相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)要求于2014年11月4日提交的申請(qǐng)?zhí)枮?2/074,702的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)，其內(nèi)容通過(guò)引用并入本文。
背景技術(shù)：
：：在本申請(qǐng)中，各種出版物以括號(hào)中的數(shù)字表示。這些參考文獻(xiàn)的完整引用可在說(shuō)明書(shū)的末尾處找到。這些出版物和本文引用的所有書(shū)籍、專(zhuān)利和專(zhuān)利申請(qǐng)出版物的公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用整體并入本申請(qǐng)中，以便更全面地描述本發(fā)明適用的主題中的現(xiàn)有技術(shù)。胰腺導(dǎo)管腺癌，即胰腺癌的是癌癥死亡的第四大原因。“無(wú)癥狀殺傷者”的特征是在檢測(cè)到原發(fā)腫瘤被之前的轉(zhuǎn)移行為(3)，導(dǎo)致5年存活率僅為4％。目前的癌癥治療手段，即伴隨放療和/或化療的手術(shù)，對(duì)轉(zhuǎn)移灶是無(wú)效的。經(jīng)fda批準(zhǔn)的胰腺癌治療藥物：吉西他濱和厄洛替尼，可在晚期患者中提高中位生存期約6個(gè)月(1-3)，急切需要新的胰腺癌替代療法。這種新方法可是基于單核細(xì)胞增生李斯特菌的癌癥治療方法。該實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)，高度減毒的李斯特菌(李斯特菌at)提供了對(duì)轉(zhuǎn)移性癌癥特別有用的治療方法。骨源性抑制細(xì)胞(mdsc)通常是癌癥疫苗接種中的主要問(wèn)題，因?yàn)樗鼈儚?qiáng)烈地抑制t細(xì)胞和自然殺傷(nk)細(xì)胞反應(yīng)并促進(jìn)血管生成(4-10)，導(dǎo)致癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的發(fā)生。然而，當(dāng)感染李斯特菌at時(shí)，mdsc通過(guò)其免疫抑制特征(chandra等人未發(fā)表的結(jié)果)保護(hù)李斯特菌at不被免疫清除，并且將李斯特菌at安全地傳送到腫瘤微環(huán)境中，其中李斯特菌at通過(guò)高水平的活性氧物質(zhì)(ros)感染和殺死腫瘤細(xì)胞(11)。同時(shí)，李斯特菌at—特異性細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞(ctl)殺死腫瘤細(xì)胞，因?yàn)楸桓腥镜哪[瘤細(xì)胞存在李斯特菌at抗原(11)。重要的是，在缺乏免疫抑制的正常組織中，李斯特菌at被巨噬細(xì)胞、nk細(xì)胞和ctl(11,12)快速清除，使得這種治療對(duì)于人類(lèi)來(lái)說(shuō)是安全的。靶向放射性核素治療在治療多種癌癥已被證明是成功的，并且其使用放射性標(biāo)記的小分子、單克隆抗體、肽和其他腫瘤靶向載體(13)。由放射性核素放射的放射性粒子物理破壞癌細(xì)胞，而這種療法不受多重耐藥機(jī)制的影響。已經(jīng)有人嘗試將以放射性標(biāo)記的腫瘤特異性抗體(ab)(放射免疫療法)的形式的靶向放射性核素療法用于治療胰腺癌。然而，胰腺癌的放射免疫治療在臨床(14-16)和不可手術(shù)切除的肝轉(zhuǎn)移癌的癌癥患者中均顯示出差強(qiáng)人意的結(jié)果(17)。需要重新選擇靶向載體以使靶向放射性核素治療方法成功治療胰腺癌。用包含放射性同位素標(biāo)記抗體的細(xì)菌療法已經(jīng)被提出(例如，參見(jiàn)編號(hào)為2014-0417379-a1的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)，其通過(guò)引用并入本文)，但是需要更簡(jiǎn)單、更有效和更經(jīng)濟(jì)的制造輻射菌的方法。本發(fā)明通過(guò)提供一種更簡(jiǎn)單且更有效和經(jīng)濟(jì)的生產(chǎn)輻射菌的方法來(lái)滿足對(duì)新靶向癌癥療法的需求。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：提供一種生產(chǎn)輻射菌的方法。在一個(gè)實(shí)施例中，該方法包括獲得細(xì)菌培養(yǎng)物，使所述細(xì)菌在鹽水溶液中饑餓5至60分鐘，隨后將細(xì)菌在含放射性核素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)5至240分鐘，以產(chǎn)生輻射菌。同時(shí)提供了治療受試者腫瘤、或者減少或預(yù)防受試者腫瘤轉(zhuǎn)移灶的方法，包括向受試者施用一定量的通過(guò)本文公開(kāi)的任何方法生產(chǎn)的輻射菌，其能有效治療受試者中的腫瘤、或者減少或預(yù)防受試者腫瘤的轉(zhuǎn)移。附圖說(shuō)明圖1：將32p摻入李斯特菌：李斯特菌在鹽水中饑餓30分鐘，然后在無(wú)磷酸鹽培養(yǎng)基(愛(ài)丁堡無(wú)磷酸鹽基本培養(yǎng)基)中培養(yǎng)1小時(shí)，然后洗滌并重新懸浮于注射用鹽水中(107/200μl)。以用于重現(xiàn)性，如x軸所示，重復(fù)實(shí)驗(yàn)。圖2：李斯特菌-32p的存活率：將32p摻入李斯特菌后，將李斯特菌的存活率與未經(jīng)處理的李斯特菌進(jìn)行比較(存活的李斯特菌32p/存活的未處理李斯特菌×100％)。如x軸所示，該實(shí)驗(yàn)重復(fù)數(shù)次。誤差線表示平均值(sem)的標(biāo)準(zhǔn)誤差。圖3a-3b：腫瘤細(xì)胞感染率：將具有李斯特菌-32p(lm-p32)的4t1腫瘤細(xì)胞的感染率與未處理的李斯特菌(lm)(a)進(jìn)行比較。感染1小時(shí)后每株的cfu數(shù)。如x軸所示，該實(shí)驗(yàn)重復(fù)數(shù)次。誤差線表示平均值(sem)的標(biāo)準(zhǔn)誤差。同時(shí)用panc-02細(xì)胞(b)測(cè)驗(yàn)感染率。圖4：將放射性計(jì)數(shù)結(jié)合到正常組織中：在使用李斯特菌-32p處理結(jié)束后，將小鼠安樂(lè)死，并使用閃爍計(jì)數(shù)器分析組織的放射性計(jì)數(shù)，并使用以32p的已知量(μci)為標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)μci進(jìn)行歸一化。p32單獨(dú)強(qiáng)烈結(jié)合到骨髓(bm)細(xì)胞中，但沒(méi)有32p結(jié)合到李斯特菌中。圖5：李斯特菌-32p在panc-02模型中的功效研究：將2×106個(gè)panc-02腫瘤細(xì)胞接種到c57b16小鼠的乳腺脂肪墊中。三天后，每三天(ip)將小鼠用李斯特菌-32p(107cfu)處理直到第20天。所有小鼠在第21天被安樂(lè)死，并分析癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移數(shù)量和腫瘤重量。所有未經(jīng)治療的小鼠在21天內(nèi)在乳腺脂肪發(fā)現(xiàn)了小型原發(fā)性腫瘤，在肝臟和其他器官中發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶，以及在腹腔中發(fā)現(xiàn)腹水。n＝5只小鼠/組。在2組實(shí)驗(yàn)中的對(duì)照組中，5只小鼠中有4只沒(méi)有癌癥。曼-惠特尼檢驗(yàn)*p<0.05，**p<0.01。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶顯著出現(xiàn)在肝臟中。圖6：李斯特菌-32p幾乎完全消除了pane-2模型中的肝臟轉(zhuǎn)移灶。圖7：李斯特菌滲入胰腺腫瘤，轉(zhuǎn)移瘤和正常組織。6個(gè)月和4個(gè)月大的具有胰腺腫瘤(其中一只小鼠有轉(zhuǎn)移瘤)的kpc小鼠注射107cfu的李斯特菌，第二天分析李斯特菌的cfu數(shù)。將小鼠組織在磨砂載玻片之間浸漬，使細(xì)胞在水中溶解，并在瓊脂上鋪板。李斯特菌主要在腫瘤、轉(zhuǎn)移灶、胰腺(胰腺組織不能從胰腺腫瘤中宏觀分離)中被發(fā)現(xiàn)。請(qǐng)注意，在骨髓中發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌數(shù)為零。圖8：患有panc-02腫瘤和轉(zhuǎn)移灶的p-小鼠的生物分布，用107李斯特菌-32p注射一次，并以不同的時(shí)間間隔(1，2，4，24，48，和96小時(shí))分析原發(fā)腫瘤、轉(zhuǎn)移灶和各種正常組織中的輻射菌數(shù)量。如圖所示，32p在轉(zhuǎn)移灶和腫瘤中數(shù)量最高，特別是在注射1和4小時(shí)后，而在注射24，48和96小時(shí)后，32p水平降低，但與正常組織相比數(shù)量仍然很高。在肝臟處發(fā)現(xiàn)異常，因?yàn)檗D(zhuǎn)移灶已經(jīng)蔓延到這個(gè)器官。圖9：劑量限制性毒性(dlt)研究——將不同劑量的李斯特菌-32p注射到?jīng)]患癌癥的c57b16小鼠中，并在接下來(lái)的5天內(nèi)測(cè)定存活時(shí)間。如圖所示，107cfu是最佳劑量，而108cfu小鼠在第1天及之后就死亡，這與單獨(dú)注射李斯特菌的結(jié)果ld50＝108一致。這些結(jié)果表明，每次注射107cfu劑量的李斯特菌-32p，其發(fā)出的1μci射線是無(wú)毒的。即使在接受12劑量的107cfu李斯特菌-32p的小鼠中，沒(méi)有副作用的結(jié)論也得到了病理報(bào)告的支持。圖10：李斯特菌-32p對(duì)已確診的腫瘤和轉(zhuǎn)移灶的影響——利用李斯特菌-32p和鹽水對(duì)已確診的腫瘤(0.5-1cm)和轉(zhuǎn)移灶進(jìn)行研究。簡(jiǎn)言之，連續(xù)四天注射107cfu李斯特菌-32p三個(gè)循環(huán)，然后在每個(gè)周期之間休息三天(總共12次)。與以前的實(shí)驗(yàn)相反，第一次治療是在第10天而不是在第3天開(kāi)始。如圖所示，李斯特菌-32p治療有效地根除了腫瘤和轉(zhuǎn)移灶。方差分析*p<0.05，**p<0.005是顯著的。圖11：血清中李斯特菌-32p的解離度——通過(guò)在37℃下將李斯特菌-32p與血清一起培養(yǎng)來(lái)分析李斯特菌-32p在血清中的穩(wěn)定性。在0，1，2和3小時(shí)后，將rl細(xì)菌離心，分析上清液的放射性計(jì)數(shù)。通過(guò)將上清液中的游離放射性活度除沉淀細(xì)菌中的放射性活度×100％來(lái)確定李斯特菌-32p復(fù)合物的解離度(百分比)。顯示的數(shù)據(jù)是兩次實(shí)驗(yàn)的平均值。誤差線代表sem。具體實(shí)施方式制定將32p結(jié)合到減毒的單核細(xì)胞增生李斯特菌中用于治療癌癥的方案：發(fā)現(xiàn)利用該方案生產(chǎn)的李斯特菌-32p對(duì)治療胰腺癌是非常有效的(80％的小鼠在用李斯特菌-32p治療后沒(méi)有患癌癥)。療效很顯著，因?yàn)橐认侔O難治療。在本文中，公開(kāi)了一種最佳結(jié)合方案，在一個(gè)實(shí)施例中，首先在鹽水中饑餓單核細(xì)胞增生李斯特菌30分鐘，隨后在無(wú)磷酸鹽培養(yǎng)基中加入32p培養(yǎng)細(xì)菌60分鐘，隨后是洗滌步驟，最后得到的李斯特菌-32p可以用于注射。這是生產(chǎn)放射性李斯特菌治療胰腺癌(和其他轉(zhuǎn)移灶)癌癥的一種非常簡(jiǎn)單和便宜的方法。提供了一種用于生產(chǎn)輻射菌的方法，包括獲得細(xì)菌培養(yǎng)基物，在鹽水溶液中使所述細(xì)菌饑餓5至60分鐘，隨后將細(xì)菌在含放射性核素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)5至240分鐘以產(chǎn)生輻射菌。在一個(gè)實(shí)施例中，含放射性核素的培養(yǎng)基補(bǔ)充有32p，并且培養(yǎng)基中不含磷酸鹽，所述細(xì)菌在該培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。在一個(gè)實(shí)施例中，細(xì)菌是減毒的。在一個(gè)實(shí)施例中，細(xì)菌是單核細(xì)胞增生李斯特菌。在一個(gè)實(shí)施例中，任何合適的革蘭氏陽(yáng)性或革蘭氏陰性細(xì)菌，如沙門(mén)氏傷寒菌、霍亂弧菌、梭菌或短雙歧桿菌可以用于生產(chǎn)輻射菌。在一個(gè)實(shí)施例中，放射性核素為32p。在一個(gè)實(shí)施例中，細(xì)菌在含放射性核素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)50-70分鐘。在一個(gè)實(shí)施例中，細(xì)菌在含放射性核素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)60分鐘。在一個(gè)實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包括試驗(yàn)后洗滌并回收輻射菌。同時(shí)提供了一種治療受試者中的腫瘤，或減少或預(yù)防受試者腫瘤轉(zhuǎn)移灶的方法，包括向受試者施用一定量的通過(guò)本文公開(kāi)的任何方法生產(chǎn)的輻射菌，其有效治療受試者中的腫瘤，或者減少或預(yù)防受試者腫瘤的轉(zhuǎn)移灶。在一個(gè)實(shí)施例中，生產(chǎn)輻射菌的細(xì)菌是單核細(xì)胞增生李斯特菌。在一個(gè)實(shí)施例中，任何合適的革蘭氏陽(yáng)性或革蘭氏陰性細(xì)菌，如沙門(mén)氏傷寒菌、霍亂弧菌、梭菌或短雙歧桿菌可以用于生產(chǎn)輻射菌。在一個(gè)實(shí)施例中，輻射菌全身施用于受試者。在一個(gè)實(shí)施例中，輻射菌局部施用于受試者的腫瘤。在一個(gè)實(shí)施例中，輻射菌被注射到受試者的腫瘤中。在一個(gè)實(shí)施例中，腫瘤是胰腺腫瘤。在一個(gè)實(shí)施例中，腫瘤是卵巢、子宮、頸部、頭部、乳腺、前列腺、肝、肺、腎、神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)、結(jié)腸、睪丸或膀胱處的腫瘤，或是肝細(xì)胞癌。在一個(gè)實(shí)施例中，腫瘤是不能手術(shù)的腫瘤。在一個(gè)實(shí)施例中，腫瘤是晚期腫瘤。在一個(gè)實(shí)施例中，腫瘤是已確診的腫瘤。在一個(gè)實(shí)施例中，腫瘤是iii期腫瘤。在一個(gè)實(shí)施例中，腫瘤是iv期腫瘤。在一個(gè)實(shí)施例中，腫瘤不可切除的。在一個(gè)實(shí)施例中，施用的輻射菌的量提供1-500mci的輻射劑量。在一個(gè)實(shí)施例中，施用的輻射菌的量提供1-5mci的輻射劑量。在一個(gè)實(shí)施例中，該方法用于治療受試者的腫瘤。在一個(gè)實(shí)施例中，該方法用于減少或預(yù)防受試者中腫瘤的轉(zhuǎn)移灶。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明所述的細(xì)菌是減毒的。與野生型細(xì)菌相比，減毒細(xì)菌是通過(guò)處理降低了毒性的細(xì)菌。例如，可以通過(guò)細(xì)菌基因組中的基因沉默或通過(guò)細(xì)菌的基因工程來(lái)減弱細(xì)菌毒性。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明所述的細(xì)菌被分離或被純化。本發(fā)明對(duì)于幾乎沒(méi)有有效治療方法的癌癥特別有效，例如胰腺癌(幾乎總是以轉(zhuǎn)移灶的形式被檢測(cè))、卵巢癌、由于腫瘤位置不能由手術(shù)切除的原發(fā)性腫瘤癌癥(如頭頸部癌癥)、不能手術(shù)的肝細(xì)胞癌，以及用常規(guī)治療會(huì)復(fù)發(fā)或難治的轉(zhuǎn)移性疾病(非限制性實(shí)例是肺癌、結(jié)腸癌以及乳腺癌)。在使用本文公開(kāi)的輻射菌治療胰腺癌的具體方面，由于腹膜腔內(nèi)充滿含有mdsc的腹水，所以預(yù)計(jì)腹膜腔給藥是最佳的。這些mdsc將李斯特菌-32p傳送到腫瘤和轉(zhuǎn)移灶處。因?yàn)檗D(zhuǎn)移灶的存在，胰腺癌成為最致命的癌癥。如本文所述，“治療”腫瘤意味著疾病的一種或多種癥狀，例如腫瘤本身、其轉(zhuǎn)移灶、腫瘤的血管形成或疾病特征的其它參數(shù)被減少、改善、預(yù)防、處于緩解狀態(tài)，或維持緩解狀態(tài)?！爸委煛蹦[瘤同時(shí)意味著可以通過(guò)治療消除、減少或預(yù)防腫瘤的一個(gè)或多個(gè)特征。這種特征的非限制性實(shí)例包括，基底膜和近端細(xì)胞外基質(zhì)不受控制的降解，內(nèi)皮細(xì)胞成為新的功能性毛細(xì)血管的遷移、分裂和組織化，以及這種功能性毛細(xì)血管的持續(xù)存在。如本文所述，“不能手術(shù)的腫瘤”是醫(yī)學(xué)界常用術(shù)語(yǔ)。不能手術(shù)的腫瘤通常是指位于不可被接近的位置(例如在機(jī)械無(wú)法進(jìn)入的腦部位置)，或由多個(gè)不能被全部切除的腫瘤組成的腫瘤。如本文所述，降低或預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移灶意味著疾病的任一癥狀，例如轉(zhuǎn)移灶、其擴(kuò)散程度、轉(zhuǎn)移灶的血管形成或疾病特征的其它參數(shù)被減少、改善、預(yù)防、處于緩解狀態(tài)、或維持緩解狀態(tài)。本文所用的“放射性核素”是指元素的放射性同位素。對(duì)于如李斯特菌所包括的特定放射性同位素的選擇，將由待治療的腫瘤的類(lèi)型及其在體內(nèi)的位置決定。32p是優(yōu)選的。在放射性同位素在組織中輻射范圍和半衰期的選擇中，兩個(gè)特征是重要的。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，放射性同位素是β發(fā)射體。β發(fā)射體的實(shí)例包括188-錸(半衰期16.7小時(shí))，90-釔(半衰期2.7天)，32-磷(半衰期14.3天)，47-鈧(半衰期3.4天)，67–銅(半衰期62小時(shí))，64-銅(半衰期13小時(shí))，77-砷(半衰期38.8小時(shí))，89-鍶(半衰期51天)，105-銠(半衰期35小時(shí))，109-鈀(半衰期13小時(shí))，111-銀(半衰期7.5天)，131-碘(半衰期8天)，177-镥(半衰期6.7天)153-釤(半衰期46.7小時(shí))，159-釓(半衰期18.6小時(shí))，186-錸(半衰期3.7天)，166-鈥(半衰期26.8小時(shí))，166-鏑(半衰期81.6小時(shí))，140-鑭(半衰期40.3小時(shí))，194-銥(半衰期19小時(shí))，198-金(半衰期2.7天)和199-金(半衰期3.1天)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，β發(fā)射的放射性同位素是高能β-射線188-錸(emax＝2.12mev)。188re的額外優(yōu)點(diǎn)是，其能發(fā)出用于成像的γ射線，例如評(píng)估輻射菌的治療進(jìn)展和對(duì)輻射菌成功定位，如輻射李斯特菌。也可以使用較長(zhǎng)壽命的同位素如90-釔(半衰期2.7天)，177-镥(半衰期6.7天)或131-碘(半衰期8天)。正電子發(fā)射體，例如68-鎵(半衰期68分鐘)，18-氟(半衰期為10分鐘)和61-銅(半衰期為3.4小時(shí))也可用于治療膿腫和傳播性疾病。此外，可以使用俄歇電子發(fā)射體和/或轉(zhuǎn)換電子發(fā)射體的放射性同位素；然而，這種放射性同位素需要與李斯特菌內(nèi)部化的抗體偶聯(lián)。俄歇電子發(fā)射體的實(shí)例包括67-鎵(半衰期78小時(shí))，111-銦(半衰期2.8天)，123-碘(半衰期13小時(shí))，125-碘(半衰期60天)和201-鉈(半衰期3天)。轉(zhuǎn)換電子發(fā)射體的實(shí)例包括117m-錫(半衰期為13.6天)。同時(shí)發(fā)射俄歇電子和轉(zhuǎn)換電子的放射性同位素的實(shí)例包括195m-汞(半衰期41.6小時(shí))和195m-鉑(半衰期4天)。這種放射性同位素需要與抗李斯特菌抗體偶聯(lián)，然后與李斯特菌一起培養(yǎng)，使與同位素偶聯(lián)的抗李斯特菌抗體與李斯特菌之間穩(wěn)定結(jié)合。本發(fā)明是對(duì)該方法的改進(jìn)。與β發(fā)射體相比，具有小范圍輻射的α發(fā)射體可能對(duì)于在體內(nèi)或血液中傳播的腫瘤或癌癥更有效。α發(fā)射體的實(shí)例包括213-鉍(半衰期46分鐘)，223-鐳(半衰期1.3天)，224-鐳(半衰期3.7天)，225-鐳(半衰期14.8天)，225-錒(半衰期10天)，212-鉛(半衰期10.6小時(shí))，212-鉍(半衰期60分鐘)，211-砹(半衰期7.2小時(shí))和255-鐨(半衰期20小時(shí))。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，α發(fā)射體放射的放射性同位素是213-鉍。213鉍發(fā)射具有e＝5.9mev的高letα粒子在組織中的路徑長(zhǎng)度為50-80μm。理論上可以用一個(gè)或兩個(gè)α粒子殺死細(xì)胞。213鉍目前以生產(chǎn)器形式提供，其允許將該同位素從源頭運(yùn)輸?shù)矫绹?guó)和國(guó)外的臨床中心。放射性同位素的劑量可以根據(jù)腫瘤的位置、腫瘤的嚴(yán)重性、輻射菌例如輻射李斯特菌的施用方法(局部或全身)和放射性同位素的衰變方案而變化。為了計(jì)算可以顯著降低或消除腫瘤而同時(shí)不對(duì)重要器官產(chǎn)生放射毒性的劑量，可以像核醫(yī)學(xué)那樣，在治療之前，對(duì)具有輻射菌例如輻射李斯特菌、具有診斷放射性同位素或者具有低活性治療放射性同位素的患者進(jìn)行診斷掃描?？梢允褂脕?lái)自診斷掃描的數(shù)據(jù)進(jìn)行劑量測(cè)定計(jì)算?？梢允褂梅旨?jí)劑量的輻射菌，例如輻射李斯特菌，或單次劑量，盡管前者可能對(duì)正常器官的放射毒性較小而優(yōu)先用于腫瘤。根據(jù)患者的狀況和第一次治療的有效性，治療可以由一個(gè)劑量或幾個(gè)隨后的分次劑量組成。在一個(gè)實(shí)施例中，受試者是人，并且通過(guò)輻射菌株放射的放射性同位素的劑量(例如輻射李斯特菌-32p)在1-5mci之間。在不同的實(shí)施例中，通過(guò)輻射菌(例如輻射李斯特菌)放射的放射性同位素的劑量在1-100mci，101-200mci，201-300mci，301-400mci或401-500mci之間。輻射菌，例如輻射李斯特菌，本文提供的療法可以在一段時(shí)間內(nèi)單獨(dú)、或與佐劑或與另一種抗癌劑組合施用于受試者。在一個(gè)實(shí)施例中，抗癌劑是化學(xué)治療劑。輻射菌，例如輻射李斯特菌，可以以本領(lǐng)域已知的任何方式用于抗腫瘤療法?？梢允褂帽疚乃龅幕钚曰衔锏娜魏慰山邮艿慕o藥途徑。例如，口、舌、舌下神經(jīng)、口腔，腸胃外，頰內(nèi)，鞘內(nèi)，腦室內(nèi)，腹膜內(nèi)，腫瘤內(nèi)或鼻內(nèi)給藥，都可以通過(guò)本領(lǐng)域熟知的方法施藥而無(wú)需過(guò)多的實(shí)驗(yàn)。對(duì)于腸胃外給藥，例如通過(guò)靜脈、肌肉、鞘內(nèi)或皮下注射給藥，可以通過(guò)將輻射菌，例如輻射李斯特菌，或包含本發(fā)明的組合物溶入溶液或懸浮液中來(lái)給藥。這樣的溶液或懸浮液還可以包括無(wú)菌稀釋劑，例如注射用水，鹽水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶劑和其它介質(zhì)，條件是輻射菌例如輻射李斯特菌，能在它們中存活。也可以在與輻射菌(如輻射李斯特菌)存活力相容的程度上加入緩沖劑如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽以及用于調(diào)節(jié)張力的藥劑如氯化鈉或葡萄糖。在非限制性實(shí)例中，腸胃外制劑可以封裝在安瓿、一次性注射器或多劑量小瓶中。輻射菌，例如輻射李斯特菌，可以與藥物可接受的載體聯(lián)合使用，其與輻射菌的存活力相容，由此包含藥物組合物。藥物組合物可以包含藥學(xué)上可接受的載體中的輻射菌?；蛘?，藥物組合物可以基本上由藥學(xué)上可接受的載體中的輻射菌組成。或者，藥物組合物可以由藥學(xué)上可接受的載體中的輻射組成。藥學(xué)上可接受的載體必須與輻射菌相容，并且不會(huì)對(duì)受試者過(guò)度有害。載體的選擇將取決于給藥方法。受試者可以是哺乳動(dòng)物。在不同的實(shí)施例中，哺乳動(dòng)物是小鼠、大鼠、貓、狗、馬、綿羊、母牛、閹牛、公牛、家畜、靈長(zhǎng)類(lèi)、猴或優(yōu)選人。本文所述的各種元素的所有組合都在本發(fā)明的范圍內(nèi)，除非本文另有說(shuō)明或者與上下文明顯矛盾。下面的實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)將更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易理解，本發(fā)明所討論的具體方法和結(jié)果僅僅是在隨后的權(quán)利要求中更全面地描述的本發(fā)明的說(shuō)明。實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)本文公開(kāi)了將32p摻入減毒的單核細(xì)胞增生李斯特菌中的方案。通過(guò)本文公開(kāi)的方案將32p摻入其中的減毒李斯特菌已經(jīng)在人類(lèi)臨床試驗(yàn)中進(jìn)行了測(cè)試(maciag等人，2009，vaccine27：3975-3983)。本方案開(kāi)發(fā)涉及到分析以下標(biāo)準(zhǔn)：32p與李斯特菌的結(jié)合效率、與單獨(dú)李斯特菌相比，李斯特菌-32p的存活率、與單獨(dú)李斯特菌相比，李斯特菌-32p的腫瘤細(xì)胞的感染率、將32p摻入正常組織、李斯特氏菌-32p的毒性、李斯特氏菌-32p在胰腺模型(panc-02模型)中的功效、以及李斯特菌在kpc模型中的胰腺腫瘤的滲透力。將32p摻入李斯特菌：為了將32p摻入李斯特菌中，首先將細(xì)菌在鹽水中饑餓，然后在無(wú)磷酸鹽培養(yǎng)基中補(bǔ)充32p。測(cè)驗(yàn)各種饑餓時(shí)間(30，60，120分鐘)、摻入時(shí)間(30，60，120分鐘)以及32p的量(10，50，100，300μci)。利用鹽水饑餓30分鐘、60分鐘，發(fā)現(xiàn)不含磷酸鹽的酵母培養(yǎng)基產(chǎn)生了最佳結(jié)果，培養(yǎng)基中有0.5×109cfu李斯特菌和50μci的32p。利用該方案，93％的32p以高再生能力摻入到李斯特菌中(圖1)。李斯特菌-32p的存活率：在將32p摻入李斯特菌期間，通過(guò)實(shí)驗(yàn)測(cè)試32p是否影響李斯特菌的活力(quispe-tintaya等人，2013b)。為此，在瓊脂載玻片上制備未加處理的李斯特菌和摻入32p的李斯特菌的連續(xù)稀釋?zhuān)⒃诘诙鞕z測(cè)兩者存活的李斯特菌菌落數(shù)(圖2)。李斯特菌-32p的感染率：利用李斯特菌或李斯特菌-32p培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞2小時(shí)，測(cè)定李斯特菌-32p的腫瘤細(xì)胞的感染率，然后在水中溶解細(xì)胞，并鋪在如前所述瓊脂載玻片上(quispe-tintaya等人，2013b)。第二天確定存活的李斯特菌菌落數(shù)(圖3)。將32p摻入正常組織：在治療結(jié)束時(shí)分析了通過(guò)李斯特菌或32p作為單一化合物在小鼠體內(nèi)的胰腺癌細(xì)胞遞送的32p的生物分布。與李斯特菌-32p相比，32p單獨(dú)處理后，32p摻入骨髓(bm)的水平顯著升高(圖4)。這是出于安全起見(jiàn)的重要結(jié)果。李斯特菌-32p的毒性：與施用鹽水小鼠相比，用李斯特菌-32p治療及治療1個(gè)月后，通過(guò)其直接病理檢查，分析李斯特菌-32p對(duì)肝、腎、骨髓、骨和小腸的影響。在用李斯特菌-32p處理后的小鼠中發(fā)現(xiàn)了一些炎癥細(xì)胞，但是這與未經(jīng)治療的小鼠沒(méi)有顯著差異，這與用李斯特菌-32p治療的正常組織中低摻入水平的結(jié)果一致。此外，用李斯特菌-32p處理的小鼠的bm細(xì)胞略高于鹽水小鼠。然而，實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)一個(gè)月后，在正常組織中未觀察到李斯特菌-32p的影響。李斯特菌-32p在胰腺癌小鼠實(shí)驗(yàn)中的療效：最后，在證明李斯特菌的存活率和功能未被32p改變之后，安全性方面令人鼓舞，在胰腺癌小鼠(pane-02模型)中測(cè)定了李斯特菌-32p的功效。為此，在第0天用panc-02腫瘤細(xì)胞(乳腺脂肪墊)攻擊小鼠，并且每三天(ip)用107cfu的李斯特菌-32p(如李斯特菌-188re)治療小鼠(quispe-tintaya等人，2013b)。發(fā)現(xiàn)80％的小鼠未患癌癥(圖5)。由于胰腺癌特別容易轉(zhuǎn)移到肝臟，所以利用李斯特菌-32p使panc-02模型肝臟轉(zhuǎn)移灶的消除實(shí)例(圖6)顯示了該方法治療轉(zhuǎn)移灶的有效性。在kpc模型中李斯特菌進(jìn)入胰腺腫瘤的滲透率：在癌癥患者中，基質(zhì)屏障阻止腫瘤吸收藥物(olive等人，2009)。在本文中，證明李斯特菌確實(shí)能滲透胰腺腫瘤和kpc模型的轉(zhuǎn)移灶。給kpc小鼠注射107cfu的李斯特菌ip，第二天從正常組織、腫瘤和轉(zhuǎn)移灶中分離cfu。類(lèi)似于4t1和panc-02模型，李斯特菌在kpc模型的轉(zhuǎn)移灶和腫瘤中被大量發(fā)現(xiàn)，而在正常組織中則少得多(圖7)。進(jìn)一步確認(rèn)實(shí)驗(yàn)如圖8-11所示。如圖8所示，在患有panc-02腫瘤和轉(zhuǎn)移灶的小鼠中測(cè)定32p的生物分布。用107李斯特菌-32p注射小鼠一次，并以不同的時(shí)間間隔(1，2，4，24，48和96小時(shí))分析原發(fā)性腫瘤、轉(zhuǎn)移灶和各種正常組織中的放射性計(jì)數(shù)的數(shù)量。如圖所示，32p在轉(zhuǎn)移灶和腫瘤中最高，特別是在注射1和4小時(shí)后，而在注射24。48和96小時(shí)后，32p水平降低，但與正常組織相比保持著明顯更高的數(shù)量。肝臟中發(fā)現(xiàn)異常，因?yàn)檗D(zhuǎn)移灶已經(jīng)擴(kuò)散到這個(gè)器官。執(zhí)行劑量限制性毒性(dlt)研究(見(jiàn)圖9)。將不同劑量的李斯特菌-32p注射到?jīng)]患癌癥的c57b16小鼠中，并在接下來(lái)的5天內(nèi)測(cè)定存活時(shí)間。如圖所示，107cfu是最佳劑量，而108cfu小鼠在第1天及之后就死亡，這與單獨(dú)注射李斯特菌的結(jié)果ld50＝108一致。這些結(jié)果表明，每次注射107cfu劑量的李斯特菌-32p，其發(fā)出的1μci放射性活度是無(wú)毒的。即使在接受12劑量的107cfu李斯特菌-32p的小鼠中，沒(méi)有副作用的結(jié)論也得到了病理報(bào)告的支持。李斯特菌-32p對(duì)已確診的腫瘤和轉(zhuǎn)移灶的影響，利用李斯特菌-32p和鹽水對(duì)已確診的腫瘤(0.5-1cm)和轉(zhuǎn)移灶進(jìn)行研究。簡(jiǎn)言之，連續(xù)四天注射107cfu李斯特菌-32p注射三個(gè)循環(huán)，然后在每個(gè)周期之間休息三天(總共12次)。與以前的實(shí)驗(yàn)相反，第一次治療是在第10天而不是在第3天開(kāi)始。如圖所示，李斯特菌-32p治療有效地根除了腫瘤和轉(zhuǎn)移灶。方差分析*p<0.05，**p<0.005是顯著的。血通過(guò)在37℃下將李斯特菌-32p與血清一起培養(yǎng)來(lái)分析清中李斯特菌-32p的解離度，。在0，1，2和3小時(shí)后，將rl細(xì)菌離心，分析上清液的放射性計(jì)數(shù)。通過(guò)將上清液中的游離放射性活度除沉淀細(xì)菌中的放射性活度×100％來(lái)確定李斯特菌-32p復(fù)合物的解離度(百分比)。顯示的數(shù)據(jù)是兩次實(shí)驗(yàn)的平均值。誤差線代表sem。材料和方法將32p摻入李斯特菌的示例性方案饑餓李斯特菌·從-80℃取出減毒單核細(xì)胞增生李斯特菌(lm)的冷凍軟管，并在37℃的水浴(管含有1.5毫升)中解凍：準(zhǔn)備兩管，因?yàn)?管用于lm-p32，另一個(gè)管用于lm單獨(dú)實(shí)驗(yàn)。如下準(zhǔn)備0.5×l09細(xì)菌/ml?！u旋10秒，并將1ml轉(zhuǎn)移到新管中；·以15000rpm離心1ml120秒；·棄去上清液，用1ml鹽水洗滌細(xì)菌；·以15000rpm離心1ml120秒；·棄去上清液并將沉淀重懸于鹽水中(如果沉淀中有0.8×109個(gè)細(xì)胞，然后重懸于0.8ml鹽水->109/ml)；然后通過(guò)向500μl的細(xì)菌中加入500μl鹽水使細(xì)菌濃度為0.5×109。以及·將鹽水中1ml細(xì)菌(0.5x10e9)從eppendorf轉(zhuǎn)移到15ml的管中；·封閉15ml管，并在37℃的振蕩器(200rpm)上將細(xì)菌在鹽水中饑餓30分鐘。將32p摻入李斯特菌(rl)·在30分鐘的饑餓后，渦旋15ml管，并將1ml轉(zhuǎn)移到eppendorf試管中，并以15000rpm離心試管120秒；·棄去上清液并將沉淀重懸于1ml無(wú)磷酸鹽培養(yǎng)基(emmp)中，并充分渦旋；·將1ml細(xì)菌溶液從eppendorf試管再次轉(zhuǎn)移到15ml管中，并加入5ul10uci/ul32p(添加50uci至0.5x10e9/1ml無(wú)磷酸鹽培養(yǎng)基)；以及·封閉15ml管，并在37℃振蕩器上培養(yǎng)細(xì)菌60分鐘，進(jìn)行32p摻入(200rpm)。準(zhǔn)備測(cè)驗(yàn)上清液和細(xì)菌中的放射性活度·培養(yǎng)60分鐘后，將0.5x10e9/1ml培養(yǎng)物再次轉(zhuǎn)移到eppendorf試管中，并以15000rpm離心試管120秒；·取出100ul上清液，保存，測(cè)定未摻入的32p，棄去其他上清液；·將沉淀物重懸于1ml鹽水渦旋，并以15000rpm離心試管120秒；·棄去上清液，將沉淀物重懸于500ul鹽水(使細(xì)菌最終稀釋為10e9/ml)，充分渦旋，確保沉淀物完全重新懸??；以及·取500μl中具有10e9rl/1ml的100μl，以保存測(cè)量32p的摻入量(確保將放射性計(jì)數(shù)除以2以等于上清液)。rl的存活力在稀釋至10e4cfu/ml(每個(gè)lb載玻片上鋪有100μl10e4/ml)后，使用另外100μl(10e9/ml；稀釋10e5x)將細(xì)菌鋪在載玻片上。將rl注入小鼠體內(nèi)為了將最終稀釋的5×107cfu的lm-p32/ml鹽水注射到小鼠體內(nèi)，并在每只小鼠體內(nèi)注射200μl[100μl的0.5×109李斯特菌-p32/ml加上900μl鹽水->注射200μlip]。確保對(duì)照實(shí)驗(yàn)，也可以單獨(dú)使用lm。通過(guò)rl腫瘤細(xì)胞的感染率對(duì)于測(cè)試感染率，加入100μl10e8cfu的p32摻入的細(xì)菌至鋪在24孔平板上的4t1細(xì)胞中(10e6細(xì)胞/孔在500μl不含抗生素的10％fbs的dmem中)。感染細(xì)胞2小時(shí)，并加入50μg/ml終濃度的慶大霉素1小時(shí)。1小時(shí)后，將培養(yǎng)基完全取出并用1ml溫和的無(wú)抗生素的培養(yǎng)基洗滌感染細(xì)胞。最后用1ml水溶解細(xì)胞5分鐘。通過(guò)將溶解的細(xì)胞上下移液20次，將溶解物很好地混合，然后將裂解物轉(zhuǎn)移到eppendorf試管中。精細(xì)渦旋，并在lb板上平鋪100μl。制備培養(yǎng)基·美國(guó)生物科技生命科學(xué)愛(ài)丁堡無(wú)磷酸鹽(emmp)粉末基本培養(yǎng)基-目錄號(hào)：e2205-20；·溶解29.328g/l水。調(diào)節(jié)ph至5.5；·高壓滅菌或過(guò)濾滅菌(0.2μm)；·在室溫下存放。參考文獻(xiàn)1.a.maitra,andr.h.hruban,"pancreaticcancer."annu.rev.pathol.3,157-188(2008).2.m.j.moore,d.goldstein,j.hamm,a.figer,j.r.hecht,s.gallinger,h.j.auetal,erlotinibplusgemcitabinecomparedwithgemcitabinealoneinpatientswithadvancedpancreaticcancer:aphaseiiitrialofthenationalcancerinstituteofcanadaclinicaltrialsgroup.jclinoncol15,1960-1966(2007).3.m.h.kulke,l.s.blaszkowski,d.p.ryan,j.w.clark,etal,capecitabinepluserlotinibingemcitabine-refractoryadvancedpancreaticcancer.j.clin.oncol.25,4787-4792(2007).4.d.i.gabrilovich,ands.nagaraj,myeloid-derivedsuppressorcellsasregulatorsoftheimmunesystem.nat.rev.immunol.9,162-174(2009).5.s.ostrand-rosenberg,andp.sinha,myeloid-derivedsuppressorcells:linkinginflammationandcancer.j.immunol.182,4499-4506(2009).6.p.serafini,andv.bronte.myeloid-derivedsuppressorcellsincancer.in:tumorinducedimmunesuppression.edsgabrilovichdiandhurwitzaa.springer.pp157-194(2008).7.a.mantovani,a.sica,andm.locatim.newvistasandmacrophagedifferentiationandactivation.eur.j.immunol.37,14-16(2007).8.p.sinha,v.k.clements,ands.ostrand-rosenberg,interleukin-13-regulatedm2macrophagesincombinationwithmyeloidsuppressorcellsblockimmunesurveillanceagainstmetastases.cancerres.65,11743-11751(2005).9.c.murdoch,m.muthana,s.b.coffelt,andc.e.lewis,theroleofmyeloidcellsinthepromotionoftumorangiogenesis.naturereviewscancer8,618-631(2008).10.m.c.schmid,andj.a.varner,myeloidcellsinthetumormicroenvironment:modulationoftumorangiogenesisandtumorinflammation.j.oncol,doi:10.1155/2010/201026(2010).11.s.h.kim,f.castro,y.paterson,c.gravekamp,highefficacyofalisteria-basedvaccineagainstmetastaticbreastcancerrevealsadualmodeofaction.cancerres.69,5860-5866(2009).12.e.muraille,e.narni-mancinelli,p.gounon,d.bassand,n.glaichenhaus,l.l.lenz,g.lauvau,cytosolycexpressionofseca2isapreruiquisiteforlong-termprotectiveimmunity.cell.microbiol.doi:10.1lll/j.l462-5822.2007.00883.x(2007).13.targetedradionuclidetherapy.ed.todspeer,lippincott,williams&wilkins,philadelphia(2010).14.l.bodel,m.cremonesi,c.grana,p.rocca,m.bartelomei,m.chinol,g.andpaganelli,receptorradionuclidetherapywith90y-[dota]0-tyr3-octreotide(90ydotatoc)inneuroendocrinetumors.eur.j.med.andmol.imaging31,1038-1046,2004.15.d.e.milenic,k.garmestani,e.d.brady,p.s.albert,d.ma,a.abdulla,m.w.brechbiel,alpha-particleradioimmunotherapyofdisseminatedperitonealdiseaseusinga(212)pb-labeledradio-immunoconjugatetargetingher2.cancerbiotherradiopharm,20,557-68(2005).16.d.v.gold,z.karanjawala,d.e.modrak,d.m.goldenberg,r.h.hruban,pam4-reactivemuc1isabiomarkerforearlypancreaticadenocarcinoma.clin.cancerres.13,7380-7(2007).17.a.sultana,s.shore,m.g.raraty,s.vinjamuri,j.e.evans,c.t.smith,s.lane,s.chauhan,l.bosonnet,c.garvey,r.sutton,j.p.neoptolemos,p.ghaneh,randomisedphaseviitrialassessingthesafetyandefficacyofradiolabelledanticarcinoembryonicantigen1(131)kab201antibodiesgivenintra-arteriallyorintravenouslyinpatientswithunresectablepancreaticadenocarcinoma.bmccancer25,966-971(2009).當(dāng)前第1頁(yè)12當(dāng)前第1頁(yè)12