本發(fā)明的實(shí)施方案大體上涉及核酸分子的復(fù)制和擴(kuò)增的領(lǐng)域。更確切地說，本發(fā)明的某些實(shí)施方案涉及使用滾環(huán)復(fù)制從生物樣品復(fù)制DNA分子。本發(fā)明的其它實(shí)施方案涉及使用滾環(huán)擴(kuò)增從生物樣品擴(kuò)增DNA分子。本發(fā)明的某些實(shí)施方案可以用于表征源自于生物樣品的基因組中的序列變異。本發(fā)明的某些實(shí)施方案可以用于對源自于生物樣品的整個(gè)染色體或其部分進(jìn)行分子計(jì)數(shù)。本發(fā)明的某些實(shí)施方案可以用于表征源自于生物樣品的基因組中的單倍型結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的某些實(shí)施方案可以應(yīng)用于基因組科學(xué)、生物醫(yī)藥研究、診斷測定、以及疫苗和治療劑開發(fā)中的樣品制備和分析。
背景技術(shù)：
：全基因組技術(shù)，如高密度基因分型陣列和下一代測序(NGS)可以鑒定給定的個(gè)體或物種的序列變異，特別是單核苷酸多態(tài)性(SNP)和單核苷酸變體(SNV)，這些在本文被統(tǒng)稱為“序列變體”。然而，當(dāng)前的方法不能確定同一個(gè)DNA分子上那些序列變體的組合。確定序列變體的組合被稱作“定相(phase)”并且同一個(gè)DNA分子上序列變體的特定組合被稱作“單倍型”。舉例來說，人類個(gè)體是二倍體的，每一個(gè)體細(xì)胞含有從每一個(gè)親本遺傳而來的兩組常染色體。表征給定的個(gè)體的單倍型狀態(tài)對于定位疾病基因、闡明群體病史、以及研究順式作用變體和反式作用變體在表型表達(dá)中的平衡來說是重要的。存在三種確定單倍型信息的一般方法：(i)群體推斷；(ii)親本推斷；以及(iii)分子單倍型分析。用于對單倍型進(jìn)行定相的最常見的方法是使用來自從群體基因型或親本基因型獲得的數(shù)據(jù)的推斷和統(tǒng)計(jì)方法。然而，在整個(gè)基因組上的單倍型信息不能使用計(jì)算方法來分辨，特別是當(dāng)給定的染色體區(qū)域的連鎖不平衡較低時(shí)以及對于罕見變體來說。另一方面，親本推斷方法依靠在家庭譜系的背景下序列變異的基因遺傳的原理。雖然在正確執(zhí)行時(shí)是有效的，但是許多生物樣品缺乏足夠的譜系信息或需要適當(dāng)?shù)募易鍢悠穪硗茢嗨P(guān)注的給定樣品的單倍型狀態(tài)。已知多種分子單倍型分析方法克服了基于計(jì)算的方法的限制。這些分子方法包括分離單個(gè)DNA分子或單個(gè)DNA分子的組，然后進(jìn)行基因分型或測序以確定給定生物樣品的單倍型結(jié)構(gòu)的各種策略。一種這樣的策略涉及構(gòu)建大插入序列克隆(即F粘粒(fosmid))文庫。然后將這些克隆在多孔板(即96孔板或384孔板)的單個(gè)孔中稀釋，形成模板文庫，進(jìn)行條形編碼以跟蹤特定克隆到單個(gè)孔，并且通過基因分型或測序方法來表征。對單個(gè)染色體或其部分的單倍型進(jìn)行定相的挑戰(zhàn)減少到對微量滴定板內(nèi)稀釋池中更小的DNA片段(即在尺寸上從幾百兆堿基到數(shù)十千堿基至數(shù)百千堿基)進(jìn)行表征。還已經(jīng)報(bào)道了設(shè)定DNA片段的尺寸或使用基因組DNA而不是形成大插入序列克隆，繼而是稀釋，通過全基因組方法擴(kuò)增，形成模板文庫，并且測序以確定給定的樣品的單倍型。還可以通過流式分選方法或顯微解剖方法分離整個(gè)染色體或其部分，繼而稀釋，通過全基因組方法擴(kuò)增，形成模板文庫，并且進(jìn)行基因分型或測序以確定來自生物樣品的給定基因組的單倍型結(jié)構(gòu)。所有這些方法均需要高水平的技術(shù)專長以及在對給定的生物樣品的單倍型進(jìn)行定相中形成大量的單個(gè)模板文庫(約數(shù)百個(gè))。大多數(shù)的成像系統(tǒng)不能檢測單個(gè)熒光事件，因此不得不對樣品中的DNA分子進(jìn)行擴(kuò)增。目前存在三種下一代測序方法：(i)乳液PCR(emPCR)；(ii)固相擴(kuò)增；以及(iii)基于溶液的滾環(huán)復(fù)制。對于所有這些方法，通常使用標(biāo)準(zhǔn)物理剪切技術(shù)將基因組DNA片段化以形成DNA片段的文庫。存在其中可能不需要片段化的例外。舉例來說，一些生物來源，如從癌癥患者或妊娠的女性獲得的血漿或血清含有通常以小于1,000個(gè)堿基對(bp)并且在一些情況下小于500bp的尺寸存在的循環(huán)無細(xì)胞基因組DNA片段。根據(jù)是否需要尺寸選擇的中間步驟，然后將含有通用引發(fā)位點(diǎn)的銜接子序列連接到DNA片段末端。使用共同PCR引物進(jìn)行有限次數(shù)的PCR循環(huán)。這三種方法在這一步驟上有區(qū)別，但是在所有情況下，這些克隆擴(kuò)增方法限于復(fù)制或擴(kuò)增在尺寸上通常小于1,000bp的小片段，并且在更典型的實(shí)例中，限于700bp或更小。舉例來說，Illumina的固相擴(kuò)增方法最多僅可以擴(kuò)增具有700bp的尺寸的DNA片段。這一尺寸限制制約了從頭組裝人類基因組的能力。當(dāng)前的全基因組技術(shù)，特別是NGS的顯著缺點(diǎn)在于依賴于源自于短模板文庫的序列讀段，這些序列讀段然后以大規(guī)模并行形式被克隆擴(kuò)增。重要的是，當(dāng)前的配對末端文庫構(gòu)建方法在本質(zhì)上會破壞容易地鑒定出在正常人類基因組中存在的并且似乎在許多疾病的產(chǎn)生中特別重要的大的復(fù)雜的結(jié)構(gòu)改變的能力。基因組結(jié)構(gòu)變異可以代表早期腫瘤發(fā)生和癌癥進(jìn)展、疾病易感性、以及治療抗性中的驅(qū)動力。源自于短模板文庫的序列讀段使得非常難以經(jīng)由從頭組裝來完全分辨新型的、重復(fù)的以及疾病改變的序列。因而，大多數(shù)的全基因組測序工作仍依靠于將序列讀段與參考基因組進(jìn)行比對。因此，NGS數(shù)據(jù)集可能含有仍未表征的大段的人類基因組序列，并且對疾病機(jī)制的了解可能因缺乏基因組結(jié)構(gòu)信息而有偏差。大多數(shù)的全基因組測序工作仍依賴于將序列讀段與參考基因組進(jìn)行比對。雖然比對實(shí)驗(yàn)可以捕捉大部分的序列變體，但是需要約10kb至100kb的大模板來分辨大部分的結(jié)構(gòu)變體和/或提供在整個(gè)人類基因組上單倍型的定相。許多分子生物學(xué)和計(jì)算機(jī)軟件技術(shù)已經(jīng)被用于克服尺寸限制。盡管獲得了一定的改進(jìn)，但是缺點(diǎn)是生物學(xué)工作流程的復(fù)雜性以及與試劑、勞動力、以及計(jì)算機(jī)硬件相關(guān)的成本顯著增加。通過將線性核酸片段的末端連接而形成DNA環(huán)是一種非常低效的方法，這需要顯著量的來自生物樣品的起始物質(zhì)。與通過使給定的DNA片段的遠(yuǎn)端彼此靠近而形成環(huán)相關(guān)的問題從20世紀(jì)80年代起就已經(jīng)是本領(lǐng)域公認(rèn)的。舉例來說，與通過使DNA片段的末端連接在一起以形成環(huán)相關(guān)的一個(gè)問題是“分子內(nèi)”連接事件(即同一個(gè)DNA片段的DNA環(huán))與“分子間”連接事件(即被稱作多聯(lián)體的兩個(gè)或更多個(gè)DNA片段的連接)之間的競爭反應(yīng)。與通過將DNA片段的末端連接在一起以形成環(huán)相關(guān)的另一個(gè)問題是相較于更小的DNA片段，必須將更大的DNA片段進(jìn)一步稀釋以達(dá)到形成分子內(nèi)環(huán)的合理的效率。本領(lǐng)域需要將形成大DNA環(huán)(即用于桑格測序(Sangersequencing)的5kb至7kb或更大的大插入序列克隆)與下一代測序方法的高通量復(fù)制或擴(kuò)增性質(zhì)相結(jié)合的創(chuàng)新方法。本發(fā)明的某些實(shí)施方案通過以非尺寸依賴性方式形成DNA環(huán)而克服了從大DNA片段形成DNA環(huán)的尺寸限制。本發(fā)明的其它實(shí)施方案通過摻入非尺寸依賴性DNA環(huán)，通過形成和復(fù)制或擴(kuò)增可用于許多基因組科學(xué)應(yīng)用的大插入序列模板來克服直接擴(kuò)增>1千堿基的模板的尺寸限制。本發(fā)明還通過提供更簡單的使用啞鈴狀環(huán)制備大插入序列模板的工作流程以及改良的用于滾環(huán)復(fù)制和滾環(huán)擴(kuò)增以形成用于測序應(yīng)用的多個(gè)拷貝的方法來克服當(dāng)前方法的研究人員工作的復(fù)雜性和相關(guān)的更高的成本。本發(fā)明的某些實(shí)施方案還通過提供更簡單的用于制備依賴于通用引物序列的模板的工作流程來克服需要單獨(dú)的等位基因鑒別引物以用于一組不同的異源核酸序列的基因分型和測序應(yīng)用的限制。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是一種復(fù)制至少一個(gè)DNA分子的方法。所述方法包括以下步驟：將至少一個(gè)DNA分子片段化以形成至少一個(gè)片段化的DNA分子；使一個(gè)或多個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)連接到所述至少一個(gè)片段化的DNA分子的每一個(gè)末端以形成至少一個(gè)啞鈴狀模板；使所述至少一個(gè)啞鈴狀模板與至少一種基本上互補(bǔ)的引物接觸，其中所述至少一種基本上互補(bǔ)的引物與至少一種基質(zhì)連接；以及在與所述至少一種基本上互補(bǔ)的引物接觸的所述至少一個(gè)啞鈴狀模板上進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制以形成至少一個(gè)復(fù)制的啞鈴狀模板。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是一種復(fù)制至少一個(gè)DNA分子的方法。所述方法包括以下步驟：將至少一個(gè)DNA分子片段化以形成至少一個(gè)片段化的DNA分子；使一個(gè)或多個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)連接到所述至少一個(gè)片段化的DNA分子的每一個(gè)末端以形成至少一個(gè)啞鈴狀模板；通過用核酸外切酶處理任何未連接的發(fā)夾結(jié)構(gòu)和任何未連接的片段化的核酸分子來將所述至少一個(gè)啞鈴狀模板純化；使所述至少一個(gè)啞鈴狀模板與至少一種基本上互補(bǔ)的引物接觸，其中所述至少一種基本上互補(bǔ)的引物與至少一種基質(zhì)連接；以及在與所述至少一種基本上互補(bǔ)的引物接觸的所述至少一個(gè)啞鈴狀模板上進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制以形成至少一個(gè)復(fù)制的啞鈴狀模板。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是一種擴(kuò)增至少一個(gè)DNA分子的方法。所述方法包括以下步驟：將至少一個(gè)DNA分子片段化以形成至少一個(gè)片段化的DNA分子；使一個(gè)或多個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)連接到所述至少一個(gè)片段化的DNA分子的每一個(gè)末端以形成至少一個(gè)啞鈴狀模板；使所述至少一個(gè)啞鈴狀模板與至少一種基本上互補(bǔ)的引物接觸，其中所述至少一種基本上互補(bǔ)的引物與至少一種基質(zhì)連接；以及在與所述至少一種基本上互補(bǔ)的引物接觸的所述至少一個(gè)啞鈴狀模板上進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增以形成至少一個(gè)復(fù)制的啞鈴狀模板。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是一種檢測至少一個(gè)復(fù)制的啞鈴狀模板的方法。所述方法包括以下步驟：將至少一個(gè)DNA分子片段化以形成至少一個(gè)片段化的DNA分子；使一個(gè)或多個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)連接到所述至少一個(gè)片段化的DNA分子的每一個(gè)末端以形成至少一個(gè)啞鈴狀模板；使所述至少一個(gè)啞鈴狀模板與至少一種基本上互補(bǔ)的引物接觸，其中所述至少一種基本上互補(bǔ)的引物與至少一種基質(zhì)連接；在與所述至少一種基本上互補(bǔ)的引物接觸的所述至少一個(gè)啞鈴狀模板上進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制以形成至少一個(gè)復(fù)制的啞鈴狀模板；以及檢測所述至少一個(gè)復(fù)制的啞鈴狀模板。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述檢測所述至少一個(gè)復(fù)制的啞鈴狀模板的步驟由對所述至少一個(gè)復(fù)制的啞鈴狀模板進(jìn)行測序組成。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是一種檢測至少一個(gè)復(fù)制的啞鈴狀模板的方法。所述方法包括以下步驟：將至少一個(gè)DNA分子片段化以形成至少一個(gè)片段化的DNA分子；使一個(gè)或多個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)連接到所述至少一個(gè)片段化的DNA分子的每一個(gè)末端以形成至少一個(gè)啞鈴狀模板；通過用核酸外切酶處理任何未連接的發(fā)夾結(jié)構(gòu)和任何未連接的片段化的核酸分子來將所述至少一個(gè)啞鈴狀模板純化；使所述至少一個(gè)啞鈴狀模板與至少一種基本上互補(bǔ)的引物接觸，其中所述至少一種基本上互補(bǔ)的引物與至少一種基質(zhì)連接；在與所述至少一種基本上互補(bǔ)的引物接觸的所述至少一個(gè)啞鈴狀模板上進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制以形成至少一個(gè)復(fù)制的啞鈴狀模板；以及檢測所述至少一個(gè)復(fù)制的啞鈴狀模板。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述檢測所述至少一個(gè)復(fù)制的啞鈴狀模板的步驟由對所述至少一個(gè)復(fù)制的啞鈴狀模板進(jìn)行測序組成。在某些實(shí)施方案中，所述檢測所述至少一個(gè)復(fù)制的啞鈴狀模板的步驟包括使所述至少一個(gè)復(fù)制的啞鈴狀模板與寡核苷酸探針接觸。在某些實(shí)施方案中，所述寡核苷酸探針是標(biāo)記的寡核苷酸探針。在某些實(shí)施方案中，所述寡核苷酸探針是標(biāo)記的DNA探針。在某些實(shí)施方案中，所述寡核苷酸探針與熒光團(tuán)連接。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是一種檢測至少一個(gè)擴(kuò)增的DNA分子的方法。所述方法包括以下步驟：將至少一個(gè)DNA分子片段化以形成至少一個(gè)片段化的DNA分子；使一個(gè)或多個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)連接到所述至少一個(gè)片段化的DNA分子的每一個(gè)末端以形成至少一個(gè)啞鈴狀模板；使所述至少一個(gè)啞鈴狀模板與至少一種基本上互補(bǔ)的引物接觸，其中所述至少一種基本上互補(bǔ)的引物與至少一種基質(zhì)連接；在與所述至少一種基本上互補(bǔ)的引物接觸的所述至少一個(gè)啞鈴狀模板上進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增以形成至少一個(gè)擴(kuò)增的DNA分子；以及檢測所述至少一個(gè)擴(kuò)增的DNA分子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述檢測所述至少一個(gè)擴(kuò)增的DNA分子的步驟由對所述至少一個(gè)擴(kuò)增的DNA分子進(jìn)行測序組成。在某些實(shí)施方案中，所述檢測所述至少一個(gè)擴(kuò)增的啞鈴狀模板的步驟包括使所述至少一個(gè)擴(kuò)增的啞鈴狀模板與寡核苷酸探針接觸。在某些實(shí)施方案中，所述寡核苷酸探針是標(biāo)記的寡核苷酸探針。在某些實(shí)施方案中，所述寡核苷酸探針是標(biāo)記的DNA探針。在某些實(shí)施方案中，所述寡核苷酸探針與熒光團(tuán)連接。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是一種復(fù)制至少一個(gè)DNA分子的方法。所述方法包括以下步驟：從樣品中分離至少一個(gè)DNA分子；將至少一個(gè)DNA分子片段化以形成至少一個(gè)片段化的DNA分子；使一個(gè)或多個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)連接到所述至少一個(gè)片段化的DNA分子的每一個(gè)末端以形成至少一個(gè)啞鈴狀模板；使所述至少一個(gè)啞鈴狀模板與至少一種基本上互補(bǔ)的引物接觸，其中所述至少一種基本上互補(bǔ)的引物與至少一種基質(zhì)連接；以及在與所述至少一種基本上互補(bǔ)的引物接觸的所述至少一個(gè)啞鈴狀模板上進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制以形成至少一個(gè)復(fù)制的啞鈴狀模板。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是一種擴(kuò)增至少一個(gè)DNA分子的方法。所述方法包括以下步驟：從樣品中分離至少一個(gè)DNA分子；將至少一個(gè)DNA分子片段化以形成至少一個(gè)片段化的DNA分子；使一個(gè)或多個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)連接到所述至少一個(gè)片段化的DNA分子的每一個(gè)末端以形成至少一個(gè)啞鈴狀模板；使所述至少一個(gè)啞鈴狀模板與至少一種基本上互補(bǔ)的引物接觸，其中所述至少一種基本上互補(bǔ)的引物與至少一種基質(zhì)連接；以及在與所述至少一種基本上互補(bǔ)的引物接觸的所述至少一個(gè)啞鈴狀模板上進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增以形成至少一個(gè)擴(kuò)增的DNA分子。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是一種復(fù)制至少一個(gè)DNA分子的方法。所述方法包括以下步驟：從樣品中分離至少一個(gè)DNA分子；使一個(gè)或多個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)連接到所述至少一個(gè)DNA分子的每一個(gè)末端以形成至少一個(gè)啞鈴狀模板；使所述至少一個(gè)啞鈴狀模板與至少一種基本上互補(bǔ)的引物接觸，其中所述至少一種基本上互補(bǔ)的引物與至少一種基質(zhì)連接；以及在與所述至少一種基本上互補(bǔ)的引物接觸的所述至少一個(gè)啞鈴狀模板上進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制以形成至少一個(gè)復(fù)制的啞鈴狀模板。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是一種擴(kuò)增至少一個(gè)DNA分子的方法。所述方法包括以下步驟：從樣品中分離至少一個(gè)DNA分子；使一個(gè)或多個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)連接到所述至少一個(gè)DNA分子的每一個(gè)末端以形成至少一個(gè)啞鈴狀模板；使所述至少一個(gè)啞鈴狀模板與至少一種基本上互補(bǔ)的引物接觸，其中所述至少一種基本上互補(bǔ)的引物與至少一種基質(zhì)連接；以及在與所述至少一種基本上互補(bǔ)的引物接觸的所述至少一個(gè)啞鈴狀模板上進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增以形成至少一個(gè)擴(kuò)增的DNA分子。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是一種檢測至少一個(gè)擴(kuò)增的啞鈴狀模板的方法。所述方法包括將至少一個(gè)核酸分子片段化以形成至少一個(gè)片段化的核酸分子；使一個(gè)或多個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)連接到所述至少一個(gè)片段化的核酸分子的每一個(gè)末端以形成至少一個(gè)啞鈴狀模板；通過用核酸外切酶處理任何未連接的發(fā)夾結(jié)構(gòu)和任何未連接的片段化的核酸分子來將所述至少一個(gè)啞鈴狀模板純化；使所述至少一個(gè)啞鈴狀模板與至少兩種基本上互補(bǔ)的引物接觸，其中所述至少一種基本上互補(bǔ)的引物與至少一種基質(zhì)連接；在與所述至少一種基本上互補(bǔ)的引物接觸的所述至少一個(gè)啞鈴狀模板上進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增以形成至少一個(gè)擴(kuò)增的啞鈴狀模板；以及檢測所述至少一個(gè)擴(kuò)增的啞鈴狀模板。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是一種擴(kuò)增至少一個(gè)核酸分子的方法。所述方法包括從樣品中分離至少一個(gè)核酸分子；使一個(gè)或多個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)連接到所述至少一個(gè)核酸分子的每一個(gè)末端以形成至少一個(gè)啞鈴狀模板；通過用核酸外切酶處理任何未連接的發(fā)夾結(jié)構(gòu)和任何未連接的片段化的核酸分子來將所述至少一個(gè)啞鈴狀模板純化；使所述至少一個(gè)啞鈴狀模板與至少兩種基本上互補(bǔ)的引物接觸，其中所述至少一種基本上互補(bǔ)的引物與至少一種基質(zhì)連接；以及在與所述至少一種基本上互補(bǔ)的引物接觸的所述至少一個(gè)啞鈴狀模板上進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增以形成至少一個(gè)擴(kuò)增的啞鈴狀模板。本發(fā)明的實(shí)施方案還包括一種試劑盒，所述試劑盒含有能夠形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的至少一種寡核苷酸；連接酶，用于使所述發(fā)夾結(jié)構(gòu)連接到來自樣品的至少一個(gè)核酸分子以形成至少一個(gè)啞鈴狀模板；核酸外切酶，用于通過消化任何未連接的發(fā)夾結(jié)構(gòu)和任何未連接的核酸分子來將所述至少一個(gè)啞鈴狀模板純化；以及聚合酶和與所述至少一個(gè)啞鈴狀模板的區(qū)域基本上互補(bǔ)的至少一種引物，用于復(fù)制所述至少一個(gè)啞鈴狀模板以形成至少一個(gè)復(fù)制的啞鈴狀模板。本發(fā)明的某些實(shí)施方案包括一種試劑盒，所述試劑盒含有能夠形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的至少一種寡核苷酸；連接酶，用于使所述發(fā)夾結(jié)構(gòu)連接到來自樣品的至少一個(gè)核酸分子以形成至少一個(gè)啞鈴狀模板；核酸外切酶，用于通過消化任何未連接的發(fā)夾結(jié)構(gòu)和任何未連接的核酸分子來將所述至少一個(gè)啞鈴狀模板純化；以及復(fù)制體和與所述至少一個(gè)啞鈴狀模板的區(qū)域基本上互補(bǔ)的至少一種引物，用于復(fù)制所述至少一個(gè)啞鈴狀模板以形成至少一個(gè)復(fù)制的啞鈴狀模板。本發(fā)明的某些實(shí)施方案包括一種試劑盒，所述試劑盒含有能夠形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的至少一種寡核苷酸；連接酶，用于使所述發(fā)夾結(jié)構(gòu)連接到來自樣品的至少一個(gè)核酸分子以形成至少一個(gè)啞鈴狀模板；核酸外切酶，用于通過消化任何未連接的發(fā)夾結(jié)構(gòu)和任何未連接的核酸分子來將所述至少一個(gè)啞鈴狀模板純化；以及聚合酶和與所述至少一個(gè)啞鈴狀模板的至少兩個(gè)區(qū)域基本上互補(bǔ)的至少兩種引物，用于擴(kuò)增所述至少一個(gè)啞鈴狀模板以形成至少一個(gè)擴(kuò)增的啞鈴狀模板。本發(fā)明的某些實(shí)施方案包括一種試劑盒，所述試劑盒含有能夠形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的至少一種寡核苷酸；連接酶，用于使所述發(fā)夾結(jié)構(gòu)連接到來自樣品的至少一個(gè)核酸分子以形成至少一個(gè)啞鈴狀模板；核酸外切酶，用于通過消化任何未連接的發(fā)夾結(jié)構(gòu)和任何未連接的核酸分子來將所述至少一個(gè)啞鈴狀模板純化；以及復(fù)制體和與所述至少一個(gè)啞鈴狀模板的至少兩個(gè)區(qū)域基本上互補(bǔ)的至少兩種引物，用于擴(kuò)增所述至少一個(gè)啞鈴狀模板以形成至少一個(gè)擴(kuò)增的啞鈴狀模板。附圖說明為了可以更詳細(xì)地了解本發(fā)明的特征和益處以及將變得顯而易見的其它特征和益處，可以通過參考本發(fā)明的示于附圖中的實(shí)施方案來更具體描述本發(fā)明的實(shí)施方案，所述附圖形成本說明書的一部分。然而，還應(yīng)當(dāng)指出的是，所述附圖僅圖示了本發(fā)明的各種實(shí)施方案并且因此不被認(rèn)為是限制了本發(fā)明的范圍，這是因?yàn)楸景l(fā)明也可以包括其它有效的實(shí)施方案。圖1是根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的啞鈴狀模板的滾環(huán)復(fù)制的示例性方法的示意圖。圖2是根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案由啞鈴狀模板產(chǎn)生的滾環(huán)產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠分析的圖像。圖3是根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的啞鈴狀模板的滾環(huán)復(fù)制的示例性方法的示意圖。圖4是根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案所產(chǎn)生的啞鈴狀模板和它們的滾環(huán)產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠分析的圖像。圖5是根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案所產(chǎn)生的啞鈴狀模板和它們的滾環(huán)產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠分析的圖像。圖6是根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案所產(chǎn)生的啞鈴狀模板的瓊脂糖凝膠分析的圖像。圖7是根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案所產(chǎn)生的啞鈴狀模板的瓊脂糖凝膠分析的圖像。圖8是根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案所產(chǎn)生的滾環(huán)產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠分析的圖像。圖9是根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案所產(chǎn)生的滾環(huán)產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠分析的圖像。圖10是顯示根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案通過熒光檢測發(fā)夾結(jié)構(gòu)的圖表。圖11A和11B是根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方案的示例性裝置的圖像。具體實(shí)施方式在詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施方案之前，將對在本發(fā)明的實(shí)施方案的上下文中所使用的多個(gè)術(shù)語進(jìn)行定義。除了這些術(shù)語之外，還根據(jù)需要在說明書的其它地方定義其它術(shù)語。除非本文另外明確定義，否則本說明書中所用的技術(shù)術(shù)語將具有它們的本領(lǐng)域認(rèn)可的含義。為了更容易地促進(jìn)對本發(fā)明的理解，鑒于各種術(shù)語的常見用法和以下提供的明確定義，本文使用的術(shù)語的含義將根據(jù)本說明書的上下文而變得顯而易見。如本文所用的術(shù)語“包含(comprise/comprising)”、“含有(contain/containing)”、“包括(include/including)”以及“諸如”是以它們的開放性的、非限制性的意義使用的?！皵U(kuò)增的啞鈴狀模板”意指由于滾環(huán)擴(kuò)增而產(chǎn)生多個(gè)拷貝靶序列的含有一個(gè)或多個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)的一個(gè)核酸分子?！敖佑|”意指通過任何方式引入物質(zhì)以促進(jìn)與另一物質(zhì)的相互作用的過程。舉例來說而不限于，可以使啞鈴狀模板與一種或多種基本上互補(bǔ)的引物接觸以促進(jìn)一個(gè)或多個(gè)雜交過程以形成能夠參與滾環(huán)復(fù)制或滾環(huán)擴(kuò)增的一個(gè)或多個(gè)雙鏈雙鏈體區(qū)?！皺z測核酸分子”意指使用可以確定所關(guān)注的核酸的存在或可以確定關(guān)于核酸序列的更詳細(xì)的信息、在與參考序列相比較時(shí)核酸序列的改變、或核酸序列的一個(gè)或多個(gè)拷貝的存在或不存在的分析方法?！皢♀彔钅０濉币庵妇哂幸粋€(gè)或多個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)的在結(jié)構(gòu)上呈線性并且在拓?fù)渖铣虱h(huán)狀的體外復(fù)制型或體外擴(kuò)增型核酸分子。當(dāng)變性或基本上變性時(shí)，啞鈴狀模板以環(huán)狀單鏈核酸分子的形式存在。啞鈴狀模板不同于體內(nèi)復(fù)制型環(huán)狀雙鏈DNA，例如而不限于質(zhì)粒、粘粒、F粘粒、細(xì)菌人工染色體、以及酵母人工染色體，它們是借助于克隆載體技術(shù)形成的。不同于在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中獨(dú)立復(fù)制的這些環(huán)狀雙鏈DNA，啞鈴狀模板不需要在這樣的宿主細(xì)胞中繁殖復(fù)制?！捌位暮怂岱肿拥哪┒恕币庵改軌蚧虼皇沟媚軌騾⑴c連接反應(yīng)的一個(gè)或多個(gè)末端核苷酸殘基。在某些實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)核酸分子可以含有能夠或待被使得能夠進(jìn)行連接反應(yīng)以使一個(gè)或多個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)連接到所述核酸分子的每一個(gè)末端的功能性末端。舉例來說而不限于，5'末端的末端核苷酸含有磷酸酯基并且3'末端的末端核苷酸含有羥基。“片段化的核酸分子”意指由片段化過程變成任意更小的核酸分子的任何更大的核酸分子?！捌位币庵甘褂没瘜W(xué)劑或生化劑以非序列依賴性方式(即隨機(jī))或以序列特異性方式使核酸分子斷裂。舉例來說，可以通過以下方法將核酸隨機(jī)地片段化：使用DNA酶I、核酸內(nèi)切酶V、或轉(zhuǎn)座酶的酶法；使用物理方法，如剪切、超聲處理、或霧化，其中后者使核酸溶液通過小孔；或使用機(jī)械力，例如而不限于聲學(xué)方法，特別是自適應(yīng)聚焦聲學(xué)方法?？梢酝ㄟ^PCR，使用隨機(jī)引物來制備隨機(jī)的核酸片段。還可以通過序列特異性方法，例如而不限于，使用限制性核酸內(nèi)切酶和多重PCR將核酸片段化。由一個(gè)或多個(gè)更大的核酸分子的片段化過程產(chǎn)生的片段的集合被稱作文庫。“發(fā)夾結(jié)構(gòu)”意指一種核酸分子，所述核酸分子內(nèi)的兩個(gè)或更多個(gè)部分序列彼此互補(bǔ)或基本上互補(bǔ)，從而引起部分雙鏈區(qū)域和一個(gè)或多個(gè)內(nèi)部單鏈區(qū)域的形成。所述發(fā)夾結(jié)構(gòu)還可以含有兩個(gè)或更多個(gè)核酸分子，所述兩個(gè)或更多個(gè)核酸分子由接頭連接在一起并且所述兩個(gè)或更多個(gè)核酸分子的兩個(gè)或更多個(gè)部分序列彼此互補(bǔ)或基本上互補(bǔ)，從而引起部分雙鏈區(qū)域和一個(gè)或多個(gè)內(nèi)部單鏈區(qū)域的形成?！胺蛛x核酸分子”意指從樣品中獲得核酸分子的過程?！斑B接劑”意指使兩個(gè)或更多個(gè)核酸分子共價(jià)連接，這是通過酶劑，例如而不限于DNA連接酶或RNA連接酶；或化學(xué)劑，例如而不限于使用水溶性碳二亞胺或溴化氰進(jìn)行的縮合反應(yīng)以及與自動化DNA合成技術(shù)相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)操作而實(shí)現(xiàn)的，從而產(chǎn)生天然核酸骨架結(jié)構(gòu)、修飾的核酸骨架結(jié)構(gòu)、以及它們這兩種骨架結(jié)構(gòu)的組合。天然的核酸骨架結(jié)構(gòu)例如而不限于由核苷酸殘基之間的一個(gè)或多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)磷酸二酯鍵組成。修飾的核酸骨架結(jié)構(gòu)例如而不限于由一個(gè)或多個(gè)修飾的磷酸二酯鍵組成，所述修飾的磷酸二酯鍵諸如非橋氧原子被氮原子(即氨基磷酸酯鍵)或硫原子(即硫代磷酸酯鍵)取代、橋氧原子被硫原子取代(即硫代磷酸酯)、磷酸二酯鍵被肽鍵取代(即肽核酸或PNA)、或形成一個(gè)或多個(gè)另外的共價(jià)鍵(即鎖核酸或LNA)，所述鎖核酸在核糖的2'-氧與4'-碳之間具有另外的鍵。修飾的鍵可以均是一種類型的修飾或可以是兩種或更多種修飾類型的任何組合并且進(jìn)一步可以包含一個(gè)或多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)磷酸二酯鍵?！敖宇^”意指充當(dāng)兩個(gè)其它核酸分子之間的共價(jià)鍵合的分子橋的一個(gè)或多個(gè)二價(jià)基團(tuán)(連接成員)。接頭可以含有一個(gè)或多個(gè)連接成員和一種或多種類型的連接成員。示例性連接成員包括：-C(O)NH-、-C(O)O-、-NH-、-S-、-S(O)n-(其中n是0、1或2)、-O-、-OP(O)(OH)O-、-OP(O)(O-)O-、烷二基、烯二基、炔二基、芳二基、雜芳二基或其組合。一些接頭具有側(cè)鏈或側(cè)鏈官能團(tuán)(或這兩者)。側(cè)鏈部分可以是親水性改性劑(即提高接頭的水溶性的化學(xué)基團(tuán))，例如而不限于增溶基團(tuán)，如-SO3H、-SO3-、CO2H或CO2-。“核酸分子”意指包括標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范堿基、高度修飾堿基、非天然堿基、或它們這些堿基的任何組合的任何單鏈或雙鏈核酸分子。舉例來說而不限于，核酸分子含有四種規(guī)范DNA堿基，即腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、以及胸腺嘧啶；或四種規(guī)范RNA堿基，即腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、以及尿嘧啶。當(dāng)核苷含有2'-脫氧核糖基時(shí)，尿嘧啶可以取代胸腺嘧啶。核酸分子可以從RNA轉(zhuǎn)化成DNA以及從DNA轉(zhuǎn)化成RNA。舉例來說而不限于，可以使用逆轉(zhuǎn)錄酶使mRNA形成互補(bǔ)DNA(cDNA)，并且可以使用RNA聚合酶使DNA形成RNA。核酸分子還可以含有一個(gè)或多個(gè)高度修飾堿基，例如而不限于5-羥甲基尿嘧啶、5-羥尿嘧啶、α-腐胺基胸腺嘧啶、5-羥甲基胞嘧啶、5-羥基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N4-甲基胞嘧啶、2-氨基腺嘌呤、α-氨基甲?；谆汆堰?、N6-甲基腺嘌呤、肌苷、黃嘌呤、次黃嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、以及N7-甲基鳥嘌呤。核酸分子還可以含有一個(gè)或多個(gè)非天然堿基，例如而不限于7-脫氮-7-羥甲基腺嘌呤、7-脫氮-7-羥甲基鳥嘌呤、異胞嘧啶(isoC)、5-甲基異胞嘧啶、以及異鳥嘌呤(isoG)。僅含有規(guī)范堿基、高度修飾堿基、非天然堿基、或它們這些堿基的任何組合的核酸分子還可以含有例如而不限于其中核苷酸殘基之間的每一個(gè)鍵可以由標(biāo)準(zhǔn)磷酸二酯鍵組成，并且此外，可以含有一個(gè)或多個(gè)修飾的鍵，例如而不限于非橋氧原子被氮原子取代(即氨基磷酸酯鍵)、被硫原子取代(即硫代磷酸酯鍵)、或被烷基或芳基取代(即烷基膦酸酯或芳基膦酸酯)；橋氧原子被硫原子取代(即硫代磷酸酯)；磷酸二酯鍵被肽鍵取代(即肽核酸或PNA)；或形成一個(gè)或多個(gè)另外的共價(jià)鍵(即鎖核酸或LNA)，所述鎖核酸在核糖的2'-氧與4'-碳之間具有另外的鍵。術(shù)語“2'-脫氧核糖核酸分子”的意思與術(shù)語“核酸分子”相同，限制是2'-脫氧核糖基的2'-碳原子含有至少一個(gè)氫原子。術(shù)語“核糖核酸分子”的意思與術(shù)語“核酸分子”相同，限制是核糖基的2'-碳原子含有至少一個(gè)羥基?！昂怂嵝蛄小币庵负怂岱肿又写嬖诘囊?guī)范堿基、高度修飾堿基、非天然堿基、或它們這些堿基的任何組合的順序?！斑M(jìn)行”意指提供使得化學(xué)反應(yīng)或生化反應(yīng)能夠進(jìn)行以獲得所期望的產(chǎn)物的所有必要的組分、試劑、以及條件?！凹兓币庵笍慕o定混合物的所期望的組分分離基本上所有不希望有的組分。舉例來說而不限于，純化啞鈴狀模板指的是去除沒有成功連接以形成任何給定尺寸范圍的啞鈴狀模板的不希望有的核酸分子的方法?！皬?fù)制的啞鈴狀模板”意指由于滾環(huán)復(fù)制而產(chǎn)生靶序列的多個(gè)拷貝的含有一個(gè)或多個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)的一個(gè)核酸分子?！皾L環(huán)擴(kuò)增”或“RCA”意指使用兩種或更多種引物進(jìn)行的生化過程，其中除原始的啞鈴狀模板之外，拷貝的核酸分子也在后續(xù)數(shù)輪的擴(kuò)增中用作模板，以制備起始核酸分子的更多拷貝?！皾L環(huán)復(fù)制”或“RCR”意指使用一種或多種引物進(jìn)行的生化過程，其中拷貝的核酸分子在后續(xù)數(shù)輪的復(fù)制中不用作模板，以制備起始核酸分子的更多拷貝。在某些實(shí)施方案中，當(dāng)啞鈴狀模板是正鏈時(shí)，滾環(huán)復(fù)制產(chǎn)生負(fù)鏈的更多拷貝。在某些實(shí)施方案中，當(dāng)啞鈴狀模板是負(fù)鏈時(shí)，滾環(huán)復(fù)制產(chǎn)生正鏈的更多拷貝。如本文所用的復(fù)制不同于擴(kuò)增，所述擴(kuò)增在后續(xù)數(shù)輪的擴(kuò)增中利用拷貝的核酸以制備起始核酸分子的更多拷貝?！皹悠贰币庵笍暮兴P(guān)注的核酸分子的生物樣品或合成產(chǎn)生的來源中獲得的材料。在某些實(shí)施方案中，樣品是含有數(shù)據(jù)或信息被尋求的所期望的核酸的生物材料。樣品可以包括疑似含有靶核酸分子的至少一個(gè)細(xì)胞、胎兒細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物、組織標(biāo)本、血液、血清、血漿、唾液、尿液、淚液、陰道分泌物、汗液、淋巴液、腦脊髓液、粘膜分泌物、腹膜液、腹水、糞便物、身體滲出物、臍帶血、絨毛膜絨毛、羊水、胚胎組織、多細(xì)胞胚胎、裂解物、提取物、溶液、或反應(yīng)混合物。樣品還可以包括非人類來源，如非人類靈長類動物、嚙齒類動物以及其它哺乳動物、病原物種，包括病毒、細(xì)菌、以及真菌。在某些實(shí)施方案中，樣品還可以包括來自環(huán)境來源的分離物，以用于檢測人類和非人類物種以及血液、水、空氣、土壤、食物中的病原物種，以及用于在沒有任何先驗(yàn)知識的情況下鑒定樣品中的所有生物體。在某些實(shí)施方案中，樣品可以含有被降解的核酸分子。核酸分子可以具有切口、斷裂或修飾，它們是由暴露于物理力，如剪切力；惡劣環(huán)境，如熱或紫外光；化學(xué)降解過程，如可以用于臨床分析或法醫(yī)分析的化學(xué)降解過程；由于微生物或老化所引起的生物降解過程；純化或分離技術(shù)；或其組合所產(chǎn)生的?！皽y序”意指可以鑒定出來自復(fù)制的啞鈴狀模板或擴(kuò)增的啞鈴狀模板的核苷酸的順序的任何生化方法?！盎旧匣パa(bǔ)的引物”意指與另一核酸分子形成穩(wěn)定的雙鏈雙鏈體的核酸分子，盡管所述雙鏈體區(qū)內(nèi)的核酸序列的一個(gè)或多個(gè)堿基不與所述另一核酸序列堿基配對。單鏈核酸分子和雙鏈核酸分子的基本結(jié)構(gòu)是由堿基對相互作用決定的。舉例來說，兩條相反鏈上互補(bǔ)的或基本上互補(bǔ)的核苷酸之間堿基對的形成將使得這兩條鏈彼此纏繞形成雙螺旋結(jié)構(gòu)。這被稱作兩條或更多條核酸分子鏈的互補(bǔ)核苷酸的分子間堿基配對。術(shù)語“核苷酸”在本發(fā)明中被廣義地定義為由糖、堿基以及一個(gè)或多個(gè)磷酸酯基組成的單元，對于它來說，所述糖例如而不限于由以下各項(xiàng)組成：核糖、具有與核糖基的一個(gè)或多個(gè)原子連接的另外的化學(xué)基團(tuán)的修飾的核糖、2'-脫氧核糖、或具有與2'-脫氧核糖基的一個(gè)或多個(gè)原子連接的另外的化學(xué)基團(tuán)的修飾的2'-脫氧核糖；并且對于它來說，所述堿基例如而不限于由規(guī)范堿基、高度修飾堿基、或非天然堿基組成，如上述核酸分子定義中所述?；パa(bǔ)的核苷酸或基本上互補(bǔ)的核苷酸的堿基配對也可以在同一個(gè)DNA鏈分子上發(fā)生，這被稱作互補(bǔ)的核苷酸或基本上互補(bǔ)的核苷酸的分子內(nèi)堿基配對。發(fā)夾結(jié)構(gòu)可以由給定核酸分子的互補(bǔ)的核苷酸或基本上互補(bǔ)的核苷酸的分子內(nèi)堿基配對形成，這可以形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)。發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖部分是由互補(bǔ)的核苷酸或基本上互補(bǔ)的核苷酸序列雜交以形成雙鏈段而形成的。發(fā)夾結(jié)構(gòu)的環(huán)區(qū)是核苷酸序列的未配對段的結(jié)果。發(fā)夾結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性取決于莖區(qū)的長度、核酸序列組成、以及堿基對互補(bǔ)或基本上互補(bǔ)的程度。舉例來說，一段五個(gè)互補(bǔ)的核苷酸可以被認(rèn)為比一段三個(gè)互補(bǔ)的核苷酸要更穩(wěn)定，或一段主要由鳥嘌呤和胞嘧啶構(gòu)成的互補(bǔ)核苷酸可以被認(rèn)為比一段主要由腺嘌呤和胸腺嘧啶(DNA)或尿嘧啶(RNA)構(gòu)成的互補(bǔ)核苷酸要更穩(wěn)定?？梢杂眯揎椀暮塑账崛〈愿淖冞@些天然堿基的雙鏈莖區(qū)的穩(wěn)定性，所述修飾的核苷酸的實(shí)例包括但不限于肌苷、黃嘌呤、次黃嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、N6-甲基腺嘌呤、5-甲基胞嘧啶、7-脫氮嘌呤、5-羥甲基嘧啶。修飾的核苷酸還可以包括RNA物質(zhì)中存在的許多修飾堿基。天然存在的莖環(huán)結(jié)構(gòu)主要存在于RNA物質(zhì)中，如轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNA)、微RNA前體、核糖酶以及它們的等同物。核酸發(fā)夾結(jié)構(gòu)可以通過有意的設(shè)計(jì)，使用制造合成寡核苷酸的方法來產(chǎn)生。寡核苷酸被廣泛地用作DNA測序和PCR的引物、篩選和檢測實(shí)驗(yàn)的探針、以及用于克隆目的的接頭或銜接子。15個(gè)核苷酸至25個(gè)核苷酸范圍的短寡核苷酸可以不經(jīng)純化而被直接使用。由于逐步產(chǎn)率小于100％，因此更長的寡核苷酸需要通過高效液相色譜或HPLC、或通過制備型凝膠電泳純化以去除失敗的寡核苷酸級分，也被稱為n-1、n-2等產(chǎn)物。在某些實(shí)施方案中，核酸發(fā)夾大致具有約100個(gè)堿基。根據(jù)實(shí)驗(yàn)的性質(zhì)，給定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)可以被設(shè)計(jì)成含有雙鏈雙鏈體的所期望的穩(wěn)定性，這是通過以下方式來實(shí)現(xiàn)的：用如本文所論述的一個(gè)或多個(gè)高度修飾堿基或非天然堿基和/或一個(gè)或多個(gè)骨架鍵進(jìn)行取代；或包括其它合成堿基，如7-脫氮-7-羥基嘌呤、isoC以及isoG、或它們的等同物；以及形成例如而不限于RNA-DNA、PNA-DNA、PNA-RNA、PNA-PNA、LNA-DNA、LNA-RNA、LNA-LNA雙鏈雙鏈體。合成設(shè)計(jì)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)可用于多種分子生物學(xué)技術(shù)中，例如而不限于，通過使發(fā)夾連接到DNA片段的末端而用作DNA聚合酶的引發(fā)位點(diǎn)、作為探針以鑒定所關(guān)注的序列的檢測部分、以及由線性片段產(chǎn)生拓?fù)洵h(huán)狀DNA分子。在某些實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)的5'-末端將被磷酸化，例如而不限于使用T4多核苷酸激酶磷酸化，以有助于使用連接劑高效連接到一個(gè)或多個(gè)片段化的核酸分子的末端。在某些實(shí)施方案中，可以使用寡核苷酸探針檢測經(jīng)過擴(kuò)增或復(fù)制的啞鈴狀模板。所述寡核苷酸探針可以是標(biāo)記的寡核苷酸探針。所述寡核苷酸探針可以是標(biāo)記的DNA探針。在某些實(shí)施方案中，所述寡核苷酸探針可以與熒光團(tuán)、發(fā)色團(tuán)、放射性同位素、酶、或發(fā)光化合物、或其組合中的一種或多種連接。某些發(fā)夾結(jié)構(gòu)也已經(jīng)用作寡核苷酸探針。也被稱為分子信標(biāo)的某些DNA探針是被設(shè)計(jì)成含有具有彼此互補(bǔ)的兩個(gè)末端的內(nèi)部探針序列的寡核苷酸。在適當(dāng)?shù)臈l件下，所述末端雜交在一起，從而形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)。探針序列被包含在分子信標(biāo)的環(huán)部分內(nèi)并且與莖臂無關(guān)。熒光染料與莖上的一個(gè)末端連接，并且非熒光猝滅部分或“猝滅劑”與莖的另一個(gè)末端連接。在莖環(huán)構(gòu)型中，雜交臂使熒光染料和猝滅劑保持靠近，從而通過眾所周知的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)過程引起熒光染料信號猝滅。在環(huán)結(jié)構(gòu)內(nèi)的探針序列發(fā)現(xiàn)它的預(yù)期靶序列并且與其雜交時(shí)，莖結(jié)構(gòu)被破壞以有利于更長的和更穩(wěn)定的探針-靶雙鏈體。探針雜交使得熒光染料和猝滅劑分離(即現(xiàn)在失去靠近的狀態(tài))，因此染料現(xiàn)在可以在暴露于檢測器的適當(dāng)激發(fā)源時(shí)發(fā)熒光。分子信標(biāo)已經(jīng)用于許多分子生物學(xué)技術(shù)，如實(shí)時(shí)PCR，以鑒別等位基因差異。在某些實(shí)施方案中，發(fā)夾結(jié)構(gòu)可以通過使用兩個(gè)或更多個(gè)核酸分子來形成，所述兩個(gè)或更多個(gè)核酸分子然后連接形成單個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)?？梢允褂眠B接試劑使兩個(gè)或更多個(gè)核酸分子連接在一起以形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。還可以使用接頭使兩個(gè)或更多個(gè)核酸分子以化學(xué)方式連接在一起以形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。在某些實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)的5'-末端將被磷酸化，例如而不限于使用T4多核苷酸激酶磷酸化，以有助于使用連接劑高效連接到一個(gè)或多個(gè)片段化的核酸分子的末端。在某些實(shí)施方案中，功能上重要的信息可以存在于發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖區(qū)中。在某些實(shí)施方案中，功能上重要的信息可以存在于發(fā)夾結(jié)構(gòu)的環(huán)區(qū)中。功能上重要的信息可以包括例如而不限于對于體外復(fù)制、體外擴(kuò)增、唯一標(biāo)識(即條形碼)以及檢測來說必要的序列。在其中功能上重要的信息存在于發(fā)夾結(jié)構(gòu)的環(huán)區(qū)中的某些實(shí)施方案中，莖區(qū)的長度可以少到四個(gè)或六個(gè)堿基對。在其中功能上重要的信息存在于發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖區(qū)中的某些實(shí)施方案中，環(huán)區(qū)的長度可以少到一個(gè)或兩個(gè)堿基。配對模板文庫是通過使已經(jīng)針對給定的尺寸，如2kb選擇的經(jīng)過剪切的基因組DNA環(huán)化，從而使先前彼此遠(yuǎn)離的末端靠近來制備的。然后通過機(jī)械手段或物理手段將環(huán)切成線性DNA片段。使用那些被稱作連接片段的含有連接的遠(yuǎn)端的DNA片段形成配對模板?！斑B接片段”是含有更大的DNA分子的遠(yuǎn)端與選擇標(biāo)記的組合的DNA分子，并且所述DNA分子是通過首先制備DNA環(huán)，將所述DNA環(huán)片段化，并且選擇含有選擇標(biāo)記的片段而形成的。舉例來說而不限于，形成環(huán)的方法涉及使用限制性核酸內(nèi)切酶，如MboI將高分子量基因組DNA部分消化。還可以使用其它已知的4-堿基、6-堿基、或8-堿基“切割劑”或等同物。將非常低濃度的并且與小的選擇標(biāo)記組合的DNA片段連接在一起以形成共價(jià)DNA環(huán)。因此，產(chǎn)生環(huán)狀DNA分子，所述環(huán)狀DNA分子具有由DNA片段的兩個(gè)遠(yuǎn)端側(cè)接的選擇標(biāo)記。連接片段的文庫是通過用不同的限制性核酸內(nèi)切酶，如EcoRI消化DNA環(huán)，然后選擇由那些遠(yuǎn)端側(cè)接的標(biāo)記片段而形成的。連接片段文庫用于遺傳和物理圖譜實(shí)驗(yàn)以及測序應(yīng)用中。更一般來說，當(dāng)優(yōu)化傾向于“分子內(nèi)”連接事件(即同一個(gè)核酸分子的DNA環(huán))的連接片段相對于“分子間”連接事件(即被稱作多聯(lián)體的兩個(gè)或更多個(gè)核酸分子的連接)的比率時(shí)，應(yīng)當(dāng)考慮幾個(gè)因素。所述比率取決于兩個(gè)參數(shù)：分子的一個(gè)末端的由該同一個(gè)分子的另一個(gè)末端所經(jīng)受的有效局部摩爾濃度(j)以及所有其它DNA分子的末端的摩爾濃度(i)。參數(shù)j可以根據(jù)雅各布-斯托克邁耶方程式(Jacobon-Stockmayerequation)來確定：j＝3.55×10-8M/kb3/2其中kb是以千堿基對(kpb)計(jì)的核酸分子的長度。對于給定的連接反應(yīng)，分子內(nèi)事件的百分比是通過j/(i+j)的比率來確定的。也就是說，相較于更小的核酸分子，更大的核酸分子必須被進(jìn)一步稀釋以實(shí)現(xiàn)合理的形成分子內(nèi)環(huán)的效率。為了在分子內(nèi)連接期間以合理的概率摻入選擇標(biāo)記，它的摩爾濃度應(yīng)當(dāng)約等于j。然而，即使在非常稀的連接條件下，形成分子間連接物質(zhì)的概率仍將存在，從而產(chǎn)生分子內(nèi)環(huán)和兩個(gè)或更多個(gè)核酸分子的線性多聯(lián)體的混合物。存在與形成大的環(huán)狀核酸分子相關(guān)的多個(gè)技術(shù)問題，包括：(a)產(chǎn)生和處理非常大的核酸分子而不使它們斷裂成更小的核酸分子；(b)鑒定適當(dāng)?shù)倪x擇標(biāo)記以富集連接片段；以及(c)需要大量的起始核酸材料來形成完整的代表性的核酸文庫。本領(lǐng)域中存在用于處理大核酸分子的非常確實(shí)的方法，如脈沖場凝膠電泳，并且已經(jīng)使用替代策略，如生物素/親和素或鏈霉親和素系統(tǒng)，以提高對連接片段的選擇。然而，有關(guān)需要大量的起始核酸材料的問題仍沒有被充分解決。因此，在考慮對以有限量出現(xiàn)的珍貴的生物樣品，如在手術(shù)程序期間獲得的活檢樣品或從全血、血漿或血清中獲得的游離循環(huán)DNA進(jìn)行分析時(shí)，通過分子內(nèi)連接事件的策略形成核酸環(huán)很少適用。存在許多從樣品中分離核酸的方法。一旦被分離，一個(gè)或多個(gè)核酸分子就可以通過片段化過程斷裂成更小的片段，所述片段化過程例如而不限于是以非序列特異性方式或序列特異性方式進(jìn)行的。預(yù)期非序列特異性或隨機(jī)的片段化過程會產(chǎn)生片段化的核酸分子沿著所關(guān)注的給定基因組的均勻分布或基本上均勻的分布。舉例來說而不限于，1,000,000個(gè)片段化的核酸分子可以被定位到相等尺寸的1,000個(gè)位置(即窗口)，其中每一個(gè)窗口具有1,000個(gè)定位的片段化的核酸分子的計(jì)數(shù)。在某些實(shí)施方案中，從片段化的核酸分子沿所關(guān)注的給定基因組的均勻分布或基本上均勻的分布獲得的數(shù)據(jù)可以顯示出相對于另外的數(shù)據(jù)類型偏向有利于某些數(shù)據(jù)類型，例如而不限于，被研究的基因組的給定區(qū)域的GC含量。在某些實(shí)施方案中，使用將雙鏈DNA非特異性片段化的DNA酶I將核酸分子以酶促方式片段化。片段化的產(chǎn)物是具有不同尺寸的5'-磷酸化的二核苷酸、三核苷酸、以及寡核苷酸。DNA酶I在含有Mn2+、Mg2+以及Ca2+，但是在緩沖液中沒有其它鹽的緩沖液中具有最佳的活性。使用DNA酶I進(jìn)行的片段化通常將引起對雙鏈DNA的隨機(jī)消化，當(dāng)在基于Mn2+的緩沖液存在下使用時(shí)，平端雙鏈DNA片段占優(yōu)勢。即使在使用基于Mn2+的緩沖條件下，片段化的核酸分子仍可能含有延伸超出片段化的雙鏈體的另一條核酸鏈的末端的未知序列的一個(gè)或多個(gè)單鏈核苷酸的5'-突出末端(在此被稱為“5'-末端突出端”)以及延伸超出片段化的雙鏈體的另一條核酸鏈的末端的未知序列的一個(gè)或多個(gè)單鏈核苷酸的3'-突出末端(在此被稱為“3'-末端突出端”)。在DNA酶I消化后文庫的片段尺寸的范圍取決于幾個(gè)因素，例如而不限于(i)用于反應(yīng)中的DNA酶I的量(單位)；(ii)反應(yīng)的溫度；以及(iii)反應(yīng)的時(shí)間。在某些實(shí)施方案中，使用物理手段或機(jī)械手段以非序列特異性方式將核酸分子片段化。舉例來說而不限于，可以使用霧化將核酸分子片段化，所述霧化將雙鏈核酸分子剪切成更小的片段。在霧化后文庫的片段尺寸的范圍取決于幾個(gè)因素，例如而不限于(i)向霧化器施加的壓力；以及(ii)剪切過程的時(shí)間。剪切的片段文庫含有多種末端類型，包括平端、5'-末端突出端、以及3'-末端突出端。在使用隨機(jī)片段化方法的情況下一個(gè)或多個(gè)片段化的核酸分子的末端可以直接使用連接劑連接到銜接頭以形成啞鈴狀模板或被使得能夠連接啞鈴狀模板，參見下文。還可以通過序列特異性片段化過程，例如而不限于使用一種或多種限制性核酸內(nèi)切酶使來自樣品的分離的核酸分子斷裂成更小的片段。預(yù)期序列特異性片段化過程會產(chǎn)生片段化的核酸分子沿著所關(guān)注的給定基因組的不均勻分布或基本上不均勻的分布。對于全基因組研究，序列特異性片段化過程可能不是最佳的，這是因?yàn)榭赡茱@著的一定分?jǐn)?shù)的基因組區(qū)域預(yù)期將具有低頻率的限制性核酸內(nèi)切酶切割位點(diǎn)。切割位點(diǎn)的分布取決于用于給定的片段化過程的限制性核酸內(nèi)切酶的類型和數(shù)量。具有低頻率的切割位點(diǎn)的區(qū)域?qū)?dǎo)致基因組信息的表示不足。使用序列特異性片段化方法有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)，例如而不限于靶向所關(guān)注的基因組的子集，這減少了工作、成本、以及數(shù)據(jù)分析，并且片段化的核酸分子的末端將被限定為平端或限定的5'-末端突出端核酸序列和限定的3'-末端突出端核酸序列。具有確定的核酸序列的突出末端被稱為“粘性末端”。在某些實(shí)施方案中，可以使用兩種或更多種限制性核酸內(nèi)切酶來形成每一個(gè)末端均具有不同的粘性末端序列的更小的片段。舉例來說而不限于，使用兩種限制性核酸內(nèi)切酶(即EcoRI和BamHI)消化分離的核酸分子，這將產(chǎn)生三種不同的粘性末端類型(即兩個(gè)末端含有相同的5'-突出端序列5'-AATT[EcoRI]或5'-突出端序列5'-GATC[BamHI]或兩個(gè)末端含有不同的粘性末端(即一個(gè)末端具有5'-突出端序列5'-AATT并且另一個(gè)末端具有5'-突出端序列5'-GATC))?？梢允褂眠B接劑使具有5'-AATT的互補(bǔ)粘性末端的一種發(fā)夾結(jié)構(gòu)連接到含有EcoRI粘性末端的片段，并且可以使用連接劑使具有5'-GATC的互補(bǔ)粘性末端的不同的發(fā)夾結(jié)構(gòu)連接到含有BamHI粘性末端的片段。可以使用含有不同的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)序列的親和載體富集含有不同的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的啞鈴狀模板，關(guān)于更多的細(xì)節(jié)，參見實(shí)施例。還可以通過序列特異性片段化過程，例如而不限于使用多重PCR使來自樣品的分離的核酸分子形成更小的片段。舉例來說而不限于，兩個(gè)或更多個(gè)PCR引物組可以被設(shè)計(jì)成特異性擴(kuò)增包含核酸分子的兩個(gè)或更多個(gè)靶區(qū)域。除了設(shè)計(jì)包括引物的靶標(biāo)特異性核酸序列之外，具有功能上重要的信息的另外的核酸序列還可以包括例如而不限于一個(gè)或多個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶切割位點(diǎn)和唯一標(biāo)識(即條形碼)。在某些實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)正向PCR引物可以含有一個(gè)給定的限制性核酸內(nèi)切酶切割位點(diǎn)，并且一個(gè)或多個(gè)反向PCR引物可以含有一個(gè)不同的限制性核酸內(nèi)切酶切割位點(diǎn)。在使擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物與相應(yīng)的限制性核酸內(nèi)切酶接觸時(shí)，所述限制性核酸內(nèi)切酶中的每一種識別并切割它的切割位點(diǎn)，擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物的末端可以含有不同的粘性末端，這些粘性末端可以用于以可預(yù)測的方式連接兩種不同的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。舉例來說而不限于，除了靶標(biāo)特異性核酸序列之外，所有正向PCR引物均含有EcoRI限制性核酸內(nèi)切酶切割位點(diǎn)并且所有反向PCR引物均含有BamHI限制性核酸內(nèi)切酶切割位點(diǎn)。在使用兩個(gè)或更多個(gè)PCR引物組進(jìn)行多重PCR之后，用EcoRI和BamHI對擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行的限制性核酸內(nèi)切酶消化將產(chǎn)生具有5'-突出端序列5'-AATT的正向引物末端和具有5'-突出端序列5'-GATC的反向引物末端?？梢允褂眠B接劑使具有5'-AATT的互補(bǔ)粘性末端的一種發(fā)夾結(jié)構(gòu)僅連接到正向引物末端，并且可以使用連接劑使具有5'-GATC的互補(bǔ)粘性末端的不同的發(fā)夾結(jié)構(gòu)僅連接到反向引物末端。在一些實(shí)施方案中，來自樣品的分離的核酸分子可能不需要任何片段化過程，這是因?yàn)檫@些分離的核酸分子可能是充分片段化的以形成啞鈴狀模板。舉例來說而不限于，來自從妊娠女性或癌癥患者獲得的血清或血漿、全血的分離的核酸分子在體內(nèi)是充分片段化的，因此可能不需要另外的片段化來形成啞鈴狀模板。在某些實(shí)施方案中，樣品可以是從癌癥患者獲得的。在某些實(shí)施方案中，樣品可以是從妊娠個(gè)體獲得的。在某些實(shí)施方案中，樣品可以是從病理學(xué)標(biāo)本獲得的。在某些實(shí)施方案中，樣品可以是從福爾馬林固定的石蠟包埋(FFPE)標(biāo)本獲得的。在某些實(shí)施方案中，樣品可以是從環(huán)境樣品獲得的。在某些實(shí)施方案中，核酸分子可以具有100bp至100kbp范圍的長度。分離的體內(nèi)片段化核酸分子文庫含有多種末端類型，包括平端、5'-末端突出端、以及3'-末端突出端。片段化的核酸分子的末端可以直接使用連接劑連接到銜接頭以形成連接的啞鈴狀模板或首先經(jīng)過加工以使得所述末端能夠形成連接的啞鈴狀模板，參見下文?？梢酝ㄟ^使用拋光方法，例如而不限于，通過使用表現(xiàn)出3'-核酸外切酶活性的聚合酶來提高含有平端的片段化的核酸分子的百分比。舉例來說而不限于，這樣的聚合酶可以包括T4DNA聚合酶、克列諾DNA聚合酶(KlenowDNApolymerase)、或PfuDNA聚合酶。這些DNA聚合酶的3'-核酸外切酶活性是通過從3'-末端突出端去除未知序列或已知序列的一個(gè)或多個(gè)單鏈核苷酸以形成平端片段化的核酸分子來起作用。通過使互補(bǔ)核苷酸以酶促方式摻入到凹入的3'-末端鏈中來使5'-末端突出端變成平端，從而也形成平端片段化的核酸分子。在某些實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)片段化的核酸分子的5'-末端可以被磷酸化，例如而不限于使用T4多核苷酸激酶磷酸化，以有助于使用連接劑連接到一個(gè)或多個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)的末端以高效形成啞鈴狀模板。在某些實(shí)施方案中，在將片段化的核酸分子平端化和磷酸化之后，雙鏈寡核苷酸銜接子可以被設(shè)計(jì)成引入功能上重要的信息，例如而不限于復(fù)制、擴(kuò)增和/或唯一標(biāo)識(即條形碼)序列，以及提供任何給定的粘性末端序列。后者序列可以用于有助于使用連接劑用具有互補(bǔ)粘性末端序列的5'-磷酸化的發(fā)夾結(jié)構(gòu)高效形成啞鈴狀模板。在某些實(shí)施方案中，可以使用轉(zhuǎn)座酶和轉(zhuǎn)座子復(fù)合物來將一個(gè)或多個(gè)核酸分子片段化，并且同時(shí)插入功能上重要的信息，例如而不限于復(fù)制、擴(kuò)增、和/或唯一標(biāo)識(即條形碼)序列以及在插入點(diǎn)處提供能夠形成粘性末端序列的任何給定的限制性核酸內(nèi)切酶切割位點(diǎn)。在某些實(shí)施方案中，片段化的核酸分子的末端可以通過其它手段來修飾，例如而不限于，通過將2'-脫氧腺苷(dA)核苷酸添加到平端片段化的核酸分子的3'-末端。舉例來說而不限于，缺乏3'-核酸外切酶活性的DNA聚合酶，如克列諾3'-exo(-)DNA聚合酶和TaqDNA聚合酶可以將2'-脫氧腺苷三磷酸添加到平端片段化的核酸分子的3'-末端以得到具有一個(gè)2'-脫氧腺苷一磷酸核苷酸的3'-末端突出端。dA加尾法也有助于使用連接劑，用具有一個(gè)2'-胸苷一磷酸核苷酸的互補(bǔ)3'-末端突出端的5'-磷酸化的發(fā)夾結(jié)構(gòu)進(jìn)行高效的啞鈴狀模板構(gòu)建。在某些實(shí)施方案中，平端片段化的核酸分子也可以直接被用于使用連接劑以連接具有相應(yīng)的平端的5'-磷酸化的發(fā)夾結(jié)構(gòu)來形成啞鈴狀模板。不同于通過分子內(nèi)連接事件的策略形成核酸環(huán)的當(dāng)前方法，所述策略在考慮對有限量的珍貴的生物樣品進(jìn)行分析時(shí)很少適用，本發(fā)明的方法大幅提高了形成核酸環(huán)的效率。舉例來說而不限于，通過分子內(nèi)連接事件的策略形成核酸環(huán)需要數(shù)十微克的起始材料，但在形成所期望的核酸環(huán)時(shí)得到百分之一(1％)或更低的近似效率。與分子內(nèi)連接策略相關(guān)的問題被進(jìn)一步加重，這是因?yàn)檫@種方法依賴于核酸分子的尺寸并且與連接效率成反比。也就是說，更大尺寸的核酸分子通過分子內(nèi)連接方法形成更少的環(huán)，這是因?yàn)榉磻?yīng)條件要求與核酸分子的長度成比例越來越稀的濃度。另一方面，本發(fā)明中所述的形成啞鈴狀模板的方法是非常高效的，這是因?yàn)樗龇椒ú灰蕾囉诜肿觾?nèi)連接方法。相反，通過分子間事件形成啞鈴狀模板，其中可以使得使核酸分子與發(fā)夾結(jié)構(gòu)連接的連接效率非常高效。連接反應(yīng)可以進(jìn)行到完成或基本上接近完成，這是因?yàn)榘l(fā)夾結(jié)構(gòu)的濃度可以足夠高的程度(即100倍)高于核酸分子的濃度。連接反應(yīng)也不依賴于或基本上不依賴于一個(gè)或多個(gè)核酸分子的尺寸，這是因?yàn)?,000bp尺寸的啞鈴狀模板可以與5,000bp尺寸或10,000bp尺寸或甚至100,000bp尺寸、或甚至大于100,000bp的啞鈴狀模板同樣高效地形成。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，可以從基因組DNA以0.5kb、1.0kb、2.5kb、5.0kb、7.5kb、以及10.0kb的尺寸增量構(gòu)建有效的雙重發(fā)夾啞鈴狀模板。在某些實(shí)施方案中，然后可以在均相反應(yīng)溶液中使用滾環(huán)機(jī)制復(fù)制或擴(kuò)增啞鈴狀模板。在某些實(shí)施方案中，還可以在非均相反應(yīng)溶液中，使用滾環(huán)機(jī)制，使用一種或多種固相結(jié)合引物，通過在有限稀釋中將啞鈴狀模板引入到基質(zhì)上來復(fù)制或擴(kuò)增啞鈴狀模板，以使得一個(gè)或多個(gè)復(fù)制的啞鈴狀模板或擴(kuò)增的啞鈴狀模板是在空間上和在光譜上可分辨的以檢測核酸分子。在某些實(shí)施方案中，所述啞鈴狀模板是含有一個(gè)或多個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)的正鏈核酸分子。在某些實(shí)施方案中，還可以形成啞鈴狀模板，由此單鏈核酸分子的每一個(gè)末端連接到發(fā)夾結(jié)構(gòu)，由此一個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)可以用作引物以使單鏈核酸分子延伸和拷貝到發(fā)夾結(jié)構(gòu)的另一個(gè)末端。在連接步驟后，形成啞鈴狀模板。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，可以使線性雙鏈區(qū)解鏈，例如而不限于通過熱、化學(xué)手段或酶促手段，并且可以使啞鈴狀模板轉(zhuǎn)化成完全開放的單鏈環(huán)。在某些實(shí)施方案中，可以使用具有含有獨(dú)特的限制性核酸內(nèi)切酶切割位點(diǎn)的不同的核酸序列的兩個(gè)不同的發(fā)夾結(jié)構(gòu)形成啞鈴狀模板?？梢允褂脻L環(huán)機(jī)制復(fù)制這些環(huán)狀模板以形成靶序列的多個(gè)拷貝。在RCR步驟后，可以用適當(dāng)?shù)南拗菩院怂醿?nèi)切酶消化線性多聯(lián)體以產(chǎn)生靶序列的單體單元，然后使其末端連接在一起以形成環(huán)狀靶序列的多個(gè)拷貝。在本發(fā)明的某些其它實(shí)施方案中，啞鈴狀模板可以用于轉(zhuǎn)錄所關(guān)注的基因的RNA分子。產(chǎn)生含有一個(gè)或多個(gè)RNA啟動子序列的啞鈴狀模板并且使用這些閉合單鏈核酸環(huán)作為體外轉(zhuǎn)錄所關(guān)注的基因的RNA分子的模板。在某些實(shí)施方案中，可以使用核酸外切酶去除沒有成功連接以形成啞鈴狀模板的不希望有的核酸分子。這些不希望有的核酸分子可以具有可以呈平端、5'-突出末端和/或3'-突出末端的形式的一個(gè)或多個(gè)5'-末端或3'-末端，或可以單鏈形式存在。這些不希望有的核酸分子包括但不限于未片段化和片段化的核酸分子、可能沒有形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的寡核苷酸、以及未連接的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。核酸外切酶III(也被稱作ExoIII)催化單核苷酸從雙鏈DNA的3'-羥基末端上的逐步去除。在每一個(gè)結(jié)合事件期間去除有限數(shù)量的核苷酸，從而使得DNA分子的群體內(nèi)發(fā)生協(xié)調(diào)的漸進(jìn)性缺失。ExoIII的優(yōu)選底物是含有平端或5'-突出末端的核酸分子，盡管所述酶也在雙鏈DNA中的切口處起作用以產(chǎn)生單鏈空位。ExoIII對單鏈DNA沒有活性，因此3'-突出末端對切割具有抗性?？剐缘某潭热Q于延伸的長度，其中四個(gè)堿基或更長的延伸基本上對切割具有抗性。這一特性可以被利用以從具有一個(gè)抗性末端(3'-突出末端)和一個(gè)敏感末端(平端或5'-突出末端)的線性分子產(chǎn)生單向缺失。核酸外切酶III的活性部分地取決于螺旋結(jié)構(gòu)并且顯示出序列依賴性(C>A＝T>G)。溫度、鹽濃度以及酶與DNA的比率極大地影響酶活性，從而需要針對特定應(yīng)用調(diào)控反應(yīng)條件。核酸外切酶VII(也被稱作ExoVII)在5'→3'方向和3'→5'方向上切割單鏈DNA。這種酶對線性或環(huán)狀雙鏈DNA沒有活性。在形成啞鈴狀模板時(shí)，它可用于去除來自完成的PCR反應(yīng)和后連接反應(yīng)的單鏈寡核苷酸引物和發(fā)夾。核酸外切酶VII對單鏈DNA的消化具有非金屬依賴性。ExoIII和ExoVII可以組合用于去除沒有成功連接以形成啞鈴狀模板的不希望有的核酸分子?；|(zhì)可以包含任何材料，例如而不限于固體材料、半固體材料(即[i]固體載體和凝膠或基體材料的復(fù)合材料或[ii]線性或交聯(lián)的聚丙烯酰胺、纖維素、交聯(lián)瓊脂糖、以及聚乙二醇)、或流體或液體材料。所述基質(zhì)還可以包含具有任何尺寸和形狀的任何材料，例如而不限于正方形、梯形、球形、類球形、管形、球粒形、桿形、或八面體。所述基質(zhì)應(yīng)當(dāng)含有與本發(fā)明相容的特性(即對復(fù)制過程、擴(kuò)增過程、或檢測過程表現(xiàn)出最低限度的干擾)。在某些實(shí)施方案中，所述基質(zhì)是無孔的。在某些實(shí)施方案中，所述基質(zhì)是多孔的。在某些實(shí)施方案中，所述基質(zhì)可以包含親水性多孔基體，如水凝膠。在某些實(shí)施方案中，固體材料包括例如而不限于玻璃材料(即硼硅酸鹽、可控孔度玻璃、熔融二氧化硅、或摻鍺二氧化硅)、硅、氧化鋯、二氧化鈦、聚合材料(即聚苯乙烯、交聯(lián)聚苯乙烯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚二甲基硅氧烷、聚乙烯、聚氟乙烯、聚氧乙烯、聚丙烯、聚丙烯酰胺、聚酰胺(如尼龍)、葡聚糖、交聯(lián)葡聚糖、膠乳、環(huán)烯烴聚合物、環(huán)烯烴共聚物以及其它共聚物和其接枝物)、或金屬材料。固體基質(zhì)可以由例如而不限于以下各項(xiàng)組成：一個(gè)或多個(gè)膜、平面表面、基本上平面的表面、非平面表面、微量滴定板、球形珠粒、非球形珠粒、光纖、含有球形珠粒的光纖、含有非球形珠粒的光纖、半導(dǎo)體器件、含有球形珠粒的半導(dǎo)體器件、含有非球形珠粒的半導(dǎo)體器件、具有容納球形珠粒的一個(gè)或多個(gè)孔的載片、具有容納非球形珠粒的一個(gè)或多個(gè)孔的載片、過濾器、測試條、載片、蓋片、或試管。在某些實(shí)施方案中，半固體材料包括例如而不限于線性或交聯(lián)的聚丙烯酰胺、纖維素、交聯(lián)的瓊脂糖、以及聚乙二醇。可以通過任何合適的手段使一種或多種引物連接到基質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，一種或多種引物與基質(zhì)的連接例如而不限于是通過共價(jià)鍵合、氫鍵鍵合(即由此引物與共價(jià)連接到基質(zhì)的另一個(gè)互補(bǔ)的寡核苷酸雜交并且仍發(fā)揮復(fù)制型或擴(kuò)增型功能)、范德華力(VanDerWaalforce)、物理吸附、疏水性相互作用、離子相互作用或親和相互作用(即結(jié)合對，如生物素/鏈霉親和素或抗原/抗體)所介導(dǎo)的。在某些實(shí)施方案中，結(jié)合對的一個(gè)成員與基質(zhì)連接并且結(jié)合對的另一個(gè)成員與一種或多種引物連接。一種或多種引物與基質(zhì)的連接是經(jīng)由結(jié)合對的兩個(gè)成員的相互作用而發(fā)生。一種或多種引物與基質(zhì)連接的順序可以是任何排列，這被廣義地定義為“引物陣列”，例如而不限于按隨機(jī)陣列、通過圖案化陣列中的隨機(jī)分配、或通過有序陣列中圖案化的已知物。通過滾環(huán)機(jī)制復(fù)制啞鈴狀模板的引物陣列被廣義地定義為“復(fù)制的啞鈴狀模板陣列”。通過滾環(huán)機(jī)制擴(kuò)增啞鈴狀模板的引物陣列被廣義地定義為“擴(kuò)增的啞鈴狀模板陣列”。通過設(shè)計(jì)，預(yù)期圖案化陣列和有序陣列提供在空間上和在光譜上可分辨以用于檢測核酸分子的復(fù)制的啞鈴狀模板陣列或擴(kuò)增的啞鈴狀模板陣列。在隨機(jī)陣列的某些實(shí)施方案中，一種或多種引物可以共價(jià)鍵合到基質(zhì)以在平面表面或基本上平面的表面上形成固定的引物的高密度坪。一種或多種引物可以通過任何手段連接，例如而不限于通過涉及滴加、噴涂、電鍍或涂鋪溶液、乳液、氣溶膠、蒸氣、或干制劑的方法。通過以有限稀釋方式將啞鈴狀模板引入到基質(zhì)上，一種或多種引物將接觸啞鈴狀模板，從而使得滾環(huán)機(jī)制在聚合酶存在下能夠產(chǎn)生在空間上和在光譜上可分辨以用于檢測核酸分子的一個(gè)或多個(gè)復(fù)制的啞鈴狀模板(即復(fù)制的啞鈴狀模板陣列)或擴(kuò)增的啞鈴狀模板(即擴(kuò)增的啞鈴狀模板陣列)。在圖案化陣列中的隨機(jī)分配的某些實(shí)施方案中，一種或多種引物可以共價(jià)鍵合到基質(zhì)以在一個(gè)或多個(gè)球形珠?；蚍乔蛐沃榱Ｉ闲纬筛呙芏鹊墓潭ǖ囊铩Ｍㄟ^使用水包油乳液系統(tǒng)在有限稀釋中將啞鈴狀模板引入到基質(zhì)上，一種或多種引物將接觸啞鈴狀模板，從而使得滾環(huán)機(jī)制能夠產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)復(fù)制的啞鈴狀模板或擴(kuò)增的啞鈴狀模板。在某些實(shí)施方案中，可以基于分布單個(gè)分子的泊松統(tǒng)計(jì)(Poissonstatistics)，將復(fù)制的啞鈴狀模板化珠粒或擴(kuò)增的啞鈴狀模板化珠粒富集以去除沒能復(fù)制或擴(kuò)增啞鈴狀模板的那些珠粒。在進(jìn)行或沒有進(jìn)行富集的情況下，復(fù)制的啞鈴狀模板化珠?；驍U(kuò)增的啞鈴狀模板化珠粒然后可以有序的圖案隨機(jī)分布在含有孔、凹陷、或其它容器、器皿、特征、或位置的平面的或基本上平面的載片基質(zhì)、光纖基質(zhì)、或半導(dǎo)體器件基質(zhì)上。在圖案化陣列中的隨機(jī)分配的其它某些實(shí)施方案中，表面上一個(gè)或多個(gè)預(yù)制的親水性特征(即斑點(diǎn))可以由疏水性表面包圍以使一種或多種引物共價(jià)鍵合到基質(zhì)。舉例來說而不限于，可以在通過光刻法蝕刻的具有約300納米斑點(diǎn)的網(wǎng)格圖案化陣列的表面改性的硅基質(zhì)上形成圖案化陣列。通過以有限稀釋方式將啞鈴狀模板引入到圖案化基質(zhì)上，引物將接觸啞鈴狀模板，從而使得滾環(huán)機(jī)制能夠產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)復(fù)制的啞鈴狀模板或擴(kuò)增的啞鈴狀模板。在某些實(shí)施方案中，可以使預(yù)制的親水性斑點(diǎn)小到甚至僅容納一個(gè)復(fù)制的啞鈴狀模板或擴(kuò)增的啞鈴狀模板。由于基于泊松統(tǒng)計(jì)分布單個(gè)分子產(chǎn)生相當(dāng)一部分的無模板斑點(diǎn)，因此在滾環(huán)程序后，可以使用另外數(shù)輪的分布、接觸、以及滾環(huán)來提高基質(zhì)上復(fù)制的啞鈴狀模板或擴(kuò)增的啞鈴狀模板的密度。在有序陣列中圖案化的“已知物”的某些實(shí)施方案，可以在基質(zhì)上可尋址的位置處印刷(即點(diǎn)樣陣列)或原位制備一種或多種已知的引物。通過以有限稀釋方式將啞鈴狀模板引入到圖案化的基質(zhì)上，一種或多種引物將接觸啞鈴狀模板，從而使得滾環(huán)機(jī)制能夠產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)復(fù)制的啞鈴狀模板或擴(kuò)增的啞鈴狀模板。使用聚合酶鏈反應(yīng)(“PCR”)特異性擴(kuò)增少量核酸分子，從而產(chǎn)生所關(guān)注的靶序列的數(shù)千個(gè)至數(shù)百萬個(gè)拷貝。一般來說，PCR涉及反復(fù)加熱以使雙鏈體鏈變性或解鏈，冷卻以使引物雜交，然后再次加熱(通常在DNA聚合酶的最佳溫度，但是低于變性溫度)以使模板序列在體外(即在生物體外)擴(kuò)增。DNA聚合酶從單鏈模板拷貝或合成互補(bǔ)鏈。為了使這一酶促反應(yīng)發(fā)生，需要DNA的部分雙鏈段。通常，引物與單鏈模板的互補(bǔ)區(qū)雜交。DNA聚合酶沿5'至3'的方向合成新生鏈以形成雙鏈DNA。多重PCR允許同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)靶區(qū)域并且已經(jīng)用于檢測X-連鎖病癥中的一個(gè)或多個(gè)編碼外顯子缺失(這些外顯子是被轉(zhuǎn)錄成信使RNA(mRNA)并且被翻譯成一種或多種蛋白質(zhì)的基因序列)；這樣的X-連鎖病癥包括杜氏肌營養(yǎng)不良癥(Duchennemusculardystrophy)和萊-奈二氏綜合征(Lesch-Nyhansyndrome)。在替代方案中，可以使用PCR擴(kuò)增起始混合物中存在的整個(gè)池的核酸，從而引起核酸的任何給定子集的擴(kuò)增，但不是靶向富集。這是通過使共同序列或共同銜接子連接到片段的末端，并且通過使片段變性，使具有與共同銜接子互補(bǔ)的序列的共同引物雜交，并且拷貝DNA片段來擴(kuò)增片段而實(shí)現(xiàn)的。這種類型的PCR被稱作“通用PCR”。噬菌體(bacteriophage/phage)，如ΦX174、M13、λ、以及一些病毒可以通過“滾環(huán)”機(jī)制復(fù)制它們對應(yīng)的基因組。通過從環(huán)狀模板拷貝來復(fù)制整個(gè)基因組。不同于PCR，滾環(huán)機(jī)制可以等溫進(jìn)行(即不需要加熱或冷卻循環(huán))。滾環(huán)方法已經(jīng)被用作用于復(fù)制(即使用僅拷貝原始的啞鈴狀模板的一種或多種引物)或擴(kuò)增(即使用拷貝原始的啞鈴狀模板以及啞鈴狀模板的拷貝這兩者的兩種或更多種引物)所關(guān)注的核酸分子的體外方法。舉例來說，已經(jīng)使用滾環(huán)機(jī)制，使用大腸桿菌PolIDNA聚合酶和單一寡核苷酸引物復(fù)制了具有34個(gè)至52個(gè)堿基范圍的尺寸的環(huán)狀合成寡核苷酸模板。使用26至74范圍的類似尺寸的環(huán)的滾環(huán)機(jī)制使用多種聚合酶，包括大腸桿菌PolI、克列諾DNA聚合酶、以及T4DNA聚合酶。在某些實(shí)施方案中，DNA環(huán)可以形成為“鎖式探針”。使用鎖式方法的主要缺點(diǎn)在于形成環(huán)狀核酸分子的尺寸限制，例如而不限于用于靶向CFTRG542X基因座的具有46個(gè)核苷酸的環(huán)。這些鎖式環(huán)可用于使用DNA聚合酶，如DNA聚合酶、BstDNA聚合酶、以及Vent(exo-)DNA聚合酶在僅僅幾分鐘內(nèi)形成數(shù)百個(gè)靶拷貝。在某些實(shí)施方案中，鎖式環(huán)可以在滾環(huán)擴(kuò)增機(jī)制中使用兩種引物，這不僅使得能夠拷貝模板環(huán)(即負(fù)鏈)，而且還使得能夠拷貝新合成的一條或多條正鏈。使用兩種不同的具有46個(gè)核苷酸的鎖式環(huán)的RCA方法可以用于基因分型應(yīng)用，例如而不限于針對CFTRG542X基因座檢測野生型序列和突變型序列。用于基因分型的RCA鎖式方法的另一個(gè)缺點(diǎn)在于所測定的每一個(gè)突變的基因座需要單獨(dú)的等位基因鑒別引物。滾環(huán)擴(kuò)增已經(jīng)在使用隨機(jī)六聚體(即多于兩種引物)和DNA聚合酶的桑格測序應(yīng)用中用于使用具有5kb至7kb尺寸范圍的尺寸的傳統(tǒng)的克隆來源，如質(zhì)粒和噬菌體作為DNA環(huán)進(jìn)行基于溶液的模板制備。使用傳統(tǒng)的克隆方法形成DNA環(huán)的缺點(diǎn)在于需要經(jīng)由適當(dāng)?shù)募?xì)胞宿主繁殖這樣的DNA環(huán)。本發(fā)明的啞鈴狀模板克服了這一限制。使用嵌合DNA模板進(jìn)行的滾環(huán)復(fù)制已經(jīng)用于邊連接邊測序的方法中。模板制備方法使用一系列復(fù)雜的定向銜接子連接和IIs型限制性內(nèi)切酶消化以通過分子內(nèi)連接方法形成具有約300bp尺寸的小DNA環(huán)，在溶液中使用單一引物和φ29DNA聚合酶復(fù)制這些小DNA環(huán)以形成“DNA納米球”。然后使這些納米球吸附到圖案化的基質(zhì)上以進(jìn)行它們的邊連接邊測序方法。納米球方法的主要限制在于嵌合模板環(huán)中可供使用的基因組DNA序列的量小(即76bp是實(shí)際的靶序列并且其余222bp是銜接子序列)以及需要分子內(nèi)連接。本發(fā)明通過提供使用啞鈴狀模板的更簡單的工作流程克服了通過分子內(nèi)連接方法構(gòu)建小環(huán)狀模板的復(fù)雜方法的限制，所述啞鈴狀模板可以在滾環(huán)機(jī)制中被復(fù)制或擴(kuò)增。在滾環(huán)機(jī)制中有用的聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶一般表現(xiàn)出鏈置換特性，這是在核酸合成期間置換由所述酶所遇到的“下游”核酸鏈的能力。這些鏈置換酶也缺乏5'-核酸外切酶活性。任何鏈置換聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶可以用于滾環(huán)復(fù)制或滾環(huán)擴(kuò)增中，例如而不限于DNA聚合酶、大腸桿菌PolI、克列諾DNA聚合酶、BstDNA聚合酶(大片段)、BsmDNA聚合酶(大片段)、BsuDNA聚合酶(大片段)、Vent(exo-)DNA聚合酶、T7(exo-)DNA聚合酶(T7測序酶)、或TopoTaq(TaqDNA聚合酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶V的嵌合蛋白)、以及它們這些DNA聚合酶的突變型式，T7RNA聚合酶、T3RNA聚合酶、或SP6RNA聚合酶、以及它們這些RNA聚合酶的突變型式、或禽成髓細(xì)胞瘤病毒逆轉(zhuǎn)錄酶或莫洛尼鼠類白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(Moloneymurineleukemiavirusreversetranscriptase)、以及這些逆轉(zhuǎn)錄酶的突變型式，如ThermoScript逆轉(zhuǎn)錄酶、SuperScript逆轉(zhuǎn)錄酶或PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄酶。除了鏈置換聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶之外，輔助蛋白也可以通過提高滾環(huán)機(jī)制的穩(wěn)健性、保真性和/或持續(xù)性來進(jìn)一步增強(qiáng)核酸合成期間下游核酸鏈的置換。鏈置換輔助蛋白可以是任何類型并且包括例如而不限于解旋酶、單鏈結(jié)合蛋白、拓?fù)洚悩?gòu)酶、反向旋轉(zhuǎn)酶、以及刺激輔助蛋白的其它蛋白質(zhì)，例如而不限于大腸桿菌MutL蛋白或硫氧還蛋白。DNA解旋酶在體內(nèi)可用于在DNA復(fù)制期間將兩條互補(bǔ)的或基本上互補(bǔ)的DNA鏈分離或解旋。解旋酶可以在5'到3'方向(例如而不限于噬菌體T7基因4解旋酶、DnaB解旋酶以及Rho解旋酶)和3'到5'方向(例如而不限于大腸桿菌UvrD解旋酶、PcrA、Rep、以及丙型肝炎病毒的NS3RNA解旋酶)上使核酸分子解旋。解旋酶可以從任何來源獲得并且包括例如而不限于大腸桿菌解旋酶(即I、II[UvrD]、III和IV、Rep、DnaB、PriA以及PcrA)、噬菌體T4gp41、噬菌體T7基因4解旋酶、SV40大T抗原、Rho解旋酶、酵母RAD解旋酶、來自騰沖嗜熱厭氧桿菌(T.tengcongensis)的熱穩(wěn)定性UvrD解旋酶、和丙型肝炎病毒的NS3RNA解旋酶、以及這些和其它解旋酶的突變型式。單鏈結(jié)合蛋白以比對雙鏈DNA更大的親和力結(jié)合單鏈DNA。這些蛋白質(zhì)協(xié)同地結(jié)合，從而有利于侵入單鏈區(qū)域并且因此使雙鏈體結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。舉例來說而不限于，單鏈結(jié)合蛋白可以通過去除二級結(jié)構(gòu)而表現(xiàn)出螺旋去穩(wěn)定活性并且可以置換雜交的核酸分子。單鏈結(jié)合蛋白可以從任何來源獲得并且包括例如而不限于噬菌體T4基因32蛋白、RB49基因32蛋白、大腸桿菌單鏈結(jié)合蛋白、單鏈結(jié)合蛋白或噬菌體T7基因2.5、以及這些和其它單鏈結(jié)合蛋白的突變型式，如噬菌體T7基因2.5F232L。可以使用高度持續(xù)性鏈置換聚合酶，如phi29聚合酶對啞鈴狀模板進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制。滾環(huán)復(fù)制可以分兩個(gè)步驟進(jìn)行。首先，在適當(dāng)?shù)摹半s交條件”下使經(jīng)過尺寸選擇的啞鈴狀模板與啞鈴狀互補(bǔ)引物雜交，所述雜交條件包括溫度、諸如鹽、緩沖液和pH值的因素、洗滌劑、以及有機(jī)溶劑。可以使用封閉劑，如牛血清白蛋白(BSA)或登哈特試劑(Denhardt'sreagent)作為雜交條件的一部分。其次，向第一反應(yīng)混合物提供適當(dāng)?shù)木酆厦富驈?fù)制體和核苷酸混合物以產(chǎn)生擴(kuò)增或復(fù)制的啞鈴狀模板。雜交和擴(kuò)增或復(fù)制條件是基于幾個(gè)因素來優(yōu)化的，包括但不限于啞鈴狀模板的莖區(qū)的長度和序列組成、雜交條件、本文使用的特異性聚合酶或復(fù)制體、以及反應(yīng)溫度。在某些實(shí)施方案中，反應(yīng)溫度可以是約10℃至35℃。在其它實(shí)施方案中，反應(yīng)溫度可以是約15℃至30℃。在其它實(shí)施方案中，反應(yīng)溫度可以是約20℃至25℃。在某些實(shí)施方案中，在選擇的時(shí)間間隔內(nèi)升高溫度。舉例來說而不限于，將反應(yīng)在10℃維持五分鐘，然后在15℃維持五分鐘，在20℃維持五分鐘，然后在25℃維持五分鐘，并且在30℃維持五分鐘。被稱作“復(fù)制體”的復(fù)制復(fù)合體可以在體外形成以通過制備復(fù)制的啞鈴狀模板或擴(kuò)增的啞鈴狀模板的更多拷貝和/或復(fù)制或擴(kuò)增更大的啞鈴狀模板(即具有>1kb、>5kb、>10kb以及>50kb的尺寸)來增強(qiáng)滾環(huán)方法。包括解旋酶、單鏈結(jié)合蛋白、拓?fù)洚悩?gòu)酶以及反向旋轉(zhuǎn)酶的鏈置換輔助蛋白可以與鏈置換聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶以任何組合配置成形成用于啞鈴狀模板的滾環(huán)方法的復(fù)制型或擴(kuò)增型復(fù)制體復(fù)合體。在某些實(shí)施方案中，在適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件下φ29DNA聚合酶和φ29單鏈結(jié)合蛋白的組合可以使?jié)L環(huán)機(jī)制的伸長作用增強(qiáng)數(shù)倍。在某些實(shí)施方案中，依賴解旋酶和單鏈結(jié)合蛋白的協(xié)同活性的聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶的組合可以用于滾環(huán)方法中以復(fù)制10kb或更大的啞鈴狀模板或擴(kuò)增10kb或更大的啞鈴狀模板。舉例來說而不限于，可以通過形成復(fù)制體復(fù)合體，使用T7測序酶、T7解旋酶以及T7單鏈結(jié)合蛋白的協(xié)同活性來擴(kuò)增10kb質(zhì)粒。本發(fā)明的某些實(shí)施方案包括用高度持續(xù)性固相RCR系統(tǒng)高效形成10kb尺寸的雙重發(fā)夾啞鈴狀物。在某些方面，獨(dú)特選擇的方法特異性雙重發(fā)夾啞鈴狀模板是以非尺寸依賴性的和緊密分布的方式(即10kb±1kb)形成的，從而允許信息性下游生物信息學(xué)處理以進(jìn)行從頭組裝。啞鈴狀模板的形成消除了對大量的起始基因組DNA的需要，這是因?yàn)檫@些構(gòu)建體是用簡單的工作流程高效制備的(即分子間連接對比分子內(nèi)連接)。在使用通常以微量獲得的臨床樣品時(shí)，這是一個(gè)重要的考慮因素。本發(fā)明的實(shí)施方案還提供了固相RCR的開發(fā)和優(yōu)化，放寬了由可供使用的聚合酶所施加的當(dāng)前的尺寸限制，這代表了NGS技術(shù)中的技術(shù)突破。這些創(chuàng)新的大模板高密度陣列將使得能夠真正從頭組裝復(fù)雜的、新型的和疾病基因組以用于研究應(yīng)用、臨床應(yīng)用、以及診斷應(yīng)用，并且還容許更全面的系統(tǒng)生物學(xué)研究以研究全基因組DNA-DNA、DNA-RNA、以及DNA-蛋白質(zhì)相互作用。與基質(zhì)連接的復(fù)制的啞鈴狀模板和擴(kuò)增的啞鈴狀模板(即復(fù)制的啞鈴狀模板陣列或擴(kuò)增的啞鈴狀模板陣列)對于許多不同的目的可以是有用的，包括例如而不限于核酸測序的所有方面(即全基因組從頭測序；全基因組重新測序以用于序列變體檢測、結(jié)構(gòu)變體檢測、確定分子單倍型的相和/或分子計(jì)數(shù)以用于非整倍體檢測；基因集合、全外顯子組、或染色體區(qū)的靶向測序以用于序列變體檢測、結(jié)構(gòu)變體檢測、確定分子單倍型的相和/或分子計(jì)數(shù)以用于非整倍體檢測；以及其它靶向測序方法，如RNA-seq、Chip-seq、Methyl-seq等；所有類型的測序活動在此被廣義地定義為“測序”)。復(fù)制的啞鈴狀模板陣列和擴(kuò)增的啞鈴狀模板陣列還可用于形成核酸分子陣列以研究核酸-核酸結(jié)合相互作用、核酸-蛋白質(zhì)結(jié)合相互作用(即定量地測量蛋白質(zhì)-DNA親和力的熒光配體相互作用表征)；以及核酸分子表達(dá)陣列(即以將2'-脫氧核糖核酸分子轉(zhuǎn)錄成核糖核酸分子，在此被定義為“核糖核酸模板陣列”)以研究核酸結(jié)構(gòu)/功能關(guān)系。在某些實(shí)施方案中，結(jié)構(gòu)/功能陣列可用于測試可以干擾核糖核酸模板陣列的一種或多種結(jié)構(gòu)/功能關(guān)系的小分子抑制劑或激活劑或核酸治療劑的作用，例如而不限于治療性反義RNA、核糖酶、適體、以及小干擾RNA；以及檢測核酸-核酸結(jié)合相互作用和核酸-蛋白質(zhì)結(jié)合相互作用。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，核糖核酸模板陣列可以進(jìn)一步被翻譯成它們相應(yīng)的氨基酸序列，在此被定義為“蛋白質(zhì)陣列”，所述蛋白質(zhì)陣列可用于例如而不限于研究蛋白質(zhì)-核酸結(jié)合相互作用和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)結(jié)合相互作用；篩選對一種或多種相關(guān)的蛋白質(zhì)受體具有特異性的配體(特別是孤兒配體)；對可以干擾蛋白質(zhì)陣列的一種或多種結(jié)構(gòu)/功能關(guān)系的小分子抑制劑或激活劑或核酸治療劑進(jìn)行藥物篩選，例如而不限于治療性反義RNA、核糖酶、適體、和小干擾RNA。在某些實(shí)施方案中，復(fù)制的啞鈴狀模板陣列和擴(kuò)增的啞鈴狀模板陣列可以通過提供超出單目的用途以外的另外的信息而可用于不僅僅一個(gè)目的，例如而不限于全基因組從頭測序，繼而檢測核酸-蛋白質(zhì)結(jié)合相互作用以鑒定序列特異性核酸-蛋白質(zhì)基序。相對于依賴固相方法來擴(kuò)增700bp或更小的片段的DNA陣列，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)勢在于復(fù)制或擴(kuò)增至少>1kb，或優(yōu)選地>5kb，或更優(yōu)選地10kb，并且最優(yōu)選地50kb的大核酸分子。具有增加的模板尺寸的復(fù)制的啞鈴狀模板陣列和擴(kuò)增的啞鈴狀模板陣列能夠提供進(jìn)一步的信息，如沿著核酸分子，兩個(gè)或更多個(gè)核酸-蛋白質(zhì)結(jié)合相互作用事件的協(xié)同遠(yuǎn)程相互作用?，F(xiàn)在下文將參考附圖更充分地描述本發(fā)明，其中展示了本發(fā)明的實(shí)施方案。然而，這些發(fā)明可以許多不同的形式被實(shí)施，而不應(yīng)當(dāng)被視為限于本文所闡述的示例性實(shí)施方案；相反，提供這些實(shí)施方案以使得本公開將是透徹和完整的，并且將向本領(lǐng)域技術(shù)人員充分傳達(dá)本發(fā)明的范圍。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，經(jīng)由啞鈴狀模板高效產(chǎn)生環(huán)狀DNA分子已經(jīng)與固相滾環(huán)復(fù)制組合以形成克隆復(fù)制的大插入序列(具有10kb的尺寸)的復(fù)制的啞鈴狀模板，所述模板與上文所述的許多不同的目的相容。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，經(jīng)由啞鈴狀模板高效產(chǎn)生環(huán)狀DNA分子已經(jīng)與固相滾環(huán)擴(kuò)增組合以形成克隆擴(kuò)增的大插入序列(具有10kb的尺寸)的擴(kuò)增的啞鈴狀模板，所述模板與上文所述的許多不同的目的相容。啞鈴狀模板高效地形成并且不依賴于片段化的核酸分子尺寸，從而克服了當(dāng)前的下一代測序方法中顯著的限制。使用啞鈴狀模板的滾環(huán)復(fù)制方法或滾環(huán)擴(kuò)增方法克服了在諸如乳液PCR和固相擴(kuò)增的其它固相擴(kuò)增方法中所觀測到的片段化的核酸分子尺寸的主要限制。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是一種復(fù)制至少一個(gè)啞鈴狀模板的方法，所述方法包括以下步驟：將至少一個(gè)核酸分子片段化以形成至少一個(gè)片段化的核酸分子；使用連接劑使一個(gè)或多個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)連接到所述至少一個(gè)片段化的核酸分子的每一個(gè)末端以形成至少一個(gè)啞鈴狀模板；使所述至少一個(gè)啞鈴狀模板與至少一種基本上互補(bǔ)的引物接觸，其中所述至少一種基本上互補(bǔ)的引物與至少一種基質(zhì)連接；以及在與所述至少一種基本上互補(bǔ)的引物接觸的所述至少一個(gè)啞鈴狀模板上進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制以形成至少一個(gè)復(fù)制的啞鈴狀模板。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是一種擴(kuò)增至少一個(gè)啞鈴狀模板的方法，所述方法包括以下步驟：將至少一個(gè)核酸分子片段化以形成至少一個(gè)片段化的核酸分子；使用連接劑使一個(gè)或多個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)連接到所述至少一個(gè)片段化的核酸分子的每一個(gè)末端以形成至少一個(gè)啞鈴狀模板；使所述至少一個(gè)啞鈴狀模板與至少兩種基本上互補(bǔ)的引物接觸，其中所述至少一種基本上互補(bǔ)的引物與至少一種基質(zhì)連接；以及在與所述至少一種基本上互補(bǔ)的引物接觸的所述至少一個(gè)啞鈴狀模板上進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增以形成至少一個(gè)擴(kuò)增的啞鈴狀模板。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是一種檢測至少一個(gè)復(fù)制的啞鈴狀模板的方法，所述方法包括以下步驟：將至少一個(gè)核酸分子片段化以形成至少一個(gè)片段化的核酸分子；使用連接劑使一個(gè)或多個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)連接到所述至少一個(gè)片段化的核酸分子的每一個(gè)末端以形成至少一個(gè)啞鈴狀模板；使所述至少一個(gè)啞鈴狀模板與至少一種基本上互補(bǔ)的引物接觸，其中所述至少一種基本上互補(bǔ)的引物與至少一種基質(zhì)連接；在與所述至少一種基本上互補(bǔ)的引物接觸的所述至少一個(gè)啞鈴狀模板上進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制以形成至少一個(gè)復(fù)制的啞鈴狀模板；以及檢測所述至少一個(gè)復(fù)制的啞鈴狀模板。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述檢測所述至少一個(gè)復(fù)制的啞鈴狀模板的步驟由對所述至少一個(gè)復(fù)制的啞鈴狀模板進(jìn)行測序組成。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是一種檢測至少一個(gè)擴(kuò)增的啞鈴狀模板的方法，所述方法包括以下步驟：將至少一個(gè)核酸分子片段化以形成至少一個(gè)片段化的核酸分子；使用連接劑使一個(gè)或多個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)連接到所述至少一個(gè)片段化的核酸分子的每一個(gè)末端以形成至少一個(gè)啞鈴狀模板；使所述至少一個(gè)啞鈴狀模板與至少兩種基本上互補(bǔ)的引物接觸，其中所述至少一種基本上互補(bǔ)的引物與至少一種基質(zhì)連接；在與所述至少一種基本上互補(bǔ)的引物接觸的所述至少一個(gè)啞鈴狀模板上進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增以形成至少一個(gè)擴(kuò)增的啞鈴狀模板；以及檢測所述至少一個(gè)擴(kuò)增的啞鈴狀模板。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述檢測所述至少一個(gè)擴(kuò)增的啞鈴狀模板的步驟由對所述至少一個(gè)擴(kuò)增的啞鈴狀模板進(jìn)行測序組成。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是一種復(fù)制至少一個(gè)啞鈴狀模板的方法，所述方法包括以下步驟：從樣品中分離至少一個(gè)核酸分子；將至少一個(gè)核酸分子片段化以形成至少一個(gè)片段化的核酸分子；使用連接劑使一個(gè)或多個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)連接到所述至少一個(gè)片段化的核酸分子的每一個(gè)末端以形成至少一個(gè)啞鈴狀模板；使所述至少一個(gè)啞鈴狀模板與至少一種基本上互補(bǔ)的引物接觸，其中所述至少一種基本上互補(bǔ)的引物與至少一種基質(zhì)連接；以及在與所述至少一種基本上互補(bǔ)的引物接觸的所述至少一個(gè)啞鈴狀模板上進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制以形成至少一個(gè)復(fù)制的啞鈴狀模板。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是一種擴(kuò)增至少一個(gè)啞鈴狀模板的方法，所述方法包括以下步驟：從樣品中分離至少一個(gè)核酸分子；將至少一個(gè)核酸分子片段化以形成至少一個(gè)片段化的核酸分子；使用連接劑使一個(gè)或多個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)連接到所述至少一個(gè)片段化的核酸分子的每一個(gè)末端以形成至少一個(gè)啞鈴狀模板；使所述至少一個(gè)啞鈴狀模板與至少兩種基本上互補(bǔ)的引物接觸，其中所述至少一種基本上互補(bǔ)的引物與至少一種基質(zhì)連接；以及在與所述至少一種基本上互補(bǔ)的引物接觸的所述至少一個(gè)啞鈴狀模板上進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增以形成至少一個(gè)擴(kuò)增的啞鈴狀模板。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是一種復(fù)制至少一個(gè)核酸分子的方法，所述方法包括以下步驟：從樣品中分離至少一個(gè)核酸分子；使用連接劑使一個(gè)或多個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)連接到所述至少一個(gè)核酸分子的每一個(gè)末端以形成至少一個(gè)啞鈴狀模板；使所述至少一個(gè)啞鈴狀模板與至少一種基本上互補(bǔ)的引物接觸，其中所述至少一種基本上互補(bǔ)的引物與至少一種基質(zhì)連接；以及在與所述至少一種基本上互補(bǔ)的引物接觸的所述至少一個(gè)啞鈴狀模板上進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制以形成至少一個(gè)復(fù)制的啞鈴狀模板。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是一種擴(kuò)增至少一個(gè)核酸分子的方法，所述方法包括以下步驟：從樣品中分離至少一個(gè)核酸分子；使用連接劑使一個(gè)或多個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)連接到所述至少一個(gè)核酸分子的每一個(gè)末端以形成至少一個(gè)啞鈴狀模板；使所述至少一個(gè)啞鈴狀模板與至少兩種基本上互補(bǔ)的引物接觸，其中所述至少一種基本上互補(bǔ)的引物與至少一種基質(zhì)連接；以及在與所述至少一種基本上互補(bǔ)的引物接觸的所述至少一個(gè)啞鈴狀模板上進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增以形成至少一個(gè)擴(kuò)增的啞鈴狀模板。雖然在本文已經(jīng)在著重于實(shí)施方案的情況下描述了實(shí)施方案，但是應(yīng)當(dāng)了解的是，在所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)，所述實(shí)施方案可能以除如本文具體所述以外的方式被實(shí)施。盡管本發(fā)明已僅以它的幾種形式被展示，但是對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說應(yīng)當(dāng)顯而易見的是，本發(fā)明不限于此，但是在不脫離本發(fā)明的范圍的情況下容許各種改變。因此，意圖涵蓋落入所附權(quán)利要求書的精神和廣泛范圍內(nèi)的所有這些替代方案、改動方案以及變化方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到的是，可以對實(shí)施本發(fā)明的方法作出許多變化和改動而不脫離本發(fā)明的范圍和精神。在附圖和說明書中，已經(jīng)公開了本發(fā)明的實(shí)施方案，并且盡管使用了特定的術(shù)語，但是它們僅僅是以一般性和描述性的意義使用的而不是用于限制的目的，本發(fā)明的范圍闡述于以下權(quán)利要求書中。已經(jīng)具體參考這些所示的實(shí)施方案相當(dāng)詳細(xì)地描述了本發(fā)明。然而，將顯而易見的是，可以在如前述說明書中所述的本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)作出各種改動和變化。此外，涉及順序的語言，如第一和第二，應(yīng)當(dāng)在示例性意義上而不是在限制性意義上被理解。舉例來說，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以認(rèn)識到的是，某些步驟可以被組合成單個(gè)步驟。實(shí)施例以下實(shí)施例進(jìn)一步說明了組合物和方法。實(shí)施例1證實(shí)含有兩種不同的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的啞鈴狀模板的非尺寸依賴性。使用一組引物(即正向：5'-GGATCCGAATTCGCTGAAGCCAGTTACCTTCG和反向：5'-GGATCCGAATTCAGCCCTCCCGTATCGTAGTT)擴(kuò)增樣品DNA，即pUC18載體以得到具有425個(gè)堿基對的產(chǎn)物。每一個(gè)引物的5'-末端均含有BamHI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)和EcoRI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。然后使用EcoRI消化PCR產(chǎn)物以提供5'-AATT突出端并且用QIAquickPCR純化試劑盒純化。通過加熱到50℃，繼而冷卻，從而允許寡核苷酸在加下劃線的序列處自退火，進(jìn)而產(chǎn)生5'-AATT突出端以形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)1(5'-AATTGCGAGTTGCGAGTTGTAAAACGACGGCCAGTCTCGC)。環(huán)結(jié)構(gòu)含有M13通用引物序列。將發(fā)夾結(jié)構(gòu)1和pUC18PCR產(chǎn)物分別以10:1摩爾比組合，并且在37℃用5單位的T4多核苷酸激酶處理40分鐘，在16℃用400粘性末端單位的T4DNA連接酶連接30分鐘，然后在65℃滅活10分鐘以形成啞鈴狀模板。當(dāng)變性時(shí)，所述啞鈴狀模板變成單鏈環(huán)。使用QIAquickPCR清除試劑盒將啞鈴狀模板純化以去除過量的未連接的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。使用M13引物的反向互補(bǔ)序列(RC)對啞鈴狀模板進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制，如圖1中所示。在此，通過在20μL反應(yīng)中在含有200μM的dNTP和200μg/mL的BSA的φ29反應(yīng)緩沖液中加熱到94℃，持續(xù)5分鐘并且冷卻到57℃，持續(xù)1分鐘來使2μM的M13-RC引物(5'-ACTGGCCGTCGTTTTACAA)和M13對照引物(5'-TTGTAAAACGACGGCCAGT)分別與約10ng的pUC18啞鈴狀模板退火。將反應(yīng)進(jìn)一步冷卻到30℃，此時(shí)將10單位的φ29DNA聚合酶添加到引發(fā)的啞鈴狀模板中并且孵育30分鐘，繼而在65℃熱滅活10分鐘。作為對照，將正常的M13通用測序引物在單獨(dú)的滾環(huán)復(fù)制混合物中孵育。然后通過凝膠電泳分析復(fù)制的啞鈴狀模板。如圖2中所示，M13-RCR產(chǎn)物(泳道2)產(chǎn)生高分子量產(chǎn)物(孔中的上部條帶)，而M13對照沒有產(chǎn)生可見的滾環(huán)復(fù)制產(chǎn)物。泳道2中的結(jié)果證實(shí)了滾環(huán)復(fù)制方法形成高分子量啞鈴狀模板。上文所示的方法只是使發(fā)夾結(jié)構(gòu)連接到片段化的核酸分子的末端的一種方式。舉例來說而不限于，還可以通過TA克隆和平端連接來連接發(fā)夾結(jié)構(gòu)，如具有“T”-突出端的發(fā)夾結(jié)構(gòu)2(5'-TGCGAGTTGCGAGTTGTAAAACGACGGCCAGTCTCGC)。還可以用NEBNextdA加尾試劑盒處理425bp的pUC18PCR擴(kuò)增子以使“dA”殘基連接在DNA片段的3'-末端處。然后將pUC18擴(kuò)增子和發(fā)夾結(jié)構(gòu)2磷酸化并且使用上文所述的方法連接在一起以形成啞鈴狀模板。這種方法集成到用于全基因組樣品的大部分的下一代測序文庫構(gòu)建方法中。實(shí)施例2也可以使用基因組DNA作為起始樣品。舉例來說而不限于，可以從卡瑞爾細(xì)胞庫(CoriellCellRepositories)獲得來自HapMap樣品NA18507的純化的基因組DNA并且使用標(biāo)準(zhǔn)的下一代測序方法(即使用CovarisE210R裝置)將其剪切，然后以0.5kb、1.0kb、2.5kb、5.0kb、7.5kb、以及10.0kb的尺寸增量對片段進(jìn)行尺寸選擇。類似于上文所述，可以對DNA樣品進(jìn)行片段化以產(chǎn)生不同尺寸的DNA片段，對片段的起始數(shù)量進(jìn)行定量，使用相同條件連接hpA/hpB，并且富集hpA-片段-hpB啞鈴狀模板。將使用雙標(biāo)記熒光顯微術(shù)來計(jì)數(shù)共定位熒光信號并且將該數(shù)與熒光信號的總數(shù)相比較來確定富集因子。NikonEclipse顯微鏡分析工具可以進(jìn)行許多分析，包括強(qiáng)度測量、多個(gè)熒光信號的共定位、以及如核心包項(xiàng)目中所包括的其它分析。在這個(gè)實(shí)施例中，在稀釋限制性內(nèi)切酶反應(yīng)中使用EcoR1消化500ng的正常人基因組DNA(密理博公司(Millipore))，繼而在65℃滅活。使在任一末端含有5'-AATT突出端的這些片段連接到穩(wěn)定和獨(dú)特的發(fā)夾結(jié)構(gòu)HP1。通過在高鹽緩沖液中加熱到95℃，繼而在冰上快速冷卻，從而允許寡核苷酸在加下劃線的序列處自退火，進(jìn)而得到5'-AATT突出端以形成HP1(5'-AATTGCGAGTTGCGAGTTGTAAAACGACGGCCAGTCTCGC)。將HP1和消化的基因組DNA分別以10:1摩爾比組合，并且在16℃使用400粘性末端單位的T4DNA連接酶連接30分鐘，然后在65℃滅活10分鐘以形成啞鈴狀模板，參見圖3。稀釋消化和HP1連接產(chǎn)生具有約20kb至1kb范圍的尺寸的啞鈴狀模板DNA的彌散帶(smear)。對啞鈴狀模板進(jìn)行凝膠純化以去除過量的未連接的和自連接的HP1銜接子，并且進(jìn)行尺寸選擇以分離三個(gè)不同的片段尺寸，即10kb-6kb、6kb-3kb、以及3kb-2kb。HP1的環(huán)結(jié)構(gòu)含有M13通用引物序列。使用M13引物的反向互補(bǔ)序列(RC)對啞鈴狀模板進(jìn)行RCR(即使用一種引物)，參見圖3。在此，通過在20μL反應(yīng)物中在含有200μM的dNTP和200μg/mL的BSA的φ29反應(yīng)緩沖液中加熱到94℃，持續(xù)5分鐘并且冷卻到45℃，持續(xù)2分鐘來使2μM的M13-RC引物和M13對照引物(未示)分別與約10ng的經(jīng)過尺寸選擇的基因組DNA啞鈴狀模板退火。將反應(yīng)物進(jìn)一步冷卻到30℃，此時(shí)將10單位的φ29DNA聚合酶添加到引發(fā)的環(huán)中并且孵育60分鐘，繼而在65℃熱滅活10分鐘。通過瓊脂糖凝膠電泳分析起始物質(zhì)和最終物質(zhì)。如圖4中所示，將EcoR1消化的連接HP1的基因組DNA上樣到泳道1的孔中。將經(jīng)過尺寸選擇和純化的啞鈴狀模板上樣到泳道2、泳道3、以及泳道4的孔中。被上樣到泳道5、泳道6、以及泳道7中的RCR產(chǎn)物似乎是在凝膠電泳后保留在孔中的不動的復(fù)合物。預(yù)期的M13-RCRCR產(chǎn)物產(chǎn)生高分子量產(chǎn)物(圖4的泳道5、泳道6、以及泳道7的孔中的上部條帶)，而M13對照沒有產(chǎn)生可見的RCR產(chǎn)物(未示)。圖4的泳道5、泳道6、以及泳道7中的結(jié)果證實(shí)了使用啞鈴狀模板形成高分子量DNA的RCR方法。實(shí)施例3還從大的片段化的dA加尾的基因組DNA形成復(fù)制的啞鈴狀模板。在此，通過TA克隆和平端連接來連接發(fā)夾。TA克隆方法很好地集成到大部分當(dāng)前的NGS平臺中。我們已經(jīng)設(shè)計(jì)了具有“T”-突出端的發(fā)夾2(HP2)(5'-/Phos-CTTTTTCTTTCTTTTCTGGGTTGCGTCTGTTCGTCTAGAAAAGAAAGAAAAAGT)。使用CovarisG-管將人類基因組DNA(500ng)片段化以實(shí)現(xiàn)嚴(yán)格限定的片段長度群體，如圖5的泳道1和泳道2中所示。然后使用NEBNextUltraDNA文庫制備試劑盒的末端制備模塊對這一基因組DNA進(jìn)行末端修復(fù)和dA加尾。類似于HP1使HP2自退火，并且使用平端/TA連接酶主混合物(Blunt/TALigaseMaterMix)(5:1摩爾比)連接到修復(fù)的基因組DNA。使用核酸外切酶III和VII去除過量的HP2和未連接的基因組DNA。使用Qiaexii珠粒將所得的啞鈴狀模板純化并且類似于先前所述的反應(yīng)進(jìn)行使用獨(dú)特引物(5'-AAAAAAACAGACGCAACCC)的RCR反應(yīng)。如圖5中所示，兩個(gè)片段化的基因組DNA群體顯示出CovarisG-管的高度可調(diào)的片段化能力(泳道1和泳道2)。由末端修復(fù)的dA加尾的連接HP2的片段產(chǎn)生的RCR產(chǎn)物仍為在凝膠電泳后保留在孔中的高度不動的復(fù)合物(泳道3和泳道4)。實(shí)施例4在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，將約20μL的高分子量正常人基因組DNA(gDNA)(100ng/μL)與130μL的HPLC級H2O組合，并且將總共150μL吸移到CovarisG-管中。首先以5600RCF(即相對離心力)將所述管離心1分鐘，然后使G-管的取向反轉(zhuǎn)并且以5600RCF離心1分鐘。這產(chǎn)生基因組DNA的約8千堿基-10千堿基的片段，如圖6的泳道2中所示。基因組DNA樣品還可以使用本領(lǐng)域已知的多種方法來片段化，包括但不限于使用新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室公司(NewEnglandBiolabs，NEB)的片段化酶、核酸酶、以及限制性內(nèi)切酶的酶促片段化；使用機(jī)械力的片段化，如經(jīng)由小號針進(jìn)行的針剪切、超聲處理、點(diǎn)匯剪切、霧化、聲學(xué)片段化、以及轉(zhuǎn)座體介導(dǎo)的片段化。然后使用多種手段中的一種，如在突出的5'-末端和3'-末端處去除或摻入核苷酸、5'磷酸化、以及dA加尾來將片段化的DNA的末端制備用于與適當(dāng)?shù)你暯宇^連接。將如上文所制備的約55.5μL的于H2O中的片段化的gDNA與6.5μL的10×末端修復(fù)緩沖液(NEB)和3μL的末端制備酶混合物(NEB)組合并且等分到熱循環(huán)儀微型管中。然后將這一反應(yīng)混合物在20℃孵育30分鐘，繼而在65℃孵育30分鐘。通過將反應(yīng)管放在冰上或放在4℃將反應(yīng)物冷卻并且準(zhǔn)備用于隨后的步驟。由線性寡核苷酸形成發(fā)夾銜接子。將凍干的銜接子在HPLCH2O中復(fù)原到100μM。將以下組分在微量離心管中組合：10μL的100μM銜接子原液、5μL的10×末端修復(fù)緩沖液(NEB)、1μL的500mMNaCl、以及34μL的HPLCH2O。將混合物在95℃孵育15分鐘，然后立即移到4℃。通過使發(fā)夾銜接子連接到片段化的末端修復(fù)的gDNA的每一個(gè)末端上來形成啞鈴狀模板。將以下組分組合以形成樣品反應(yīng)混合物：65μL如上文所述的具有修復(fù)末端的片段化的gDNA、3μL如上文所述制備的20μM銜接子、15μL的平端/TA連接主混合物(NEB)以及3μL的HPLCH2O。使這一連接反應(yīng)在20℃進(jìn)行1小時(shí)至16小時(shí)，然后立即移到4℃。對未連接的銜接頭和未連接的片段化的DNA進(jìn)行核酸外切酶消化。將以下組分組合以形成樣品反應(yīng)混合物：1μL的10×核酸外切酶VII緩沖液(NEB)、1μL的核酸外切酶VII、1μL的核酸外切酶III、以及7μL的HPLCH2O。將這一混合物添加到含有啞鈴狀模板、未連接的銜接頭、以及具有游離末端的片段化的DNA的連接反應(yīng)混合物中。將所得的反應(yīng)混合物在37℃孵育1小時(shí)，然后在95℃孵育10分鐘，然后轉(zhuǎn)移回到4℃。圖6是對如上文所述所制備的DNA產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠分析的實(shí)施例。泳道1示出了未片段化的基因組DNA；泳道2示出了在CovarisG-管中片段化后片段化的DNA；泳道3示出了在使銜接頭連接到1μg的片段化的DNA之后形成的產(chǎn)物；泳道4示出了在使銜接頭連接到500ng的片段化的DNA之后形成的產(chǎn)物；泳道5示出了在沒有任何銜接頭的情況下使1μg的片段化的DNA進(jìn)行連接反應(yīng)之后形成的產(chǎn)物；泳道6示出了在沒有片段化的DNA而只有銜接頭的情況下進(jìn)行連接反應(yīng)之后形成的產(chǎn)物；泳道7示出了在對通過使銜接頭連接到1μg的片段化的DNA所獲得的產(chǎn)物進(jìn)行核酸外切酶消化之后形成的產(chǎn)物；泳道8示出了在用ExoIII和ExoVII對通過使銜接頭連接到500ng的片段化的DNA所獲得的產(chǎn)物進(jìn)行核酸外切酶消化之后形成的產(chǎn)物；泳道9示出了在用ExoIII和ExoVII對在沒有任何銜接頭的情況下進(jìn)行連接反應(yīng)的片段化的DNA進(jìn)行核酸外切酶消化之后形成的產(chǎn)物；泳道10示出了在用ExoIII和ExoVII對在沒有片段化的DNA而只有銜接頭的情況下進(jìn)行連接反應(yīng)所獲得的產(chǎn)物進(jìn)行核酸外切酶消化之后形成的產(chǎn)物。泳道11示出了片段化的基因組DNA和沒有連接的銜接子的消化對照。還對DNA樣品進(jìn)行濃縮以去除鹽并且濃縮核酸外切酶抗性啞鈴狀模板。用約4μL的HPLCH2O將核酸外切酶消化之后反應(yīng)混合物的體積調(diào)整到100μL溶液。將約10μL的3M乙酸鈉(pH5.2)和5μL的糖原(20mg/mL)添加到所述溶液中，繼而添加115μL的冷100％異丙醇。將這一反應(yīng)混合物在-20℃冷藏>1小時(shí)，然后在室溫以10RCF離心20分鐘。抽吸上清液并且用70％乙醇洗滌沉淀物。將最終的沉淀物干燥約15分鐘，然后重懸在30μL的10μMTris-HCl(pH8.0)中。圖7是對如上文所述所制備的DNA產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠分析的實(shí)例。泳道1示出了在使銜接頭10.1連接到片段化的DNA并且隨后進(jìn)行乙醇沉淀之后形成的產(chǎn)物；泳道2示出了在使銜接頭2.1連接到片段化的DNA并且隨后進(jìn)行乙醇沉淀之后形成的產(chǎn)物；泳道3示出了在沒有銜接頭的情況下使片段化的DNA進(jìn)行連接反應(yīng)并且隨后進(jìn)行乙醇沉淀之后形成的產(chǎn)物；泳道4示出了在沒有片段化的DNA的情況下僅使銜接頭10.1進(jìn)行連接反應(yīng)并且隨后進(jìn)行乙醇沉淀之后沒有形成產(chǎn)物；泳道5示出了在沒有片段化的DNA的情況下僅使銜接頭2.1進(jìn)行連接反應(yīng)并且隨后進(jìn)行乙醇沉淀之后沒有形成產(chǎn)物；泳道6示出了在沒有片段化的DNA和銜接頭的情況下進(jìn)行連接反應(yīng)并且隨后進(jìn)行乙醇沉淀之后沒有形成產(chǎn)物。還對啞鈴狀模板進(jìn)行尺寸選擇。通過瓊脂糖凝膠電泳分離具有所期望的尺寸的核酸外切酶抗性啞鈴狀模板以使任何不希望有的產(chǎn)物，如銜接子-銜接子連接產(chǎn)物的殘留減到最低限度。制備0.8％(重量/體積)1×TAE瓊脂糖凝膠。制備含有適量的DNA上樣染料的濃縮的啞鈴狀模板并且將約20μL的濃縮啞鈴狀模板上樣到瓊脂糖凝膠上。在足以分離產(chǎn)物的時(shí)間之后，將凝膠用SybrSafe凝膠染色劑染色，并且在燈箱上可視化。使用無菌手術(shù)刀切下含有所期望的尺寸范圍的啞鈴狀模板的凝膠區(qū)段。使用Qiaexii分離方案分離啞鈴狀模板并且重懸在30μL的H2O中。然后使用高度持續(xù)性鏈置換聚合酶對啞鈴狀模板進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制。用以下組分配制第一反應(yīng)混合物：5μL的經(jīng)過尺寸選擇的啞鈴狀模板、1.5μL的10×phi29聚合酶緩沖液(NEB)、1μL的啞鈴狀模版互補(bǔ)引物、0.5μL的牛血清白蛋白(BSA)-100mg/mL、以及7μL的HPLCH2O。將反應(yīng)混合物在95℃孵育10分鐘，冷卻到45℃，持續(xù)5分鐘，然后進(jìn)一步冷卻到20℃。使用以下組分配制第二反應(yīng)混合物：1μL的10×phi29聚合酶緩沖液(NEB)、5μL的10mMdNTP混合物、0.5μL的phi29聚合酶、以及3.5μL的HPLCH2O。將如上文所述處理后的第一反應(yīng)混合物和第二反應(yīng)混合物組合并且在25℃孵育1小時(shí)-4小時(shí)。然后，將所得混合物加熱到65℃，持續(xù)20分鐘以滅活聚合酶。然后通過瓊脂糖凝膠電泳分析滾環(huán)復(fù)制產(chǎn)物。由于它們的高分子量，因此在電泳后這些滾環(huán)復(fù)制產(chǎn)物存在于孔中而未進(jìn)入凝膠。某些另外的早期終止產(chǎn)物也是可見的。圖8是對通過對圖6中所分析的產(chǎn)物進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制所制備的DNA產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠分析的實(shí)例。泳道1示出了從圖6的泳道7切下的產(chǎn)物的低效滾環(huán)反應(yīng)。泳道2示出了在對從圖6的泳道8切下的產(chǎn)物進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制之后獲得的滾環(huán)產(chǎn)物，所述產(chǎn)物為在凝膠電泳后保留在孔中的高度不動的復(fù)合物。泳道3示出了在對從圖6的泳道9切下的產(chǎn)物進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制之后沒有獲得滾環(huán)產(chǎn)物。泳道4示出了在對從圖6的泳道10切下的產(chǎn)物進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制之后沒有獲得滾環(huán)產(chǎn)物。泳道5示出了在不存在DNA的情況下進(jìn)行的滾環(huán)反應(yīng)沒有獲得滾環(huán)產(chǎn)物。泳道6示出了用片段化的DNA產(chǎn)物進(jìn)行的滾環(huán)反應(yīng)沒有獲得滾環(huán)產(chǎn)物，這表明沒有從片段化的DNA的隨機(jī)引發(fā)。圖9是對通過對圖7中所分析的產(chǎn)物進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制所制備的DNA產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠分析的實(shí)例。泳道1示出了在對圖7的泳道1中所分析的經(jīng)過尺寸選擇的產(chǎn)物進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制之后獲得的滾環(huán)產(chǎn)物。在凝膠電泳后保留在孔中的不動復(fù)合物指示成功的RCR產(chǎn)物。泳道2示出了在對圖7的泳道2中所分析的經(jīng)過尺寸選擇的產(chǎn)物進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制之后獲得的滾環(huán)產(chǎn)物。泳道3示出了在對圖7的泳道3中所分析的經(jīng)過尺寸選擇的產(chǎn)物進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制之后沒有獲得滾環(huán)產(chǎn)物。泳道4示出了在對圖7的泳道4中所分析的經(jīng)過尺寸選擇的產(chǎn)物進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制之后沒有獲得滾環(huán)產(chǎn)物。泳道5示出了在對圖7的泳道5中所分析的經(jīng)過尺寸選擇的產(chǎn)物進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制之后沒有獲得滾環(huán)產(chǎn)物。泳道6示出了在對圖7的泳道6中所分析的經(jīng)過尺寸選擇的產(chǎn)物進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制之后沒有獲得滾環(huán)產(chǎn)物。泳道7、泳道8以及泳道9示出了在對照反應(yīng)中沒有獲得滾環(huán)產(chǎn)物，在所述對照反應(yīng)中，在沒有連接的情況下向滾環(huán)反應(yīng)提供片段化的DNA(泳道7)；在沒有引物的情況下向滾環(huán)反應(yīng)提供片段化的DNA(泳道8)；以及在沒有連接的情況下沒有向滾環(huán)反應(yīng)提供片段化的DNA(泳道9)。實(shí)施例5還可以通過使用針對啞鈴狀模板的發(fā)夾序列的互補(bǔ)區(qū)的分子探針或信標(biāo)來檢測滾環(huán)復(fù)制產(chǎn)物。為了證實(shí)這種方法的可行性，形成H3發(fā)夾銜接子的滴定系列，濃度在0μM至5μM的范圍。將10μMH3發(fā)夾的原液連續(xù)稀釋以實(shí)現(xiàn)2倍測試濃度。發(fā)夾銜接頭3(H3)具有以下序列：5'PO4-AATTGCGAGCTATGACCATGATTACGCCACTGGCCGTCGTTTTACAACTCGC舉例來說，將10μM的原液稀釋成一半以實(shí)現(xiàn)5μM的測試樣品，將5μM的原液稀釋成一半以實(shí)現(xiàn)2.5μM的測試樣品，諸如此類。這些代表實(shí)際測試濃度的兩倍(2×)。然后將約5μL的2×H3銜接子濃縮液與1μL的NEBphi29反應(yīng)緩沖液10×、1μL的200μM信標(biāo)2、以及3μL的HPLCH2O組合。分子信標(biāo)2具有以下序列，并且“5,6-FAM”是5-FAM和6-FAM異構(gòu)體的混合物并且“IABkFQ”是IowaBlack猝滅劑：5'-/5,6-FAM/CGGAGTTGCGAGTTGTAAAACGACGGCCAGTCTCCG/3-IABkFQ在設(shè)置這一反應(yīng)混合物時(shí)，將測試樣品中H3的濃度降低到最終的1×測量濃度。然后將反應(yīng)混合物在熱板上加熱到98℃，在該溫度維持十分鐘，然后在臺面上緩慢冷卻。在關(guān)燈的情況下并且在用錫箔覆蓋反應(yīng)管以防止來自信標(biāo)的信號損失的情況下進(jìn)行所有的反應(yīng)和熱循環(huán)步驟。一旦冷卻到室溫，就準(zhǔn)備反應(yīng)以在MolecularDevicesSpectraMaxGeminiXPS熒光微孔板讀數(shù)器上進(jìn)行讀數(shù)。確切地說，使用SpectraDrop微孔板載片以有助于測量非常小的體積。將來自每一個(gè)滴定反應(yīng)的約2μL加到微體積載片上。一旦插入機(jī)器中，就在室溫運(yùn)行以下程序：激發(fā)波長：495nm發(fā)射波長：520nm6次閃爍/讀數(shù)收集并且處理原始數(shù)據(jù)，如圖10中所示。將0μM的RLU(相對發(fā)光單位)讀數(shù)從所有樣品中減去以通過消除背景熒光來歸一化。表1μM[H3]52.51.250.6250.31250.156250RFU134.896118.25796.35166.29753.1252.3446.489經(jīng)過調(diào)整88.40771.76849.86219.8086.6315.8510實(shí)施例6可以設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)以確定獨(dú)立于片段長度尺寸制備啞鈴狀模板的效率。當(dāng)前的大片段NGS文庫構(gòu)建方法的主要限制在于通過使長DNA片段的末端環(huán)化來形成配對模板。在理論上，高效形成啞鈴狀模板的能力應(yīng)當(dāng)具有非尺寸依賴性。這些啞鈴狀模板可以具有各種尺寸，包括例如而不限于0.5kb、1.0kb、2.5kb、5.0kb、7.5kb、或10.0kb。這些片段尺寸首先可以用PCR，通過使用人類BACDNA設(shè)計(jì)靶向同一個(gè)基因組區(qū)域的引物來產(chǎn)生。這種方法將允許使用實(shí)時(shí)PCR來定量不同尺寸的啞鈴狀模板的拷貝數(shù)。在一個(gè)實(shí)施例中，已經(jīng)形成用于TCF7L2rs7903146等位基因的實(shí)時(shí)PCR試劑，所述試劑是使用生命科技公司(LifeTechnologies)的定制TaqMan測定網(wǎng)站設(shè)計(jì)的。5'-引物序列是5'-CCTCAAACCTAGCACAGCTGTTAT，3'-引物序列是5'-TGAAAACTAAGGGTGCCTCATACG，并且探針序列是5'-CTTTTTAGATA[C/T]TATATAATTTAA。在其它實(shí)施例中，可以產(chǎn)生不同尺寸的片段，定量擴(kuò)增子的起始數(shù)量，使用相同條件連接發(fā)夾結(jié)構(gòu)2，然后用實(shí)時(shí)PCR定量啞鈴狀模板的拷貝數(shù)。在其它實(shí)驗(yàn)中，可以主要經(jīng)由兩種方法，即CovarisG-管和NEB片段化酶來形成限定的片段群體。隨后將根據(jù)本文所述的TA克隆方法來制備和分離啞鈴狀模板。可以使用與發(fā)夾序列雜交的分子信標(biāo)來使用熒光板讀數(shù)器定量不同尺寸的啞鈴狀模板的數(shù)量。這些實(shí)驗(yàn)證實(shí)啞鈴狀模板可以獨(dú)立于起始基因組DNA樣品的片段尺寸高效地形成。此外，還可以使用這些分子信標(biāo)來定量RCR產(chǎn)物和反應(yīng)效率。實(shí)施例7在NGS配對末端測序平臺中高效插入啞鈴狀模板需要在DNA模板的每一個(gè)末端上存在獨(dú)特的引物或發(fā)夾。這將經(jīng)由標(biāo)準(zhǔn)的末端修復(fù)/dA加尾方法，繼而連接兩個(gè)獨(dú)特的發(fā)夾寡核苷酸(即hpA和hpB)來實(shí)現(xiàn)，所述寡核苷酸各自含有獨(dú)特的通用復(fù)制/測序引發(fā)位點(diǎn)和分子信標(biāo)位點(diǎn)。在發(fā)夾連接后，我們期望由25％的hpA-片段-hpA、50％的hpA-片段-hpB、以及25％的hpB-片段-hpB構(gòu)成的群體?？梢酝ㄟ^捕捉探針色譜，通過首先使連接產(chǎn)物通過含有發(fā)夾A的反向互補(bǔ)序列的柱，從而捕捉hpA-片段-hpA模板和hpA-片段-hpB模板，但不捕捉hpB-片段-hpB模板來富集所期望的形式hpA-片段-hpB。在洗脫后，然后使部分富集的樣品通過含有發(fā)夾B的反向互補(bǔ)序列的第二柱，從而捕捉hpA-片段-hpB模板，但不捕捉hpA-片段-hpA模板。這種雙重發(fā)夾方法將使用與上文所概述類似的方法來證實(shí)；將形成圍繞0.5kb、1.0kb、2.5kb、5.0kb、7.5kb、以及10.0kb的獨(dú)特尺寸的DNA片段的群體，對它們進(jìn)行尺寸選擇、純化、末端修復(fù)以及dA加尾。然后將這些連接到hpA發(fā)夾和hpB發(fā)夾并且雙重標(biāo)記，將使用上述技術(shù)富集hpA-片段-hpB啞鈴狀模板。將進(jìn)行使用φ29DNA聚合酶和T7復(fù)制體系統(tǒng)的初步實(shí)驗(yàn)以使用基于溶液的分子信標(biāo)評估復(fù)制拷貝數(shù)對啞鈴狀模板尺寸的依賴性。實(shí)施例8可以優(yōu)化用于滾環(huán)擴(kuò)增的條件以包括適當(dāng)?shù)腄NA聚合酶、復(fù)制因子、以及反應(yīng)條件以使得可以支持10kb啞鈴狀模板的至少1,000倍復(fù)制。以1,000個(gè)拷貝的復(fù)制倍數(shù)作為目標(biāo)，這是因?yàn)檫@是在IlluminacBot儀器上實(shí)現(xiàn)的克隆擴(kuò)增的短模板的等同數(shù)目，并且因此，可以預(yù)期在測序過程期間所測量的熒光信號的類似水平?？梢圆捎靡唤MDNA聚合酶以用于長合成，包括可商購獲得的DNA聚合酶(LongAmp、Bst、Bst2.0、Q5、以及T7DNA聚合酶)、以及至少12種非市售的專有的家族A、B、以及DDNA聚合酶。此外，還可以使用一組復(fù)制輔助因子作為復(fù)制增強(qiáng)子?？梢蕴砑虞o助蛋白以提高所期望的滾環(huán)產(chǎn)物的產(chǎn)生效率，包括但不限于提高DNA聚合酶持續(xù)性的持續(xù)性夾(processivityclamp)和夾裝載因子復(fù)合體(clamploadercomplex)、使單鏈DNA區(qū)穩(wěn)定的單鏈結(jié)合蛋白、在DNA聚合酶前分離雙鏈DNA的解旋酶、用于分辨瓣?duì)頓NA結(jié)構(gòu)的瓣?duì)詈怂醿?nèi)切酶、以及密封DNA切口的DNA連接酶。這些因子與來自同一家族內(nèi)的DNA聚合酶是可互換的并且可以使用適當(dāng)?shù)腄NA聚合酶配偶體測試。舉例來說，來自嗜熱古菌菌種9°N(archaeonThermococcussp.9°N)的核心輔助因子將與家族BDNA聚合酶一起使用，而家族ADNA聚合酶將使用大腸桿菌輔助因子測試。將使用定量PCR來測量復(fù)制的啞鈴狀模板DNA。qPCR探針可以靶向如本文所述所形成的2kb啞鈴狀模板和10kb啞鈴狀模板的發(fā)夾區(qū)域。在復(fù)制引發(fā)的啞鈴狀模板的情況下，探針可以結(jié)合合成的發(fā)夾區(qū)域的每一段。因此，當(dāng)與一系列標(biāo)準(zhǔn)的稀釋的發(fā)夾模板相比較時(shí)，可以使用探針強(qiáng)度來指示拷貝數(shù)(圖11)。除了qPCR之外，還可以通過堿性瓊脂糖凝膠電泳監(jiān)測擴(kuò)增產(chǎn)物的長度。堿性瓊脂糖凝膠電泳將DNA分離成單鏈并且準(zhǔn)確地測量總復(fù)制產(chǎn)物長度。實(shí)施例9在一個(gè)實(shí)施例中，將用于滾環(huán)復(fù)制的最佳密度的官能化的引物連接到定制設(shè)計(jì)的流動池的玻璃表面。如圖11A中所示設(shè)計(jì)夾在兩個(gè)載玻片之間的定制的切割粘合劑墊圈。使復(fù)制子連接到蓋片的底側(cè)。所述蓋玻片具有用納米端口配件緊固的入口端口/出口端口。這里的墊圈是具有微通道的3M雙面膠帶，并且位于標(biāo)準(zhǔn)顯微鏡載片的頂部。這種設(shè)計(jì)將必要的光學(xué)特性、化學(xué)特性以及機(jī)械特性與實(shí)際需要，如易用性、制造速度、簡單性以及成本效益相配合。如圖11B中所示，流動池設(shè)計(jì)由通過將130μm厚的3M雙面膠膜墊圈夾在標(biāo)準(zhǔn)的1mm厚的25mm×75mm的硼硅酸鹽玻璃載片(VWR)與25mm×75mm的#1.5H硼硅酸鹽蓋片(SchottNexterion)之間所形成的微通道組成。微流體通道墊圈層是使用激光切割器(UniversalX-660)從3M雙面膠帶中切出的，并且入口孔/出口孔是穿過頂部蓋片層噴砂而來的。通過將粘合劑墊圈放置在載玻片的頂部上，然后將蓋片放置在墊圈的頂部上來密封通道。所得的通道具有130μm深、3mm寬以及4cm長的矩形橫截面。使用納米端口夾具(IDEXHealth&Science公司)將100μm內(nèi)徑的PEEK管連接到入口端口和出口端口作為用于交換流動池內(nèi)的溶液和試劑的裝置。可以通過使用化學(xué)策略將預(yù)先合成的寡核苷酸連接到玻璃表面。鑒定最佳的載體化學(xué)物質(zhì)是重要的，這是因?yàn)橄惹暗难芯恳呀?jīng)證實(shí)某些偶聯(lián)策略可以影響雜交和固相PCR應(yīng)用的性能。在一個(gè)實(shí)例中，將玻璃表面用硅烷試劑，如3-氨基丙基三乙氧基硅烷官能化是第一步驟。許多化學(xué)偶聯(lián)策略涉及氨基修飾的寡核苷酸。使用這些末端官能團(tuán)作為起點(diǎn)容許使用系統(tǒng)方法評價(jià)用于使寡核苷酸連接到玻璃表面的不同的中間偶聯(lián)劑。舉例來說而不限于，氰尿酰氯激活法已經(jīng)用于使寡核苷酸序列5'-NH2-TTTTTTTTTTTTGTAAAACGACGGCCAGT連接到蓋片表面。其它實(shí)例可以利用多種其它激活化學(xué)物質(zhì)，例如1,4-亞苯基二異硫氰酸酯和二羧酸反應(yīng)。所有這些激活策略均產(chǎn)生類似良好的雜交數(shù)據(jù)。本發(fā)明的實(shí)施方案包括不同長度的聚(dT)n接頭(即n＝0、10、20)。在一個(gè)實(shí)例中，可以利用NikonEclipseFN1顯微鏡，所述顯微鏡使用寬帶LED光源并且提供使用跨越可見光區(qū)和近IR區(qū)的不同熒光染料的靈活性。在一個(gè)實(shí)例中，使用dA加尾方法，用發(fā)夾結(jié)構(gòu)3(5'-TCGCGAGCTCGCG)形成pUC18啞鈴狀模板。已經(jīng)設(shè)計(jì)了分子信標(biāo)2(5'-FAM-CGGAGCTCCG-IowaBlack)以測定上述流動池中的固相滾環(huán)復(fù)制反應(yīng)。加下劃線的序列表示雙鏈莖區(qū)，第一個(gè)加方框的序列表示探針序列，并且第二個(gè)加方框的序列表示將結(jié)合到固定的M13引物序列的引物序列。由于分子信標(biāo)應(yīng)當(dāng)產(chǎn)生低背景熒光，因此產(chǎn)生表面結(jié)合復(fù)制子的充分的滾環(huán)復(fù)制將產(chǎn)生良好的信噪比(SNR)?？梢詰{經(jīng)驗(yàn)確定0.5kb啞鈴狀模板的稀釋度以將每個(gè)視野(FOV)25k至50k的復(fù)制子密度作為目標(biāo)。在某些實(shí)施例中，表面效應(yīng)可能抑制一些反應(yīng)并且可能需要使用鈍化劑，如聚乙烯吡咯烷酮或高分子量PEG。在某些實(shí)例中，可以利用低產(chǎn)率的硫代磷酸酯引物，這是因?yàn)棣?9DNA聚合酶可以對單鏈DNA表現(xiàn)出顯著的核酸外切酶活性。實(shí)施例10可以將從先前實(shí)例中搜集的試劑和條件應(yīng)用于片段化的人類基因組DNA以證實(shí)從10kb啞鈴狀模板形成NGS相容的克隆復(fù)制簇的穩(wěn)健的能力。在某些實(shí)例中，10kb啞鈴狀模板可以產(chǎn)生靶序列的1,000個(gè)拷貝。多種DNA聚合酶在滾環(huán)復(fù)制方法中有效地發(fā)揮作用，包括但不限于Bst、以及Vent(exo-)DNA聚合酶。最近，一種突變型φ29DNA聚合酶被鑒定出將DNA合成產(chǎn)率提高到數(shù)倍并且可從Sygnis公司商購獲得。在某些實(shí)例中，可以使用復(fù)制體復(fù)合體以使用T7測序酶、T7解旋酶、以及T7單鏈結(jié)合蛋白的協(xié)同活性來復(fù)制10kb啞鈴狀模板。在某些實(shí)例中，啞鈴狀模板(以0.5kb、1.0kb、2.5kb、5.0kb、7.5kb、以及10.0kb的尺寸增量)可以用于溶液測定并且使用實(shí)時(shí)PCR測試針對TCF7L2來分析。在某些實(shí)例中，可以包括輔助蛋白，包括例如而不限于其它解旋酶、單鏈結(jié)合蛋白、硫氧還蛋白、拓?fù)洚悩?gòu)酶、反向旋轉(zhuǎn)酶、或其任何組合以提高滾環(huán)復(fù)制方法的效率和準(zhǔn)確度。在某些實(shí)例中，可以用發(fā)夾結(jié)構(gòu)3形成0.5kb、1.0kb、2.5kb、5.0kb、7.5kb、或10.0kb的啞鈴狀模板并且用在基于溶液的實(shí)時(shí)PCR測定中所鑒定的最佳條件中的若干個(gè)來測試。在滾環(huán)復(fù)制方法后，可以使用分子信標(biāo)2探測復(fù)制的啞鈴狀模板并且通過熒光顯微術(shù)分析以確定復(fù)制的啞鈴狀模板的信號強(qiáng)度。在某些實(shí)施例中，可以用雙重發(fā)夾啞鈴狀模板作為從HapMap樣品NA18507中分離的真實(shí)世界模板進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制。本發(fā)明的實(shí)施方案還可以包括一種或多種發(fā)夾結(jié)構(gòu)、酶、其它核苷酸以及蛋白質(zhì)試劑，它們被包裝成試劑盒以用于實(shí)施本文所述的方法和產(chǎn)生本文所述的組合物。用于實(shí)施如本文所述的方法以及檢測如本文所述的滾環(huán)產(chǎn)物的存在的試劑可以被單獨(dú)提供或可以被共同包裝成試劑盒的形式。舉例來說，試劑盒可以被制備成包括一種或多種引物、一種或多種標(biāo)記的核苷三磷酸、以及用于執(zhí)行本文所述的方法的各個(gè)步驟的相關(guān)酶。試劑盒還可以包括一種或多種親和標(biāo)記的發(fā)夾結(jié)構(gòu)和一個(gè)或多個(gè)相應(yīng)的固體載體的包裝組合以純化啞鈴狀模板。試劑盒的容器內(nèi)試劑的布置將取決于所涉及的具體試劑。每一種試劑可以被包裝在單個(gè)容器中，但是各種組合也是可能的。本發(fā)明的實(shí)施方案還可以包括一種試劑盒，所述試劑盒含有一種或多種寡核苷酸以形成一種或多種發(fā)夾結(jié)構(gòu)；一組用于連接的組分，包括連接酶、輔因子、輔助因子、以及適當(dāng)?shù)木彌_液；以及一組用于復(fù)制的組分，包括基本上互補(bǔ)的引物、執(zhí)行本文所述的各個(gè)步驟的酶、輔助因子、以及適當(dāng)?shù)木彌_液。本發(fā)明的某些實(shí)施方案包括一種試劑盒，所述試劑盒含有能夠形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的至少一種寡核苷酸；用于使所述發(fā)夾結(jié)構(gòu)連接到來自樣品的至少一個(gè)核酸分子以形成至少一個(gè)啞鈴狀模板的第一組的組分，其中所述第一組的組分含有連接酶、輔因子、連接酶適用的緩沖液、以及其組合中的一種或多種；用于通過消化任何未連接的發(fā)夾結(jié)構(gòu)和任何未連接的核酸分子來純化所述至少一個(gè)啞鈴狀模板的第二組的組分，其中所述第二組的組分含有核酸外切酶、核酸外切酶適用的緩沖液、以及其組合中的一種或多種；以及用于復(fù)制所述至少一個(gè)啞鈴狀模板以形成至少一個(gè)擴(kuò)增的啞鈴狀模板的第三組的組分，其中所述第三組的組分含有聚合酶或復(fù)制體、核苷酸、輔助因子、以及與所述至少一個(gè)啞鈴狀模板的區(qū)域基本上互補(bǔ)的至少一種引物。本發(fā)明的實(shí)施方案還包括一種試劑盒，所述試劑盒含有能夠形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的至少一種寡核苷酸；連接酶，用于使所述發(fā)夾結(jié)構(gòu)連接到來自樣品的至少一個(gè)核酸分子以形成至少一個(gè)啞鈴狀模板；核酸外切酶，用于通過消化任何未連接的發(fā)夾結(jié)構(gòu)和任何未連接的核酸分子來將所述至少一個(gè)啞鈴狀模板純化；以及聚合酶和與所述至少一個(gè)啞鈴狀模板的區(qū)域基本上互補(bǔ)的至少一種引物，用于復(fù)制所述至少一個(gè)啞鈴狀模板以形成至少一個(gè)復(fù)制的啞鈴狀模板。本發(fā)明的某些實(shí)施方案包括一種試劑盒，所述試劑盒含有能夠形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的至少一種寡核苷酸；連接酶，用于使所述發(fā)夾結(jié)構(gòu)連接到來自樣品的至少一個(gè)核酸分子以形成至少一個(gè)啞鈴狀模板；核酸外切酶，用于通過消化任何未連接的發(fā)夾結(jié)構(gòu)和任何未連接的核酸分子來將所述至少一個(gè)啞鈴狀模板純化；以及復(fù)制體和與所述至少一個(gè)啞鈴狀模板的區(qū)域基本上互補(bǔ)的至少一種引物，用于復(fù)制所述至少一個(gè)啞鈴狀模板以形成至少一個(gè)復(fù)制的啞鈴狀模板。本發(fā)明的某些實(shí)施方案包括一種試劑盒，所述試劑盒含有能夠形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的至少一種寡核苷酸；連接酶，用于使所述發(fā)夾結(jié)構(gòu)連接到來自樣品的至少一個(gè)核酸分子以形成至少一個(gè)啞鈴狀模板；核酸外切酶，用于通過消化任何未連接的發(fā)夾結(jié)構(gòu)和任何未連接的核酸分子來將所述至少一個(gè)啞鈴狀模板純化；以及聚合酶和與所述至少一個(gè)啞鈴狀模板的至少兩個(gè)區(qū)域基本上互補(bǔ)的至少兩種引物，用于擴(kuò)增所述至少一個(gè)啞鈴狀模板以形成至少一個(gè)擴(kuò)增的啞鈴狀模板。本發(fā)明的某些實(shí)施方案包括一種試劑盒，所述試劑盒含有能夠形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的至少一種寡核苷酸；連接酶，用于使所述發(fā)夾結(jié)構(gòu)連接到來自樣品的至少一個(gè)核酸分子以形成至少一個(gè)啞鈴狀模板；核酸外切酶，用于通過消化任何未連接的發(fā)夾結(jié)構(gòu)和任何未連接的核酸分子來將所述至少一個(gè)啞鈴狀模板純化的核酸外切酶；以及復(fù)制體和與所述至少一個(gè)啞鈴狀模板的至少兩個(gè)區(qū)域基本上互補(bǔ)的至少兩種引物，用于擴(kuò)增所述至少一個(gè)啞鈴狀模板以形成至少一個(gè)擴(kuò)增的啞鈴狀模板。此外，上文已經(jīng)廣泛地概述了本發(fā)明的某些目的、特征和技術(shù)優(yōu)勢以及具體實(shí)施方式以使得可以鑒于如本文所述的本發(fā)明的特征和優(yōu)勢更好地理解本發(fā)明的實(shí)施方案，所述實(shí)施方案形成本發(fā)明的某些權(quán)利要求的主題。應(yīng)當(dāng)了解的是，所公開的構(gòu)思和具體實(shí)施方案可以容易地被用作修改或設(shè)計(jì)其它結(jié)構(gòu)以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的相同目的的基礎(chǔ)。還應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到的是，這些等同構(gòu)造沒有脫離如所附權(quán)利要求書中所闡述的本發(fā)明。當(dāng)結(jié)合附圖考慮時(shí)，從上述說明中更好地理解關(guān)于本發(fā)明的組織和操作方法以及另外的目的和優(yōu)勢被認(rèn)為是本發(fā)明的特征的新穎特征。然而，應(yīng)當(dāng)明確地了解，提供這樣的說明和附圖僅是為了說明和描述的目的，而不意在作為對本發(fā)明的限制的限定。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將顯而易見的是，可以在如前述說明書中所述的本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)作出各種改動和變化。當(dāng)前第1頁1 2 3