本發(fā)明涉及能夠以高純度分離阿洛酮糖的阿洛酮糖的制備方法。

背景技術(shù)：

阿洛酮糖(d-psicose)為果糖(d-fructose)的3號(hào)碳的差向異構(gòu)體(epimer)，雖然像普通糖類一樣具有甜味，但由于無(wú)法在人體內(nèi)代謝，因而屬于因卡路里幾乎為零而對(duì)糖尿病及肥胖患者而言可作為代替白糖的功能性甜味劑來(lái)使用的功能性糖。并且，具有通過(guò)抑制在肝臟參與脂質(zhì)合成的酶的活性來(lái)減少腹部肥胖的功能，是當(dāng)前作為糖尿病和動(dòng)脈硬化治療劑來(lái)進(jìn)行研究的糖。

像這樣，隨著阿洛酮糖作為甜味劑備受矚目，在食品產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域，開(kāi)發(fā)可有效生產(chǎn)阿洛酮糖的方法的必要性逐漸增加。由于在天然物質(zhì)內(nèi)的糖蜜處理過(guò)程或葡萄糖異構(gòu)化反應(yīng)過(guò)程中存在非常少量的阿洛酮糖，因而現(xiàn)有的阿洛酮糖生產(chǎn)主要通過(guò)化學(xué)過(guò)程來(lái)實(shí)現(xiàn)。比利克(bilik)等人曾開(kāi)發(fā)利用鉬酸(molybdicacid)離子的催化作用來(lái)從果糖生產(chǎn)阿洛酮糖的技術(shù)。麥克唐納(mcdonald)通過(guò)對(duì)1,2:4,5-二-o-丙酮縮甘油-β-d-果糖(1,2:4,5-di-o-ispropylidene-bata-d-fructopyranose)進(jìn)行三步驟化學(xué)處理過(guò)程來(lái)生產(chǎn)了阿洛酮糖。并且，多納(doner)通過(guò)對(duì)乙醇、三乙胺及果糖一同進(jìn)行加熱的方法生產(chǎn)了阿洛酮糖。但是，這些通過(guò)化學(xué)方法生產(chǎn)阿洛酮糖的方法花費(fèi)很多費(fèi)用，相反，存在生產(chǎn)效率低、產(chǎn)生大量副產(chǎn)物的問(wèn)題。

作為基于生物學(xué)方法實(shí)現(xiàn)的阿洛酮糖生產(chǎn)方法，肯·伊茲莫里(kenizumori)等人證實(shí)了可利用微生物細(xì)胞反應(yīng)來(lái)從半乳糖醇(galacitol)、d-塔格糖(d-tagatose)或d-塔羅糖醇(d-talitol)等生產(chǎn)阿洛酮糖。但是，這些底物屬于自然界中非常稀缺的糖或糖醇，具有成本高的缺點(diǎn)。

酶轉(zhuǎn)換方法有在重組大腸桿菌中生產(chǎn)并純化分離微生物菊苣假單胞菌st-24(pseudomonascichoriist-24)的d-塔格糖-3-差向異構(gòu)酶(d-tagatose-3-epimerase)來(lái)使果糖酶轉(zhuǎn)換為阿洛酮糖的方法，肯·伊茲莫里等人曾利用固定d-塔格糖-3-差向異構(gòu)酶的反應(yīng)系統(tǒng)來(lái)以25％的轉(zhuǎn)換率生產(chǎn)了阿洛酮糖。

根據(jù)這種現(xiàn)有技術(shù)，為了從果糖生產(chǎn)阿洛酮糖，以往以通過(guò)純化酶，固定所純化的酶來(lái)提高阿洛酮糖生產(chǎn)率的方向進(jìn)行了研究。但這種酶純化過(guò)程實(shí)際需要很多時(shí)間和費(fèi)用。

另一方面，果糖具有與阿洛酮糖類似的物性，從而即使生產(chǎn)阿洛酮糖，也存在難以從果糖中分離其的問(wèn)題。

因此，需要能夠以高效率生產(chǎn)阿洛酮糖且容易分離其的阿洛酮糖的生產(chǎn)方法。

現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)

韓國(guó)公開(kāi)專利第2013-0029754號(hào)

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

技術(shù)問(wèn)題

本發(fā)明的目的在于，提供能夠以高純度分離阿洛酮糖的阿洛酮糖的制備方法。

本發(fā)明的目的在于，提供阿洛酮糖的生產(chǎn)能力得到改善的阿洛酮糖的制備方法。

解決問(wèn)題的方案

本發(fā)明的一實(shí)施方式提供阿洛酮糖的制備方法，其包括：在果糖及阿洛酮糖的混合物中添加甘露醇脫氫酶來(lái)使上述果糖轉(zhuǎn)換為甘露醇的步驟；以及從上述混合物中分離上述甘露醇的步驟。

作為阿洛酮糖的代表性的制備方法，可例舉利用催化劑來(lái)將果糖轉(zhuǎn)換為阿洛酮糖的化學(xué)方法、將對(duì)催化從果糖到阿洛酮糖的轉(zhuǎn)換的酶進(jìn)行編碼的基因?qū)胗谖⑸?，?lái)從中將果糖轉(zhuǎn)換為阿洛酮糖的生物學(xué)方法等。

這些方法具有均將果糖用作底物的共同點(diǎn)，果糖和阿洛酮糖的物性類似，從而存在難以從反應(yīng)混合物中分離阿洛酮糖的問(wèn)題。

但是，本發(fā)明人著眼于可使果糖和阿洛酮糖的混合物與甘露醇脫氫酶發(fā)生反應(yīng)來(lái)將果糖轉(zhuǎn)換為甘露醇，并從甘露醇中分離阿洛酮糖，來(lái)更容易且高效率地分離阿洛酮糖的情況，從而完成了本發(fā)明。

以下，詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，首先，在果糖及阿洛酮糖的混合物中添加甘露醇脫氫酶來(lái)使上述果糖轉(zhuǎn)換為甘露醇。

上述果糖及阿洛酮糖的混合物是通過(guò)化學(xué)或生物學(xué)方法來(lái)將果糖轉(zhuǎn)換為阿洛酮糖之后的經(jīng)轉(zhuǎn)換的阿洛酮糖和未轉(zhuǎn)換的果糖的混合物。

對(duì)此，本發(fā)明還可包括如下步驟：使作為底物的果糖與其差向異構(gòu)酶發(fā)生反應(yīng)，來(lái)制備上述果糖及阿洛酮糖的混合物。

上述差向異構(gòu)酶可以為阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶，具體地，可以為來(lái)源于根癌土壤桿菌(agrobacteriumtumefaciens)的阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶或來(lái)源于糞厭氧棒狀菌(anaerostipescaccae)的阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶。

對(duì)上述差向異構(gòu)酶進(jìn)行編碼的基因可以為對(duì)來(lái)源于序列1的根癌土壤桿菌的阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶進(jìn)行編碼的基因或?qū)?lái)源于序列2的糞厭氧棒狀菌的阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶進(jìn)行編碼的基因。

來(lái)源于根癌土壤桿菌的阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶可具有序列3的氨基酸序列，來(lái)源于糞厭氧棒狀菌的阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶可具有序列4的氨基酸序列。

差向異構(gòu)酶具有更優(yōu)秀的高溫穩(wěn)定性，從這個(gè)方面來(lái)看，優(yōu)選地，對(duì)差向異構(gòu)酶進(jìn)行編碼的基因可以為對(duì)序列5的阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶的氨基酸序列進(jìn)行編碼的基因。

上述序列5的氨基酸序列為來(lái)源于根癌土壤桿菌的阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶的氨基酸序列中的第33個(gè)氨基酸被亮氨酸取代且第213個(gè)氨基酸被半胱氨酸取代的序列，其熱穩(wěn)定性優(yōu)秀。

本發(fā)明的發(fā)明人確認(rèn)了來(lái)源于梭菌屬的阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶具有優(yōu)秀的熱穩(wěn)定性，參照?qǐng)D7，在熱穩(wěn)定性高的來(lái)源于梭菌屬的阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶的情況下，一個(gè)氨基酸具有與其相對(duì)應(yīng)的序列，或具有如上所述的兩個(gè)序列。

對(duì)此，不僅是來(lái)源于根癌土壤桿菌的阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶，來(lái)源于其他菌株的阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶也被確認(rèn)到與來(lái)源于上述根癌土壤桿菌的阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶的氨基酸序列的第33個(gè)氨基酸、第213個(gè)氨基酸相對(duì)應(yīng)的氨基酸序列為對(duì)提高熱穩(wěn)定性重要的序列。

這種氨基酸序列的具體的例可例舉在序列6的氨基酸序列中第32個(gè)氨基酸被亮氨酸取代或第196個(gè)氨基酸被半胱氨酸取代的序列。序列6為對(duì)圖7中的用方框所標(biāo)注的序列進(jìn)行排列的序列，是在本發(fā)明中所使用的根癌土壤桿菌、糞厭氧棒狀菌、鮑氏梭菌(clostridiumbolteae)、來(lái)源于門冬蟲(chóng)梭菌(clostridiumhylemonae)的阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶氨基酸序列(序列3、序列4、序列9、序列10)的共同堿基序列。因此，上述微生物可以為被對(duì)上述氨基酸序列進(jìn)行編碼的基因取代的，但并不限定于此。

并且，同樣，從優(yōu)秀的高溫穩(wěn)定性、阿洛酮糖的生產(chǎn)能力方面來(lái)看，差向異構(gòu)酶可以為來(lái)源于梭菌屬的阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶，對(duì)其進(jìn)行編碼的基因可以為對(duì)來(lái)源于序列7的鮑氏梭菌的阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶進(jìn)行編碼的基因或?qū)?lái)源于序列8的門冬蟲(chóng)梭菌的阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶進(jìn)行編碼的基因。從將高溫穩(wěn)定性極大化的方面來(lái)看，優(yōu)選地，可以為對(duì)來(lái)源于序列8的門冬蟲(chóng)梭菌的阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶進(jìn)行編碼的基因。

來(lái)源于鮑氏梭菌的阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶可具有序列9的氨基酸序列，來(lái)源于門冬蟲(chóng)梭菌的阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶可具有序列10的氨基酸序列。

在所例示的上述阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶中，來(lái)源于糞厭氧棒狀菌的阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶、具有在序列6的氨基酸序列中的第32個(gè)氨基酸被亮氨酸取代或第196個(gè)氨基酸被半胱氨酸取代的序列的阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶、來(lái)源于鮑氏梭菌的阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶及來(lái)源于門冬蟲(chóng)梭菌的阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶的表示最佳活性的ph為7以下。

果糖和差向異構(gòu)酶的反應(yīng)可在20℃至90℃的溫度下執(zhí)行，從阿洛酮糖的生產(chǎn)能力極大化方面來(lái)看，優(yōu)選地，可在40℃至90℃的溫度下執(zhí)行。具體地，例如，可以為40℃至50℃、40℃至60℃、40℃至70℃、40℃至80℃、40℃至90℃、45℃至60℃、45℃至70℃、45℃至80℃、45℃至90℃、50℃至70℃、50℃至80℃、50℃至90℃、55℃至60℃、55℃至70℃、55℃至80℃、55℃至90℃、60℃至70℃、60℃至80℃、60℃至90℃、70℃至80℃、70℃至90℃、75℃至80℃、75℃至90℃、80℃至90℃等。若反應(yīng)溫度大于90℃，則差向異構(gòu)酶或后述的微生物有可能被熱損傷或變性。

若上述反應(yīng)在40℃以上的溫度下執(zhí)行，則差向異構(gòu)酶有可能被熱損傷或變性，因而優(yōu)選地，上述反應(yīng)在微生物內(nèi)執(zhí)行。隨著反應(yīng)溫度增加，阿洛酮糖生產(chǎn)能力更增加，但差向異構(gòu)酶熱變性而有可能難以將其實(shí)現(xiàn)，但是，在微生物內(nèi)執(zhí)行上述反應(yīng)的情況下，差向異構(gòu)酶由微生物保護(hù)，因而可在高溫條件下執(zhí)行反應(yīng)。

在本說(shuō)明書(shū)中，術(shù)語(yǔ)“微生物”可以為可在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的細(xì)胞。

上述微生物可內(nèi)在性表達(dá)上述差向異構(gòu)酶或通過(guò)轉(zhuǎn)化來(lái)表達(dá)上述差向異構(gòu)酶。在此情況下，可在微生物內(nèi)生成差向異構(gòu)酶來(lái)通過(guò)上述果糖與差向異構(gòu)酶的微生物內(nèi)反應(yīng)連續(xù)執(zhí)行阿洛酮糖的生產(chǎn)。

在上述微生物轉(zhuǎn)化為對(duì)差向異構(gòu)酶進(jìn)行編碼的基因來(lái)表達(dá)差向異構(gòu)酶的情況下，對(duì)上述差向異構(gòu)酶進(jìn)行編碼的基因可以為對(duì)來(lái)源于序列1的根癌土壤桿菌的阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶進(jìn)行編碼的基因或?qū)?lái)源于序列2的糞厭氧棒狀菌的阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶進(jìn)行編碼的基因。

差向異構(gòu)酶具有更優(yōu)秀的高溫穩(wěn)定性，從這個(gè)方面來(lái)看，優(yōu)選地，對(duì)差向異構(gòu)酶進(jìn)行編碼的基因可以為對(duì)序列5的阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶的氨基酸序列進(jìn)行編碼的基因。

并且，同樣，從優(yōu)秀的高溫穩(wěn)定性、阿洛酮糖的生產(chǎn)能力方面來(lái)看，對(duì)差向異構(gòu)酶進(jìn)行編碼的基因可以為對(duì)來(lái)源于序列7的鮑氏梭菌的阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶進(jìn)行編碼的基因或?qū)?lái)源于序列8的門冬蟲(chóng)梭菌的阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶進(jìn)行編碼的基因。

上述微生物為原核細(xì)胞或真核細(xì)胞，可在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，并可在上述的高溫條件下進(jìn)行培養(yǎng)。上述微生物例如可以為細(xì)菌、霉或它們的組合。細(xì)菌可以為革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌、革蘭氏陰性細(xì)菌或它們的組合，從提高阿洛酮糖生產(chǎn)率方面來(lái)看，優(yōu)選地，可以為革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。革蘭氏陰性細(xì)菌可以為埃希氏菌屬(escherichia)。革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌可以為芽孢桿菌屬、棒狀桿菌屬、放線菌屬、乳酸菌或它們的組合。霉可以為酵母、克魯維酵母屬或它們的組合。

在本發(fā)明的阿洛酮糖的生產(chǎn)方法中，若果糖與差向異構(gòu)酶的反應(yīng)在40℃以上的溫度下執(zhí)行，則微生物優(yōu)選為熱穩(wěn)定性高的高溫型微生物(thermophiles)。例如，可以為棒狀桿菌屬、放線菌屬，更優(yōu)選為谷氨酸棒狀桿菌，最優(yōu)選為向谷氨酸棒狀桿菌atcc13032導(dǎo)入對(duì)上述差向異構(gòu)酶進(jìn)行編碼的基因的微生物。

埃希氏菌屬微生物可以為大腸桿菌，具體地，可以為向dh5α、mg1655、bl21(de)、s17-1、xl1-blue、bw25113或它們的組合導(dǎo)入對(duì)差向異構(gòu)酶進(jìn)行編碼的基因的微生物。

并且，上述大腸桿菌可以為對(duì)內(nèi)在性6-磷酸果糖激酶進(jìn)行編碼的基因及由阿洛糖代謝操縱子(allosemetabolicoperon)形成的一個(gè)區(qū)域?qū)崿F(xiàn)非活性化的菌。

對(duì)上述6-磷酸果糖激酶進(jìn)行編碼的基因例如可以為具有序列11的核苷酸序列的基因，6-磷酸果糖激酶可以為具有序列12的氨基酸序列的酶。

構(gòu)成上述阿洛糖代謝操縱子的基因?yàn)閞pib、alsr、alsb、alsa、alsc、alse及alsk，可以為其中的一個(gè)以上的基因?qū)崿F(xiàn)非活性化的基因。

上述rpib、alsr、alsb、alsa、alsc、alse及alsk基因例如可以為分別具有序列13、序列14、序列15、序列16、序列17、序列18及序列19的核苷酸序列的基因。

上述rpib、alsr、alsb、alsa、alsc、alse及alsk基因可以為分別對(duì)序列20、序列21、序列22、序列23、序列24、序列25及序列26的氨基酸序列進(jìn)行編碼的基因。

術(shù)語(yǔ)“非活性化”意味著上述基因的表達(dá)減少或未形成表達(dá)的情況。上述“非活性化”可通過(guò)本領(lǐng)域公知的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。例如，可通過(guò)同源重組(homologuousrecombination)來(lái)實(shí)現(xiàn)非活性化。上述同源重組例如可由轉(zhuǎn)位子突變(transposonmutagenesis)或p1轉(zhuǎn)導(dǎo)(p1transduction)介導(dǎo)。

棒狀桿菌屬微生物可以為谷氨酸棒狀桿菌，具體地，可以為向谷氨酸棒狀桿菌atcc13032導(dǎo)入對(duì)差向異構(gòu)酶進(jìn)行編碼的基因的微生物。

棒狀桿菌屬微生物可以為將內(nèi)在性d-果糖轉(zhuǎn)換為d-果糖1-磷酸鹽并使作為向菌體內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)的pts轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的ptsf(eiifru、frua、ncgl1861、gi:19553141、ec2.7.1.69)基因缺損或?qū)崿F(xiàn)非活性化的微生物。

ptsf基因可以為具有序列27的核苷酸序列的基因，也可以為對(duì)序列28的氨基酸序列進(jìn)行編碼的基因。

由于阿洛酮糖從d-果糖生成，因而若使上述基因缺損或?qū)崿F(xiàn)非活性化，則可抑制果糖的磷酸化，因而可明顯改善阿洛酮糖的生成效率。

并且，棒狀桿菌屬微生物可以為使對(duì)甘露醇2-脫氫酶(mannitol2-dehydrogenase)進(jìn)行編碼的mtld(ncgl0108、gi:19551360、ec1.1.1.67)基因缺損或?qū)崿F(xiàn)非活性化的微生物。

mtld基因可以為具有序列29的核苷酸序列的基因，也可以為對(duì)序列30的氨基酸序列進(jìn)行編碼的基因。

若上述果糖與其差向異構(gòu)酶的反應(yīng)在微生物內(nèi)執(zhí)行，則可在包含果糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物。

上述培養(yǎng)基可以為2yt培養(yǎng)基、lb培養(yǎng)基、tb培養(yǎng)基等的包含酵母提取物和氮源的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基。

培養(yǎng)基所包含的果糖的濃度不受特別限制，例如，能夠以1％(w/v)至80％(w/v)的濃度包含，在上述范圍內(nèi)，例如，可以為1％(w/v)至35％(w/v)、10％(w/v)至80％(w/v)、20％(w/v)至80％(w/v)、30％(w/v)至80％(w/v)、40％(w/v)至80％(w/v)等。優(yōu)選地，可以為1％(w/v)至50％(w/v)。

并且，培養(yǎng)基可以為包含葡萄糖、甘油等的碳源、包含氨、尿素(urea)等的氮源、鈉、鉀、鈣、鎂、錳、鈷等的必要金屬離子、包含維生素等的在本領(lǐng)域通常使用的規(guī)定(defined)培養(yǎng)基。

上述培養(yǎng)可以為連續(xù)、半連續(xù)或批量(batch)形式的培養(yǎng)。

上述微生物可在包含果糖的培養(yǎng)基中以使菌體的濁度(在600nm的吸光度下測(cè)定的測(cè)定值，以下稱為od600)達(dá)到0.01至300的濃度接種，例如，菌體的濁度可達(dá)到1至300、10至300、20至300、5至300或40至300。通過(guò)使用包含這種高濃度的上述酶的菌體，可在包含高濃度果糖的培養(yǎng)基中使果糖有效地轉(zhuǎn)換為阿洛酮糖。

上述培養(yǎng)可通過(guò)還添加用于誘導(dǎo)對(duì)差向異構(gòu)酶進(jìn)行編碼的基因的表達(dá)的物質(zhì)來(lái)執(zhí)行。

用于誘導(dǎo)基因的表達(dá)的物質(zhì)不受特別限制，可以為在本領(lǐng)域通常使用的物質(zhì)。

在本發(fā)明的阿洛酮糖的生產(chǎn)方法中，可在僅包含作為底物的果糖和用于供給輔助因子的無(wú)機(jī)鹽的培養(yǎng)基中生產(chǎn)阿洛酮糖?？稍趦H包含作為底物的果糖和用于供給輔助因子的無(wú)機(jī)鹽的培養(yǎng)基中執(zhí)行上述反應(yīng)。上述無(wú)機(jī)鹽例如可以為錳鹽或鈷鹽。從呈現(xiàn)更加得到改善的阿洛酮糖的生產(chǎn)速度的方面來(lái)看，優(yōu)選為鈷鹽，從可將所生產(chǎn)的阿洛酮糖安全地用作食品等的方面來(lái)看，優(yōu)選為錳鹽。

僅包含果糖和無(wú)機(jī)鹽的培養(yǎng)基可以為果糖和無(wú)機(jī)鹽溶解于溶劑的液體培養(yǎng)基。溶劑例如可以為水。

當(dāng)利用微生物來(lái)生產(chǎn)阿洛酮糖時(shí)，除了阿洛酮糖之外，培養(yǎng)基中還會(huì)生成微生物的有機(jī)酸等的代謝物等，因而培養(yǎng)基有可能逐漸被酸性化。由于本發(fā)明的僅包含果糖和無(wú)機(jī)鹽的培養(yǎng)基并不包含緩沖溶液，因而更優(yōu)選地，使用最佳活性ph低的(例如，ph為7以下)阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶。

在上述果糖與差向異構(gòu)酶發(fā)生反應(yīng)之前，本發(fā)明的阿洛酮糖的生產(chǎn)方法還可包括如下的步驟：在未包含上述果糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述微生物，來(lái)以使上述微生物具有休眠細(xì)胞的方式進(jìn)行誘導(dǎo)。

以具有上述休眠細(xì)胞的方式進(jìn)行的誘導(dǎo)可通過(guò)在未包含果糖的培養(yǎng)基中將上述微生物培養(yǎng)至靜止期(stationaryphase)來(lái)執(zhí)行。

在本說(shuō)明書(shū)中，休眠細(xì)胞(restingcell)意味著處于不再進(jìn)行增殖的狀態(tài)的培養(yǎng)細(xì)胞。在本說(shuō)明書(shū)中，靜止期意味著在培養(yǎng)細(xì)胞的過(guò)程中經(jīng)過(guò)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(exponentialphase)后使細(xì)胞的分裂及增殖停止來(lái)不再呈現(xiàn)出細(xì)胞個(gè)體數(shù)量的增加并使細(xì)胞成分的合成和分解達(dá)到均衡的狀態(tài)。

因此，本發(fā)明的休眠細(xì)胞意味著處于結(jié)束生長(zhǎng)并使細(xì)胞內(nèi)的差向異構(gòu)酶的表達(dá)達(dá)到充分的狀態(tài)的細(xì)胞，在以使微生物具有休眠細(xì)胞的方式進(jìn)行誘導(dǎo)的情況下，差向異構(gòu)酶的表達(dá)量呈現(xiàn)最大值，從而可將阿洛酮糖的生產(chǎn)極大化。

除了不包含果糖之外，未包含果糖的培養(yǎng)基可以為與上述的包含果糖的培養(yǎng)基相同的培養(yǎng)基。

并且，在上述果糖與其差向異構(gòu)酶發(fā)生反應(yīng)之后，本發(fā)明還可包括如下的步驟：回收上述微生物來(lái)再用于使其他底物轉(zhuǎn)換為阿洛酮糖。

在本發(fā)明中，在微生物內(nèi)執(zhí)行果糖與其差向異構(gòu)酶的反應(yīng)，即使露出在高溫下，也可使差向異構(gòu)酶得到微生物的保護(hù)，因此仍然呈現(xiàn)出酶的活性，因而可以再使用。

即，可在上述反應(yīng)之后，通過(guò)回收上述微生物來(lái)再用于使其他底物轉(zhuǎn)換為阿洛酮糖。

若在可使所分離的微生物的生育得到維持的環(huán)境中執(zhí)行反應(yīng)，則再使用次數(shù)不受限制，可達(dá)到數(shù)百次以上、數(shù)千次以上。

若本發(fā)明還包括再使用微生物的步驟，則微生物多次露在高溫下，因而優(yōu)選地，使用熱穩(wěn)定性高的高溫型微生物，以使再使用時(shí)的酶的活性達(dá)到高的水平。

在上述的例示內(nèi)容中，優(yōu)選地，可以為棒狀桿菌屬、放線菌屬，更優(yōu)選為谷氨酸棒狀桿菌，最優(yōu)選為向谷氨酸棒狀桿菌atcc13032導(dǎo)入對(duì)上述差向異構(gòu)酶進(jìn)行編碼的基因。

在本發(fā)明中，使上述果糖及阿洛酮糖的混合物與甘露醇脫氫酶發(fā)生反應(yīng)，來(lái)將未與差向異構(gòu)酶發(fā)生反應(yīng)的果糖轉(zhuǎn)換為甘露醇。

若在微生物內(nèi)執(zhí)行上述的果糖與阿洛酮糖的轉(zhuǎn)換反應(yīng)，則上述反應(yīng)混合物可以為從微生物中分離果糖和阿洛酮糖的混合物的上清液。

上述甘露醇脫氫酶可以為甘露醇-2-脫氫酶。具體地，可以為來(lái)源于假腸膜明串珠菌atcc12291(leuconostocpseudomesenteroidesatcc12291)的甘露醇-2-脫氫酶(genbank:cad31644.1,gi:28865823)、來(lái)源于腸膜明串珠菌(leuconostocmesenteroides)的甘露醇-2-脫氫酶(genbank:act22631.1,gi:253317413)、來(lái)源于類球紅細(xì)菌(rhodobactersphaeroides)的甘露醇-2-脫氫酶(genbank:aac45771.1,gi:2338764)或來(lái)源于熒光假單胞菌dsm50106(pseudomonasfluorescensdsm50106)的甘露醇-2-脫氫酶(genbank:aac04472.1,gi:2293418)，從果糖向甘露醇的轉(zhuǎn)換率方面來(lái)看，優(yōu)選地，可以為來(lái)源于假腸膜明串珠菌atcc12291的甘露醇-2-脫氫酶。

來(lái)源于假腸膜明串珠菌atcc12291的甘露醇-2-脫氫酶可具有序列43的氨基酸序列，來(lái)源于腸膜明串珠菌的甘露醇-2-脫氫酶可具有序列44的氨基酸序列，來(lái)源于類球紅細(xì)菌的甘露醇-2-脫氫酶可具有序列45的氨基酸序列，來(lái)源于熒光假單胞菌dsm50106的甘露醇-2-脫氫酶可具有序列46的氨基酸序列。

根據(jù)需要，果糖及阿洛酮糖的混合物與甘露醇脫氫酶的反應(yīng)可在還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nadh，(nad，nicotinamideadeninedinucleotide)的還原形態(tài))供給源存在下執(zhí)行。

還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸為甘露醇脫水酶的輔酶，在向甘露醇脫水酶供給還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的情況下，可明顯增加果糖向甘露醇的轉(zhuǎn)換率。由此，反應(yīng)液中的果糖減少，從而可更容易分離阿洛酮糖。

還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸供給源可不受限制地使用在本領(lǐng)域公知的物質(zhì)，例如，可以為甲酸及甲酸脫氫酶。

甲酸脫氫酶可不受限制地使用在本領(lǐng)域公知的甲酸脫氫酶，例如，可以為來(lái)源于母牛分枝桿菌菌苗n10(mycobacteriumvaccaen10)的甲酸脫氫酶(formatedehydrogenase，fdh，genbank:ab072394.1,gi:15982576)。

來(lái)源于母牛分枝桿菌菌苗n10(mycobacteriumvaccaen10)的甲酸脫氫酶可具有序列49的氨基酸序列。

同樣，上述反應(yīng)混合物與甘露醇脫氫酶的反應(yīng)可在微生物內(nèi)執(zhí)行。

上述微生物為原核細(xì)胞或真核細(xì)胞，可在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，并可在上述的高溫條件下進(jìn)行培養(yǎng)。上述微生物例如可以為細(xì)菌、霉或它們的組合。細(xì)菌可以為革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌、革蘭氏陰性細(xì)菌或它們的組合，從提高阿洛酮糖生產(chǎn)率方面來(lái)看，優(yōu)選地，可以為革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。革蘭氏陰性細(xì)菌可以為埃希氏菌屬。革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌可以為芽孢桿菌屬、棒狀桿菌屬、放線菌屬、乳酸菌或它們的組合。霉可以為酵母、克魯維酵母屬或它們的組合。

阿洛酮糖作為代替白糖的功能性甜味劑，用于食品中，上述微生物優(yōu)選為一般認(rèn)為安全的(gras，generallyrecognizedassafe)菌株。例如，可以為棒狀桿菌屬，更具體地，可以為谷氨酸棒狀桿菌，最優(yōu)選地，可以為谷氨酸棒狀桿菌atcc13032。

上述微生物可內(nèi)在性表達(dá)上述甘露醇脫氫酶或通過(guò)轉(zhuǎn)化來(lái)表達(dá)上述甘露醇脫氫酶。在此情況下，可在微生物內(nèi)生成甘露醇脫氫酶來(lái)通過(guò)上述反應(yīng)混合物與甘露醇脫氫酶的微生物內(nèi)反應(yīng)連續(xù)執(zhí)行甘露醇的生產(chǎn)。

在上述微生物轉(zhuǎn)化為對(duì)甘露醇脫氫酶進(jìn)行編碼的基因來(lái)使甘露醇脫氫酶表達(dá)的情況下，可使來(lái)源于上述假腸膜明串珠菌kctc3652(leuconostocpseudomesenteroideskctc3652)的甘露醇-2-脫氫酶(genbank:cad31644.1,gi:28865823)、來(lái)源于腸膜明串珠菌(leuconostocmesenteroides)的甘露醇-2-脫氫酶(genbank:act22631.1,gi:253317413)、來(lái)源于類球紅細(xì)菌的甘露醇-2-脫氫酶(genbank:aac45771.1,gi:2338764)或來(lái)源于熒光假單胞菌dsm50106(pseudomonasfluorescensdsm50106)的甘露醇-2-脫氫酶(genbank:aac04472.1,gi:2293418)表達(dá)。

并且，上述微生物可內(nèi)在性表達(dá)甲酸脫氫酶或通過(guò)轉(zhuǎn)化來(lái)表達(dá)甲酸脫氫酶。在此情況下，可在微生物內(nèi)生成甲酸脫氫酶來(lái)從甲酸生成還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸。由此，所生成的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸起到甘露醇脫氫酶的輔酶的作用，從而可明顯增加果糖向甘露醇的轉(zhuǎn)換率。

甲酸脫氫酶例如可以為來(lái)源于母牛分枝桿菌菌苗n10(mycobacteriumvaccaen10)的甲酸脫氫酶(formatedehydrogenase，fdh，genbank:ab072394.1,gi:15982576)。

并且，上述微生物可內(nèi)在性表達(dá)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)(glucosetransportprotein，glf)或通過(guò)轉(zhuǎn)化來(lái)表達(dá)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)。在此情況下，向微生物內(nèi)的作為底物的果糖的流入量增加，從而可增加甘露醇生成量。由此，反應(yīng)液中的果糖減少，從而可更容易分離阿洛酮糖。

葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)可不受限制地使用在本領(lǐng)域公知的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)，例如，可以為來(lái)源于運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(zymomonasmobilissubsp.mobiliszm4、atcc31821或kctc1534)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)(genbank:aag29864.1；gi:11095424)。

來(lái)源于運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(zymomonasmobilissubsp.mobiliszm4、atcc31821或kctc1534)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)可具有序列50的氨基酸序列。

在上述果糖與其差向異構(gòu)酶的反應(yīng)在微生物內(nèi)執(zhí)行的情況下，可在上述的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物。

在上述微生物內(nèi)在性表達(dá)甲酸脫氫酶或通過(guò)轉(zhuǎn)化來(lái)表達(dá)甲酸脫氫酶的情況下，培養(yǎng)基還包含甲酸。

此時(shí)，培養(yǎng)基的ph可以為6至7.5，更優(yōu)選地，ph可以為6.5至7.0。若ph在上述范圍內(nèi)，則甘露醇生產(chǎn)率優(yōu)秀，從而可更容易分離阿洛酮糖。上述范圍的ph是通過(guò)將乙酸鈉、哌嗪-1,4-二乙磺酸(pipes)、磷酸鈉緩沖溶液等用作液體培養(yǎng)基的溶劑或使用水來(lái)取得的。

并且，若上述微生物可內(nèi)在性表達(dá)甲酸脫氫酶或通過(guò)轉(zhuǎn)化來(lái)表達(dá)甲酸脫氫酶，則使上述果糖轉(zhuǎn)換為甘露醇的步驟可在開(kāi)放的反應(yīng)系統(tǒng)中執(zhí)行。在此情況下，釋放通過(guò)甲酸與甲酸脫氫酶的反應(yīng)來(lái)生成的co2，從而可活躍地維持甲酸脫氫酶的作用。只是，甲酸的消耗有可能使培養(yǎng)基的ph變高，優(yōu)選地，培養(yǎng)基包含緩沖溶液作為液體溶劑，更優(yōu)選地，可使用哌嗪-1,4-二乙磺酸緩沖溶液。

在上述反應(yīng)混合物與甘露醇脫氫酶發(fā)生反應(yīng)之前，本發(fā)明的阿洛酮糖的生產(chǎn)方法還可包括如下的步驟：在未包含上述果糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述微生物，來(lái)以使上述微生物具有休眠細(xì)胞的方式進(jìn)行誘導(dǎo)。

并且，在上述反應(yīng)混合物與甘露醇脫氫酶發(fā)生反應(yīng)之后，本發(fā)明還可包括如下的步驟：回收上述微生物來(lái)再用于使其他底物轉(zhuǎn)換為甘露醇。

之后，從上述混合物中分離上述甘露醇。

果糖和阿洛酮糖具有類似的物性，從而難以分離，但甘露醇的物性與阿洛酮糖的物性不同，從而可從甘露醇容易分離阿洛酮糖。

其分離方法不受特別限制，例如，可例舉離心分離、過(guò)濾、結(jié)晶化、離子交換色譜法等的方法，甘露醇和阿洛酮糖對(duì)于溶劑的溶解度差異大，因而優(yōu)選地，可通過(guò)根據(jù)甘露醇和阿洛酮糖對(duì)于溶劑的溶解度差異的結(jié)晶化來(lái)進(jìn)行分離。例如，可使用在包含第一溶劑的反應(yīng)液內(nèi)添加第一溶劑和另一第二溶劑來(lái)使甘露醇結(jié)晶化，或使反應(yīng)液內(nèi)的溶劑加熱及濃縮來(lái)使甘露醇結(jié)晶化等的方法。

上述溶劑不受特別限制，例如，可例舉水、鹽類水溶液、乙醇、己烷、丙酮等。這些可單獨(dú)使用或混合兩種以上來(lái)使用。

并且，甘露醇和阿洛酮糖還可通過(guò)液體色譜法來(lái)進(jìn)行分離。阿洛酮糖和果糖的物性類似，從而停留在液體色譜法中的柱的時(shí)間類似，導(dǎo)致峰上面積相重疊，但阿洛酮糖和甘露醇的物性不同，從而在峰上分離，因而可容易進(jìn)行分離。

并且，本發(fā)明的一實(shí)施方式提供阿洛酮糖的制備方法，其包括如下的步驟：在果糖及阿洛酮糖的混合物中添加甘露醇脫氫酶來(lái)使上述果糖轉(zhuǎn)換為甘露醇。

在果糖及阿洛酮糖的混合物中添加甘露醇脫氫酶來(lái)使上述果糖轉(zhuǎn)換為甘露醇的步驟如上所述可通過(guò)化學(xué)或生物學(xué)方法來(lái)將果糖轉(zhuǎn)換為阿洛酮糖之后，在經(jīng)轉(zhuǎn)換的阿洛酮糖和未轉(zhuǎn)換的果糖的混合物中添加甘露醇脫氫酶，來(lái)使果糖轉(zhuǎn)換為甘露醇。

如上所述，上述反應(yīng)混合物與甘露醇脫氫酶的反應(yīng)可在微生物內(nèi)執(zhí)行。具體的方法如上所述。

阿洛酮糖為果糖的3號(hào)碳的差向異構(gòu)體，雖然像普通糖類一樣具有甜味，但由于無(wú)法在人體內(nèi)代謝，因而屬于因卡路里幾乎為零而對(duì)糖尿病及肥胖患者而言可作為代替白糖的功能性甜味劑來(lái)使用的糖，但果糖的卡路里高，且當(dāng)過(guò)度攝取時(shí)，有可能成為使胰島素敏感性降低來(lái)誘發(fā)糖尿病的主要原因。

但是，甘露醇與果糖不同，是卡路里低，不易被體內(nèi)吸收，且需要長(zhǎng)時(shí)間的代謝的多糖類，也是利用為糖尿病患者的甜味劑的成分。

由此，若在果糖及阿洛酮糖的混合物中添加甘露醇脫氫酶來(lái)使上述果糖轉(zhuǎn)換為甘露醇，則即使不將阿洛酮糖單獨(dú)分離為甘露醇，以阿洛酮糖和甘露醇的混合物狀態(tài)用作甜味劑，也可利用為減少了糖尿病、肥胖等代謝綜合征誘發(fā)可能性的代替白糖的功能性甜味劑。

并且，本發(fā)明還可包括如下的步驟：使作為底物的果糖與其差向異構(gòu)酶發(fā)生反應(yīng)，來(lái)制備上述果糖及阿洛酮糖的混合物。

使作為底物的果糖與其差向異構(gòu)酶發(fā)生反應(yīng)，來(lái)制備上述果糖及阿洛酮糖的混合物的步驟可通過(guò)上述的方法來(lái)執(zhí)行。

并且，在上述果糖與其差向異構(gòu)酶發(fā)生反應(yīng)之后，本發(fā)明還可包括如下的步驟：回收上述微生物來(lái)再用于其他底物向阿洛酮糖的轉(zhuǎn)換，同樣，這可通過(guò)上述的方法來(lái)執(zhí)行。

發(fā)明的效果

根據(jù)本發(fā)明的方法，能夠以高純度分離阿洛酮糖，從而明顯改善阿洛酮糖的生產(chǎn)收率。

根據(jù)本發(fā)明的方法，改善阿洛酮糖的生產(chǎn)量及生產(chǎn)速度。

附圖說(shuō)明

圖1為從導(dǎo)入了阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶的谷氨酸棒狀桿菌轉(zhuǎn)化體對(duì)來(lái)自作為根據(jù)休眠細(xì)胞轉(zhuǎn)換反應(yīng)的反應(yīng)溫度的底物的果糖的阿洛酮糖生產(chǎn)量進(jìn)行測(cè)定來(lái)表示的。

圖2為從導(dǎo)入了阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶的大腸桿菌mg1655轉(zhuǎn)化體對(duì)來(lái)自作為根據(jù)休眠細(xì)胞轉(zhuǎn)換反應(yīng)的反應(yīng)溫度的底物的果糖的阿洛酮糖生產(chǎn)量進(jìn)行測(cè)定來(lái)表示的。

圖3為對(duì)利用導(dǎo)入了阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶的谷氨酸棒狀桿菌和大腸桿菌mg1655轉(zhuǎn)化體來(lái)在60℃溫度下將阿洛酮糖生產(chǎn)休眠細(xì)胞轉(zhuǎn)換反應(yīng)進(jìn)行3小時(shí)之后，再回收菌體來(lái)在相同反應(yīng)條件下進(jìn)行反應(yīng)而得的阿洛酮糖生產(chǎn)量進(jìn)行測(cè)定來(lái)表示的。

圖4為從根據(jù)用于導(dǎo)入了阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶的谷氨酸棒狀桿菌轉(zhuǎn)化體的休眠細(xì)胞轉(zhuǎn)換反應(yīng)的阿洛酮糖生產(chǎn)反應(yīng)培養(yǎng)基的組成變化的果糖表示阿洛酮糖的生產(chǎn)量的。

圖5為表示導(dǎo)入了阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶的谷氨酸棒狀桿菌轉(zhuǎn)化體的休眠細(xì)胞轉(zhuǎn)換反應(yīng)時(shí)的來(lái)源于阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶的菌株及根據(jù)阿洛酮糖生產(chǎn)反應(yīng)培養(yǎng)基組成的阿洛酮糖的生產(chǎn)量的。

圖6為表示導(dǎo)入了阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶的谷氨酸棒狀桿菌轉(zhuǎn)化體的休眠細(xì)胞轉(zhuǎn)換反應(yīng)時(shí)的來(lái)源于阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶的菌株及根據(jù)加熱時(shí)間的阿洛酮糖的生產(chǎn)量的。

圖7為比較來(lái)源于多種菌株的阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶的氨基酸序列的。

圖8為根據(jù)導(dǎo)入了來(lái)源于梭菌屬的阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶的谷氨酸棒狀桿菌的再使用次數(shù)的阿洛酮糖的生產(chǎn)量的。

圖9為表示利用導(dǎo)入了來(lái)源于多種菌株的甘露醇脫氫酶和甲酸脫氫酶的棒狀桿菌重組菌株來(lái)生產(chǎn)的甘露醇生產(chǎn)量的圖表。lpmdh表示來(lái)源于假腸膜明串珠菌的甘露醇脫氫酶，lmmdh表示來(lái)源于腸膜明串珠菌的甘露醇脫氫酶，rsmdh表示來(lái)源于類球紅細(xì)菌的甘露醇脫氫酶，且pfmdh表示來(lái)源于熒光假單胞菌的甘露醇脫氫酶。

圖10為表示當(dāng)提供由阿洛酮糖和果糖形成的混合糖作為底物時(shí)，未利用甘露醇脫氫酶來(lái)發(fā)生反應(yīng)而殘留的阿洛酮糖的量(圖10的(a)部分)和從果糖轉(zhuǎn)換的甘露醇生產(chǎn)量(圖10的(b)部分)的圖表。

圖11為表示使用包括具有分別不同的ph的緩沖溶液的轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基時(shí)以及不使用緩沖溶液而使用含水的轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基時(shí)的甘露醇生產(chǎn)量(圖11的(a)部分)和ph變化(圖11的(b)部分)的圖表。w表示將無(wú)緩沖溶液的水用作轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基，sa表示將ph為5的乙酸鈉(sodiumaceteate)緩沖溶液用作轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基，p表示將ph為6的哌嗪-1,4-二乙磺酸緩沖溶液用作轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基，sp表示將ph為6.5的磷酸鈉(sodiumphosphate)緩沖溶液用作轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基。

圖12為比較使用作為密閉反應(yīng)容器的錐形管(conicaltube)和作為開(kāi)放反應(yīng)容器的試管(testtube)之后的甘露醇生產(chǎn)量(圖12的(a)部分)和ph變化(圖12的(b)部分)的圖表。

圖13為表示在作為開(kāi)放反應(yīng)容器的試管中將水或ph為6的哌嗪-1,4-二乙磺酸緩沖溶液用作轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基時(shí)的甘露醇生產(chǎn)量的圖表。

圖14為比較根據(jù)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)的導(dǎo)入與否的甘露醇生產(chǎn)量的圖表。

圖15為表示根據(jù)乙醇添加量來(lái)分離在甘露醇轉(zhuǎn)換反應(yīng)混合糖溶液中進(jìn)行結(jié)晶化的甘露醇之后的果糖、甘露醇、阿洛酮糖的濃度的曲線圖。

圖16為表示分離隨著通過(guò)蒸發(fā)減少甘露醇轉(zhuǎn)換反應(yīng)混合糖溶液的體積而結(jié)晶化的甘露醇之后的果糖、甘露醇、阿洛酮糖的濃度的曲線圖。

圖17為比較在根據(jù)阿洛酮糖生產(chǎn)工序之后添加的甘露醇轉(zhuǎn)換反應(yīng)有無(wú)的反應(yīng)液內(nèi)的多種混合糖的高性能液體色譜法中分離能力狀態(tài)的曲線圖。

具體實(shí)施方式

以下，為了具體說(shuō)明本發(fā)明，例舉實(shí)施例來(lái)進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。

實(shí)施例

1.在利用谷氨酸棒狀桿菌菌株來(lái)從果糖生產(chǎn)阿洛酮糖的過(guò)程中根據(jù)溫度的阿洛酮糖生產(chǎn)速度及生產(chǎn)量變化

(1)重組菌株的制備

使作為大腸桿菌-棒狀桿菌穿梭載體的pces208(j.microbiol.biotechnol.,18:639-647,2008)發(fā)生變形來(lái)制作插入有終止子(terminator)和lac啟動(dòng)子的psgt208穿梭載體，從而進(jìn)行使用。

為了從谷氨酸棒狀桿菌生產(chǎn)阿洛酮糖，阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶將根癌土壤桿菌(agrobacteriumtumefaciensstr.c58；taxid:176299；genbanknid:nc_003062,atcc33970)的dpe基因(agr_l_260,gi:15890243，序列1)導(dǎo)入于已制作的上述psgt208穿梭載體來(lái)進(jìn)行使用。

詳細(xì)地，利用序列31的引物1和序列32的引物2來(lái)從根癌土壤桿菌基因組擴(kuò)增dpe基因，使用限制酶kpni和bamhi來(lái)進(jìn)行切割，并向psgt208穿梭載體的相同部位進(jìn)行插入，從而制作了包含阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶的ps208-dpe重組穿梭載體。

之后，為了在谷氨酸棒狀桿菌中增加阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶的表達(dá)量，在ps208-dpe中將lac啟動(dòng)子取代為來(lái)源于ptrc99a的trc啟動(dòng)子，并將其命名為ps208ct-dpe。

將所制作的包含上述阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶的重組載體ps208-dpe、ps208ct-dpe和作為其陰性對(duì)照組的psgt208載體導(dǎo)入于野生型谷氨酸棒狀桿菌atcc13032來(lái)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，并將其利用于從果糖生產(chǎn)阿洛酮糖的生產(chǎn)當(dāng)中。轉(zhuǎn)化法采用了handbookofcorynebacteriumglutamicum(lothareggeling等，isbn0-8493-1821-1,2005bycrcpress)中的方法。

(2)重組菌株的培養(yǎng)及利用其的阿洛酮糖的生產(chǎn)

為了確保高濃度的菌體，將在上述中制備的谷氨酸棒狀桿菌轉(zhuǎn)化體接種到包含20μg/ml的卡那霉素的5ml的lb培養(yǎng)基(difco)來(lái)在30℃溫度且250rpm的條件下進(jìn)行種培養(yǎng)，之后，接種到包含10g/l的葡萄糖及20μg/ml的卡那霉素的最小培養(yǎng)基(每1l包含1g的k2hpo4、10g的(nh4)2so4、0.4g的mgso47h2o、20mg的feso47h2o、20mg的mnso45h2o、50mg的nacl、2g的尿素、0.1mg的生物素(biotin)、0.1mg的硫胺素(thiamine))來(lái)進(jìn)行了本培養(yǎng)。本培養(yǎng)在具有槽的500ml的三角燒瓶中以100ml的體積在30℃溫度且180rpm的條件下進(jìn)行12個(gè)小時(shí)，從而誘導(dǎo)了充分的菌體量和蛋白質(zhì)的充分表達(dá)。

對(duì)所得到的上述培養(yǎng)液進(jìn)行離心分離來(lái)去除上清液，并回收菌體，從而在包含作為底物的40％(w/v)果糖的與上述相同的最小培養(yǎng)基中以使菌體濃度達(dá)到40od600的方式進(jìn)行再懸浮之后，在25℃、30℃、37℃、50℃、60℃或70℃溫度且180rpm的條件下進(jìn)行了休眠細(xì)胞轉(zhuǎn)換反應(yīng)。

利用高性能液體色譜法(hplc)來(lái)測(cè)定了果糖及阿洛酮糖的濃度。高性能液體色譜法使用了設(shè)置有kromasil5nh2柱(4.6mm×250mm)的scl-10a(日本島津公司，shimadzu)，移動(dòng)相利用75％乙腈來(lái)在以1.5ml/分鐘流下并在40℃溫度下分離后，利用反射指數(shù)(ri，reflectiveindex)檢測(cè)器來(lái)進(jìn)行了分析。在上述條件下，果糖的停留時(shí)間(retentiontime)為5.5分鐘，阿洛酮糖的停留時(shí)間為4.6分鐘。

圖1示出了測(cè)定結(jié)果。參照?qǐng)D1，使導(dǎo)入了psgt208ct-dpe穿梭載體的谷氨酸棒狀桿菌atcc13032菌株在包含40％果糖的培養(yǎng)基中進(jìn)行轉(zhuǎn)換反應(yīng)，其結(jié)果表明反應(yīng)溫度越高，阿洛酮糖的生產(chǎn)速度越快，生產(chǎn)量越增加。尤其，在50℃、60℃、70℃溫度下發(fā)生反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)組大致在3個(gè)小時(shí)的時(shí)間內(nèi)使阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶達(dá)到酶的反應(yīng)平衡，從而生產(chǎn)了約120g/l的阿洛酮糖，這可被視為阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶的從果糖轉(zhuǎn)換為阿洛酮糖的轉(zhuǎn)換速度及生產(chǎn)量依賴于溫度。

生產(chǎn)量以50℃溫度為起點(diǎn)來(lái)急劇增加，這屬于比正常酶反應(yīng)所需的溫度明顯高的溫度，判斷為在該溫度下，酶與底物之間的反應(yīng)的狀態(tài)發(fā)生變化。

2.在利用大腸桿菌來(lái)從果糖生產(chǎn)阿洛酮糖的過(guò)程中根據(jù)溫度的阿洛酮糖生產(chǎn)速度及生產(chǎn)量變化

根據(jù)在韓國(guó)專利授權(quán)號(hào)第10-1106253號(hào)中的實(shí)施例1中所記載的方法，制備了使用向ptrc99a載體導(dǎo)入來(lái)源于根癌土壤桿菌的阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶的ptpe質(zhì)體進(jìn)行轉(zhuǎn)化的e.colimg1655(δpfka，als2)菌株。

為了阻斷阿洛酮糖分解路徑，利用了pfka(序列11)和als2(序列14、序列15、序列16、序列17、序列18及序列19)基因缺損的大腸桿菌mg1655。

為了確保高濃度的菌體，將在上述中所制備的大腸桿菌mg1655轉(zhuǎn)化體接種到包含100μg/ml的氨比西林的5ml的lb培養(yǎng)基(difco)，并在37℃溫度且250rpm的條件下進(jìn)行種培養(yǎng)，之后，接種到包含10g/l的葡萄糖及100μg/ml的氨比西林的2yt培養(yǎng)基進(jìn)行了本培養(yǎng)。本培養(yǎng)在具有槽的500ml的三角燒瓶中以100ml的體積在37℃溫度且180rpm的條件下進(jìn)行12個(gè)小時(shí)，從而誘導(dǎo)了充分的菌體量和蛋白質(zhì)的充分表達(dá)。

對(duì)所得到的上述培養(yǎng)液進(jìn)行離心分離來(lái)去除上清液，并回收菌體，從而在包含作為底物的40％(w/v)果糖的大腸桿菌最小培養(yǎng)基m9培養(yǎng)基中(每1l包含11.3g的m9最小鹽(minimalsalts)(difco)、0.1ml的1mcacl2、2ml的1mmgso4、1ml的100mmmnso45h2o)中以使菌體濃度達(dá)到40od600的方式進(jìn)行再懸浮之后，分別在37℃、60℃或70℃溫度且180rpm的條件下進(jìn)行了休眠細(xì)胞轉(zhuǎn)換反應(yīng)。果糖及阿洛酮糖的濃度根據(jù)在上述實(shí)施例1中所記載的方法來(lái)進(jìn)行了分析。圖2示出測(cè)定結(jié)果。

參照?qǐng)D2，也使導(dǎo)入了ptpe載體的大腸桿菌mg1655(δpfka、als2)菌株在包含40％果糖的培養(yǎng)基中進(jìn)行轉(zhuǎn)換反應(yīng)，其結(jié)果也表明反應(yīng)溫度越高，阿洛酮糖的生產(chǎn)速度越快，生產(chǎn)量越增加。尤其，在60℃、70℃溫度下發(fā)生反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)組也與棒狀桿菌中的實(shí)驗(yàn)一樣，大致在2個(gè)小時(shí)的時(shí)間內(nèi)使阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶達(dá)到酶的反應(yīng)平衡，從而生產(chǎn)了約120g/l的阿洛酮糖。

這重新證明了阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶的從果糖轉(zhuǎn)換為阿洛酮糖的轉(zhuǎn)換速度及生產(chǎn)量依賴于溫度。

以作為代表性的革蘭氏陽(yáng)性菌的棒狀桿菌和作為代表性的革蘭氏陰性菌的大腸桿菌作為對(duì)象來(lái)在高溫條件下進(jìn)行休眠細(xì)胞轉(zhuǎn)換反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果可知，作為糖轉(zhuǎn)換酶的阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶在細(xì)胞內(nèi)在極寒外部環(huán)境中受到保護(hù)，因而與單純的酶的狀態(tài)相比，可在高溫條件下，不發(fā)生熱變性，并以更快的速度生產(chǎn)阿洛酮糖。這種細(xì)胞轉(zhuǎn)換反應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)也可適用于大部分微生物。

3.谷氨酸棒狀桿菌轉(zhuǎn)化菌體通過(guò)在休眠細(xì)胞轉(zhuǎn)換反應(yīng)中的菌體回收及再使用來(lái)實(shí)現(xiàn)的從果糖生產(chǎn)的阿洛酮糖的連續(xù)生產(chǎn)

從上述實(shí)施例1及實(shí)施例2的結(jié)果中可知，當(dāng)將阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶導(dǎo)入于棒狀桿菌和大腸桿菌轉(zhuǎn)化體內(nèi)，并在50℃以上的高溫條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)換反應(yīng)時(shí)，在3小時(shí)以內(nèi)使阿洛酮糖的生產(chǎn)量達(dá)到最大值之后，并不再增加。

即，為了確認(rèn)阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶在達(dá)到使阿洛酮糖的生產(chǎn)量達(dá)到最大值的反應(yīng)平衡的3個(gè)小時(shí)之后還殘留多少使果糖轉(zhuǎn)換為阿洛酮糖的活性，回收在存在果糖的條件下通過(guò)3個(gè)小時(shí)的休眠細(xì)胞轉(zhuǎn)換反應(yīng)來(lái)用于阿洛酮糖生產(chǎn)的菌體，來(lái)再用于阿洛酮糖生產(chǎn)休眠細(xì)胞轉(zhuǎn)換反應(yīng)中。

上述菌體的再使用休眠細(xì)胞轉(zhuǎn)換反應(yīng)在60℃溫度下反復(fù)進(jìn)行了3次。最初的休眠細(xì)胞轉(zhuǎn)換反應(yīng)表示為r0，從之前的反應(yīng)液中回收菌體來(lái)進(jìn)行第一次再使用的休眠細(xì)胞轉(zhuǎn)換反應(yīng)表示為r1，進(jìn)行第二次再使用的休眠細(xì)胞轉(zhuǎn)換反應(yīng)表示為r2，進(jìn)行第三次再使用的休眠細(xì)胞轉(zhuǎn)換反應(yīng)表示為r3。培養(yǎng)條件及分析方法與實(shí)施例1相同。圖3示出其結(jié)果。

參照?qǐng)D3，即使在60℃的高溫糖轉(zhuǎn)換反應(yīng)中也可再使用菌體。但是，越是再使用菌體，酶的活性的規(guī)定部分越減少。并且，當(dāng)在高溫條件下再使用菌體時(shí)，作為革蘭氏陽(yáng)性菌的谷氨酸棒狀桿菌菌株的殘留酶活性高于作為革蘭氏陰性菌的大腸桿菌mg1655菌株的殘留酶活性。

實(shí)施例4.在多種休眠細(xì)胞轉(zhuǎn)換反應(yīng)培養(yǎng)基中從果糖生產(chǎn)阿洛酮糖

在上述實(shí)施例1中，在谷氨酸棒狀桿菌中從果糖生產(chǎn)阿洛酮糖的轉(zhuǎn)換反應(yīng)中，利用了包含40％果糖的最小培養(yǎng)基(每1l包含1g的k2hpo4、10g的(nh4)2so4、0.4g的mgso47h2o、20mg的feso47h2o、20mg的mnso45h2o、50mg的nacl、2g的尿素、0.1mg的生物素、0.1mg的硫胺素)。將用于該轉(zhuǎn)換反應(yīng)的培養(yǎng)基的結(jié)構(gòu)成分最小化來(lái)制備更經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便的培養(yǎng)基，執(zhí)行了與在實(shí)施例1中使用的培養(yǎng)基之間的阿洛酮糖生產(chǎn)率比較。

參照?qǐng)D4，即使使用包含40％果糖和0.1mm的mnso4的磷酸鹽緩沖液(phosphatebuffer)(ph為7)培養(yǎng)基，更簡(jiǎn)便地，僅使用僅包含40％果糖和0.1mm的mnso4的培養(yǎng)基，也在最終生產(chǎn)的阿洛酮糖的生產(chǎn)量方面沒(méi)有太大差異。上述狀態(tài)在30℃和60℃的反應(yīng)溫度下均同樣被觀察到。在未將0.1mm的mnso4作為阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶的輔助因子來(lái)進(jìn)行添加的情況下，得到了生產(chǎn)量減少的結(jié)果。

在上述實(shí)施例中，可知用于阿洛酮糖生產(chǎn)休眠細(xì)胞轉(zhuǎn)換反應(yīng)的培養(yǎng)基的成分僅有作為底物的果糖和作為阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶的輔助因子的mnso4即可。

5.包含對(duì)來(lái)源于多種菌株的阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶氨基酸序列進(jìn)行編碼的多核苷酸的重組谷氨酸棒狀桿菌的制備

從德國(guó)微生物菌種保藏中心(dsmz)公司購(gòu)買了糞厭氧棒狀菌(anaerostipescaccaedsm14662；taxid:411490)的整體基因。將所購(gòu)買的整體基因作為模板以包含阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶推定基因(apendonuclease；sequenceid:gb|edr98778.1|；gi:167654649；序列4)的方式將序列33及序列34的引物對(duì)作為引物來(lái)執(zhí)行了第一次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)。以擴(kuò)增的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物作為模板將與阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶基因特異性結(jié)合的序列35及序列36的引物對(duì)用作引物，來(lái)執(zhí)行了第二次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。

使用限制酶bamhi和xbai來(lái)將所得到的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的產(chǎn)物插入于ps208ct-dpe(在韓國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?0-2013-0060703的實(shí)施例1中所記載的載體)的相同酶部位，來(lái)制備了重組載體ps208ct-acdpe。

將所制備的ps208ct-acdpe載體導(dǎo)入于野生型谷氨酸棒狀桿菌atcc13032來(lái)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，并將其用于從果糖生產(chǎn)阿洛酮糖的生產(chǎn)中。轉(zhuǎn)化法采用在handbookofcorynebacteriumglutamicum(lothareggeling等，isbn0-8493-1821-1,2005bycrcpress)中記載的方法。

所得到的重組谷氨酸棒狀桿菌菌株在-80℃溫度下得到保管后用于培養(yǎng)。

包含鮑氏梭菌(clostridiumbolteaeatccbaa-613；taxid:411902)的阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶推定基因(hypotheticalproteinclobol_00069；sequenceid:gb|edp19602.1|；gi:15844190；序列9)的質(zhì)體從韓國(guó)益力多乳品有限公司購(gòu)得。將與阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶基因特異性結(jié)合的序列37及序列38的引物對(duì)用作引物來(lái)執(zhí)行了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。

使用限制酶kpnⅰ和xbaⅰ來(lái)將所得到的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的產(chǎn)物插入于ps208ct-dpe(在韓國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?0-2013-0060703的實(shí)施例1中所記載的載體)的相同酶部位，來(lái)制備了重組載體ps208ct-cbdpe。

通過(guò)如上所述的方法將所制備的重組載體ps208ct-cbdpe載體導(dǎo)入于野生型谷氨酸棒狀桿菌atcc13032來(lái)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，并將其用于從果糖生產(chǎn)阿洛酮糖的生產(chǎn)中。所得到的重組谷氨酸棒狀桿菌菌株在-80℃溫度下得到保管后用于培養(yǎng)。

從德國(guó)微生物菌種保藏中心購(gòu)買了門冬蟲(chóng)梭菌(clostridiumhylemonaedsm15053；taxid:553973)的整體基因。將所購(gòu)買的整體基因作為模板以包含阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶推定基因(dolicholmonophosphatemannosesynthase；sequenceid:ref|wp_006442985.1|；gi:225161759；序列10)的方式將序列39及序列40的引物對(duì)作為引物來(lái)執(zhí)行了第一次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。以擴(kuò)增的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物作為模板將與阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶基因特異性結(jié)合的序列41及序列42的引物對(duì)用作引物，來(lái)執(zhí)行了第二次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。

使用限制酶bamhi和xbai來(lái)將所得到的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的產(chǎn)物插入于ps208ct-dpe(在韓國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?0-2013-0060703的實(shí)施例1中所記載的載體)的相同酶部位，來(lái)制備了重組載體ps208ct-chdpe。

通過(guò)如上所述的方法將所制備的ps208ct-chdpe載體導(dǎo)入于野生型谷氨酸棒狀桿菌atcc13032來(lái)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，并將其用于從果糖生產(chǎn)阿洛酮糖的生產(chǎn)中。所得到的重組谷氨酸棒狀桿菌菌株在-80℃溫度下得到保管后用于培養(yǎng)。

6.利用導(dǎo)入了來(lái)源于多種菌株的阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶的重組谷氨酸棒狀桿菌菌株來(lái)從果糖生產(chǎn)阿洛酮糖

利用在上述實(shí)施例5中所制備的谷氨酸棒狀桿菌轉(zhuǎn)化體來(lái)確認(rèn)了從高濃度的果糖生產(chǎn)阿洛酮糖。

將上述的轉(zhuǎn)化體接種到包含20μg/ml的卡那霉素的2yt培養(yǎng)基來(lái)在30℃溫度且250rpm條件下進(jìn)行種培養(yǎng)，之后，再次將轉(zhuǎn)化體接種到包含20μg/ml的卡那霉素的2yt培養(yǎng)基來(lái)進(jìn)行了本培養(yǎng)。本培養(yǎng)在具有槽的300ml的三角燒瓶中以60ml的體積在30℃溫度且180rpm條件下培養(yǎng)7個(gè)小時(shí)，從而誘導(dǎo)了充分的菌體量和蛋白質(zhì)的充分表達(dá)。

對(duì)所得到的上述培養(yǎng)液進(jìn)行離心分離來(lái)去除上清液，并回收菌體，從而在包含20μg/ml的卡那霉素、作為底物的40％(w/v)果糖和濃度為0.1mm的作為阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶的主要輔助因子的錳或鈷的簡(jiǎn)單的轉(zhuǎn)換反應(yīng)培養(yǎng)基中，在55℃溫度下進(jìn)行了休眠細(xì)胞轉(zhuǎn)換反應(yīng)。果糖和阿洛酮糖的濃度采用在上述實(shí)施例1中所記述的方法相同的方法來(lái)進(jìn)行了測(cè)定。圖5示出其結(jié)果。atdpe是指以往使用的根癌土壤桿菌的阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶。

參照?qǐng)D5，在所有導(dǎo)入了多種阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶的重組菌株中，與錳相比，將鈷作為輔助因子時(shí)，阿洛酮糖的生產(chǎn)速度更快。

導(dǎo)入了來(lái)源于糞厭氧棒狀菌和根癌土壤桿菌的阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶的重組谷氨酸棒狀桿菌的阿洛酮糖生產(chǎn)量在6個(gè)小時(shí)時(shí)達(dá)到平衡，但導(dǎo)入了來(lái)源于梭菌屬的阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶的重組谷氨酸棒狀桿菌的阿洛酮糖生產(chǎn)量在將錳作為輔助因子的情況下，也在3個(gè)小時(shí)時(shí)達(dá)到平衡。

因此，不僅可確認(rèn)到來(lái)源于梭菌屬的阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶可實(shí)現(xiàn)從果糖生產(chǎn)阿洛酮糖，阿洛酮糖的生產(chǎn)速度比來(lái)源于根癌土壤桿菌的阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶更快。

7.導(dǎo)入了來(lái)源于多種菌株的阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶的重組谷氨酸棒狀桿菌菌株的高溫條件下的阿洛酮糖生產(chǎn)活性的持續(xù)維持

從上述實(shí)施例1、實(shí)施例2的結(jié)果中，確認(rèn)到當(dāng)以50℃以上的高溫條件進(jìn)行轉(zhuǎn)換反應(yīng)時(shí)，所有阿洛酮糖生產(chǎn)在3個(gè)小時(shí)以內(nèi)完成。像這樣，在高溫條件下，從果糖生產(chǎn)阿洛酮糖的生產(chǎn)速度快，因而需要即使再使用菌體的情況下也可在長(zhǎng)時(shí)間的高溫條件下維持穩(wěn)定的阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶。因此，確認(rèn)了來(lái)源于多種菌株的阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶在高溫條件下的活性維持程度。

使通過(guò)上述實(shí)施例1中所記載的方法得到的菌體在2yt中進(jìn)行浮游，從而利用振蕩培養(yǎng)器來(lái)在0小時(shí)、3小時(shí)、6小時(shí)、9小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)的時(shí)間內(nèi)持續(xù)施加60℃的熱量。在按各個(gè)時(shí)間施加熱量之后，回收菌體，并在僅包含20μg/ml的卡那霉素、0.1mm的錳及40％(w/v)的果糖的簡(jiǎn)單轉(zhuǎn)換反應(yīng)培養(yǎng)基中進(jìn)行浮游，從而再次在60℃溫度下進(jìn)行3個(gè)小時(shí)的休眠細(xì)胞轉(zhuǎn)換反應(yīng)。果糖和阿洛酮糖的濃度通過(guò)與上述實(shí)施例1中所記載的方法相同的方法進(jìn)行了測(cè)定。圖6示出其結(jié)果。

參照?qǐng)D6，導(dǎo)入了以往使用的來(lái)源于根癌土壤桿菌的阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶和來(lái)源于糞厭氧棒狀菌的阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶的重組谷氨酸棒狀桿菌在受到3個(gè)小時(shí)的60℃熱量之后，幾乎無(wú)法進(jìn)行阿洛酮糖的生產(chǎn)。相反，導(dǎo)入了來(lái)源于梭菌屬的阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶的重組谷氨酸棒狀桿菌在受到24個(gè)小時(shí)的熱量后，也維持阿洛酮糖的生產(chǎn)，從而與來(lái)源于根癌土壤桿菌的阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶相比，更加有利于高溫工序下的阿洛酮糖的生產(chǎn)。

眾所周知，當(dāng)對(duì)于來(lái)源于根癌土壤桿菌的阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶的熱穩(wěn)定性起到重要作用的序列(參考文獻(xiàn)1)中的第33個(gè)氨基酸或第213個(gè)氨基酸分別被亮氨酸、半胱氨酸取代時(shí)，50℃溫度下的酶的半壽命分別達(dá)到3.3倍、7.2倍，或者，在兩個(gè)均被取代時(shí)，達(dá)到29.9倍。

圖7示出來(lái)源于根癌土壤桿菌的阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶的氨基酸序列與來(lái)源于梭菌屬的阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶的氨基酸序列之間的比較，參照?qǐng)D7，熱穩(wěn)定性高的來(lái)源于梭菌屬的阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶使一個(gè)氨基酸具有與其相對(duì)應(yīng)的序列或具有兩個(gè)序列。

8.導(dǎo)入了來(lái)源于梭菌屬的阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶的重組谷氨酸棒狀桿菌菌體通過(guò)在休眠細(xì)胞轉(zhuǎn)換反應(yīng)中的菌體回收及再使用來(lái)實(shí)現(xiàn)從果糖生產(chǎn)阿洛酮糖

由于在上述實(shí)施例7中確認(rèn)到來(lái)源于梭菌屬的阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶在高溫條件下具有穩(wěn)定性，因而在導(dǎo)入了來(lái)源于梭菌屬的阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶的兩個(gè)重組菌株中，代表性地，使導(dǎo)入了門冬蟲(chóng)梭菌的阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶的重組谷氨酸棒狀桿菌菌體在高溫條件下進(jìn)行休眠細(xì)胞轉(zhuǎn)換反應(yīng)之后，確認(rèn)了菌體再使用效果。

在使通過(guò)與在上述實(shí)施例3中所記述的方法相同的方法得到的菌體在60℃溫度下進(jìn)行3個(gè)小時(shí)的休眠細(xì)胞轉(zhuǎn)換反應(yīng)之后，再回收菌體來(lái)實(shí)施相同的休眠細(xì)胞轉(zhuǎn)換反應(yīng)，菌體共被再使用3次(與上述實(shí)施例3中的條件相同的條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn))。最初的休眠細(xì)胞轉(zhuǎn)換反應(yīng)表示為r0，從之前的反應(yīng)液中回收菌體來(lái)進(jìn)行第一次再使用的休眠細(xì)胞轉(zhuǎn)換反應(yīng)表示為r1，進(jìn)行第二次再使用的休眠細(xì)胞轉(zhuǎn)換反應(yīng)表示為r2，進(jìn)行第三次再使用的休眠細(xì)胞轉(zhuǎn)換反應(yīng)表示為r3。圖8示出其結(jié)果。

參照?qǐng)D8，可知在高溫條件下多次再使用菌體的過(guò)程中，導(dǎo)入了梭菌屬的阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶的重組菌體以阿洛酮糖生產(chǎn)量沒(méi)有任何減少的方式維持規(guī)定量?？山Y(jié)合上述實(shí)施例7的結(jié)果來(lái)確認(rèn)到酶本身的熱穩(wěn)定性在高溫條件下持續(xù)進(jìn)行糖轉(zhuǎn)換反應(yīng)，并且，在菌體的再使用過(guò)程中也非常有利。

9.從果糖生產(chǎn)甘露醇的谷氨酸棒狀桿菌重組菌株的開(kāi)發(fā)

(1)重組棒狀桿菌菌株的開(kāi)發(fā)

將以容易克隆的方式變形的psgt208載體用作作為大腸桿菌-棒狀桿菌穿梭載體的pces208載體(在韓國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?0-2013-0060703的實(shí)施例1中所記載的載體)。啟動(dòng)子使用了去除lac操縱子來(lái)持續(xù)表達(dá)的trc啟動(dòng)子。

作為甘露醇生產(chǎn)酶，使用了來(lái)源于假腸膜明串珠菌atcc12291(或kctc3652，leuconostocpseudomesenteroidesatcc12291)、腸膜明串珠菌、類球紅細(xì)菌及熒光假單胞菌dsm50106(pseudomonasfluorescensdsm50106)的酶。

從kctc購(gòu)買假腸膜明串珠菌菌株，并對(duì)整體基因組進(jìn)行純化之后，將其作為模板來(lái)以包含甘露醇脫氫酶(mannitol2-dehydrogenase；mdh；genbank:aj486977.1,gi:28865822,序列43,lpmdh)的方式將序列47及序列48的引物對(duì)作為引物執(zhí)行了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。

從genscript合成了來(lái)源于腸膜明串珠菌的甘露醇脫氫酶(genbank:act22631.1,gi:253317413,序列44,lmmdh)、來(lái)源于類球紅細(xì)菌的甘露醇脫氫酶(genbank:aac45771.1,gi:2338764,序列45,rsmdh)及來(lái)源于熒光假單胞菌的甘露醇脫氫酶(genbank:aac04472.1,gi:2293418,序列46,pfmdh)。

使用限制酶kpni和bamhi來(lái)向?qū)肓巳コ齦ac操縱子的trc啟動(dòng)子的psgt208載體的相同的限制酶部位插入所得到的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物及合成基因，從而制備了重組載體ps208ct-lpmdh、ps208ct-lmmdh、ps208ct-rsmdh及ps208ct-pfmdh。

并且，一同導(dǎo)入了有助于用作甘露醇脫氫酶的輔酶的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的持續(xù)再生的酶。作為有助于還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的再生的酶，利用了通過(guò)從甲酸到二氧化碳的氧化來(lái)再生還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的甲酸脫氫酶。利用了來(lái)源于母牛分枝桿菌菌苗n10(mycobacteriumvaccaen10)的甲酸脫氫酶(formatedehydrogenase，fdh，genbank:ab072394.1,gi:15982576,序列49)，并從genscript合成了基因。使用限制酶bamhi和xbai來(lái)向之前構(gòu)筑的ps208ct-lpmdh、ps208ct-lmmdh、ps208ct-rsmdh及ps208ct-pfmdh載體的相同的限制酶部位插入所合成的基因，從而制備了重組載體ps208ct-lpmdh-fdh、ps208ct-lmmdh-fdh、ps208ct-rsmdh-fdh及ps208ct-pfmdh-fdh。

將所制備的ps208ct-lpmdh-fdh、ps208ct-lmmdh-fdh、ps208ct-rsmdh-fdh及ps208ct-pfmdh-fdh載體導(dǎo)入于野生型谷氨酸棒狀桿菌atcc13032(corynebacteriumglutamicumatcc13032)，轉(zhuǎn)化法采用handbookofcorynebacteriumglutamicum(lothareggeling等，isbn0-8493-1821-1,2005bycrcpress)中的方法。所轉(zhuǎn)化的重組棒狀桿菌菌株在-80℃溫度下進(jìn)行保管來(lái)使用。

(2)利用重組菌株的甘露醇生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)

甘露醇生產(chǎn)使用了利用高濃度的菌體的休眠細(xì)胞轉(zhuǎn)換反應(yīng)。為了確保高濃度的菌體，將所制備的上述谷氨酸棒狀桿菌重組菌株接種到包含20μg/ml的卡那霉素的2yt培養(yǎng)基，并以30℃溫度且250rpm的條件進(jìn)行種培養(yǎng)之后，在包含20μg/ml的卡那霉素、0.5％(v/v)葡萄糖的2yt培養(yǎng)基中接種5％(v/v)至10％(v/v)的種培養(yǎng)液，從而以30℃溫度且180rpm的條件進(jìn)行了誘導(dǎo)充分的菌體量及蛋白質(zhì)表達(dá)的本培養(yǎng)。

針對(duì)通過(guò)本培養(yǎng)得到的大量的菌體去除培養(yǎng)基之后，利用于轉(zhuǎn)換反應(yīng)中。休眠細(xì)胞轉(zhuǎn)換反應(yīng)通過(guò)在包含10％(v/v)果糖和555mm的甲酸的100mm的磷酸鈉(ph為6.5)緩沖溶液中以使?jié)舛瘸蔀閛d60040的方式將菌體進(jìn)行懸浮，來(lái)以30℃溫度且250rpm的條件進(jìn)行了48個(gè)小時(shí)。果糖及甘露醇的濃度利用高性能液體色譜法來(lái)進(jìn)行了測(cè)定。高性能液體色譜法使用了設(shè)置有kromasil5nh2柱(4.6mm×250mm)的scl-10a(日本島津公司)，移動(dòng)相利用80％乙腈來(lái)以1.5ml/分鐘流下并在40℃溫度下分離之后，利用反射指數(shù)檢測(cè)器來(lái)進(jìn)行了分析。圖9示出其測(cè)定結(jié)果。

參照?qǐng)D9，根據(jù)甘露醇脫氫酶的甘露醇生產(chǎn)量無(wú)大的差異，但當(dāng)利用來(lái)源于假腸膜明串珠菌的甘露醇脫氫酶時(shí)，在48個(gè)小時(shí)的轉(zhuǎn)換反應(yīng)之后，從100g/l的果糖生產(chǎn)約26g/l的甘露醇，從而呈現(xiàn)最多的甘露醇生產(chǎn)量。由此，之后，在甘露醇轉(zhuǎn)換反應(yīng)中繼續(xù)使用了來(lái)源于假腸膜明串珠菌的甘露醇脫氫酶。雖然未在實(shí)施例中表示，但與導(dǎo)入甲酸脫氫酶之前相比，甘露醇生產(chǎn)量增加約86倍，從而可以確認(rèn)到利用了甲酸脫氫酶的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的再生起到有效作用。

10.利用了阿洛酮糖和果糖的混合糖的甘露醇生產(chǎn)

如上所述，阿洛酮糖和果糖的物性很類似。由此，若甘露醇脫氫酶為對(duì)于底物的特異性不高的酶，則不僅是果糖，阿洛酮糖也被認(rèn)定為底物，從而還可以被還原。因此，在阿洛酮糖和果糖的混合糖中，僅將果糖轉(zhuǎn)換為甘露醇，從而確認(rèn)了容易與阿洛酮糖分離的戰(zhàn)略是否適用。

利用所構(gòu)筑的上述重組棒狀桿菌菌株來(lái)僅將底物換為阿洛酮糖和果糖的混合糖，從而以與實(shí)施例9中的實(shí)驗(yàn)條件相同的條件進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)?；旌咸且钥稍趶墓堑桨⒙逋堑霓D(zhuǎn)換反應(yīng)之后得到的果糖7和阿洛酮糖3(v/v)的比率制備而成，混合糖的濃度如同實(shí)施例9利用了10％(v/v)。圖10的(a)部分和圖10的(b)部分示出其結(jié)果。

圖10的(a)部分表示未用作底物而殘留的阿洛酮糖濃度，在48個(gè)小時(shí)的轉(zhuǎn)換反應(yīng)期間，一直維持作為初始濃度的約30g/l，可確認(rèn)到幾乎未使用。圖10的(b)部分表示從構(gòu)成100g/l的混合糖的70g/l的果糖生產(chǎn)的甘露醇量，在30℃的轉(zhuǎn)換溫度下，在48個(gè)小時(shí)的轉(zhuǎn)換反應(yīng)期間，生產(chǎn)了約20g/l。由此，可以確認(rèn)到甘露醇脫氫酶在阿洛酮糖和果糖一同存在的混合糖底物溶液中選擇性地僅將果糖用作底物。因此，確認(rèn)了可成功適用將在從果糖到阿洛酮糖的轉(zhuǎn)換反應(yīng)之后殘留的果糖轉(zhuǎn)換為甘露醇，從而容易分離阿洛酮糖的本專利的概念。

11.利用多種轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基的甘露醇生產(chǎn)比較

需要尋找用于提高甘露醇生產(chǎn)率的最佳ph條件，從而比較了根據(jù)ph的甘露醇生產(chǎn)量。眾所周知，甘露醇轉(zhuǎn)換反應(yīng)在弱酸性條件下發(fā)生，因而篩選了以弱酸性的ph維持的緩沖溶液。并且，一同確認(rèn)了即使利用無(wú)緩沖溶液而僅由水構(gòu)成的轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基，甘露醇生產(chǎn)是否也有效進(jìn)行。

使用無(wú)緩沖溶液的水(w)、ph為5的乙酸鈉緩沖溶液(sa)、ph為6的哌嗪-1,4-二乙磺酸緩沖溶液(p)來(lái)與以往使用的ph為6.5的磷酸鈉緩沖溶液(sp)比較了甘露醇生產(chǎn)率。未用實(shí)施例表示轉(zhuǎn)換溫度，但利用了比30℃呈現(xiàn)更快的轉(zhuǎn)換反應(yīng)的45℃，作為轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基，在之前說(shuō)明的水或緩沖溶液中包含作為底物的10％(v/v)果糖和555mm的甲酸，若使用緩沖溶液，則使緩沖溶液濃度成為100mm。此外，以與上述實(shí)施例9中的實(shí)驗(yàn)條件相同的條件進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，隨著轉(zhuǎn)換速度變快，轉(zhuǎn)換反應(yīng)進(jìn)行至24個(gè)小時(shí)為止。圖11的(a)部分及圖11的(b)部分示出其結(jié)果。

參照?qǐng)D11的(a)部分，當(dāng)使用ph為6的哌嗪-1,4-二乙磺酸時(shí)，生產(chǎn)約29g/l的甘露醇，從而呈現(xiàn)了最多的甘露醇生產(chǎn)量。并且，當(dāng)使用由水構(gòu)成的轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基時(shí)，與將以往使用的ph為6.5的磷酸鈉緩沖溶液作為轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基來(lái)生產(chǎn)的甘露醇生產(chǎn)量無(wú)差異，從而可以確認(rèn)到即使將水用作轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基來(lái)代替緩沖溶液，也可有效地生產(chǎn)甘露醇。

根據(jù)使用圖11的(a)部分的分別不同的轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基時(shí)的甘露醇生產(chǎn)量和圖11的(b)部分的轉(zhuǎn)換反應(yīng)時(shí)的ph變化的對(duì)照結(jié)果可知，若轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基的ph維持在6.5至7之間，則活躍地進(jìn)行甘露醇的生產(chǎn)。由此，當(dāng)前條件下的最佳甘露醇生產(chǎn)ph視為6.5至7之間，這視為將弱酸性ph5為最佳的甘露醇生產(chǎn)環(huán)境和將弱堿性ph7.5為最佳的甲酸脫氫酶的折中ph。

12.根據(jù)有無(wú)反應(yīng)容器密閉的甘露醇生產(chǎn)量比較

在之前的實(shí)施例中，在轉(zhuǎn)換反應(yīng)中使用錐形管來(lái)在密閉的環(huán)境中實(shí)施了甘露醇轉(zhuǎn)換反應(yīng)。但是，為了確認(rèn)在甲酸的脫氫反應(yīng)過(guò)程中生產(chǎn)的co2不被排出而再次溶解于轉(zhuǎn)換反應(yīng)培養(yǎng)基，從而影響反應(yīng)的情況，使用氣體進(jìn)出自由的試管來(lái)執(zhí)行了實(shí)驗(yàn)。以與將之前實(shí)施例11的水用作轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基的實(shí)驗(yàn)條件相同的條件進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。圖12的(a)部分和圖12的(b)部分示出實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖12的(a)部分表示在作為密閉容器反應(yīng)條件的錐形管和作為開(kāi)放容器反應(yīng)條件的試管中得到的甘露醇生產(chǎn)量。有關(guān)甘露醇生產(chǎn)，可以確認(rèn)到在利用試管的開(kāi)放環(huán)境下，反而更少生產(chǎn)約9倍左右。但是，參照?qǐng)D12的(b)部分的ph測(cè)定結(jié)果，在開(kāi)放環(huán)境下，甘露醇轉(zhuǎn)換反應(yīng)進(jìn)行24個(gè)小時(shí)之后的ph為9.2，可見(jiàn)與密閉環(huán)境下的ph為7.2相比，非常高。其原因推定為在密閉的環(huán)境下，未排出co2而以碳酸形態(tài)溶解于培養(yǎng)基，從而還妨礙ph的上升和甲酸脫氫酶的作用。

甲酸脫氫酶的作用具有通過(guò)甲酸消耗使培養(yǎng)基的ph上升的效果。但是，這應(yīng)該是在開(kāi)放的環(huán)境下，容易排出co2，且甲酸脫氫酶的作用也活躍，從而使ph大大上升，在這種高的ph條件下，甘露醇脫氫酶的作用受到阻礙，從而減少甘露醇生產(chǎn)量的原因。

因此，若甲酸脫氫酶的作用考慮是供給甘露醇脫氫酶的作用所需的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的反應(yīng)，則推定為只要防止在甲酸脫氫酶的反應(yīng)活躍的開(kāi)放的環(huán)境下，ph上升至阻礙甘露醇脫氫酶的反應(yīng)的水平以上，則可得到高的甘露醇生產(chǎn)率。

13.在開(kāi)放的環(huán)境下，利用弱酸性轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基的甘露醇生產(chǎn)

如從之前實(shí)施例12中所確認(rèn)，在利用試管的情況下，由于甲酸脫氫酶的活躍作用，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的供給變得豐富。因此，在開(kāi)放的環(huán)境下，以適合生產(chǎn)甘露醇的方式將ph校正為弱酸性來(lái)生產(chǎn)了甘露醇。以使最終濃度成為300mm的方式向轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基添加哌嗪-1,4-二乙磺酸(ph6)緩沖溶液來(lái)校正了ph，轉(zhuǎn)換溫度利用了45℃。圖13示出其結(jié)果。

參照?qǐng)D13，當(dāng)未校正ph且使用僅由底物和水構(gòu)成的培養(yǎng)基時(shí)，在12個(gè)小時(shí)期間，甘露醇生產(chǎn)量低，是3.6g/l，但若利用哌嗪-1,4-二乙磺酸緩沖溶液來(lái)校正ph，則可以確認(rèn)在24個(gè)小時(shí)的轉(zhuǎn)換反應(yīng)之后，是51g/l，可知100g/l的果糖中的一半轉(zhuǎn)換為甘露醇。這應(yīng)該是在開(kāi)放的環(huán)境下，由于甲酸脫氫酶的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的再生速度得到提高，且因使用哌嗪-1,4-二乙磺酸緩沖溶液來(lái)校正ph而提高甘露醇脫氫酶的甘露醇生產(chǎn)速度的原因。

14.通過(guò)導(dǎo)入果糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)來(lái)提高底物流入量

(1)重組棒狀桿菌菌株的開(kāi)發(fā)

利用眾所周知的流入了果糖的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)來(lái)增加細(xì)胞內(nèi)作為底物的果糖的流入量，從而提高甘露醇的生產(chǎn)量。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)使用了來(lái)源于運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(zymomonasmobilissubsp.mobiliszm4或atcc31821)的酶，并從kctc購(gòu)買(kctc1534)。將所純化的基因組作為模板，并對(duì)于運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)(genbank:aag29864.1；gi:11095424；序列50)將序列51及序列52的引物對(duì)作為引物來(lái)執(zhí)行了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。使用限制酶bamhi及xbai來(lái)向pjc1-1-ct-cmp載體的相同的限制酶部位插入所得到的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物，從而構(gòu)筑了重組載體pjc1-1-ct-glf-cmp。

用于構(gòu)筑的表達(dá)載體(pjc1-1-ct-cmp)是將作為大腸桿菌-棒狀桿菌穿梭載體的pjc1變形而得的，導(dǎo)入了psgt208載體的啟動(dòng)子可變區(qū)域和mcs區(qū)域，追加地，導(dǎo)入棒狀桿菌的終止子區(qū)域來(lái)構(gòu)筑了pjc1-1載體。由trc啟動(dòng)子取代包含pjc1-1載體的lac操縱子的lac啟動(dòng)子區(qū)域來(lái)構(gòu)筑了pjc1-1-ct載體，為了與在之前實(shí)施例中使用的psgt208載體一同用于表達(dá)，由氯霉素抗生素抗性基因取代卡那霉素抗生素抗性基因來(lái)最終構(gòu)筑了pjc1-1-ct-cmp載體。

將之前制備的pjc1-1-ct-glf-cmp重組載體導(dǎo)入于由ps208ct-lpmdh-fdh轉(zhuǎn)化的谷氨酸棒狀桿菌atcc13032(corynebacteriumglutamicumatcc13032)，重組棒狀桿菌菌株在-80℃溫度下進(jìn)行保管來(lái)使用。

(2)利用重組菌株的甘露醇生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)

利用之前構(gòu)筑的重組棒狀桿菌菌株來(lái)以與實(shí)施例13中的條件相同的條件使用哌嗪-1,4-二乙磺酸緩沖溶液轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基進(jìn)行了甘露醇生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)，氯霉素濃度使用了5μg/ml。圖14示出其結(jié)果。

參照?qǐng)D14，在未導(dǎo)入葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)的情況下，在24個(gè)小時(shí)的轉(zhuǎn)換反應(yīng)之后，生產(chǎn)51g/l的甘露醇，相反，在導(dǎo)入葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)來(lái)提高果糖的流入量的情況下，通過(guò)24個(gè)小時(shí)的轉(zhuǎn)換反應(yīng)來(lái)生產(chǎn)95g/l的甘露醇，從而呈現(xiàn)了從果糖接近100％的轉(zhuǎn)換率。

由此，將難以與阿洛酮糖分離的果糖轉(zhuǎn)換為甘露醇，從而可從甘露醇容易分離阿洛酮糖，且將阿洛酮糖和甘露醇混合糖其本身也能夠以高價(jià)的功能性糖所利用。

15.通過(guò)甘露醇轉(zhuǎn)換反應(yīng)液中的甘露醇結(jié)晶化的阿洛酮糖含量增加

(1)通過(guò)添加乙醇的甘露醇的結(jié)晶化

以往的果糖和阿洛酮糖的物理特性類似，從而當(dāng)前難以分離及純化。但是，甘露醇與果糖和阿洛酮糖的溶解度差異大，因而可容易分離及純化。在阿洛酮糖生產(chǎn)工序中，作為底物的果糖以約30％的轉(zhuǎn)換率轉(zhuǎn)換為阿洛酮糖。因此，在使用400g/l的果糖的情況下，反應(yīng)結(jié)束之后的反應(yīng)液混合有約280/l的果糖和約120g/l的阿洛酮糖。

在上述反應(yīng)液中，利用實(shí)施例13的重組棒狀桿菌菌株(ps208ct-mdh-fdh)來(lái)執(zhí)行殘留果糖的甘露醇轉(zhuǎn)換反應(yīng)，從而得到了混合有果糖(140g/l)、甘露醇(140g/l)及阿洛酮糖(120g/l)的最終反應(yīng)液。在微量離心管(eppendorf-tube)中以500μl的方式分注果糖(140g/l)、甘露醇(140g/l)及阿洛酮糖(120g/l)混合糖溶液，并將乙醇從100μl添加至900μl的體積，從而對(duì)溶解度低的甘露醇進(jìn)行結(jié)晶化來(lái)分離。

在添加乙醇之后，在常溫(25℃)條件下定置1個(gè)小時(shí)，并通過(guò)離心分離(13000rpm，10分鐘)來(lái)分離了經(jīng)結(jié)晶化的甘露醇和溶液。以與實(shí)施例9中的條件相同的條件利用高性能液體色譜法來(lái)分析了通過(guò)離心分離所得到的溶液中的糖濃度。圖15示出其結(jié)果。

參照?qǐng)D15，可以確認(rèn)通過(guò)甘露醇結(jié)晶化維持甘露醇轉(zhuǎn)換反應(yīng)液中的果糖和阿洛酮糖的濃度，相反，只有甘露醇的濃度明顯下降。因此，通過(guò)添加乙醇僅分離甘露醇，從而可容易得到阿洛酮糖含量增加的溶液。

(2)通過(guò)蒸發(fā)的甘露醇的結(jié)晶化

將100ml的甘露醇轉(zhuǎn)換反應(yīng)混合糖溶液(果糖140g/l、甘露醇140g/l、阿洛酮糖120g/l)放入燒杯進(jìn)行攪拌，并通過(guò)水浴來(lái)煮。隨著混合糖溶液蒸發(fā)，整體溶液濃度變高，體積減小。此時(shí)，當(dāng)通過(guò)蒸發(fā)的溶液的體積分別減小為100ml、75ml、50ml時(shí)，提取1ml的溶液來(lái)在常溫(25℃)條件下進(jìn)行冷卻，并使甘露醇進(jìn)行結(jié)晶化。在對(duì)冷卻的溶液進(jìn)行離心分離(13000rpm，10分鐘)之后，提取上清液來(lái)以與實(shí)施例9中的條件相同的條件利用高性能液體色譜法來(lái)測(cè)定了糖濃度。圖16示出其結(jié)果。

參照?qǐng)D16，可以確認(rèn)在初始混合糖溶液中，果糖和阿洛酮糖的濃度被濃縮而增加，相反，甘露醇的濃度下降。因此，若果糖轉(zhuǎn)換為甘露醇，則僅通過(guò)提高溫度的方法也可提高混合糖內(nèi)阿洛酮糖比率。

16.從使用高性能液體色譜法的混合糖中分離阿洛酮糖

利用實(shí)施例1的高性能液體色譜法分析條件來(lái)觀察了甘露醇轉(zhuǎn)換反應(yīng)前后的反應(yīng)液內(nèi)的多種混合糖的分離能力狀態(tài)。使用阿洛酮糖生產(chǎn)反應(yīng)液(阿洛酮糖120g/l、果糖280g/l；圖17的(a)部分)、50％甘露醇轉(zhuǎn)換反應(yīng)液(阿洛酮糖120g/l、果糖140g/l、甘露醇140g/l；圖17的(b)部分)、100％甘露醇轉(zhuǎn)換反應(yīng)液(阿洛酮糖120g/l、甘露醇280g/l；圖17的(c)部分)來(lái)進(jìn)行了分析。

參照?qǐng)D17的(a)部分，可以確認(rèn)阿洛酮糖和果糖的停留時(shí)間相似，從而在峰上相重疊的面積寬。參照?qǐng)D17的(b)部分，果糖50％轉(zhuǎn)換為停留時(shí)間更長(zhǎng)的甘露醇，從而呈現(xiàn)阿洛酮糖與果糖相重疊的區(qū)間減小的狀態(tài)。參照?qǐng)D17的(c)部分，若果糖均轉(zhuǎn)換為甘露醇，則可以確認(rèn)阿洛酮糖和甘露醇在高性能液體色譜法峰上完全分離。

用于上述實(shí)驗(yàn)的高性能液體色譜法柱為實(shí)驗(yàn)室水平的柱。產(chǎn)業(yè)用高性能液體色譜法柱的容積大于實(shí)驗(yàn)室水平柱的容積，可在不稀釋的情況下直接分離高濃度的溶液，但分離能力是不及于此的水平。因此，當(dāng)使用產(chǎn)業(yè)用高性能液體色譜法柱時(shí)，阿洛酮糖與果糖的重疊面積更明顯突出。因而，當(dāng)使用產(chǎn)業(yè)用高性能液體色譜法柱時(shí)，為了從果糖有效地分離阿洛酮糖，有利的是，必須將殘留果糖轉(zhuǎn)換為甘露醇。