發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及發(fā)酵方法。具體而言，本發(fā)明涉及利用乙酸轉(zhuǎn)化提高的轉(zhuǎn)化甘油和乙酸的酵母細胞的發(fā)酵方法。本發(fā)明還涉及其中所述酵母細胞生成發(fā)酵產(chǎn)物如乙醇的方法。發(fā)明背景第二代生物乙醇由例如水解成游離單體糖(如己糖和戊糖)以發(fā)酵成乙醇的植物生物質(zhì)的木質(zhì)纖維素級分生產(chǎn)。除生物質(zhì)預(yù)處理和水解期間的糖釋放外，還形成一些有毒副產(chǎn)物。例如，糠醛和hmf就是這些產(chǎn)物中的兩種。它們形成的量取決于幾個預(yù)處理參數(shù)，如溫度、壓力和預(yù)處理時間。木質(zhì)纖維素水解物也含有大量的乙酸，乙酸是微生物如酵母發(fā)酵能力的強抑制物。甘油是糖發(fā)酵成乙醇期間的主要副產(chǎn)物，其主要由于重氧化反應(yīng)消耗在厭氧條件下的生物合成期間形成的過量nadh而形成(vandijken和scheffers，1986)。因此，在工業(yè)發(fā)酵期間，酵母細胞消耗的約5％至10％的糖被轉(zhuǎn)為甘油。降低這種多元醇的量被認為是增加乙醇產(chǎn)量的有前景的途徑。這可以通過調(diào)節(jié)分批補料過程中的進料速率，或通過選擇生成更少甘油的菌株而實現(xiàn)。然而，在文獻中，已經(jīng)報道幾種不同的方法，它們可以幫助減少乙酸對水解物中糖發(fā)酵的抑制作用，以及(例如通過酵母的遺傳工程)通過缺失甘油生成中涉及的基因來(部分)解決氧化還原平衡問題。sonderegger等(2004)公開了在發(fā)酵木糖的saccharomycescerevisiae菌株中磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶和乙醛脫氫酶的異源表達。結(jié)合天然磷酸酮酶，sonderegger等由此生成了功能磷酸酮酶途徑，其能夠凈重氧化nadh，所述nadh由該特定菌株中用于木糖利用的木糖還原酶和木糖醇脫氫酶的異源表達所產(chǎn)生。guadalupe等(2010)描述了一種saccharomycescerevisiae菌株，其中通過破壞內(nèi)源性nad依賴型甘油3-磷酸脫氫酶基因(gpd1和gpd2)而消除副產(chǎn)物甘油的生成。編碼乙酰化nad依賴型乙醛脫氫酶的e.colimhpf基因的表達通過為培養(yǎng)基補充乙酸恢復(fù)了gpd1gpd2雙缺失菌株厭氧生長的能力。yu等(2010)構(gòu)建了經(jīng)代謝工程化以通過甘油脫氫酶(由gcy1編碼)、二羥基丙酮激酶(dak1)和甘油攝取蛋白(gup1)的同時過表達來提高由甘油生成乙醇的saccharomycescerevisiae菌株。在同一團隊的后來報告中(yu等，2012)，描述到分別編碼醇脫氫酶和丙酮酸脫羧酶的adh1和pdc1的額外過表達引起在發(fā)酵條件下的生長速率和甘油消耗增加，導(dǎo)致最終乙醇產(chǎn)量略有增加。lee和dasilva(2006)公開了經(jīng)工程化以通過引入escherichiacolimgs和glda基因的表達等由甘油生成1,2-丙二醇的酵母saccharomycescerevisiae。guadelupe等(2010)(并且還在專利申請wo2011/010923中)描述的技術(shù)提供了用于在生物質(zhì)糖發(fā)酵和前述乙酸發(fā)酵成例如乙醇期間降低水解物的乙酸含量的方法。通過引入額外的nadh生成途徑，例如通過另外(過)表達甘油消耗途徑，進一步增強轉(zhuǎn)化乙酸的能力是有潛在可能性的。在表達厭氧乙酸轉(zhuǎn)化途徑的酵母菌株(例如medina等，2009所描述)中引入前述gup1-、gcy1-和dak1-基因(yu等，2010)后，乙酸轉(zhuǎn)化應(yīng)增加以維持氧化還原平衡，導(dǎo)致水解物的去毒進一步增加且乙醇產(chǎn)量更高。然而yu等的解決方案不起作用，因為酵母甘油脫氫酶(由gcy1編碼)使用nadp+作為輔因子，由于輔因子再生不足而導(dǎo)致輔因子不平衡。替代性甘油脫氫酶(來自于e.coli的glda)結(jié)合乙酸還原途徑一起被測試，并且的確提高了在厭氧生長(發(fā)酵)條件下乙酸的轉(zhuǎn)化(專利申請wo2013/081456)。已知方法的一個缺點是：對于轉(zhuǎn)化甘油/hac的酵母菌株而言，具有高毒性(例如，含有2g/l乙酸或更多)的某些木質(zhì)纖維素水解物的已知分批發(fā)酵是不可行的。我們在本文中發(fā)現(xiàn)并在實施例中描述了這一點。發(fā)明概述因此，本發(fā)明的一個目標是提供發(fā)酵具有高毒性的木質(zhì)纖維素水解物的可行方法。本發(fā)明的另一個目標是提供具有有效的甘油和hac轉(zhuǎn)化的方法。另一個目標是提供一種方法，其中菌株具有提高的糖轉(zhuǎn)化率和改善的細胞生長。根據(jù)本發(fā)明實現(xiàn)了這些目標中的一個或多個，其提供了生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)物的方法，所述方法包括在反應(yīng)器中利用能夠轉(zhuǎn)化糖、甘油和乙酸的細胞發(fā)酵碳源，其中所述碳源包括糖和乙酸，所述方法包括以下步驟：a)用所述細胞接種任選稀釋的碳源；b)任選地，以分批模式發(fā)酵所述反應(yīng)器；c)向所述反應(yīng)器中逐漸加入包含甘油和任選的糖的碳源；d)充足的發(fā)酵時間之后，從所述反應(yīng)器中分離發(fā)酵產(chǎn)物；e)任選地，將步驟d)的分離后剩余的級分保留為廢液(spentbroth)；和f)任選地，在步驟a)中使用所述廢液稀釋所述碳源。如實施例中所示，所述目標得以實現(xiàn)。附圖簡介圖1yd01248在合成培養(yǎng)基上的發(fā)酵性能；糖轉(zhuǎn)化和etoh產(chǎn)生(a)、甘油轉(zhuǎn)化和hac轉(zhuǎn)化、生物質(zhì)(b)；圖2yd01248在甘油濃度遞增的合成培養(yǎng)基上的發(fā)酵性能；圖3yd01248在補充有不同濃度甘油的(nrel)預(yù)處理的玉米稈水解物上的發(fā)酵性能；圖4在補充有不同濃度甘油的(nrel)預(yù)處理的玉米稈水解物的發(fā)酵中，yd01248的酵母生物質(zhì)生長(由od700計算)(a)；以及單位生物質(zhì)葡萄糖轉(zhuǎn)化率(b)和木糖轉(zhuǎn)化率(c)；圖4b和圖4c的圖注與圖4a的圖注相同。圖5a在補充有不同濃度甘油的(nrel)預(yù)處理的玉米稈水解物的發(fā)酵中，在葡萄糖耗盡時(50小時)，yd01248的酵母生物質(zhì)生長(由od700計算)；圖5a、5c和5e的圖注與圖5b的圖注相同。圖5b-e在補充有不同濃度甘油的(nrel)預(yù)處理的玉米稈水解物的發(fā)酵中，在葡萄糖耗盡時(50小時)，yd01248的酵母生物質(zhì)生長(由od700計算)(a)、葡萄糖轉(zhuǎn)化曲線(b)、木糖轉(zhuǎn)化曲線(c)、hac轉(zhuǎn)化曲線(d)和甘油轉(zhuǎn)化曲線(e)；圖6yd01397(a、c)和yd01437(b、d)在合成培養(yǎng)基上的發(fā)酵性能；糖轉(zhuǎn)化和etoh產(chǎn)生(a、b)、甘油轉(zhuǎn)化和hac轉(zhuǎn)化、生物質(zhì)(由od700計算)(c、d)；圖6b的圖注與圖6a的圖注相同；圖6d的圖注與圖6c的圖注相同。圖7在發(fā)酵合成培養(yǎng)基的過程中，菌株yd01397和yd01437的單位生物質(zhì)甘油轉(zhuǎn)化；圖8在補充有甘油的(nrel)預(yù)處理的玉米稈水解物上分批發(fā)酵yd01437；糖轉(zhuǎn)化和etoh產(chǎn)生(a)、甘油轉(zhuǎn)化和hac轉(zhuǎn)化、生物質(zhì)(由od700計算)(b)；圖9在補充有甘油的(nrel)預(yù)處理的玉米稈水解物上分批補料發(fā)酵yd01437；糖轉(zhuǎn)化和etoh產(chǎn)生(a)、甘油轉(zhuǎn)化和hac轉(zhuǎn)化、生物質(zhì)(由od700計算)(b)；圖10在降低的ph下，在補充有甘油的(nrel)預(yù)處理的玉米稈水解物上分批補料發(fā)酵yd01437；t＝0-36小時，在ph5.5下進料；t＝36-75小時，在ph4.3下進料。糖轉(zhuǎn)化和etoh產(chǎn)生(a)、甘油轉(zhuǎn)化和hac轉(zhuǎn)化、發(fā)酵液ph和生物質(zhì)(由od700計算)(b)。圖11圖11(a、c)菌株yd01437在(nrel)預(yù)處理的玉米稈水解物上的有氧ph受調(diào)節(jié)的分批補料增殖，隨后進行補充有甘油的相同水解物的ph受調(diào)節(jié)的分批補料發(fā)酵(b、d)。糖轉(zhuǎn)化和etoh產(chǎn)生(a)、甘油轉(zhuǎn)化和hac轉(zhuǎn)化、發(fā)酵液ph和生物質(zhì)(由od700計算)(b)。圖12實施例6的發(fā)酵系統(tǒng)和ph受調(diào)節(jié)的連續(xù)酵母增殖的示意圖。圖13在補充有甘油的(nrel)預(yù)處理的玉米稈水解物上分批補料發(fā)酵yd01437；起始體積中沒有回收的發(fā)酵液(a、d)；起始體積中有30ml回收的發(fā)酵液(b、e)；起始體積中有90ml(c、f)回收的發(fā)酵液。在圖13a、圖13b、圖13c中使用以下符號：etoh和木糖和葡萄糖的糖轉(zhuǎn)化，發(fā)酵罐體積(......)；在圖13d、圖13e、圖13f中使用以下符號：甘油hacph生物質(zhì)(由od600計算)發(fā)酵罐體積(......)。發(fā)明詳述在本說明書和所附權(quán)利要求的通篇，詞語“包括”、“包含”和“含有”應(yīng)被解釋為包含性的。換言之，在語境允許的情況下，這些詞語意圖傳達的意思是：可以包括其它沒有明確列舉的要素或整體。本文中不使用數(shù)量詞修飾時指的是一個/種或多于一個/種(即一個/種或至少一個/種)語法對象。例如，“要素”可意味著一個/種要素或多于一個/種要素。因此，本發(fā)明涉及生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)物的方法，所述方法包括在反應(yīng)器中利用能夠轉(zhuǎn)化糖、甘油和乙酸的細胞發(fā)酵碳源，其中所述碳源包括糖和乙酸，所述方法包括以下步驟：a)用所述細胞接種任選稀釋的碳源；b)任選地，以分批模式發(fā)酵所述反應(yīng)器；c)向所述反應(yīng)器中逐漸加入包含甘油和任選的糖的碳源；d)充足的發(fā)酵時間之后，從所述反應(yīng)器中分離發(fā)酵產(chǎn)物；e)任選地，將步驟d)的分離后剩余的級分保留為廢液；和f)任選地，在步驟a)中使用所述廢液稀釋所述碳源。如實施例中所示，利用本發(fā)明的方法，實現(xiàn)了發(fā)酵具有高毒性的木質(zhì)纖維素水解物的可行方法。此外，實現(xiàn)了具有有效的甘油和hac轉(zhuǎn)化的方法。此外，在所述方法中，菌株具有提高的糖轉(zhuǎn)化率和改善的細胞生長。此外，來自根據(jù)本發(fā)明的發(fā)酵方法的發(fā)酵液的一個獨特特征是：其具有顯著降低的hac含量(與未發(fā)酵的水解物或現(xiàn)有技術(shù)產(chǎn)物相比)。這允許(部分或全部)發(fā)酵液或蒸餾的發(fā)酵液(釜餾物)再循環(huán)進入隨后的增殖和發(fā)酵循環(huán)的分批相(batchphase)，而不引入抑制濃度的hac。在一種實施方式中，例如，在預(yù)處理之前和/或之后，使用釜餾物的液體級分作為稀釋水。在一種實施方式中，當使用耐蒸餾的熱穩(wěn)定酶時，這允許木質(zhì)纖維素材料水解中所用酶的再循環(huán)。在此更詳細地描述了本發(fā)明方法的實施方式：步驟a)可包括用碳源填充反應(yīng)器。這可以通過任何常規(guī)方式進行?？刹糠只蛲耆畛浞磻?yīng)器?？梢杂嬃刻畛洹Ｔ谠撾A段，可以例如通過加熱或冷卻改變溫度。碳源可以是水性液體、水性漿體。水性液體可包含細胞能夠利用的任何碳源，例如己糖或戊糖，例如葡萄糖、木糖和/或阿拉伯糖。在一種實施方式中，碳源是木質(zhì)纖維素水解物。此外，在步驟a)的一種實施方式中，可任選地用包含2g/l或更少乙酸的液體稀釋碳源。由于碳源對細胞可能有毒性，所以在該步驟中，如果反應(yīng)器的內(nèi)容物對微生物毒性太大，則可以對其進行稀釋。可以通過任何常規(guī)方式，通過添加稀釋劑例如(工藝)水進行稀釋。可以計量稀釋。雖然可以通過常規(guī)方式進行該工藝步驟，但這些步驟的一些參數(shù)可以與特定的已知常規(guī)方法中的參數(shù)不同，如下文更詳細描述的那樣。在步驟a)中，可以使用任何合適的碳源。在一種實施方式中，在步驟a)中，碳源可以是稀釋的木質(zhì)纖維素水解物，更具體的是在水中稀釋兩倍或更多倍的木質(zhì)纖維素水解物。在步驟a)中，向反應(yīng)器中加入細胞。通過已知的方式(例如以細胞群體的形式)向反應(yīng)器內(nèi)容物中加入細胞(接種)。細胞群體可以以干細胞塊(作為乳膏)的形式加入或懸浮于水中。向反應(yīng)器中加入碳源、稀釋碳源和接種這些步驟也可以以任何其它方式進行：將碳源、稀釋劑和初始細胞合在一起，加入例如碳源中，并且可以在不同于反應(yīng)器中的另一個容器中合并碳源和稀釋劑，以供稍后在反應(yīng)器中使用。b)任選地，以分批模式在反應(yīng)器中發(fā)酵初始細胞群體。在該任選步驟中，在一定條件下，以已知方式發(fā)酵初始細胞群體，從而使碳源用于使細胞生長并/或用于產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物。c)向反應(yīng)器中逐漸加入包含甘油和任選的糖的碳源；在該步驟中，向反應(yīng)器中逐漸加入包含甘油和任選的糖的碳源。本發(fā)明允許在乙醇發(fā)酵中使用第一代乙醇設(shè)備釜餾物作為甘油來源。因此，在一種實施方式中，向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入第一代釜餾物?？梢允褂玫母s物的干物質(zhì)含量范圍是常見的，例如，10-60wt％或20-40wt％。甘油濃度通常可以為15g/l-200g/l，例如80-120g/l或約100g/l。在本發(fā)明的一個實施方式中，在乙醇發(fā)酵中使用源自基于酯交換反應(yīng)的生物柴油方法的甘油作為甘油來源。在一種實施方式中，在葡萄糖基本耗盡之后(例如當葡萄糖濃度為2g/l或更低時)或在葡萄糖耗盡之后，加入甘油。在一種實施方式中，加入的甘油的量使得反應(yīng)器中甘油的摩爾濃度為反應(yīng)器中乙酸的摩爾濃度的約兩倍。例如，反應(yīng)器中甘油的摩爾濃度可以是反應(yīng)器中乙酸的摩爾濃度的1.8-2.2倍。在一種實施方式中，加入的甘油來源自基于淀粉或基于蔗糖的乙醇生產(chǎn)設(shè)備。在一種實施方式中，所添加的甘油來源自基于酯交換反應(yīng)的生物柴油生產(chǎn)設(shè)備。在一種實施方式中，當反應(yīng)器中的葡萄糖濃度為2g/l或更低時，開始加入甘油。向水解物或水解物進料中加入甘油來源以使甘油濃度在一定范圍內(nèi)，例如對于17％dspcs而言<8g/l(參見對比實驗c)，對于％ds較高的水解物而言可以更高。在一種實施方式中，濃度使得甘油的mol數(shù)＝hac的mol數(shù)*2。例如甘油的mol數(shù)＝hac的mol數(shù)*1.8-2.2的范圍也是合適的。糖可任選地與甘油一起加入。糖可以是任何糖，例如葡萄糖、木糖和/或阿拉伯糖，單獨地或作為任何底物(例如木質(zhì)纖維素水解物和/或木質(zhì)纖維素水解物的級分)的一部分。在一種實施方式中，通過添加充足的木質(zhì)纖維素水解物，使處于分批補料模式的分批補料反應(yīng)器中的混合物的ph保持基本恒定。在一種實施方式中，分批補料反應(yīng)器中乙酸的濃度為30g/l或更低。在一種實施方式中，進料到分批補料反應(yīng)器中的木質(zhì)纖維素水解物的速率為0.10h-1或更低。在一種實施方式中，進料到分批補料反應(yīng)器中的木質(zhì)纖維素水解物的速率為0.01h-1–0.10h-1。在一種實施方式中，處于分批補料模式的反應(yīng)器中的ph為ph4至ph7、優(yōu)選地ph4至ph5。在一種實施方式中，酵母能夠厭氧發(fā)酵至少一種c6糖和至少一種c5糖。d)充足的發(fā)酵時間之后，從所述反應(yīng)器中分離發(fā)酵產(chǎn)物。充足的發(fā)酵時間是形成期望量的發(fā)酵產(chǎn)物時的時間。這尤其取決于所用微生物、微生物的接種物(pitch)和碳源。例如，合適的發(fā)酵時間可以為例如約72小時、約60小時、約48小時或約24小時。e)任選地，將步驟d)的分離后剩余的級分保留為廢液；和可以利用已知的技術(shù)(例如分離和貯存技術(shù))進行該步驟。f)任選地，在步驟a)中使用所述廢液稀釋所述碳源。(與未發(fā)酵的水解物相比)具有顯著降低的hac含量是廢液(即，來自使用hac轉(zhuǎn)化菌株與如本文所述的進料策略的組合的發(fā)酵方法的發(fā)酵培養(yǎng)液)的一個獨特特征。這允許(部分)廢液或蒸餾的發(fā)酵液(釜餾物)再循環(huán)進入隨后的增殖和發(fā)酵循環(huán)的分批相，而不引入抑制濃度的hac。如果這種廢液還含有殘留的甘油，則使其在隨后的發(fā)酵循環(huán)中所應(yīng)用的級分中再循環(huán)，以降低水解物所需的甘油補充，從而改善轉(zhuǎn)化過程的經(jīng)濟性。因此，本發(fā)明包括使具有降低的hac含量并含有殘留甘油的發(fā)酵液的一部分再循環(huán)進入隨后的增殖或發(fā)酵循環(huán)的分批相。本發(fā)明還涉及根據(jù)上文所述方法獲得的發(fā)酵產(chǎn)物。在一種實施方式中，發(fā)酵產(chǎn)物是乙醇。在一種實施方式中，向發(fā)酵方法中加入增殖方法。在一種實施方式中，一種或多種方法是連續(xù)的。木質(zhì)纖維素水解物本文中的木質(zhì)纖維素水解物是任何水解的木質(zhì)纖維素。本文中的木質(zhì)纖維素是生物質(zhì)。它在本文中包括半纖維素和生物質(zhì)的半纖維素部分。木質(zhì)纖維素還包括生物質(zhì)的木質(zhì)纖維素級分。合適的木質(zhì)纖維素材料可見以下列表：果園底料，樹叢，磨坊廢棄物，城市木材廢棄物，市政廢棄物，伐木廢棄物，森林疏伐廢棄物，短期輪種木本作物，工業(yè)廢棄物，小麥秸，燕麥秸，水稻秸，大麥秸，黑麥秸，亞麻秸，大豆殼，稻殼，水稻秸，玉米谷蛋白飼料，燕麥殼，甘蔗，玉米稈，玉米桿，玉米芯，玉米殼，柳枝稷，芒草，高粱，蕓苔莖，大豆莖，牧場草，磨擦禾，狐尾草；甜菜漿，柑橘果實漿，種子殼，纖維素動物糞便，草坪修剪廢棄物，棉花，海藻，樹木，軟木材，硬木材，白楊，松樹，灌木叢，草，小麥，小麥秸，甘蔗渣，玉米，玉米殼，玉米棒，玉米粒，來自玉米粒的纖維，來自谷物濕磨或干磨的產(chǎn)物和副產(chǎn)物，市政固體廢棄物，廢紙，庭院廢棄物，草本材料，農(nóng)業(yè)殘余物，林業(yè)殘余物，市政固體廢棄物，廢紙，紙漿，造紙廠殘余物，樹枝，灌木，甘蔗，玉米，玉米殼，能源作物，森林，水果，鮮花，谷物，草，草本作物，樹葉，樹皮，針葉，原木，根，樹苗，灌木叢，柳枝稷，樹木，蔬菜，水果皮，藤蔓，甜菜漿，小麥麩皮，燕麥殼，硬木材或軟木材，由農(nóng)業(yè)加工產(chǎn)生的有機廢棄物材料，林業(yè)木材廢棄物或其中任意兩種或更多的組合。木質(zhì)纖維素水解物可以是酸性的。在一種實施方式中，木質(zhì)纖維素水解物包含有機酸。可存在于木質(zhì)纖維素水解物中的有機酸的實例有乙酸和甲酸。在一種實施方式中，有機酸是乙酸。酸性木質(zhì)纖維素水解物是來自其中使用酸的預(yù)處理的常見產(chǎn)物，其導(dǎo)致形成乙酸。細胞本發(fā)明中使用的細胞能夠轉(zhuǎn)化糖、甘油和乙酸。在一種實施方式中，所述細胞能夠由乙酸和甘油產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物(例如，乙醇)，同時還具有發(fā)酵己糖(葡萄糖、果糖、半乳糖等)以及戊糖(如木糖和阿拉伯糖)的能力。在一種實施方式中，所述細胞是酵母細胞。合適酵母細胞的實例是經(jīng)遺傳修飾的酵母細胞，其包含：a)編碼異源nad+依賴型乙酰化乙醛脫氫酶(e.c.1.2.1.10)的一個或多個核苷酸序列；b)編碼同源或異源乙酰-coa合成酶(e.c.6.2.1.1)的一個或多個核苷酸序列；c)編碼異源甘油脫氫酶(e.c.1.1.1.6)的一個或多個核苷酸序列；和d)編碼同源或異源二羥基丙酮激酶(e.c.2.7.1.28或e.c.2.7.1.29)的一個或多個核苷酸序列。在一種實施方式中，所述細胞具有編碼甘油3-磷酸磷酸水解酶和/或編碼甘油3-磷酸脫氫酶基因的一個或多個內(nèi)源核苷酸序列的缺失或破壞。例如歐洲專利申請ep13182222.3中描述了這種細胞，其內(nèi)容被并入本文。在一種實施方式中，酵母細胞具有編碼甘油3-磷酸磷酸水解酶和/或編碼甘油3-磷酸脫氫酶基因的一個或多個內(nèi)源核苷酸序列的缺失或破壞。在一種實施方式中，在所述方法期間，不需要向反應(yīng)器中的混合物中添加堿。在一種實施方式中，酵母能夠代謝有機酸，優(yōu)選代謝乙酸。在一種實施方式中，細胞具有編碼甘油轉(zhuǎn)運體的一個或多個核苷酸序列。歐洲專利申請ep13182225.6中描述了這種細胞，其內(nèi)容被并入本文，例如來自zygosaccharomycesrouxii(zyro0e01210p)的甘油轉(zhuǎn)運體。在一個實施方式中，細胞能夠發(fā)酵c5和/或c6糖，例如木糖、阿拉伯糖、甘露糖或半乳糖。在本發(fā)明的一種實施方式中，經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細胞包含以下之一種或多種：xyla-基因、xyl1基因和xyl2基因和/或xks1-基因，以允許經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細胞發(fā)酵木糖；以及araa、arab和arad基因的一個或多個或者2-10個拷貝，其中這些基因可以整合到細胞基因組中，以允許細胞發(fā)酵阿拉伯糖；醛糖還原酶(gre3)基因的缺失；ppp-基因tal1、tkl1、rpe1和rki1的過表達，以允許提高細胞中通過戊糖磷酸通路的通量。在一個實施方案中，經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細胞是工業(yè)細胞，更優(yōu)選地是工業(yè)酵母。工業(yè)細胞和工業(yè)酵母細胞可如下定義。工業(yè)方法中(酵母)細胞的生存環(huán)境與實驗室中顯著不同。工業(yè)酵母細胞必須能夠在所述方法期間可能變化的多種環(huán)境條件下表現(xiàn)良好。此類改變包括養(yǎng)分來源、ph、乙醇濃度、溫度、氧濃度等等的改變，它們一起對saccharomycescerevisiae的細胞生長和乙醇生產(chǎn)具有潛在的影響。在不利的工業(yè)條件下，環(huán)境耐受菌株會允許強健的生長和生產(chǎn)。對使用工業(yè)酵母菌株的應(yīng)用(例如烘焙工業(yè)、釀造工業(yè)、造酒和乙醇工業(yè))中可能發(fā)生的環(huán)境條件中的這些改變而言，工業(yè)酵母菌株通常更加強健。在一種實施方式中，以工業(yè)宿主細胞為基礎(chǔ)構(gòu)建工業(yè)經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細胞，其中所述構(gòu)建如下文所述進行。工業(yè)酵母(s.cerevisiae)的實例是ethanol(fermentis)、(dsm)和(lallemand)。在一種實施方式中，經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細胞是抑制物耐受的。抑制物耐受是對抑制性化合物的抗性。乙酸乙酸在本文中被理解為包括等效的乙酸酯(鹽)。乙酸(即，乙酸/乙酸酯(鹽))以及甲酸/甲酸酯(鹽)形成水解的木質(zhì)纖維素材料的一部分，其可以用作本發(fā)明的碳源。木質(zhì)纖維素水解物含有大量乙酸，其是微生物(例如酵母)的發(fā)酵能力的有效抑制物。因此，在根據(jù)本發(fā)明的方法中，避免了乙酸對細胞的抑制。所述方法可以根據(jù)以下實施方式進行。在厭氧或缺氧的分批補料發(fā)酵方法中，反應(yīng)器中發(fā)酵液的ph高于進料的ph(對于分批補料而言)。在一種實施方式中，乙酸的進料低于細胞的乙酸轉(zhuǎn)化率。在一種實施方式中，進行分批補料發(fā)酵方法時發(fā)酵培養(yǎng)基中乙酸的濃度為3-15g/lhac。在一種實施方式中，反應(yīng)器中發(fā)酵液的ph值≤5且≥3.5，例如ph為4-4.5。在一種實施方式中，保持分批補料發(fā)酵方法中的底物濃度(c6和c5糖、甘油和hac)低，例如10g/l或更低、7g/l或更低、5g/l或更低或2g/l或更低。分批補料方法分批補料方法可以是發(fā)酵方法，即產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法；或增殖方法，其中細胞是產(chǎn)物。在一種其實施方式中，所述方法是組合的連續(xù)增殖&發(fā)酵方法。在一種實施方式中，增殖方法是需氧的限碳且/或ph受調(diào)節(jié)的分批補料增殖。hac轉(zhuǎn)化是這種方法中的限速步驟。分批補料的優(yōu)點包括：在發(fā)酵期間，乙酸(hac)以及其它底物(c6和c5糖、甘油)的濃度均保持較低，從而消除/降低了它們各自的生長抑制效應(yīng)(去偶聯(lián)、滲透等)。與分批發(fā)酵或傳統(tǒng)的限糖分批補料發(fā)酵相比，這導(dǎo)致：·能夠進行下述水解物發(fā)酵，其中hac對酵母生長和存活的影響嚴重至它們導(dǎo)致生物催化劑的活性不足以完成底物轉(zhuǎn)化。·降低抑制物含量不太嚴重的水解物對酵母接種物的要求。·通過以下方式降低發(fā)酵中細菌污染物的風(fēng)險和實際的糖損失：■使得能夠在低于常用于木質(zhì)纖維素水解物發(fā)酵的ph5-5.5的ph值下發(fā)酵含hac的木質(zhì)纖維素水解物。現(xiàn)在甚至可以在低于hac的pka的ph下進行發(fā)酵；■與限糖或非限糖的分批補料發(fā)酵相比，整個發(fā)酵過程中的etoh濃度更高；與分批發(fā)酵相比，etoh濃度甚至更高；■這些效應(yīng)還能降低/消除對添加抗生素的要求。■該方法導(dǎo)致酶促水解后和發(fā)酵前對滴定劑的要求更低，成本節(jié)省了0.01-0.02$/gal產(chǎn)生的etoh(相較于在發(fā)酵前用氨調(diào)節(jié)ph的17％dm玉米稈水解物)。通過以下實施例來闡釋本發(fā)明，不應(yīng)將其解釋為限制本發(fā)明的范圍。實施例材料和方法培養(yǎng)基在含有10g/l酵母提取物、20g/l蛋白胨、20g/l葡萄糖和15g/l瓊脂(yphd)的固體培養(yǎng)基上，并在含有200mg/l組氨酸且用6nkoh設(shè)定為ph6.0的液體礦質(zhì)培養(yǎng)基(luttik等人，2000)中預(yù)培養(yǎng)菌株。使用合成礦質(zhì)培養(yǎng)基(luttik等人2000)或(nrel)預(yù)處理的玉米稈水解物進行發(fā)酵實驗。每當在組氨酸營養(yǎng)缺陷型的特定發(fā)酵實驗中應(yīng)用菌株時，便用該氨基酸補充發(fā)酵培養(yǎng)基至終濃度為200mg/l。實驗說明中分別列出了糖、乙酸和甘油的初始ph和濃度。對于預(yù)處理的玉米稈水解物的發(fā)酵而言，使用2個不同批次。二者源自分別從nrel獲得的稀酸預(yù)處理的玉米稈，并且在使用2m氨將預(yù)處理材料的ph(從約1-2)調(diào)節(jié)至ph4.5之后，使用dsm的專利酶混合物進行酶促水解。表1中給出了這些水解物的組成。表1.nrel稀酸預(yù)處理的、酶促水解的玉米稈水解物的組成化合物批次1批次2糖單體:(g/l)(g/l)葡萄糖63,0a64,5b木糖40,9a33,6b阿拉伯糖4,8a4,1b甘露糖1,1a半乳糖2,5a果糖0,1a抑制物和副產(chǎn)物:(g/l)(g/l)乙酸b5,15,1乳酸bndnd甲酸b0,30,2甘油bnd0,4乙醇bndnd羥甲基糠醛(hmf)b0,20,4糠醛b1,00,7其它分析:ph4,24,3干物質(zhì)(％(m/m))17,319,5密度1,06g/ml1,05g/mla通過hpaec分析測定，b通過hplc-h分析測定，nd＝未檢出，無或存在可忽略的量。通過離心(30分鐘，4520xg)然后在發(fā)酵前過濾(106μm)上清液來除去水解物中的懸浮固體。這是為了允許通過od測量監(jiān)測酵母生長，并簡化實驗室規(guī)模的分批補料發(fā)酵中水解物的進料。除非另有說明，加入氨(25％(w/v))以將ph調(diào)節(jié)至5.5并充當?shù)础榱朔乐顾馕镏写嬖诘娜魏渭毦廴疚锏脑鲩L，加入新霉素和青霉素g至終濃度分別為50μg/ml和100μg/ml。向每種水解物中加入約250μl/l硅酮消泡劑(dowcorning1520)以防發(fā)泡。加入如上所述的大批量供應(yīng)的2種工業(yè)副產(chǎn)物流之一作為甘油來源；為“糖漿”或“粗甘油”。糖漿(有時也被稱為“可溶物”)是從傳統(tǒng)的(第一代)玉米淀粉-朝向-乙醇設(shè)備獲得的釜餾物的濃縮液體級分(通過蒸發(fā))。“粗甘油”是從基于酯交換反應(yīng)的生物柴油生產(chǎn)設(shè)備獲得的。表2中給出了這些甘油來源的組成。表2.工業(yè)甘油來源“糖漿”和“粗甘油”的組成化合物糖漿粗甘油糖單體:(g/l)(g/l)葡萄糖ab木糖ab阿拉伯糖ab抑制物和副產(chǎn)物:(g/l)(g/l)乙酸b1,9乳酸b20,9甲酸bnd甘油b106,9乙醇bnd羥甲基糠醛(hmf)bnd糠醛bnd其它分析:ph干物質(zhì)％密度g/mlg/mla通過hpaec分析測定，b通過hplc-h分析測定，nd＝未檢出，無或存在可忽略的量。菌株實驗中使用的菌株為yd01248、yd01397和yd01437，其隨后如下所述源自rn1001、rn1041和rn1069。菌株rn1001是菌株rn1041的親本菌株，即在his3基因缺失之前。wo2012/067510中已經(jīng)描述了rn1041。該菌株具有以下基因型：mata、ura3-52、leu2-112、his3::loxp、gre3::loxp、loxp-ptpi1::tal1、loxpptpi1::rki1、loxp-ptpi1-tkl1、loxp-ptpi1-rpe1、δ::padh1-xks1-tcyc1-leu2、δ::ura3-ptpi1-xyla-tcyc1。mata＝接合型a，分別在ura3、leu2和his3基因中的ura3-52、leu2-112、his3::loxp突變。ura3-52突變由piromycesxyla過表達構(gòu)建體上的ura3基因補充；leu2-112突變由xks1過表達構(gòu)建體上的leu2基因補充。his3基因的缺失產(chǎn)生組氨酸營養(yǎng)缺陷型。出于這個原因，rn1041需要培養(yǎng)基中的組氨酸才能生長。gre3::loxp是編碼醛糖還原酶的gre3基因缺失。去除標記后loxp位點留在基因組中。loxp-ptpi1指在本文描述的實驗中，通過用tpi1基因的啟動子置換天然啟動子，來過表達非氧化磷酸戊糖途徑的基因。去除標記后tpi1組成型強啟動子上游的loxp位點留在基因組中(kuyper等，femsyeastresearch5(2005)925-934)。δ::意為在ty1反轉(zhuǎn)座子的長末端重復(fù)序列上重組后，構(gòu)建體的染色體整合。菌株rn1069源自rn1041：通過基因置換破壞了gpd1和gpd2基因。wo2013/081456中也詳細描述了菌株rn1069的構(gòu)建。菌株rn1069的基因型為：mata、ura3-52、leu2-112、his3::loxp、gre3::loxp、loxp-ptpi1::tal1、loxp-ptpi1::rki1、loxp-ptpi1-tkl1、loxp-ptpi1-rpe1、δ::padh1-xks1-tcyc1-leu2、δ::ura3-25ptpi1-xyla-tcyc1gpd1::hphmx、gpd2::natmx。由于未知的原因，該菌株已丟失了其natmx-標記，即不再耐諾爾絲菌素。這允許在隨后的轉(zhuǎn)化實驗中使用該標記。但也可以使用另一種標記來代替。wo2015028583中已描述了菌株yd01248，參見例如實施例2和3。表3：在菌株yd01248中表達的、編碼期望的酶活性的甘油/乙酸基因。基因來源生物體酶活性acdhlactobacillusplantarum乙醛脫氫酶acs2saccharomycescerevisiae乙酰輔酶a連接酶gldaescherichiacoli甘油脫氫酶dak1saccharomycescerevisiae二羥基丙酮激酶通過移除選擇標記物并引入來自zygosaccharomycesrouxii的推定甘油轉(zhuǎn)運體從菌株yd01248得到菌株yd01437，菌株yd01437詳細描述于wo2015028583中，特別是實施例6和7中，菌株t5。預(yù)培養(yǎng)物制備將接種環(huán)量的冷凍(甘油)貯存培養(yǎng)物在yphd(參見“培養(yǎng)基”)上劃線，并在30℃下孵育3天。將獲得的酵母生物質(zhì)從瓊脂平板轉(zhuǎn)移到含有200ml礦質(zhì)培養(yǎng)基(luttik等，2000)的500ml搖瓶中，所述礦質(zhì)培養(yǎng)基含有200mg/l組氨酸并且已經(jīng)用6nkoh設(shè)定為ph6.0。將培養(yǎng)物在振蕩培養(yǎng)箱(200rpm)中在32℃孵育過夜(17-20小時)。通過離心(3分鐘，13500xg)收獲細胞，并用50ml冷(4℃)無菌脫礦質(zhì)水洗滌。將細胞沉淀懸浮在1/3原始培養(yǎng)體積的冷(4℃)無菌脫礦質(zhì)水中。使用先前確定的特定菌株的(干)酵母生物質(zhì)和od700之間的線性相關(guān)性，由懸浮液的od700計算發(fā)酵接種體積。分批發(fā)酵條件除非另有說明，每個發(fā)酵試驗使用500ml燒瓶中體積為400ml的發(fā)酵培養(yǎng)基(80％填充)，將其從預(yù)培養(yǎng)細胞的懸浮液接種至(干)酵母生物質(zhì)濃度為約0.5g/l。當在發(fā)酵中使用組氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株時，向水解物培養(yǎng)基中加入組氨酸至終濃度為200mg/l。使用乙醇發(fā)酵監(jiān)測儀(afm)(applikonbiotechnology,schiedam,荷蘭)進行分批發(fā)酵試驗，將溫度控制在32℃，并在250rpm下攪拌。發(fā)酵期間不控制發(fā)酵液的ph。通過afm在線測量co2產(chǎn)生，其與乙醇(etoh)形成和生物質(zhì)形成的總和相關(guān)，并在發(fā)酵過程中定期取樣，以測定酵母生長、底物利用和產(chǎn)物形成。分批補料發(fā)酵條件類似于分批發(fā)酵實驗進行分批補料發(fā)酵。在終體積為400-800ml時，使用生物活性監(jiān)測儀(bam)(halotec,veenendaal,荷蘭)；其基本上是afm儀器的前身，其中將發(fā)酵燒瓶用常規(guī)磁力攪拌器攪拌并使用水浴在32℃下孵育。使用配備有hplh20vs或hplh200vs泵頭(cat,staufen,德國)的可編程hplh泵定量加入進料。使用minifors發(fā)酵罐(infors-ht，basel，瑞士)進行終體積為800-2000ml的分批補料發(fā)酵，以及其中監(jiān)測ph的所有其它實驗。樣品分析使用配備有保護柱(bio-radh筒)和aminexhpx-87h柱(300x7.8mm；bio-rad，hercules，usa)的帶有柱溫箱cto-10a-vp和自動注射器sil-10ad-vp的shimadzu(’s-hertogenbosch，荷蘭)定量發(fā)酵液樣品中的葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、乙醇、乙酸和甘油。在80℃下利用5mmh2so4以0.6ml*min-1進行洗脫。使用示差折光檢測器rid-10a(shimadzu,’s-hertogenbosch,荷蘭)監(jiān)測洗脫液。請注意，當使用這種分離柱時，木糖、果糖、甘露糖和半乳糖具有相似的保留時間。因此，標有“使用hplc-h分析”的木糖的報告數(shù)量包括所有這些糖單體。從表1可以看出，所用水解物的木糖含量比這些其它糖單體的木糖含量高得多，因此這些其它糖單體對報告的木糖數(shù)量只有很小的影響。如上所述，通過高效陰離子交換色譜法(hpaec)分別分析單糖濃度(葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、果糖)。在配備有dionexcarbopacpa-1柱(4mmidx250mm)連同dionexcarbopacpa保護柱(4mmx50mm)和ed50-檢測器(dionex)的dionex(sunnyvale,usa)ics3000系統(tǒng)上進行hpaec。用水進行23分鐘等度洗脫(20℃，1ml*min-1)。每次洗脫后，進行洗滌步驟(2分鐘，0.15mnaoh；3分鐘，0.15mnaoh+1mnaac；1分鐘，0.15mnaoh)和平衡步驟(1分鐘，水)。通過在分光光度計(perkin-elmerlambda2)中測量700nm處樣品的od來估計發(fā)酵培養(yǎng)液樣品中的酵母生物質(zhì)濃度，根據(jù)發(fā)酵培養(yǎng)基的od進行校正，并使用先前確定的(菌株和儀器-特異性)線性相關(guān)因子來計算(干)酵母生物質(zhì)。必要時，將培養(yǎng)液樣品稀釋至該線性范圍(通常介于0-1od單位之間)。對比實驗a菌株yd01248的發(fā)酵特征使用菌株yd01248在含有約20g/l葡萄糖、20g/l木糖、2g/l乙酸和5g/l甘油的合成培養(yǎng)基上發(fā)酵。利用6mkoh將培養(yǎng)基的初始ph調(diào)節(jié)至4.5。將發(fā)酵培養(yǎng)基接種至od600為約0.9(相當于約0.15g/l(干)酵母生物質(zhì))。圖1中給出了結(jié)果。yd01248在合成培養(yǎng)基上的發(fā)酵性能；糖轉(zhuǎn)化和etoh產(chǎn)生(a)、甘油轉(zhuǎn)化和hac轉(zhuǎn)化、生物質(zhì)(b)。從圖1可以推斷出：在葡萄糖發(fā)酵期間，直到稍晚于24小時，沒有發(fā)生顯著的甘油轉(zhuǎn)化。只有在葡萄糖水平降至低于約5g/l之后，甘油轉(zhuǎn)化才開始。在發(fā)酵的前24小時，乙酸水平略有下降(從2.2g/l到1.6g/l)。在該階段期間，需要發(fā)生乙酸轉(zhuǎn)化，以平衡氧化還原當量(將細胞生長過程中產(chǎn)生的nadh再氧化為nad+)。然而，24小時后，當甘油轉(zhuǎn)化加速時，乙酸轉(zhuǎn)化的速率也加快。在24小時和72小時之間，由于甘油轉(zhuǎn)化和一定程度的酵母生長(直至48小時)，更多乙酸被轉(zhuǎn)化。然而，雖然培養(yǎng)基中存在理論上充足的甘油以向細胞提供足夠的nadh，旨在將所有hac轉(zhuǎn)化為etoh，但是當甘油轉(zhuǎn)化和hac轉(zhuǎn)化由于木糖耗盡而停止時，發(fā)酵培養(yǎng)基中殘留0.8g/lhac。為了改善甘油進入細胞從而提高其轉(zhuǎn)化度，在對比實驗b所述的實驗中提高外部提供的甘油的濃度。對比實驗byd01248在不同甘油濃度的合成培養(yǎng)基中的發(fā)酵特征使用菌株yd01248在含有約20g/l葡萄糖、20g/l木糖、2g/l乙酸的合成培養(yǎng)基上發(fā)酵。分別以0g/l、5g/l、10g/l、15g/l、20g/l和30g/l向培養(yǎng)基中加入甘油。利用6mkoh將培養(yǎng)基的初始ph調(diào)節(jié)至4.5。將發(fā)酵培養(yǎng)基接種至od600為約0.9(相當于約0.15g/l(干)酵母生物質(zhì))。結(jié)果示于圖2。圖2顯示：將發(fā)酵培養(yǎng)基中的甘油濃度從5g/l提高到30g/l會導(dǎo)致更高程度的甘油(2d)轉(zhuǎn)化和hac(2c)轉(zhuǎn)化。然而，這些提高的甘油濃度會負面影響葡萄糖(2a)，并且更大程度地負面影響木糖轉(zhuǎn)化(2b)。對比實驗cyd01248在不同甘油濃度的木質(zhì)纖維素水解物上的發(fā)酵特征以0.5g/l(干)酵母生物質(zhì)的量，使用菌株yd01248在預(yù)處理的玉米稈水解物(nrel批次1，參見表1)上發(fā)酵。分別以0g/l(參照物)、2g/l、4g/l、6g/l、8g/l和15g/l向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入甘油。利用6mkoh將培養(yǎng)基的初始ph調(diào)節(jié)至5.5。結(jié)果示于圖3和圖4。圖3顯示：木質(zhì)纖維素水解物中的甘油(3d)轉(zhuǎn)化和hac(3c)轉(zhuǎn)化比合成培養(yǎng)基上的甘油轉(zhuǎn)化和hac轉(zhuǎn)化(參見對照實驗b)低得多。盡管以高達6g/l的濃度添加甘油僅有限地負面影響糖轉(zhuǎn)化，但是在8g/l和更高的濃度下，其抑制效果看起來急劇增加(3a、b)，這是允許完全轉(zhuǎn)化水解物中存在的hac所必需的。從圖4可以看出，提高發(fā)酵液中的甘油濃度不僅會負面影響酵母的生長速率(a)并從而負面影響發(fā)酵中存在的生物催化劑的總量，而且會負面影響單位生物質(zhì)的葡萄糖消耗率(b)和木糖消耗率(c)，這兩種效應(yīng)都有助于次佳的糖轉(zhuǎn)化(率)。這些結(jié)果表明：當使用比得上yd01248的甘油轉(zhuǎn)化和hac轉(zhuǎn)化菌株發(fā)酵補充有甘油的木質(zhì)纖維素水解物時，待用于發(fā)酵培養(yǎng)基中的最佳甘油濃度是增加的甘油/hac-轉(zhuǎn)化與(c5)糖轉(zhuǎn)化程度之間的權(quán)衡。由于在葡萄糖濃度變低之前不使用甘油，所以改善這種權(quán)衡的一種方法是：在轉(zhuǎn)化開始之前(處于低葡萄糖濃度)，不向發(fā)酵提供甘油。從而避免了甘油對酵母的葡萄糖轉(zhuǎn)化和生長率的負面影響，而不損害甘油轉(zhuǎn)化。為了驗證這一假設(shè)，進行對比實驗d中描述的實驗。對比實驗d在葡萄糖發(fā)酵結(jié)束時加入甘油進行木質(zhì)纖維素水解物的分批發(fā)酵以0.5g/l(干)酵母生物質(zhì)的量，使用菌株yd01248在預(yù)處理的玉米稈水解物(nrel批次1，參見表1)上發(fā)酵。利用6mkoh將培養(yǎng)基的初始ph調(diào)節(jié)至5.5。由于甘油僅在葡萄糖降至低于約5g/l之后才轉(zhuǎn)化(先前的對比實驗c)，所以在葡萄糖幾乎耗盡(50小時)時加入甘油至濃度分別為0g/l(參照物)、2g/l、4g/l、6g/l、8g/l和15g/l，以防止在葡萄糖發(fā)酵階段抑制酵母生長。圖5顯示：在葡萄糖(幾乎)耗盡并且大部分生長已發(fā)生(5a)時向發(fā)酵培養(yǎng)液中加入甘油，避免了抑制酵母生物質(zhì)形成。應(yīng)用該策略時，可以應(yīng)用在對比實驗c中證明強烈抑制糖轉(zhuǎn)化的甘油濃度(≥8g/l)，以改善甘油(5d)轉(zhuǎn)化和hac(5e)轉(zhuǎn)化，而不會很大程度地損害糖轉(zhuǎn)化，這相較于在發(fā)酵開始時添加甘油，導(dǎo)致更有效的乙醇生產(chǎn)。發(fā)酵120小時之后，實現(xiàn)了最高的甘油轉(zhuǎn)化和hac轉(zhuǎn)化，分別提高了1.0g/l(1.4g/l到2.4)和0.4g/l(1.2g/l到1.6g/l)。應(yīng)用該方法時，甘油轉(zhuǎn)化和hac轉(zhuǎn)化的最佳甘油濃度≥15g/l。然而，添加甘油至其濃度高于完全轉(zhuǎn)化給定水解物中存在的hac理論所需濃度(對于含5.1g/lhac的這種特定的nrel預(yù)處理的玉米稈水解物：15.6g/l甘油，化學(xué)計量轉(zhuǎn)化率為2摩爾甘油酶/1摩爾hac(忽略由厭氧酵母生長產(chǎn)生的nadh所實現(xiàn)的hac轉(zhuǎn)化))從經(jīng)濟角度來看是次佳的，因為其將不可避免地留下相對大量的未轉(zhuǎn)化甘油。這個問題的更好解決方案是：通過使得能夠進行葡萄糖-甘油共轉(zhuǎn)化，將甘油/hac轉(zhuǎn)化期從僅在木糖發(fā)酵階段期間擴展到發(fā)酵的整個持續(xù)時間，以改善甘油(和伴隨的hac)轉(zhuǎn)化。在甘油和hac-轉(zhuǎn)化酵母菌株(描述于專利申請wo2015028583中)中表達來自z.rouxii的甘油-質(zhì)子同向轉(zhuǎn)運體(symporter)能夠?qū)崿F(xiàn)這個方案，并且還會提高酵母對甘油的親和力，從而可以在發(fā)酵液中留下較少殘余甘油(對比實驗e)。對比實驗e使用含有外源甘油同向轉(zhuǎn)運體的菌株分批發(fā)酵含有甘油的合成培養(yǎng)基使用菌株yd01397(描述于專利申請wo2015028583中，特別是實施例6和7中，菌株t3)和yd01437(表達來自z.rouxii的甘油-質(zhì)子同向轉(zhuǎn)運體，描述于wo2015028583中，特別是實施例6和7中，菌株t5)發(fā)酵含約20g/l葡萄糖、20g/l木糖、2g/l乙酸和10g/l甘油的合成培養(yǎng)基，菌株yd01397和yd01437的濃度為約0.125g/l(干)酵母生物質(zhì)。利用6mkoh將培養(yǎng)基的初始ph調(diào)節(jié)至4.5。將發(fā)酵培養(yǎng)基接種至od600為約0.9。圖6顯示：yd01397中的甘油攝取僅在葡萄糖幾乎耗盡(約23小時)之后方才開始，而菌株yd01437在20g/l葡萄糖時明顯共轉(zhuǎn)化葡萄糖和甘油。yd01437中的甘油轉(zhuǎn)化率(圖7)也顯著提高。然而，這種提高水平的甘油輸入和/或轉(zhuǎn)化嚴重抑制了糖轉(zhuǎn)化率和生物質(zhì)生長。圖7在發(fā)酵合成培養(yǎng)基的過程中，菌株yd01397和yd01437的單位生物質(zhì)甘油轉(zhuǎn)化。對比實驗f使用表達外源甘油同向轉(zhuǎn)運體的菌株分批發(fā)酵補充有甘油的木質(zhì)纖維素水解物對酵母菌株yd01437進行預(yù)培養(yǎng)、收獲、洗滌并重懸至(干)生物質(zhì)濃度為50g/l。將含有(900ml)預(yù)處理的玉米稈水解物(nrel批次2，參見表1)(補充有12.2g/l甘油并利用6mkoh調(diào)節(jié)至ph5.5)的(1000ml)發(fā)酵罐接種至基于最終發(fā)酵體積為1.0g/l(干)酵母生物質(zhì)。在32℃下進行厭氧發(fā)酵，并以150rpm攪拌。圖8顯示：菌株yd01437明顯共消耗葡萄糖(a)、甘油和hac(b)。然而，hac、甘油與水解物混合物中存在的其它化合物的抑制效果的組合導(dǎo)致發(fā)酵中的糖轉(zhuǎn)化和酵母生長非常緩慢和低效。通過應(yīng)用分批補料發(fā)酵能夠降低這些抑制效果，如實施例1所示。實施例1使用表達外源甘油同向轉(zhuǎn)運體的菌株分批補料發(fā)酵補充有甘油的木質(zhì)纖維素水解物對酵母菌株yd01437進行預(yù)培養(yǎng)、收獲、洗滌并重懸至生物質(zhì)濃度為50g/l(干)，然后加入到空的(1000ml)發(fā)酵罐中至基于最終發(fā)酵體積為1.0g/l(干)酵母生物質(zhì)。隨后利用補充有12.2g/l甘油并利用6mkoh調(diào)節(jié)至ph5.5的900ml預(yù)處理的玉米稈水解物(nrel批次2，參見表1)以恒定的進料速率向發(fā)酵罐進料93.75小時。在32℃下進行厭氧發(fā)酵，并以150rpm攪拌。圖9所示的獲得的發(fā)酵數(shù)據(jù)顯示：從進入發(fā)酵至少6小時(第一次取樣)開始，酵母能夠以近似于將其進料到發(fā)酵罐的速率轉(zhuǎn)化葡萄糖、木糖、hac和甘油，從而導(dǎo)致這些底物在發(fā)酵過程中保持相對較低，這與對照實驗f的分批發(fā)酵相反。由于這些低濃度，這些化合物的抑制效應(yīng)(如對比實驗f中所示)顯著降低，從而抵消了它們對糖的不利影響，進而導(dǎo)致了發(fā)酵120小時之后明顯改善的底物轉(zhuǎn)化水平和增加的etoh含量?！?yōu)點：在發(fā)酵期間，hac以及其它底物的濃度(c6和c5糖、甘油)均相對較低，從而降低了它們各自的生長抑制效應(yīng)(去偶聯(lián)、滲透等)。與分批發(fā)酵或傳統(tǒng)的限糖分批補料發(fā)酵相比，這導(dǎo)致：·使得能夠進行這樣的水解物發(fā)酵，其中hac對酵母生長和存活的影響嚴重至它們導(dǎo)致生物催化劑的活性不足以完成底物轉(zhuǎn)化?！そ档鸵种莆锖坎惶珖乐氐乃馕飳湍附臃N物的要求。實施例2在降低的ph下分批補料發(fā)酵補充有甘油的木質(zhì)纖維素水解物在實施例1中所述的實驗中，與對比實驗f的分批發(fā)酵相比，hac、糖和甘油的濃度劇烈降低。為了保持這些化合物對酵母的抑制效應(yīng)盡可能的低，理想地，在發(fā)酵的整個持續(xù)時間內(nèi)，這些濃度接近于0g/l。相較于實施例1(其中2.1g/lhac保持未轉(zhuǎn)化)中的實驗，為了改善hac轉(zhuǎn)化率，通過加入在酶促水解后未進行ph調(diào)節(jié)的水解物/甘油混合物來維持發(fā)酵培養(yǎng)液的ph較低。因此，可用于轉(zhuǎn)化為etoh的發(fā)酵培養(yǎng)液中未解離的hac級分增加，并且總殘留hac隨后降低。對酵母菌株yd01437進行預(yù)培養(yǎng)、收獲、洗滌并重懸至生物質(zhì)濃度為50g/l(干)，然后加入到3個空的(1000ml)發(fā)酵罐中至基于最終發(fā)酵體積為1.0g/l(干)酵母生物質(zhì)。最初利用補充有12.2g/l甘油并利用6mkoh調(diào)節(jié)至ph5.5的預(yù)處理的玉米稈水解物(nrel批次2，參見表1)以0.20ml/min的恒定速率(1.31％最終體積/小時，相當于總進料時間為75小時)向發(fā)酵罐進料。在32℃下進行缺氧發(fā)酵，并以150rpm攪拌。圖10顯示：從36小時開始添加未經(jīng)ph調(diào)節(jié)的進料導(dǎo)致培養(yǎng)液的ph降低(b)，但發(fā)酵仍然與僅進料ph5.5的水解物/甘油混合物的發(fā)酵幾乎相同地進行(實施例1，圖9)?！?yōu)點：通過以下方式降低發(fā)酵中歸因于細菌污染物的糖損失：·使得能夠在低于木質(zhì)纖維素水解物發(fā)酵慣用的ph5-5.5的ph值下發(fā)酵含hac的木質(zhì)纖維素水解物。在培養(yǎng)液中的hac濃度非常低時，甚至可以在低于hac的pka的ph下進行發(fā)酵，這在傳統(tǒng)的(第一代)糖/淀粉-朝向-etoh設(shè)備中是常見的，因為它有利于酵母菌超過細菌生長?！づc限糖或非限糖的分批補料發(fā)酵相比，整個發(fā)酵過程中的etoh濃度更高；與分批發(fā)酵相比，etoh濃度甚至更高。這些效應(yīng)還降低/消除了對添加抗生素的要求。實施例3分批補料發(fā)酵補充有工業(yè)甘油來源的木質(zhì)纖維素水解物重復(fù)實施例1的實驗，并通過添加工業(yè)副產(chǎn)物流向水解物補充甘油；一種利用(第一代)淀粉-朝向-etoh的“糖漿”，另一種利用基于酯交換反應(yīng)的生物柴油“粗甘油”(參見表2的組成)?！疤菨{”或“可溶物”是從傳統(tǒng)的(第1代)玉米淀粉-朝向-乙醇設(shè)備(通過蒸發(fā))獲得的釜餾物的濃縮液體級分(見表2)。將甘油來源混合到水解物進料中，以使得獲得的混合進料中甘油與hac的摩爾比為2:1。由于這引起水解物的輕微稀釋，因此還在表2的最右欄中示出所得混合進料的分析。結(jié)果如圖11(a-d)所示；甘油來源：1g糖漿(a、c)和源自生物柴油的甘油(b、d)。在發(fā)酵轉(zhuǎn)化中引入的另外的糖和hac在發(fā)酵結(jié)束時轉(zhuǎn)變?yōu)槁晕⑻岣叩膃toh滴度。優(yōu)點：·釜餾物可在與第一代乙醇設(shè)備位于同一位置的生物煉制廠現(xiàn)場直接獲得。·釜餾物含有來自c6發(fā)酵的(大部分裂解的)酵母的營養(yǎng)物，其在木質(zhì)纖維素水解物發(fā)酵中有益于酵母生長。這些營養(yǎng)物還包括氮，取決于水解物的初始n含量和預(yù)期的n源(例如氨)的價格，這會導(dǎo)致節(jié)省高達0.03$/gal添加到水解物的n-源?！じs物含有來自c6發(fā)酵的殘留糖，這會提高木質(zhì)纖維素水解物發(fā)酵的可能最終etoh滴定度?！じs物往往含有在c6發(fā)酵中產(chǎn)生的hac，其也可能在木質(zhì)纖維素水解物的發(fā)酵中被轉(zhuǎn)化為etoh?！按指视汀笔菑幕邗ソ粨Q反應(yīng)的生物柴油生產(chǎn)獲得的(見表2)。將其混合到水解物進料中，以使得獲得的混合進料中甘油與hac的摩爾比為2:1?！?yōu)點：·粗甘油可以以生物柴油生產(chǎn)的主要副產(chǎn)物的形式大批量獲得，其是由植物或動物脂肪和油的酯交換反應(yīng)生成的。由于雜質(zhì)(例如甲醇、鹽和脂肪酸)的存在，粗甘油的價值相對較低，因此對于本應(yīng)用而言是經(jīng)濟上有吸引力的甘油來源?！ご指视蜁兊迷絹碓饺菀自谂c第一代etoh設(shè)備位于同一位置的生物煉制廠(其中由提取的玉米油生產(chǎn)生物柴油)現(xiàn)場作為副產(chǎn)物獲得。在這種方法中，使用現(xiàn)場產(chǎn)生的etoh而非甲醇進行酯交換反應(yīng)；當在本文所述的發(fā)酵方法中應(yīng)用甘油副產(chǎn)物時，粗甘油中的任何殘留etoh都會被回收?！び捎诒疚乃龇椒ㄖ性O(shè)想的甘油-水解物共混比中的稀釋(4-8倍)，濃度相當高的雜質(zhì)例如鹽(k2so4或nacl，高達7％w/v)將不是大問題，在由于經(jīng)濟原因而需要利用未稀釋或稀釋度低的粗甘油的方法中，所述濃度相當高的雜質(zhì)會抑制微生物轉(zhuǎn)化。當使用粗甘油作為甘油來源時，由于雜質(zhì)(鹽)的引入，發(fā)酵速率略微降低。實施例4以ph受調(diào)節(jié)的進料曲線分批補料增殖和發(fā)酵含有甘油的木質(zhì)纖維素水解物為了保持糖、hac和甘油對酵母的抑制效應(yīng)盡可能的低，理想地，在發(fā)酵的整個持續(xù)時間內(nèi)，這些化合物的濃度為(接近于)0g/l。雖然在木質(zhì)纖維素水解物中，糖通常以比hac(和補充的甘油)更高的濃度存在，但是當應(yīng)用旨在保持所有(抑制酵母的)底物水平低的進料策略時，甘油和hac利用是限速的，這是因為甘油和hac的轉(zhuǎn)化率(通過nad+-nadh輔因子利用而偶聯(lián))遠低于水解物中存在的糖的轉(zhuǎn)化率。理想地，定量進料與發(fā)酵液中的剩余的hac直接偶聯(lián)。如在實施例2中所觀察到的那樣，發(fā)酵培養(yǎng)液的ph值指示hac的殘留濃度。因此，通過使用(酸性)水解物進料進行ph調(diào)節(jié)，可以使殘留的hac偶聯(lián)的進料自動化，這類似于專利申請wo2014072232-a1中所述的ph受調(diào)節(jié)的需氧分批補料酵母增殖。加上這種方法的實用性，ph是(乙醇)發(fā)酵過程中已經(jīng)普遍(在線)測量的參數(shù)，因此在大規(guī)模應(yīng)用時不需要大的硬件改造投資。通過根據(jù)wo2014072232a1進行菌株yd01437的需氧ph受控制的分批補料酵母增殖來開始實驗。不調(diào)節(jié)進料的ph(酶促水解后，從ph4.3開始)。通過定量加入木質(zhì)纖維素水解物進料持續(xù)72小時，將增殖培養(yǎng)液的ph控制在4.5。此時停止發(fā)酵罐通氣，之后從發(fā)酵罐中移出一部分增殖培養(yǎng)液，在發(fā)酵罐中留500ml培養(yǎng)液(相當于發(fā)酵罐最小工作體積)，其含有23.4g/l(干)酵母生物質(zhì)。轉(zhuǎn)變?yōu)槿毖鯒l件之后，通過定量加入木質(zhì)纖維素水解物和甘油的混合物，其中甘油與hac的摩爾比為2:1，將發(fā)酵液的ph控制在4.5。還不調(diào)節(jié)進料的ph值(從ph4.3開始)。結(jié)果如圖12所示。在圖12中，(a、c)是菌株yd01437在(nrel)預(yù)處理的玉米稈水解物上的需氧ph受調(diào)節(jié)的分批補料增殖，(b、d)是補充有甘油的相同水解物的ph受調(diào)節(jié)的分批補料發(fā)酵。糖轉(zhuǎn)化和etoh產(chǎn)生(a)、甘油轉(zhuǎn)化和hac轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)液ph和生物質(zhì)(由od700計算)(b)。實施例5利用甘油再循環(huán)分批補料發(fā)酵木質(zhì)纖維素水解物當向體積相對較小的培養(yǎng)液進料水解物/甘油混合物時，可以通過下述方法來防止發(fā)酵早期hac、甘油和糖的峰濃度：增加分批相體積，從而有效降低進料開始時相對較高的稀釋率?？梢酝ㄟ^兩種方式實現(xiàn)分批相體積的增加：通過以較低的最終酵母生物質(zhì)濃度進行增殖過程，因此在發(fā)酵中使用較大體積的增殖培養(yǎng)液。然而，從經(jīng)濟角度來看，這是不期望的，因為會需要相應(yīng)較大的增殖罐(propagator)，從而導(dǎo)致資本支出(capex)增加。稀釋增殖培養(yǎng)液。這通常在木質(zhì)纖維素水解物的工業(yè)發(fā)酵中通過向發(fā)酵罐中加入生產(chǎn)用水(processwater)進行。然而，這也是不期望的，因為會將額外的水引入系統(tǒng)，從而增加總發(fā)酵體積(需要較大的發(fā)酵罐和增加的資本支出)、降低最終的etoh滴度(蒸餾中較低的(能量)效率)，進而導(dǎo)致運營支出(opex)增加。此外，需要在蒸餾的下游處理稀釋水(蒸發(fā)/厭氧消化池)，從而導(dǎo)致生產(chǎn)成本進一步提高(資本支出&運營支出)。來自使用hac-轉(zhuǎn)化菌株與如本文所述的進料策略組合的發(fā)酵方法的發(fā)酵液的獨特特征之一是：其具有顯著降低的hac含量(與未發(fā)酵的水解物相比)。這允許(部分)發(fā)酵的培養(yǎng)液或蒸餾的發(fā)酵培養(yǎng)液(釜餾物)再循環(huán)進入隨后的增殖和發(fā)酵循環(huán)的分批相，而不引入抑制濃度的hac。如果這種發(fā)酵的培養(yǎng)液還含有殘留的甘油，則使其在隨后的發(fā)酵循環(huán)中所應(yīng)用的級分中再循環(huán)，以降低水解物所需的甘油補充，從而改善轉(zhuǎn)化過程的經(jīng)濟性。如下開始實驗：根據(jù)wo2014072232a1在預(yù)處理的玉米稈水解物批次3(表1)上進行菌株yd01437的ph受控制的需氧分批補料酵母增殖，其中固定稀釋率為0.06hr-1。調(diào)節(jié)進料的ph(酶促水解后，從4.3到5.5)。50小時(此時已加入了約800ml水解物進料)之后，從發(fā)酵罐中收獲增殖培養(yǎng)液。此時，增殖培養(yǎng)液含有34gdcw/l酵母生物質(zhì)，而所有可發(fā)酵c源(葡萄糖、木糖、hac和甘油)的濃度均>1g/l。將等份的30ml發(fā)酵液(含有1.0gdcw酵母生物質(zhì))轉(zhuǎn)移到分別含有0ml、30ml和90ml再循環(huán)發(fā)酵培養(yǎng)液的(1000ml)發(fā)酵罐中(含有0.4g/l葡萄糖、0.5g/l木糖、1.7g/lhac和2.8g/l甘油作為可發(fā)酵c源，以及47.5g/letoh，ph為7.7)。由于這種培養(yǎng)液在從發(fā)酵罐中收獲之后已被過濾(0.2μm孔徑)，因此使得能夠(在4℃下)貯存而不發(fā)生腐敗，并且使得能夠通過隨后發(fā)酵中的od測量來進行生物質(zhì)監(jiān)測，這種培養(yǎng)液不含來自先前發(fā)酵的酵母活性。隨后以恒定的進料速率經(jīng)94小時向發(fā)酵罐中加入總量為745ml的預(yù)處理的玉米稈水解物(nrel批次3，參見表1)，其補充有14.3g/l甘油并用6mkoh調(diào)節(jié)至ph5.5。在32℃進行厭氧發(fā)酵，以150rpm攪拌培養(yǎng)液。結(jié)果示于圖13中。圖13顯示：通過添加再循環(huán)發(fā)酵液將分批體積增加至2倍，沒有產(chǎn)生不利影響(a、d相對于b、e)。即使以4倍增加分批體積，稀釋酵母生物質(zhì)的效果也是有限的，導(dǎo)致糖轉(zhuǎn)化率略有降低。在通過轉(zhuǎn)化為etoh而使乙酸濃度降低更具挑戰(zhàn)性的發(fā)酵中(例如毒性更高的水解物)，存在過量進料的風(fēng)險。當向培養(yǎng)液中加入的hac比酵母能夠轉(zhuǎn)化的hac多時，殘留的hac導(dǎo)致在發(fā)酵培養(yǎng)液中的高濃度，這是由于發(fā)酵罐中只有很小的液體體積，因此這種殘留的hac未被大幅稀釋。培養(yǎng)液中高濃度的hac隨后抑制其通過酵母轉(zhuǎn)化為etoh，這可導(dǎo)致發(fā)酵卡滯或至少緩慢。通過在進料之前向發(fā)酵罐中加入來自先前發(fā)酵的脫毒培養(yǎng)液，加入發(fā)酵罐的未直接轉(zhuǎn)化的任何hac被更強烈地稀釋，從而有效地阻抑過量進料的抑制作用，并允許培養(yǎng)液中hac的轉(zhuǎn)化繼續(xù)進行并且當稀釋因子逐漸變得越來越小時，可能在發(fā)酵稍后的時候趕上。實施例6偶聯(lián)的連續(xù)增殖和發(fā)酵系統(tǒng)圖12)示出了該實驗的示意圖。通過向2個發(fā)酵罐(圖12：1-2)中填充1/5其終體積的(nrel預(yù)處理的玉米稈，批次2)水解物(見表1)和4/5體積的水來開始實驗。用營養(yǎng)物補充發(fā)酵罐1中的培養(yǎng)基，用釜餾物補充發(fā)酵罐2中的培養(yǎng)基(見表2)，以使得兩個發(fā)酵罐中甘油與hac的摩爾比為2:1)。將發(fā)酵罐1接種至新預(yù)培養(yǎng)的菌株yd01437的濃度為約0.02g/l，并以1vvm通氣(圖12：3)。通過攪拌器級聯(lián)系統(tǒng)(150-500rpm)將溶解氧氣控制在20％(圖12：4)。酵母利用來自稀釋的水解物的可用碳源進行生長和維持。hac的連續(xù)轉(zhuǎn)化導(dǎo)致培養(yǎng)液ph升高(圖12：5)。隨后通過向發(fā)酵罐中定量加入(酸性)水解物(圖12：6)來將ph維持在4.5，這有效地導(dǎo)致ph受調(diào)節(jié)的進料，其使平均稀釋率穩(wěn)定在約0.09hr-1。雖然向發(fā)酵罐中加入了額外的水解物，但培養(yǎng)液中hac的濃度保持在接近0g/l，從而允許酵母有效生長。水解物中酵母生物質(zhì)的濃度逐漸提高至約46g/l(干)。發(fā)酵罐1中的最高水平指示物(圖12：8)會觸發(fā)一個泵，該泵提供從發(fā)酵罐1到發(fā)酵罐2的連續(xù)的增殖培養(yǎng)液流(圖12：2)。在發(fā)酵罐1中(厭氧)增殖的酵母在發(fā)酵罐2中轉(zhuǎn)化葡萄糖、木糖、甘油和hac。發(fā)酵罐2中的最高水平指示物(圖12：9)會觸發(fā)一個泵，該泵提供離開發(fā)酵罐2的連續(xù)的發(fā)酵培養(yǎng)液流(圖12：10)。在工業(yè)環(huán)境中，將這種流進料至蒸餾系統(tǒng)，任選地通過緩沖罐進行。來自發(fā)酵罐1的新增殖酵母的連續(xù)流入(圖12：8)提高了發(fā)酵罐2中的酵母濃度，使得達到了一定程度的甘油和hac轉(zhuǎn)化，其將培養(yǎng)液的ph提高至觸發(fā)2種單獨的進料(水解物(圖12：11)和釜餾物(圖12：12))到發(fā)酵罐2的設(shè)定點水平。設(shè)定這些進料之間的比例，使得合并的進料流入(水解物+釜餾物)中甘油與hac的摩爾比為2:1。在這種組合的連續(xù)增殖和發(fā)酵系統(tǒng)中，在發(fā)酵部分中酵母的量與發(fā)酵停留時間之間自動建立平衡。通過改變發(fā)酵罐1的工作體積可手動調(diào)節(jié)酵母生物質(zhì)的通量；(通過調(diào)節(jié)水平傳感器的高度(圖12：7))；較小的增殖體積會降低酵母產(chǎn)量?？梢酝ㄟ^改變發(fā)酵罐2的ph控制設(shè)置來手動調(diào)節(jié)hac轉(zhuǎn)化度；降低這種設(shè)置會減少必須轉(zhuǎn)化以觸發(fā)(酸性)進料的hac部分。文獻●vandijken和scheffers(1986)“redoxbalancesinthemetabolismofsugarsbyyeasts”.femsmicrobiologyletters第32卷.第3-4期.第99–224頁；●sonderegger等人(2004)“metabolicengineeringofaphosphoketolasepathwayforpentosecatabolisminsaccharomycescerevisiae”.aem70(5).2892-2897；●guadalupemedinav.almeringmj.vanmarisaj.pronkjt(2009)“eliminationofglycerolproductioninanaerobicculturesofsaccharomycescerevisiaeengineeredforuseofaceticacidaselectronacceptor.”applenvironmicrobiol.第190-195頁；●yu等人(2010)“engineeringofglycerolutilizationpathwayforethanolproductionbysaccharomycescerevisiae”.bioresour.technol.101(11):4157-4161；●yu等人(2012)“improvementofethanolyieldfromglycerolviaconversionofpyruvatetoethanolinmetabolicallyengineeredsaccharomycescerevisiae”,appl.biochem.biotechnol.2012年2月,第166(4)卷,第856-865頁●lee和dasilva(2006)“applicationofsequentialintegrationformetabolicengineeringof1.2-propanediolproductioninyeast”.metab.eng.8(1):58-65；●luttik等人(2000)“thesaccharomycescerevisiaeicl2geneencodesamitochondrial2-methylisocitratelyaseinvolvedinpropionyl-coenzymeametabolism”,j.bacteriol.2000年12月,812(24)第7000-7013頁.當前第1頁12