本申請(qǐng)涉及并要求2014年4月4日提交的名稱為“癌癥治療的生物標(biāo)記”的中國(guó)專利申請(qǐng)No.201410135569.9的優(yōu)先權(quán)，其全部?jī)?nèi)容在此參考并入。

發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明通常涉及在腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的新的融合基因，以及靶向這種融合基因的治療。

背景技術(shù)：

R-spondin蛋白是典型Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激動(dòng)劑。最近發(fā)現(xiàn)R-spondin基因家族成員(RSPO)與一些結(jié)腸直腸癌中的其它基因伴侶融合(Seshagiri等人，Nature 2012488(7413):660-664)。據(jù)報(bào)道，由RSPO2基因和EIF3E基因融合形成的EIF3E(外顯子1)-RSPO2(外顯子2)融合基因在結(jié)腸癌患者的2％的癌癥樣品中出現(xiàn)，而由RSPO3基因和PTPRK基因融合形成的PTPRK(外顯子1)-RSPO3(外顯子2)融合基因在8％的樣品中出現(xiàn)?；蛉诤鲜录ǔ＜せ頡-spondin蛋白表達(dá)，從而激活Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。

因此，鑒定在癌細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中RSPO2融合的基因伴侶將為癌癥的治療干預(yù)提供潛在機(jī)會(huì)。

發(fā)明概述

本發(fā)明提供了在含有核酸的樣品中檢測(cè)HNF4G和RSPO2融合基因的方法，其包括：使樣品與檢測(cè)試劑接觸，所述檢測(cè)試劑特異性地檢測(cè)包含HNF4G的第一序列和RSPO2的第二序列的融合物的多核苷酸，以及檢測(cè)所述多核苷酸的存在。

在某些實(shí)施方式中，所述第一序列是非編碼序列，所述第二序列是編碼序列。

在某些實(shí)施方式中，所述方法還包括檢測(cè)所述多核苷酸的水平。

在某些實(shí)施方式中，所述HNF4G的第一序列位于RSPO2的第二序列的上游5'端。在某些實(shí)施方式中，所述HNF4G的第一序列包含(a)如ENST00000396419中所示的HNF4G基因轉(zhuǎn)錄子的外顯子2的至少一部分，和(b)如ENST00000494318中所示的HNF4G基因轉(zhuǎn)錄子的外顯子3的至少一部分。

在某些實(shí)施方式中，所述RSPO2的第二序列包含：(a)如ENST00000276659、ENST00000517781、ENST00000522333或ENST00000378439中所示的RSPO2基因轉(zhuǎn)錄子的外顯子2的至少一部分，或(b)如ENST00000521956中所示的RSPO2基因轉(zhuǎn)錄子的外顯子1的至少一部分。

在某些實(shí)施方式中，所述HNF4G的第一序列包含選自以下的序列：a)如ENST00000396419中所示的HNF4G基因轉(zhuǎn)錄子的外顯子2的至少一部分，和b)如ENST00000494318中所示的HNF4G基因轉(zhuǎn)錄子的外顯子3的至少一部分，并且所述RSPO2的第二序列包含如ENST00000276659中所示的RSPO2基因轉(zhuǎn)錄子的外顯子2的至少一部分，并且所述HNF4G基因轉(zhuǎn)錄子ENST00000396419的外顯子2或所述HNF4G基因轉(zhuǎn)錄子ENST00000494318的外顯子3融合至所述RSPO2基因轉(zhuǎn)錄子的外顯子2。

在某些實(shí)施方式中，所述HNF4G的第一序列包含選自以下的序列：a)如ENST00000396419中所示的HNF4G基因轉(zhuǎn)錄子的外顯子2的至少一部分，和b)如ENST00000494318中所示的HNF4G基因轉(zhuǎn)錄子的外顯子3的至少一部分，并且所述RSPO2的第二序列包含如ENST00000517781中所示的RSPO2基因轉(zhuǎn)錄子的外顯子2的至少一部分，并且所述HNF4G基因轉(zhuǎn)錄子ENST00000396419的外顯子2或所述HNF4G基因轉(zhuǎn)錄子ENST00000494318的外顯子3融合至所述RSPO2基因轉(zhuǎn)錄子的外顯子2。

在某些實(shí)施方式中，所述HNF4G的第一序列包含選自以下的序列：a)如ENST00000396419中所示的HNF4G基因轉(zhuǎn)錄子的外顯子2的至少一部分，和b)如ENST00000494318中所示的HNF4G基因轉(zhuǎn)錄子的外顯子3的至少一部分，并且所述RSPO2的第二序列包含如ENST00000522333中所示的RSPO2基因轉(zhuǎn)錄子的外顯子2的至少一部分，并且所述HNF4G基因轉(zhuǎn)錄子ENST00000396419的外顯子2或所述HNF4G基因轉(zhuǎn)錄子ENST00000494318的外顯子3融合至所述RSPO2基因轉(zhuǎn)錄子的外顯子2。

在某些實(shí)施方式中，所述HNF4G的第一序列包含選自以下的序列：a)如ENST00000396419中所示的HNF4G基因轉(zhuǎn)錄子的外顯子2的至少一部分，和b)如ENST00000494318中所示的HNF4G基因轉(zhuǎn)錄子的外顯子3的至少一部分，并且所述RSPO2的第二序列包含如ENST00000378439中所示的RSPO2基因轉(zhuǎn)錄子的外顯子2的至少一部分，并且所述HNF4G基因轉(zhuǎn)錄子ENST00000396419的外顯子2或所述HNF4G基因轉(zhuǎn)錄子ENST00000494318的外顯子3融合至所述RSPO2基因轉(zhuǎn)錄子的外顯子2。

在某些實(shí)施方式中，所述HNF4G的第一序列包含選自以下的序列：a)如ENST00000396419中所示的HNF4G基因轉(zhuǎn)錄子的外顯子2的至少一部分，和b)如ENST00000494318中所示HNF4G基因轉(zhuǎn)錄子的外顯子3的至少一部分，并且所述RSPO2的第二序列包含如ENST00000521956中所示的RSPO2基因轉(zhuǎn)錄子的外顯子1的至少一部分，并且所述HNF4G基因轉(zhuǎn)錄子ENST00000396419的外顯子2或所述HNF4G基因轉(zhuǎn)錄子ENST00000494318的外顯子3融合至所述RSPO2基因轉(zhuǎn)錄子的外顯子1。

在某些實(shí)施方式中，所述融合基因包含CCACAGCCTT|gttcgtggcg(SEQ ID NO:3)的融合連接處。在某些實(shí)施方式中，所述多核苷酸是cDNA或者mRNA。

在某些實(shí)施方式中，所述檢測(cè)試劑包含針對(duì)所述HNF4G的第一序列的第一引物和針對(duì)所述RSPO2的第二序列的第二引物。在某些實(shí)施方式中，所述檢測(cè)試劑包含針對(duì)含有所述融合連接處的片段的連接引物和針對(duì)所述第一或第二序列的非連接引物。

在某些實(shí)施方式中，所述檢測(cè)試劑包含針對(duì)所述HNF4G的第一序列的第一探針和針對(duì)所述RSPO2的第二序列的第二探針。在某些實(shí)施方式中，所述檢測(cè)試劑包含針對(duì)含有所述融合連接處的片段的連接探針。

在某些實(shí)施方式中，所述方法還包括檢測(cè)所述多核苷酸的水平。

在某些實(shí)施方式中，所述核酸樣品來(lái)自患有胃癌的受試者。

本申請(qǐng)還提供了一組用于檢測(cè)HNF4G和RSPO2融合基因的引物組，其包含：針對(duì)HNF4G的第一序列的第一引物和針對(duì)RSPO2的第二序列的第二引物；或針對(duì)含有HNF4G和RSPO2的融合連接處的片段的連接引物，以及針對(duì)HNF4G的第一序列或RSPO2的第二序列的非連接引物。

在某些實(shí)施方式中，所述第一引物或第二引物是針對(duì)所述融合基因的融合連接處的上游或下游至少80bp的區(qū)域，其中所述融合連接處包含CCACAGCCTT|gttcgtggcg(SEQ ID NO:3)。

在某些實(shí)施方式中，所述第一引物和第二引物可用于擴(kuò)增長(zhǎng)度為約200bp至400bp的擴(kuò)增子。在某些實(shí)施方式中，所述第一引物是針對(duì)SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:6；所述第二引物是針對(duì)SEQ ID NO:2。

本申請(qǐng)還提供了一組用于檢測(cè)HNF4G和RSPO2融合基因的探針組，其包含：針對(duì)HNF4G的第一序列的第一探針和針對(duì)RSPO2的第二序列的第二探針；或針對(duì)含有HNF4G和RSPO2的融合連接處的片段的連接探針。

本申請(qǐng)還提供了一種用于檢測(cè)HNF4G和RSPO2融合基因的試劑盒，其包含前述引物組或探針組。

本申請(qǐng)還提供了一種用于對(duì)HNF4G和RSPO2融合基因呈陽(yáng)性的人類疾病的動(dòng)物模型，其包括含有所述融合基因的人異種移植物。

本申請(qǐng)還提供了一種評(píng)估測(cè)試試劑對(duì)人類疾病的影響的方法，所述人類疾病對(duì)HNF4G和RSPO2融合基因呈陽(yáng)性，所述方法包括：獲得前述用于人類疾病的動(dòng)物模型；將所述測(cè)試試劑施用至所述動(dòng)物模型；測(cè)定所述測(cè)試試劑對(duì)人異種移植物的影響；以及評(píng)估所述測(cè)試試劑對(duì)所述人類疾病的影響。在某些實(shí)施方式中，所述測(cè)試試劑是wnt通路拮抗劑。在某些實(shí)施方式中，所述治療劑是wnt通路拮抗劑。在某些實(shí)施方式中，所述測(cè)試試劑靶向RSFO2或HNF4G和RSPO2融合基因。在特定實(shí)施方式中，所述治療劑是結(jié)合RSPO2或HNF4G和RSPO2融合基因的小干擾RNA(siRNA)。在某些實(shí)施方式中，所述測(cè)試試劑是結(jié)合RSPO2或HNF4G和RSPO2融合基因的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段。在某些實(shí)施方式中，所述疾病是癌癥。

本申請(qǐng)還提供了一種評(píng)估測(cè)試試劑對(duì)HNF4G和RSPO2融合基因的影響的方法，所述方法包括：獲得對(duì)所述融合基因呈陽(yáng)性的細(xì)胞；將所述細(xì)胞暴露于所述測(cè)試試劑；以及測(cè)定所述測(cè)試試劑對(duì)所述融合基因或所述細(xì)胞的影響。在某些實(shí)施方式中，所述測(cè)試試劑是wnt通路拮抗劑。在某些實(shí)施方式中，所述治療劑是wnt通路拮抗劑。在某些實(shí)施方式中，所述測(cè)試試劑靶向RSFO2或HNF4G和RSPO2融合基因。在特定實(shí)施方式中，所述測(cè)試試劑是結(jié)合RSPO2或HNF4G和RSPO2融合基因的小干擾RNA(siRNA)。在某些實(shí)施方式中，所述測(cè)試試劑是結(jié)合RSPO2或HNF4G和RSPO2融合基因的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段。在某些實(shí)施方式中，所述疾病是癌癥。

本申請(qǐng)還提供了一種鑒定用于治療與HNF4G和RSPO2融合基因相關(guān)的疾病的試劑的方法，所述方法包括：提供對(duì)所述融合基因呈陽(yáng)性的細(xì)胞，將所述細(xì)胞暴露于候選藥劑，以及鑒定調(diào)節(jié)所述融合基因或其基因產(chǎn)物的生物活性的試劑。在某些實(shí)施方式中，所述試劑是wnt通路拮抗劑。在某些實(shí)施方式中，所述試劑是wnt通路拮抗劑。在某些實(shí)施方式中，所述試劑靶向RSFO2或HNF4G和RSPO2融合基因。在特定實(shí)施方式中，所述試劑是結(jié)合RSPO2或HNF4G和RSPO2融合基因的小干擾RNA(siRNA)。在某些實(shí)施方式中，所述試劑是結(jié)合RSPO2或HNF4G和RSPO2融合基因的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段。在某些實(shí)施方式中，所述疾病是癌癥。

本申請(qǐng)還提供了一種治療與HNF4G和RSPO2融合基因相關(guān)的疾病的方法，所述方法包括施用有效量的治療劑，從而治療所述疾病，所述治療劑能夠調(diào)節(jié)所述融合基因或其基因產(chǎn)物的生物活性。在某些實(shí)施方式中，所述治療劑是wnt通路拮抗劑。在某些實(shí)施方式中，所述治療劑靶向RSFO2或HNF4G和RSPO2融合基因。在特定實(shí)施方式中，所述治療劑是結(jié)合RSPO2或HNF4G和RSPO2融合基因的小干擾RNA(siRNA)。在某些實(shí)施方式中，所述治療劑是結(jié)合RSPO2或HNF4G和RSPO2融合基因的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段。在某些實(shí)施方式中，所述疾病是癌癥。

附圖說(shuō)明

圖1是GA3055中HNF4G-RSPO2基因融合物的示意圖。HNF4G基因的外顯子2融合至RSPO2基因的外顯子2(或在RSPO2-005轉(zhuǎn)錄子的情況下為外顯子1)。

圖2是GA3055中的HNF4G-RSPO2基因融合物的連接序列(SEQ ID NO:4)。大寫(xiě)字母的序列來(lái)自HNF4G，小寫(xiě)字母的序列來(lái)自RSPO2。融合連接處用“|”表示。

圖3顯示GA3055中HNF4G-RSPO2基因融合物對(duì)RSPO2基因表達(dá)的激活。

圖4顯示HNF4G-RSPO2基因融合物連接序列和用于通過(guò)PCR驗(yàn)證融合的引物的位置。大寫(xiě)字母表示HNF4G的序列；小寫(xiě)字母表示RSPO2的序列；框內(nèi)序列表示PCR引物的序列。

圖5表明HNF4G-RSPO2基因融合物交界區(qū)的PCR擴(kuò)增。箭頭指向預(yù)期大小的特異性PCR產(chǎn)物。

圖6顯示HNF4G-RSPO2基因融合物交界區(qū)的RT-PCR產(chǎn)物的直接測(cè)序。

發(fā)明詳述

本公開(kāi)至少部分基于對(duì)作為RSPO2基因的新融合伴侶的HNF4G基因的發(fā)現(xiàn)。特別地，HNF4G和RSPO2的新融合基因在胃癌中發(fā)現(xiàn)。

本公開(kāi)提供了檢測(cè)HNF4G和RSPO2融合基因的方法、用于檢測(cè)所述融合基因或其基因產(chǎn)物的引物組和探針組。還提供了體外和體內(nèi)測(cè)試方法以評(píng)估或鑒定用于抑制或減少所述融合基因或其基因產(chǎn)物的活性劑。

融合基因

本公開(kāi)提供了HNF4G和RSPO2的新融合基因?！叭诤匣颉焙汀盎蛉诤衔铩痹诒疚闹锌苫Q使用，并且旨在涵蓋DNA和RNA，包括但不限于在DNA水平(例如基因組DNA或cDNA)、RNA水平(例如mRNA)上兩個(gè)或更多個(gè)獨(dú)立基因的融合。在特定實(shí)施方式中，由于染色體重排(例如易位、中間缺失或染色體倒位)，兩個(gè)基因在基因組DNA水平上融合。融合基因可以轉(zhuǎn)錄和/或翻譯為其基因產(chǎn)物，所述基因產(chǎn)物可以是RNA或蛋白質(zhì)。

本文提供的融合基因包含與RSPO2的第二序列共價(jià)連接的HNF4G的第一序列。本文所用的“HNF4G”可以指基因(例如DNA序列)或基因轉(zhuǎn)錄物(例如mRNA)。本文所用的“RSPO2”可以指基因(例如DNA序列)、基因轉(zhuǎn)錄物(例如mRNA)或蛋白質(zhì)產(chǎn)物(即氨基酸序列)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以從上下文中理解其含義。本文所用的“編碼序列”是指編碼蛋白質(zhì)產(chǎn)物的至少一個(gè)片段的多核苷酸序列。本文所用的“非編碼序列”是指不編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸序列，或轉(zhuǎn)錄成功能性非編碼RNA的多核苷酸序列。序列可以是DNA序列，如基因組DNA或cDNA，也可以是RNA序列，如mRNA。兩個(gè)編碼序列的融合可以在框內(nèi)，從而在被翻譯成其蛋白質(zhì)產(chǎn)物后，HNF4G的蛋白質(zhì)片段融合至RSPO2的蛋白質(zhì)片段。在融合基因中，HNF4G序列可以是RSPO2的編碼序列的上游5’端或下游3’端。在特定實(shí)施方式中，HNF4G的第一序列位于RSPO2的第二序列的上游5'端。在特定實(shí)施方式中，所述第一序列是非編碼序列，所述第二序列是編碼序列。

所述序列包含一個(gè)或多個(gè)外顯子。HNF4G和RSPO2的外顯子的序列可以獲自公開(kāi)可用的數(shù)據(jù)庫(kù)，例如Ensembl。簡(jiǎn)而言之，Ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)提供了給定基因(如HNF4G或RSPO2)的轉(zhuǎn)錄子，并且對(duì)于每個(gè)轉(zhuǎn)錄子，每個(gè)外顯子序列從5’端至3’端方向按序編號(hào)，并提供了外顯子序列，其中也鑒定了外顯子序列在染色體上起始和結(jié)束的位置。在一些情況下，外顯子序列在不同轉(zhuǎn)錄子中可具有不同的外顯子編號(hào)。例如，外顯子序列可以在轉(zhuǎn)錄子1中編號(hào)為外顯子1，但在轉(zhuǎn)錄子2中編號(hào)為外顯子2，盡管外顯子序列可以本質(zhì)上仍然是相同的。

在某些實(shí)施方式中，HNF4G的第一序列包含(a)如ENST00000396419中所示的HNF4G基因轉(zhuǎn)錄子的外顯子2的至少一部分，或(b)如ENST00000494318中所示的HNF4G基因轉(zhuǎn)錄子的外顯子3的至少一部分。如本文所用，基因轉(zhuǎn)錄子通過(guò)其Ensembl編號(hào)來(lái)鑒定，其相應(yīng)的序列可在萬(wàn)維網(wǎng)Ensemble組織網(wǎng)站(http://asia.ensembl.org/)獲得。關(guān)于Ensemble數(shù)據(jù)庫(kù)的更多細(xì)節(jié)，請(qǐng)參見(jiàn)Flicek等人，Nucleic Acids Research 2014，42Database issue：D749-D755，其通過(guò)引用整體并入本文。

在特定實(shí)施方式中，HNF4G的第一序列包括如下序列：所述序列包含如ENST00000396419中所示的HNF4G基因轉(zhuǎn)錄子的外顯子2的至少一部分，并且所述序列包含SEQ ID NO:1(5’-3’)：

AGCTCCGGGAGCGGCCCGCGCAGGAGCACCAGCGAAAGCAGCCAGTCTGAGATATTGACACTACAGAAAAAACTGACAGCTTACTCCTTGTATTGATTCTACTCTTCTCTACAAATATAGACTCCGTTCCCTACCACAGCCTT。

在特定實(shí)施方式中，HNF4G的第一序列包括如下序列：所述序列包含如ENST00000494318中所示的HNF4G基因轉(zhuǎn)錄子的外顯子3的至少一部分，并且所述序列包含SEQ ID NO:6(5’-3’)：

GCGGCCCGCGCAGTGATTGCTGCCTTGACCGTCCCTGCTCTTGAAGAGCACCAGCGAAAGCAGCCAGTCTGAGATATTGACACTACAGAAAAAACTGACAGCTTACTCCTTGTATTGATTCTACTCTTCTCTACAAATATAGACTCCGTTCCCTACCACAGCCTT。

在某些實(shí)施方式中，RSPO2的第二序列包含：(a)如ENST00000276659、ENST00000517781、ENST00000522333或ENST00000378439中所示的RSPO2基因轉(zhuǎn)錄子的外顯子2的至少一部分，或(b)如ENST00000521956中所示的RSPO2基因轉(zhuǎn)錄子的外顯子1的至少一部分。在特定實(shí)施方式中，RSPO2基因的第二序列包含以下或由以下組成：i)如ENST00000276659所示的RSPO2基因轉(zhuǎn)錄子的外顯子2、外顯子3、外顯子4、外顯子5和外顯子6；ii)如ENST00000517781所示的RSPO2基因轉(zhuǎn)錄子的外顯子2、外顯子3、外顯子4和外顯子5；iii)如ENST00000522333所示的RSPO2基因轉(zhuǎn)錄子的外顯子2和外顯子3；iv)如ENST00000521956所示的RSPO2基因轉(zhuǎn)錄子的外顯子1、外顯子2和外顯子3；或v)如ENST00000378439所示的RSPO2基因轉(zhuǎn)錄子的外顯子2、外顯子3、外顯子4和外顯子5。

在特定實(shí)施方式中，RSPO2的第二序列包含SEQ ID NO:2(5’-3’)：

GTTCGTGGCGGAGAGATGCTGATCGCGCTGAACTGACCGGTGCGGCCCGGGGGTGAGTGGCGAGTCTCCCTCTGAGTCCTCCCCAGCAGCGCGGCCGGCGCCGGCTCTTTGGGCGAACCCTCCAGTTCCTAGACTTTGAGAGGCGTCTCTCCCCCGCCCGACCGCC。

在特定實(shí)施方式中，HNF4G的第一序列包含選自以下的序列：a)如ENST00000396419中所示的HNF4G基因轉(zhuǎn)錄子的外顯子2的至少一部分，和b)如ENST00000494318中所示的HNF4G基因轉(zhuǎn)錄子的外顯子3的至少一部分，并且RSPO2的第二序列包含如ENST00000276659中所示的RSPO2基因轉(zhuǎn)錄子的外顯子2的至少一部分，并且HNF4G基因轉(zhuǎn)錄子ENST00000396419的外顯子2或HNF4G基因轉(zhuǎn)錄子ENST00000494318的外顯子3融合至所述RSPO2基因轉(zhuǎn)錄子的外顯子2。

在特定實(shí)施方式中，HNF4G的第一序列包含選自以下的序列：a)如ENST00000396419中所示的HNF4G基因轉(zhuǎn)錄子的外顯子2的至少一部分，和b)如ENST00000494318中所示的HNF4G基因轉(zhuǎn)錄子的外顯子3的至少一部分，并且RSPO2的第二序列包含如ENST00000517781中所示的RSPO2基因轉(zhuǎn)錄子的外顯子2的至少一部分，并且HNF4G基因轉(zhuǎn)錄子ENST00000396419的外顯子2或HNF4G基因轉(zhuǎn)錄子ENST00000494318的外顯子3融合至所述RSPO2基因轉(zhuǎn)錄子的外顯子2；

在特定實(shí)施方式中，HNF4G的第一序列包含選自以下的序列：a)如ENST00000396419中所示的HNF4G基因轉(zhuǎn)錄子的外顯子2的至少一部分，和b)如ENST00000494318中所示的HNF4G基因轉(zhuǎn)錄子的外顯子3的至少一部分，并且RSPO2的第二序列包含如ENST00000522333中所示的RSPO2基因轉(zhuǎn)錄子的外顯子2的至少一部分，并且HNF4G基因轉(zhuǎn)錄子ENST00000396419的外顯子2或HNF4G基因轉(zhuǎn)錄子ENST00000494318的外顯子3融合至所述RSPO2基因轉(zhuǎn)錄子的外顯子2。

在特定實(shí)施方式中，HNF4G的第一序列包含選自以下的序列：a)如ENST00000396419中所示的HNF4G基因轉(zhuǎn)錄子的外顯子2的至少一部分，和b)如ENST00000494318中所示的HNF4G基因轉(zhuǎn)錄子的外顯子3的至少一部分，并且RSPO2的第二序列包含如ENST00000378439中所示的RSPO2基因轉(zhuǎn)錄子的外顯子2的至少一部分，并且HNF4G基因轉(zhuǎn)錄子ENST00000396419的外顯子2或HNF4G基因轉(zhuǎn)錄子ENST00000494318的外顯子3融合至所述RSPO2基因轉(zhuǎn)錄子的外顯子2。

在特定實(shí)施方式中，HNF4G的第一序列包含選自以下的序列：a)如ENST00000396419中所示的HNF4G基因轉(zhuǎn)錄子的外顯子2的至少一部分，和b)如ENST00000494318中所示的HNF4G基因轉(zhuǎn)錄子的外顯子3的至少一部分，并且RSPO2的第二序列包含如ENST00000521956中所示的RSPO2基因轉(zhuǎn)錄子的外顯子1的至少一部分，并且HNF4G基因轉(zhuǎn)錄子ENST00000396419的外顯子2或HNF4G基因轉(zhuǎn)錄子ENST00000494318的外顯子3融合至所述RSPO2基因轉(zhuǎn)錄子的外顯子1。

HNF4G序列融合至RSPO2序列的位點(diǎn)稱為融合連接處。在某些實(shí)施方式中，本文提供的融合基因包含CCACAGCCTT|gttcgtggcg(SEQ ID NO:3)的融合連接處，其中HNF4G序列是大寫(xiě)字母，RSPO2序列是小寫(xiě)字母。在某些實(shí)施方式中，所述融合基因包含SEQ ID NO:4，其中HNF4G序列是大寫(xiě)字母，RSPO2序列是小寫(xiě)字母(參見(jiàn)圖2)。在特定實(shí)施方式中，所述融合基因包含SEQ ID NO:5，其中HNF4G序列是大寫(xiě)字母，RSPO2序列是小寫(xiě)字母(參見(jiàn)圖4)。

融合基因的某些具體實(shí)例在下表1和圖1中示出。在融合基因中融合在一起的外顯子以粗體標(biāo)記。所有5個(gè)融合基因共享相同的融合連接處，其為SEQ ID NO:3。圖1顯示融合基因中外顯子的示例性排列和融合。

表1

檢測(cè)融合基因和/或其基因產(chǎn)物的方法

本文還提供在含有核酸的樣品中檢測(cè)本文提供的HNF4G和RSPO2融合基因的方法，其包括：使樣品與檢測(cè)試劑接觸，所述檢測(cè)試劑特異性地檢測(cè)包含HNF4G的第一序列和RSPO2的第二序列的融合物的靶多核苷酸，以及檢測(cè)所述靶多核苷酸的存在。

含有核酸的樣品可以源自受試者的細(xì)胞或組織。本文使用的“核酸”可以是RNA的聚合物或DNA的聚合物。樣品可以包含分離的核酸，例如分離的RNA或cDNA?；蛘?，樣品可以包含處于其天然或未純化或未擴(kuò)增狀態(tài)的核酸，例如，樣品可以是分離的細(xì)胞或組織，所述分離的細(xì)胞或組織被任選地預(yù)處理以釋放其中包含的核酸。在另一實(shí)施方式中，樣品中的核酸可以例如通過(guò)PCR反應(yīng)或逆轉(zhuǎn)錄而被擴(kuò)增。

在特定實(shí)施方式中，樣品來(lái)源于疑似患有胃腫瘤或胃癌的受試者。樣品可以是從受試者收集的任何合適的生物材料，例如體液(例如血液)和活檢樣品(例如來(lái)自疾病影響區(qū)域的細(xì)胞或組織)。在特定實(shí)施方式中，樣品來(lái)源于胃腫瘤或癌細(xì)胞或組織?？梢蕴幚順悠芬蕴崛『怂?。

在檢測(cè)方法中，使樣品與寡核苷酸接觸，所述寡核苷酸特異性地檢測(cè)包含融合基因的靶多核苷酸。靶多核苷酸可以是cDNA或mRNA，這取決于樣品中包含的核酸的類型。靶多核苷酸可以包含本文提供的任何融合基因。在特定實(shí)施方式中，靶多核苷酸包含SEQ ID NOs:3-9或其RNA版本中的任一個(gè)。

靶多核苷酸可以基于本領(lǐng)域已知的任何合適的方法檢測(cè)，例如但不限于基于雜交的方法和基于擴(kuò)增的方法?；陔s交的方法通常涉及使用探針來(lái)雜交和檢測(cè)靶序列?；陔s交的方法的例子包括：Northern blot、DNA微陣列、全基因組測(cè)序、RNA測(cè)序(RNA-seq)、定量實(shí)時(shí)PCR(qRT-PCR)、數(shù)字多重基因表達(dá)分析方法(參見(jiàn)例如Kulkarni MM,Curr Protoc Mol Biol.2011年4月，第25章:Unit25B.10)、FISH方法(熒光原位雜交)、CISH(顯色原位雜交)方法、SISH(銀原位雜交)方法等?；跀U(kuò)增的方法通常涉及使用引物、聚合酶和核苷酸單體的混合物，以基于靶模板多核苷酸的堿基序列合成新生多核苷酸鏈?；跀U(kuò)增的方法的例子包括：PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))、LCR(連接酶鏈反應(yīng))、SDA(鏈置換擴(kuò)增)、等溫和嵌合引物啟動(dòng)的核酸擴(kuò)增、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增等。

在特定實(shí)施方式中，檢測(cè)步驟涉及擴(kuò)增步驟。在這種情況下，檢測(cè)試劑包含至少一對(duì)引物，所述引物可以與靶多核苷酸雜交，并在聚合酶存在下擴(kuò)增包含融合連接處的靶區(qū)域。在一種實(shí)施方式中，檢測(cè)試劑包含針對(duì)HNF4G的第一序列的第一引物和針對(duì)RSPO2的第二序列的第二引物。本文所用的“針對(duì)”序列的引物或探針是指引物或探針與序列的至少一部分具有足夠的同一性或互補(bǔ)性，使得引物或探針可以與序列或其互補(bǔ)鏈特異性地雜交。本文所用的“特異性地雜交”是指引物或探針可在嚴(yán)格條件下與預(yù)期序列雜交。本文所用的“嚴(yán)格條件”是指在42℃下在由5×SSPE、5×Denhardt溶液、0.5％SDS和100ug/mL變性鮭精DNA組成的溶液中雜交，然后在42℃下用包含0.5×SSC和0.1％SDS的溶液洗滌。

在另一實(shí)施方式中，檢測(cè)試劑包含針對(duì)含有融合連接處的片段的連接引物和針對(duì)第一或第二序列的非連接引物。連接引物將特異性地與融合連接處雜交，從而在靶多核苷酸存在時(shí)特異性地實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增。否則，如果樣品中的核酸不含靶多核苷酸，則連接引物不會(huì)與其靶序列特異性雜交，并且不能實(shí)現(xiàn)有意義的擴(kuò)增。

在通過(guò)合適的核酸擴(kuò)增方法(例如PCR)擴(kuò)增后，檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。在特定實(shí)施方式中，擴(kuò)增產(chǎn)物具有100bp-1500bp(例如100bp-1000bp、100bp-900bp、100bp-800bp、100bp-700bp、100bp-600bp、100bp-500bp、100bp-400bp、100bp-350bp、100bp-300bp、200bp-1000bp、200bp-900bp、200bp-800bp、200bp-700bp、200bp-600bp、200bp-500bp、200bp-400bp、200bp-350bp、200bp-300bp等)的長(zhǎng)度。在特定實(shí)施方式中，擴(kuò)增產(chǎn)物的存在將指示靶多核苷酸的存在。在特定實(shí)施方式中，進(jìn)一步檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量或大小或序列，并且擴(kuò)增產(chǎn)物的期望大小或序列表明靶多核苷酸的存在。

當(dāng)靶多核苷酸是RNA時(shí)，擴(kuò)增步驟可任選地進(jìn)一步包括逆轉(zhuǎn)錄步驟以產(chǎn)生樣品中的RNA的cDNA。然后使用引物擴(kuò)增cDNA，以允許檢測(cè)融合連接處的存在。

本文提供的引物具有約10-100bp(例如10-50bp、10-40bp、10-30bp、10-25bp等)的長(zhǎng)度。在特定實(shí)施方式中，第一引物包含與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:6的等長(zhǎng)部分互補(bǔ)的至少10(例如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20等)個(gè)連續(xù)核苷酸，并且第二引物包含SEQ ID NO:2的等長(zhǎng)部分的至少10(例如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20等)個(gè)連續(xù)核苷酸。在特定實(shí)施方式中，第一引物包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:6的等長(zhǎng)部分的至少10(例如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20等)個(gè)連續(xù)核苷酸，并且第二引物包含與SEQ ID NO:2的等長(zhǎng)部分互補(bǔ)的至少10(例如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20等)個(gè)連續(xù)核苷酸。

在特定實(shí)施方式中，第一引物或第二引物針對(duì)融合基因的融合連接處上游或下游至少80bp的區(qū)域。在特定實(shí)施方式中，融合基因包含SEQ ID NO:3的融合連接處。在特定實(shí)施方式中，第一引物和第二引物可用于擴(kuò)增長(zhǎng)度為約200bp至400bp的擴(kuò)增子。在特定實(shí)施方式中，第一引物是針對(duì)SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:6，并且第二引物是針對(duì)SEQ ID NO:2。在特定實(shí)施方式中，第一引物和第二引物選自如下組成的組：

5’CAGGAGCACCAGCGAAAG 3’(SEQ ID NO:7)和5’TGAGGGCAAAGGAGAAAAGG 3’(SEQ ID NO:8)。

連接引物包含SEQ ID NO:3的至少6(例如6、7、8、9或10)個(gè)連續(xù)核苷酸，或包含與SEQ ID NO:3的等長(zhǎng)部分互補(bǔ)的至少6個(gè)連續(xù)核苷酸。在特定實(shí)施方式中，連接引物包含SEQ ID NO:3或與SEQ ID NO:3互補(bǔ)。一旦確定了連接引物，可以基于擴(kuò)增產(chǎn)物的期望長(zhǎng)度設(shè)計(jì)非連接引物。例如，當(dāng)期望有300bp的擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，非連接引物可以設(shè)計(jì)為與融合連接處上游5’端或融合連接處下游3’端約300bp處的靶多核苷酸互補(bǔ)。

在特定實(shí)施方式中，檢測(cè)步驟包括雜交步驟?？梢詫⑻结樤O(shè)計(jì)成與靶多核苷酸特異性地雜交，從而達(dá)到其檢測(cè)作用。本文提供的探針可具有合適的長(zhǎng)度，例如約20-200bp(例如20-190bp、20-150bp、20-120bp、20-100bp、20-90bp、20-80bp、20-70bp、20-60bp、20-50bp、20-40bp等)。

在特定實(shí)施方式中，檢測(cè)試劑包含針對(duì)HNF4G的第一序列的第一探針和針對(duì)RSPO2的第二序列的第二探針。在特定實(shí)施方式中，第一探針包含針對(duì)SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:6的等長(zhǎng)部分的至少10(例如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20等)個(gè)連續(xù)核苷酸，并且第二探針包含針對(duì)SEQ ID NO:2的等長(zhǎng)部分的至少10(例如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20等)個(gè)連續(xù)核苷酸。在說(shuō)明性實(shí)例中，第一和第二探針之一可以是捕獲探針，其還包含能夠通過(guò)共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵與底物結(jié)合的固定部分，另一探針可以是還包含可檢測(cè)標(biāo)記的檢測(cè)探針。捕獲探針可以首先與樣品接觸以允許與核酸雜交，然后通過(guò)捕獲探針上的固定部分將復(fù)合物固定在底物上，并除去未結(jié)合的分子。然后將檢測(cè)探針加入到固定的復(fù)合物中以允許發(fā)生雜交。在洗去多余的探針后，檢測(cè)固定在底物上的可檢測(cè)標(biāo)記。固定部分的說(shuō)明性實(shí)例包括但不限于生物素、鏈霉親和素、抗原、抗體、蛋白A、蛋白G、寡核苷酸等。檢測(cè)探針上的可檢測(cè)標(biāo)記可以是例如熒光染料、放射性同位素、抗體、酶和寡核苷酸(例如寡核苷酸條形碼)。在另一個(gè)說(shuō)明性實(shí)例中，第一和第二探針之一還包含熒光染料，另一探針包含淬滅劑。在兩個(gè)探針與靶多核苷酸結(jié)合后，兩個(gè)探針彼此接近，使得一個(gè)探針上的淬滅劑淬滅另一探針上的染料的熒光信號(hào)。熒光染料的說(shuō)明性實(shí)例包括但不限于異硫氰酸熒光素(FITC)、Alexa 488、Alexa 532、cy3、cy5、6-joe、EDANS；羅丹明6G(P6G)及其衍生物(四甲基羅丹明(TMR)、四甲基異硫氰酸羅丹明(TMRITC)、x-羅丹明、德克薩斯紅、“BODJPY FL”(商品名，Molecular Probes公司(Eugene，Oregon，USA)產(chǎn)品、“BODIPY FL/C3”(商品名，Molecular Probes公司產(chǎn)品)，“BODIPY EL/C6”(商品名，Molecular Probes公司產(chǎn)品)、“BODIPY 5-FAM”(商品名，Molecular Probes公司產(chǎn)品)、“BODIPY TMR”(商品名，Molecular Probes公司產(chǎn)品)及其衍生物(例如，“BODIPY TR”(商品名，Molecular Probes公司產(chǎn)品)、“BODIPY R6G”(商品名，Molecular Probes公司產(chǎn)品)、“BODIPY 564”(商品名，Molecular Probes公司產(chǎn)品)和“BODIPY 581”(商品名，Molecular Probes公司產(chǎn)品))。淬滅劑的說(shuō)明性實(shí)例包括但不限D(zhuǎn)abcyl、“QSY7”(Molecular Probes)、“QSY33”(Molecular Probes)、二茂鐵及其衍生物、甲基紫精和N,N'-二甲基-2,9-二氮雜芘等。

在特定實(shí)施方式中，檢測(cè)試劑包含針對(duì)含有融合連接處的片段的連接探針。連接探針包含與SEQ ID NO:3等長(zhǎng)的至少6(例如，6、7、8、9或10)個(gè)連續(xù)核苷酸，或包含與SEQ ID NO:3的等長(zhǎng)互補(bǔ)的至少6個(gè)連續(xù)核苷酸。連接探針還可包含可檢測(cè)標(biāo)記。在說(shuō)明性實(shí)例中，樣品中的核酸可以固定在底物上，然后與識(shí)別融合連接處的探針接觸。在洗去未反應(yīng)的探針后，可以檢測(cè)底物以確定是否存在探針，這可以表明融合基因的融合連接處的存在。在另一個(gè)說(shuō)明性實(shí)例中，連接探針可以包含熒光染料和淬滅劑兩者，從而當(dāng)探針是完整的時(shí)，淬滅劑淬滅染料的熒光。該探針可用于一種擴(kuò)增方法，在這種擴(kuò)增方法中，使用具有5'-3'核酸外切酶活性的聚合酶(例如Taq聚合酶)來(lái)擴(kuò)增包含融合連接處的靶區(qū)域。在擴(kuò)增期間，與融合連接處雜交的探針在其沿著靶多核苷酸前進(jìn)時(shí)被聚合酶降解，從而分離探針上的熒光染料和淬滅劑，并允許熒光染料發(fā)射其待檢測(cè)的信號(hào)。

另一方面，本公開(kāi)還提供了在含蛋白質(zhì)的樣品中檢測(cè)本文提供的融合基因的方法，所述方法包括使樣品與檢測(cè)試劑接觸，所述檢測(cè)試劑特異性地檢測(cè)由融合基因編碼的融合蛋白，并檢測(cè)融合蛋白的存在。

可以檢測(cè)由融合基因編碼的融合蛋白的存在和水平。例如，樣品可以與融合蛋白的特異性抗體接觸，并且可以使用本領(lǐng)域已知的方法檢測(cè)抗體和融合蛋白之間的復(fù)合物的形成，所述方法例如，免疫組織化學(xué)測(cè)定、蛋白質(zhì)印跡法、ELISA、ELIFA、熒光免疫測(cè)定法、放射免疫測(cè)定法、酶免疫測(cè)定法、雙抗體夾心法等。

試劑盒

本文提供的引物組或探針組或連接探針可用于檢測(cè)HNF4G和RSPO2融合基因。因此，本公開(kāi)的另一方面涉及包含本文所述的引物組或探針組或連接探針的試劑盒。

在特定實(shí)施方式中，試劑盒包含針對(duì)HNF4G的第一序列的第一引物和針對(duì)RSPO2的第二序列的第二引物。在特定實(shí)施方式中，試劑盒包含針對(duì)含有HNF4G和RSPO2的融合連接處的片段的連接引物，以及針對(duì)HNF4G的第一序列或針對(duì)RSPO2的第二序列的非連接引物。

在特定實(shí)施方式中，試劑盒包含針對(duì)HNF4G的第一序列的第一探針和針對(duì)RSPO2的第二序列的第二探針。在特定實(shí)施方案中，試劑盒包含針對(duì)含有融合連接處的片段的連接探針。

本文提供的試劑盒可以進(jìn)一步包含一種或多種用于檢測(cè)的組分，例如聚合酶、用于擴(kuò)增的緩沖液和/或用于探針雜交的緩沖液。

使用方法

本公開(kāi)還提供了使用融合基因的方法。

HNF4G-RSPO2的基因融合是人第8條染色體上的染色體內(nèi)重排。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，這種HNF4G和RSPO2融合基因存在于胃癌組織中，而先前的R-SPONDIN蛋白基因融合物僅在結(jié)腸直腸腫瘤樣品中有過(guò)描述。因此，HNF4G和RSPO2的融合基因可以是對(duì)融合基因呈陽(yáng)性的疾病(特別是對(duì)于與wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的疾病)的藥物靶標(biāo)。

一方面，本公開(kāi)提供了鑒定可用于治療受試者中對(duì)HNF4G和RSPO2融合基因呈陽(yáng)性的疾病的候選試劑的方法，所述方法包括：提供對(duì)所述融合基因呈陽(yáng)性的細(xì)胞，將所述細(xì)胞暴露于候選試劑，以及鑒定調(diào)節(jié)所述融合基因或其基因產(chǎn)物的生物活性的候選試劑。

本文使用的術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)”是指融合基因或其基因產(chǎn)物的表達(dá)水平和/或生物活性的上調(diào)或下調(diào)。在特定實(shí)施方式中，細(xì)胞源自對(duì)HNF4G和RSPO2融合基因呈陽(yáng)性的受試者的組織或樣品。在特定實(shí)施方式中，細(xì)胞源自具有胃腫瘤或胃癌的受試者的組織或樣品，這些受試者被檢測(cè)為對(duì)融合基因呈陽(yáng)性。在特定實(shí)施方式中，細(xì)胞可以被基因工程化以包含融合基因。在特定實(shí)施方式中，候選試劑可以包括但不限于核酸、小的有機(jī)或無(wú)機(jī)分子和抗體或其抗原結(jié)合片段。在特定實(shí)施方式中，候選試劑是wnt通路拮抗劑。在特定實(shí)施方式中，候選試劑靶向RSPO2或HNF4G和RSPO2融合基因。在特定實(shí)施方式中，候選試劑是結(jié)合RSPO2或HNF4G和RSPO2融合基因的小干擾RNA(siRNA)。在特定實(shí)施方式中，候選試劑是結(jié)合RSPO2或HNF4G和RSPO2融合基因的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段。

在特定實(shí)施方式中，本公開(kāi)還提供了評(píng)估測(cè)試試劑對(duì)HNF4G和RSPO2融合基因的影響的方法，所述方法包括：獲得對(duì)所述融合基因呈陽(yáng)性的細(xì)胞；將所述細(xì)胞暴露于所述測(cè)試試劑；以及測(cè)定所述測(cè)試試劑對(duì)所述融合基因或所述細(xì)胞的影響。測(cè)試試劑對(duì)融合基因的影響可以是，例如降低或提高融合基因或其基因產(chǎn)物的表達(dá)水平和/或生物活性。

另一方面，本公開(kāi)提供了治療與HNF4G和RSPO2融合基因相關(guān)的疾病的方法，所述方法包括施用有效量的治療劑，從而治療所述疾病，所述治療劑能夠調(diào)節(jié)所述融合基因或其基因產(chǎn)物的生物活性。

在特定實(shí)施方式中，所述疾病是涉及不受控制的細(xì)胞生長(zhǎng)的增殖性疾病。在特定實(shí)施方式中，所述疾病是腫瘤或癌癥。在特定實(shí)施方式中，所述疾病是胃腫瘤或胃癌。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“處理”或“治療”是指一種或多種治療行為，其為了具有一種或多種期望的或有益的結(jié)果而進(jìn)行，并且可以用于預(yù)防或在臨床病理學(xué)過(guò)程期間進(jìn)行。在本發(fā)明中，期望的或有益的治療包括但不限于以下的一種或多種：預(yù)防疾病的發(fā)作或復(fù)發(fā)、減輕由疾病導(dǎo)致的一種或多種癥狀、減輕疾病的病理后果、預(yù)防轉(zhuǎn)移、改善疾病、提高患病人群的生活質(zhì)量、減少治療疾病所需的其它藥物的劑量、延遲疾病進(jìn)展和/或延長(zhǎng)患病人群的生存期。在特定實(shí)施方式中，治療劑可以是如下中的任一種：抗體或其抗原結(jié)合片段、結(jié)合蛋白、小的有機(jī)或無(wú)機(jī)分子、核酸及其任意組合。

在特定實(shí)施方式中，治療劑包括但不限于核酸、小的有機(jī)或無(wú)機(jī)分子和抗體或其抗原結(jié)合片段。在特定實(shí)施方式中，治療劑是wnt通路拮抗劑。在特定實(shí)施方式中，治療劑靶向RSPO2或HNF4G和RSPO2融合基因。在特定實(shí)施方式中，治療劑是結(jié)合RSPO2或HNF4G和RSPO2融合基因的小干擾RNA(siRNA)。在某些實(shí)施方式中，治療劑是結(jié)合RSPO2或HNF4G和RSPO2融合基因的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段。本發(fā)明還提供了評(píng)估測(cè)試試劑對(duì)HNF4G和RSPO2融合基因的影響的方法，所述方法包括：獲得對(duì)所述融合基因呈陽(yáng)性的細(xì)胞；將所述細(xì)胞暴露于所述測(cè)試試劑；以及測(cè)定所述測(cè)試試劑對(duì)所述融合基因或所述細(xì)胞的影響。

如本文所用，表述“測(cè)試試劑的影響”可包括對(duì)融合基因的表達(dá)水平或生物學(xué)活性，和/或?qū)θ诤匣虻牡鞍踪|(zhì)產(chǎn)物的表達(dá)水平或生物學(xué)活性的影響。

在某些實(shí)施方式中，測(cè)試試劑是wnt通路拮抗劑。在某些實(shí)施方式中，治療劑是wnt通路拮抗劑。在某些實(shí)施方式中，測(cè)試試劑靶向RSPO2或HNF4G和RSPO2融合基因或融合基因的基因產(chǎn)物。在特定實(shí)施方式中，測(cè)試試劑是結(jié)合RSPO2或HNF4G和RSPO2融合基因的小干擾RNA(siRNA)。在某些實(shí)施方式中，測(cè)試試劑是結(jié)合RSPO2或HNF4G和RSPO2融合基因的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段。在特定實(shí)施方式中，所述疾病是腫瘤或癌癥。在特定實(shí)施方式中，所述疾病是胃腫瘤或胃癌。

動(dòng)物模型和動(dòng)物模型的用途

另一方面，本公開(kāi)提供了用于對(duì)HNF4G和RSPO2融合基因呈陽(yáng)性的人類疾病的動(dòng)物模型，其包括含有本文提供的融合基因的人異種移植物。

人異種移植物包含對(duì)HNF4G和RSPO2融合基因呈陽(yáng)性的細(xì)胞或組織，其在被移植到動(dòng)物之后可以模擬或模仿與融合基因相關(guān)的人類疾病或疾病病變?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的任何合適的方法將異種移植物移植到動(dòng)物模型上，例如通過(guò)皮下、腹膜內(nèi)或靜脈注射移植細(xì)胞；或者通過(guò)手術(shù)植入一部分組織。在某些實(shí)施方式中，異種移植物是癌細(xì)胞，并且通過(guò)皮下注射移植到動(dòng)物模型。在特定實(shí)施方式中，異種移植物是源自人胃腫瘤或胃癌的細(xì)胞或組織。融合基因的存在可導(dǎo)致疾病的不同，例如，疾病的不同嚴(yán)重性、疾病的不同亞型、疾病的不同階段、對(duì)特定治療劑的不同響應(yīng)性等。因此，本文提供的動(dòng)物模型可特別用于研究與融合基因相關(guān)的人類疾病，以及評(píng)估疾病對(duì)特定治療劑的反應(yīng)性。在特定實(shí)施方式中，所述疾病是腫瘤或癌癥。在特定實(shí)施方式中，所述疾病是胃腫瘤或胃癌。

本文所用的術(shù)語(yǔ)“動(dòng)物”是指除人以外的所有脊椎動(dòng)物，優(yōu)選哺乳動(dòng)物，例如狗、豬、兔或嚙齒目動(dòng)物(例如小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠、豚鼠等)。在特定實(shí)施方式中，動(dòng)物模型是哺乳動(dòng)物。在特定實(shí)施方式中，動(dòng)物模型是嚙齒目動(dòng)物。在特定實(shí)施方式中，嚙齒目動(dòng)物是小鼠、大鼠、豚鼠或倉(cāng)鼠。在特定實(shí)施方式中，動(dòng)物模型是免疫缺陷的。免疫缺陷動(dòng)物缺乏活化內(nèi)源性T細(xì)胞、活化內(nèi)源性B細(xì)胞和活化內(nèi)源性自然殺傷細(xì)胞。免疫缺陷動(dòng)物的實(shí)例包括，例如：T淋巴細(xì)胞缺陷動(dòng)物(例如，BALB/c裸鼠、C57BL裸鼠、NIH裸鼠、裸大鼠等)；B淋巴細(xì)胞缺陷動(dòng)物(例如CBA/N小鼠)；NK細(xì)胞缺陷動(dòng)物(例如Beige小鼠)；聯(lián)合免疫缺陷動(dòng)物(例如重癥聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠(T、B淋巴細(xì)胞聯(lián)合免疫缺陷型)，Beige/Nude(T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞聯(lián)合免疫缺陷型)，SCID Beige/SCID NOD小鼠(T、B淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞聯(lián)合免疫缺陷型))，以及經(jīng)處理或操作以具有類似于任何上述免疫缺陷動(dòng)物的免疫系統(tǒng)的動(dòng)物。

另一方面，本公開(kāi)提供了評(píng)估測(cè)試試劑對(duì)HNF4G和RSPO2融合基因呈陽(yáng)性的人類疾病的影響的方法，所述方法包括：獲得用于本文提供的人類疾病的動(dòng)物模型；將所述測(cè)試試劑施用至所述動(dòng)物模型；測(cè)定所述測(cè)試試劑對(duì)人異種移植物的影響；以及評(píng)價(jià)所述測(cè)試試劑對(duì)所述人類疾病的影響。

在特定實(shí)施方式中，測(cè)試試劑可以包括但不限于核酸、小的有機(jī)或無(wú)機(jī)分子和抗體或其抗原結(jié)合片段。在某些實(shí)施方式中，測(cè)試試劑是wnt通路拮抗劑。在某些實(shí)施方式中，治療劑靶向RSPO2或HNF4G和RSPO2融合基因。在特定實(shí)施方式中，測(cè)試試劑是結(jié)合RSPO2或HNF4G和RSPO2融合基因的小干擾RNA(siRNA)。在某些實(shí)施方式中，測(cè)試試劑是結(jié)合RSPO2或HNF4G和RSPO2融合基因的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段。在特定實(shí)施方式中，所述疾病是腫瘤或癌癥。在特定實(shí)施方式中，所述疾病是胃腫瘤或胃癌。可以以一個(gè)或多個(gè)合適劑量將測(cè)試試劑施用至動(dòng)物模型，并且可以評(píng)估對(duì)動(dòng)物模型的影響?？梢砸员绢I(lǐng)域已知的任何合適的方式將測(cè)試試劑施用至動(dòng)物模型。在某些實(shí)施方式中，測(cè)試試劑可以通過(guò)口服、胃腸、局部、直腸內(nèi)、靜脈內(nèi)、經(jīng)皮、經(jīng)粘膜等施用。在特定實(shí)施方式中，術(shù)語(yǔ)“合適劑量”或“劑量”是指包含預(yù)定量的測(cè)試試劑的物理上分立的單位，其被計(jì)算以產(chǎn)生期望的效果。在特定實(shí)施方式中，以單劑量或多劑量施用至動(dòng)物。在特定實(shí)施方式中，所述評(píng)價(jià)通過(guò)單次或多次進(jìn)行。在特定實(shí)施方式中，在施用測(cè)試試劑之前和之后，在來(lái)自動(dòng)物的樣品或標(biāo)本(例如，血液、活組織檢查)中進(jìn)行評(píng)估。在某些實(shí)施方式中，通過(guò)觀察施用測(cè)試試劑前后動(dòng)物的物理變化(例如體重減輕/增加、精神狀態(tài))來(lái)進(jìn)行測(cè)試。在特定實(shí)施方式中，通過(guò)比較施用測(cè)試試劑前后動(dòng)物模型中異種移植物的大小/重量和/或比較某些生物標(biāo)志物的存在和/或水平來(lái)進(jìn)行評(píng)估。

提供以下實(shí)例以說(shuō)明本發(fā)明。它們不以任何方式限制本發(fā)明。

實(shí)施例

實(shí)施例1：來(lái)自患者的異種移植(PDX)模型的基因組分析

來(lái)自患者的異種移植物(PDX)反映患者的病理和遺傳圖譜，因此被評(píng)價(jià)為用于研究腫瘤發(fā)生和個(gè)性化治療的預(yù)測(cè)性實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。為了更好地了解癌癥發(fā)展的基本機(jī)制，以及鑒別生物標(biāo)志物和分子靶標(biāo)以進(jìn)行有效的癌癥診斷和治療，在50個(gè)PDX胃癌模型的集合上進(jìn)行基因組譜分析。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案，使用試劑制備和純化得到總RNA，所述總RNA源自50個(gè)PDX模型的快速冷凍的腫瘤組織。在Illumina HiSeq 2500平臺(tái)上進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，隨后使用SOAPfuse和Defuse軟件對(duì)融合基因進(jìn)行RNAseq(如表2所示)數(shù)據(jù)分析。

表2.在PDX模型GA3055中檢測(cè)到HNF4G-RSPO2基因融合

通過(guò)RNA-seq技術(shù)從50個(gè)PDX胃癌模型(參見(jiàn)圖3)產(chǎn)生的基因表達(dá)數(shù)據(jù)使用log10(FPKM)表示。最低log10(FPKM)設(shè)置為-2。當(dāng)將表達(dá)值繪圖時(shí)，log10(FPKM)小于-2的基因顯示在-2處。用于RNA-seq分析的基因和轉(zhuǎn)錄子基于ENSEMBL數(shù)據(jù)庫(kù)版本66，可以很方便的在網(wǎng)站“http://feb2012.archive.embembl.org/index.html”上搜索相關(guān)的基因信息。

在胃癌PDX模型中通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序檢測(cè)HNF4G-RSPO2基因融合。這是在人胃癌異種移植物樣品中首次發(fā)現(xiàn)的這種基因融合構(gòu)建體的報(bào)告。

在檢查的超過(guò)50個(gè)胃PDX模型中，發(fā)現(xiàn)只有一個(gè)模型含有HNF4G-RSPO2基因融合，其可能代表胃癌患者的亞群。HNF4G-RSPO2融合事件似乎激活了RSPO2基因的表達(dá)，因?yàn)槠溆辔赴㏄DX模型不表達(dá)該基因。

實(shí)施例2：使用PCR驗(yàn)證癌組織模型中的HNF4G-RSPO2基因融合

為了驗(yàn)證HNF4G-RSPO2融合基因的存在，從癌癥組織模型中提取RNA，并使用試劑根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行純化。然后按照標(biāo)準(zhǔn)方案使用逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA，隨后進(jìn)行基因特異性PCR擴(kuò)增和直接測(cè)序。從如圖4所示的基因融合連接處位置設(shè)計(jì)如表3所示的引物。

表3.引物信息

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)在由以下組成的50μl反應(yīng)體系中進(jìn)行：1μl樣品cDNA、5μl10X PCR緩沖液，1μl每種引物，4μl dNTP和1μl TaqE。循環(huán)條件如下：在94℃下初始變性10分鐘，隨后是在94℃下變性30秒、在55-65℃下退火30秒和在72℃下延伸30秒的40個(gè)循環(huán)，最后在72℃下延伸7分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯現(xiàn)(參見(jiàn)圖5)。

通過(guò)使用正向(上部)和反向(底部)引物的Sanger測(cè)序方法對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，并且通過(guò)RNA測(cè)序檢測(cè)顯示了色譜圖具有一致的序列接合(參見(jiàn)圖6)。因此，通過(guò)RT-PCR和直接測(cè)序證實(shí)了HNF4G-RSPO2基因融合的存在。

在胃癌PDX模型中鑒定HNF4G-RSPO2基因融合為研究具有相似遺傳背景的癌癥患者中的腫瘤發(fā)生提供了一種有價(jià)值的工具。此外，基因融合模型還為評(píng)估靶向R-spondin蛋白或Wnt信號(hào)通路成員的新型抗癌藥物提供了一種有價(jià)值的工具。

雖然已經(jīng)參照特定實(shí)施例(其中一些是優(yōu)選實(shí)施例)具體示出和描述了本發(fā)明，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，在不脫離本文公開(kāi)的本發(fā)明的精神和范圍的情況下，可在形式和細(xì)節(jié)上進(jìn)行各種改變。

序列表

<110> 中美冠科(太倉(cāng))生物技術(shù)有限公司

<120> HNF4G-RSPO2融合基因及其在癌癥治療中的用途

<130> 061557-8011WO01

<150> CN201410135569.9

<151> 2014-04-04

<160> 8

<170> PatentIn 3.3版本

<210> 1

<211> 143

<212> DNA

<213> 智人

<400> 1

agctccggga gcggcccgcg caggagcacc agcgaaagca gccagtctga gatattgaca 60

ctacagaaaa aactgacagc ttactccttg tattgattct actcttctct acaaatatag 120

actccgttcc ctaccacagc ctt 143

<210> 2

<211> 166

<212> DNA

<213> 智人

<400> 2

gttcgtggcg gagagatgct gatcgcgctg aactgaccgg tgcggcccgg gggtgagtgg 60

cgagtctccc tctgagtcct ccccagcagc gcggccggcg ccggctcttt gggcgaaccc 120

tccagttcct agactttgag aggcgtctct cccccgcccg accgcc 166

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 智人

<400> 3

ccacagcctt gttcgtggcg 20

<210> 4

<211> 331

<212> DNA

<213> 智人

<400> 4

gcggcccgcg cagtgattgc tgccttgacc gtccctgctc ttgaagagca ccagcgaaag 60

cagccagtct gagatattga cactacagaa aaaactgaca gcttactcct tgtattgatt 120

ctactcttct ctacaaatat agactccgtt ccctaccaca gccttgttcg tggcggagag 180

atgctgatcg cgctgaactg accggtgcgg cccgggggtg agtggcgagt ctccctctga 240

gtcctcccca gcagcgcggc cggcgccggc tctttgggcg aaccctccag ttcctagact 300

ttgagaggcg tctctccccc gcccgaccgc c 331

<210> 5

<211> 343

<212> DNA

<213> 智人

<400> 5

agctccggga gcggcccgcg caggagcacc agcgaaagca gccagtctga gatattgaca 60

ctacagaaaa aactgacagc ttactccttg tattgattct actcttctct acaaatatag 120

actccgttcc ctaccacagc cttgttcgtg gcggagagat gctgatcgcg ctgaactgac 180

cggtgcggcc cgggggtgag tggcgagtct ccctctgagt cctccccagc agcgcggccg 240

gcgccggctc tttgggcgaa ccctccagtt cctagacttt gagaggcgtc tctcccccgc 300

ccgaccgccc agatgcagtt tcgccttttc tcctttgccc tca 343

<210> 6

<211> 165

<212> DNA

<213> 智人

<400> 6

gcggcccgcg cagtgattgc tgccttgacc gtccctgctc ttgaagagca ccagcgaaag 60

cagccagtct gagatattga cactacagaa aaaactgaca gcttactcct tgtattgatt 120

ctactcttct ctacaaatat agactccgtt ccctaccaca gcctt 165

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 7

caggagcacc agcgaaag 18

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 8

tgagggcaaa ggagaaaagg 20