理瓊脂時，根據本發(fā)明的提高3,6-脫水-l-半乳糖和半乳糖的生產產率的方法可以獲得3,6-脫水-l-半乳糖和半乳糖的生產產率，類似于當使用瓊脂糖作為初始底物時的那些，并且使用大約100倍更少的用于中和的滴定溶劑(例如naoh)，因此該方法適合于大規(guī)模生產系統。

具體實施例

下面將參考實施例詳細描述本發(fā)明。然而，以下實施例僅用于舉例說明本發(fā)明，本發(fā)明的范圍不限于以下實施例。

<實施例1>重組酶的生產

使用pet-21a作為載體以及aga50d(emblid：adb81904)、nabh(emblid：adb81917)和abg(emblid：cp003241)酶在作為用于重組菌株的宿主的大腸桿菌(e.coli)bl21(de3)中生產重組蛋白。通過將鋪在50μg/ml添加氨芐青霉素的固體培養(yǎng)基上的宿主細胞轉化獲得的菌落再次接種在含有50μg/ml氨芐青霉素的luria肉湯(lb)平板中，然后在37℃和220rpm下溫育12小時(20ml×2)用于種子培養(yǎng)。然后，將細胞接種在兩個各含有1llb肉湯的3l錐形瓶中，在相同條件下振蕩培養(yǎng)3小時(od＝0.8)并在冰上冷卻1小時，然后加入0.1mmiptg以在16℃和120rpm下誘導表達12小時。將所得培養(yǎng)物離心分離(6000rpm，4℃，15分鐘)以收集細胞，然后將所得細胞懸浮于20mmtris緩沖液(tris-hcl，1mnaclph8)中，用超聲波儀裂解，并離心分離(16000rpm，4℃，60分鐘)。使用histraphp柱和histrapqff柱(gehealthcare，piscataway，nj，usa)從上清液中將酶分開和隔離，然后通過8％sds-page鑒定。

<實施例2>用緩沖液預處理瓊脂

為了比較在使用20mmtris-hcl(ph7.5)緩沖液的瓊脂預處理和使用3％乙酸的瓊脂糖預處理后的糖化，進行兩種類型的預處理。將1g(5％)瓊脂與20ml的20mmtris-hcl(ph7.5)緩沖液在170℃下混合5、10、15和20分鐘，并且1.4g(7％)瓊脂糖與20ml的3％乙酸混合并在130℃下微波處理30分鐘，從而進行水解。然后，使用1mnaoh將所得產物中和至ph7，使用蒸餾水將瓊脂和瓊脂糖的最終濃度調節(jié)至4.5％。

表1顯示了根據預處理條件和初始底物的3,6-脫水-l-半乳糖和d-半乳糖的最終生產產率、hmf產生的量和中和溶劑的量。

[表1]

如表1中所示，與使用乙酸的瓊脂糖預處理(130℃，30分鐘)相比，在使用20mmtris-hcl(ph7.5)緩沖液的瓊脂預處理(170℃，10分鐘)中顯示6倍更高量的hmf產生，中和中使用的1mnaoh的量為100倍以下，其更適合于大規(guī)模生產系統。此外，在上述條件下，在兩種情況下也顯示了類似的3,6-脫水-l-半乳糖和d-半乳糖的生產產率。

<實施例3>用緩沖液預處理的預處理產物的酶促糖化方法

將5ml實施例2的預處理產物依次與實施例1中制備的酶aga50d(19.0u)、abg(4.6u)和nabh(14.5u)反應。使每種酶在30℃下反應12小時，然后在沸水中滅活5分鐘。為了證實abg在該過程中的效果，只有兩種酶例如aga50d和nabh(不包括abg)在如上所述的相同條件下反應。

使用aminexhpx-87h柱(bio-rad，richmond，ca)通過hplc(agilent1100，agilent，waldbronn，德國)定量最終反應產物例如3,6-脫水-l-半乳糖和d-半乳糖。流動相是含有0.01m三氟乙酸的40％(v/v)乙腈(ch3cn)水溶液，并且在65℃和0.5ml/min的流速下進行分析。

aga50d的單位定義為在30℃下在20mmtris-hcl緩沖液(ph7)中1分鐘由瓊脂糖產生的瓊脂二糖的量。

abg和nabh酶的單位定義為在20mmtris-hcl緩沖液(ph7)中在30℃下1分鐘從瓊脂三糖和新瓊脂二糖產生的d-半乳糖的量。

如圖1中所示，預處理后，當用abg處理3,6-脫水-l-半乳糖和d-半乳糖兩者10分鐘時，檢測到最高水平的生產產率。此外，當使用abg時，3,6-脫水-l-半乳糖增加1.3倍，d-半乳糖增加1.8倍(參考圖2和3)。

[工業(yè)實用性]

本發(fā)明能夠應用于生物乙醇生產的領域。

序列表

<110>高麗大學校產學協力團

<120>通過使用緩沖液預處理提高瓊脂中單糖生產產率的方法

<130>g17u13c0056p/cn

<150>kr10-2014-0132401

<151>2014-10-01

<160>6

<170>patentin版本3.2

<210>1

<211>747

<212>prt

<213>糖酵母降解2-40

<400>1

metleupheaspphegluasnaspglnvalproserasnilehisphe

151015

leuasnalaargalaserilegluthrtyrthrglyileasnglyglu

202530

proserlysglyleulysleualametglnserlysglnhissertyr

354045

thrglyleualailevalprogluglnprotrpasptrpsergluphe

505560

thrseralaserleutyrpheaspilevalservalglyasphisser

65707580

thrglnphetyrleuaspvalthraspglnasnglyalavalphethr

859095

argserileaspileprovalglylysmetglnsertyrtyralalys

100105110

leuserglyhisaspleugluvalproaspserglyaspvalasnasp

115120125

leuasnleualaserglyleuargserasnproprothrtrpthrser

130135140

aspaspargglnphevaltrpmettrpglyvallysasnleuaspleu

145150155160

serglyilealalysileserleuservalglnseralamethisasp

165170175

lysthrvalileileaspasnileargileglnproasnproprogln

180185190

aspgluasnpheleuvalglyleuvalaspglupheglyglnasnala

195200205

lysvalasptyrlysglylysilehisserleuglugluleuhisala

210215220

alaargaspvalgluleualagluleuaspglylysprometproser

225230235240

argserlyspheglyglytrpleualaglyprolysleulysalathr

245250255

glytyrpheargthrglulysileasnglylystrpmetleuvalasp

260265270

progluglytyrprotyrphealathrglyleuaspileileargleu

275280285

serasnserserthrmetthrglytyrasptyraspglnalathrval

290295300

alaglnargseralaaspaspvalthrprogluaspserlysglyleu

305310315320

metalavalserglulysserphealathrarghisleualaserpro

325330335

thrargalaalametpheasntrpleuproasptyrasphisproleu

340345350

alaasnhistyrasntyrargargseralahisserglyproleulys

355360365

argglyglualatyrserphetyrseralaasnleugluarglystyr

370375380

glygluthrtyrproglysertyrleuasplystrparggluvalthr

385390395400

valaspargmetleuasntrpglyphethrserleuglyasntrpthr

405410415

aspproalatyrtyraspasnasnargileprophephealaasngly

420425430

trpvalileglyaspphelysthrvalserserglyalaaspphetrp

435440445

glyalametproaspvalpheaspprogluphelysvalargalamet

450455460

gluthralaargvalvalserglugluilelysasnserprotrpcys

465470475480

valglyvalpheileaspasnglulysserpheglyargproaspser

485490495

asplysalaglntyrglyileproilehisthrleuglyargproser

500505510

gluglyvalprothrargglnalapheserlysleuleulysalalys

515520525

tyrlysthrilealaalaleuasnasnalatrpglyleulysleuser

530535540

sertrpalaglupheaspleuglyvalaspvallysalaleuproval

545550555560

thraspthrleuargalaasptyrsermetleuleuseralatyrala

565570575

aspglntyrphelysvalvalhisglyalavalgluhistyrmetpro

580585590

asnhisleutyrleuglyalaargpheproasptrpglymetpromet

595600605

gluvalvallysalaalaalalystyralaaspvalvalsertyrasn

610615620

sertyrlysgluglyleuprolysglnlystrpalapheleualaglu

625630635640

leuasplysproserileileglygluphehisileglyalametasp

645650655

hisglysertyrhisproglyleuilehisalaalaserglnalaasp

660665670

argglyglumettyrlysasptyrmetglnservalileaspasnpro

675680685

tyrphevalglyalahistrppheglntyrmetaspserproleuthr

690695700

glyargalatyraspglygluasntyrasnvalglyphevalaspval

705710715720

thraspthrprotyrglnglumetvalaspalaalalysgluvalasn

725730735

alalysiletyrthrgluargleuglyserlys

740745

<210>2

<211>2244

<212>dna

<213>糖酵母降解2-40

<400>2

atgttattcgattttgaaaacgatcaagtcccttcaaatattcattttttaaatgcgcgt60

gcaagtatagaaacctataccggtataaatggcgagccgagtaaagggttaaagttggcg120

atgcagtccaagcagcacagttatactggccttgccattgtgccagagcagccttgggat180

tggagcgagtttacctctgctagcttgtatttcgatatagtcagtgttggcgatcattcc240

acacaattttatttagatgttaccgaccaaaatggcgccgtgtttacccgcagtattgat300

attccagtgggtaaaatgcaatcgtactacgccaagttaagcggtcacgatttagaagtg360

cccgatagtggagacgttaacgatttaaacctcgcctctggcttgcgttctaacccgcct420

acatggacatctgacgataggcagtttgtttggatgtggggagtgaaaaatttagatttg480

tcgggcattgctaaaatatcgctaagtgtgcaaagcgcaatgcacgataaaacagttatt540

atcgataatattcgtattcaacccaacccgccgcaagatgaaaacttccttgtcggtttg600

gtagacgagtttggccaaaacgccaaagttgattacaagggtaaaatccatagtttagaa660

gaattgcatgcagcgcgcgatgtggaactggccgagcttgatggcaagccaatgcctagt720

cgctctaagtttggcggttggttggccggccccaagctaaaagctacagggtactttcgc780

acagaaaaaattaacggtaaatggatgctagtagacccagaagggtacccttactttgct840

acgggtttagacattattcgcctatctaattcatctaccatgactggttacgattacgat900

caagctactgttgctcagcgctctgccgacgatgtaacacctgaagactcaaaaggttta960

atggcagtgagcgaaaaatcatttgctacgcgccacctagcatcgccaacacgagcggca1020

atgtttaactggttgccagattacgatcaccctctcgcaaatcattataactaccgtcgc1080

tctgcgcattccggcccactgaaacgcggtgaagcctacagcttctacagtgccaacctt1140

gagcgtaaatacggtgaaacttaccccggttcttacttggataagtggcgcgaagtaacg1200

gtagacagaatgctaaactggggctttacctcgctaggcaactggactgacccagcatat1260

tacgacaacaatcgcataccgtttttcgcgaatggttgggtaataggggattttaaaacc1320

gtatctagcggtgcggatttttggggcgcaatgccagatgtattcgacccagaatttaaa1380

gtgcgcgctatggaaacggcacgcgtggtttcagaagaaattaaaaatagcccttggtgc1440

gtaggggtatttatcgataacgaaaaaagcttcggtcgccccgattccgataaggcgcaa1500

tacggtattcccattcataccctcggtcgcccaagcgaaggtgtgcctactaggcaggcg1560

tttagtaagctgcttaaagccaaatacaaaactatagccgcgttaaacaatgcctggggg1620

ttaaagcttagttcttgggctgagtttgatttgggcgtagatgtaaaagcgctgccggta1680

accgatactctgcgcgcagattactcaatgttactttcggcctatgcggaccaatatttt1740

aaggtggtacacggcgcggttgaacattacatgccgaaccacttgtatttaggcgcacgc1800

tttcctgattggggaatgccaatggaggtagtgaaagctgccgcaaaatacgccgatgtg1860

gttagctataattcctacaaagagggcttgcctaagcagaagtgggcttttttagcagag1920

ctagataagccgagtataatcggtgagtttcacataggtgctatggatcacggttcgtat1980

caccccggtttaattcacgctgcgtcgcaggccgatagaggtgaaatgtacaaagattat2040

atgcaatcggtaattgataacccctacttcgtaggcgcgcactggttccagtatatggat2100

tcgccattaacgggcagagcttatgatggtgaaaactacaatgtgggttttgtggatgtt2160

accgacacgccgtaccaagaaatggtggatgcagcaaaagaagtaaatgcgaaaatatac2220

accgaaaggctaggcagcaaataa2244

<210>3

<211>806

<212>prt

<213>弧菌屬ejy3

<400>3

methisasnserproargserthrthrleupheasnaspasntrpleu

151015

pheglnleualalysasplysproasnthrlysglntrpserthrval

202530

thrleuprohisasptrpservalalaseralapheserproglntyr

354045

aspglyalathrglytyrleuproglyglyileglytrptyrlyslys

505560

glnphelysasnproleuasnlyshistyrserargcysileleuval

65707580

pheaspglyiletyrasnasnalathrileasnileasnglytyrasp

859095

ilehispheglnalatyrglytyralapropheasnilegluilethr

100105110

asptyrleulysseraspasnvalilethrilehisvalaspargarg

115120125

argtyrileaspserargtrptyrthrglyserglyiletyrargasp

130135140

ileglumetvalleuthrlysaspvalphevalproiletrpgluasn

145150155160

hisilelysalaservalserserasnglnileglyhisilehisgln

165170175

glnleumetileglualalysthrlysthrhistyrleuthrileval

180185190

serargleuleugluproasnseraspasncysvalalathralaarg

195200205

thrhisargservalasnasnarggluvalcysaspleugluleuthr

210215220

cysaspglnleuserleutrpserproaspserproileleutyrlys

225230235240

leugluthrglniletyrgluasnglycysvalileasplysvalser

245250255

gluasnileglypheargserileglupheserprogluglnglyphe

260265270

pheleuasnglymetprothrlysvalargglyvalcysleuhishis

275280285

aspglyglyleuvalglyalaalavalproaspgluiletrpilearg

290295300

argleuserlysleulysglncysglyvalasnalaileargileala

305310315320

hisasnproalaserlysargleuleuhisleucysaspthrmetgly

325330335

pheleuvalglnaspgluphepheaspglutrpasptyrprolysasp

340345350

lysargleuasnmetglyasnglnhisaspaspphepheserglncys

355360365

tyrthrgluhispheglnthrargalalysthraspleucysasnthr

370375380

leulyscyshisileasnhisproserilephemettrpserilegly

385390395400

asngluileglutrpthrtyrproargasnvalglualathrglyphe

405410415

pheaspalasertrpaspglyasntyrphetrpserleuproproasn

420425430

serproaspgluilelysasplysleulysasnleuproglnhisthr

435440445

tyraspileglylysthralaasnlysleualaargtrpvallysala

450455460

ileaspglnthrargproilethralaasncysileleuproserser

465470475480

sertyrhisserglytyralaaspalaleuaspvalileglypheser

485490495

tyrargargvalvaltyrasptyrglyhisgluileargproasnleu

500505510

proileileglyasngluasnleuproglntrphisglutrplysala

515520525

valleugluargasnhisvalserglyleupheleutrpthrglyile

530535540

asntyrmetglygluserhisglylystrpprovalargthrthrasp

545550555560

serglyleuleuaspthralaglypheglulysprosertyralaleu

565570575

phelysserleutrpthraspgluprotyrvallysvalphethrgln

580585590

argalaaspleuthrglnleulyspheaspgluglnthrphevalala

595600605

phegluhisaspgluasnalatrpglnlyslysleutrpvaltrpasp

610615620

gluargasnserhistrpasntyrgluasngluglntrpvalthrile

625630635640

glualatyrserasncysproglnvalglnleutyrleuasnaspglu

645650655

leuvalglythrglnglnleuglulysglnileaspargvalphearg

660665670

trpalaleuprotyrargalaglylysileserleuvalglyleulys

675680685

asnaspvalgluvalthrargaspgluilevalthrserglyvalpro

690695700

arglysileserilevalaspgluthrhisgluglysersersertyr

705710715720

argglnleuilevalglnmetleuasplysaspasnhisprovalser

725730735

hisgluglualaleuleuglupheargvalargglycysglutrpile

740745750

glyalaaspasnglyserileserserileasnalatyrasnserpro

755760765

thrilealathrarghisglyargvalleualavalvallysserser

770775780

glnglyglnserglyaspilegluiletyrserasnserglyvallys

785790795800

alaserpheserleuleu

805

<210>4

<211>2421

<212>dna

<213>弧菌屬ejy3

<400>4

atgcacaattcaccgagaagtaccacattatttaacgacaactggctttttcagttggca60

aaagataaaccgaataccaaacaatggtcgacggttacgcttccccacgattggagtgta120

gcttcggccttttctccacagtatgatggagccacgggttacctacctgggggaattggt180

tggtacaaaaagcagtttaaaaatcctctaaataaacactattcgcgctgtatactcgtt240

tttgacgggatttacaacaatgcaaccattaatatcaatggctatgatatacatttccaa300

gcgtatggttatgcgccattcaatatagaaattactgattacttgaaatcagacaatgta360

attactatccatgtcgatagacgcaggtatatcgacagtaggtggtatacaggttcaggt420

atttaccgtgatatagaaatggttctaactaaggatgtgtttgttcctatttgggaaaat480

catataaaagcttccgttagctcaaaccagattggccatatccaccagcaactgatgatt540

gaagcaaaaacgaaaacgcattacttgacaattgtaagtcgtttgctcgagcccaattcc600

gataattgcgtagctacagctcgaacgcatcgttcagtgaacaatcgagaagtatgtgat660

ttagaactaacgtgtgatcaactgagcctttggagcccagattcaccaattctttataag720

ttggaaactcaaatctacgaaaatggctgcgtcattgataaggtatctgaaaacattggt780

tttcgtagcatagagttttcgccagaacaggggtttttcctcaatgggatgccaactaaa840

gtccgtggggtctgccttcatcatgatggcggactcgttggcgctgccgtacctgatgaa900

atatggatacgtcggttgtcaaagctcaaacaatgtggtgtaaatgcaataagaatcgca960

cacaacccagcctccaagcgtctattgcacctctgtgacacgatgggatttctggtgcag1020

gatgagttttttgacgagtgggattatcctaaagataaacgccttaacatgggcaaccaa1080

cacgatgactttttcagccaatgttacaccgagcactttcaaacccgagcaaaaaccgat1140

ctttgtaatacgttgaaatgccatattaaccatccatcaatattcatgtggagtattggc1200

aacgaaattgagtggacctacccacgcaacgtcgaagcaacgggcttttttgatgcaagt1260

tgggatgggaattatttctggagcttaccacctaactctcccgatgaaataaaagataaa1320

ctcaaaaatttgccacagcacacttatgatattgggaaaactgcgaacaagcttgctcgt1380

tgggtaaaagctatcgatcaaactcgaccgattactgccaactgtatccttccatcatcc1440

agctaccattcaggttacgccgacgcgctcgatgtaattggatttagttatcgacgtgtt1500

gtatatgattatgggcatgaaatcagacctaacctgccgataatcggtaatgaaaattta1560

cctcaatggcatgaatggaaagcagtgcttgaacgcaaccatgtatccggattgtttctt1620

tggactggaatcaattatatgggagaatctcatggtaaatggcctgtaagaaccactgac1680

agcggcctgctagacaccgctgggtttgaaaaaccaagttatgcgctttttaaatcgctg1740

tggacagacgaaccttatgtcaaagtatttactcaacgagcagacttaacacaactgaag1800

tttgacgagcaaacttttgttgcctttgaacatgatgaaaatgcttggcaaaaaaaatta1860

tgggtctgggacgaaagaaactcgcactggaattatgaaaatgagcaatgggtcactatc1920

gaagcctatagcaactgtccgcaggtacaactctacctcaacgatgagttggttggaacc1980

caacagttagaaaagcaaatcgacagagtctttcgttgggccttaccatatagagcagga2040

aagatctctctggttggtttaaagaacgacgtagaggtaactagagatgaaattgtcacg2100

tctggagtgccgaggaagatctcgattgtagatgaaacccatgaaggttcaagctcatac2160

cggcaacttatagtccagatgcttgataaagacaaccatccagtgagtcatgaagaagca2220

ttgttagagtttcgtgttcgcggttgtgaatggattggagccgataatggcagtatatct2280

tctatcaacgcatataatagcccaacgattgctacacgtcatggcagagttttagcagtt2340

gtaaaatcatcgcagggtcaaagtggtgatatcgaaatttactcaaattcaggagtgaaa2400

gcctctttttcactactttaa2421

<210>5

<211>368

<212>prt

<213>糖酵母降解2-40

<400>5

metseraspserlysvalasnlyslysleuserlysalaserleuarg

151015

alailegluargglytyraspglulysglyproglutrpleupheglu

202530

pheaspilethrproleulysglyaspleualatyrglugluglyval

354045

ileargargaspproseralavalleulysvalaspaspglutyrhis

505560

valtrptyrthrlysglygluglygluthrvalglypheglyserasp

65707580

asnprogluasplysvalpheprotrpasplysthrgluvaltrphis

859095

alathrserlysasplysilethrtrplysgluileglyproalaile

100105110

glnargglyalaalaglyalatyraspaspargalavalphethrpro

115120125

gluvalleuarghisasnglythrtyrtyrleuvaltyrglnthrval

130135140

lysalaprotyrleuasnargserleugluhisilealailealatyr

145150155160

seraspserpropheglyprotrpthrlysseraspalaproileleu

165170175

serprogluasnaspglyvaltrpaspthraspgluaspasnargphe

180185190

leuvallysglulysglyserpheaspserhislysvalhisasppro

195200205

cysleumetphepheasnasnargphetyrleutyrtyrlysglyglu

210215220

thrmetglyglusermetasnmetglyglyarggluilelyshisgly

225230235240

valalailealaaspserproleuglyprotyrthrlysserglutyr

245250255

asnproilethrasnserglyhisgluvalalavaltrpprotyrlys

260265270

glyglymetalathrmetleuthrthraspglyproglulysasnthr

275280285

cysglntrpalagluaspglyileasnpheaspilemetserhisile

290295300

lysglyalaproglualavalglyphepheargprogluseraspser

305310315320

aspaspproileserglyileglutrpglyleuserhislystyrasp

325330335

alasertrpasntrpasntyrleucysphephelysthrargarggln

340345350

valleuaspalaglysertyrglnglnthrglyaspserglyalaval

355360365

<210>6

<211>1107

<212>dna

<213>糖酵母降解2-40

<400>6

atgagcgattcaaaagtaaataaaaaattgagtaaagctagcctgcgagccatagagcgc60

ggctacgatgaaaaggggcctgaatggctgtttgagtttgatattaccccactaaaaggc120

gacttagcctacgaagaaggcgtaattcgtcgagaccccagcgcagtattaaaggtggac180

gatgaatatcacgtttggtacaccaagggcgaaggtgaaacagtaggcttcggcagcgac240

aaccccgaagacaaagtcttcccatgggataaaacagaagtttggcacgccacctctaaa300

gataagattacttggaaagaaattggccctgccatacaacgcggcgcagctggggcatat360

gatgaccgtgcagtgttcacccccgaagtcctgcgccataacggcacctactaccttgta420

tatcaaacggtaaaagcgccctacttaaaccgatcgctagagcatatagccatcgcatac480

agcgattccccctttggcccatggaccaaatccgatgcgccaattttaagcccagaaaat540

gacggcgtttgggatacggacgaagacaatcgatttttagtaaaagagaaaggcagtttc600

gatagccacaaagtacacgacccctgcttaatgttttttaacaatcgtttctacctgtat660

tacaaaggcgagactatgggcgaaagcatgaacatgggcggcagagaaataaaacacggt720

gtagccattgccgactcgccacttgggccctacaccaaaagcgaatacaaccctattacc780

aatagtggccatgaagttgccgtatggccctacaaaggtggaatggccaccatgctaacc840

accgacgggccagaaaaaaacacctgccagtgggcagaagacggcattaactttgacatt900

atgtcgcatataaaaggcgcaccagaagcagtaggtttttttagaccagaaagcgatagc960

gacgaccctataagcggcattgaatgggggctaagccacaagtacgacgccagctggaac1020

tggaactatctatgcttttttaaaacgcgtcgacaagttttagatgcaggtagctatcag1080

caaacaggcgattccggagcagtataa1107