專利名稱：煙草煙堿脫甲基酶基因組克隆及其應(yīng)用的制作方法
煙草煙堿脫甲基酶基因組克隆及其應(yīng)用本申請是國際申請日為2005年4月20日，發(fā)明名稱為“煙草煙堿脫甲基酶基因組 克隆及其應(yīng)用”即中國專利申請200580019669. 4的分案申請。本發(fā)明涉及編碼煙堿脫甲基酶的核酸序列和使用那些核酸序列來改變植物表型 的方法。細(xì)胞色素p450s催化廣泛范圍的在化學(xué)上不相似的底物的酶促反應(yīng)，其包括內(nèi) 源性和異生底物的氧化、過氧化和還原代謝。在植物中，p450s參與生化途徑，所述生化 途徑包括植物產(chǎn)物諸如phenylpropanoids，生物堿，類萜，脂質(zhì)，氰苷和芥子油苷的合成 (Chappel 1, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 46 :521_547，1995)。細(xì)胞色素 p450s，也已知為p450血紅素-硫醇鹽蛋白質(zhì)，通常充當(dāng)被稱為包含p450的單氧化酶系統(tǒng) 的多成分電子傳遞鏈中的末端氧化酶。由這些酶系統(tǒng)催化的具體反應(yīng)包括脫甲基作用，羥 基化作用，環(huán)氧化作用，N-氧化作用，硫代氧化作用，N-、S-、和0-脫烷基化，脫硫作用，脫氨 作用和偶氮、硝基和N-氧化物基團(tuán)的還原作用。煙草屬(Nicotiana)植物p450酶的多樣作用涉及對多種植物代謝物的影響，所述 植物代謝物諸如Phenylpropanoids，生物堿，類萜，脂質(zhì)，氰苷，芥子油苷和許多其它的化學(xué) 實(shí)體。一些P450酶可以影響植物代謝物的組成。例如，長期以來，理想的是通過育種來改 變植物的選定脂肪酸的模式從而改善某些植物的香味和香氣；然而關(guān)于涉及控制這些葉組 分的水平的機(jī)制知道的很少。與脂肪酸改變相關(guān)的P450酶的下調(diào)或上調(diào)可以促進(jìn)理想的 脂肪酸的積累，這提供了更為優(yōu)選的葉表型的品質(zhì)。關(guān)于p450酶的功能和它們在植物組分中的更多作用仍舊在發(fā)現(xiàn)中。例如，發(fā)現(xiàn)一 類特殊的P450酶催化脂肪酸分解為揮發(fā)性C6-和C9-醛和β -醇，其是水果和蔬菜的“鮮 綠”氣味的主要起作用的因素。可以改變其它新的目標(biāo)p450s的水平，從而通過改變在煙草 屬葉中的脂質(zhì)組成和相關(guān)的分解代謝物來提高葉子組分的品質(zhì)。這些葉組分中的一些受到 刺激葉品質(zhì)成熟的衰老的影響。還有其它的報(bào)道顯示p450s酶在改變脂肪酸中具有功能性 作用，所述脂肪酸涉及植物_病原體相互作用和疾病抗性。在其它的情形中，已經(jīng)顯示p450酶涉及生物堿的生物合成。如通過申請人的專 利申請所提供，去甲煙堿，一種在煙草(Nicotiana tabacum)中發(fā)現(xiàn)的次要生物堿，通過 P450-介導(dǎo)的煙堿的脫甲基作用隨后在N位點(diǎn)進(jìn)行?；饔煤蛠喯趸饔糜纱水a(chǎn)生一系列 的N-?；ゼ谉焿A和N-亞硝基去甲煙堿而產(chǎn)生，本申請要求所述專利申請的優(yōu)先權(quán)，并且 將所述專利申請并入本文作為參考。認(rèn)為由P450脫甲基酶催化的N-脫甲基作用是煙草屬 中去甲煙堿生物合成中的主要來源。在本領(lǐng)域中存在對于改進(jìn)植物表型的試劑和方法的需要。特別地，存在對于改進(jìn) 煙堿脫甲基酶的試劑和方法的需要。本發(fā)明提供許多用于改進(jìn)煙堿脫甲基酶的表達(dá)的策 略。發(fā)明概述本申請人已經(jīng)鑒定和表征了來自煙草的煙堿脫甲基酶的基因組克隆。包括在本文
4中的是，煙堿脫甲基酶蛋白質(zhì)編碼區(qū)的序列，3'非翻譯序列(“3' UTR")，單一內(nèi)含子和 煙堿脫甲基酶基因啟動(dòng)子及其轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列(


圖1)。另外描述的是將這些序列用于產(chǎn)生轉(zhuǎn) 基因植物的應(yīng)用，所述轉(zhuǎn)基因植物相對于對照植物，具有去甲煙堿或N’ -亞硝基去甲煙堿 ("NNN")或兩者的改變的水平。因此，在第一個(gè)方面，本發(fā)明的特征是分離的核酸分子，例如包含編碼煙堿脫甲基 酶的核苷酸序列的DNA序列。在理想的實(shí)施方案中，第一個(gè)方面的核苷酸序列基本上與編 碼煙草煙堿脫甲基酶的核苷酸序列相同，所述煙草煙堿脫甲基酶諸如這樣的煙草煙堿脫甲 基酶，其包含與SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 3的核苷酸序列至少70%相同的核苷酸序列， 或包含 SEQ ID NO :1 的核苷酸 2010-2949 和 / 或 3947-4562，或包含 SEQ ID NO :1 或 SEQ ID NO :3的序列。本發(fā)明的第一個(gè)方面的分離的核酸分子，例如與在植物細(xì)胞中有功能的 啟動(dòng)子可操縱地連接并且理想地被包含在表達(dá)載體中。在其它理想的實(shí)施方案中，表達(dá)載 體被包含在細(xì)胞中，例如植物細(xì)胞中。理想地，植物細(xì)胞，諸如煙草植物細(xì)胞被包括在植物 中。在另一個(gè)理想的實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征是來自包含表達(dá)載體的植物的種子，例如煙 草種子，其中所述種子包括分離的核酸分子，所述分離的核酸分子在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交于SEQ ID NO :3的序列，其與異源啟動(dòng)子序列可操縱地連接。此外，本發(fā)明的特征是來自包含表達(dá) 載體的萌發(fā)的種子的植物，來自所述植物的綠色或加工處理(cured)的葉子，和由所述葉 子制成的制品。在另一個(gè)理想的實(shí)施方案中，核苷酸序列包含這樣的序列，所述序列在嚴(yán)謹(jǐn)條件 下雜交于SEQ ID N0:1和/或SEQ ID NO :3的核苷酸序列的互補(bǔ)體，或SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :3的片段。理想地，所述核苷酸序列編碼煙堿脫甲基酶，所述煙堿脫甲基酶與SEQ ID NO 2的氨基酸序列基本上相同。在本發(fā)明的第一個(gè)方面的另一個(gè)理想實(shí)施方案中，所述煙 堿脫甲基酶具有這樣的氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQ ID NO :2的煙堿脫甲基酶氨基 酸序列或煙堿脫甲基酶的片段具有至少70%同一性，所述煙堿脫甲基酶的片段與全長多肽 相比具有改變的(例如減少)的酶活性。理想地，所述煙堿脫甲基酶包括SEQ ID N0:2的 氨基酸序列。在另一個(gè)方面，本發(fā)明的特征是包含啟動(dòng)子或驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄的其片段的分離的核酸分 子，所述啟動(dòng)子在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交于SEQ ID NO :6的序列。理想地，所述啟動(dòng)子(i)在用 乙烯處理后或在衰老過程中被誘導(dǎo)；并且(ii)包括(a)SEQ ID NO 1的堿基對1-2009，或 (b)至少200個(gè)連續(xù)的堿基對，其與由SEQ ID NO=I的堿基對1-2009限定的200個(gè)連續(xù)的 堿基對的序列相同，或(c) 20個(gè)堿基對核苷酸部分，其在序列上與在SEQ ID NO :1的堿基對 1-2009中提出的20個(gè)連續(xù)堿基對部分的序列相同。本發(fā)明的另一個(gè)方面的特征是分離的核酸啟動(dòng)子，其包含與SEQ ID NO 6的序列 具有50%或更多的序列同一性的核苷酸序列。理想地，該分離的核酸啟動(dòng)子在用乙烯處理 后，或在衰老過程中被誘導(dǎo)，并且例如包含SEQ ID NO :6的序列。備選地，所述啟動(dòng)子可以 包含可從SEQ ID NO :6中獲得的片段，其中所述片段驅(qū)動(dòng)異源基因的轉(zhuǎn)錄或減少或改變煙 堿脫甲基酶活性(例如，使基因表達(dá)沉默)。在理想的實(shí)施方案中，所述啟動(dòng)子序列與異源 核酸序列可操縱地連接，并且可以例如被包含在表達(dá)載體中。在其它理想的實(shí)施方案中，所 述表達(dá)載體被包含在細(xì)胞，例如植物細(xì)胞中。理想地，植物細(xì)胞，諸如煙草植物細(xì)胞，被包括 在植物中。在另一個(gè)理想的實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征是來自包含表達(dá)載體的植物的種子，例如煙草種子，其中所述種子包含分離的核酸分子，其在嚴(yán)謹(jǐn)條件下，雜交于SEQ ID NO 6 的序列，其與異源核酸序列可操縱地連接。此外，本發(fā)明的特征是來自包含本發(fā)明的該方面 的啟動(dòng)子的萌發(fā)種子的植物，來自所述植物的綠色或加工處理的葉子，或由所述葉子制成 的制品。本發(fā)明的另一個(gè)方面的特征是在植物中表達(dá)異源基因的方法。該方法包括(i)將 包含啟動(dòng)子序列的載體引入植物細(xì)胞，所述啟動(dòng)子序列與SEQ ID NO :6的序列具有50%或 更多的序列同一性，其與異源核酸序列可操縱地連接；和(ii)從細(xì)胞中再生植物。此外，該 方法可以包括將載體通過性手段傳遞到子代，并且進(jìn)一步可以包括收集從子代中產(chǎn)生的種 子的步驟。在另一個(gè)方面，本發(fā)明的特征是在煙草植物中減少煙堿脫甲基酶的表達(dá)的方法。 該方法包括下列步驟(i)將包含與異源核酸序列可操縱地連接的SEQ ID NO :6的序列或 可從SEQ ID NO :6獲得的片段的載體引入煙草植物中，和(ii)在煙草植物中表達(dá)所述載 體。在該方法的理想實(shí)施方案中，煙草脫甲基酶的表達(dá)被沉默。在其它理想的實(shí)施方案中， 所述載體表達(dá)RNA，諸如反義RNA或能夠誘導(dǎo)RNA干擾(RNAi)的RNA分子。在另一個(gè)理想的方面中，本發(fā)明的特征是包含這樣的內(nèi)含子的分離的核酸分子， 所述內(nèi)含子在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交于SEQ ID NO :5的序列或其片段，所述片段減少或改變煙堿 脫甲基酶的酶活性(例如，沉默基因表達(dá))或可以充當(dāng)分子標(biāo)志物以鑒定煙堿脫甲基酶核 酸序列。在理想的實(shí)施方案中，內(nèi)含子包括(a) SEQ ID NO :1的堿基對2950-3946，或(b) 至少200個(gè)連續(xù)的堿基對，其與SEQ ID NO 1的堿基對2950-3946所定義的200個(gè)連續(xù)的 堿基對的序列相同，或(c) 20個(gè)堿基對核苷酸部分，其在序列上與在SEQ ID NO :1的堿基對 2950-3946中提出的20個(gè)連續(xù)的堿基對部分的序列相同。本發(fā)明的另一個(gè)理想的方面的特征是分離的核酸內(nèi)含子，所述內(nèi)含子包括與SEQ ID NO 5的序列或其片段具有50%或更多序列同一性的核苷酸序列，其減少或改變煙堿脫 甲基酶的酶活性(例如，沉默基因表達(dá))或可以充當(dāng)分子標(biāo)志物以鑒定煙堿脫甲基酶核酸 序列。使基因表達(dá)沉默，可以例如，包括導(dǎo)致不具有煙堿脫甲基酶活性的基因產(chǎn)物的同源重 組或突變。具體而言，所述內(nèi)含子可以包括SEQ ID NO :5的序列或可以從SEQ ID NO :5獲 得的片段。理想地，包含內(nèi)含子的分離的核酸分子與異源核酸序列可操縱地連接并且該序 列理想地被包含在表達(dá)載體中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體被包含在細(xì)胞，諸如植 物細(xì)胞中。具體而言，所述細(xì)胞可以是煙草細(xì)胞。包含這樣的植物細(xì)胞的植物，例如煙草植 物是本發(fā)明的另一個(gè)理想的實(shí)施方案，所述植物細(xì)胞包含在表達(dá)載體中與異源核酸序列可 操縱地連接的SEQ ID NO :5的序列或可從SEQ ID NO :5獲得的片段。另外，來自植物的種 子，例如煙草種子也是理想的，其中所述種子包含內(nèi)含子，所述內(nèi)含子在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交于 SEQ ID NO :5，其與異源核酸序列可操縱地連接。此外，本發(fā)明的特征是來自包含本發(fā)明的 該方面的內(nèi)含子的萌發(fā)的種子的植物，來自所述植物的綠色或加工處理的葉子，和從綠色 或加工處理的葉子制成的制品。本發(fā)明的另一個(gè)方面的特征是在植物中表達(dá)內(nèi)含子的方法。該方法包括(i)將表 達(dá)載體引入植物細(xì)胞，所述表達(dá)載體包含與異源核酸序列可操縱地連接的SEQ ID N0:5的 序列或可從SEQ ID NO :5獲得的片段；和(ii)從細(xì)胞中再生植物。在理想的實(shí)施方案中， 該方法還包括(iii)將載體通過性手段傳遞到子代，并可以包括收集子代產(chǎn)生的種子的另外的步驟。所述方法理想地包括，例如再生來自萌發(fā)的種子的植物，來自所述植物的綠色或 加工處理的葉子，和從所述葉子制備制品的方法。在另一個(gè)方面中，本發(fā)明的特征是減少煙草植物中煙堿脫甲基酶的表達(dá)的方法。 該方法包括下列步驟(i)將載體引入煙草植物，所述載體包含與異源核酸序列可操縱地連 接的SEQ ID NO :5的序列或可從SEQ ID NO :5獲得的片段，和(ii)在煙草植物中表達(dá)所述 載體。在該方法的理想實(shí)施方案中，使煙堿脫甲基酶的表達(dá)被沉默。在其它理想的實(shí)施方 案中，所述載體表達(dá)RNA，諸如反義RNA或能夠誘導(dǎo)RNA干擾(RNAi)的RNA分子。在另一個(gè)方面，本發(fā)明的特征是分離的核酸分子，所述核酸分子包含非翻譯區(qū)，所 述非翻譯區(qū)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交于SEQ ID NO 7的序列或其片段，所述SEQ ID NO 7的序列 或其片段可以改變基因的表達(dá)模式，減少或改變煙堿脫甲基酶酶活性(例如，使基因表達(dá) 沉默)，或可以用作標(biāo)志物來鑒定煙堿脫甲基酶核酸序列。在本發(fā)明該方面的理想實(shí)施方案 中，非翻譯區(qū)包括(a) SEQ ID NO 1的堿基對4563-6347，或(b)至少200個(gè)連續(xù)的堿基對， 其與SEQ ID NO 1的堿基對4563-6347所限定的序列的200個(gè)連續(xù)的堿基對相同，或(c) 20 個(gè)堿基對核苷酸部分，其在序列上與SEQ ID NO :1的堿基對4563-6347提出的序列的20個(gè) 連續(xù)的堿基對部分相同。本發(fā)明的另一個(gè)理想的方面的特征是分離的核酸非翻譯區(qū)，所述核酸非翻譯區(qū)包 含這樣的核苷酸序列，其與SEQ ID NO :7的序列具有50%或更多的序列同一性。理想地， 所述非翻譯區(qū)包含SEQ ID NO :7的序列或所述非翻譯區(qū)包括可從SEQ ID NO :7獲得的片 段，其可以改變基因的表達(dá)模式，減少或改變煙堿脫甲基酶的酶活性(例如，使基因表達(dá)沉 默)，或可以用作標(biāo)志物來鑒定煙堿脫甲基酶核酸序列。所述非翻譯區(qū)理想地與異源核酸序 列可操縱地連接并且可以包含在表達(dá)載體中。此外，該表達(dá)載體理想地包含在細(xì)胞，諸如植 物細(xì)胞，例如煙草細(xì)胞中。本發(fā)明的另一個(gè)理想的實(shí)施方案的特征是包括植物細(xì)胞的植物， 諸如煙草植物，所述植物細(xì)胞包含包括分離的核酸序列的載體，所述分離的核酸序列與SEQ ID NO 7的序列具有50%或更多的序列同一性并且與異源核酸序列可操縱地連接。本發(fā)明的特征還在于來自植物的種子，例如煙草種子，其中所述種子包括非翻譯 區(qū)，所述非翻譯區(qū)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交于SEQ ID NO :7，其與異源核酸序列可操縱地連接。此 外，本發(fā)明的特征是來自包含本發(fā)明的該方面的非翻譯區(qū)的萌發(fā)的種子的植物，來自所述 植物的綠色或加工處理的葉子，和由綠色或加工處理的葉子制成的制品。在另一個(gè)方面，本發(fā)明的特征是在植物中表達(dá)非翻譯區(qū)的方法。該方法包括(i) 將載體引入植物細(xì)胞，所述載體包含這樣的分離的核酸序列，所述核酸序列與SEQ ID NO 7 的序列具有50%或更多的序列同一性，并且與異源核酸序列可操縱地連接；和(ii)從細(xì)胞 中再生植物。此外，該方法還可以包括(iii)將載體通過性手段傳遞到子代，并且理想地， 包括收集由子代產(chǎn)生的種子的另外的步驟。該方法理想地包括再生來自萌發(fā)的種子的植 物，來自所述植物的綠色或加工處理的葉子，和從綠色或加工處理的葉子制備制品的方法。此外，本發(fā)明的特征是在煙草植物中減少煙堿脫甲基酶的表達(dá)或改變煙堿脫甲基 酶的酶活性的方法。該方法包括下列步驟(i)將載體引入煙草植物中，所述載體包含這樣 的分離的核酸序列，所述分離的核酸序列與SEQ ID NO :7的序列具有50%或更多的序列同 一性并且與異源核酸序列可操縱地連接和(ii)在煙草植物中表達(dá)所述載體。理想地，煙堿 脫甲基酶 表達(dá)被沉默。在其它理想的實(shí)施方案中，載體表達(dá)RNA，例如反義RNA或能夠誘導(dǎo)RNA干擾(RNAi)的RNA分子。本發(fā)明的另一個(gè)方面的特征是表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包括包含編碼煙堿脫甲基 酶的核苷酸序列的核酸分子，其中所述載體能夠定向由分離的核酸分子編碼的煙堿脫甲基 酶的表達(dá)。理想地，所述載體包括SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :3的序列。在其它理想的實(shí) 施方案中，本發(fā)明的特征是植物或植物組分，例如煙草植物或植物組分(例如，煙草葉子或 莖)，其包括核酸分子，所述核酸分子包含編碼使煙堿脫甲基的多肽的核苷酸序列。本發(fā)明的另一個(gè)方面的特征是包含分離的核酸分子的細(xì)胞，所述分離的核酸分子 包括編碼煙堿脫甲基酶的核苷酸序列。理想地，該細(xì)胞是植物細(xì)胞或細(xì)菌細(xì)胞，諸如土壤桿 菌屬(Agrobacterium)。本發(fā)明的另一個(gè)方面的特征是植物或植物組分(例如煙草葉子或莖)，其包含分 離的核酸分子，所述核酸分子編碼煙堿脫甲基酶，其中所述核酸分子在植物或植物組分中 進(jìn)行表達(dá)。理想地，所述植物或植物組分是被子植物、雙子葉植物、茄科植物或煙草屬物種。 該方面的其它理想的實(shí)施方案是來自所述植物或植物組分的種子或細(xì)胞，以及來自所述植 物的綠色或加工處理的葉子和由其制備的制品。在另外的方面中，本發(fā)明的特征是煙草植物，其具有編碼多肽的核酸序列的減少 的表達(dá)，所述多肽是例如包括SEQ ID NO :2的序列并且使煙堿脫甲基的多肽，其中所述減少 的表達(dá)(或酶活性的減少)減少植物中去甲煙堿的水平。在理想的實(shí)施方案中，煙草植物 是轉(zhuǎn)基因植物，諸如包括轉(zhuǎn)基因的植物，當(dāng)所述轉(zhuǎn)基因在轉(zhuǎn)基因植物中進(jìn)行表達(dá)時(shí)，使內(nèi)源 煙草煙堿脫甲基酶的基因表達(dá)沉默。具體而言，所述轉(zhuǎn)基因植物理想地包括下列各項(xiàng)中的一個(gè)或多個(gè)表達(dá)煙草煙堿 脫甲基酶的反義分子或能夠誘導(dǎo)RNA干擾(RNAi)的RNA分子的轉(zhuǎn)基因；當(dāng)在轉(zhuǎn)基因植物中 表達(dá)時(shí)，共抑制煙草煙堿脫甲基酶的表達(dá)的轉(zhuǎn)基因；編碼顯性負(fù)調(diào)控(dominant negative) 失活基因產(chǎn)物，例如SEQ ID NO :2的氨基酸序列的突變形式的轉(zhuǎn)基因；在編碼SEQ ID NO 2 的氨基酸序列的基因中的點(diǎn)突變；在編碼煙草煙堿脫甲基酶的基因中的缺失；和在編碼煙 草煙堿脫甲基酶的基因中的插入。在其它理想的實(shí)施方案中，編碼多肽的核酸序列的減少的表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平、在翻 譯水平或在翻譯后水平發(fā)生。本發(fā)明的另一個(gè)方面的特征是煙草植物，所述煙草植物包含被穩(wěn)定整合到其基因 組中的重組表達(dá)盒，其中所述表達(dá)盒能夠?qū)崿F(xiàn)煙堿脫甲基酶活性中的減少。該煙草植物的 種子是理想的實(shí)施方案中的特征。其它的理想的實(shí)施方案包括來自該植物的綠色或加工處 理的葉子和由其制備的制品。本發(fā)明的另一個(gè)方面的特征是在植物中表達(dá)煙草煙堿脫甲基酶的方法。該方法 包括(i)將表達(dá)載體引入植物細(xì)胞中，所述表達(dá)載體包括包含編碼煙堿脫甲基酶的核苷酸 序列的核酸分子；和(ii)從所述細(xì)胞中再生植物。在理想的實(shí)施方案中，該方法的特征是 將載體通過性手段傳遞到子代，并且理想地還包括收集由子代產(chǎn)生的種子的另外的步驟。 另外的理想的實(shí)施方案包括來自萌發(fā)的種子的植物，來自所述植物的綠色或加工處理的葉 子，或由所述綠色或加工處理的葉子制備的制品。本發(fā)明的另一個(gè)方面的特征是基本純的煙草煙堿脫甲基酶。理想地，該煙草煙堿 脫甲基酶包括與SEQ ID NO :2的氨基酸序列具有至少70%同一性的氨基酸序列或包括SEQID NO :2的氨基酸序列。在理想的實(shí)施方案中，所述煙草煙堿脫甲基酶，在植物細(xì)胞中表達(dá) 后，將煙堿轉(zhuǎn)化為去甲煙堿。在其它理想的實(shí)施方案中，所述煙草煙堿脫甲基酶，在植物細(xì) 胞中表達(dá)后，被主要定位在葉子中，或所述煙草煙堿脫甲基酶由乙烯誘導(dǎo)或在植物衰老的 過程中進(jìn)行表達(dá)。在另一個(gè)方面，本發(fā)明的特征是基本純的抗體，其特異性地識(shí)別并且結(jié)合煙草煙 堿脫甲基酶。理想地，所述抗體識(shí)別并且結(jié)合重組煙草煙堿脫甲基酶，例如包含SEQ ID NO 2的序列或其片段的重組煙草煙堿脫甲基酶。本發(fā)明的另一個(gè)方面的特征是產(chǎn)生煙草煙堿脫甲基酶的方法。該方法包括下列步 驟(a)提供被用分離的核酸分子轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，所述分離的核酸分子包含編碼使煙堿脫甲 基的多肽的核苷酸序列；(b)在表達(dá)所述分離的核酸分子的條件下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化的細(xì)胞； 和(c)回收所述煙草煙堿脫甲基酶。本發(fā)明的特征還在于按照該方法產(chǎn)生的重組煙草煙堿 脫甲基酶。在另一個(gè)方面，本發(fā)明的特征是分離煙草煙堿脫甲基酶或其片段的方法。該方法 包括下列步驟(a)使SEQ ID N0S:1，3，5，6，或7的核酸分子或其部分與來自植物細(xì)胞的核 酸制品在這樣的雜交條件下進(jìn)行接觸，所述雜交條件提供核酸序列的檢測，所述核酸序列 與SEQ ID NOS :1，3，5，6，或7的核酸序列具有至少70%或更大的序列同一性；和(b)分離 所述雜交的核酸序列。在另一個(gè)方面，本發(fā)明的特征是分離煙草煙堿脫甲基酶或其片段的另一個(gè)方法。 該方法包括下列步驟(a)提供植物細(xì)胞DNA的樣品；(b)提供寡核苷酸對，其與具有SEQ ID NOS :1，3，5，6，或7的序列的核酸分子的區(qū)域具有序列同一性；(c)使所述寡核苷酸對與 植物細(xì)胞DNA在這樣的條件下進(jìn)行接觸，所述條件適合于聚合酶鏈反應(yīng)介導(dǎo)的DNA擴(kuò)增；和 (d)分離所述擴(kuò)增的煙草煙堿脫甲基酶或其片段。在該方面的理想的實(shí)施方案中，使制備自 植物細(xì)胞的cDNA的樣品進(jìn)行擴(kuò)增步驟。在另一個(gè)理想的實(shí)施方案中，所述煙草煙堿脫甲基 酶編碼多肽，所述多肽與SEQ ID NO :2的氨基酸序列具有至少70%的同一性。本發(fā)明的另一個(gè)方面的特征是在植物或植物組分中減少煙草煙堿脫甲基酶的表 達(dá)的方法。該方法包括下列步驟(a)將編碼煙草煙堿脫甲基酶的轉(zhuǎn)基因引入植物細(xì)胞 中以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，所述轉(zhuǎn)基因與在植物細(xì)胞中有功能的啟動(dòng)子可操縱地連接；和 (b)從轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞中再生植物或植物組分，其中所述煙草煙堿脫甲基酶在植物或植物 組分的細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，由此在植物或植物組分中減少煙草煙堿脫甲基酶的表達(dá)。在本發(fā) 明的該方面的具體實(shí)施方案中，將編碼煙草煙堿脫甲基酶的轉(zhuǎn)基因例如，以組織特異性，細(xì) 胞特異性或器官特異性方式，組成性地表達(dá)或誘導(dǎo)性地進(jìn)行表達(dá)。在本發(fā)明的該方面的另 一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因的表達(dá)共抑制內(nèi)源煙草煙堿脫甲基酶的表達(dá)。本發(fā)明的另一個(gè)方面的特征是在植物或植物組分中減少煙草煙堿脫甲基酶的表 達(dá)的另一種方法。該方法包括下列步驟(a)將編碼煙草煙堿脫甲基酶的反義編碼序列或 能夠誘導(dǎo)RNA干擾(RNAi)的RNA分子的轉(zhuǎn)基因引入植物細(xì)胞中以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，所 述轉(zhuǎn)基因與在植物細(xì)胞中有功能的啟動(dòng)子可操縱地連接；和(b)從轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞中再生 植物或植物組分，其中煙草煙堿脫甲基酶的編碼序列的反義編碼序列或能夠誘導(dǎo)RNA干擾 (RNAi)的RNA分子在植物或植物組分的細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，由此在植物或植物組分中減少煙 草煙堿脫甲基酶的表達(dá)。理想地，編碼煙草煙堿脫甲基酶的反義序列或能夠誘導(dǎo)RNA干擾(RNAi)的RNA分子的轉(zhuǎn)基因，例如以組織特異性、細(xì)胞特異性或器官特異性方式組成性地 表達(dá)或誘導(dǎo)性地進(jìn)行表達(dá)。本發(fā)明的另一個(gè)方面的特征是在植物或植物組分中減少煙草煙堿脫甲基酶的表 達(dá)的另一種方法。該方法包括下列步驟(a)將轉(zhuǎn)基因引入植物細(xì)胞中以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的植物 細(xì)胞，所述轉(zhuǎn)基因編碼煙草煙堿脫甲基酶的顯性負(fù)調(diào)控的基因產(chǎn)物，其與在植物細(xì)胞中有 功能的啟動(dòng)子可操縱地連接；和(b)從轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生植物或植物組分，其中煙草煙 堿脫甲基酶的顯性負(fù)調(diào)控基因產(chǎn)物在植物或植物組分的細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，由此在植物或植 物組分中減少煙草煙堿脫甲基酶的表達(dá)。在本發(fā)明的該方面的具體實(shí)施方案中，編碼顯性 負(fù)調(diào)控基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因以例如組織_特異性、細(xì)胞特異性或器官特異性方式進(jìn)行組成性 表達(dá)或誘導(dǎo)性表達(dá)。本發(fā)明的另一個(gè)方面的特征是在植物細(xì)胞中減少煙草煙堿脫甲基酶的表達(dá)或酶 活性的另一種方法。該方法包括在植物細(xì)胞中減少內(nèi)源煙草煙堿脫甲基酶的水平，或其酶 活性。理想地，所述植物細(xì)胞來自雙子葉植物、茄科植物，或煙草植物種類。在該方面的理 想實(shí)施方案中，減少內(nèi)源煙草煙堿脫甲基酶水平包括在植物細(xì)胞中表達(dá)編碼煙草煙堿脫甲 基酶的反義核酸分子或能誘導(dǎo)RNA干擾(RNAi)的RNA分子的轉(zhuǎn)基因，或包括在植物細(xì)胞中 表達(dá)編碼煙草煙堿脫甲基酶的雙鏈RNA分子的轉(zhuǎn)基因。理想地，所述雙鏈RNA是對應(yīng)于SEQ ID NO :1，SEQ ID NO :3，SEQ ID NO :5，SEQ ID NO :6，或 SEQ ID NO 7 的序列的 RNA 序列， 或其片段。在另一個(gè)實(shí)施方案中，減少內(nèi)源煙草煙堿脫甲基酶的水平包括在植物細(xì)胞中共 抑制內(nèi)源煙草煙堿脫甲基酶或包括在植物細(xì)胞中表達(dá)顯性負(fù)調(diào)控基因產(chǎn)物。具體而言，所 述顯性負(fù)調(diào)控基因產(chǎn)物可以包括編碼SEQ ID NO :2的氨基酸序列的突變形式的基因。在本發(fā)明的該方面的其它理想實(shí)施方案中，內(nèi)源煙草煙堿脫甲基酶包括在編碼 SEQ ID NO :2的氨基酸序列的基因中的點(diǎn)突變。在其它理想的實(shí)施方案中，減少內(nèi)源煙草 煙堿脫甲基酶的表達(dá)的水平包括在編碼煙草煙堿脫甲基酶的基因中的缺失或包括在編碼 煙草煙堿脫甲基酶的基因中的插入。減少的表達(dá)可以在轉(zhuǎn)錄水平，在翻譯水平，或在翻譯后 水平發(fā)生。在本發(fā)明的另一個(gè)方面的特征是鑒定在細(xì)胞中改變煙草煙堿脫甲基酶的表達(dá)的 化合物的方法。該方法包括下列步驟(a)提供包含編碼煙草煙堿脫甲基酶的基因的細(xì)胞； (b)將候選化合物應(yīng)用到細(xì)胞中；和(c)測量編碼煙草煙堿脫甲基酶的基因的表達(dá)，其中相 對于未處理的對照樣品在表達(dá)中的增加或減少是化合物改變煙草煙堿脫甲基酶的表達(dá)的 指示。在該方法的理想實(shí)施方案中，部分(a)的基因編碼這樣的煙草煙堿脫甲基酶，其 與SEQ ID NO :2的氨基酸序列具有至少70%的同一性。理想地，所述化合物減少或增加編 碼所述煙草煙堿脫甲基酶的基因的表達(dá)。在另一個(gè)方面，本發(fā)明的特征是鑒定在細(xì)胞中改變煙草煙堿脫甲基酶的活性的化 合物的另一種方法。該方法包括下列步驟(a)提供表達(dá)編碼煙草煙堿脫甲基酶的基因的 細(xì)胞；(b)將候選化合物應(yīng)用到細(xì)胞中；和(c)測量所述煙草煙堿脫甲基酶的活性，其中相 對于未處理的對照樣品的活性的增加或減少是化合物改變所述煙草煙堿脫甲基酶的活性 的指示。在本發(fā)明的該方面的理想實(shí)施方案中，步驟(a)的基因編碼這樣的煙草煙堿脫甲 基酶，其與SEQ ID NO :2的氨基酸序列具有至少70%的同一性。理想地，所述化合物減少或增加煙草煙堿脫甲基酶的活性。本發(fā)明的另一個(gè)方面的特征是加工處理的煙草植物或植物組分，其包含(i)減少 的水平的煙堿脫甲基酶或(ii)具有改變的酶活性的煙堿脫甲基酶和減少量的亞硝胺。理 想地，所述植物組分是煙草葉子或煙草莖。在理想的實(shí)施方案中，亞硝胺是去甲煙堿，并 且所述去甲煙堿的含量理想地是少于5mg/g，4. 5mg/g, 4. Omg/g, 3. 5mg/g, 3. Omg/g,更理想 地少于 2. 5mg/g，2. Omg/g, 1. 5mg/g，1. Omg/g,更理想地少于 750 μ g/g，500 μ g/g，250 μ g/ g, 100 μ g/g,甚至更理想地少于 75 μ g/g, 50 μ g/g, 25 μ g/g, 10 μ g/g, 7. 0 μ g/g, 5. O μ g/ g，4. O μ g/g,和甚至更理想地少于 2. O μ g/g, 1. O μ g/g, 0. 5 μ g/g, 0. 4 μ g/g, 0. 2 μ g/g, 0. 1 μ g/g，0. 05μ g/g，或0. 01 μ g/g，或其中次要生物堿相對于其中總的生物堿含量的百分 比少于 90%，70%，50%，30%，10%，理想地少于 5 %，4 %，3 %，2 %，1. 5 %，1 %，并且更理 想地少于0.75%，0.5%，0.25%，或0. 1%。在另一個(gè)理想的實(shí)施方案中，亞硝胺是N’ -亞 硝基去甲煙堿(NNN)，并且N，-NNN的含量理想地是少于5mg/g，4. 5mg/g, 4. Omg/g, 3. 5mg/ g, 3. Omg/g,更理想地少于 2. 5mg/g, 2. 0mg/g, 1. 5mg/g, 1. 0mg/g,更理想地少于 750 μ g/ g, 500 μ g/g, 250 μ g/g, 100 μ g/g,甚至更理想地少于 75 μ g/g，50 μ g/g，25 μ g/g，10 μ g/ g, 7. O μ g/g, 5. O μ g/g, 4. O μ g/g,并且甚至更理想地少于 2. O μ g/g，1. O μ g/g，0. 5 μ g/ g，0. 4 μ g/g, 0. 2 μ g/g, 0. 1 μ g/g, 0. 05 μ g/g,或 0· 01 μ g/g,或其中次要生物堿相對于其 包含的總生物堿含量的百分比是少于90 %，70 %，50 %，30 %，10 %，理想地少于5 %，4 %， 3%，2%，1. 5%，1%，并且更理想地少于0. 75%，0. 5%，0. 25%，或0. 1%。在本發(fā)明的該 方面的另一個(gè)理想的實(shí)施方案中，所述加工處理的煙草植物或植物組分是深色煙草(dark tobacco)、白萊煙(Burley tobacco)、煙熏煙(flue-cured tobacco)、深色0京煙(air-cured tobacco)或東方型煙草(oriental tobacco)。此外，本發(fā)明的加工處理的煙草植物或植物組分理想地包括重組煙堿脫甲基酶基 因，例如包含SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :3的序列，或其片段的基因。理想地，在加工處理 的煙草植物或植物成分中，內(nèi)源煙堿脫甲基酶基因的表達(dá)被沉默。本發(fā)明的另一個(gè)方面的特征是包含加工處理的煙草植物或植物組分的煙草產(chǎn)品， 其包括(i)煙堿脫甲基酶的減少的表達(dá)或(ii)具有改變活性的煙堿脫甲基酶，和減少量 的亞硝胺。理想地，所述煙草產(chǎn)品是無煙煙草、濕或干鼻煙、嚼煙、卷煙、雪茄煙、小雪茄煙、 pipe tobacco或bidis。具體而言，本發(fā)明的該方面的煙草產(chǎn)品可以包含深色煙草、研磨過 的煙草(milled tobacco)，或包括加香成分。本發(fā)明的特征還在于制備煙草產(chǎn)品，例如無煙煙草產(chǎn)品的方法，所述產(chǎn)品包含(i) 煙堿脫甲基酶的減少的表達(dá)或(ii)具有改變(例如減少的)酶活性的煙堿脫甲基酶，和減 少量的亞硝胺。該方法包括提供加工處理的煙草植物或植物組分，和從所述加工處理的煙 草植物或植物成分中制備煙草產(chǎn)品，所述加工處理的煙草植物或植物組分包含(i)減少水 平的煙堿脫甲基酶或(ii)具有改變的酶活性的煙堿脫甲基酶和減少量的亞硝胺。1. 一種分離的編碼煙堿脫甲基酶的核酸分子，其中所述核酸分子包括(a)SEQ ID NO 1 的序列，或(b)與 SEQ ID NO :5，SEQ ID NO :6，或 SEQ ID NO 7 的 200 個(gè)連續(xù)堿基對 相同的至少200個(gè)連續(xù)的堿基對，或(c)與SEQ ID NO :5,SEQ ID NO :6，或SEQ ID NO :7的 20個(gè)連續(xù)的堿基對相同的至少20個(gè)連續(xù)的堿基對。2.項(xiàng)1的分離的核酸分子，其中所述核酸分子是DNA。
3.項(xiàng)1的分離的核酸分子，其中所述核酸分子包括SEQ ID NO 1的序列。4.項(xiàng)1的分離的核酸分子，其中所述核酸分子編碼包含SEQ ID NO 2的氨基酸序 列的煙堿脫甲基酶。5.項(xiàng)1的分離的核酸分子，其中所述分離的核酸分子與在植物細(xì)胞中有功能的啟 動(dòng)子可操縱地連接。6.項(xiàng)1的分離的核酸分子，其包含在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO 6的序列或其片段 雜交的啟動(dòng)子，所述片段驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄。7.項(xiàng)6的分離的核酸分子，其中所述啟動(dòng)子(i)在用乙烯處理后或在衰老過程中 被誘導(dǎo)；和(ii)包含(a) SEQ ID NO 1的堿基對1-2009，或(b)與由SEQ ID NO 1的堿基 對1-2009限定的序列的200個(gè)連續(xù)的堿基對相同的至少200個(gè)連續(xù)的堿基對，或(c)在序 列上與SEQ ID NO 1的堿基對1-2009中提出的序列的20個(gè)連續(xù)堿基對部分相同的20個(gè) 堿基對核苷酸部分。8.項(xiàng)1的分離的核酸分子，其包括與SEQ ID NO 6的序列具有50%或更大的序列 同一性的核苷酸序列。9.項(xiàng)1或8的分離的核酸分子，其中所述核酸分子在用乙烯處理后或在衰老過程 中被誘導(dǎo)。10.項(xiàng)1或8的分離的核酸分子，其中所述核酸分子包含SEQ ID NO 6的序列。11.項(xiàng)1或8的分離的核酸分子，其中所述核酸分子包含可從SEQ ID NO :6獲得 的片段，其中所述片段驅(qū)動(dòng)異源基因的轉(zhuǎn)錄。12.項(xiàng)8的分離的核酸分子，其與異源核酸序列可操縱地連接。13.項(xiàng)1的分離的核酸分子，其包含內(nèi)含子，所述內(nèi)含子在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO 5的序列或其片段雜交。14.項(xiàng)13的分離的核酸分子，其中所述內(nèi)含子包含(a)SEQ ID NO 1的堿基對 2950-3946，或(b)與由SEQ ID NO 1的堿基對2950-3946限定的序列的200個(gè)連續(xù)的堿基 對相同的至少200個(gè)連續(xù)的堿基對，或(c)在序列上與SEQ ID NO 1的堿基對2950-3946 中提出的序列的20個(gè)連續(xù)的堿基對部分相同的20個(gè)堿基對核苷酸部分。15.項(xiàng)1的分離的核酸，其中所述核酸分子包含與SEQ ID NO 5的序列或其片段 具有50%或更大的序列同一性的核苷酸序列。16.項(xiàng)1或13的分離的核酸分子，其中所述核酸分子包含SEQ ID NO 5的序列。17.項(xiàng)1或13的分離的核酸分子，其中所述核酸分子包含可從SEQ ID NO 5獲得 的片段。18.項(xiàng)13的分離的核酸分子，其與異源核酸序列可操縱地連接。19.項(xiàng)1的分離的核酸分子，其包含非翻譯區(qū)，所述非翻譯區(qū)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下，與SEQ ID NO :7的序列，或其片段雜交。20.項(xiàng)19的分離的核酸分子，其中所述非翻譯區(qū)包含(a) SEQ ID NO=I的堿基對 4563-6347，或(b)與由SEQ ID NO 1的堿基對4563-6347所限定的序列的200個(gè)連續(xù)的堿 基對相同的至少200個(gè)連續(xù)的堿基對，或(c)在序列上與SEQ ID NO 1的堿基對4563-6347 提出的序列的20個(gè)連續(xù)的堿基對部分相同的20個(gè)堿基對核苷酸部分。21.項(xiàng)1的分離的核酸分子，其中所述 酸分子包含與SEQ ID NO 7的序列具有50 %或更大序列同一性的核苷酸序列。22.項(xiàng)1或19的分離的核酸分子，其中所述核酸分子包含SEQ ID NO 7的序列。23.項(xiàng)1或19的分離的核酸分子，其中所述核酸分子包含可從SEQ ID NO 7獲得 的片段。24.項(xiàng)19的分離的核酸分子，其與異源核酸序列可操縱地連接。25. 一種煙草植物，其具有由項(xiàng)1的核酸分子編碼的煙堿脫甲基酶的減少的表 達(dá)或改變的酶活性，其中所述減少的表達(dá)或改變的酶活性減少所述植物中的去甲煙堿或 N’ -亞硝基去甲煙堿的水平。26.項(xiàng)25的煙草植物，其中所述煙堿脫甲基酶包含SEQ ID NO 2的氨基酸序列。27.項(xiàng)25的煙草植物，其中所述植物是轉(zhuǎn)基因植物。28.項(xiàng)27的煙草植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物包含轉(zhuǎn)基因，當(dāng)所述轉(zhuǎn)基因在所述轉(zhuǎn) 基因植物中表達(dá)時(shí)，使內(nèi)源煙草煙堿脫甲基酶的基因表達(dá)沉默。29.項(xiàng)27的煙草植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物包含表達(dá)煙草煙堿脫甲基酶的反義分 子的轉(zhuǎn)基因。30.項(xiàng)27的煙草植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物包含編碼煙草煙堿脫甲基酶的雙鏈 RNA分子的轉(zhuǎn)基因。31.項(xiàng)27的煙草植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物包含轉(zhuǎn)基因，當(dāng)所述轉(zhuǎn)基因在所述轉(zhuǎn) 基因植物中表達(dá)時(shí)，共抑制煙草煙堿脫甲基酶的表達(dá)。32.項(xiàng)27的煙草植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物包含編碼顯性負(fù)調(diào)控基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基 因。33.項(xiàng)32的煙草植物，其中所述顯性負(fù)調(diào)控基因產(chǎn)物包含編碼SEQ IDNO 2的氨 基酸序列的突變形式的基因。34.項(xiàng)33的煙草植物，其中所述植物包含編碼SEQ ID NO 2的氨基酸序列的基因 中的點(diǎn)突變。35.項(xiàng)27的煙草植物，其中所述植物包含在編碼煙草煙堿脫甲基酶的基因中的缺失。36.項(xiàng)25的煙草植物的植物組分。37.項(xiàng)36的植物組分，其中所述植物組分是煙草葉、莖或種子。38.項(xiàng)37的植物組分，其中所述葉子是加工處理的。39.項(xiàng)36的植物組分，其中去甲煙堿的含量少于4. 0 μ g/g。40.項(xiàng)36的植物組分，其中相對于總生物堿含量，次級(jí)生物堿的含量少于3%。41.項(xiàng)36的植物組分，其中N'-亞硝基去甲煙堿的含量少于4. 0 μ g/g。42. 一種煙草產(chǎn)品，其包含項(xiàng)36-41中任一項(xiàng)的植物組分。43.來自項(xiàng)25的煙草植物的種子。44. 一種產(chǎn)生煙草煙堿脫甲基酶的方法，所述方法包括下列步驟(a)提供用項(xiàng)1的分離的核酸分子轉(zhuǎn)化的細(xì)胞；(b)在表達(dá)所述分離的核酸分子的條件下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化的細(xì)胞；和(c)回收所述煙草煙堿脫甲基酶。45.按照項(xiàng)44的方法制備的重組煙草煙堿脫甲基酶。
46. 一種分離煙草煙堿脫甲基酶或其片段的方法，所述方法包括下列步驟(a)在這樣的雜交條件下，使項(xiàng)1的核酸分子與來自植物細(xì)胞的核酸制備物接觸， 所述雜交條件提供與項(xiàng)1的核酸分子具有至少70%或更大序列同一性的核酸序列的檢測； 和(b)分離所述雜交的核酸序列。47. 一種分離煙草煙堿脫甲基酶或其片段的方法，所述方法包括下列步驟(a)提供植物細(xì)胞DNA的樣品；(b)提供與項(xiàng)1的核酸分子的區(qū)域具有序列同一性的一對寡核苷酸；(C)在適合于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)_介導(dǎo)的DNA擴(kuò)增的條件下，使寡核苷酸對與所述植 物細(xì)胞DNA接觸；和(d)分離擴(kuò)增的煙草煙堿脫甲基酶或其片段。48.項(xiàng)47的方法，其中所述擴(kuò)增步驟使用制備自植物細(xì)胞的cDNA樣品來進(jìn)行。49.項(xiàng)47的方法，其中所述煙草煙堿脫甲基酶編碼這樣的多肽，其與選自由SEQ ID NO 2組成的組的氨基酸序列具有至少70%的同一性。“酶活性”指包括，但不限于脫甲基作用，羥基化作用，環(huán)氧化作用，N-氧化作用，硫 代氧化作用，N-、S-、和0-脫烷基化，脫硫作用，脫氨作用和偶氮、硝基和N-氧化物和其它這 樣的酶促反應(yīng)性化學(xué)基團(tuán)的還原作用。改變的酶活性指相對于對照酶(例如，野生型煙草 植物煙堿脫甲基酶)的活性減少酶活性(例如，煙草煙堿脫甲基酶的減少酶活性)達(dá)至少 10-20%，優(yōu)選地至少25-50%，和更優(yōu)選地至少55-95%或更多。煙草煙堿脫甲基酶的活性 可以使用本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)方法，諸如本文所述的通過酵母表達(dá)的微粒體測量放射性煙堿的脫甲 基作用進(jìn)行測定。術(shù)語“核酸”指單鏈或雙鏈形式存在的，或有義或反義的脫氧核糖核苷酸或核糖核 苷酸聚合物，并且除非另外限定，涵蓋天然核苷酸的已知類似物，其以類似于天然存在的核 苷酸的方式與核酸雜交。除非另外指出，特定的核酸序列包括其互補(bǔ)序列。術(shù)語“可操縱地 連接”，“以可操縱的組合”和“以可操縱的順序”指在核酸表達(dá)控制序列(諸如啟動(dòng)子、信號(hào) 序列或轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的陣列)和第二核酸序列之間的功能連接，其中所述表達(dá)控制序 列影響對應(yīng)于第二序列的核酸的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。當(dāng)關(guān)于細(xì)胞使用時(shí)，術(shù)語“重組”指出細(xì)胞復(fù)制異源核酸，表達(dá)所述核酸或表達(dá)肽， 異源肽，或由異源核酸編碼的蛋白質(zhì)。重組細(xì)胞可以表達(dá)在細(xì)胞的天然(native)(非重組) 形式中未發(fā)現(xiàn)的有義或反義形式的基因或基因片段或能夠誘導(dǎo)RNA干擾(RNAi)的RNA分 子。重組細(xì)胞也可以表達(dá)在細(xì)胞的天然形式中發(fā)現(xiàn)的基因，但是其中所述基因被以人工方 式進(jìn)行修飾并再次引入細(xì)胞中?！敖Y(jié)構(gòu)基因”是包括編碼蛋白質(zhì)、多肽或其部分的DNA片段的基因的部分，并且不包 括，例如，驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄起始的5'序列或3' UTR。所述結(jié)構(gòu)基因可以備選地編碼不可翻譯的產(chǎn) 物。所述結(jié)構(gòu)基因可以是通常在細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的基因或在細(xì)胞或其被引入的細(xì)胞定位中通常 未發(fā)現(xiàn)的基因，在該種情況下其被稱為“異源基因”。異源基因可以完全或部分來自本領(lǐng)域 已知的任何來源，包括細(xì)菌基因組或游離基因(印isome)，真核生物的核或質(zhì)粒DNA，cDNA, 病毒DNA或化學(xué)合成的DNA。結(jié)構(gòu)基因可以包含可以影響生物學(xué)活性或其特征、表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)活性或化學(xué)結(jié)構(gòu)，表達(dá)的速率或表達(dá)控制的方式的一個(gè)或多個(gè)修飾。這些修飾包括， 但不限于，一個(gè)或多個(gè)核苷酸的突變、插入、缺失和置換。結(jié)構(gòu)基因可以由不間斷的編碼序列構(gòu)成或其可以包括一個(gè)或多個(gè)由適合的剪接 點(diǎn)結(jié)合的內(nèi)含子。所述結(jié)構(gòu)基因可以是可翻譯或不可翻譯的，包括反義或能夠誘導(dǎo)RNA干 擾(RNAi)的RNA分子。結(jié)構(gòu)基因可以是來自多個(gè)來源和來自多個(gè)基因序列(天然存在或 合成的，其中合成的指化學(xué)合成的DNA)的片段的組合物。關(guān)于核酸序列用于本文時(shí)，“外顯子”指基因的核酸序列的部分，其中外顯子的核 酸序列編碼基因產(chǎn)物的至少一個(gè)氨基酸。外顯子典型地鄰近于非編碼DNA片段諸如內(nèi)含 子。理想地，外顯子編碼SEQ ID NO :2的煙草煙堿脫甲基酶氨基酸序列的部分，諸如SEQ ID NO 2序列的氨基酸1-313和/或314-517。關(guān)于核酸序列用于本文時(shí)，“內(nèi)含子”指位于編碼區(qū)側(cè)翼的基因的非編碼區(qū)。內(nèi)含 子典型地是基因的非編碼區(qū)，其被轉(zhuǎn)錄為RNA分子，但是接著在產(chǎn)生信使RNA或其它功能性 結(jié)構(gòu)RNA的過程中通過RNA剪接被切除。理想地，內(nèi)含子包括SEQ ID NO :5的序列，或其片 段。關(guān)于核酸序列用于本文時(shí)，“3' UTR”指鄰近于外顯子的終止密碼子的非編碼核酸 序列。理想地，3' UTR包括SEQ ID NO :7的序列，或其片段。“衍生自”用于指取自、獲自、接受自、發(fā)現(xiàn)自、復(fù)制自或遺傳自某一來源(化學(xué)和/ 或生物的)。衍生物可以通過原始來源的化學(xué)或生物操作(包括，但不限于，置換、添加、插 入、缺失、提取、分離、突變和復(fù)制)而進(jìn)行制備。與DNA序列相關(guān)的“化學(xué)合成”指將組成核苷酸的部分在體外裝配。DNA的 手動(dòng)化學(xué)合成可以使用公知的方法來完成(Caruthers，Methodology of DNA and RNA Sequencing, (1983), Weissman (ed. ), Praeger Publishers,紐約，第一章)；自動(dòng)化學(xué)合成 可以使用許多商購機(jī)械之一來進(jìn)行。進(jìn)行比較的序列的優(yōu)化排比可以，例如通過Smith和Waterman，Adv. App 1 · Math. 2 482 (1981)的局部同源性算法，Needleman 和 Wunsch，J. Mol. Biol. 48 443 (1970) 的同源性排比算法，通過 Pearson 禾口 Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. Α. )85 2444(1988)的進(jìn)行相似性方法的搜索，通過這些算法的計(jì)算機(jī)執(zhí)行(在Wisconsin遺傳軟 件包中的 GAP，BESTFIT, FASTA，和 TFASTA，Genetics Computer Group, 575 Science Dr.， Madison, Wis.),或通過目測進(jìn)行。NCBI基本局部排比搜索工具(BLAST) (Altschul等，1990)獲自幾種來源，包括生 物信息國家中心(National Center for Biological Information) (NCBI,Bethesda,Md.) 和在互聯(lián)網(wǎng)上，與序列分析程序blastp，blastn，blastx，tblastn，和tblastx組合使用。 其可以在http://WWW. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/上進(jìn)行評估。關(guān)于怎樣使用該程序確定 序列同一性的描述在 http://www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/blast help, html 可獲得。用于氨基酸序列并且用于本文時(shí)，術(shù)語“基本的氨基酸同一性”或“基本的氨基酸 序列同一性”指多肽的特征，其中所述肽包括與SEQ ID NOS :2和/或4的蛋白質(zhì)序列比較， 具有至少70%序列同一性，優(yōu)選地80%氨基酸序列同一性，更優(yōu)選地90%氨基酸序列同一 性，和最優(yōu)選地至少99到100%的序列同一性。理想地，對于煙堿脫甲基酶而言， 列比較 理想地用于細(xì)胞色素P450基序(GXRXCX(G/A) ；SEQ ID NO 29)到翻譯肽的終止密碼子的區(qū)域的比較。用于核酸序列和用于本文時(shí)，術(shù)語“基本的核酸同一性”或“基本的核酸序列同 一性”指多核苷酸序列的特征，其中所述多核苷酸包含這樣的序列，其與SEQ ID NOS 1,3, 5，6，和/或7比較，具有至少50 %，優(yōu)選地60 %，65 %，70 %，或75 %的序列同一性，更優(yōu) 選地81 %或91 %的核酸序列同一性，和最優(yōu)選地至少95%，99 %或甚至100%的序列同一 性。理想地，對于煙堿脫甲基酶核酸序列而言，比較理想地用于編碼從細(xì)胞色素p450基序 (GXRXCX(G/A) ；SEQ ID NO 29)到翻譯肽的終止密碼子的區(qū)域的比較。核苷酸序列是基本上相同的另一個(gè)指示是兩個(gè)分子是否在嚴(yán)謹(jǐn)條件下彼此雜交。 嚴(yán)謹(jǐn)條件是序列依賴型的并且將在不同的情況下是不同的。一般而言，在限定的離子強(qiáng)度 和PH上，對于具體序列選擇的嚴(yán)謹(jǐn)條件是低于熱熔點(diǎn)(Tm)約5°C到約20°C，通常是約10°C 到約15°C。Tm是這樣的溫度(在限定的離子強(qiáng)度和pH)，其中靶序列的50%與匹配的探針 雜交。典型地，嚴(yán)謹(jǐn)條件將是其中鹽濃度在PH 7是約0.02摩爾并且溫度是至少約60°C的 那些。例如，在標(biāo)準(zhǔn)的DNA雜交方法中，嚴(yán)謹(jǐn)條件將包括于42°C在6xSSC中的開始的洗滌， 隨后在至少約55°C、典型地約60°C，通常約65°C的溫度上在0. 2xSSC中進(jìn)行的一次或多次 另外的洗滌。出于本發(fā)明的目的，當(dāng)所述核苷酸序列編碼基本上相同的多肽和/或蛋白質(zhì)時(shí)， 核苷酸序列也是基本上相同的。因此，當(dāng)一個(gè)核酸序列編碼基本上與第二個(gè)核酸序列相同 的多肽時(shí)，所述兩個(gè)核酸序列是基本上相同的，即使它們由于遺傳密碼所容許的簡并性在 嚴(yán)謹(jǐn)條件下不雜交(見，Darnell 等.(1990)Molecular Cell Biology, Second Edition Scientific American Books W. H. Freeman and Company New York for an explanation of codon degeneracy and the genetic code)。蛋白質(zhì)純度或均一性可以通過許多本領(lǐng) 域眾所周知的方式來指示，所述方式諸如蛋白質(zhì)樣品的聚丙烯酰胺凝膠電泳，隨后通過染 色進(jìn)行觀察。對于某些目的而言，可能需要高分辨率，并且可以使用HPLC或類似的用于純 化的方式。所謂“特異性結(jié)合”或“特異性識(shí)別”煙草煙堿脫甲基酶的抗體意為相對于等量的 任何其它蛋白質(zhì)，增加親和性的煙草煙堿脫甲基酶的抗體。例如，特異性結(jié)合包含SEQ ID NO 2的氨基酸序列的煙草煙堿脫甲基酶的抗體理想地對于其抗原具有這樣的親和性，所 述親和性與等量的任何其它抗原，包括相關(guān)抗原相比，大于至少2倍、5倍、10倍、30倍或 100倍。抗體與抗原，例如煙草煙堿脫甲基酶的結(jié)合可以通過許多本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)的方法例如， 蛋白質(zhì)印跡分析、ELISA或共免疫沉淀進(jìn)行確定。用于本文時(shí)，術(shù)語“載體”指將DNA片段傳遞給細(xì)胞的核酸分子使用。載體可以 作用于復(fù)制DNA并且可以獨(dú)立地在宿主細(xì)胞中增殖。術(shù)語“媒介物”有時(shí)與“載體”交互使 用。用于本文時(shí)，術(shù)語“表達(dá)載體”指這樣的重組DNA分子，其包含需要的編碼序列和在具 體宿主生物中表達(dá)可操縱連接的編碼序列所必需的適合的核酸序列。在原核生物中用于表 達(dá)必需的核酸序列通常包括啟動(dòng)子、操縱子(任選)和核糖體結(jié)合位點(diǎn)，經(jīng)常還伴隨其它序 列。理想地，所述啟動(dòng)子包括驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄的SEQ ID NO :6的序列，或其片段。此外，理想的是 與SEQ ID NO :6的序列具有至少50%，60%，75%，80%，90%，95%，或甚至99%序列同一 性并且驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子序列。已知真核生物細(xì)胞使用啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和終止子以及多腺 苷酸化信號(hào)，諸如SEQ ID N0:7的3' UTR序列。在某些情形中，已經(jīng)觀察到植物表達(dá)載體需要植物來源的內(nèi)含子，諸如具有SEQ ID NO :5的序列的內(nèi)含子的存在以具有穩(wěn)定的表達(dá)。 同樣，SEQ ID NO :5的序列，或具有適合的RNA剪接點(diǎn)的任何其它內(nèi)含子可以如本文進(jìn)一步 描述進(jìn)行使用。出于再生具有根的全遺傳改造的植物的目的，可以將核酸插入植物細(xì)胞中，例 如通過任何技術(shù)諸如體內(nèi)接種或通過任何已知的體外組織培養(yǎng)技術(shù)以產(chǎn)生可以再生為 全植物的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。因此，例如，插入植物細(xì)胞可以通過由致病性或非致病性的 A. tumefaciens的體外接種來進(jìn)行。還可以使用其它這樣的組織培養(yǎng)技術(shù)?！爸参锝M織”，“植物組分”或“植物細(xì)胞”包括植物的分化和未分化的組織，包括，但 不限于，培養(yǎng)的根、莖、葉、花粉、種子、腫瘤組織和各種形式的細(xì)胞，諸如單細(xì)胞、原生質(zhì)體、 胚和胼胝體組織。所述植物組織可以是在植物中或以器官、組織或細(xì)胞培養(yǎng)物存在。用于本文時(shí)，“植物細(xì)胞”包括在植物中的植物細(xì)胞和培養(yǎng)的植物細(xì)胞和原生質(zhì) 體。“cDNA”或“互補(bǔ)的DNA”通常指具有這樣的核苷酸序列的單鏈DNA分子，所述核苷酸序 列互補(bǔ)于包含內(nèi)含子的未加工的RNA分子，或缺乏內(nèi)含子的加工的mRNA。通過在RNA模板 上的酶逆轉(zhuǎn)錄酶的作用來形成cDNA。用于本文時(shí)，“煙草”包括煙熏煙、弗吉尼亞煙(Virginia)、白萊煙、深色煙、東方型 煙和在煙草屬中的其它類型的植物。煙草屬的種子容易以煙草的形式商購獲得?！爸破贰被颉盁煵莓a(chǎn)品”包括產(chǎn)品諸如濕和干鼻煙、嚼煙、卷煙、雪茄煙、小雪茄煙、 pipe tobacco、bidis和類似的煙草來源的產(chǎn)品。至于“基因沉默”指相對于對照植物(例如，野生型煙草植物)的水平，在基因表 達(dá)(例如，編碼煙草煙堿脫甲基酶的基因的表達(dá))水平中的減少達(dá)至少30-50%，優(yōu)選地至 少50-80%，和更優(yōu)選地至少80-95%或更大。這種表達(dá)水平的減少可以通過使用本領(lǐng)域已 知的標(biāo)準(zhǔn)方法或通過使用標(biāo)準(zhǔn)突變發(fā)生技術(shù)，諸如本文描述的那些進(jìn)行突變基因的產(chǎn)生來 完成，所述標(biāo)準(zhǔn)方法包括，但不限于，RNA干擾、三鏈干擾、核酶、同源重組、病毒誘導(dǎo)的基因 沉默、反義和共抑制技術(shù)、顯性失活基因產(chǎn)物的表達(dá)。按照任何標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)監(jiān)測煙草煙堿脫甲 基酶多肽或轉(zhuǎn)錄物，或兩者的水平，所述標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)包括，但不限于，RNA印跡、核糖核酸酶保 護(hù)或免疫印跡。用于本文時(shí)，“煙草煙堿脫甲基酶”或“煙堿脫甲基酶”指，基本上與SEQID NO 2的 序列相同的多肽。理想地，煙草煙堿脫甲基酶能夠?qū)焿A(CltlH14N2,還稱為3- (1-甲基-2-吡 咯烷基)吡啶)轉(zhuǎn)化為去甲煙堿(C9H12N2)15如本文所述，可以使用本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)的方法來評 估煙草煙堿脫甲基酶的活性，所述本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)方法諸如通過測量酵母表達(dá)的微粒體進(jìn)行的 對放射性煙堿的脫甲基作用來進(jìn)行。至于煙草煙堿脫甲基酶氨基酸序列的“片段”或“部分”指SEQ ID NO 2的氨基酸 序列的至少例如20，15，30，50，75，100，250，300，400，或500個(gè)連續(xù)氨基酸。示范性的理想 的片段是SEQ ID NO 2的序列的氨基酸1-313和SEQ ID NO 2的序列的氨基酸314-517。 此外，關(guān)于煙草煙堿脫甲基酶核酸序列的片段或部分，理想的片段包括SEQ ID N0:1的 核酸序列的至少100，250，500，750，1000，或1500個(gè)連續(xù)的核酸。示范性的理想的片段 是 SEQ ID NO 1 的序列的核酸 1-2009，2010-2949，2950-3946，3947-4562，4563-6347，和 4731-6347。其它理想的片段包括 SEQ ID NO :5，的核酸 1-100，101-250，251-500，501-750 和 751-998，SEQ ID NO 6 的核酸 1-398，1-1400，1401-2009，1840-2009，1940-2009，399-1240，和 1241-2009，和 SEQ ID NO 7 的核酸 1-100，101-250，251-500，501-750， 751-1000，1001-1250，1251-1500，和 1501-1786。至于“基本純的多肽”指已經(jīng)從天然伴隨其的大多數(shù)成分中分離的煙草煙堿脫甲 基酶；然而，也將這樣的其它蛋白質(zhì)認(rèn)為是基本純的多肽，所述其它蛋白質(zhì)見于與制備物相 關(guān)的微粒體部分中，具有至少8. 3pKat/mg蛋白質(zhì)，9pKat/mg蛋白質(zhì)，9. 5pKat/mg蛋白質(zhì)， 10pKat/mg蛋白質(zhì)，10. 5pKat/mg，或10. 8pKat/mg蛋白質(zhì)的煙堿脫甲基酶活性。典型地，當(dāng) 去除了至少60重量％的與其天然相關(guān)的蛋白質(zhì)和天然存在的有機(jī)分子時(shí)，所述多肽是基 本純的。優(yōu)選地，所述制備物是至少75重量％，更優(yōu)選地至少90重量％和最優(yōu)選地至少99 重量％的煙草煙堿脫甲基酶。可以通過，例如從天然來源(例如，煙草植物細(xì)胞)中提?。?通過編碼煙草煙堿脫甲基酶的重組核酸的表達(dá)；或通過蛋白質(zhì)的化學(xué)合成來獲得基本純的 煙草煙堿脫甲基酶。可以通過任何適合的方法，例如柱色譜法、聚丙烯酰胺凝膠電泳，或通 過HPLC分析來測量純度。至于“分離的核酸分子”指去除了天然位于生物的基因組的核酸分子序列側(cè)翼的 核酸序列的核酸序列。至于“轉(zhuǎn)化的細(xì)胞”指其中(或其祖先中)已經(jīng)通過重組DNA技術(shù)引入DNA分子， 例如編碼煙草煙堿脫甲基酶的DNA分子的細(xì)胞。如本文提供的，術(shù)語“細(xì)胞色素p450”和“p450”交替使用。附圖簡述
圖1是煙草煙堿脫甲基酶基因的基因組結(jié)構(gòu)的示意圖。圖2-1到2-3是基因組煙草煙堿脫甲基酶核酸序列(SEQ ID NO 1)和其翻譯產(chǎn)物 (SEQ ID NO :2)。圖3是煙草煙堿脫甲基酶編碼區(qū)的核酸序列(SEQ ID NO 3)(也稱為D121-AA8) 和其翻譯產(chǎn)物(SEQ ID NO :4)。圖4是在煙草煙堿脫甲基酶基因組序列中存在的內(nèi)含子的核酸序列(SEQ ID NO 5)。圖5是煙草煙堿脫甲基酶啟動(dòng)子區(qū)的核酸序列(SEQ ID NO 6)。圖6是煙草煙堿脫甲基酶基因的3' UTR的核酸序列(SEQ ID NO 7)。詳細(xì)描述編碼煙草煙堿脫甲基酶的基因組克隆的鑒定按照本發(fā)明，從轉(zhuǎn)化體(converter)和非轉(zhuǎn)化體煙草屬品系的煙草屬組織中提取 RNA。接著，將提取的RNA用于產(chǎn)生cDNA。接著，使用兩種策略來產(chǎn)生本發(fā)明的核酸序列。在第一個(gè)策略中，從植物組織中提取富聚腺苷酸的RNA，并且通過反轉(zhuǎn)錄PCR來制 備cDNA。接著，使用簡并引物加寡d(T)反向引物，將單鏈cDNA用于產(chǎn)生p450特異性PCR 群。引物設(shè)計(jì)基于其它植物細(xì)胞色素P450基因序列的高度保守基序進(jìn)行。特異性簡并引 物的實(shí)例在US 2004/0103449A1和US 2004/0111759A1專利申請出版物中的
圖1中提出， 將它們并入本文作為參考。將來自包含適合大小的插入片段的質(zhì)粒的片段的序列進(jìn)行進(jìn)一 步分析。根據(jù)所用的引物，這些大小的插入片段典型地在從約300到約800核苷酸。在第二個(gè)策略中，開始構(gòu)建cDNA文庫。使用簡并引物加在質(zhì)粒上的T7引物作為 反向引物將質(zhì)粒中的cDNA用于產(chǎn)生p450特異性PCR群。如在第一個(gè)策略中，對來自包含適合大小的插入片段的質(zhì)粒的片段的序列進(jìn)行進(jìn)一步分析?？梢詫⒁阎a(chǎn)生高水平的去甲煙堿的煙草屬植物品系(轉(zhuǎn)化體)和具有低水平 去甲煙堿的植物品系用作原材料。接著可以從植物中去除葉子，并且用乙烯進(jìn)行處理以激 活本文定義的P450酶活性。使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)來提取總的RNA。接著，可以使用以寡 d(T)引物進(jìn)行的PCR(RT-PCR)來產(chǎn)生cDNA片段。接著，可以如在本文實(shí)施例中所更充分的 描述來構(gòu)建cDNA文庫。將p450型酶保守區(qū)用作簡并引物的模板。使用簡并引物，通過PCR來擴(kuò)增p450 特異性條帶。通過DNA測序來鑒定指示p450樣酶的帶。使用BLAST搜索，排比或其它工具 來對PCR片段進(jìn)行特征以鑒定適合的候選物。將來自鑒定的片段的序列信息用于開發(fā)PCR引物。將這些引物與cDNA文庫中的 質(zhì)粒引物組合以用于克隆全長P450基因。進(jìn)行大規(guī)模Southern反向分析來檢查獲得的所 有的片段克隆和在某些情形中的全長克隆的差異表達(dá)。在本發(fā)明的該方面中，可以使用來 自不同組織的標(biāo)記的總cDNAs作為探針與克隆的DNA片段進(jìn)行雜交來進(jìn)行這些大規(guī)模的反 向Southern測定從而篩選所有的克隆的插入片段。還將非放射性和放射性(P32)RNA印跡 法用于表征克隆的p450片段和全長克隆。通過衍生它們的氨基酸序列和選擇具備抗原性且相對于其它克隆是獨(dú)特的肽區(qū) 域來制備肽特異性抗體。制備兔抗體以合成與載體蛋白綴合的肽。使用這些抗體，在植物 組織上進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析或其它免疫方法。此外，通過衍生它們的氨基酸序列和選擇具 有潛在抗原性并且相對于其它克隆是獨(dú)特的肽區(qū)域來制備針對數(shù)種全長克隆的肽特異性 抗體。制備兔抗體以合成與載體蛋白綴合的肽。使用這些抗體，進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。煙草煙堿脫甲基酶的下調(diào)按照標(biāo)準(zhǔn)基因沉默方法來產(chǎn)生具有減少的煙草煙堿脫甲基酶的表達(dá)的植物。 (至于綜述，見 Arndt 和 Rank，Genome 40 :785_797，1997 ；Turner 和 Schuch，Journal of Chemical Technology and Biotechnology 75 869-882,2000 ；禾口 Klink 禾口 Wolniak， Journal of Plant Growth Regulation 19(4) :371_384，2000.)具體而言，可以將煙草煙 堿脫甲基酶基因啟動(dòng)子(例如，SEQ ID NO :6)，結(jié)構(gòu)基因(SEQ ID NO :3)，內(nèi)含子(SEQ ID N0:5)，或3' UTR(SEQ ID NO 7)或整個(gè)基因組克隆(SEQ ID NO 1)用于改變煙草表型或 煙草代謝物，例如在任何煙草屬物種中的去甲煙堿。煙草煙堿脫甲基酶基因的減少的表達(dá) 可以使用，例如 RNA干擾(RNAi) (Smith et al. , Nature 407 :319_320，2000 ；Fire et al.， Nature 391 306-311,1998 ；Waterhouse et al.，PNAS 95 13959-13964,1998 ；Stalberg et al.，Plant Molecular Biology 23 671-683,1993 ；Brignetti et al. , EMBO J. 17 6739-6746,1998 ；Allen et al.，Nature Biotechnology 22 1559-1566, 2004)；病毒誘導(dǎo) 的基因沉默(〃 VIGS“ ) (Baulcombe, Current Opinions in Plant Biology，2 :109_113， 1999 ；Cogoni 禾口 Macino，Genes Dev 10 638-643,2000 ；Ngelbrecht et al. , PNAS 91: 10502-10506,1994)；通過在有義方向傳遞植物內(nèi)源基因來使目標(biāo)基因沉默(Jorgensen et al.，Plant Mol Biol 31:957-973,1996)；反義基因的表達(dá)；同源重組(Ohl et al.， Homologous Recombination and Gene Silencing in Plants (Kluwer, Dordrecht, The Netherlands, 1994) ；Cre/lox 系統(tǒng)(Qin et al. ,PNAS 91 :1706-1710，1994 ;Koshinsky et al. , The Plant Journal 23 :715_722,2000 ；Chou, et al. , Plantand Animal Genome VIIConference Abstracts. San Diego,CA, 17-21 1999年 1月)；基因捕獲和T-DNA標(biāo)記(Burns et al.，Genes Dev. 8 :1087_1105，1994 ；Spradling, et al.，PNAS 92 10824-10830,1995 ； Skarnes et al., Bio/Technology 8,827-831,1990 ；Sundaresan, et al. , Genes Dev. 9 1797-1810，1995)；和任何其它可能的基因沉默系統(tǒng)進(jìn)行，所述基因沉默系統(tǒng)可在沉默區(qū)獲 得，其導(dǎo)致煙草煙堿脫甲基酶的表達(dá)的下調(diào)或在其酶活性中的減少。在下面更詳細(xì)地描述 示例性方法。RNA 干擾RNA干擾(“RNAi")是通常在許多生物包括植物中用于誘導(dǎo)有效的和特異性的 翻譯后基因沉默的可應(yīng)用的方法(見，例如，Bosher et al.，Nat. Cell Biol. 2 :E31_36， 2000 ；和 Tavernarakis et al. ,Nat. Genetics 24 180-183，2000)。RNAi 包括將具有部分 或全長雙鏈特征的RNA引入細(xì)胞或引入細(xì)胞外環(huán)境中。抑制是特異性的，因?yàn)檫x擇來自目 標(biāo)基因(例如煙草煙堿脫甲基酶)的部分的核苷酸序列來產(chǎn)生抑制RNA。選擇的部分通常 包括目標(biāo)基因的外顯子，但是選擇的部分還可以包括非翻譯區(qū)(UTRs)，以及內(nèi)含子(例如 SEQ ID NO :5或7的序列)。例如，為了構(gòu)建產(chǎn)生能夠形成雙鏈體的RNAs的轉(zhuǎn)化載體，可以將一個(gè)在有義方 向，另一個(gè)在反義方向的兩個(gè)煙草煙堿脫甲基酶核酸序列可操縱地進(jìn)行連接，并且將其 置于強(qiáng)病毒啟動(dòng)子的控制下，所述強(qiáng)病毒啟動(dòng)子諸如CaMV 35S，或從木薯棕色條紋病毒 (CBSV)中分離的啟動(dòng)子。然而，使用內(nèi)源啟動(dòng)子，諸如具有SEQ ID NO :6的序列的煙草煙 堿脫甲基酶啟動(dòng)子，或驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄的其片段也可以是理想的。包括在這種構(gòu)建體中的煙草煙 堿脫甲基酶核酸序列的長度理想地是至少25個(gè)核苷酸，但是可以包括這樣的序列，其包括 直到全長煙草煙堿脫甲基酶基因?？梢酝ㄟ^土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(Chuanget al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA97 4985-4990,2000)將產(chǎn)生能夠形成雙鏈體的RNAs的構(gòu)建體引入植物諸如煙草植物的基因 組，導(dǎo)致煙草煙堿脫甲基酶中的特異性和可遺傳的遺傳干擾。還可以將雙鏈RNA直接引入 細(xì)胞(即，細(xì)胞內(nèi)地)或細(xì)胞外地引入，例如通過將種子、幼苗或植物浸浴在包含雙鏈RNA 的溶液中來進(jìn)行。根據(jù)遞送的雙鏈RNA物質(zhì)的劑量，所述RNAi可以提供目標(biāo)基因的功能的部分或完 全的損失?？梢栽谥辽?9%的目標(biāo)細(xì)胞中獲得基因表達(dá)的減少或損失。通常，被注射物質(zhì) 的更低的劑量和在施用dsRNA后的更長時(shí)間導(dǎo)致更少部分的細(xì)胞的抑制。在RNAi中所用的RNA可以包括聚合的核糖核苷酸的一條或多條鏈；其可以包括對 磷酸_糖主鏈或核苷的改變。雙鏈結(jié)構(gòu)可以通過單一自我互補(bǔ)的RNA鏈或通過兩條互補(bǔ)的 RNA鏈來形成，并且RNA雙鏈體形成可以起始于細(xì)胞的內(nèi)部或外部。可以以容許每個(gè)細(xì)胞 遞送至少一個(gè)拷貝的量來引入RNA。然而，更高的劑量(例如，每個(gè)細(xì)胞至少5，10，100，500 或1000個(gè)拷貝)的雙鏈物質(zhì)可以產(chǎn)生更有效的抑制。抑制是序列特異性的，因?yàn)檫z傳抑制 針對對應(yīng)于RNA的雙鏈體區(qū)的核苷酸序列。對于抑制，優(yōu)選包含與目標(biāo)基因的部分相同的 核苷酸序列的RNA。相對于目標(biāo)序列具有插入、缺失和單點(diǎn)突變的RNA序列對于抑制也可以 是有效的。因此，可以通過本領(lǐng)域已知的排比算法和在核苷酸序列之間計(jì)算百分比差異來 優(yōu)化序列同一性。備選地，可以將RNA的雙鏈體區(qū)在功能上定義為能夠與目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄物 的部分雜交的核苷酸序列。
此外，用于RNAi的RNA可以在體內(nèi)或體外進(jìn)行合成。例如，在細(xì)胞中的內(nèi)源RNA 聚合酶可以介導(dǎo)體內(nèi)轉(zhuǎn)錄，或可以將克隆的RNA聚合酶用于體內(nèi)或體外轉(zhuǎn)錄。對于從體內(nèi) 的轉(zhuǎn)基因或表達(dá)的構(gòu)建體中進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，可以將調(diào)節(jié)區(qū)用于翻譯RNA —條鏈(或多條鏈)。三鏈干擾內(nèi)源煙草煙堿脫甲基酶基因表達(dá)還可以通過靶向互補(bǔ)于煙草煙堿脫甲基酶基因 的調(diào)節(jié)區(qū)(例如，啟動(dòng)子或增強(qiáng)子區(qū))的脫氧核糖核苷酸序列以形成三股螺旋結(jié)構(gòu)來進(jìn)行 下調(diào)，所述三股螺旋結(jié)構(gòu)阻止靶細(xì)胞中的煙草煙堿脫甲基酶基因的轉(zhuǎn)錄(通常見，Helene, Anticancer Drug Des. 6 :569_584，1991 ；Helene et al.，Ann. N. Y.Acad. Sci. 660 :27_36， 1992 ；禾口 Maher，Bioassaysl4 :807_815，1992.)。用于轉(zhuǎn)錄的抑制的在三股螺旋形成中所用的核酸分子優(yōu)選地是單鏈的并且由脫 氧核糖核苷酸組成。這些寡核苷酸的堿基組成應(yīng)該以Hoogsteen堿基配對法則來促進(jìn)三股 螺旋形成，其通常需要相當(dāng)大的嘌呤或嘧啶的一段序列存在于雙鏈體的一條鏈上。核苷酸 序列可以是基于嘧啶的，其將導(dǎo)致穿過得到的三股螺旋的三條相關(guān)鏈的TAT和CGC三聯(lián)體。 富含嘧啶的分子以與該鏈平行的方向提供對于所述雙鏈體的單鏈的富含嘌呤區(qū)的堿基互 補(bǔ)性。此外，可以選擇富含嘌呤的核酸分子，例如包含G殘基的一段序列。這些分子將與富 含GC對的DNA雙鏈體形成三股螺旋，其中大部分的嘌呤殘基位于目標(biāo)雙鏈體的單鏈上，導(dǎo) 致穿過在三股螺旋中的三條鏈的CGC三聯(lián)體?；蛘撸瑢τ谌陕菪纬煽梢员话邢虻目赡苄蛄锌梢酝ㄟ^產(chǎn)生“轉(zhuǎn)向”核酸分子得 以增加。轉(zhuǎn)向分子以交替的5' -3' ,3' -5'方式進(jìn)行合成，從而使得它們與雙鏈體的第 一條鏈堿基配對，接著與另一條鏈堿基配對，消除了存在于雙鏈體的一條鏈上的嘌呤或嘧 啶的相當(dāng)大的一段序列的必要性。核糖核酸酶核糖核酸酶是這樣的RNA分子，其充當(dāng)酶起作用并且可以被改造以裂解其它的 RNA分子。可以對核糖核酸酶進(jìn)行設(shè)計(jì)以特異性地與實(shí)際上任何目標(biāo)RNA配對并且裂解在 特定位點(diǎn)的磷酸二酯主鏈，由此在功能上使目標(biāo)RNA失活。在此過程中，核糖核酸酶本身沒 有消耗，并且可以在催化上起作用來裂解多拷貝的mRNA目標(biāo)分子。因此，還可以將核糖核 酸酶用作下調(diào)煙草煙堿脫甲基酶的表達(dá)的工具。目標(biāo)RNA-特異性核糖核酸酶的設(shè)計(jì)和使 用描述在Haseloff et al. (Nature 334:585-591,1988)中。優(yōu)選地，核糖核酸酶在核糖核 酸酶的活性位點(diǎn)的每一側(cè)上包括互補(bǔ)于目標(biāo)序列(例如，煙草煙堿脫甲基酶)的至少約20 個(gè)連續(xù)的核苷酸。此外，核糖核酸酶序列還可以被包括在反義RNA中以賦予在反義RNA上的RNA-裂 解活性并且因此增加反義構(gòu)建體的有效性。同源重組基因替代技術(shù)是下調(diào)給定基因，例如煙草煙堿脫甲基酶的表達(dá)的另一種理想的方 法?；蛱娲夹g(shù)基于同源重組(見，Schnable et al.，Curr. Opinions Plant Biol. 1 123-129,1998)?？梢酝ㄟ^突變發(fā)生(例如，插入、缺失、復(fù)制或替代)來操縱目標(biāo)酶諸如 煙草煙堿脫甲基酶的核酸序列以減少酶的功能。接著，可以將改變的序列引入基因組中通 過同源重組以替代現(xiàn)存的，例如野生型的基因(Puchta et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 5055-5060,1996 ；禾口 Kempin et al.，Nature 389 :802_803，1997)。
共抑制使基因表達(dá)沉默的另一種理想的方法是共抑制(還稱為有義抑制)。包括引入以 有義方向構(gòu)造的核酸的該技術(shù)已經(jīng)顯示對目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄的有效的阻礙(見，例如，Napoli et al·，Plant Cell，2 :279_289，1990 和 Jorgensen et al.，美國專利號(hào) 5，034，323)。—般而言，有義抑制包括被引入序列的轉(zhuǎn)錄。然而，共抑制還可以發(fā)生在被引入的 序列本身包含非編碼序列的時(shí)候，但是僅有內(nèi)含子(例如SEQ ID NO 5的序列)或非翻譯 序列諸如SEQ ID NO :7或基本上與存在于內(nèi)源基因的初級(jí)轉(zhuǎn)錄物中的序列相同的其它這樣 的序列將被抑制。被引入的序列通?；旧吓c被靶向抑制的內(nèi)源基因相同。這樣的同一性 典型地大于約50%，但是優(yōu)選更高的同一性(例如，80%或甚至95%)因?yàn)樗鼈儗?dǎo)致更有 效的抑制。共抑制的效果還可以被應(yīng)用于在顯示同源性或基本的同源性的基因的類似家族 中的其它蛋白質(zhì)。可以將來自一種植物的基因的片段直接使用，例如，以抑制在不同植物種 類中的同源基因的表達(dá)。在有義抑制中，要求更少絕對同一性的被引入序列，相對于初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或充分 加工的mRNA，不需要是全長的。在短于全長的序列中的更高程度的序列同一性彌補(bǔ)更少同 一性的更長序列。此外，被引入的序列不需要具有相同的內(nèi)含子或外顯子模式，并且非編碼 片段的同一性可以是一樣有效的。優(yōu)選至少50個(gè)堿基對的序列，其中更優(yōu)選更長長度的被 引入序列(見，例如，描述在Jorgensen et al.，美國專利號(hào)5，034，323中的方法)。反義抑制在反義技術(shù)中，克隆來自需要的植物的基因的核酸片段，諸如在SEQ ID NOS :1，3， 5，6，或7中發(fā)現(xiàn)的片段，并且將其與表達(dá)控制區(qū)可操縱地連接從而合成RNA的反義鏈。接 著，將構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到植物中并且產(chǎn)生RNA的反義鏈。在植物細(xì)胞中，已經(jīng)顯示反義RNA抑制 基因表達(dá)。在反義抑制中被引入的核酸片段通?；旧吓c被抑制的內(nèi)源一個(gè)或多個(gè)基因的 至少一部分相同，但是不需要是相同的。本文公開的煙草煙堿脫甲基酶的核酸序列可以被 包括在設(shè)計(jì)的載體中從而使抑制作用應(yīng)用于顯示與目標(biāo)基因同源或基本同源的基因的家 族中的其它蛋白質(zhì)。可以將來自一種植物的基因的片段直接使用，例如，以抑制在不同煙草 屬物種中的同源基因的表達(dá)。相對于初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或充分加工的mRNA，被引入的序列也不需要是全長的。一般 而言，可以將更高的同源性用于彌補(bǔ)更短序列的使用。而且，被引入的序列不需要具有相 同的內(nèi)含子或外顯子模式，并且非編碼片段的同源性將是一樣的有效。通常，這樣的反義 序列在長度上將通常是至少15個(gè)堿基對，優(yōu)選地是約15-200個(gè)堿基對，并且更優(yōu)選地是 200-2，000個(gè)堿基對或更長。反義序列可以互補(bǔ)于待抑制基因的全部或部分(例如，煙草 煙堿脫甲基酶啟動(dòng)子(SEQ ID NO :6)，外顯子，內(nèi)含子(SEQ ID NO 5)，或UTR (SEQ ID NO: 7)，并且如本領(lǐng)域技術(shù)那些技術(shù)人員所理解，根據(jù)需要抑制的程度和反義序列的獨(dú)性狀，反 義序列結(jié)合的特定一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)以及反義序列的長度將會(huì)變化。表達(dá)植物負(fù)調(diào)節(jié)物反 義核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄構(gòu)建體在轉(zhuǎn)錄的方向上包括，啟動(dòng)子，編碼有義鏈上的反義RNA的序 列，和轉(zhuǎn)錄終止區(qū)?？梢詷?gòu)建反義序列并且將其如例如在van der Krol et al. (Gene 72: 45-50,1988) ；Rodermel et al. (Cell 55:673-681,1988) ；Mol et al. (FEBS Lett. 268 427-430,1990) ；Weigel 和 Nilsson(Nature 377 495-500,1995) ；Cheung al.，(Cell82:383-393,1995)；和 Shewmaker et al.(美國專利號(hào) 5，107,065)中所述進(jìn)行表達(dá)。顯性負(fù)調(diào)控可以在人工環(huán)境或在田間來測定轉(zhuǎn)基因植物，從而證實(shí)所述轉(zhuǎn)基因在轉(zhuǎn)基因植物 中賦予下調(diào)煙草煙堿脫甲基酶，所述轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)編碼煙草煙堿脫甲基酶的顯性負(fù)調(diào)控 基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因。按照本領(lǐng)域已知的方法來構(gòu)建顯性負(fù)調(diào)控轉(zhuǎn)基因。典型地，顯性負(fù)調(diào) 控基因編碼煙草煙堿脫甲基酶的突變的負(fù)調(diào)節(jié)物多肽，其當(dāng)過量表達(dá)時(shí)，干擾野生型酶的 活性。突變體還可以使用標(biāo)準(zhǔn)的突變發(fā)生的方法來產(chǎn)生具有減少的煙草煙堿脫甲基酶的表 達(dá)或酶活性的植物。這些突變發(fā)生的方法包括，但不限于，用甲基硫酸乙酯處理種子 (Hildering和 Verkerk, In, The use of induced mutations in plant breeding. Pergamon press, pp 317-320,1965)或 UV-輻射，X-射線，和快中子輻射(見，例如，Verkerk, Neth. J. Agric. Sci. 19 197-203,1971 ；和 Poehlman, Breeding Field Crops, Van Nostrand Reinhold,New York (3. sup. rd cd)，1987)，使用轉(zhuǎn)座子(Fedoroff et al.，1984 ；美國專利 號(hào) 4，732，856 和美國專利號(hào) 5，013, 658)，以及 T-DNA 插入方法(Hoekema et al.，1983 ；美 國專利號(hào)5，149，645)。可以存在于煙草煙堿脫甲基酶基因中的突變的類型，包括，例如點(diǎn) 突變、缺失、插入、復(fù)制和倒位。這些突變理想地存在于煙草煙堿脫甲基酶基因的編碼區(qū)中； 然而，在煙草煙堿脫甲基酶基因的啟動(dòng)子區(qū)，和內(nèi)含子，或非翻譯區(qū)中的突變也可以是理想 的。例如，可以將T-DNA插入突變發(fā)生用于在煙草煙堿脫甲基酶基因中產(chǎn)生插入突變 以下調(diào)所述基因的表達(dá)。在理論上，對于在任何給定基因中獲得插入片段的95%的可能 性，需要約 100,000 個(gè)獨(dú)立的 T-DNA 插入片段(McKinnet, Plant J. 8 :613_622，1995 ；和 Forsthoefel et al.，Aust. J. Plant Physiol. 19 :353_366，1992)?？梢允褂镁酆厦告?zhǔn)椒?應(yīng)(PCR)分析來篩選植物的T-DNA標(biāo)記的品系。例如，可以設(shè)計(jì)用于T-DNA的一端的引物， 并且可以設(shè)計(jì)用于目標(biāo)基因的另一種引物，兩種引物都可以用在PCR分析中。如果沒有獲 得PCR產(chǎn)物，那么在目標(biāo)基因中沒有插入片段。相反，如果獲得PCR產(chǎn)物，那么在目標(biāo)基因 中有插入片段?？梢园凑諛?biāo)準(zhǔn)方法(例如，在本文中所述的那些)來評估突變的煙草煙堿脫甲基 酶的表達(dá)，并且任選地可以與未突變酶的表達(dá)進(jìn)行比較。當(dāng)與未突變植物進(jìn)行比較時(shí)，具有 減少的編碼煙草煙堿脫甲基酶的基因的表達(dá)的突變植物是本發(fā)明的理想實(shí)施方案。植物啟動(dòng)子按照本發(fā)明的有用植物啟動(dòng)子的實(shí)例是具有SEQ ID NO :6的序列的煙堿脫甲基酶 啟動(dòng)子，或驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄的其片段。另一種理想的啟動(dòng)子是花椰菜花葉病毒啟動(dòng)子，例如花椰菜 花葉病毒(CaMV)啟動(dòng)子或木薯葉脈花葉病毒(CsVMV)啟動(dòng)子。這些啟動(dòng)子在大多數(shù)植物組 織中賦予高水平的表達(dá)，并且這些啟動(dòng)子的活性不依賴于病毒編碼的蛋白質(zhì)。CaMV是35S 和19S啟動(dòng)子兩者的來源。使用這些啟動(dòng)子的植物表達(dá)構(gòu)建體的實(shí)例是本領(lǐng)域已知的。在 轉(zhuǎn)基因植物的大多數(shù)組織中，所述CaMV 35S啟動(dòng)子是強(qiáng)啟動(dòng)子。所述CaMV啟動(dòng)子在單子 葉植物中也是具有高度活性的。而且，該啟動(dòng)子的活性可以通過CaMV 35S啟動(dòng)子的復(fù)制進(jìn) 一步增加(即，在2-10倍之間)。
其它有用的植物啟動(dòng)子包括，但不限于，胭脂氨酸合成酶(NOS)啟動(dòng)子，章魚堿合 酶啟動(dòng)子，玄參(figwort)花葉病毒(FMV)啟動(dòng)子，稻肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子，和遍在蛋白啟動(dòng)子 系統(tǒng)。示例性的單子葉植物啟動(dòng)子包括，但不限于，鴨跖草黃斑駁病毒(commelina yellow mottle virus)啟動(dòng)子，甘蔗badna病毒啟動(dòng)子，水稻tungro桿狀病毒啟動(dòng)子，玉米 條紋病毒元件，和小麥矮縮病毒啟動(dòng)子。對于某些應(yīng)用而言，可能理想的是以適合的水平，或在適合的發(fā)育時(shí)間，在適合的 組織中產(chǎn)生煙草煙堿脫甲基酶，諸如顯性負(fù)調(diào)控突變的煙草煙堿脫甲基酶。對此目的，存 在各類基因啟動(dòng)子，每種具有體現(xiàn)在其調(diào)節(jié)序列中的本身的獨(dú)特的性狀，響應(yīng)于可誘導(dǎo)的 信號(hào)諸如環(huán)境、激素和/或發(fā)育信息時(shí)顯示被調(diào)節(jié)。這些包括，但不限于，負(fù)責(zé)熱調(diào)節(jié)的基 因表達(dá)，光調(diào)節(jié)的基因表達(dá)的基因啟動(dòng)子(例如，豌豆rbcS-3A;玉米rbcS啟動(dòng)子；發(fā)現(xiàn)于 豌豆中的葉綠素a/b結(jié)合蛋白質(zhì)基因；或Arabssu啟動(dòng)子)，激素調(diào)節(jié)的基因表達(dá)(例如， 來自小麥Em基因的脫落酸(ABA)反應(yīng)序列；ABA誘導(dǎo)的HVAl和HVA22，和大麥和擬南芥 (Arabidopsis)的rd29A啟動(dòng)子；和創(chuàng)傷誘導(dǎo)的基因表達(dá)(例如，wunl的)，器官特異性基 因表達(dá)(例如，塊莖特異性的貯存蛋白質(zhì)基因的器官特異性基因表達(dá)；來自所述的玉米的 23-kDa玉米蛋白基因的器官特異性基因表達(dá)；或法國菜豆菜豆蛋白基因的器官特異性 基因表達(dá))，或病原體誘導(dǎo)的啟動(dòng)子(例如，PR-I, prp-Ι，或β-1，3-葡聚糖酶啟動(dòng)子，小 麥的真菌誘導(dǎo)的wirla啟動(dòng)子，和線蟲誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，分別為煙草和芹菜的TobRB7-5A和 Hmg-I))。植物表達(dá)載體典型地，植物表達(dá)載體包括(1)在5'和3'調(diào)節(jié)序列(例如煙草煙堿脫甲基酶啟 動(dòng)子(SEQ ID NO 6)和3' UTR區(qū)(SEQ ID NO 7))的轉(zhuǎn)錄控制下克隆的植物基因(例如， 煙草煙堿脫甲基酶基因)和(2)顯性可選擇的標(biāo)志物。如果需要，這樣的植物表達(dá)載體還 可以包含，啟動(dòng)子調(diào)節(jié)區(qū)(例如賦予可誘導(dǎo)的或組成性的，病原體或創(chuàng)傷誘導(dǎo)的，環(huán)境或發(fā) 育調(diào)節(jié)的，或細(xì)胞或組織特異性的表達(dá)的啟動(dòng)子調(diào)節(jié)區(qū))，轉(zhuǎn)錄開始起始位點(diǎn)，核糖體結(jié)合 位點(diǎn)，RNA加工信號(hào)，轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)和/或多腺苷酸化信號(hào)。植物表達(dá)載體還可以任選地包含RNA加工信號(hào)，例如內(nèi)含子，其已經(jīng)顯示對于有 效的RNA合成和累積是重要的。RNA剪接序列的定位可以大大影響植物中轉(zhuǎn)基因表達(dá)的水 平。鑒于該事實(shí)，內(nèi)含子可以位于轉(zhuǎn)基因中的煙草煙堿脫甲基酶編碼序列的上游或下游以 改變基因表達(dá)的水平。除了上述5 ‘調(diào)節(jié)控制序列之外，表達(dá)載體還可以包含調(diào)節(jié)控制區(qū)，其通常存在于 植物基因的3'區(qū)中。例如，3'終止子區(qū)(例如，SEQ ID NO :7的序列)可以被包括在表 達(dá)載體中以增加mRNA的穩(wěn)定性。一個(gè)這樣的終止子區(qū)可以來自馬鈴薯的PI-II終止子區(qū)。 此外，其它常用的終止子來自章魚氨酸或胭脂氨酸合成酶信號(hào)。植物表達(dá)載體也典型地包含顯性可選擇的標(biāo)志物基因，所述標(biāo)志物基因用于鑒定 已經(jīng)被轉(zhuǎn)化的那些細(xì)胞。用于植物系統(tǒng)的有用的可選擇的基因包括轉(zhuǎn)座子Tn5(Aph II)的 氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，編碼抗生素抗性基因的基因，例如編碼對于潮霉素、卡那霉素、 博來霉素、新霉素G418、鏈霉素或大觀霉素的抗性的那些。光合作用所需的基因還可以用 光合作用缺陷型品系的可選擇的標(biāo)志物。最后，編碼除草劑抗性的基因可以用作可選擇的標(biāo)志物；有用的除草劑抗性基因包括編碼酶膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶且賦予對廣譜除草劑 Basta (Bayer Cropscience Deutschland GmbH, Langenfeld, H )的Jftf生的 bar ―因。 其它的可選擇的標(biāo)志物包括提供對于其它這樣的除草劑諸如草甘膦等，和咪唑啉酮，磺酰 脲，三唑并嘧啶除草劑，諸如chlorosulfron，bromoxynil，dalapon等的抗性的基因。此外， 編碼二氫葉酸還原酶的基因可以與分子諸如methatrexate組合使用。通過確定植物細(xì)胞對特定可選擇試劑的敏感性和確定有效殺死大多數(shù)，如果不 是全部的，被轉(zhuǎn)化細(xì)胞的該試劑的濃度來促進(jìn)可選擇標(biāo)志物的有效使用。用于煙草轉(zhuǎn)化 的一些有用的抗生素濃度包括，例如20-100 μ g/ml (卡那霉素)，20-50 μ g/ml (潮霉素)， 或5-10 μ g/ml (博來霉素)。用于選擇除草劑抗性的轉(zhuǎn)化體的有用策略由，例如Vasil描 述(Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants， Vol I， II， III Laboratory Procedures and Their Applications Academic Press, New York，1984)。除了可選擇的標(biāo)志物之外，可能理想的是使用報(bào)道基因。在某些情形中，可以使用 報(bào)道基因，而不用可選擇的標(biāo)志物。報(bào)道基因是這樣的基因，其典型地在受體生物或組織中 不存在或表達(dá)。報(bào)道基因典型地編碼提供一些表型變化或酶性質(zhì)的蛋白質(zhì)。這些基因的實(shí) 例在Weising等(Ann. Rev. Genetics 22:421,1988)中進(jìn)行提供，將其并入本文作為參考。 優(yōu)選的報(bào)道基因包括，但不限于葡糖醛酸糖苷酶(GUS)基因和GFP基因。在構(gòu)建植物表達(dá)載體后，可以使用一些標(biāo)準(zhǔn)的方法將載體引入植物宿主中， 由此產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。這些方法包括(1) 土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(A. tumefaciens或 A.rhizogenes)(見，例如，Lichtenstein 禾口 Fuller In :Genetic Engineering, vol 6, PffJ Rigby, ed, London, Academic Press, 1987 ；禾口 Lichtenstein, C. P.,禾口 Draper, J, . In DNA Cloning, Vol II，D. M. Glover, ed, Oxford, IRI Press, 1985 ；美國專利號(hào) 4，693，976， 4，762，785,4，940，838,5，004，863,5，104，310,5，149，645,5，159，135,5，177，010, 5，231，019，5，463，174，5，469，976，和 5, 464, 763 ；和歐洲專利申請?zhí)?0131624B1, 0159418B1，0120516，0176112，0116718，0267159，0290799，0292435，0320500，0604622，和 0627752)，(2)顆粒遞送系統(tǒng)(見，例如美國專利號(hào)4，945，050和5，141，131)，(3)微注射 方法，(4)聚乙二醇(PEG)方法，(5)脂質(zhì)體介導(dǎo)的DNA吸收，(6)電穿孔方法(見，例如 W087/06614,W0 92/09696，和 WO 93/21335 ；和美國專利號(hào) 5，384，253 和 5，472，869，(7)渦 旋方法，或(8)所謂的whiskers方法(見，例如，Coffee et al.，美國專利號(hào)5，302，523和 5，464，765)?？梢杂帽磉_(dá)載體轉(zhuǎn)化的植物組織的類型包括胚胎組織，I型和II型胼胝體組 織，下胚軸，分生組織等。一旦被引入植物組織中，結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)可以通過任何本領(lǐng)域已知方式進(jìn)行 測定，并且表達(dá)可以測量為轉(zhuǎn)錄的mRNA，合成的蛋白質(zhì)，或基因沉默的量，其通過對煙草 中的次級(jí)生物堿進(jìn)行化學(xué)分析的代謝物監(jiān)測進(jìn)行測定(如本文所述；還見美國專利號(hào) 5，583，021，將其并入本文作為參考)。已知用于植物組織的體外培養(yǎng)的技術(shù)，并且在許多 情形中，已知用于再生為完整植物的技術(shù)(見，例如美國專利號(hào)5，595，733和5，766，900)。 將引入的表達(dá)復(fù)合體傳遞到商用栽培品種中的方法是本領(lǐng)域那些技術(shù)人員已知的。一旦獲得了表達(dá)需要水平的煙堿脫甲基酶(或去甲煙堿或NNN或兩者)的植物細(xì) 胞，可以使用本領(lǐng)域眾所周知的方法和技術(shù)從其中再生植物組織和完整植物。接著，通過常 規(guī)方式來繁殖再生的植物并且通過常規(guī)植物育種技術(shù)可以將被引入的基因遞送到其它品系和栽培品種中。轉(zhuǎn)基因煙草植物可以以不同的方向結(jié)合基因組基因的任何部分的核酸，所述方向 或者用于下調(diào)，例如以反義方向結(jié)合或以某種形式來誘導(dǎo)RNAi，或用于過量表達(dá)，例如以有 義方向結(jié)合。對于在煙草屬品系中增加煙堿脫甲基酶的表達(dá)，編碼全長煙草煙堿脫甲基酶 基因的氨基酸序列的完整或功能部分的核酸序列的過量表達(dá)是理想的。'鵬’腦麵■隱煙草煙堿脫甲基酶的表達(dá)可以例如，使用煙草煙堿脫甲基酶(或cDNA片段)作 為雜交探針，通過標(biāo)準(zhǔn)RNA印跡分析來進(jìn)行測量(Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley&Sons, New York, NY, (2001),禾口 Sambrook et al., Molecular Cloning :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y., (1989))。RNA表達(dá)水平的確定還可以通過反轉(zhuǎn)錄PCR(rtPCR)來協(xié)助，所述反轉(zhuǎn)錄 PCR(rtPCR)包括定量 rtPCR(見，例如 Kawasaki et al.，in PCR Technology principles and Applications of DNA Amplification(H. A. Erlich, Ed.)Stockton Press (1989)； Wang et al. in PCR Protocols :A Guide to Methods and Applications(M. A. Innis, et al. , Eds. )Academic Press(1990)；禾口 Freeman et al. , Biotechniques 26 :112—122 禾口 124-125,1999)。用于確定煙草煙堿脫甲基酶基因的表達(dá)的另外的眾所周知的技術(shù)包括原 位雜交，禾口焚光原位雜交(見，例如，Ausubel et al. , Current Protocols in Molecular Biology，John ffiley&Sons, New York, NY, (2001))。上述標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)還可以用于比較植物之 間，例如在煙草煙堿脫甲基酶基因中具有突變的植物和對照植物之間來比較表達(dá)水平。如果需要，煙草煙堿脫甲基酶基因的表達(dá)可以在煙草煙堿脫甲基酶蛋白質(zhì)制備的 水平上，使用相同的通用方法和標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分析技術(shù)包括Bradford測定、分光光度測定和 免疫檢測技術(shù)，諸如蛋白質(zhì)印跡或用煙草煙堿脫甲基酶-特異性抗體進(jìn)行的免疫沉淀來測 量(Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley&Sons, New York，NY, (2001)，禾口 Sambrook et al.，Molecular Cloning :A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y.，(1989))。煙草煙堿脫甲基酶調(diào)節(jié)劑的鑒定煙草煙堿脫甲基酶cDNA的分離還有利于增加或減少煙草煙堿脫甲基酶的表達(dá)的 分子的鑒定。按照一種方法，將候選分子以不同的濃度加入表達(dá)煙草煙堿脫甲基酶mRNA的 細(xì)胞(例如，原核生物細(xì)胞諸如大腸桿菌或真核生物細(xì)胞諸如酵母、哺乳動(dòng)物、昆蟲或植物 細(xì)胞)的培養(yǎng)基中。接著，使用標(biāo)準(zhǔn)方法諸如在本文中提到的那些，在存在和缺乏候選分子 的情況下測量煙草煙堿脫甲基酶的表達(dá)。候選的調(diào)節(jié)劑可以是純化(或基本純)的分子或可以是化合物的混合物的一種成 分。在混合的化合物測定中，針對越來越小的候選化合物庫的子集(例如，通過標(biāo)準(zhǔn)純化技 術(shù)，例如HPLC而產(chǎn)生)來測試煙草煙堿脫甲基酶的表達(dá)直到證實(shí)單一化合物或最少化合物 混合物改變煙草煙堿脫甲基酶基因的表達(dá)。認(rèn)為促進(jìn)煙草煙堿脫甲基酶的表達(dá)的減少的分 子在本發(fā)明中是特別有用的?？梢哉J(rèn)定發(fā)現(xiàn)在煙草煙堿脫甲基酶的表達(dá)或活性水平上有效 的調(diào)節(jié)劑在植物中有效的。對于農(nóng)業(yè)應(yīng)用，使用本文公開的方法鑒定的分子、化合物或試劑可以用作化學(xué)品， 所述化學(xué)品被用作在植物的葉子上的噴霧劑或粉劑。所述分子、化合物或試劑還可以與另一種分子組合應(yīng)用于植物，所述另一種分子對植物提供某種益處。煙堿脫甲基酶基因啟動(dòng)子和非翻譯區(qū)的使用本文所述的煙堿脫甲基酶基因的啟動(dòng)子區(qū)是可乙烯誘導(dǎo)的或與植物衰老相關(guān)的。 因此，該啟動(dòng)子可以用于驅(qū)動(dòng)任何理想的基因產(chǎn)物的表達(dá)以改善農(nóng)作物質(zhì)量或增加具體的 性狀。因?yàn)闊煵轃焿A脫甲基酶啟動(dòng)子(例如SEQ ID NO 6)是可誘導(dǎo)并且在植物生活周期 的特定時(shí)期表達(dá)，包含該啟動(dòng)子的構(gòu)建體可以被引入植物以表達(dá)獨(dú)特的基因，所述基因涉 及香味和由次級(jí)代謝物導(dǎo)致的芳香產(chǎn)物的生物合成。這些化合物的實(shí)例是在類萜途徑中的 化合物，其它生物堿，植物激素，黃酮類化合物或含糖的部分。煙草煙堿脫甲基酶啟動(dòng)子還 可以用于增加或改變結(jié)構(gòu)性糖或蛋白質(zhì)的表達(dá)，其影響最終使用性質(zhì)。此外，煙草煙堿脫甲 基酶啟動(dòng)子還可以與異源基因組合，所述異源基因包括涉及營養(yǎng)產(chǎn)物、藥劑或工業(yè)物質(zhì)的 生物合成的基因。所述啟動(dòng)子可以用于驅(qū)動(dòng)煙草內(nèi)源的基因的下調(diào)，所述基因包括煙堿脫 甲基酶或其它涉及生物堿生物合成和或在其它途徑中的基因。而且，煙草煙堿脫甲基酶基因的啟動(dòng)子區(qū)(例如，SEQ ID NO 6)或煙草煙堿脫甲 基酶基因的3' UTR(例如，SEQ ID NO :7)還可以用在任何定點(diǎn)基因沉默方法諸如T-DNA 標(biāo)記，基因捕獲和同源重組中以改變目標(biāo)基因的表達(dá)模式，如本文所述。還可以將啟動(dòng)子基 序，用于鑒定與煙草煙堿脫甲基酶相關(guān)或調(diào)節(jié)其表達(dá)的因子，所述啟動(dòng)子基序可以使用本 領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)方法，容易地在啟動(dòng)子序列，諸如SEQ ID NO :6的序列中進(jìn)行鑒定。理想地，將煙 草煙堿脫甲基酶啟動(dòng)子區(qū)或其它轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)用于改變化學(xué)性質(zhì)諸如植物中的去甲煙堿含 量和亞硝胺水平。此外，可以將煙草煙堿脫甲基酶基因的任何部分用作遺傳標(biāo)志物以分離相關(guān)基 因、啟動(dòng)子或調(diào)節(jié)區(qū)，或用于在其它煙草或煙堿物種中篩選脫甲基酶基因。產(chǎn)物按照本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法，使用本文所述的任何煙草植物材料，制備具有減少 量的亞硝胺含量的煙草產(chǎn)品。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用獲自遺傳修飾的加工處理的煙草的 植物材料來制備煙草產(chǎn)品，所述加工處理的煙草植物具有少于約5mg/g，4. 5mg/g，4. Omg/ g, 3. 5mg/g, 3. Omg/g, 2. 5mg/g, 2. Omg/g, 1. 5mg/g, 1. Omg/g, 750 μ g/g, 500 μ g/g, 250 μ g/g, 100 μ g/g, 75 μ g/g, 50 μ g/g, 25 μ g/g, 10 μ g/g, 7. O μ g/g, 5. O μ g/g, 4. O μ g/g, 2. O μ g/ g，1· O μ g/g, 0· 5 μ g/g, 0· 4 μ g/g, 0. 2 μ g/g, 0. 1 μ g/g, 0. 05 μ g/g,或 0. 01 μ g/g 的減少 量的去甲煙堿或NNN，或其中相對于包含在其中的總生物堿含量，次級(jí)生物堿的百分比少 于 90 %，70 %，50 %，30 %，10 %，5 %，4 %，3 %，2 %，1. 5 %，1 %，0. 75 %，0. 5 %，0. 25 %，或 0.1%。即，所述加工處理的煙草制備自遺傳修飾的煙草植物。短語“減少的量”傾向于指 與在天然存在的煙草植物、煙草或以相同方式處理的來自相同種類的煙草的煙草產(chǎn)品中發(fā) 現(xiàn)的相比，在轉(zhuǎn)基因煙草植物、煙草或煙草產(chǎn)品中存在的去甲煙堿或NNN或兩者的量較少， 所述天然存在的煙草植物、煙草或以相同方式處理的來自相同種類的煙草的煙草產(chǎn)品沒有 被制成具有減少的去甲煙堿或NNN的轉(zhuǎn)基因材料。因此，在某些情形中，以相同方式加工的 相同種類的天然存在的煙草被用作對照，通過其測量是否已經(jīng)通過本文所述的方法獲得去 甲煙堿或NNN的減少。按照煙草領(lǐng)域眾所周知的方法來測量去甲煙堿和NNN的水平。下列實(shí)施例舉例說明了實(shí)施本發(fā)明的方法并且應(yīng)當(dāng)被理解為對于本發(fā)明范圍的 例證而非限制，所述范圍在后附的權(quán)利要求書中進(jìn)行限定。
實(shí)施例1棺物組織的發(fā)育和乙烯處理棺物的牛長將植物種在盆中并于溫室中生長4周。將4周齡的幼苗移植入單個(gè)盆中并于溫室 中生長2個(gè)月。在生長過程中將植物用含有150ppm NPK肥料的水一天澆水2次。將展開 的綠葉從植物上分離進(jìn)行下述的乙烯處理。細(xì)胞系78379將煙草品系78379用作植物材料來源，所述煙草品系78379是由肯塔基大學(xué)給 出的白萊煙煙草品系。按照為生長煙草領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)一百株植物，移植，并用不同數(shù)字 (1-100)進(jìn)行標(biāo)記。根據(jù)推薦地那樣進(jìn)行受精和田間管理。所述100株植物中的四分之三將20和100%之間的煙堿轉(zhuǎn)化為去甲煙堿。所述 100株植物中的四分之一將少于5%的煙堿轉(zhuǎn)化為去甲煙堿。87號(hào)植物具有最少的轉(zhuǎn)化 (2%)而21號(hào)植物具有100%的轉(zhuǎn)化。將轉(zhuǎn)化少于3%的植物歸類為非轉(zhuǎn)化體。制備87 號(hào)植物和21號(hào)植物的自花傳粉種子，以及雜交(21x87和87x21)種子來研究遺傳和表型差 異。來自自交21的植物為轉(zhuǎn)化體，而99%的來自87的自交株為非轉(zhuǎn)化體。來自87的植物 的另外顯示低轉(zhuǎn)化(5-15% )。來自反交的植物全部為轉(zhuǎn)化體。細(xì)胞系4407將煙草屬品系4407用作植物材料的來源，所述煙草品系4407為白萊煙品系。選 擇一致和代表性的植物(100)并進(jìn)行標(biāo)記。100株植物的97株為非轉(zhuǎn)化體而三株為轉(zhuǎn)化 體。56號(hào)植物具有最少的轉(zhuǎn)化量(1. 2% )而58號(hào)植物具有最高的轉(zhuǎn)化水平(96% )。用 這兩種植物制備自花傳粉種子和雜交種子。來自自交58的植物以3 1轉(zhuǎn)化體對非轉(zhuǎn)化體的比例分離。植物58_33和58_25 分別被鑒定為純合的轉(zhuǎn)化體和非轉(zhuǎn)化體植物品系。通過其后代的分析確認(rèn)了 58-33的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。細(xì)胞系PBLBOlPBLBOl是由ProfiGen，Inc.開發(fā)的白萊煙品系并被用作植物材料的來源。轉(zhuǎn)化 體植物選自PBLBOl的起始種子。乙烯處理方法將綠葉從2-3個(gè)月溫室培養(yǎng)的植物上取下并噴以0.3%乙烯溶液(Pr印brand Eth印hon(Rhone-Poulenc))。將每片噴過的葉子懸掛于處理架上，所述處理架裝備了增濕 器并覆以塑料。在處理過程中，用乙烯溶液周期性地噴樣品葉子。在乙烯處理后的大約 24-48個(gè)小時(shí)，收集葉子進(jìn)行RNA抽提。取另一份小樣進(jìn)行代謝組分分析以測定葉代謝物和 更加具體的目標(biāo)組分如多種生物堿的濃度。作為實(shí)例，可以如下進(jìn)行生物堿分析。將樣品(0. Ig)于150rpm與0. 5ml 2N NaOH 和5ml抽提溶液一起進(jìn)行搖動(dòng)，所述抽提溶液包含作為內(nèi)標(biāo)的喹啉和甲基叔丁醚。在配備 了 FID檢測器的HP 6890 GC上分析樣品。對于檢測器和注射器使用250°C的溫度。在以每 分鐘10°C的110-185°C的溫度梯度上使用由熔融的硅石組成的HP柱(30m_0. 32nm-lmm)， 所述熔融的硅石交聯(lián)了 5%的苯酚和95%的聚甲基硅氧烷(methyl silicon)。于100°C以 1. TctAirr1的流速，以40 1的裂解比率 以2 1的注射體積利用氦作為載氣來操作所述柱。實(shí)施例2RNA 分離為了進(jìn)行RNA提取，如上述用乙烯處理來自兩個(gè)月齡的溫室生長植物的中葉。將0 和24-48小時(shí)的樣品用于RNA抽提。在一些情況下，從除去花頭后10天的植物上取處于衰 老過程的葉子樣品。也將這些樣品用于抽提。根據(jù)生產(chǎn)商的方案利用Rneasy Plant Mini Kit (Qiagen, Inc. ，Valencia, California)分離總 I NA。利用DEPC處理的研體和研杵將組織樣品在液氮下研磨成精細(xì)粉末。將大約100 毫克的研磨組織轉(zhuǎn)移入無菌的1. 5ml Eppendorf管中。將此樣品管置于液氮中直到收集了 所有樣品。隨后，將如試劑盒中提供的450 μ 1緩沖液RLT(加入巰基乙醇)加入到每只單 個(gè)管中。劇烈渦旋樣品并于56°C溫育3分鐘。隨后將裂解物應(yīng)用到置于2ml收集管中的 QIAshredder 離心柱上，并以最大速度離心2分鐘。收集流過物并將0. 5體積的乙醇加入到 清除的裂解物中。充分混合樣品并轉(zhuǎn)移到置于2ml收集管中的Rneasy 微型離心柱上。于 10，OOOrpm將樣品離心1分鐘。接下來，將700 μ 1的緩沖液RWl吸移到Rneasy 柱上并于 10，OOOrpm離心1分鐘。將緩沖液RPE吸移到在新收集管中的Rneasy 柱上并于10，OOOrpm 離心1分鐘。再次將緩沖液RPE加入到Rneasy 離心柱上并以最大速度離心2分鐘以干燥 所述膜。為了除去任何殘余的乙醇，將膜置于單獨(dú)的收集管中并以最大速度再離心1分鐘。 將Rneasy 柱轉(zhuǎn)移入新的1. 5ml收集管中，并將40 μ 1不含RNA酶的水直接吸移到Rneasy 膜上。將此最終洗脫管于10，OOOrpm離心1分鐘。通過變性甲醛凝膠和分光光度計(jì)分析總 RNA的質(zhì)與量。遵照生產(chǎn)商的方案使用Oligotex 聚A+RNA純化試劑盒(Qiagen Inc.)分離聚 (A) RNA。使用250 μ 1最大體積中的大約200 μ g總RNA。將250 μ 1體積的緩沖液OBB和 15 μ 1的Oligotex 混懸液加入到250 μ 1的總RNA中。通過吸移將組分充分混合并在加熱 模塊上于70°C溫育3分鐘。隨后將樣品置于室溫大約20分鐘。通過以最大速度離心2分 鐘將Oligotex :mRNA復(fù)合物沉淀。除了 50 μ 1上清液之外將全部物質(zhì)從微量離心管中除 去。用OBB緩沖液進(jìn)一步處理樣品。通過渦旋將Oligotex :mRNA沉淀重懸于400 μ 1的 緩沖液0W2中。將此混合物轉(zhuǎn)移到置于新管中的小離心柱上并以最大速度離心1分鐘。將 離心柱轉(zhuǎn)移到新的管中并向柱中加入另外400μ 1的緩沖液0W2。隨后以最大速度將所述管 離心1分鐘。將所述離心柱轉(zhuǎn)移到最終的1. 5ml微量離心管中。用60 μ 1的熱(70°C )緩 沖液OEB洗脫樣品。通過變性甲醛凝膠和分光光度分析來分析聚腺苷酸產(chǎn)物。實(shí)施例3反轉(zhuǎn)錄PCR按照生產(chǎn)商的方案使用SuperScript反轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen，Carlsbad, California)制備第一鏈cDNA。富含聚A+的RNA/寡dT引物混合物由少于5 μ g的總RNA， 1 μ 1 的 IOmM dNTP 混合物，1 μ 1 的寡 d (T) 12_18 (0. 5 μ g/ μ 1)，和多達(dá) 10 μ 1 的 DEPC 處理的 水組成。將每個(gè)樣品于65°C溫育5分鐘，隨后置于冰上至少1分鐘。反應(yīng)混合物通過順序 加入每種下列組分進(jìn)行制備:2μ 110X RT緩沖液，4 μ 1的25mM MgCl2,2y 1的0. IM DTT， 和1 μ 1的RNA酶OUT重組RNA酶抑制劑。將另外9 μ 1的反應(yīng)混合物吸移到每種RNA/引 物混合物中并輕輕混合。將其于42°C溫育2分鐘并將1 μ 1的Super Script II RT加入到每管中。將所述管于42°C溫育50分鐘。于70°C終止反應(yīng)15分鐘并于冰上冷卻。通過離 心收集樣品并將1 μ 1的RNA酶H加入到每管中并于37°C溫育20分鐘。用200pmoleS的正 向引物和lOOpmoles反向引物(后帶1個(gè)隨機(jī)堿基的18nt寡d(T)的混合物)進(jìn)行第二次 PCR。反應(yīng)條件為94°C 2分鐘和隨后在94°C 1分鐘，45°C -60°C 2分鐘，72°C 3分鐘的 40個(gè)PCR循環(huán)，于72°C再延伸lOmin。利用1 %的瓊脂糖凝膠通過電泳分析10微升的擴(kuò)增 樣品。將正確大小的片段從瓊脂糖凝膠上純化出來。實(shí)例例4PCR片段群的牛成按照生產(chǎn)商的說明書將來自實(shí)施例3的PCR片段連接入pGEM-T Easy載體 (Promega，Madison，Wisconsin)。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入JM109感受態(tài)細(xì)胞中并接種于LB培養(yǎng) 基板上進(jìn)行藍(lán)/白篩選。選擇菌落并于37°C過夜生長于具有1. 2ml LB培養(yǎng)基的96孔板中。 對于所有選擇的菌落都制成冷凍的貯存母液。以Wizard SV Minipr印試劑盒(Promega) 利用Beckman' sBiomeck 2000小量制備機(jī)器人由板中純化質(zhì)粒DNA。用100 μ 1水洗脫質(zhì) 粒DNA并保存于96孔板中。通過EcoRl消化質(zhì)粒并利用1 %的瓊脂糖凝膠進(jìn)行分析以確定 DNA量和插入片段的大小。利用CEQ 2000測序儀(Beckman，F(xiàn)ullerton，California)對包 含400-600bp插入片段的質(zhì)粒進(jìn)行測序。通過BLAST搜索將序列與GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比 對。鑒定P450相關(guān)片段并進(jìn)一步進(jìn)行分析?；蛘撸瑢450片段從消減式文庫中分離。也 如上所述對這些片段進(jìn)行分析。實(shí)施例5cDNA文庫構(gòu)建.如下通過由乙烯處理的葉子制備總RNA來構(gòu)建cDNA文庫。首先，利用改進(jìn)的酸苯 酚和氯仿抽提方法由乙烯處理的煙草品系58-33葉子中抽提總RNA。改進(jìn)所述方法以使用 一克組織，所述組織進(jìn)行過研磨并隨后在5ml抽提緩沖液(IOOmM Tris-HCl,pH 8. 5 ；200mM NaCl ；IOmM EDTA ；0. 5% SDS)中進(jìn)行渦旋，向其中加入5ml苯酚(pH5. 5)和5ml氯仿。將 抽提樣品離心并保留上清液。將此抽提步驟重復(fù)2-3次直到上清液看起來清亮。加入大約 5ml的氯仿以去除痕量的苯酚。通過加入3倍體積的乙醇和1/10體積的3M NaOAc (pH5. 2) 將RNA由合并的上清液級(jí)分中沉淀并于-20°C保存1小時(shí)。在轉(zhuǎn)移到Corex玻璃容器中后 將RNA級(jí)分于9，000RPM于4°C離心45分鐘。用70%乙醇洗滌沉淀物并于9，000RPM于4°C 離心5分鐘。干燥沉淀后，將沉淀的RNA溶解于0. 5ml不含RNA酶的水中。分別通過變性 甲醛凝膠和分光光度計(jì)分析總RNA的質(zhì)與量。通過下列方案利用寡(dT)纖維素方法(Invitrogen)和微量離心柱(Invitrogen) 將得到的總RNA用于分離聚A+RNA。將大約20mg的總RNA進(jìn)行兩次純化以獲得高質(zhì)量的聚 A+RNA。通過進(jìn)行變性甲醛凝膠和隨后的已知全長基因的RT-PCR來分析聚A+RNA產(chǎn)物以確 保高質(zhì)量的mRNA。接下來，采用cDNA合成試劑盒，ZAP-cDNA合成試劑盒，和ZAP-cDNA Gigapack III gold克隆試劑盒(Stratagene，La Jolla, California)將聚A+RNA用作模板來產(chǎn)生cDNA文 庫。所述方法包括遵循指定的生產(chǎn)商方案。將大約8yg的聚A+RNA用來構(gòu)建cDNA文庫。 初級(jí)文庫的分析揭示了大約2. 5X106-lX107pfu。利用IPTG和Χ-gal通過互補(bǔ)測定完成文庫質(zhì)量背景測試，其中重組斑以高于背景反應(yīng)的超過100倍進(jìn)行表達(dá)。
通過隨機(jī)PCR進(jìn)行的更加定量的文庫分析顯示插入cDNA的平均大小為大約 1.2kb。該方法使用兩步PCR法。對于第一步，基于獲自p450片段的初步序列信息設(shè)計(jì)反 向引物。利用設(shè)計(jì)的反向引物和T3(正向)引物由cDNA文庫擴(kuò)增相應(yīng)的基因。將PCR反 應(yīng)進(jìn)行瓊脂糖電泳并切除相應(yīng)的高分子量條帶，純化，克隆和測序。在第二步中，由5' UTR 或P450的起始編碼區(qū)設(shè)計(jì)作為正向引物的新引物與反向引物(由p450的3' UTR設(shè)計(jì)) 一起用于隨后的PCR中來獲得全長p450克隆。 除了反向引物之外，如實(shí)施例3中所述，通過PCR擴(kuò)增由構(gòu)建的cDNA文庫生成 P450片段。將位于cDNA插入片段質(zhì)粒下游的T7引物用作反向引物。如實(shí)施例4中所述對 PCR片段進(jìn)行分離，克隆和測序。通過這種PCR方法由構(gòu)建的的cDNA文庫分離全長p450基因。使用基因特異性反 向引物(由P450片段下游序列設(shè)計(jì))和正向引物(在文庫質(zhì)粒上的T3)克隆全長基因。對 PCR片段進(jìn)行分離，克隆和測序。如果必要的話，應(yīng)用第二個(gè)PCR步驟。在第二個(gè)步驟中，由 克隆的p450s的5' UTR設(shè)計(jì)的新的正向引物與由p450克隆的3' UTR設(shè)計(jì)的反向引物一 起用于隨后的PCR反應(yīng)中來獲得全長p450克隆。隨后對克隆進(jìn)行測序。實(shí)施例6克降片段的特征鑒定-反向DNA印跡分析對于在以上實(shí)施例中鑒定的所有p450克隆進(jìn)行非放射性大規(guī)模反向DNA印跡測 定以檢測差異表達(dá)。觀察到在不同P450簇之間表達(dá)水平非常不同。對于具有高度表達(dá)的 那些進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)時(shí)檢測。如下進(jìn)行非放射性DNA印跡操作。1)如實(shí)施例2中所述使用Qiagen Rnaeasy試劑盒由乙烯處理的和未處理的轉(zhuǎn)化 體(58-33)和非轉(zhuǎn)化體(58-25)葉子抽提總RNA。2)通過生物素尾端標(biāo)記單鏈cDNA產(chǎn)生探針，所述單鏈cDNA衍生自以上步驟中生 成的富含聚A+的RNA。如實(shí)施例3中所述通過轉(zhuǎn)化體和非轉(zhuǎn)化體總RNA(Invitrogen)的 RT-PCR生成這種經(jīng)標(biāo)記的單鏈cDNA，除了使用生物素化的寡dT作為引物(Promega)。這些 被用作與克隆DNA雜交的探針。3)用限制性酶EcoRl消化質(zhì)粒DNA并在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。同時(shí)將凝膠干燥 并轉(zhuǎn)移到兩個(gè)尼龍膜上(Biodyne B)。將一個(gè)膜與轉(zhuǎn)化體探針雜交而另一個(gè)與非轉(zhuǎn)化體探 針雜交。雜交前將膜進(jìn)行UV-交聯(lián)(自動(dòng)交聯(lián)裝置，254nm，Stratagene，Stratalinker)。或者，利用位于P-GEM質(zhì)粒兩條臂上的序列T3和SP6作為引物，由每個(gè)質(zhì)粒PCR 擴(kuò)增插入片段。通過在96孔預(yù)運(yùn)行(Ready-to-rim)瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳來分析PCR產(chǎn) 物。將確認(rèn)的插入片段點(diǎn)在兩個(gè)尼龍膜上。將一個(gè)膜與轉(zhuǎn)化體探針雜交而另一個(gè)與非轉(zhuǎn)化 體探針雜交。4)根據(jù)生產(chǎn)商的說明書(Enzo MaxSence kit, Enzo Diagnostics, Inc, Farmingdal^NY)，對洗滌嚴(yán)謹(jǐn)性進(jìn)行改進(jìn)，對膜進(jìn)行雜交和洗滌。將膜于42°C與雜交緩沖 液(2x SSC緩沖的甲酰胺，含有去污劑和雜交增強(qiáng)劑)預(yù)雜交30min并與ΙΟμΙ變性探針 于42°C過夜雜交。隨后將膜在室溫于IX雜交洗滌緩沖液中洗滌1次持續(xù)IOmin并于68°C 洗滌4次持續(xù)15min。所述膜可以用于檢測操作。
5)如生產(chǎn)商的檢測方法(Enzo Diagnostics, Inc.)中所述通過堿性磷酸酶標(biāo)記 隨后進(jìn)行NBT/BCIP colometric檢測對經(jīng)洗滌的膜進(jìn)行檢測。用Ix封閉溶液于室溫將膜封 閉1小時(shí)，用IX檢測試劑洗滌3次達(dá)lOmin，用IX預(yù)顯色反應(yīng)緩沖液洗滌2次達(dá)5min，并 且隨后在顯色溶液中將斑點(diǎn)顯色30-45min直到斑點(diǎn)顯現(xiàn)。所有試劑都由生產(chǎn)商提供(Enzo Diagnostics, Inc)。此外，還利用KPL DNA雜交和檢測試劑盒根據(jù)生產(chǎn)商的說明書(KPL， Gaithersburg, Maryland)進(jìn)行大規(guī)模反向DNA測定。實(shí)施例7克降的特征鑒定-RNA印跡分析作為DNA印跡分析的備選，如在RNA印跡測定的實(shí)施例中所述對一些膜進(jìn)行雜交 和檢測。如下利用RNA雜交來檢測在煙草屬中差異表達(dá)的mRNA。利用一種隨機(jī)引導(dǎo)方法來由克隆的p450制備探針(Megaprime DNA Labelling Systems, Amersham Biosciences)?；旌舷铝薪M分25ng變性的DNA模板；4 μ 1每種未標(biāo)記 的dTTP, dGTP和dCTP ；5 μ 1的反應(yīng)緩沖液；P32-標(biāo)記的dATP和2 μ 1的Klenow I ；禾口 H2O, 使反應(yīng)達(dá)到50 μ 1。將混合物于37°C溫育1-4小時(shí)，并以2 μ 1的0. 5M EDTA終止。使用前 通過于95°C溫育5分鐘將探針變性。由乙烯處理和未處理的數(shù)對煙草品系的新鮮葉制備RNA樣品。在一些情況下使用 富含聚A+的RNA。用DEPC H2O (5-10 μ 1)將大約15 μ g總RNA或1. 8 μ g mRNA (如實(shí)施例 5中所述的RNA和mRNA抽提方法)達(dá)到等同體積。加入相同體積的加樣緩沖液(lx M0PS； 18. 5% 甲醛；50% 甲酰胺；4% Ficoll400 ；溴酚藍(lán))和 0. 5μ 1 EtBr (0. 5 μ g/μ 1)。隨后將 樣品在制備中變性用來通過電泳分離RNA。用IX MOP緩沖液(0. 4Μ嗎啉代丙烷磺酸；0. IM醋酸鈉_3 χΗ20 ；IOmM EDTA ；用 NaOH調(diào)節(jié)至ρΗ 7.2)將樣品在甲醛凝膠(1 %瓊脂糖，lxMOPS，0. 6Μ甲醛)上進(jìn)行電泳。通 過毛細(xì)管法在10X SSC緩沖液(1. 5MNaCl ；0. 15M檸檬酸鈉)中將RNA轉(zhuǎn)移到Hybond-N+膜 上(Nylon，Amersham Pharmacia Biotech) 24小時(shí)。在雜交前將具有RNA樣品的膜進(jìn)行UV ^Wi (自云力$__:K，254nm，Stratagene, Stratal inker) 將膜在42°C與5-10ml預(yù)雜交緩沖液(5x SSC ；50%甲酰胺；5xDenhardt' s_溶 液；SDS ； 100 μ g/ml熱變性剪切的非同源性DNA)預(yù)雜交1_4小時(shí)。棄去舊的預(yù)雜交緩 沖液，加入新的預(yù)雜交緩沖液和探針。于42°C過夜進(jìn)行雜交。用2x SSC于室溫洗滌膜達(dá) 15分鐘，隨后用2x SSC洗滌。在獲自轉(zhuǎn)化體和非轉(zhuǎn)化體白萊煙品系的煙草屬組織上利用全長克隆進(jìn)行RNA印 跡分析，所述轉(zhuǎn)化體和非轉(zhuǎn)化體白萊煙品系都通過乙烯處理進(jìn)行誘導(dǎo)。目的是鑒定那些相 對于乙烯誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化體品系相對于乙烯誘導(dǎo)的非轉(zhuǎn)化體白萊煙品系在乙烯誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化體 品系中顯示表達(dá)升高的全長克隆。通過這樣做，全長克隆的功能性關(guān)系可以通過比較轉(zhuǎn)化 體和非轉(zhuǎn)化體品系之間葉組分的生化差異進(jìn)行確定。實(shí)施例8由克隆的基因編碼的p450s的免疫檢測由三個(gè)p450克隆選擇對應(yīng)于20-22個(gè)氨基酸長的肽區(qū)，其1)與其它克隆具有較 低的或沒有同源性和2)具有良好的親水性和抗原性。下面列出選自各個(gè)P450克隆的肽區(qū) 的氨基酸序列。將合成的肽與KHL綴合并隨后注射入兔體內(nèi)。第4次注射后2和4周收集抗血清(Alpha Diagnostic Intl. Inc. San Antonio, TX)。D234-AD1 DIDGSKSKLVKAHRKIDEILG(SEQ ID NO 8)D90a-BB3 RDAFREKETFDENDVEELNY(SEQ ID NO 9)D89-AB1 FKNNGDEDRHFSQKL⑶LADKY(SEQ ID NO 10)通過蛋白質(zhì)印跡分析對抗血清檢查與來自煙草植物組織的目標(biāo)蛋白的交叉反應(yīng) 性。粗制蛋白提取物獲自乙烯處理的(0-40小時(shí))轉(zhuǎn)化體和非轉(zhuǎn)化體品系的中葉。根據(jù)生 產(chǎn)商的方案使用RC DC蛋白質(zhì)測定試劑盒(BIO-RAD)測定提取物的蛋白質(zhì)濃度。將兩毫克蛋白質(zhì)加載到每個(gè)泳道上并利用Laemmli SDS-PAGE系統(tǒng)在10% -20% 的梯度凝膠上分離蛋白質(zhì)。用Trans-Blot Semi-Dry細(xì)胞(BIO-RAD)將蛋白質(zhì)由凝膠轉(zhuǎn) 移到 I3ROTRAN 硝化纖維素轉(zhuǎn)移膜(Schleicher&Schuell)上。用 ECL Advance Western Blotting檢測試劑盒(Amersham Biosciences)檢測并顯現(xiàn)目標(biāo)p450蛋白。在兔體內(nèi)制備 抗合成性KLH綴合物的一抗。與過氧化物酶偶聯(lián)的抗兔IgG的二抗購自Sigma。一抗和二 抗都以1 1000稀釋使用?？贵w顯示對于蛋白質(zhì)印跡上單一條帶的強(qiáng)烈反應(yīng)性，提示抗血 清對于目標(biāo)靶肽是單特異性的。抗血清還與綴合到KLH上的合成肽具有交叉反應(yīng)性。實(shí)施例9結(jié)合RNA印跡分析對超過100個(gè)克隆的p450片段進(jìn)行測序以確定它們的結(jié)構(gòu)關(guān) 系。該方法使用基于位于P450基因羧基末端附近的兩個(gè)共同p450基序中任一個(gè)的正向引 物。所述正向引物對應(yīng)于細(xì)胞色素P450基序FXPERF(SEQ ID NO 11)或GRRXCP(A/G) (SEQ ID N0:12)。反向引物使用來自質(zhì)粒的標(biāo)準(zhǔn)引物，位于pGEM質(zhì)粒兩臂上的SP6或T7，或者 來自聚腺苷酸尾巴的標(biāo)準(zhǔn)引物。下面描述所用的方法。根據(jù)生產(chǎn)商的方案(Beckman Coulter)利用分光光度法評估起始雙鏈DNA的濃 度。將模板用水稀釋到合適的濃度，通過于95°C加熱2分鐘進(jìn)行變性，隨后置于冰上。利 用 0.5-10 μ 1 的變性 DNA 模板，2 μ 1 的 1. 6pmol 的正向引物，8 μ 1 的 DTCS Quick Start Master Mix在冰上制備測序反應(yīng)物，并用水使總體積達(dá)到20 μ 1。熱循環(huán)程序由30個(gè)循環(huán) 的下列循環(huán)組成96°C 20秒，500C 20秒，和60°C 4分鐘，隨后保持于4°C。通過加入5 μ 1的終止緩沖液(等體積的3Μ NaOAc和IOOmM EDTA和1 μ 1的20mg/ ml糖原)終止測序反應(yīng)。用60 μ 1的冷95%乙醇沉淀樣品并于6000xg離心6分鐘。棄去 乙醇。用200 μ 1的冷70%乙醇洗滌沉淀物兩次。在沉淀干燥后，加入40 μ 1的SLS溶液并 重懸沉淀。覆蓋一層礦物油。隨后將樣品置于CEQ 8000自動(dòng)測序儀上作進(jìn)一步分析。為了確證核酸序列，使用ρ450 基因的 FXPERF (SEQ ID NO 11)或GRRXCP (A/G) (SEQ ID Ν0 12)區(qū)的正向引物或質(zhì)粒或聚腺苷酸尾巴的反向引物在兩個(gè)方向上對核酸序列進(jìn)行 重新測序。所有的測序都在兩個(gè)方向上至少進(jìn)行兩次。將細(xì)胞色素p450片段的核酸序列彼此相比較，從對應(yīng)于編碼GRRXCP(A/G) (SEQ ID NO 12)基序區(qū)之后的第一個(gè)核酸的編碼區(qū)一直到終止密碼子。將此區(qū)選作P450蛋白之間 遺傳多樣性的指征。在70個(gè)過量基因中，觀察到大量遺傳上不同的P450基因，類似于其它 植物物種的情況。在比較核酸序列之后，發(fā)現(xiàn)基于它們的序列同一性可以將基因插入不同 的序列組。發(fā)現(xiàn)P450成員的最佳獨(dú)特組被確定為具有75%或更大核酸同一性的那些序列。 (見例如，US 2004/0162420專利申請出版物中的表1，將其并入本文作為參考)。減少百分比同一性導(dǎo)致明顯更大的組。觀察到優(yōu)選的組為具有81%或更大核酸同一性的那些序列， 更加優(yōu)選的組為具有91%或更大核酸同一性，和最優(yōu)選的組為具有99%或更大核酸同一 性的那些序列。大多數(shù)組包含至少兩個(gè)成員并經(jīng)常包含三個(gè)或更多的成員。未反復(fù)發(fā)現(xiàn)其 它的，提示所采用的方法能夠在所用的組織中分離低和高表達(dá)的mRNA。利用基因芯片技術(shù)鑒定在轉(zhuǎn)化體對非轉(zhuǎn)化體煙草品系中差異表達(dá)的基因，測定 D121-AA8具有在乙烯處理的轉(zhuǎn)化體品系中的可復(fù)制的誘導(dǎo)?；谶@些結(jié)果，D121-AA8基因 (其cDNA序列是SEQ ID NO 3的序列；圖3)被鑒定為煙草煙堿脫甲基酶目標(biāo)基因?？紤]到p450命名規(guī)則，煙草煙堿脫甲基酶基因是新的并屬于CYP82E類 (The Arabidopsis Genome Initiative (AGI) and The Arabidopsis Information Resource (TAIR) ；Frank, Plant Physiol. 110 :1035—1046，1996 ；Whitbred et al. ， Plant Physiol. 124 :47_58，2000) ；Schopfer 和 Ebel, Mol.Gen.Genet. 258 :315_322，1998 ；和 Takemoto 等，Plant Cell Physiol. 40 :1232-1242，1999)。實(shí)施例10煙草煙堿脫甲基酶的?；治錾治?，例如，如并入本文作為參考的先前提交的申請中所述，確定了 SEQ ID NO 3的序列編碼煙草煙堿脫甲基酶(SEQ ID NO :4 ；圖3)。特別地，通過如下測定酵母細(xì)胞中異源表達(dá)的p450的酶活性，確定候選克隆 (D121-AA8)的功能為煙堿脫甲基酶的編碼基因。1.酵母表達(dá)載體的構(gòu)建將煙草煙堿脫甲基酶編碼cDNA(D121_AA8)的推定蛋白質(zhì)編碼序列克隆入酵母表 達(dá)載體pYeDP60。通過包含這些序列的PCR引物在翻譯起始密碼子(ATG)的上游或終止密 碼子(TAA)的下游導(dǎo)入合適的BamHI和MfeI位點(diǎn)(下面下劃線的)。擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物上的 Mfel與載體上的EcoRI位點(diǎn)相容。用來擴(kuò)增cDNA的引物是5' -TAGCTACGCGGATCCATGCTT TCTCCCATAGAAGCC-3‘ (SEQ IDN0:27)和5' -CTGGATCACAATTGTTAGTGATGGTGATGGTGATGCG ATCCTCTATAAAGCTCAGGTGCCAGGC-3 ‘ (SEQ ID NO :28)。將編碼蛋白質(zhì) C 末端九個(gè)額外氨基 酸，包括六個(gè)組氨酸的序列片段，并入反向引物中以利于誘導(dǎo)后6-His標(biāo)記的p450的表達(dá)。 酶消化后在參照GAL10-CYC1啟動(dòng)子的有義方向上將PCR產(chǎn)物連接入pYeDP60載體中。通 過限制性酶切分析和DNA測序確認(rèn)酵母表達(dá)載體的正確構(gòu)建。2.酵母轉(zhuǎn)化將改進(jìn)來表達(dá)擬南芥NADPH-細(xì)胞色素p450還原酶ATRl的WATll酵母品系用 pYeDP60-p450cDNA質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)化。將50微升的WATll酵母細(xì)胞混懸液與 1 μ g質(zhì)粒DNA 在具有0. 2cm電極隙的比色杯中混合。Eppendorf電穿孔儀(Model 2510)應(yīng)用2. OkV的 脈沖。將細(xì)胞鋪到SGI板上(5g/L bactocasamino acids，6. 7g/L無氨基酸的酵母氮堿 (nitrogen base)，20g/L葡萄糖，40mg/L DL-色氨酸，20g/L瓊脂)。通過直接在隨機(jī)選擇 的集落上進(jìn)行的PCR分析確認(rèn)轉(zhuǎn)化體。3.在轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞中的p450表達(dá)利用單一酵母菌落接種30mL SGI 培養(yǎng)基(5g/L bactocasamino acids，6. 7g/L 無 氨基酸的酵母氮堿，20g/L葡萄糖，40mg/L DL-色氨酸)并于30°C生長大約24小時(shí)。將等 分試樣的這種培養(yǎng)物以1 50稀釋到IOOOmL的YPGE培養(yǎng)基中(10g/L酵母提取物，20g/L細(xì)菌培養(yǎng)用蛋白胨，5g/L葡萄糖，30ml/L乙醇)并培養(yǎng)直到葡萄糖被完全耗盡，如通過 Diastix尿分析試劑條(Bayer，Elkhart, IN)的比色變化所示。通過加入DL-半乳糖到終 濃度2%來起始克隆P450的誘導(dǎo)。在使用前將培養(yǎng)物再培養(yǎng)20小時(shí)進(jìn)行體內(nèi)活性測定或 進(jìn)行微粒體制備。使用表達(dá)pYeDP60_CYP71D20(催化煙草中 5_印i-aristolochene 和 1-deoxycapsidiol的羥基化作用的p450)的WATll酵母細(xì)胞作為p450表達(dá)和酶活性測定 的對照。為了更加詳細(xì)地評估p450的酵母表達(dá)的有效性，進(jìn)行簡化的CO差異光譜分析。 簡化的CO光譜在450nm上顯現(xiàn)來自所有四種P450轉(zhuǎn)化的酵母品系的蛋白質(zhì)的峰。在對 照酵母或載體對照酵母的微粒體中沒有觀察到類似的峰。所述結(jié)果顯示P450蛋白在具有 pYeDP60-CYP 450的酵母品系中得以有效表達(dá)。酵母微粒體中表達(dá)的p450蛋白的濃度為從 45 到 68nmole/mg 總蛋白。4.體內(nèi)酶測定通過對酵母培養(yǎng)物飼以DL-煙堿(吡咯烷-2-14C)來測定轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞中煙堿脫 甲基酶的活性。將14C標(biāo)記的煙堿(54mCi/mmol)加入到75 μ 1的半乳糖誘導(dǎo)的培養(yǎng)物中達(dá) 到最終濃度55 μ Μ。在14ml聚丙烯試管中以搖動(dòng)將測定培養(yǎng)物溫育6小時(shí)，并以900 μ 1甲 醇進(jìn)行抽提。離心后，以rp-HPLC分離20 μ 1的甲醇提取物并通過LSC對去甲煙堿級(jí)分進(jìn) 行量化。WAT11 (pYeDP60-CYP71D20)的對照培養(yǎng)物并未將煙堿轉(zhuǎn)變成去甲煙堿，顯示 WATl 1酵母株并不包含能夠催化煙堿生物轉(zhuǎn)化成去甲煙堿的步驟的內(nèi)源酶活性。相反，表達(dá) 煙草煙堿脫甲基酶基因的酵母生產(chǎn)出可檢測量的去甲煙堿，顯示SEQ ID NO :3翻譯產(chǎn)物的 煙堿脫甲基酶活性。5.酵母微粒體制備半乳糖誘導(dǎo)20小時(shí)后，通過離心收集酵母細(xì)胞并用TES-M緩沖液(50mM Tris-HCl,pH 7. 5, ImM EDTA，0. 6M山梨糖醇，IOmM 2-巰基乙醇)洗滌兩次。將沉淀物重懸 于抽提緩沖液中(50mM Tris-HCl, pH 7. 5，ImMEDTA，0. 6M山梨糖醇，2mM 2-巰基乙醇，
牛血清白蛋白，1片/50ml的蛋白酶抑制劑混合物(Roche))。隨后用玻璃珠(直徑0. 5mm, Sigma)破裂細(xì)胞并將細(xì)胞提取物以20，OOOxg離心20min以除去細(xì)胞碎片。將上清液于 100, OOOxg進(jìn)行超速離心60min，得到的沉淀物包含微粒體級(jí)分。將所述微粒體級(jí)分以Img/ HiL的蛋白質(zhì)濃度懸浮于TEG-M緩沖液中(50mM Tris-HCl, pH 7. 5, ImM EDTA，20%甘油和 1.5mM 2-巰基乙醇)。將微粒體制備物保存于液氮冷凍庫中待用。6.酵母微粒體制備物中的酶活性測定用酵母微粒體制備物進(jìn)行煙堿脫甲基酶活性的測定。特別地，DL-煙堿(吡咯 烷-2-14C)獲自Moravek Biochemicals并具有54mCi/mmol的特異性活性。氯丙嗪(CPZ)和 氧化的細(xì)胞色素C(cyt. C)，二者都是P450抑制劑，購自Sigma。還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷 酸磷酸(NADPH)是細(xì)胞色素P450通過NADPH 細(xì)胞色素P450還原酶的典型電子供體。在對 照溫育中不存在NADPH。常規(guī)酶測定包括微粒體蛋白(約lmg/ml)，6mM NADPHjP55yM 14C 標(biāo)記的煙堿。在使用時(shí)，CPZ和Cyt. C的濃度分別為ImM和100 μ Μ。反應(yīng)在25°C進(jìn)行1小 時(shí)并通過加入300 μ 1甲醇到每個(gè)25 μ 1反應(yīng)混合物中進(jìn)行終止。離心后，使用來自Varian的Inertsil 0DS-33 μ (150x4. 6mm)色譜柱以反相高效液相色譜(HPLC)系統(tǒng)(Agilent)分 離20 μ 1的甲醇提取物。恒溶劑(isocratic)流動(dòng)相是甲醇和50mM磷酸鉀緩沖液，pH 6. 25 的混合物，比率是60 40 (ν/ν)并且流速是lml/min。收集去甲煙堿峰并以2900tri-carb 液體閃爍計(jì)數(shù)器(LSC) (Perkin Elmer)進(jìn)行量化，所述去甲煙堿峰是通過與真實(shí)可信的未 標(biāo)記去甲煙堿相比較而確定的。在1小時(shí)溫育后基于14C標(biāo)記的去甲煙堿的產(chǎn)生來計(jì)算煙 堿脫甲基酶的活性。來自表達(dá)CYP71D20的對照酵母細(xì)胞的微粒體制備物并不具有任何可檢測的微粒 體煙堿脫甲基酶活性。相反，獲自表達(dá)煙草煙堿脫甲基酶基因的酵母細(xì)胞的微粒體樣品顯 示顯著水平的煙堿脫甲基酶活性。煙堿脫甲基酶活性需要NADPH并顯示被p450特異性抑 制劑所抑制，這與作為P450的煙草煙堿脫甲基酶相一致。如由放射性強(qiáng)度和蛋白質(zhì)濃度所 計(jì)算的，煙草煙堿脫甲基酶(D121-AA8)的酶活性大約為10.8pkat/mg蛋白質(zhì)。對于酵母細(xì) 胞所獲得的一組典型酶測定結(jié)果顯示于表1中。表1 在表達(dá)D121-AA8和對照P450的酵母細(xì)胞的微粒體中的脫甲基酶活性
樣品微粒體微粒體+ImM微粒體+ΙΟΟμΜ微 粒 體氯丙。秦細(xì)刀&色素C-NADPHD121-AA810.8 土 1.2*1.4±1.3 pkat/mg2.4±0.7 pkat/mg0.4±0.1 pkat/mgpkat/mg蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)對照未檢測到未檢測到未檢測到未檢測到(CYP71D20)次重復(fù)的平均結(jié)果這些實(shí)驗(yàn)在一起證明克隆的全長煙草煙堿脫甲基酶(SEQ ID NO 3 ；D121-AA8)編 碼細(xì)胞色素P450蛋白，當(dāng)在酵母中表達(dá)時(shí)其催化煙堿向去甲煙堿的轉(zhuǎn)化。實(shí)施例11分離的核酸片段的相關(guān)氨基酸序列同一件推斷由實(shí)施例8獲得的細(xì)胞色素p450片段的核酸序列的氨基酸序列。推斷區(qū)對應(yīng) 于緊接GXRXCP (A/G) (SEQ ID NO 13)序列基序之后的氨基酸到羧基末端的結(jié)尾，或終止密 碼子。在比較片段的序列同一性之后，觀察到具有70%或更大氨基酸同一性的那些序列的 獨(dú)特組。觀察到優(yōu)選的組為具有80%或更大氨基酸同一性的那些序列，更加優(yōu)選的組為具 有90%或更大氨基酸同一性，和最優(yōu)選的組為具有99%或更大氨基酸同一性的那些序列。 發(fā)現(xiàn)幾個(gè)獨(dú)特的核酸序列與其它片段具有完全的氨基酸同一性，所以只報(bào)道了具有相同氨 基酸的一個(gè)成員。對于使用植物的基因克隆和功能性研究選擇了每個(gè)氨基酸同一性組的至少一個(gè) 成員。此外，對于基因克隆和功能性研究選擇了組成員，所述成員通過如RNA和DNA分析評 估，受乙烯處理或其它生物學(xué)差異的不同影響。為了有助于基因克隆，表達(dá)研究和整體植物 評估，可以基于序列同一性和不同序列制備肽特異性抗體。實(shí)施例12
對實(shí)施例5中克隆的全長煙草屬基因的核酸序列推斷它們完整的氨基酸序列。通 過三個(gè)保守的P450結(jié)構(gòu)域基序的存在鑒定細(xì)胞色素p450基因，所述三個(gè)保守的p450結(jié)構(gòu) 域基序?qū)?yīng)于羧基末端上的 UXXRXXZ (SEQ ID NO 14) ,PXRFXF (SEQ ID NO 15)或 GXRXC (SEQ ID NO 16)，其中U是E或K，X是任何氨基酸，Z是P，T，S或M。利用BLAST程序?qū)⑺鼈兊?全長序列彼此和與已知的煙草基因相比較來對所有的P450基因氨基酸同一性進(jìn)行表征。 所述程序使用NCBI特別的BLAST工具(比對兩種序列(bl2seq)，http://www. ncbi. nlm. nih. Rov/blast/bl2sea/bl2. html)。在沒有對于核酸序列的濾器的BLASTN和對于氨基酸 序列的BLASTP之下比對兩種序列。基于它們的百分比氨基酸同一性，將每種序列歸類到同 一性組中，其中所述組包含與另一成員共有至少85%同一性的成員。觀察到優(yōu)選的組為具 有90%或更大氨基酸同一性的那些序列，更加優(yōu)選的組為具有95%或更大氨基酸同一性， 和最優(yōu)選的組為具有99%或更大氨基酸同一性的那些序列。推斷全長煙堿脫甲基酶基因的 氨基酸序列具有SEQ ID NO 4中提供的序列(圖3)。實(shí)施例13缺乏一種或多種'煙草P450 m^n^mMm^mmm^m P45o克降四個(gè)克隆具有高度核酸同源性，范圍從90%到99%的核酸同源性。不過，由于核 苷酸移碼，這些基因并不包含三個(gè)C-末端細(xì)胞色素p450結(jié)構(gòu)域的其中一個(gè)或多個(gè)并且被 排除在同一性組之外。實(shí)施例14煙草屬細(xì)胞餼素P450片段和克隆在煙草質(zhì)量的變化調(diào)控中的應(yīng)用煙草p450核酸片段或完整基因的應(yīng)用在鑒定和選擇那些具有變化的煙草表型或 煙草組分，更重要的是，變化的代謝物的植物中是有用的。通過多種轉(zhuǎn)化系統(tǒng)生成轉(zhuǎn)基因煙 草植物，所述轉(zhuǎn)化系統(tǒng)在下調(diào)方向，例如反義方向，或過量表達(dá)例如有義方向上等結(jié)合了選 自本文所報(bào)告的那些的核酸片段或全長基因。對于全長基因的過量表達(dá)，任何編碼本發(fā)明 中所述全長基因的完整或功能性部分或氨基酸序列的核酸序列都是有利的。這些核酸序列 理想地對于提高某種酶的表達(dá)是有效的并且因此導(dǎo)致煙草屬內(nèi)的表型效應(yīng)。通過一系列回 交獲得純合的煙草屬品系并評估表型變化，包括但不限于，利用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員常規(guī) 可獲得的技術(shù)進(jìn)行內(nèi)源性P450 RNA，轉(zhuǎn)錄物，p450表達(dá)肽和植物代謝物濃度的分析。煙草 植物中呈現(xiàn)的變化提供了對于目標(biāo)選定基因的功能性作用信息或者用作優(yōu)選煙草屬植物 物種的信息。實(shí)施例15來自轉(zhuǎn)^本白■煙H的基因組‘煙H'煙堿脫,甲基酶的克降如以上實(shí)施例中所述(還見生產(chǎn)商的方法)利用Qiagen Plant Easy試劑盒由轉(zhuǎn) 化體白萊煙煙草植物品系4407-33 (煙草品種4407品系)提取基因組DNA?；谠谇皩?shí)施例中克隆的5'啟動(dòng)子和3' UTR區(qū)設(shè)計(jì)引物。正向引物為5' -GGC TCT AGA TAA ATC TCT TAA GTT ACT AGG TTC TAA-3 ‘ (SEQ ID NO: 17)和 5' -TCT CTA AAG TCC CCT TCC-3 ‘ (SEQ ID NO 25)而反向引物為 5' -GGC TCT AGA AGT CAA TTA TCT TCT ACA AAC CTT TATATA TTA GC—3' (SEQ ID N0:18)，和 5' -CCA GCA TTC CTC AAT TTC-3' (SEQ ID NO :26)。用100 μ 1反應(yīng)混合物將PCR應(yīng)用于4407-33基因組DNA。使用Pfx高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在電泳后將PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行觀察。觀察到 分子量大約為3. 5kb的單一條帶并從凝膠上將其切下。利用凝膠純化試劑盒(Qiagen ；基于 生產(chǎn)商的方法)純化得到的條帶。通過酶Xba KNEB ；根據(jù)生產(chǎn)商的說明書使用)消化純化 的DNA。利用相同方法通過Xba I消化pBluescript質(zhì)粒。將片段進(jìn)行凝膠純化并連接入 pBluescript質(zhì)粒中。將連接混合物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞GM109中并接種到包含100mg/l氨 芐青霉素的LB平板上，伴隨以藍(lán)/白篩選。挑取白色菌落并培養(yǎng)在包含氨芐青霉素的IOml LB液體培養(yǎng)基中。通過小量制備提取DNA。利用CEQ 2000測序儀(Beckman，F(xiàn)ullerton, California)基于生產(chǎn)商的方法對包含插入片段的質(zhì)粒DNA進(jìn)行測序。使用T3和T7引物 以及8種其它內(nèi)部引物進(jìn)行測序。對序列進(jìn)行組合和分析，由此提供基因組序列(SEQ ID NO :1 ；圖 2-1 到 2-3)。將SEQ ID NO :1的序列與SEQ ID NO :3的序列相比較能夠確定基因編碼部分內(nèi)的 單一內(nèi)含子(鑒定為SEQ ID NO 5的序列；圖4)。如
圖1中所示，煙草煙堿脫甲基酶的基 因組結(jié)構(gòu)包括在單一內(nèi)含子側(cè)面的兩個(gè)外顯子。第一個(gè)外顯子跨越SEQ ID NO :1的核苷酸 2010-2949，其編碼SEQ IDNO :2的氨基酸1-313，第二個(gè)外顯子跨越SEQ ID NO :1的核苷酸 3947-4562，其編碼SEQ ID NO :2的氨基酸314-517。因此，所述內(nèi)含子跨越SEQ ID NO 1 的核苷酸2950-3946。內(nèi)含子序列提供在圖4中并且是SEQ ID NO :5的序列。基因組DNA 序列的翻譯產(chǎn)物作為SEQ ID NO 2的序列提供在圖2-1中。煙草煙堿脫甲基酶氨基酸序列 包含內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜錨定基序。實(shí)施例16由轉(zhuǎn)化體煙草克降5'側(cè)翼序列(SEO ID NO 6)禾口 3' UTR(SEQ ID NO 7)A.來自轉(zhuǎn)化體煙草葉組織的總DNA的分離從轉(zhuǎn)化體煙草4407-33的葉中分離基因組DNA。根據(jù)生產(chǎn)商的方案使用來自 Qiagen, Inc. (Valencia, Ca)公司的 DNeasy Plant Mini 試劑盒進(jìn)行 DNA 的分離。在此將 生產(chǎn)商的手冊 Dneasy ‘ Plant Mini and DNeasy Plant Maxi Handbook, Qiagen January 2004并入作為參考。DNA制備方法包括下列步驟在液氮下，將煙草葉組織(大約20mg干 重)研磨成精細(xì)粉末，進(jìn)行1分鐘。將組織粉末轉(zhuǎn)移入1. 5ml管中。將緩沖液APl (400 μ 1) 禾口 4μ 1的RNA酶貯存溶液(100mg/ml)加入到最大IOOmg的研磨葉組織中并進(jìn)行劇烈渦 旋。將混合物于65°C溫育IOmin并在溫育期間通過倒轉(zhuǎn)試管將其混合2-3次。隨后將緩 沖液ΑΡ2(130μ1)加入到裂解物中。將混合物混合并在冰上溫育5min。將裂解物應(yīng)用到 QIAshredder Mini離心柱上并離心2min (14，OOOrpm)。將流過物級(jí)分轉(zhuǎn)移到新的管中，不 擾動(dòng)細(xì)胞碎片沉淀。隨后將緩沖液AP3/E(1.5體積)加入到澄清的裂解物中并通過抽吸進(jìn) 行混合。將來自在前步驟的包括任何沉淀物的混合物(650 μ 1)應(yīng)用到DNeasy Mini離心 柱上。將混合物于> 6000xg( > SOOOrpm)離心Imin并棄去流過物。用剩余樣品對此進(jìn)行 重復(fù)并棄去流過物和收集管。將DNeasy Mini離心柱置于新的2ml收集管中。隨后將緩沖 液AW(500 μ 1)加入到DNeasy柱上并離心Imin ( > 8000rpm)。棄去流過物。在接下來的 步驟中重新使用該收集管。隨后將緩沖液AW(500 μ 1)加到DNeasy柱上并離心2min(> 14, OOOrpm)以便干燥膜。將DNeasy柱轉(zhuǎn)移到1. 5ml管中。隨后將緩沖液AE (100 μ 1)吸取 到DNeasy膜上。將混合物于室溫(15_25°C )溫育5min并隨后離心Imin( > 8000rpm)來 洗脫。
通過在瓊脂糖凝膠上將樣品進(jìn)行電泳來評估DNA的質(zhì)與量。1結(jié)構(gòu)基因5'側(cè)翼序列的克隆使用改進(jìn)的反向PCR方法克隆來自SEQ ID NO=I的結(jié)構(gòu)基因的5，側(cè)翼序列的750 個(gè)核苷酸。首先，基于已知序列片段中的限制性位點(diǎn)和5’側(cè)翼序列下游的限制性位點(diǎn)間距 來選擇合適的限制性酶?；谶@種已知的片段設(shè)計(jì)兩條引物。正向引物位于反向引物的下 游。反向引物位于已知片段的3’部分?？寺》椒òㄏ铝胁襟E用20-40個(gè)單位的合適的限制性酶(EcoRI和SpeI)在50 μ 1反應(yīng)混合物中消化 純化的基因組DNA (5 μ g)。用1/10體積的反應(yīng)混合物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳以確定DNA是否 消化完全。在完全消化后通過于4°C過夜連接進(jìn)行直接連接。將200μ1包含10μ1消化 DNA和0. 2μ1 T4DNA連接酶(NEB)的反應(yīng)混合物于4°C過夜連接。在獲得人工小環(huán)狀基因 組之后進(jìn)行連接反應(yīng)物的PCR。用10 μ 1連接反應(yīng)物和來自已知片段的2條引物在兩個(gè)不 同方向上于50 μ 1反應(yīng)混合物中進(jìn)行PCR。應(yīng)用梯度PCR程序，退火溫度為45-56°C。進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳以檢查PCR反應(yīng)。從凝膠上切下的所需的條帶并使用來自 QIAGEN的QIAquick凝膠純化試劑盒來純化所述條帶。按照生產(chǎn)商的說明書將純化的PCR 片段連接入pGEM-T Easy載體(Promega，Madison, WI)中。按照生產(chǎn)商的說明書利用SV 小量制備試劑盒(Promega，Madison, WI)通過小量制備來抽提轉(zhuǎn)化的DNA質(zhì)粒。利用CEQ 2000測序儀(Beckman，F(xiàn)ullerton，CA)對包含插入片段的質(zhì)粒DNA進(jìn)行測序。通過上述方 法克隆大約758nt的5，側(cè)翼序列(SEQ ID NO=I的核苷酸1241-2009)。C^結(jié)構(gòu)基因的較長5'側(cè)翼序列(SEQ ID NO :6 ；圖5)的克隆根據(jù)生產(chǎn)商的用戶手冊，使用BD基因組步移(genome walker)通用試劑盒 (Clontech laboratories, Inc.，PaloAlto, CA)來克隆結(jié)構(gòu)基因，D121-AA8 另外的 5'側(cè) 翼序列。在此將生產(chǎn)商的手冊BD Genomeffalker August，2004并入作為參考。通過將樣品 在0. 5%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳來測試煙草基因組DNA的大小和純度。對煙草33文庫基 因組步移構(gòu)建設(shè)立總共4次平端反應(yīng)(DRA I，STU I，ECOR V，PVU II)。在被消化DNAs的 純化之后，將消化的基因組DNAs連接到基因組步移接頭上。通過利用接頭引物APl和來 自 D121-AA8 的基因特異性引物(CTCTATTGATACTAGCTGGTTTTGGAC ；SEQ ID NO 19)對四種 消化的DNAs進(jìn)行初步PCR反應(yīng)。將初步PCR產(chǎn)物直接用作模板進(jìn)行嵌套PCR。在PCR反 應(yīng)中使用試劑盒提供的接頭嵌套引物和來自已知克隆D121-AA8 (SEQ ID NO :3)的嵌套引物 (GGAGGGAGAGTATAACTTACGGATTC ； SEQ ID NO :20)。通過進(jìn)行凝膠電泳檢測 PCR 產(chǎn)物。從凝 膠上切下所需的條帶，利用來自QIAGEN的QIAquick凝膠純化試劑盒純化PCR片段。根據(jù) 生產(chǎn)商的說明書將純化的PCR片段連接入pGEM-T Easy載體(Promega，Madison, WI)中。 利用SV小量制備試劑盒(Promega，Madison，WI)并按照生產(chǎn)商的說明書通過小量制備抽提 轉(zhuǎn)化的DNA質(zhì)粒。利用CEQ 2000測序儀(Beckman，F(xiàn)ullerton，CA)對包含插入片段的質(zhì)粒 DNA進(jìn)行測序。通過上述方法克隆另一種大約853nt的5，側(cè)翼序列，包括SEQ ID NO :1的 核苷酸399-1240。按照相同的方法進(jìn)行第二輪的基因組步移，其中不同在于使用下列引物GWRlA(5 ‘-AGTAACCGATTGCTCACGTTATCCTC-3‘ )(SEQ ID NO :21)和GWR2A(5' -CTCTATTCAACCCCAC ACGTAACTG-3' ) (SEQ ID NO :22)。通過該方法克隆另外的約398nt的側(cè)翼序列，包括SEQID NO 1的核苷酸1-398。對調(diào)節(jié)元件的搜索揭示，除了“TATA”盒，“CAAT”盒，和“GAGA”盒之外，數(shù)種MYB-樣 識(shí)別位點(diǎn)和器官特異性元件存在于煙草煙堿脫甲基酶啟動(dòng)子區(qū)。使用相同的方法鑒定的推 定導(dǎo)出(elicitor)反應(yīng)性元件和氮調(diào)節(jié)的元件也出現(xiàn)在啟動(dòng)子區(qū)中。1結(jié)構(gòu)基因的3'側(cè)翼序列的克隆按照生產(chǎn)商的使用手冊，將BD基因組步移通用試劑盒(Clontech laboratories, Inc.，PaloAlto，CA)用于克隆結(jié)構(gòu)基因D121-AA8的3'側(cè)翼序列?？寺〉姆椒ㄅc本實(shí)施例 前述部分C所述相同，除了所用的基因特異性引物之外。設(shè)計(jì)的第一條引物接近D121-AA8 結(jié)構(gòu)基因的末端(5' -CTA AAC TCT GGT CTG ATC CTG ATA CTT-3‘ ) (SEQ ID NO :23)。 進(jìn)一步設(shè)計(jì)的嵌套引物在D121-AA8結(jié)構(gòu)基因的引物1的下游(CTA TAC GTA AGG TAA ATC CTG TGG AAC) (SEQ ID NO :24)。通過凝膠電泳來檢查最終PCR產(chǎn)物。從凝膠上切除需要的 帶。使用來自QIAGEN的QIAquick凝膠純化試劑盒來純化PCR片段。按照生產(chǎn)商的說明書， 將純化的PCR片段連接到pGEM-T Easy載體(Promega，Madison，WI)中。按照生產(chǎn)商的說 明書，使用SV小量制備試劑盒(Promega，Madison, WI)通過小量制備來提取轉(zhuǎn)化的DNA質(zhì) 粒。使用CEQ 2000測序儀(Beckman，F(xiàn)ullerton，CA)來對包含插入片段的質(zhì)粒DNA進(jìn)行 測序。通過上述方法來克隆約1617個(gè)核苷酸的另外的3'側(cè)翼序列(SEQIDN0:1的核苷酸 4731-6347)。將3' UTR區(qū)的核酸序列顯示于圖6中。WO 03/078577， WO 2004/035745， PCT/US/2004/034218,和 PCT/US/2004/034065 和所有本文參考的其它參考文獻(xiàn)、專利、專利申請出版物、和專利申請結(jié)合入本文作為參 考，其程度如同這些參考文獻(xiàn)、專利、專利申請出版物和專利申請的每一個(gè)被單獨(dú)并入本文 作為參考。預(yù)期本領(lǐng)域那些技術(shù)人員在考慮本發(fā)明的前述詳細(xì)的描述后，在本發(fā)明的實(shí)踐上 作出各種修改和改進(jìn)。因此，意欲將這些修改和改進(jìn)包括在下列權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
一種分離的核酸，包括與SEQ ID NO1的核苷酸序列具有至少91％序列同一性的核苷酸序列。
2.權(quán)利要求1的核酸，其中所述核苷酸序列與SEQID NO 1的核苷酸2010-2949或 3947-4562具有100%序列同一性。
3.權(quán)利要求1的核酸，其中所述核酸包含編碼多肽的核苷酸序列，所述多肽與由SEQ ID NO 2編碼的多肽具有99%或更大的氨基酸序列同一性。
4.權(quán)利要求1的核酸，其中所述核苷酸序列與SEQID NO 1的核苷酸序列具有100% 同一性。
5.一種分離的核酸，包含核苷酸序列，所述核苷酸序列在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO 1 的核苷酸序列雜交，其中所述嚴(yán)謹(jǐn)條件包括在42°C在6xSSC中的開始的洗滌，隨后在65°C 進(jìn)行一次或者多次另外的洗滌。
6.一種表達(dá)載體，包含核酸，其與SEQ ID NO :1具有至少91%的序列同一性，所述載體 能夠引導(dǎo)所述核酸的表達(dá)。
7.權(quán)利要求6的表達(dá)載體，其中所述核酸與SEQID NO 1具有100%的同一性。
8.—種用植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的煙草植物，所述表達(dá)載體包含與SEQ ID NO :1的核苷酸 2010-2949或3947-4562具有至少91 %序列同一性的核酸，并編碼多肽，所述多肽包含與由 SEQ ID NO :1編碼的多肽的氨基酸序列具有99%或更大序列同一性的氨基酸序列，其中所 述核酸在所述植物中表達(dá)，且所述植物具有減少的從煙堿到去甲煙堿的轉(zhuǎn)化。
9.權(quán)利要求8的煙草植物，其中所述植物是煙草(Nicotianatabacum)植物。
10.權(quán)利要求8的煙草植物，其中所述核酸包含與SEQID NO :1的核苷酸序列具有至 少91 %同一性的核苷酸序列。
11.一種由權(quán)利要求8的煙草植物產(chǎn)生的種子，所述種子包含所述表達(dá)載體。
12.—種來自轉(zhuǎn)基因煙草植物的煙草葉片，其包含載體，所述載體包含與SEQ ID NO 1 的25個(gè)或更多連續(xù)核苷酸具有至少91%序列同一性的核苷酸序列。
13.權(quán)利要求12的煙草葉片，所述核苷酸序列具有與SEQID NO=I的100個(gè)或更多連 續(xù)核苷酸具有至少91%序列同一性。
14.權(quán)利要求13的煙草葉片，所述核苷酸序列具有與SEQID NO=I的250個(gè)或更多連 續(xù)核苷酸具有至少91%序列同一性。
15.權(quán)利要求14的煙草葉片，所述核苷酸序列具有與SEQID NO=I的500個(gè)或更多連 續(xù)核苷酸具有至少91%序列同一性。
16.權(quán)利要求12的煙草葉片，所述核苷酸序列具有與SEQID NO :1的核苷酸3947-4562 的50個(gè)或更多連續(xù)核苷酸具有至少91%序列同一性。
17.權(quán)利要求16的煙草葉片，所述核苷酸序列具有與SEQID NO :1的核苷酸3947-4562 的50個(gè)或更多連續(xù)核苷酸具有100%序列同一性。
18.權(quán)利要求16的煙草葉片，所述核苷酸序列具有與SEQID NO :1的核苷酸3947-4562 的100個(gè)或更多連續(xù)核苷酸具有91%序列同一性。
19.權(quán)利要求18的煙草葉片，所述核苷酸序列具有與SEQID NO :1的核苷酸3947-4562 的100個(gè)或更多連續(xù)核苷酸具有100%序列同一性。
20.權(quán)利要求19的煙草葉片，所述核苷酸序列具有與SEQID NO :1的核苷酸3947-4562的250個(gè)或更多連續(xù)核苷酸具有100%序列同一性。
21.權(quán)利要求12的煙草葉片，所述核苷酸序列具有與SEQID NO :1的核苷酸2010-2949 的50個(gè)或更多連續(xù)核苷酸具有91%序列同一性。
22.權(quán)利要求21的煙草葉片，所述核苷酸序列具有與SEQID NO :1的核苷酸2010-2949 的50個(gè)或更多連續(xù)核苷酸具有100%序列同一性。
23.權(quán)利要求21的煙草葉片，所述核苷酸序列具有與SEQID NO :1的核苷酸2010-2949 的100個(gè)或更多連續(xù)核苷酸具有91%序列同一性。
24.權(quán)利要求23的煙草葉片，所述核苷酸序列具有與SEQID NO :1的核苷酸2010-2949 的100個(gè)或更多連續(xù)核苷酸具有100%序列同一性。
25.權(quán)利要求24的煙草葉片，所述核苷酸序列具有與SEQID NO :1的核苷酸2010-2949 的250個(gè)或更多連續(xù)核苷酸具有100%序列同一性。
26.權(quán)利要求12的煙草葉片，其中所述葉片是加工處理過的(cured)葉片。
27.—種加工處理過的煙草植物組分，其來自包含載體的轉(zhuǎn)基因煙草植物，所述載體包 含與SEQ ID NO :1的25個(gè)或更多連續(xù)核苷酸具有至少91%序列同一性的核苷酸序列，所 述加工處理過的煙草植物組分在相對于從野生型非轉(zhuǎn)化型煙草植物獲得的相應(yīng)加工處理 過的煙草植物成分中的水平具有減少水平的去甲煙堿或N’ -亞硝基去甲煙堿。
28.權(quán)利要求27的加工處理過的煙草植物成分，其中所述加工處理過的煙草植物成分 是煙草葉片。
29.權(quán)利要求28的加工處理過的煙草植物成分，其中所述加工處理過的煙草植物成分 相對于在從野生型非轉(zhuǎn)化型煙草植物獲得的加工處理過的煙草植物成分中的水平具有減 少水平的去甲煙堿。
30.權(quán)利要求28的加工處理過的煙草植物成分，其中所述加工處理過的煙草植物成分 來自深色煙草(dark tobacco)、白萊煙(Bur ley tobacco)、煙熏煙(flue-cured tobacco)、 if-feH^jfl (air-cured tobacco)(oriental tobacco)。
31.一種包含權(quán)利要求28的加工處理過的煙草植物成分的煙草產(chǎn)品。
32.權(quán)利要求31的煙草產(chǎn)品，其中所述煙草產(chǎn)品是無煙煙草。
33.權(quán)利要求32的煙草產(chǎn)品，其中所述煙草產(chǎn)品是濕或干鼻煙。
34.權(quán)利要求32的煙草產(chǎn)品，其中所述煙草產(chǎn)品是嚼煙。
35.權(quán)利要求31的煙草產(chǎn)品，其中所述煙草產(chǎn)品是卷煙。
36.權(quán)利要求31的煙草產(chǎn)品，其中所述煙草產(chǎn)品是雪茄煙或小雪茄煙。
全文摘要
本發(fā)明的特征是煙草煙堿脫甲基酶核酸和氨基酸序列，包含這樣的序列的煙草植物和植物組分，其包括具有煙堿脫甲基酶的減少的表達(dá)或改變的酶活性的煙草植物和植物組分，使用煙堿脫甲基酶序列來產(chǎn)生與對照植物相比，具有改變水平的去甲煙堿或N′-亞硝基去甲煙堿(″NNN″)或兩者的植物的方法，以及具有減少水平的去甲煙堿或NNN的煙草制品。
文檔編號(hào)A01H5/10GK101979583SQ20101052966
公開日2011年2月23日 申請日期2005年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月29日
發(fā)明者許冬梅 申請人:美國無煙煙草公司