專利名稱：一種新型的重組腺病毒伴隨病毒的生產(chǎn)系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種重組腺病毒伴隨病毒(Adeno-associated virus,AAV)新型生產(chǎn)系統(tǒng)及其用途，特別涉及到由pHSV-AAV嵌合質(zhì)粒產(chǎn)生的單純皰疹病毒混合病毒，(見(jiàn)中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?6120549.0，能用于包裝重組腺病毒伴隨病毒)，和一種將AAV-2病毒蛋白編碼區(qū)為CMV病毒立即早期啟動(dòng)子及其下游的多接頭所取代，僅保留兩端反向末端重復(fù)序列(ITR)的AAV基因組克隆于EB病毒復(fù)制子載體而產(chǎn)生的重組AAV轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，該質(zhì)粒插入外源基因后，轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，可建立穩(wěn)定的傳代細(xì)胞系。當(dāng)上述單純皰疹病毒混合病毒感染該細(xì)胞系時(shí)，能產(chǎn)生高滴度的重組AAV病毒。
AAV屬于微小病毒科，它的基因組是單鏈DNA，由4682個(gè)核苷酸組成，兩端各有145個(gè)核苷酸的反向重復(fù)序列，是與AAV基因組的復(fù)制起點(diǎn)和與復(fù)制及整合染色體相關(guān)的順式序列元件的所在，病毒基因組的編碼信息從蛋白的功能可分成兩部分，左端編碼與病毒復(fù)制、轉(zhuǎn)錄必需的蛋白，右端編碼的是病毒的結(jié)構(gòu)蛋白。
AAV是非自主復(fù)制的病毒，它的產(chǎn)毒性復(fù)制需要有輔助病毒如腺病毒ADV或單純皰疹病毒HSV的協(xié)助才能進(jìn)行。當(dāng)輔助病毒不存在時(shí)，AAV感染人細(xì)胞后，病毒DNA整合于宿主染色體的特定位置，會(huì)建立了一種隱性感染的狀態(tài)，不會(huì)產(chǎn)生子代病毒；但當(dāng)宿主細(xì)胞被腺病毒或單純皰疹病毒感染時(shí)，可將AAV從整合于染色體的原病毒狀態(tài)激活并從中拯救出來(lái)，從而破壞了AAV的隱性感染，復(fù)制產(chǎn)生子代AAV毒粒。
AAV分子生物學(xué)的一個(gè)重要特點(diǎn)是被克隆化于大腸桿菌質(zhì)粒的AAV全基因組，轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞的時(shí)候，當(dāng)存在腺病毒或單純皰疹病毒的感染，質(zhì)粒中的AAV基因也可被拯救出來(lái)，進(jìn)行產(chǎn)毒性復(fù)制，產(chǎn)生野生型的AAV毒粒。這一特性構(gòu)成了制備重組AAV病毒載體的理論基礎(chǔ)。
克隆了AAV全基因組的質(zhì)粒，通過(guò)遺傳工程的方法，去除了基因組中用于編碼病毒蛋白的部分或全部序列元件，但保留AAV基因組中兩端的ITR，插入了相當(dāng)于被刪去AAV基因片段大小的外源DNA，可得到含外源基因的重組AAV病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)移質(zhì)粒(Ⅰ)；同時(shí)，除去克隆化AAV全基因組兩端的ITR，保留其編碼病毒蛋白的全部基因序列，可得到用于輔助重組AAV載體包裝的助手包裝質(zhì)粒(Ⅱ)，它轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，在輔助病毒如ADV或HSV存在下，可表達(dá)與AAV輔助和包裝必需的病毒蛋白，但由于缺失了復(fù)制必需的順式元件，不能進(jìn)行復(fù)制和包裝出野生型AAV毒粒。而當(dāng)感染了輔助病毒的細(xì)胞共轉(zhuǎn)染Ⅰ和Ⅱ這兩種質(zhì)粒時(shí)，(轉(zhuǎn)染方法可以是磷酸鈣共沉淀發(fā)或脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染)，助手包裝質(zhì)粒Ⅱ表達(dá)的反式蛋白，識(shí)別重組AAV病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)移質(zhì)粒Ⅰ中AAV的ITR順式作用元件，將重組AAV兩端的ITR連同外源基因一起從轉(zhuǎn)移質(zhì)粒Ⅰ中拯救出來(lái)，進(jìn)行復(fù)制和包裝出重組AAV病毒顆粒。采用化學(xué)或物理手段除去和滅活輔助病毒，得到的重組AAV毒?？勺鳛橐环N轉(zhuǎn)導(dǎo)性載體，通過(guò)病毒感染的方式將外源基因?qū)氲郊?xì)胞中，并可整合于宿主染色體得到穩(wěn)定的表達(dá)。與逆轉(zhuǎn)錄病毒載體相比，重組AAV載體能轉(zhuǎn)導(dǎo)有絲分裂后細(xì)胞和分化終端細(xì)胞，AAV具有超感染的特性，可進(jìn)行重復(fù)感染，同時(shí)在人類至今還為發(fā)現(xiàn)于AAV直接相關(guān)的疾病，這些特點(diǎn)使它具有在人類疾病的基因治療的應(yīng)用前景。
目前制備重組AAV毒粒的方法基本上是按上述原理進(jìn)行，也就是采用兩種不同的AAV質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，一種載體提供AAV的反式作用蛋白，另一種提供復(fù)制和包裝必需的順式序列元件和外源基因，在輔助病毒的協(xié)助下，獲得攜帶外源基因的AAV毒粒。
為提高重組AAV載體的包裝效率，Samulski將克隆化野生型AAV基因組的兩端ITR以腺病毒5型基因組兩端的重復(fù)序列所取代，獲得的AAV包裝質(zhì)粒pAd8,(Samulski et al:Helper free stocks of recombinant adeno-associatedvirus:normalintergration does not require viral gene expression.J.Virology 63:3822-3828)，雖然ADV的末端重復(fù)能允許被導(dǎo)入已感染ADV的細(xì)胞中的pAd8按腺病毒復(fù)制的機(jī)制進(jìn)行有限的擴(kuò)增，但還未能離開(kāi)上述的工作模式，盡管這過(guò)程相對(duì)簡(jiǎn)單，但操作起來(lái)較為繁瑣，表現(xiàn)為由于沒(méi)有獲得一種能支持重組AAV復(fù)制和包裝的細(xì)胞系的存在，每次操作都需要將兩種載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，由于共轉(zhuǎn)染兩種載體同時(shí)到大量的細(xì)胞個(gè)體的頻率較低，因此也影響到產(chǎn)生高滴度重組AAV病毒的效率。
Lebkowski等人(Applied Immune Science,Inc.)，提出了一種改進(jìn)，他們將缺失兩端ITR的AAV全基因組的序列重組于腺病毒E3區(qū)的重組腺病毒時(shí)，該重組腺病毒不僅能提供輔助病毒的功能，同時(shí)也表達(dá)出AAV包裝所必需的反式蛋白，用于rAAV的包裝(USA5173414,USA5354678)。這過(guò)程看起來(lái)相當(dāng)簡(jiǎn)化，免卻了產(chǎn)生rAAV需要共轉(zhuǎn)染兩種載體的傳統(tǒng)方法，提高了工作效率。但需要用到細(xì)胞內(nèi)同源重組，及重組病毒的篩選等繁瑣的操作才能獲得可供應(yīng)用重組腺病毒，用于產(chǎn)生rAAV病毒。
本發(fā)明的目的是提供一種新型的重組腺病毒伴隨病毒生產(chǎn)系統(tǒng)，它包括一HSV-1混合病毒(見(jiàn)中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?6120549.0，能用于包裝重組腺病毒伴隨病毒)和一穩(wěn)定傳代細(xì)胞系。HSV-1混合毒種中，野生型的HSV-1病毒提供類似腺病毒功能的輔助病毒的作用，假型病毒中攜帶的十幾個(gè)拷貝的AAV基因組序列可表達(dá)以提供重組AAV的復(fù)制蛋白和結(jié)蛋白的反式功能，以支持?jǐn)y帶外源基因的重組AAV載體包裝成重組AAV病毒顆粒。穩(wěn)定傳代細(xì)胞系由包含EB病毒復(fù)制子的重組AAV轉(zhuǎn)移質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，在有潮霉素B的選擇壓力下而得到。重組AAV轉(zhuǎn)移質(zhì)粒包含EB病毒的質(zhì)粒型復(fù)制起點(diǎn)oriP及其反式作用因子EBNA-1和兩側(cè)帶有AAV-2長(zhǎng)145bp的ITR的由CMV早期啟動(dòng)子起動(dòng)并帶有多接頭的表達(dá)盒以及真核細(xì)胞選擇標(biāo)志及帶有大腸桿菌復(fù)制子和氨芐青霉素抗性基因的大腸桿菌質(zhì)粒骨架。在細(xì)胞系中質(zhì)粒以多拷貝質(zhì)粒形式獨(dú)立存在于染色體外，并能夠自主復(fù)制。當(dāng)上述混合病毒感染該細(xì)胞系，由野生型HSV-1病毒充當(dāng)重組AAV包裝的輔助病毒，復(fù)制缺陷的HSV-1假型病毒表達(dá)AAV基因組編碼的蛋白以提供反式功能，EB病毒復(fù)制子載體上的AAV-2 ITR提供AAV的包裝信號(hào)，從而可直接得到攜帶外源基因的重組AAV病毒。
本發(fā)明的特點(diǎn)是HSV-1混合毒株提供輔助病毒功能及表達(dá)AAV基因組編碼的蛋白以提供反式功能。用包含EB病毒復(fù)制子的重組AAV轉(zhuǎn)移質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞所得到的穩(wěn)定傳代細(xì)胞系則提供包裝重組AAV病毒的必需信號(hào)和順式元件以及包裝場(chǎng)所，這樣通過(guò)簡(jiǎn)單的病毒感染則可得到重組AAV病毒，與傳統(tǒng)方法相比更為簡(jiǎn)便易行，并有效提高了rAAV的包裝效率。
本發(fā)明提出的用于包裝重組腺病毒伴隨病毒的Ⅰ型單純皰疹病毒混合毒株由pHSV-AAV(+)和pHSV-AAV(-)產(chǎn)生(見(jiàn)中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?6120549.0)，含該質(zhì)粒的菌種命名為Escherichia coli DH5 α/pHSV-AAV(+)和Escherichia coli DH5α/pHSV-AAV(-)，已于1996年12月11日保存于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，登記入冊(cè)的編號(hào)為CGMCC NO.0284)本發(fā)明提出的包含EB病毒復(fù)制的重組AAV轉(zhuǎn)移質(zhì)粒由以下DNA元件組成1EB病毒質(zhì)粒型復(fù)制子oriP及其反式作用因子EBNA-1。
2真核細(xì)胞抗性選擇標(biāo)志(潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶基因)。
3兩側(cè)帶有AAV-2長(zhǎng)145bp的ITR的由CMV早期啟動(dòng)子起動(dòng)并帶有接頭的表達(dá)盒4大腸桿菌質(zhì)粒骨架(大腸桿菌復(fù)制子和氨芐青霉素抗性β-內(nèi)酰胺酶基因)本發(fā)明提出的包含EB病毒復(fù)制的重組AAV轉(zhuǎn)移質(zhì)粒有兩種，見(jiàn)附圖1，其中CMV啟動(dòng)子方向與質(zhì)粒骨架上β內(nèi)酰胺酶基因的轉(zhuǎn)錄方向一致的pBDZ(+)，另一種是CMV啟動(dòng)子方向與質(zhì)粒骨架上β內(nèi)酰胺酶基因的轉(zhuǎn)錄方向相反的pBDZ(-)兩種質(zhì)粒均寄存于大腸桿菌HB101株，含該質(zhì)粒的菌種命名為Escherichia coliHB101/pBDZ(+)和Escherichia coliHB101/pBDZ(-)，已于1997年10月7日保存于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，登記入冊(cè)的編號(hào)為CGMCCNO.0326-1,0326-2)本發(fā)明用于構(gòu)建可組建重組腺病毒伴隨病毒包裝系統(tǒng)的EB病毒復(fù)制子載體pBDZ(+)和pBDZ(-)的原始質(zhì)粒有pSub201:Samulski et al,A recombinant plasmidfrom which aninfectious adeno-associated virus genome can be excitedin vitro and its useto study viral replication。
pBV101顏?zhàn)臃f等，中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?6 101408.3中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，登記入冊(cè)的編號(hào)為CGMCC NO.0255
pCMV-poly(A)由本單位自己構(gòu)建，中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，登記入冊(cè)的編號(hào)為CGMCC NO.0326-3從pSub201中以Pvu Ⅱ和SalⅠ酶切，分別回收1600bp和2900bpAAV基因組核苷酸片段，首先將1600bp片段插入pBV101的NotⅠ與SalⅠ之間其中NotⅠ用Klenow酶補(bǔ)平，得到質(zhì)粒pSubR’1；然后將2900bp片段插入pSubR’1質(zhì)粒的PvuⅡ和SalⅠ位點(diǎn)之間，得到質(zhì)粒pSubR’2；質(zhì)粒pSubR’2用XbalⅠ酶切，回收不含AAV基因組191-4484核苷酸片段但包括AAV兩側(cè)ITR的載體大片段，最后用XbalⅠ酶切pCMV-poly(A)得到含多克隆位點(diǎn)的CMV啟動(dòng)子表達(dá)盒，插入回收的pSubR’2載體大片段的XbalⅠ位點(diǎn)處，通過(guò)限制酶切分析，得到CMV啟動(dòng)子方向與載體上β內(nèi)酰胺酶基因的轉(zhuǎn)錄方向相同或相反的pBDZ(+)和pBDZ(-)。其中多克隆位點(diǎn)有NheⅠXhoⅠBamHⅠ，可以插入外源基因。
本發(fā)明提出的用于包裝重組腺病毒伴隨病毒的EB病毒復(fù)制子載體pBDZ(+)和pBDZ(-)，可寄存在大腸桿菌HB101株，含pBDZ(+)質(zhì)粒的菌株命名為大腸桿菌HB101/pBDZ(+)(Escherichia coliHB101/pBDZ(+)；含pBDZ(-)質(zhì)粒的菌株命名為大腸桿菌HB101/pBDZ(-)(Escherichia coli HB101/pBDZ(-)，上述兩菌種均可在含50-100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基(1％tryptone,0.5％yeastextract,1％NaCl)傳代培養(yǎng)。
以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的用于包裝重組腺病毒伴隨病毒的包裝系統(tǒng)包括混合病毒的制備和穩(wěn)定細(xì)胞株的建立及其用途作了詳細(xì)說(shuō)明，但不意味著限制本發(fā)明的內(nèi)容。在實(shí)施例中，pBDgal(+)和pBDgal(-)質(zhì)粒是pBDZ(+)質(zhì)粒和pBDZ(-)質(zhì)粒多克隆穩(wěn)定區(qū)插入β-半乳糖苷酶基因，Vero細(xì)胞是非洲綠猴腎細(xì)胞系(ATCC)，野生型HSV-1 ts株是英國(guó)病毒研究所Nigel.D.Stow教授贈(zèng)送(Genetic studies withHSV-1.the isolation of temperature-sensitive mutants,their arrangement intocomplementation groups and recombination analysis leading to linkage map.J.Gen.Virol.1973,63:2260～2269)實(shí)施例1質(zhì)粒的制備。
大腸桿菌DH5α/pHSV-AAV(+)或大腸桿菌DH5α/pHSV-AAV(-)或大腸桿菌HB101/pBDZ(+)或大腸桿菌HB101/pBDZ(-)接種于200ml LB培養(yǎng)液，37 ℃培養(yǎng)24小時(shí)，離心收菌體，加5ml溶液Ⅰ(50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris-HCl,10mmol/L EDTA,pH8.0)重懸菌體，冰浴下加10ml溶液Ⅱ(0.2mol/L NaOH,1％SDS)，5分鐘后加7.5ml溶液Ⅲ(100ml中含5mol/L乙酸鉀60ml，冰乙酸11.5ml，水28.5ml〕混勻，15000rpm離心15分鐘，上清加0.6倍體積異丙醇沉淀。沉淀以2ml TE溶液(10mmol/LTris-HCl,1mmol/LEDTA,pH5.0)溶解，等體積酚-氯仿-異戊醇(24∶24∶1,v/v)抽提除蛋白質(zhì)，然后在Sepharose 4B柱(15.0×1.0cm)凝膠過(guò)濾，收集流出的質(zhì)粒峰。
實(shí)施例2:HSV-1病毒ts株的制備HSV-1病毒ts株為溫度敏感型毒株，其允許溫度為31℃，高于此溫度會(huì)影響其活性。病毒的制備同常規(guī)病毒的制備，取0.5ml病毒液感染已長(zhǎng)成單層的vero細(xì)胞，31℃吸附2小時(shí)，倒掉病毒液，加入含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，31℃培養(yǎng)至細(xì)胞出現(xiàn)90-100％病變。將細(xì)胞反復(fù)凍融三次，離心，除去細(xì)胞殘?jiān)?，所得上清液即為病毒液?？捎檬砂叩味ǚy(cè)定病毒液的滴度。
實(shí)施例3:HSV-AAV假型病毒混合毒株的產(chǎn)生。
pHSV-AAV(+)或pHSV-AAV(-)質(zhì)粒用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)染vero細(xì)胞，48小時(shí)后倒掉培養(yǎng)液，加入0.5ml HSV-1病毒液，31℃吸附2小時(shí)，倒掉病毒液，加入含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，31℃培養(yǎng)至細(xì)胞出現(xiàn)90-100％病變。將細(xì)胞反復(fù)凍融三次，離心，除去細(xì)胞殘?jiān)?，所得上清液即為混合病毒液?br> 實(shí)施例4穩(wěn)定細(xì)胞株的制備。
pBDgal(+)或pBDgal(-)質(zhì)粒用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)染vero細(xì)胞，48小時(shí)后倒掉培養(yǎng)液，按1∶10的比例傳代細(xì)胞，加入含200μg/ml潮霉素B的選擇培養(yǎng)液培養(yǎng)，每?jī)商鞊Q液一次，直到長(zhǎng)出細(xì)胞克隆。挑取細(xì)胞克隆與6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，然后對(duì)每個(gè)細(xì)胞克隆所得到的細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，以確定pBDgal(+)或pBDgal(-)質(zhì)粒已穩(wěn)定存在于Vero細(xì)胞中。并分別命名為BDgal(+)細(xì)胞或BDgal(-)細(xì)胞。
實(shí)施例5以混合毒株感染細(xì)胞株制備重組AAV病毒顆粒。
當(dāng)實(shí)施例4所得到的BDgal(+)細(xì)胞或BDgal(-)細(xì)胞生長(zhǎng)成90％匯片時(shí)，加入0.5ml從實(shí)施例3所得的含有HSV-AAV假型病毒的混合病毒液，37℃吸附2小時(shí)，倒掉病毒液，加入含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，31℃繼續(xù)培養(yǎng)，2-3天后，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變時(shí)，收獲混有混合毒株HSV-AAV的重組AAV病毒。收毒時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)液和細(xì)胞都回收，反復(fù)凍融或以超聲處理使細(xì)胞完全裂解，離心去掉細(xì)胞碎片，65℃加熱1小時(shí)以滅活HSV-1病毒和HSV-AAV假病毒，再經(jīng)0.22μm醋酸纖維膜過(guò)濾除菌，得到可用與轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的重組AAVlac病毒。
實(shí)施例6重組AAVLac病毒顆粒感染培養(yǎng)人細(xì)胞系。
實(shí)施例5所獲的帶報(bào)道基因β半乳糖苷酶的重組腺病毒伴隨病毒顆粒AAVlac可用于感染人養(yǎng)細(xì)胞系。重組AAV-Lac病毒感染A549細(xì)胞，48小時(shí)后，以細(xì)胞化學(xué)的方法檢測(cè)β半乳糖苷酶的表達(dá)，(Somatic Cell Mol.Genet.,13(3),253-265,1987.)，細(xì)胞以磷酸鈉緩沖液洗滌2遍，加入含X-Gal的染色液，30分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間后觀察，可見(jiàn)被感染細(xì)胞因外源基因的表達(dá)而呈藍(lán)色，其典型的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率為當(dāng)病毒滴度為107時(shí)，感染培養(yǎng)有106個(gè)細(xì)胞的培養(yǎng)皿，可見(jiàn)培養(yǎng)皿的細(xì)胞全部變藍(lán)。


(2):pBDZ(+/-)質(zhì)粒圖。其中CMV啟動(dòng)子方向與Amp方向相同為pBDZ(+)，其中CMV啟動(dòng)子方向與Amp方向相反為pBDZ(-)。EBNA-lorip代表EB病毒的質(zhì)粒型復(fù)制序列，EBNA-1代表EB病毒的反式作用因子，ITR代表AAV基因的兩側(cè)末端反向重復(fù)序列，Hyg代表潮霉素抗性基因，Amp代表氨芐抗性，orip代表大腸桿菌的復(fù)制區(qū)。
權(quán)利要求
1，一種新型的重組腺病毒伴隨病毒(Adeno-associated virus,AAV)的生產(chǎn)系統(tǒng)由以下部分組成(1)、由pHSV-AAV(+/-)產(chǎn)生的HSV-1混合病毒，其中野生型的HSV-1病毒提供類似腺病毒功能的輔助病毒的作用，假型病毒中攜帶的十幾個(gè)拷貝的AAV基因組序列可表達(dá)以提供重組AAV的復(fù)制蛋白和結(jié)蛋白的反式功能，以支持?jǐn)y帶外源基因的重組AAV載體包裝成重組AAV病毒顆粒。(見(jiàn)中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?6120549.0)(2)、可以用來(lái)產(chǎn)生穩(wěn)定傳代細(xì)胞的重組AAV轉(zhuǎn)移質(zhì)粒由以下DNA元件組成(1)EB病毒質(zhì)粒型復(fù)制子oriP及其反式作用因子EBNA-1。(2)真核細(xì)胞抗性選擇標(biāo)志(潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶基因)。(3)兩側(cè)AAV-2長(zhǎng)145bp的反向末端重復(fù)(ITR)的由CMV早期啟動(dòng)子起動(dòng)并帶有接頭的表達(dá)盒(4)大腸桿菌質(zhì)粒骨架(大腸桿菌復(fù)制子和氨芐青霉素抗性β-內(nèi)酰胺酶基因)
2，能用于產(chǎn)生穩(wěn)定傳代細(xì)胞株的包含EB病毒復(fù)制子的重組AAV轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pBDZ(+)，其特征在于載體上的CMV啟動(dòng)子方向與質(zhì)粒骨架上β內(nèi)酰胺酶基因的轉(zhuǎn)錄方向一致；能用于產(chǎn)生穩(wěn)定傳代細(xì)胞株的包含EB病毒復(fù)制子的重組AAV轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pBDZ(-)，其特征在于載體上的CMV啟動(dòng)子方向與質(zhì)粒骨架上β內(nèi)酰胺酶基因的轉(zhuǎn)錄方向相反。
3，能用于包裝重組腺病毒伴隨病毒(Adeno-associated virus,AAV)的單純皰疹病毒混合毒株，其中HSV-1野生型病毒提供AAV復(fù)制和包裝的輔助功能，而含十幾個(gè)拷貝的AAV基因組的DNA連結(jié)體的HSV-1假型病毒表達(dá)AAV基因組編碼的蛋白以提供反式功能，可用于生產(chǎn)重組AAV病毒顆粒。
4.可以用來(lái)產(chǎn)生穩(wěn)定傳代細(xì)胞株的包含EB病毒復(fù)制子的重組AAV轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pBDZ(+)或pBDZ(-)其用途在于提供包裝重組AAV病毒的信號(hào)序列以及插入外源基因。
5.pBDZ(+)或pBDZ(-)質(zhì)粒插入外源基因后用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)染vero細(xì)胞，48小時(shí)后倒掉培養(yǎng)液，按1∶10的比例傳代細(xì)胞，加入含200μg/ml潮霉素B的選擇培養(yǎng)液培養(yǎng)，每?jī)商鞊Q液一次，直到長(zhǎng)出細(xì)胞克隆。挑取細(xì)胞克隆與6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，然后對(duì)每個(gè)細(xì)胞克隆所得到的細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，以確定pBDZ(+)或pBDZ(-)質(zhì)粒已穩(wěn)定存在于Vero細(xì)胞中。并分別命名為BDZ(+)細(xì)胞或BDZ(-)細(xì)胞。其特征在于質(zhì)粒在細(xì)胞中以附加子形式多拷貝穩(wěn)定存在于細(xì)胞染色體之外，并能夠自主復(fù)制。
6.根據(jù)權(quán)利要求3和5，當(dāng)HSV-1混合病毒感染BDZ(+)細(xì)胞或BDZ(-)細(xì)胞時(shí)，HSV-1野生型病毒提供AAV復(fù)制的輔助功能，而假型病毒表達(dá)AAV基因組編碼的蛋白以提供反式功能，pBDZ(+)或pBDZ(-)質(zhì)粒上的AAVITR提供包裝信號(hào)，從而產(chǎn)生高滴度攜帶外源基因的重組AAV病毒顆粒。
7.利用權(quán)利要求3所述的HSV-1混合病毒和權(quán)利要求5所述的含權(quán)利要求2所述質(zhì)粒的傳代細(xì)胞，共同構(gòu)成新型重組腺病毒伴隨病毒生產(chǎn)系統(tǒng)。該系統(tǒng)按權(quán)利要求6所述可產(chǎn)生高滴度的新型重組腺病毒伴隨病毒顆粒。
全文摘要
一種新型的重組腺病毒伴隨病毒生產(chǎn)系統(tǒng),是由以質(zhì)粒pHSV－AAV產(chǎn)生的單純皰疹病毒混合毒種(見(jiàn)中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?6120549.0)和轉(zhuǎn)化了帶EB病毒復(fù)制子的重組AAV載體轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pBDZ(+)或pBDZ(－)而獲得的穩(wěn)定傳代細(xì)胞系所組成。當(dāng)克隆了外源基因的pBDZ(+)或pBDZ(－)轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞,可建立穩(wěn)定的傳代細(xì)胞系。當(dāng)上述單純皰疹病毒混合病毒感染該細(xì)胞系時(shí),由混合病毒提供重組AAV包裝的輔助功能和反式蛋白,pBDZ(+)或pBDZ(－)載體上的AAV－2ITR提供包裝重組AAV的必需信號(hào),從而能產(chǎn)生高滴度的重組AAV病毒。
文檔編號(hào)C12N15/86GK1213699SQ9711698
公開(kāi)日1999年4月14日 申請(qǐng)日期1997年10月8日 優(yōu)先權(quán)日1997年10月8日
發(fā)明者舒躍龍, 顏?zhàn)臃f, 侯云德 申請(qǐng)人:中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒學(xué)研究院