專利名稱：發(fā)酵法生產(chǎn)甘油的二步發(fā)酵生產(chǎn)工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及發(fā)酵法生產(chǎn)甘油尤其是二步發(fā)酵生產(chǎn)工藝。
目前，甘油發(fā)酵常規(guī)工藝大規(guī)模工業(yè)化的關(guān)鍵困難是產(chǎn)品后提取，如G.Martin所著的《The Manufacture of Glycerol》一書(shū)中(Sec.III.PT)就明確記載有″從發(fā)酵法生產(chǎn)甘油的發(fā)酵液中提取甘油是相當(dāng)困難的″. P.Kishore等人在″Concentrationof Glycerol inFermentation BathsbyReverse Osmosis″(J.Microbio，Biotech-nol.1987，2(1)，22-27)一文中亦認(rèn)為“從甘油發(fā)酵液中提取甘油是發(fā)酵法生產(chǎn)甘油的瓶頸問(wèn)題”，并提出采用反滲透法解決該問(wèn)題的可能性。
具體的說(shuō)，發(fā)酵甘油的提取困難在于發(fā)酵培養(yǎng)基的起始葡萄糖濃度在25％左右，發(fā)酵后期當(dāng)糖濃度降到1～4％，甘油濃度達(dá)到8～12％時(shí)，菌體由于葡萄糖效應(yīng)而不再消耗殘留糖生產(chǎn)甘油，卻反過(guò)來(lái)將細(xì)胞外的甘油作為二次代謝碳源消耗，發(fā)酵過(guò)程被迫就此停止，而轉(zhuǎn)入后提取，即過(guò)濾、濃縮和甘油蒸餾工序。甘油的沸點(diǎn)很高，蒸餾時(shí)殘?zhí)墙够謬?yán)重，導(dǎo)致甘油蒸餾十分困難甚至無(wú)法進(jìn)行。為解決這一難題，已提出了多種技術(shù)方案。諸如溶析提取法、轉(zhuǎn)化分離法、載體蒸餾法。容易發(fā)現(xiàn)，它們的出發(fā)點(diǎn)是共同的，即承認(rèn)發(fā)酵后期殘?zhí)遣荒鼙痪w消耗完全的現(xiàn)實(shí)，進(jìn)而采取措施分離殘?zhí)桥c甘油，最終提取甘油，因此這些現(xiàn)有技術(shù)是“治標(biāo)”的工藝方案。
本發(fā)明的目的在于提出一個(gè)從根本上解決上述難題的方案，即通過(guò)全新的二步發(fā)酵工藝，使菌體在發(fā)酵后期能將殘?zhí)窍耐耆?，并盡可能少或不消耗甘油，將問(wèn)題解決在提取工序之前的發(fā)酵工序。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案是第一階段按常規(guī)工藝通氣供氧發(fā)酵，當(dāng)殘?zhí)菨舛冉抵?-4％甘油濃度升到8-12％時(shí)，菌體開(kāi)始消耗甘油，停止通氣進(jìn)行第二階段厭氧發(fā)酵，直至殘?zhí)菨舛冉抵?.2％以下時(shí)結(jié)束，發(fā)酵轉(zhuǎn)入后提取。
厭氧開(kāi)始時(shí)可適當(dāng)添加0.02-0.2％含氮、磷及其它微量元素的營(yíng)養(yǎng)成分，加快降糖。
可將殘?zhí)前▎翁呛偷途厶寝D(zhuǎn)變?yōu)榫凭蜕倭扛视汀?br> 必要時(shí)可接入另一種耗糖酵母一起混合厭氧發(fā)酵。
二步發(fā)酵可與一步發(fā)酵在同一設(shè)備中完成。厭氧條件下，菌體將不會(huì)消耗甘油卻繼續(xù)消耗殘?zhí)?，并生產(chǎn)酒精。
甘油合成代謝途徑由葡萄糖酵解反應(yīng)的中間物磷酸二羥丙酮引出，磷酸二羥丙酮在α-磷酸甘油脫氫酶(E1)的作用下，被還原為α-磷酸甘油再由甘油磷酸化酶(E2)作用脫去磷酸生成甘油；而甘油的分解代謝則從甘油激酶(E3)催化磷酸化生成L-α-磷酸甘油開(kāi)始，此時(shí)L-α-磷酸甘油面臨三個(gè)可能的代謝途徑，一是經(jīng)甘油磷酸化酶(E2)作用或甘油激酶(E3)的逆反應(yīng)重新分解為磷酸和甘油；二是通過(guò)α-磷酸甘油脫氫酶(E1)的逆反應(yīng)生成磷酸二羥丙酮，再進(jìn)入糖酵解途徑；其三則為被轉(zhuǎn)運(yùn)入線粒體內(nèi)在線粒體磷酸甘油氧化酶(E4)作用下與氧反應(yīng)，被氧化為磷酸二羥丙酮，然后再轉(zhuǎn)運(yùn)出線粒體參與糖酵解反應(yīng)。后兩種代謝會(huì)導(dǎo)致甘油的消耗。
甘油合成途徑中的3-磷酸甘油脫氫酶(E1)活力極高，在該酶作用下從磷酸二羥丙酮L-α-磷酸甘油的反應(yīng)是幾乎不可逆的，因此，當(dāng)甘油轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)被菌體消耗時(shí)，必須先經(jīng)甘油激酶(E3)作用生成L-α-磷酸甘油，再轉(zhuǎn)入線粒體內(nèi)在3-磷酸甘油氧化酶(E4)催化下與O2反應(yīng)生成磷酸二羥丙酮，最后轉(zhuǎn)入胞質(zhì)內(nèi)進(jìn)入糖酵解途徑。在葡萄糖濃度較高時(shí)，甘油激酶(E3)的活力受糖代謝中間產(chǎn)物的強(qiáng)烈抑制，菌體不會(huì)消耗甘油，只有當(dāng)糖濃度低至一定值后，對(duì)E3的抑制才被解除，菌體開(kāi)始消耗甘油。若此時(shí)停氣使細(xì)胞缺氧，一方面厭氧導(dǎo)致酵母菌本來(lái)就不發(fā)達(dá)的線粒體萎縮，線粒體酶(E4)的活性受到強(qiáng)烈抑制，另一方面厭氧使線粒體內(nèi)從L-α-磷酸甘油到磷酸二羥丙酮的反應(yīng)因缺乏底物氧而無(wú)法進(jìn)行。因此，后期采用厭氧發(fā)酵可以保證菌體不將甘油作為代謝碳源消耗掉。相反，從代謝途徑可知，厭氧發(fā)酵時(shí)，還可能使部分殘?zhí)抢^續(xù)轉(zhuǎn)變?yōu)楦视汀?br> 此外，厭氧條件下，酵母菌可通過(guò)糖酵解途徑將殘?zhí)寝D(zhuǎn)變?yōu)橛杏卯a(chǎn)物酒精，即兩步發(fā)酵工藝可以副產(chǎn)酒精。
具體操作辦法是在發(fā)酵過(guò)程監(jiān)測(cè)甘油和葡萄糖濃度，當(dāng)甘油濃度開(kāi)始下降時(shí)，即停止第一階段供氧發(fā)酵而轉(zhuǎn)入第二階段厭氧發(fā)酵，直至殘?zhí)菨舛缺唤抵?.2％以下結(jié)束發(fā)酵轉(zhuǎn)入后提取。第二階段發(fā)酵的溫度與第一階段發(fā)酵溫度相同，PH值即為第一階段結(jié)束時(shí)的自然PH值(3.2-5.0)，其他條件與第一階段發(fā)酵一致。厭氧開(kāi)始時(shí)，可適當(dāng)添加0.02-0.2％含氮、磷的營(yíng)養(yǎng)成分加快降糖。若發(fā)酵在實(shí)驗(yàn)室搖瓶上進(jìn)行，則在供氧發(fā)酵結(jié)束時(shí)將三角瓶口用封口膜封上，隔斷空氣，適當(dāng)調(diào)低度振蕩速率，進(jìn)行厭氧發(fā)酵。若發(fā)酵在發(fā)酵罐中進(jìn)行，則在供氧發(fā)酵結(jié)束時(shí)停止通空氣，采用適當(dāng)方式進(jìn)行攪拌發(fā)酵。
必要時(shí)還可以接入另一種耗糖。酵母一起混合發(fā)酵，使殘?zhí)潜幌耐耆⑥D(zhuǎn)化為酒精，而甘油不被消耗，從而使得后續(xù)甘油蒸餾容易進(jìn)行。
本發(fā)明與現(xiàn)有發(fā)酵法生產(chǎn)甘油的技術(shù)相比，其優(yōu)點(diǎn)如下1.現(xiàn)有技術(shù)立于酵結(jié)束以后再設(shè)法分離殘?zhí)桥c甘油，本發(fā)明則通過(guò)采用第二階段厭氧發(fā)酵將殘?zhí)峭耆摹?br> 2.現(xiàn)有技術(shù)為分離殘?zhí)呛透视图訌?fù)雜反應(yīng)步驟(如殘?zhí)茄趸?或操作設(shè)備(如溶析法、樹(shù)脂吸附)，使生產(chǎn)成本增加，本發(fā)明兩步發(fā)酵可在同一設(shè)備中完成，成本增加極少。
3.現(xiàn)有技術(shù)將殘?zhí)呛?jiǎn)單去除，本發(fā)明則將殘?zhí)?包括單糖和低聚糖)轉(zhuǎn)變?yōu)橛杏卯a(chǎn)品酒精和少量甘油，提高原料利用率。
以下結(jié)合工藝流程圖做進(jìn)一步說(shuō)明將發(fā)酵原料注入發(fā)酵罐，滅菌冷卻后接入油菌種并通氣供氧進(jìn)行第一次發(fā)酵，時(shí)間為60-101小時(shí)，當(dāng)殘?zhí)菨舛冉抵?-4％，甘油濃度升至8-12％時(shí)，停止通氣轉(zhuǎn)第二階段厭氧發(fā)酵，即本發(fā)明的二步工藝。二次發(fā)酵與一次發(fā)酵可在同一設(shè)備中完成。厭氧發(fā)酵開(kāi)始時(shí)可另加或不加耗糖菌種亦可適當(dāng)添加0.02-0.2％含氮、磷及其它微量元素的營(yíng)養(yǎng)成分，以便加快降糖。在厭氧條件下菌體將不會(huì)消耗甘油。卻繼續(xù)消耗殘?zhí)牵?-35小時(shí)后停止厭氧發(fā)酵。經(jīng)過(guò)濾器過(guò)后，進(jìn)入離子交換器進(jìn)行交換，同時(shí)將產(chǎn)生的酒精進(jìn)行回收。最后通過(guò)濃縮蒸餾等工藝生產(chǎn)出甘油，甘油回收率約為95％。
實(shí)施例本發(fā)明經(jīng)過(guò)了多次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。下表是其中的一些實(shí)驗(yàn)結(jié)果。其中第1、2、4、5號(hào)實(shí)驗(yàn)是在搖床上500ml三角瓶中進(jìn)行的，第3、6號(hào)實(shí)驗(yàn)則是在7升機(jī)械攪拌罐中進(jìn)行的。搖床供氧發(fā)酵和厭氧發(fā)酵的振蕩頻率分別是140rpm和80rpm，攪拌罐供氧和厭氧氧發(fā)酵的轉(zhuǎn)速分別是1200rpm和300rpm。
權(quán)利要求
1.發(fā)酵法生產(chǎn)甘油的二步發(fā)酵生產(chǎn)工藝，其特征在于第一階段供氧發(fā)酵，當(dāng)菌體開(kāi)始消耗甘油時(shí)停氣進(jìn)行第二階段厭氧發(fā)酵，直至殘?zhí)菨舛缺唤抵?.2％以下時(shí)結(jié)束，發(fā)酵轉(zhuǎn)入后提取。
2.按權(quán)利要求1所述的發(fā)酵法生產(chǎn)甘油的二步發(fā)酵生產(chǎn)工藝，其特征在于厭氧開(kāi)始時(shí)，可添加0.02-0.2％含氮、磷及其它微量元素的營(yíng)養(yǎng)成分、加快降糖。
3.按權(quán)利要求1所述的二步發(fā)酵生產(chǎn)工藝，其特征在于可將殘?zhí)前▎翁呛偷途厶寝D(zhuǎn)變?yōu)榫凭蜕倭扛视汀?br> 4.按權(quán)利要求1所述的二步發(fā)酵生產(chǎn)工藝，其特征在于必要時(shí)可接入另一種耗糖酵母一起混合厭氧發(fā)酵。
5.按權(quán)利要求1所述的二步發(fā)酵生產(chǎn)工藝，其特征在于二步發(fā)酵可與一步發(fā)酵在同一設(shè)備中完成。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種發(fā)酵法生產(chǎn)甘油的二步發(fā)酵生產(chǎn)工藝，其特征在于第一階段供氧發(fā)酵，當(dāng)菌體開(kāi)始消耗甘油時(shí)停氣進(jìn)行第二階段厭氧發(fā)酵，必要時(shí)還可以接入另外一種耗糖酵母一起混合發(fā)酵，使殘?zhí)潜幌耐耆⑥D(zhuǎn)化為酒精，而甘油不被消耗，從而使得后續(xù)甘油蒸餾容易進(jìn)行，甘油回收率約為95％。
文檔編號(hào)C12P7/20GK1148090SQ9511703
公開(kāi)日1997年4月23日 申請(qǐng)日期1995年10月18日 優(yōu)先權(quán)日1995年10月18日
發(fā)明者劉德華, 范質(zhì)良, 劉天中, 歐陽(yáng)藩, 孫燕, 張子秀, 徐曉暉, 周杰, 王會(huì)生 申請(qǐng)人:北京思拓糧食倉(cāng)儲(chǔ)應(yīng)用技術(shù)研究所, 中國(guó)科學(xué)院化工冶金研究所