本申請要求2014年4月18日提交的美國臨時專利申請第61/981,588號的優(yōu)先權(quán)，其通過引用全文納入本文。

政府權(quán)利聲明

本發(fā)明是在政府支持下由國立衛(wèi)生研究院授予的基金號EB015331資助完成的。政府對本發(fā)明擁有某些權(quán)利。

序列表

本申請包含以ASCII格式電子提交的序列表，并通過引用全文納入本文。2015年4月15日創(chuàng)建的所述ASCII拷貝命名為14-21011-WO_260947_00237_SL.txt，大小為66,959字節(jié)。

背景技術(shù)：

核酸用作疾病的重要分子標記物，并且對特定DBA和RNA序列的精確檢測形成許多研究和診斷產(chǎn)品的基礎(chǔ)。然而，許多(如果不是大多數(shù))現(xiàn)有技術(shù)平臺仍在努力解決區(qū)分緊密相關(guān)的核酸序列，如相差單個核苷酸的那些。

單核苷酸差異的區(qū)分具有兩個主要應用：單核苷酸多態(tài)性(SNP)基因分型；和稀有等位基因檢測。在SNP基因分型中，靶標DNA樣品是100％的一種等位基因，或在2種等位基因之間50％的分布，并且因此，SNP基因分型一般是用市售方案解決的問題。

在稀有等位基因檢測中，靶標DNA樣品可具有不到1％的特定稀有等位基因(在本文中稱為“含稀有等位基因的物質(zhì)”)。例如，含有癌癥突變的無循環(huán)細胞核酸可以是癌癥發(fā)生或復發(fā)的指示，并且對于檢測這種物質(zhì)存在強烈興趣。專門的技術(shù)平臺已經(jīng)市場化，其能夠檢測低至0.1％至0.001％頻率的稀有等位基因，但是這些一般需要無法市售可得的昂貴儀器。類似地，更廣泛基礎(chǔ)的儀器的生產(chǎn)商對于新分子技術(shù)感興趣，該技術(shù)可增強它們的平臺進行稀有等位基因和突變檢測的能力。然而，迄今為止，目前還沒有一種可與多種探針物質(zhì)聯(lián)用的精確且廉價的檢測系統(tǒng)。

發(fā)明概述

本發(fā)明提供了用于探針系統(tǒng)的組合物和方法。在一個實施方式中，提供可用于檢測樣品中含稀有等位基因的核酸物質(zhì)的核酸檢測組合物，所述樣品包含過量的含主要等位基因的核酸物質(zhì)，其中含稀有等位基因的核酸物質(zhì)和含主要等位基因的核酸物質(zhì)的序列除了在共有的比對區(qū)中的一個或多個核苷酸以外是保守的。含主要等位基因的核酸中的共有比對區(qū)稱為非靶核酸序列(變體)并且含稀有等位基因的核酸物質(zhì)上的共有區(qū)被稱為靶核酸序列(靶標)。在一種情況中，組合物包含2種探針復合物和2種分離的寡核苷酸。第一探針復合物對靶核酸序列有特異性并且在本文中被稱為“靶核酸探針”或“探針”，而第二探針復合物對變體核酸序列有特異性并且在本文中被稱為“變體核酸探針”或“庫(Sink)”。探針包含第一靶標探針寡核苷酸和第二靶標探針寡核苷酸。第一靶標探針寡核苷酸包含與靶核酸序列互補的靶標探針互補區(qū)以及一個或多個不與靶核酸序列互補的非互補區(qū)。第二靶標探針寡核苷酸包含與靶標探針互補區(qū)的第一靶標探針互補子序列互補的靶標探針保護區(qū)和一個或多個非保護區(qū)?？紤]到第一和第二靶標探針寡核苷酸具有互補序列，探針包含靶標雙鏈探針部分和靶標單鏈探針部分，其中靶標雙鏈探針部分包含第一靶標探針互補子序列和靶標探針保護區(qū)，并且靶標單鏈探針部分包含靶標探針互補區(qū)的第二靶標探針互補子序列。

變體核酸探針也包含第一和第二變體探針寡核苷酸。第一變體探針寡核苷酸包含與變體核酸序列互補的變體探針互補區(qū)以及一個或多個不與變體核酸序列互補的變體非互補區(qū)。第二變體探針寡核苷酸包含與變體探針互補區(qū)的第一變體探針互補子序列互補的變體探針保護區(qū)和一個或多個變體非保護區(qū)。與探針相似，變體庫包含變體雙鏈探針部分和變體單鏈探針部分，其中變體雙鏈探針部分包含第一變體探針互補子序列和變體探針保護區(qū)，其中變體單鏈探針部分包含變體探針互補區(qū)的第二變體探針互補子序列。

靶標探針互補區(qū)和變體探針互補區(qū)共有由非保守序列分隔的至少2個保守序列。非保守序列可以是探針和庫互補區(qū)之間的1個核苷酸差異，從而導致各探針分別對靶核酸序列和變體核酸序列的特異性。非保守序列可在一個共有位置上包含單個核苷酸，如在靶核酸序列中的單核苷酸多態(tài)性(SNP)的情況中。在靶核酸序列和變體核酸序列在多個共同的位置上相差單個核苷酸的情況中，靶標互補區(qū)和變體互補區(qū)可共有超過2個保守序列。還應理解靶標互補區(qū)和變體互補區(qū)不應完全針對靶核酸序列和變體核酸序列上的相同序列區(qū)或框架。例如，靶標互補區(qū)可針對靶核酸上的序列，其從變體核酸序列5′開始的幾個核苷酸開始，該變體互補區(qū)是靶向性的。因此，在靶標互補區(qū)和變體互補區(qū)中可能存在其他非保守序列，其不位于保守序列之間，而位于靶標和變體互補區(qū)的3′或5′端。

在某些實施方式中，第一靶標探針寡核苷酸包含可檢測標簽或與之偶聯(lián)的捕獲部分，并且第二靶標探針寡核苷酸包含猝滅劑，其足夠防止可檢測標簽的檢測或捕獲部分的捕獲。

在某些其他實施方式中，組合物還可包含第三靶標探針寡核苷酸，其與第一靶標探針寡核苷酸的靶標探針非互補區(qū)雜交，其中第三靶標探針寡核苷酸包含可檢測標簽或與之偶聯(lián)的捕獲部分。另外，組合物還可包含第四靶標探針寡核苷酸，其與第二靶標探針寡核苷酸的靶標探針非保護區(qū)雜交，其中第四靶標探針寡核苷酸包含猝滅劑，其足夠防止可檢測標簽的檢測或捕獲部分的捕獲。

組合物還包含靶標輔助寡核苷酸和變體輔助寡核苷酸。這些寡核苷酸各自在長度和序列上分別與第二靶標探針寡核苷酸和第二變體探針寡核苷酸相同。因此，第二靶標和變體探針寡核苷酸相對于第一靶標和變體探針寡核苷酸過量存在于組合物中，從而產(chǎn)生與探針和庫復合物分開的第二靶標和變體探針寡核苷酸的濃度，這種過量提供了靶標和變體輔助寡核苷酸。在其他實施方式中，靶標和變體輔助寡核苷酸可在長度和/或序列上與第二靶標和變體探針寡核苷酸稍有不同。

如下文中更詳細所述，靶核酸探針和變體核酸探針可包含不同形態(tài)。在一種情況中，靶核酸探針可包含X-探針形態(tài)而變體核酸探針也可包含X-探針形態(tài)或超特異性的粘性末端形態(tài)，與上述實施方式中所述的相似。參考靶核酸探針描述了X-探針形態(tài)的說明，但是應理解相同的設(shè)計也可應用于變體探針。在X-探針形態(tài)中，靶標探針、變體探針、或兩者還可包含第三寡核苷酸和第四寡核苷酸，其中第三寡核苷酸包含第一靶標(或變體)探針寡核苷酸特異性子序列和第四寡核苷酸特異性子序列，其中第一靶標(或變體)探針寡核苷酸特異性子序列與第一靶標(或變體)探針寡核苷酸的靶標(或變體)探針非互補區(qū)互補，其中第四寡核苷酸包含第二靶標(或變體)探針寡核苷酸特異性子序列和第三寡核苷酸特異性子序列，其中第二靶標(或變體)探針寡核苷酸特異性子序列與第二靶標(或變體)探針寡核苷酸的靶標(或變體)探針非保護區(qū)互補，其中第二靶標(或變體)探針寡核苷酸的靶標(或變體)探針非保護區(qū)不與靶標(或變體)探針保護區(qū)重疊，其中第四寡核苷酸特異性子序列與第三寡核苷酸特異性子序列互補，并且其中靶標(或變體)輔助寡核苷酸還包含所述第四寡核苷酸。

在X-探針形態(tài)中，第三寡核苷酸的第四寡核苷酸特異性子序列可包含可檢測標簽或與之偶聯(lián)的捕獲部分，并且第四寡核苷酸的第三寡核苷酸特異性子序列包含猝滅劑，其足夠防止可檢測標簽的檢測或捕獲部分的捕獲。

在一個實施方式中，靶核酸探針具有靶標反應標準自由能(ΔG°_rxn1)，其中變體核酸探針具有變體反應標準自由能(ΔG°_rxn2)，并且其中ΔG°_rxn1大于ΔG°_rxn2+1kcal/mol之和。

在另一個實施方式中，靶核酸探針具有定義為ΔG°_rxn1+Rτln([P_t]/[P_tC_t])的用濃度調(diào)整的靶標反應標準自由能，其中變體核酸探針具有定義為ΔG°_rxn2+Rτln([P_v]/[P_vC_v])的變體反應標準自由能，其中R為理想氣體常數(shù)，τ是開爾文溫度，P_t是輔助寡核苷酸的初始濃度，P_tC_t是靶核酸探針的初始濃度，P_v是變體輔助寡核苷酸的初始濃度，P_VC_V是變體核酸探針的濃度，其中靶核酸探針的用濃度調(diào)整的反應標準自由能大于變體核酸探針的用濃度調(diào)整的反應標準自由能+1kcal/mol之和。

在另一個實施方式中，靶核酸探針具有靶標反應標準自由能(ΔG°_rxn1)，其中變體核酸探針具有變體反應標準自由能(ΔG°_rxn2)，并且其中ΔG°_rxn1大于ΔG°_rxn2，并且ΔG°_rxn2大于-7kcal/mol。

在某些實施方式中，變體核酸探針的濃度相對于靶核酸探針的濃度為大于1∶1至約小于100000∶1。在其他實施方式中，變體核酸探針的濃度相對于靶核酸探針的濃度為大于10∶1至小于10000∶1。在其他實施方式中，變體核酸探針的濃度相對于靶核酸探針的濃度為大于100∶1至小于1000∶1。在另一個實施方式中，變體核酸探針的濃度相對于靶核酸探針的濃度為約900∶1。

在某些實施方式中，靶標輔助寡核苷酸的濃度相對于靶核酸探針的濃度為大于1∶1000至小于100000∶1。在其他實施方式中，靶標輔助寡核苷酸的濃度相對于靶核酸探針的濃度為大于1∶100至小于10000∶1。在其他實施方式中，靶標輔助寡核苷酸的濃度相對于靶核酸探針的濃度為大于1∶10至小于1000∶1。

在某些實施方式中，變體輔助寡核苷酸的濃度相對于變體核酸探針的濃度為大于1∶1000至小于100000∶1。在其他實施方式中，變體輔助寡核苷酸的濃度相對于變體核酸探針的濃度為大于1∶100至小于10000∶1。在其他實施方式中，變體輔助寡核苷酸的濃度相對于變體核酸探針的濃度為大于1∶10至小于1000∶1。

在上述或其他適用的實施方式中，靶核酸探針(探針)和變體核酸探針(庫)包含單或雙嵌段，其中嵌段是包含2個或更多通過沃森-克里克雜交反應形成的寡核苷酸的鏈或復合物。

在任意上述適用實施方式中的一個或多個中，分離確定的變體核酸探針和變體核酸序列(變體)之間雜交的平衡產(chǎn)率大于分離確定的靶核酸探針和靶核酸序列(靶標)之間雜交的平衡產(chǎn)率。

在任意上述適用實施方式中的一個或多個中，靶核酸探針是超特異性探針，微調(diào)的超特異性探針，X-探針，Yin-Yang探針，或包含雙嵌段、靶標結(jié)合嵌段和輔助嵌段或保護子并在靶標雜交的同時釋放輔助嵌段的任何其他核酸探針。在這種情況中，探針可包括過量的輔助嵌段物質(zhì)，其與作為組合物部分的輔助嵌段物質(zhì)(也稱為“靶標輔助寡核苷酸”)分開或額外添加。

在任意上述適用實施方式中的一個或多個中，靶核酸探針和靶標之間的反應標準自由能ΔG°_rxn1在操作溫度和緩沖條件下滿足不等式ΔG°_rxn1＞-6kcal/mol且ΔG°_rxn1＜+6kcal/mol。

在任意上述適用實施方式中的一個或多個中，靶標輔助寡核苷酸的初始濃度[A]和靶核酸探針的初始濃度[P]滿足不等式[A]/[P]＞0.001且[A]/[P]＜1000。

在任意上述適用實施方式中的一個或多個中，靶核酸探針和靶標之間的反應標準自由能(ΔG°_rxn1)，靶標輔助寡核苷酸的初始濃度[A]，和靶核酸探針的初始濃度[探針]在操作溫度和緩沖條件下滿足不等式ΔG°_rxn1+Rτln([A]/[探針])＞-4kcal/mol且ΔG°_rxn1+Rτln([A]/[探針])＜+3kcal/mol，其中R是理想氣體常數(shù)并且τ是開爾文溫度。

在任意上述適用實施方式中的一個或多個中，靶核酸探針是分子信標，發(fā)夾探針、三莖探針，或任何其他核酸探針分子，其包含單嵌段、靶標結(jié)合嵌段，并且不在靶標雜交的同時釋放輔助核酸物質(zhì)。在該實施方式中，靶核酸探針和靶標之間的反應標準自由能ΔG°_rxn1以及靶核酸探針的濃度[探針]在操作溫度和緩沖條件下滿足不等式ΔG°_rxn1-Rτln([探針])＞-4kcal/mol且ΔG°_rxn1-Rτln([探針])＜+3kcal/mol，其中R是理想氣體常數(shù)并且τ是開爾文溫度。

在任意上述適用實施方式中的一個或多個中，變體核酸探針(庫)是超特異性探針，微調(diào)的超特異性探針，X-探針，Yin-Yang探針，或包含雙嵌段、靶標結(jié)合嵌段和輔助嵌段并在變體雜交的同時釋放輔助嵌段的任何其他核酸探針。在這種情況中，該組合物可包括過量的輔助嵌段物質(zhì)，其與作為探針分子部分的輔助嵌段物質(zhì)(也稱為“變體輔助寡核苷酸”)分開或額外添加。

在任意上述適用實施方式中的一個或多個中，變體核酸探針和變體之間的反應標準自由能ΔG°_rxn2在操作溫度和緩沖條件下滿足不等式ΔG°_rxn2＞-11kcal/mol且ΔG°_rxn2＜+4kcal/mol。

在任意上述適用實施方式中的一個或多個中，變體輔助寡核苷酸的初始濃度[B]和變體核酸探針的初始濃度[S]滿足不等式[B]/[S]＞0.001且[B]/[S]＜1000。

在任意上述適用實施方式中的一個或多個中，變體核酸探針和變體之間的反應標準自由能(ΔG°_rxn2)，變體輔助寡核苷酸的初始濃度[B]，和變體核酸探針的初始濃度[庫]在操作溫度和緩沖條件下滿足不等式ΔG°_rxn2+Rτln([B]/[庫])＞-7kcal/mol且ΔG°_rxn2+Rτln([B]/[庫])＜+1kcal/mol，其中R是理想氣體常數(shù)并且τ是開爾文溫度。

在任意上述適用實施方式中的一個或多個中，變體核酸探針是分子信標，發(fā)夾探針、三莖探針，或任何其他核酸探針分子，其包含單嵌段、靶標結(jié)合嵌段，并且不在變體雜交的同時釋放輔助(保護)核酸物質(zhì)。在該實施方式中，變體核酸探針和變體之間的反應標準自由能ΔG°_rxn2以及變體核酸探針的濃度[庫]在操作溫度和緩沖條件下滿足不等式ΔG°_rxn2-Rτln([庫])＞-7kcal/mol且ΔG°_rxn2-Rτln([庫])＜+1kcal/mol，其中R是理想氣體常數(shù)并且τ是開爾文溫度。

在一個實施方式中，靶核酸探針以反應標準自由能(ΔG°_rxn1)與靶標發(fā)生反應，變體核酸探針以反應標準自由能(ΔG°_rxn2)與變體發(fā)生反應，靶標輔助寡核苷酸的初始濃度[A]，和變體輔助寡核苷酸的初始濃度[B]滿足以下的一個或多個：(ΔG°_rxn1+Rτln([A]/[探針])-(ΔG°_rxn2-Rτln([B]/[庫])為+8kcal/mol至0kcal/mol；(ΔG°_rxn1+Rτln([A]/[探針])-ΔG°_rxn2+Rτln([庫]))為-8kcal/mol至-1kcal/mol；(ΔG°_rxn1-Rτln[探針])-(ΔG°_rxn2-Rτln([B]/[庫])為+8kcal/mol至0kcal/mol；或者(ΔG°_rxn1-Rτln[探針])-(ΔG°_rxn2+Rτln([庫])為+8kcal/mol至0kcal/mol，各自在操作溫度和緩沖條件下評價。

在任意上述適用實施方式中的一個或多個中，用至少一個用于檢測、定位或雜交強化的化學部分，如熒光團、半抗原、生物素、疊氮化物、琥珀酰亞胺、或小溝結(jié)合劑來官能化第一靶標探針寡核苷酸。

在任意上述適用實施方式中的一個或多個中，通過與寡核苷酸的一種或多種雜交相互作用來接合第一靶標探針寡核苷酸，所述寡核苷酸用至少一個用于檢測、定位或雜交強化的化學部分如熒光團、半抗原、生物素、疊氮化物、琥珀酰亞胺、或小溝結(jié)合劑官能化。

在任意上述適用實施方式中的一個或多個中，用至少一個用于定位或雜交強化的化學部分如半抗原、生物素、疊氮化物、琥珀酰亞胺、小溝結(jié)合劑或插入熒光團來官能化第一變體探針寡核苷酸。

還提供可一種在反應中使用任意上述組合物來分離、鑒定、定量或檢測核酸異質(zhì)混合物中的靶標的方法。在一個實施方式中，該方法包括提供或獲得核酸(樣品)異質(zhì)混合物，其包含含主要等位基因的物質(zhì)(變體)和含稀有等位基因的物質(zhì)(靶標)，使得比對的變體和靶標的子序列相差至少1個核苷酸(多態(tài)性核苷酸)。與本文所述的任意組合物實施方式一致的靶核酸探針與樣品混合，其中靶核酸與靶標的雜交比與變體的雜交更有利，并且產(chǎn)生反應產(chǎn)物，其中靶標中的多態(tài)性核苷酸是與探針上的相應核苷酸配對的沃森-克里克堿基。該方法還包括將變體核酸探針與樣品混合，其與變體的雜交比與靶標的雜交更有利，并且產(chǎn)生產(chǎn)物，其中變體中的多態(tài)性核苷酸是與變體核酸探針上的相應核苷酸配對的沃森-克里克堿基。在該方法中，混合的變體核酸探針的摩爾量或濃度相對靶核酸探針的濃度過量。另外，該方法還包括以本文所述的相對濃度混合靶標輔助寡核苷酸和變體輔助寡核苷酸，如本文所述的那些。靶核酸探針和變體核酸探針，以及任意輔助寡核苷酸可以單一組合物添加到樣品中。

在任意上述適用實施方式中的一個或多個中，變體樣品濃度除以靶標的樣品濃度的比率為X，其中X是至少20。

在任意上述適用實施方式中的一個或多個中，在與競爭性組合物(探針和庫)反應之后，與探針結(jié)合的變體的量除以與探針結(jié)合的靶標的量不超過(X/10)、(X/30)、(X/100)、(X/300)、或(X/1000)。

在任意上述適用實施方式中的一個或多個中，競爭性組合物(探針和庫)與樣品之間的反應在充分混合的溶液中等溫且均勻地發(fā)生。

在任意上述適用實施方式中的一個或多個中，競爭性組合物和樣品之間的反應在充分混合的溶液中發(fā)生，其具有隨時間變化的溫度概況。

在任意上述適用實施方式中的一個或多個中，隨時間變化的溫度概況至不低于70℃的溫度的加熱步驟，之后是不超過65℃的溫度的冷卻步驟。

在任意上述適用實施方式中的一個或多個中，競爭性組合物和樣品之間的反應在充分混合的溶液中發(fā)生，其具有隨時間變化的反應緩沖概況，如通過洗滌步驟。

在任意上述適用實施方式中的一個或多個中，競爭性組合物和樣品之間的反應在表面上發(fā)生，如用于成像的載片或納米顆粒。

在任意上述適用實施方式中的一個或多個中，與探針分子雜交的變體和靶分子誘導局部可檢測的熒光、化學發(fā)光、或適于成像的金屬沉淀。

在任意上述適用實施方式中的一個或多個中，與探針分子雜交的變體和靶分子誘導酶促反應、條件性熒光、或表面定位，以能夠檢測或定量靶標。

在任意上述適用實施方式中的一個或多個中，與探針分子雜交的變體和靶分子誘導表面定位或其他分離，以能夠從初始樣品中的變體和其他物質(zhì)中純化或富集靶標。

在任意上述適用實施方式中的一個或多個中，出于分子診斷或疾病病原體或生物標記速的表征，例如針對感染性疾病，或針對遺傳疾病的目的，使用靶標成像、檢測、定量、富集或純化。

附圖的簡要說明

圖1：競爭性組合物發(fā)明概述。本發(fā)明的核酸探針組合物(也稱為競爭性組合物)2是包含對靶物質(zhì)T有特異性的靶核酸探針(探針)和對變體物質(zhì)V有特異性的變體核酸探針(庫)。再次，探針結(jié)合靶標比結(jié)合變體更有利，并且?guī)旖Y(jié)合變體比結(jié)合靶標更有利。使用本發(fā)明的核酸組合物來分離、鑒定或檢測核酸樣品1的異質(zhì)混合物中的靶標。樣品中變體與靶標的初始濃度比率為X。在反應3完成之后，與探針結(jié)合的靶標的量(T′探針)和與探針結(jié)合的變體的量(V′探針)之比Y將相對于樣品中靶標與探針的初始比率富集。

圖2：競爭性組合物組分的可能形態(tài)。競爭性組合物包含靶核酸探針(在下文中一般稱為“探針”)和變體核酸探針(在本文中一般稱為“庫”)。各自可采用先前文獻報道的或待報道的多種不同核酸分子形態(tài)之一。該圖顯示探針可采用的形態(tài)的部分列表。庫可采用的形態(tài)是相似的。重要的是，探針和庫的形態(tài)可以不同。探針和庫都可包含單嵌段或雙嵌段，其中嵌段是包含2個或更多個通過沃森-克里克雜交反應形成的寡核苷酸的鏈或復合物。左圖顯示了靶標與包含靶標結(jié)合嵌段(TB-嵌段)的單嵌段探針4之間的反應。右圖顯示了靶標與包含靶標結(jié)合嵌段(TB-嵌段)和輔助嵌段(A-嵌段)的雙嵌段探針10之間的反應。放大圖顯示了單嵌段(5-9)和雙嵌段探針(11-15)的示例性結(jié)構(gòu)。鏈之間的黑點表示各嵌段內(nèi)的堿基對，而垂直黑線表示嵌段之間以及靶標結(jié)合嵌段與結(jié)合靶標(T′探針)之間的堿基對。探針的加粗黑色部分表示核苷酸，取決于在靶標和變體物質(zhì)之間不同的多態(tài)性核苷酸。在各鏈的一端處的半箭頭表示3′端。

圖3：樣品與示例性競爭性組合物16之間的初級反應。在此，各寡核苷酸被分成由數(shù)字表示的區(qū)。各區(qū)包含連續(xù)核苷酸堿基，并且作用是雜交和解離中的功能性單元。4個初級反應是(1)靶標T結(jié)合至探針，(2)變體V結(jié)合至庫，(3)變體V結(jié)合至探針，和(4)靶標T結(jié)合至庫。這些反應各自具有表征其有利性的相應反應標準自由能ΔG°_rxn。前兩個反應是將靶標與探針以及變體與庫適當配對的需要反應，而后兩個反應是不需要的。

圖4A：顯示了在第一反應標準自由能值下探針與庫的反應平衡性質(zhì)。顯示了對探針(假設(shè)過量探針)的平衡結(jié)合產(chǎn)率對于反應ΔG°_rxn的分析依賴性，以及ΔG°_rxn1＝-0.5kcal/mol和ΔG°_rxn3＝+2.5kcal/mol的產(chǎn)率，對應于3.0kcal/mol的ΔΔG°₁。對于這些值，在靶標與探針以及變體與探針之間的結(jié)合產(chǎn)率上存在幾乎50倍的差異。

圖4B：顯示了在與圖4A不同的第二反應標準自由能值下探針與庫的反應平衡性質(zhì)。對庫的平衡結(jié)合產(chǎn)率對于反應ΔG°_rxn的分析依賴性遵循S型曲線。因為庫的目的是為了消耗變體濃度而對靶標濃度沒有過多影響，對于探針需要不同組的ΔG°_rxn。在此，ΔG°_rxn2＝-3kcal/mol且ΔG°_rxn4＝+1kcal/mol導致變體98％消耗(剩余2％)和靶標29％消耗(剩余71％)。這組值將改善富集因數(shù)超過30倍(71％/2％)。

圖5：使用X-探針作為探針和粘性探針作為庫的競爭性組合物16的實施方式，其中探針顯示出在與靶標T或變體V雜交之后的條件熒光。實現(xiàn)了條件熒光，因為熒光團(顯示為星)初始緊密靠近猝滅劑(顯示為大點)；在反應時候，猝滅劑遠離并且熒光增加。有三種原因產(chǎn)生觀察的熒光：由于與探針結(jié)合的靶標的熒光(f_A)，由于與探針結(jié)合的變體的熒光(f_C)，和由于不完全猝滅的未結(jié)合探針的熒光(f_B)。

圖6：用于熒光檢測EGFR野生型序列(V)(SEQ ID NO：44)的背景中稀有EGFR L858R(c.2573T＞G)突變(T)(SEQ ID NO：43)的示例性競爭性組合物41(以出現(xiàn)的順序分別是SEQ ID NO：2、45、1、46、47和48)。多態(tài)性核苷酸加粗顯示。顯示了單獨變體(1500nM)和含小量靶標(0.5nM)的變體(1500nM)的差異熒光響應。后面的情況對應于變體對靶標X＝3000-倍過量，并且比較f_A和f_C值表明結(jié)合探針的靶標與結(jié)合探針的變體相比有2781倍的結(jié)合親和性差異(由β計量)。實驗在37℃下在5x PBS緩沖液中使用給定序列的合成寡核苷酸進行。

圖7：用于熒光檢測TP53野生型序列(V)(SEQ ID NO：248)的背景中稀有TP53 R248Q(c.743G＞A)突變(T)(SEQ ID NO：247)的示例性競爭性組合物42(以出現(xiàn)的順序分別是SEQ ID NO：2、249、1、250、251和252)。實驗在37℃下在5x PBS緩沖液中使用給定序列的合成寡核苷酸進行。

圖8：用于熒光檢測NRAS野生型序列(V)(SEQ ID NO：146)的背景中稀有NRAS G12D(c.35G＞A)突變(T)(SEQ ID NO：145)的示例性競爭性組合物43(以出現(xiàn)的順序分別是SEQ ID NO：2、147、1、148、143和144)。實驗在37℃下在5x PBS緩沖液中使用給定序列的合成寡核苷酸進行。

圖9A提供了用于競爭性組合物以測試44種不同的癌癥相關(guān)單核苷酸多態(tài)性的探針和庫的形態(tài)。使用的探針序列和靶標/變體序列示于表1-3。

圖9B提供了使用圖9A的競爭性組合物的44種不同癌癥相關(guān)靶標/變體對的實驗結(jié)果的結(jié)合親和性倍數(shù)變化β的總結(jié)。在此，樣品變體/靶標比率為1000∶1。結(jié)合親和性倍數(shù)變化在200和2420之間變化，中值大約為1000。

圖9C提供了與含有探針和庫的競爭性組合物相比，僅使用沒有庫的競爭性組合物的探針組分對來自相同的44種靶標/變體對的實驗結(jié)果的倍數(shù)變化β的比較。在此，樣品變體/靶標比率為X＝100，比競爭性組合物低10倍。中值倍數(shù)變化β為大約30，這與之前報道的最好設(shè)計相一致。因此，競爭性組合物具有大約30-1000的額外因數(shù)的改善富集，使得稀有等位基因檢測降低至0.1％加載。這首次報道了在該靈敏度下對稀有等位基因的可靠無酶和均勻檢測。

圖9D提供了在1小時反應時間時的最優(yōu)ΔG°_rxn組合的示例性分布。該圖顯示了由常微分方程給出的圖9A-9C中所述的44種突變的最優(yōu)ΔG°_rxn1和ΔG°_rxn2值，在37℃下ΔΔG°值的范圍是+1.8kcal/mol至+5.9kcal/mol。具有這些值的ΔG°_rxn的探針和庫在1小時處顯示出最大特異性。如所示的那樣，最優(yōu)ΔG°_rxn對于不同的ΔΔG°值有顯著偏移。對于我們已經(jīng)測試的44種SNV/WT對，最優(yōu)ΔG°_rxn1和ΔG°_rxn2值可分別在從-1.6到-0.6kcal/mol和從-6.4到-2.8kcal/mol中變化。

圖10A提供了對人基因組DNA樣品的PCR擴增子的競爭性組合物試驗的實驗工作流程圖。2種從Coriell細胞庫提取的在SMAD7基因座處含有單核苷酸多態(tài)性的DNA樣品(NA18537和NA18546)以100∶0、99∶1、90∶10、10∶90、1∶99、和0∶100混合至2ng/μL的總濃度(50μL)，并且通過不對稱非等位基因特異性PCR 49擴增以生成單鏈擴增子50。針對各等位基因設(shè)計的競爭性組合物51與檢測52指定PCR產(chǎn)物混合。

圖10B提供了對用于圖10A所示實驗的各SNP的比較性組合物的熒光響應。在各實驗中，0.5nM探針和10nM庫與40μL PCR產(chǎn)物反應。在PCR之前，基因組DNA混合物中的SMAD7-C(顯示為黑色)和SMAD7-T(顯示為灰色)的等位基因頻率顯示在括號中。

圖11：由作為探針的條件性熒光X-探針和作為庫的粘性探針組成的示例性競爭性組合物中存在的附帶物質(zhì)列表。溶液中的其他物質(zhì)是由于探針46和庫47的配制，故意導致某些物質(zhì)過量。本文所示的所有物質(zhì)被考慮并模擬建模。

圖12A提供了對競爭性組合物與低比例(0.01％)靶標反應的模擬。這些模擬是基于實施例條件熒光系統(tǒng)內(nèi)容中所述的常微分方程式模型進行的。顯示了取決于ΔG°_rxn1和ΔG°_rxn2的變化值，在1小時反應、4小時反應、和48小時反應之后由該低量的靶標引起的結(jié)合親和性倍數(shù)變化β。更長的反應時間使產(chǎn)生高β的ΔG°_rxn值的范圍更寬。

圖12B提供了圖12A中所示的基于1小時反應后的ΔG°_rxn1和ΔG°_rxn2的β值的三維展示。

圖12C顯示了基于圖12A的模擬，在不同反應時間段后可實現(xiàn)的最大β值。

圖13：含不同探針和庫組分形態(tài)的競爭性組合物53，其中生物素官能化的(Bio)發(fā)夾探針用于所述探針并且Yin-Yang探針用于庫。用基于熱動力學適當設(shè)計的探針，將通過鏈霉親和素包被的表面54捕獲的靶標T與變體V的分數(shù)將在原始樣品上高度富集。由于發(fā)夾探針的單鏈性質(zhì)，在對最優(yōu)ΔG°_rxn1的評價中存在額外的Rτln([探針])項。鏈之間的黑點表示各嵌段內(nèi)的堿基對，而垂直黑線表示嵌段之間以及靶標結(jié)合嵌段與結(jié)合靶標或變體之間的堿基對。

圖14：具有未官能化的探針和庫組件的競爭性組合物55。相反，通過與探針的其他區(qū)(區(qū)56)互補的通用序列的官能化核酸分子57實現(xiàn)富集能力。探針與官能化寡核苷酸之間的間接連接不需要通過僅一個雜交相互作用：例如，探針可與未官能化的鏈部分雜交，其本身與第二官能化的鏈部分雜交。與官能化的基團共定位的產(chǎn)物將同時或依次被捕獲58、成像59、或通過任何其他方法測試，而其余的分子通常將被洗去60。

圖15：用于等位基因特異性酶促擴增富集的競爭性組合物。靶標和變體物質(zhì)是基于EGFR L858R(c.2573T＞G)突變61和相應野生型序列62的反義鏈。顯示的ΔG°_rxn的值在60℃下在0.18M Na⁺中計算，與一般PCR退火步驟的環(huán)境相一致。探針63是沒有在3′端被非延伸性基團封閉并且能夠用作引物的唯一物質(zhì)。因此，在結(jié)合探針中靶標對變體的富集用于增加由PCR擴增的靶標的比例。圖15以出現(xiàn)的順序分別公開了SEQ ID NO：277-282。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

在本發(fā)明中，提供了新試劑混合物組合物(本文中稱為“競爭性組合物”)。競爭性組合物與含有以下至少2種密切相關(guān)的核酸物質(zhì)的異質(zhì)樣品混合物反應：含主要等位基因的物質(zhì)(變體)和含稀有等位基因的物質(zhì)(靶標)，前者一般對于后者過量(圖1)。變體和靶標分子含有高度相似的子序列，長度為例如5-200個核苷酸，其相差至少1個核苷酸，稱為多態(tài)性核苷酸。

競爭性組合物包含靶核酸探針(探針)和變體核酸探針(庫)，后者濃度相對前者過量，庫與變體的反應比與靶標的反應更有利(由于庫對主要等位基因核苷酸的互補性)并且探針與靶標的反應比與變體的反應更有利(由于探針對稀有等位基因核苷酸的互補性)。

數(shù)學上，初始樣品中變體對靶標的濃度比率([變體]/[靶標])在此表示為X，并且在反應后結(jié)合至探針的變體對靶標的濃度比率表示為Y。通過使用基于本文所述的指南設(shè)計的競爭性組合物，Y將遠小于X；我們在44種不同癌癥相關(guān)突變上的實驗數(shù)據(jù)顯示約1000的平均富集比率(X/Y)。

本發(fā)明的競爭性組合物的富集比率顯著高于僅使用單一探針的現(xiàn)有技術(shù)。除了顯示與現(xiàn)有技術(shù)相比有利的實驗結(jié)果以外，本發(fā)明還包括驗證的理論分析和模擬，其解釋了為何本文所述的競爭性組合物在策略上提供優(yōu)勢。

競爭性組合物的組分

競爭性組合物的組分包含靶核酸探針(探針)、變體核酸探針(庫)、和靶標輔助寡核苷酸以及靶標輔助寡核苷酸。探針和庫都可包含單嵌段或雙嵌段，其中嵌段是包含2個或更多個通過沃森-克里克雜交反應形成的寡核苷酸的鏈或復合物。單嵌段探針或庫包含靶標結(jié)合嵌段，而除了靶標結(jié)合嵌段以外，雙嵌段探針或庫還包含輔助嵌段。在靶標或變體雜交的同時，輔助嵌段從靶標結(jié)合模塊釋放。這些組分各自是核酸分子并且可采用任意數(shù)量的不同形態(tài)(圖2)。探針和庫的示例性單嵌段實施方式包括(但不限于)分子信標、發(fā)夾探針和三莖探針。探針和庫的示例性雙嵌段實施方式包括(但不限于)Yin-Yang探針、粘性探針和X-探針。

這些設(shè)計各自一般在與其目標靶標的反應有利性上具有一定程度的可調(diào)節(jié)性(即，靶標針對探針，變體針對庫)。例如，可通過針對Yin-Yang探針、粘性探針X-探針和發(fā)夾探針的單鏈粘性區(qū)的長度；粘性探針和X-探針的非同源區(qū)的長度調(diào)節(jié)雜交的標準自由能(ΔG°_rxn)。對于單鏈組分(例如，分子信標、發(fā)夾探針、三莖探針)，可通過組分濃度來調(diào)節(jié)反應有利性。

出于顯示本發(fā)明的一個實施方式的目的，將表述包含針對探針的X-探針和針對庫的粘性探針的具體示例性競爭性組合物。應理解，該具體實施方式是為了提供競爭性組合物的示例，并且不意味著將競爭性組合物限制到該實施方式。

如圖3所示，例如，在一個實施方式中，目標核酸探針(探針)是X-探針并且非靶核酸探針(庫)是粘性探針。在此，X-探針(探針)包含以下的4個寡核苷酸或鏈：包含子序列19、18、21和27的第一靶標寡核苷酸；包含子序列17、20和25的第二靶標寡核苷酸；包含子序列23和26的第三寡核苷酸；以及包含子序列22和24的第四寡核苷酸。第三靶標寡核苷酸還可表征為包含靶序列區(qū)，其針對子序列18和19(并且在一些情況中針對20)。還應注意到，并非各寡核苷酸的所有子序列都是合適功能所需的。例如，可去除子序列20-23，或者僅去除子序列20和21，或者另外，可去除子序列22和23。由圖3中的數(shù)字表示的各子序列表示功能上作為雜交或解離單元的寡核苷酸的部分。如果各子序列的核苷酸可同時互相形成幾個沃森-克里克堿基對，則一個子序列被稱為與另一個子序列互補。在該具體實施例中，設(shè)計第一和第二靶標寡核苷酸，使得子序列17部分或完全與子序列18互補，從而形成探針的第一雙鏈區(qū)；任選子序列20部分或完全與區(qū)21互補，從而形成探針的第二雙鏈區(qū)(或簡單延伸第一雙鏈區(qū))；子序列26部分或完全與區(qū)27互補，從而形成探針的第三雙鏈區(qū)；任選子序列22部分或完全與區(qū)23互補，從而形成探針的第四雙鏈區(qū)；并且子序列24部分或完全與區(qū)25互補，從而形成探針的第五雙鏈區(qū)。另外，第一靶標核苷酸包括包含子序列19的單鏈區(qū)，該子序列與靶核酸序列互補(如子序列18)。雖然圖3中未顯示，子序列22和23(或在不用子序列22和23設(shè)計的探針的情況中任選的子序列26和24)提供了用于可檢測標簽及其猝滅劑偶聯(lián)的位點。

當如圖3所示，X-探針在合適溫度和緩沖條件下被導入含有靶標T的樣品中時，第一靶標寡核苷酸的子序列18和19分別與靶標T的子序列33和34雜交。在這種雜交之后，含有第三寡核苷酸的子序列26將仍然與第一靶標寡核苷酸的子序列27雜交(“靶標復合物”)，而第二靶標寡核苷酸和第四寡核苷酸(“保護復合物”)將從靶標復合物上解離。在熒光團F偶聯(lián)至子序列23處的第二寡核苷酸末端并且猝滅劑Q偶聯(lián)至子序列22處的第四寡核苷酸的情況中，在結(jié)合至靶標之后從靶標復合物解離保護復合物將去除猝滅劑Q并且使熒光團F在第三寡核苷酸仍然與第一靶標寡核苷酸的子序列27雜交時發(fā)出熒光。

繼續(xù)圖3，在一個實施方式中，庫包含粘性或超特異性探針。庫包括包含子序列32、29和30的第一非靶標寡核苷酸和包含子序列28和31的第二非靶標寡核苷酸。如圖3所理解，庫形成從子序列28和29的雜交產(chǎn)生的第一雙鏈區(qū)和從子序列31和32的雜交產(chǎn)生的第二雙鏈區(qū)。這留下了具有子序列30的單鏈區(qū)的第一非靶標寡核苷酸。在接觸包含靶標T和非靶標核酸變體V的樣品之后，子序列29和30將分別雜交至變體V的子序列36和37，從而導致從探針復合物釋放第二非靶標寡核苷酸。如上所述，庫可分別在子序列32和31的末端處包含在第一非靶標寡核苷酸上的標簽和在第二非靶標核苷酸上的猝滅劑。在這種情況中，標簽將在第一非靶標寡核苷酸結(jié)合至變體V而含有猝滅劑的第二非靶標寡核苷酸被替換之后變得可檢測到。

雖然圖3中未顯示，組合物可包含靶標輔助寡核苷酸和非靶標輔助寡核苷酸。在某些實施方式中，靶標輔助寡核苷酸包含與探針復合物分離且游離的與第四寡核苷酸雜交的第二靶標寡核苷酸。因此，靶標輔助寡核苷酸或復合物在第一靶標寡核苷酸和第三寡核苷酸中過量，從而產(chǎn)生與第三寡核苷酸復合的游離第一靶標寡核苷酸的初始濃度。類似地，在這種實施方式中，非靶標輔助寡核苷酸包含與庫探針復合物分離且游離的第二非靶標寡核苷酸。換句話說，第二非靶標寡核苷酸將相對第一非靶標寡核苷酸過量。

在另一個實施方式中，競爭性組合物的靶核酸探針將包含粘性探針代替X-探針，并且非靶標核酸探針或庫探針將包含粘性探針或X-探針。在另一個實施方式中，靶核酸探針可包含粘性探針或X探針并且非靶核酸探針或庫探針可包含單一寡核苷酸。在另一個實施方式中，靶核酸探針可包含單一寡核苷酸并且?guī)焯结樋砂承蕴结樆騒-探針。

如下文更詳細說明，基于其序列，靶核酸探針(探針)具有定義為ΔG°_rxn1的與靶核酸序列T的靶標反應標準自由能，而探針與變體或非靶核酸鏈V的反應將具有反應標準自由能ΔG°_rxn3，其由于錯配堿基而弱于ΔG°_rxn1(正得更多或負得更少)。此外，庫將以相反的方式作用，其中其與靶標的反應標準自由能(ΔG°_rxn4)由于靶標T中的錯配堿基而弱于其與變體的反應標準自由能(ΔG°_rxn2)。此外，在某些實施方式中，ΔG°_rxn1將弱于ΔG°_rxn2(正得更多或負得更少)。更具體地，在某些實施方式中，ΔG°_rxn1和ΔG°_rxn2之間的關(guān)系可定義為，例如，ΔG°_rxn1大于ΔG°_rxn2+1kcal/mol之和，或者ΔG°_rxn1大于ΔG°_rxn2，其中ΔG°_rxn2大于-7kcal/mol。本文所用的與探針對靶標T或庫對變體V的標準反應自由能結(jié)合的術(shù)語“大于”表示正得更多或負得更少(例如，-4kcal/mol“大于”-7kcal/mol)。因此，在許多情況中，本發(fā)明的組合物包含靶核酸探針，所述靶核酸探針與靶核酸T的相互作用比非靶核酸探針(庫)與非靶核酸變體V的相互作用更不利。在將使用本文所述的競爭性組合物的大多數(shù)樣品中，非靶核酸物質(zhì)或變體V存在于主要等位基因上并且因此將相對稀有等位基因上存在的靶核酸物質(zhì)T而過量。

在任意上述實施方式中，探針的任一鏈還可包含合成核酸類似物，如LNA、PNA、2′O-甲基取代的RNA、L-DNA、和鏡像寡核苷酸(speigelmer)。另外，探針的任一鏈還可包含合成或天然類似物，如次黃嘌呤、甲基化的核苷酸、異-胞嘧啶和異-鳥嘌呤、鏡像寡核苷酸、和xDNA。

術(shù)語“多核苷酸”、“核酸”、“寡核苷酸”、“核酸物質(zhì)”和“核酸分子”可互換使用。它們是指任何長度的核苷酸聚合形式，不論是脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或它們的類似物。多核苷酸可以具有任意的三維結(jié)構(gòu)，且可以執(zhí)行任何功能。以下是多核苷酸的非限制性例子：基因或基因片段的編碼或非編碼區(qū)域、由連鎖分析定義的基因座、外顯子、內(nèi)含子、信使RNA(mRNA)、轉(zhuǎn)移RNA、核糖體RNA、核酶、cDNA、重組多核苷酸、支鏈多核苷酸、質(zhì)粒、載體、任意序列的分離DNA、任意序列的分離RNA、核酸探針和引物。多核苷酸可包括修飾的核苷酸，如甲基化的核苷酸和核苷酸類似物。如果存在，對核苷酸結(jié)構(gòu)的修飾可在聚合物的組裝之前或之后賦予。多核苷酸可進一步被修飾，如通過與標記組分結(jié)合。

提供了用于制備X-探針的方法。在一個實施方式中，第三寡核苷酸(A)、第四寡核苷酸(B)、第二靶標(或非靶標)寡核苷酸(P)、和第一靶標(或非靶標)寡核苷酸(C)在水性溶液中混合在一起。在一個實施方式中，第一靶標(或非靶標)寡核苷酸C的濃度相對第三寡核苷酸A過量，第二靶標(或非靶標)寡核苷酸(P)的濃度相對第一靶標(或非靶標)寡核苷酸(C)過量，并且第四寡核苷酸(B)的濃度相對保護鏈過量，使得形成包含復合物BPCA、復合物BPC、復合物BP、和鏈B的探針混合物。在另一個實施方式中，P的濃度相對B過量，C的濃度相對P過量，并且A的濃度相對C過量，使得形成的探針混合物包含復合物BPCA、復合物PCA、復合物CA、和鏈A。

在任意上述實施方式中，探針組分在混合后熱退火。在一個實施方式中，熱退火包括將混合物加熱至不低于65℃的溫度，并且冷卻至不高于45℃的溫度。在另一個實施方式中，熱退火包括將混合物加熱至不低于80℃的溫度，并且冷卻至不高于60℃的溫度。在另一個實施方式中，熱退火包括將混合物加熱至不低于95℃的溫度，并且冷卻至不高于75℃的溫度。

在另一個實施方式中，探針組分通過添加鹽或高鹽溶液而等溫退火。在另一個實施方式中，探針組分通過去除或稀釋甲酰胺或其他變性劑而等溫退火。

本發(fā)明的探針可用于多種試驗，包括但不限于以下：通過熒光的特異性DNA或RNA檢測或定量；通過熒光的特異性DNA或RNA成像；通過顯色方法(例如，半抗原化探針，和后續(xù)基于抗體補充辣根過氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酶(AP))的特異性DNA或RNA檢測、定量或成像。

競爭性組合物反應

圖3顯示了分解為多個區(qū)域或子序列的靶標T、變體V、探針和庫，由數(shù)字表示。各區(qū)是多個用作雜交和解離單元的連續(xù)核苷酸堿基。區(qū)可部分或完全沃森-克里克互補至其他區(qū)(例如，區(qū)17到區(qū)18)，并且不同的區(qū)可具有互相相同的序列(例如，區(qū)34和37)。

本文中假定變體和靶標物質(zhì)互相僅相差單個多態(tài)性核苷酸，如粗黑線段或黑色圓圈所示。在該實施例中，多態(tài)性核苷酸在33和36區(qū)中。在此，假定區(qū)18和29在序列上僅在與多態(tài)性核苷酸互補的核苷酸處不同，并且區(qū)19和30在序列上相同。實際上，并不需要這樣：例如，多態(tài)性核苷酸的互補物可在探針的區(qū)2和庫的區(qū)30中，即，探針結(jié)合靶標/變體的位置不需要與庫結(jié)合變體/靶標的位置相同。圖3中變體和靶標上的區(qū)35和38是任選的并且可能對于短變體和靶標而言不存在。然而，如果它們存在，則區(qū)35和38具體地對于探針的區(qū)21和23以及庫的區(qū)32而言不是互補的。在2對物質(zhì)之間出現(xiàn)4個不同初級反應：(1)靶標與探針，(2)變體與庫，(3)變體與探針，和(4)靶標與庫。從富集結(jié)合至探針的靶標的分數(shù)來看，需要前兩個反應：反應(1)是靶標與探針的適當結(jié)合，并且反應(2)降低了可結(jié)合至探針的變體的量。相反，不需要另2個反應：反應(3)是變體與探針的不適當結(jié)合，并且反應(4)降低了可與探針結(jié)合的靶標的量。4個反應的標準自由能分別定義為ΔG°_rxn1、ΔG°_rxn2、ΔG°_rxn3、ΔG°_rxn4。

假設(shè)，需要ΔG°_rxn1和ΔG°_rxn2盡可能負(有利)，同時ΔG°_rxn3和ΔG°_rxn4應盡可能正(不利)。然而，這些值需要耦合：

ΔΔG°₁＝ΔG°_rxn3-ΔG°_rxn1

ΔΔG°₂＝ΔG°_rxn4-ΔG°_rxn2

ΔΔG°₁和ΔΔG°₂的值進而受到單堿基錯配的相對熱動力學的影響(一般，ΔΔG°₁≠ΔΔG°₂)?；趯嶒灁?shù)據(jù)和分析，已經(jīng)確定ΔG°_rxn1和ΔG°_rxn2的最優(yōu)值一定程度上取決于ΔΔG°值。

將不同ΔG°_rxn項與其對競爭性組合物性能的影響之間的耦合概念化的一種方式是考慮探針和庫與靶標和變體的各單獨反應的平衡。在這種簡化的標準中，可基于ΔG°_rxn的值分析計算各反應產(chǎn)率(定義為在平衡時與探針或庫雜交的靶標或變體的比例)(圖4A和4B)。當變體相對靶標存在大幅過量時，從富集的角度來看需要探針具有較高的特異性而庫具有較高的靈敏度。

設(shè)計原理

ΔΔG°₁和ΔΔG°₂的值分別受到在變體-探針復合物(V′探針)和靶標-庫復合物(T′庫)之間生成的單堿基錯配泡的影響。這兩項的較大值提供了更大的潛在富集，但是這種潛力只能通過適當設(shè)計具有優(yōu)化的ΔG°_rxn1和ΔG°_rxn2值的探針和庫來開發(fā)。

返回圖3以及圖4A和4B，需要考慮特異性和靈敏度之間的重要權(quán)衡。例如，僅富集因數(shù)(X/Y)最大化，代替特異性，源自分別為+∞和-∞的ΔG°_rxn1和ΔG°_rxn2的值；不幸的是，這種競爭性組合物設(shè)計將不會產(chǎn)生與探針結(jié)合的靶標或變體。這種結(jié)果明顯是稀有等位基因檢測、定量、成像和純化方面的應用所不希望的，因為這種競爭性組合物對靶標的靈敏度為零。

為了探索實際設(shè)置中的這些權(quán)衡，條件性熒光X-探針被認為是用于靶標檢測的模型應用。結(jié)合親和性倍數(shù)變化β＝(f_A·X)/(f_B+f_C)代表了由于小量靶標引起的可檢測熒光差異?？紤]到競爭性組合物中的大量物質(zhì)和反應參數(shù)，分析解決方案和優(yōu)化不可能產(chǎn)生有助于直觀理解的簡單解決方案。因此，進行對競爭性組合物的常微分方程(ODE)模擬以檢驗由于各種因數(shù)的結(jié)合親和性倍數(shù)變化特征。這種模擬遵循化學反應的速率方程并且在數(shù)字上將反應過程集成在一起。

為了精確性，也考慮探針和庫組分中的建模的偶見(incidental)物質(zhì)(圖11)。其他研究表明，這些對系統(tǒng)的總體性能的影響非常小。建模的化學反應是：

其中R表示靶標，D表示變體，k+和k-分別表示正向和反向速率常數(shù)。圖11中顯示了其他物質(zhì)的名稱和結(jié)構(gòu)。所有正向反應速率常數(shù)k+的值假定為3x10⁵M^-1s^-1；這是基于之前的研究和我們自己的校準實驗估計的(數(shù)據(jù)未顯示)。反向反應速率常數(shù)k-的值基于反應的ΔG°和k+計算：

對于k_1-，使用ΔG°_rxn1；對于k_2-，使用ΔG°_rxn2；對于k_3-，使用ΔG°_rxn3≡ΔG°_rxn1+ΔΔG°₁；對于k_4-，使用ΔG°_rxn4≡ΔG°_rxn2+ΔΔG°₂；對于k_5-，使用ΔG°_rxn5≡ΔG°_rxn1+ΔG°_NH；對于k_6-，使用ΔG°_rxn6≡ΔG°_rxn1+ΔΔG°₁+ΔG°_NH。ΔG°_NH項表示探針的不完整QPC缺失的非同源區(qū)，并且具有-8.46kcal/mol的值。對于本文的所有模擬，ΔΔG°₁＝+3kcal/mol且ΔΔG°₂＝+4kcal/mol。上述反應的ODE模擬有以下速率方程組成：

圖12顯示了競爭性組合物系統(tǒng)的匯總模擬結(jié)果。對于這些模擬，物質(zhì)的初始濃度為[靶標]＝0.15nM，[變體]＝1500nM，[FQPC]＝2.5nM，[QPC]＝1.25nM，[QP]＝3.75nM，[PSCS]＝2250nM，并且[Ps]＝450nM。f_B的背景熒光等于來自0.04nM的未猝滅熒光團標記的鏈的熒光，并且與實驗中觀察到的值相一致(圖6-9)。

有產(chǎn)生高結(jié)合親和性倍數(shù)變化的ΔG°_rxn1和ΔG°_rxn2的最優(yōu)值范圍(圖12AB)。當允許較長反應時間時，所需ΔG°_rxn1和ΔG°_rxn2值的范圍將稍變寬：例如，在1小時反應后，當ΔG°_rxn1為0至-1.5kcal/mol并且ΔG°_rxn2為-2.5至-4.5kcal/mol時信號增加是高的。在48小時后，對于ΔG°_rxn1，范圍變寬至0至-4.5kcal/mol并且對于ΔG°_rxn2，范圍變寬至-2.5至-7kcal/mol。

此外，圖12C顯示可實現(xiàn)的最大信號增加隨反應時間而增加，雖然改善在約4小時后出現(xiàn)邊際效應。在許多應用中，需要快速試驗和反應；因此，在短和長反應時間之間存在權(quán)衡。預期一般將是30分鐘至4小時。

在上述模擬中，假定ΔΔG°₁和ΔΔG°₂是+3和+4kcal/mol。通過我們的模擬和研究過程，已經(jīng)確定最優(yōu)ΔG°_rxn1和ΔG°_rxn2范圍對參數(shù)如探針濃度[FQPC]、庫濃度[P_sC_s]、反應時間、和背景熒光信號水平f_B相對不靈敏。然而，它們對化學計量比([QP]/[FQPC])、([P_s]/[P_sC_s])、和ΔΔG°是靈敏的，這與雙鏈探針的現(xiàn)有技術(shù)相一致。

因此，以下范圍的ΔG°_rxn值對于該競爭性組合物的實施方式(X-探針作為探針，超特異性探針作為庫)而言是合理的：

-4kcal/mol≤ΔG°_rxn1+Rτln([QP]/[FQPC]])≤+3kcal/mol (1)

-7kcal/mol≤ΔG°_rxn2+Rτln([P_S]/[P_SC_S])≤+1kcal/mol

其中R是理想氣體常數(shù)并且τ是開爾文溫度，并且顯示的濃度是添加樣品之前的初始濃度?？梢钥闯鲆话阍趲鞂ψ凅w的結(jié)合比探針對靶標的結(jié)合更有利時(ΔG°_rxn1＜ΔG°_rxn2)觀察到高性能。采用導致輔助物質(zhì)釋放的其他探針和庫形態(tài)的競爭性組合物遵循ΔG°_rxn值的相同范圍指南。相反，使用不釋放輔助物質(zhì)(例如，分子信標、發(fā)夾探針和三莖探針)的探針形態(tài)滿足下式：

-4kcal/mol≤ΔG°_rxn1-Rτln([探針])≤+3kcal/mol (2)

類似地，使用不釋放輔助物質(zhì)的庫形態(tài)滿足下式：

-7kcal/mol≤ΔG°_rxn2-Rτln([庫])≤+1kcal/mol (3)

可基于其序列使用軟件如NUPACK或mFold計算給定探針和庫設(shè)計的ΔG°_rxn1和ΔG°_rxn2的值；這種計算在描述組分探針本身的文獻中有更詳細說明并且被認為是熱力學指導的核酸探針設(shè)計領(lǐng)域中普通技術(shù)人員可及的。并不推薦同時使用具有不同形態(tài)的靶向相同靶標物質(zhì)的多種探針；不推薦使用具有不同形態(tài)的靶向相同變體物質(zhì)的多種庫。

例如，圖3的靶核酸T和靶核酸探針(探針)之間相互作用的標準反應自由能可表示成：

ΔG°_rxn1＝ΔG°_34-19-ΔG°_22-23-ΔG°_20-21-ΔG°_ML+(ΔG°_33-18-ΔG°_17-18)-ΔG°_標簽

其中ΔG°_34-19是子序列34和子序列19之間雜交的標準自由能，ΔG°_22-23是子序列22和子序列23之間雜交的標準自由能，ΔG°_20-21是子序列20和子序列21之間雜交的標準自由能，ΔG°_ML是在4個寡核苷酸的相交處提供的多環(huán)中的雜交標準自由能，ΔG°_33-18是子序列33和子序列18之間雜交的標準自由能，ΔG°_17-18是子序列17和子序列18之間雜交的標準自由能，并且ΔG°_標簽是第三寡核苷酸上的標簽在緊密靠近第四寡核苷酸上的標簽時的熱動力學貢獻(未顯示)對比它們遠離時的熱動力學貢獻之間的標準自由能差。

另外，圖3的非靶核酸V和非靶核酸探針(庫)之間相互作用的標準反應自由能可表示成：

ΔG°_rxn2＝ΔG°_t-TC-ΔG°_nh-PC+(ΔG°_v-TC-ΔG°_h-PC)

其中ΔG°_τ-TC是子序列37和子序列30之間雜交的標準自由能，ΔG°_nh-PC是子序列31和子序列32之間雜交的標準自由能，ΔG°_v-TC是子序列36和子序列29之間雜交的標準自由能，ΔG°_h-PC是子序列28和子序列29之間雜交的標準自由能。

最后，雖然信號增加是用于檢測靶標的條件熒光競爭性組合物的特異性量度，采用競爭性組合物的富集能力的其他應用(如基于原位雜交的成像和基于酶的擴增)可能也面臨特異性和靈敏度之間的權(quán)衡，使得對ΔG°_rxn1和ΔG°_rxn2的指南可能是一般而言合適的。

競爭性組合物的其他應用

競爭性組合我的另一個示例實施方式包括探針物質(zhì)與官能化寡聚體(稱為通用官能化鏈)通過對其他結(jié)構(gòu)域的一個或多個雜交相互作用的間接連接(圖14)。與探針反應的靶標和變體分子共定位與通用官能化鏈，其促進了靶標通過表面或納米顆粒捕獲的富集，或者能夠通過直接或下游熒光，金屬沉淀或化學發(fā)光進行檢測/成像。在一些實施方式中，不與探針結(jié)合的靶標和變體分子是暗的或在下游反應之前被洗去。

競爭性組合我的另一個示例實施方式包括使用探針作為酶促擴增的引物(圖15)。靶標可以是含有稀有突變或等位基因的生物序列，并且變體可代表野生型序列。在該實施例中，用防止酶促延伸的化學部分官能化庫的3′端，如雙脫氧核苷酸，3-碳間隔子基團，或小溝結(jié)合劑。

設(shè)計過程

許多潛在設(shè)計過程可用于生成在競爭性組合物中采用的序列。下面提供了一個實施例。

1)從靶核酸選擇靶標和變體作為子序列。靶標和變體必需含有感興趣的多態(tài)性核苷酸，否則是相同的?？紤]，如靶標和變體二級結(jié)構(gòu)，可用于提供關(guān)于靶標和變體序列選擇的信息。

(2)確定操作條件，包括溫度、緩沖液鹽度、擁擠/變性劑、反應時間和讀取機制。

(3)選擇探針和庫的形態(tài)。考慮，如組分的成分和復雜性，可用于指導/提供形態(tài)選擇信息。

(4)基于靶標和變體序列在所需操作條件下計算或估計ΔG°_rxn1和ΔG°_rxn2。某些操作條件的DNA-DNA和RNA-RNA錯配泡的熱動力學值是文獻中存在的；對以其他核酸或條件，僅可粗略估計ΔΔG°值。

(5)通過常微分方程模擬來確定ΔG°_rxn1和ΔG°_rxn2的最優(yōu)值，如本文中所述的那樣。將基于ΔΔG°值、預定背景信號、靶標和變體濃度、以及探針和庫濃度來計算許多不同ΔG°_rxn值的結(jié)合親和性倍數(shù)變化(或其他相關(guān)量度)。

(6)基于選擇的形態(tài)和選擇的ΔG°_rxn1值，根據(jù)需要用對序列的迭代精細調(diào)節(jié)來設(shè)計靶標-特異性探針。其他考慮，如寡核苷酸長度、采用的官能化等可用于進一步指導并且提供探針序列選擇的信息。

(7)基于選擇的形態(tài)和選擇的ΔG°_rxn2值，根據(jù)需要用對序列的迭代精細調(diào)節(jié)來設(shè)計變體-特異性庫。其他考慮，如寡核苷酸長度、采用的官能化等可用于進一步指導并且提供庫序列選擇的信息。

實施例

條件性熒光競爭性組合物的實驗結(jié)果

為了實驗驗證競爭性組合物在結(jié)合至探針中在變體上富集靶標的能力，在探針的條件熒光版本上設(shè)計并進行實驗(圖5)。探針天然是暗的，直至其與靶標或變體雜交。通過用小量(加載)的靶標觀察對變體樣品的熒光響應，并與沒有靶標的情況下相同量的變體的熒光響應，可推導出由競爭性組合物提供富集。

現(xiàn)在參考圖5，4個主要產(chǎn)物通過圖3所述的反應形成；這些之中，2個涉及探針的參數(shù)產(chǎn)生高熒光。由與探針結(jié)合的靶標生成的熒光表示為f_A，由與探針結(jié)合的變體生成的熒光表示為f_C，并且由于不完全猝滅、光子檢測器暗電流、比色皿的自熒光和水拉曼光譜的總背景熒光表示為f_B。

圖6-8顯示了基于3種不同的癌癥相關(guān)突變序列的探針、庫、靶標和變體的序列設(shè)計，來自COSMIC數(shù)據(jù)庫。在各自這些中，變體是野生型基因序列，并且靶標是單核苷酸變體；各種情況中，變體濃度是靶標濃度的3000倍(X＝3000)，但0.033％加載的靶標產(chǎn)生與變體相似的額外熒光信號。這表明與探針結(jié)合的分子，靶標富集倍數(shù)超過1000。

采用的不同量度是“結(jié)合親和性倍數(shù)變化β”，其定義為(f_A·X)/(f_B+f_C)-結(jié)合親和性倍數(shù)變化很可能是最可重復且文件的計量，因為背景熒光水平f_B可能由于來自不同比色皿的自熒光，或者樣品架的位置差異或其他改變而變化。富集因子(X/Y)的下限可計算為結(jié)合親和性倍數(shù)變化。

針對X＝1000的競爭性組合物，對44種不同癌癥相關(guān)突變進行圖6-8的類似實驗，使用圖9A所示的探針和庫形態(tài)。下表1-3表示用于這些實驗中的序列，其中：P-第一靶標探針寡核苷酸；C-第二靶標探針寡核苷酸；F-帶標簽的第三靶標探針寡核苷酸；Q-帶猝滅劑的第四靶標探針寡核苷酸；P_s-第一變體探針寡核苷酸；C_s-第二變體探針寡核苷酸；T-靶核酸序列；V-變體核酸物質(zhì)。應注意到第三和第四靶標探針寡核苷酸是各探針所共同的(各實驗的探針包括P-C-F-Q復合物，僅P-C序列變化)。F和P官能化鏈通過IDT進行合成后HPLC純化；雖有其他鏈安排標準脫鹽且不純化。在官能化序列中，3Rox N/表示由NHS酯化學官能化的3′ROX(羧基-X-若丹明)熒光團的IDT登錄號，并且/5IAbRQ/表示5′Iowa黑紅猝滅劑基團的IDT登錄號。

表1：圖9A-9D的實驗中使用的探針、庫、靶標和變體的序列。

表2：與表1的探針序列聯(lián)用的第三寡核苷酸(F)和第四寡核苷酸(Q)所用序列。

表3：SMAD7基因座處的序列非等位基因特異性引物。

結(jié)果總結(jié)于圖9B。為清楚起見，非線性顯示高于400的β值?？梢钥吹?，所有實驗提示超過200的富集因素，中值為1000左右。圖9C顯示了競爭性組合物實驗與僅提供探針而沒有庫的相同的44種不同靶標/變體對在X＝100處的實驗的比較。僅探針實驗的性能是高度變化的，并且中值富集明顯較低，中值為約30，與現(xiàn)有技術(shù)的報道相一致。因此，競爭性組合物以同源無酶的方式顯著改善靶標的富集，促進了在稀有等位基因檢測中的應用。

競爭性組合物相比良好的單獨靶標特異性探針改善的主要原因在于競爭性組合物同時捕獲ΔΔG°₁和ΔΔG°₂的富集能力，而單獨靶標特異性探針僅捕獲ΔΔG°₁。

圖10顯示了對人基因組DNA樣品的PCR擴增子進行的競爭性組合物試驗。兩種從Coriell細胞庫提取的在SMAD7基因座處含有單核苷酸多態(tài)性的DNA樣品(NA18537和NA18546)以各種比率混合至2ng/μL的總濃度(50μL)，并且通過不對稱非等位基因特異性PCR擴增以生成單鏈擴增子。針對各等位基因而設(shè)計的競爭性組合物與指定PCR產(chǎn)物混合用于檢測。可以看到，競爭性組合物能可靠地檢測低至1％的PCR后預期靶標。

因此，本發(fā)明非常適于實現(xiàn)上述的以及其中所固有的目的和優(yōu)點。本領(lǐng)域技術(shù)人員可作出許多包括在本發(fā)明的所示的精神(部分地由所附權(quán)利要求示出)內(nèi)的改變。

序列表

<110> 威廉馬歇萊思大學（WILLIAM MARSH RICE UNIVERSITY）

<120> 用于富集含稀有等位基因的物質(zhì)的核酸分子的競爭性組合物

<130> 14-21011-WO (260947.00237)

<140>

<141>

<150> 61/981,588

<151> 2014-04-18

<160> 282

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 1

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gtgcgaacag gtacatttgc tcgtcctt 28

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<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 32

gcctacgtga tggccagcgt ggacaacccc 30

<210> 33

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 33

aaggacgagc aaatgtacct gcactacgtg atggccatcg t 41

<210> 34

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 34

ggttgtccac gatggccatc acgtagtggt ctactatcca cgatttaac 49

<210> 35

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 35

agttctacgt gatggccagc gtg 23

<210> 36

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 36

ggttgtccac gctggccatc acgtagaact 30

<210> 37

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 37

gtgcagctca tcatgcagct catgcccttc 30

<210> 38

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 38

gtgcagctca tcacgcagct catgcccttc 30

<210> 39

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 39

aaggacgagc aaatgtacct gcagcagctc atcatgcagc tc 42

<210> 40

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 40

agggcatgag ctgcatgatg agctgctggt ctactatcca cgatttaac 49

<210> 41

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 41

tgttaatagc agctcatcac gcagctc 27

<210> 42

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 42

agggcatgag ctgcgtgatg agctgctatt aaca 34

<210> 43

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 43

atgtcaagat cacagatttt gggcgggcca 30

<210> 44

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 44

atgtcaagat cacagatttt gggctggcca 30

<210> 45

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 45

aaggacgagc aaatgtacct gcagtcaaga tcacagattt tgg 43

<210> 46

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 46

gcccgcccaa aatctgtgat cttgactggt ctactatcca cgatttaac 49

<210> 47

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 47

tgttaatagt caagatcaca gattttgg 28

<210> 48

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 48

gccagcccaa aatctgtgat cttgactatt aaca 34

<210> 49

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 49

tggccaaaca gctgggtgcg gaagagaaag 30

<210> 50

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 50

tggccaaact gctgggtgcg gaagagaaag 30

<210> 51

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 51

aaggacgagc aaatgtacct gcagccaaac agctgggtgc g 41

<210> 52

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 52

tttctcttcc gcacccagct gtttggctgg tctactatcc acgatttaac 50

<210> 53

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 53

tagttgccaa actgctgggt gcg 23

<210> 54

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 54

ttctcttccg cacccagcag tttggcaact a 31

<210> 55

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 55

actacctttc tacggacgtg ggattctgca 30

<210> 56

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 56

actacctttc tacggacgtg ggatcctgca 30

<210> 57

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 57

aaggacgagc aaatgtacct gcataccttt ctacggacgt g 41

<210> 58

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 58

cagaatccca cgtccgtaga aaggtatggt ctactatcca cgatttaac 49

<210> 59

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 59

tgttaatata cctttctacg gacgtg 26

<210> 60

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 60

caggatccca cgtccgtaga aaggtatatt aaca 34

<210> 61

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 61

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<210> 62

<211> 30

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<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 62

ttccagtggc catcaaagtg ttgagggaaa 30

<210> 63

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 63

aaggacgagc aaatgtacct gcaccagtgg ccatcaaagt g 41

<210> 64

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 64

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<210> 65

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 65

gttaatacca gtggccatca aagtg 25

<210> 66

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 66

tccctcaaca ctttgatggc cactggtatt aac 33

<210> 67

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 67

ggatgtgcgg ctcatacaca gggacttggc 30

<210> 68

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 68

ggatgtgcgg ctcgtacaca gggacttggc 30

<210> 69

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 69

aaggacgagc aaatgtacct gcaatgtgcg gctcatacac a 41

<210> 70

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 70

caagtccctg tgtatgagcc gcacattggt ctactatcca cgatttaac 49

<210> 71

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 71

gttaataatg tgcggctcgt acaca 25

<210> 72

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 72

caagtccctg tgtacgagcc gcacattatt aac 33

<210> 73

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 73

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<210> 74

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 74

cttgtggtag ttggagctgg tggc 24

<210> 75

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 75

aaggacgagc aaatgtacct gcaacttgtg gtagttggag 40

<210> 76

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 76

gccagcagct ccaactacca caagttggtc tactatccac gatttaac 48

<210> 77

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 77

ccgctgtggt agttgga 17

<210> 78

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 78

caccagctcc aactaccaca gcgc 24

<210> 79

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 79

cttgtggtag ttggagcttg tggc 24

<210> 80

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 80

cttgtggtag ttggagctgg tggc 24

<210> 81

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 81

aaggacgagc aaatgtacct gcaacttgtg gtagttggag c 41

<210> 82

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 82

gccacaagct ccaactacca caagttggtc tactatccac gatttaac 48

<210> 83

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 83

ccgctgtggt agttgga 17

<210> 84

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 84

caccagctcc aactaccaca gcgc 24

<210> 85

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 85

cttgtggtag ttggagctga tggc 24

<210> 86

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 86

cttgtggtag ttggagctgg tggc 24

<210> 87

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 87

aaggacgagc aaatgtacct gcaacttgtg gtagttggag 40

<210> 88

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 88

gccatcagct ccaactacca caagttggtc tactatccac gatttaac 48

<210> 89

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 89

gcatctgtgg tagttgga 18

<210> 90

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<212> DNA

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<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 90

caccagctcc aactaccaca gatgc 25

<210> 91

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 91

cttgtggtag ttggagctcg tggc 24

<210> 92

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 92

cttgtggtag ttggagctgg tggc 24

<210> 93

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 93

aaggacgagc aaatgtacct gcaacttgtg gtagttggag c 41

<210> 94

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 94

gccacgagct ccaactacca caagttggtc tactatccac gatttaac 48

<210> 95

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 95

ccgctgtggt agttgga 17

<210> 96

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 96

caccagctcc aactaccaca gcgc 24

<210> 97

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 97

cttgtggtag ttggagctag tggc 24

<210> 98

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 98

cttgtggtag ttggagctgg tggc 24

<210> 99

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 99

aaggacgagc aaatgtacct gcaacttgtg gtagttggag 40

<210> 100

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 100

gccactagct ccaactacca caagttggtc tactatccac gatttaac 48

<210> 101

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 101

ccgctgtggt agttgga 17

<210> 102

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 102

caccagctcc aactaccaca gcgc 24

<210> 103

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 103

cttgtggtag ttggagctgt tggc 24

<210> 104

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 104

cttgtggtag ttggagctgg tggc 24

<210> 105

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 105

aaggacgagc aaatgtacct gcaacttgtg gtagttggag 40

<210> 106

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 106

gccaacagct ccaactacca caagttggtc tactatccac gatttaac 48

<210> 107

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 107

ccgctgtggt agttgga 17

<210> 108

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 108

caccagctcc aactaccaca gcgc 24

<210> 109

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 109

cttgtggtag ttggagctgg ttgc 24

<210> 110

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 110

cttgtggtag ttggagctgg tggc 24

<210> 111

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 111

aaggacgagc aaatgtacct gcaacttgtg gtagttggag 40

<210> 112

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 112

gcaaccagct ccaactacca caagttggtc tactatccac gatttaac 48

<210> 113

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 113

caggctgtgg tagttgga 18

<210> 114

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 114

caccagctcc aactaccaca gcctg 25

<210> 115

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 115

cttgtggtag ttggagctgg tgacgtaggc 30

<210> 116

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 116

cttgtggtag ttggagctgg tggcgtaggc 30

<210> 117

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 117

aaggacgagc aaatgtacct gcatgtggta gttggagctg g 41

<210> 118

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 118

ctacgtcacc agctccaact accacatggt ctactatcca cgatttaac 49

<210> 119

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 119

ttaatatgtg gtagttggag ctggt 25

<210> 120

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 120

ctacgccacc agctccaact accacatatt aa 32

<210> 121

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 121

cttgtggtag ttggagctgg tgtcgtaggc 30

<210> 122

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 122

cttgtggtag ttggagctgg tggcgtaggc 30

<210> 123

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 123

aaggacgagc aaatgtacct gcatgtggta gttggagctg g 41

<210> 124

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 124

ctacgacacc agctccaact accacatggt ctactatcca cgatttaac 49

<210> 125

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 125

aggtgtggta gttggagctg gt 22

<210> 126

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 126

ctacgccacc agctccaact accacacct 29

<210> 127

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 127

gcaggtcacg aggagtacag tgcaatgagg 30

<210> 128

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 128

gcaggtcaag aggagtacag tgcaatgagg 30

<210> 129

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 129

aaggacgagc aaatgtacct gcaaggtcac gaggagtaca g 41

<210> 130

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 130

tcattgcact gtactcctcg tgaccttggt ctactatcca cgatttaac 49

<210> 131

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 131

tgttaataag gtcaagagga gtacag 26

<210> 132

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 132

tcattgcact gtactcctct tgaccttatt aaca 34

<210> 133

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 133

acccagaatc agaaggtggg agaactgaag 30

<210> 134

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 134

acccagaagc agaaggtggg agaactgaag 30

<210> 135

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 135

aaggacgagc aaatgtacct gcaccagaat cagaaggtgg g 41

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<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 136

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<210> 137

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 137

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<210> 138

<211> 29

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<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 138

tcagttctcc caccttctgc ttctggcct 29

<210> 139

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 139

gtggttggag catgtggtgt tgggaaaagc 30

<210> 140

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 140

gtggttggag caggtggtgt tgggaaaagc 30

<210> 141

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 141

aaggacgagc aaatgtacct gcaggttgga gcatgtggtg tt 42

<210> 142

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 142

cttttcccaa caccacatgc tccaacctgg tctactatcc acgatttaac 50

<210> 143

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 143

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<210> 144

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 144

ttttcccaac accacctgct ccaacccct 29

<210> 145

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 145

gtggttggag cagatggtgt tgggaaaagc 30

<210> 146

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 146

gtggttggag caggtggtgt tgggaaaagc 30

<210> 147

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 147

aaggacgagc aaatgtacct gcaggttgga gcagatggtg tt 42

<210> 148

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 148

cttttcccaa caccatctgc tccaacctgg tctactatcc acgatttaac 50

<210> 149

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 149

aggggttgga gcaggtggtg t 21

<210> 150

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 150

ttttcccaac accacctgct ccaacccct 29

<210> 151

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 151

tacaaactgg tggtggttgg agcaagtggt 30

<210> 152

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 152

tacaaactgg tggtggttgg agcaggtggt 30

<210> 153

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 153

aaggacgagc aaatgtacct gctcaaactg gtggtggttg ga 42

<210> 154

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 154

cacttgctcc aaccaccacc agtttgaggt ctactatcca cgatttaac 49

<210> 155

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 155

cgatcaaact ggtggtggtt gga 23

<210> 156

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 156

cacctgctcc aaccaccacc agtttgatcg 30

<210> 157

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 157

gtggttggag caggtgatgt tgggaaaagc 30

<210> 158

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 158

gtggttggag caggtggtgt tgggaaaagc 30

<210> 159

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 159

aaggacgagc aaatgtacct gcaggttgga gcaggtgatg tt 42

<210> 160

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 160

cttttcccaa catcacctgc tccaacctgg tctactatcc acgatttaac 50

<210> 161

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 161

aggggttgga gcaggtggtg t 21

<210> 162

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 162

ttttcccaac accacctgct ccaacccct 29

<210> 163

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 163

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<210> 164

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<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 164

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<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 165

aaggacgagc aaatgtacct gcaactggat acagctggac 40

<210> 166

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 166

actcttcatg tccagctgta tccagttggt ctactatcca cgatttaac 49

<210> 167

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 167

tgttaataac tggatacagc tggac 25

<210> 168

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 168

actcttcttg tccagctgta tccagttatt aaca 34

<210> 169

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 169

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<211> 30

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<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 170

atactggata cagctggaca agaagagtac 30

<210> 171

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 171

aaggacgagc aaatgtacct gcaactggat acagctggaa 40

<210> 172

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 172

actcttcttt tccagctgta tccagttggt ctactatcca cgatttaac 49

<210> 173

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<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 173

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<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 174

actcttcttg tccagctgta tccagttatt aaca 34

<210> 175

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 175

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<210> 176

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 176

ggacatactg gatacagctg gacaagaaga 30

<210> 177

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 177

aaggacgagc aaatgtacct gcaacatact ggatacagct 40

<210> 178

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 178

ttctagtcca gctgtatcca gtatgttggt ctactatcca cgatttaac 49

<210> 179

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 179

gttaataaca tactggatac agctg 25

<210> 180

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<212> DNA

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<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 180

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<210> 181

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 181

atactggata cagctggacg agaagagtac 30

<210> 182

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 182

atactggata cagctggaca agaagagtac 30

<210> 183

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<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 183

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<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 184

tactcttctc gtccagctgt atccagttgg tctactatcc acgatttaac 50

<210> 185

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<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 185

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<210> 186

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 186

actcttcttg tccagctgta tccagttatt aacac 35

<210> 187

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 187

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<210> 188

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 188

ctctctgaaa tcactgagca ggagaaagat 30

<210> 189

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 189

aaggacgagc aaatgtacct gcactctaaa atcactgagc a 41

<210> 190

<211> 50

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<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 190

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<210> 191

<211> 21

<212> DNA

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<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 191

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<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

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<210> 193

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 193

agatcctctc tctgaaatca ctaagcagga 30

<210> 194

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 194

agatcctctc tctgaaatca ctgagcagga 30

<210> 195

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 195

aaggacgagc aaatgtacct gcaatcctct ctctgaaatc ac 42

<210> 196

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 196

cctgcttagt gatttcagag agaggattgg tctactatcc acgatttaac 50

<210> 197

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 197

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<210> 198

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 198

ctgctcagtg atttcagaga gaggattatt aa 32

<210> 199

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 199

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<210> 200

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 200

tgatgcacat catggtggct ggacaacaaa 30

<210> 201

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 201

aaggacgagc aaatgtacct gcaatgcact tcatggtggc t 41

<210> 202

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 202

tgttgtccag ccaccatgaa gtgcattggt ctactatcca cgatttaac 49

<210> 203

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 203

tgttaataat gcacatcatg gtggct 26

<210> 204

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 204

tgttgtccag ccaccatgat gtgcattatt aaca 34

<210> 205

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 205

tgatgcacgt catggtggct ggacaacaaa 30

<210> 206

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 206

tgatgcacat catggtggct ggacaacaaa 30

<210> 207

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 207

aaggacgagc aaatgtacct gcaatgcacg tcatggtggc t 41

<210> 208

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 208

tgttgtccag ccaccatgac gtgcattggt ctactatcca cgatttaac 49

<210> 209

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 209

gtgttaataa tgcacatcat ggtggct 27

<210> 210

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 210

tgttgtccag ccaccatgat gtgcattatt aacac 35

<210> 211

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 211

atcgactcca ccgaggtcat ctactagccg 30

<210> 212

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 212

atcgactcca ccgaggtcat ctaccagccg 30

<210> 213

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 213

aaggacgagc aaatgtacct gcacgactcc accgaggtca t 41

<210> 214

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 214

gctggtagat gacctcggtg gagtcgtggt ctactatcca cgatttaac 49

<210> 215

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 215

caccacgact ccaccgaggt cat 23

<210> 216

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 216

gctggtagat gacctcggtg gagtcgtggt g 31

<210> 217

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 217

atcccgggcg actgtggccc cctgctctct 30

<210> 218

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 218

atcccgggcg actgtggccc cccgctctct 30

<210> 219

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 219

aaggacgagc aaatgtacct gcacccgggc gactgtggcc cc 42

<210> 220

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 220

agagcagggg gccacagtcg cccgggtggt ctactatcca cgatttaac 49

<210> 221

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 221

tgttaatacc cgggcgactg tggcccc 27

<210> 222

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 222

agagcggggg gccacagtcg cccgggtatt aaca 34

<210> 223

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 223

aggacctctt ggacatcgag gatgacatca 30

<210> 224

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 224

aggacctctt cgacatcgag gatgacatca 30

<210> 225

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 225

aaggacgagc aaatgtacct gcagacctct tggacatcga g 41

<210> 226

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 226

atgtcatcct cgatgtccaa gaggtctggt ctactatcca cgatttaac 49

<210> 227

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 227

gttaatagac ctcttcgaca tcgag 25

<210> 228

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 228

atgtcatcct cgatgtcgaa gaggtctatt aac 33

<210> 229

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 229

gttgtgaggc actgccccca ccatgagcgc 30

<210> 230

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 230

gttgtgaggc gctgccccca ccatgagcgc 30

<210> 231

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 231

aaggacgagc aaatgtacct gcatgtgagg cactgccccc ac 42

<210> 232

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 232

gctcatggtg ggggcagtgc ctcacatggt ctactatcca cgatttaac 49

<210> 233

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 233

gtcgaggcgc tgcccccacc atg 23

<210> 234

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 234

agcgctcatg gtgggggcag cgcctcgac 29

<210> 235

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 235

actttttgac atagtgtggt ggtgccctat 30

<210> 236

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 236

acttttcgac atagtgtggt ggtgccctat 30

<210> 237

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 237

aaggacgagc aaatgtacct gcatttttga catagtgtgg tg 42

<210> 238

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 238

agggcaccac cacactatgt caaaaatggt ctactatcca cgatttaac 49

<210> 239

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 239

aagacaattt tcgacatagt gtggtg 26

<210> 240

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 240

agggcaccac cacactatgt cgaaaattgt ctt 33

<210> 241

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 241

cgacatagtg tggtggtgcc ctgtgagccg 30

<210> 242

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 242

cgacatagtg tggtggtgcc ctatgagccg 30

<210> 243

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 243

aaggacgagc aaatgtacct gcaacatagt gtggtggtgc cc 42

<210> 244

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 244

gctcacaggg caccaccaca ctatgttggt ctactatcca cgatttaac 49

<210> 245

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 245

tgttaataac atagtgtggt ggtgcc 26

<210> 246

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 246

gctcataggg caccaccaca ctatgttatt aaca 34

<210> 247

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 247

ttcctgcatg ggcggcatga accagaggcc 30

<210> 248

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 248

ttcctgcatg ggcggcatga accggaggcc 30

<210> 249

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 249

aaggacgagc aaatgtacct gcacctgcat gggcggcatg a 41

<210> 250

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 250

cctctggttc atgccgccca tgcaggtggt ctactatcca cgatttaac 49

<210> 251

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 251

gccctgcatg ggcggcatga ac 22

<210> 252

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 252

cctccggttc atgccgccca tgcagggc 28

<210> 253

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 253

atgaactgga ggcccatcct caccatcatc 30

<210> 254

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 254

atgaaccgga ggcccatcct caccatcatc 30

<210> 255

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 255

aaggacgagc aaatgtacct gcagaactgg aggcccatcc t 41

<210> 256

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 256

tgatggtgag gatgggcctc cagttctggt ctactatcca cgatttaac 49

<210> 257

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 257

tgttaataga accggaggcc catcct 26

<210> 258

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 258

tgatggtgag gatgggcctc cggttctatt aaca 34

<210> 259

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 259

acggaacagc tttgaggtgt gtgtttgtgc 30

<210> 260

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 260

acggaacagc tttgaggtgc gtgtttgtgc 30

<210> 261

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 261

aaggacgagc aaatgtacct gcaggaacag ctttgaggtg t 41

<210> 262

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 262

acaaacacac acctcaaagc tgttcctggt ctactatcca cgatttaac 49

<210> 263

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 263

tgttaatagg aacagctttg aggtgc 26

<210> 264

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 264

acaaacacgc acctcaaagc tgttcctatt aaca 34

<210> 265

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 265

aggtgcatgt ttgtgcctgt cctgggagag 30

<210> 266

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 266

aggtgcgtgt ttgtgcctgt cctgggagag 30

<210> 267

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 267

aaggacgagc aaatgtacct gcagtgcatg tttgtgcctg t 41

<210> 268

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 268

ctcccaggac aggcacaaac atgcactggt ctactatcca cgatttaac 49

<210> 269

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 269

agttgtgcgt gtttgtgcct gtc 23

<210> 270

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 270

ctcccaggac aggcacaaac acgcacaact 30

<210> 271

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 271

gggagagact ggcgcacaga ggaagagaat 30

<210> 272

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 272

gggagagacc ggcgcacaga ggaagagaat 30

<210> 273

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 273

aaggacgagc aaatgtacct gcagagagac tggcgcacag a 41

<210> 274

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 274

tctcttcctc tgtgcgccag tctctctggt ctactatcca cgatttaac 49

<210> 275

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 275

gttaatagag agaccggcgc acaga 25

<210> 276

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 276

tctcttcctc tgtgcgccgg tctctctatt aac 33

<210> 277

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 277

gcagtttggc ccgcccaaaa tctgtgatct tgacatgctg cg 42

<210> 278

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 278

cggtgtcagg catgtcaaga tcacagattt tgggcggg 38

<210> 279

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 279

aatctgtgat cttgacatgc ctgacaccg 29

<210> 280

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 280

aagatcacag attttgggct ggccaaactg catctt 36

<210> 281

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 281

aagatgcagt ttggccagcc c 21

<210> 282

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成寡核苷酸

<400> 282

gcagtttggc cagcccaaaa tctgtgatct tgacatgctg cg 42