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發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明針對用于鑒定會受益于VEGF拮抗劑(例如抗VEGF抗體)治療的具有成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的患者的方法。

發(fā)明背景

膠質(zhì)瘤占所有惡性腦和CNS腫瘤的81％。特別地，成膠質(zhì)細(xì)胞瘤(多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤(GBM)；世界衛(wèi)生組織(WHO)IV級星形細(xì)胞瘤)占惡性膠質(zhì)瘤的60％至70％，而且仍然是膠質(zhì)瘤中最具攻擊性的亞型。它大多在成人中發(fā)生(診斷時的中值年齡：64歲)，而且它在美國的發(fā)病率估算是3.05/100,000。鑒于1年和5年總體存活分別為29％和3％，成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的預(yù)后仍然是特別差的(美國中樞腦腫瘤登記(2005)(CBTRUS；http://www.cbtrus.org))。

測量生物標(biāo)志物的表達(dá)水平可能是鑒定會響應(yīng)特定療法(包括例如VEGF拮抗劑(諸如抗VEGF抗體)治療)的具有成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的患者的一種有效手段。

需要確定哪些具有成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的患者會響應(yīng)哪種治療的有效手段，而且需要將此類確定并入VEGF拮抗劑療法(無論作為單一藥劑或是與其它藥劑組合使用)對患者的有效治療方案。

發(fā)明概述

本發(fā)明提供用于鑒定會很可能響應(yīng)VEGF拮抗劑(例如抗VEGF抗體，例如貝伐珠單抗)治療的具有成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的患者的方法。這些患者是基于至少一種(例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，或27)下述基因的表達(dá)水平而鑒定的：AKT3，CDH1，CYP27B1，DNM3，DYNLL1，ERBB3，KLRK1，MBP，MDM2，NCAM1，PDGFRA，PRKCZ，SNCA，TNFRSF21，AXL，BCL2L1，CD36，ETS1，ICAM2，IL17A，IRS2，PDGFRB，RPL13A，TGFB1，TNFRSF4，TNFSF4，和ZBTB16。

在第一個方面，本發(fā)明提供確定具有成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的患者是否很可能響應(yīng)VEGF拮抗劑治療的方法，該方法包括：(a)檢測對患者施用VEGF拮抗劑之前自患者獲得的生物學(xué)樣品中至少一種基因(例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，或27種基因)的表達(dá)，其中該至少一種基因選自下組：AKT3，CDH1，CYP27B1，DNM3，DYNLL1，ERBB3，KLRK1，MBP，MDM2，NCAM1，PDGFRA，PRKCZ，SNCA，TNFRSF21，AXL，BCL2L1，CD36，ETS1，ICAM2，IL17A，IRS2，PDGFRB，RPL13A，TGFB1，TNFRSF4，TNFSF4，和ZBTB16；(b)將該至少一種基因的表達(dá)水平(例如均值表達(dá)水平)與該至少一種基因的參照表達(dá)水平比較，其中(i)患者樣品中AKT3，CDH1，CYP27B1，DNM3，DYNLL1，ERBB3，KLRK1，MBP，MDM2，NCAM1，PDGFRA，PRKCZ，SNCA，和/或TNFRSF21的表達(dá)水平相對于參照水平的升高和/或(ii)患者樣品中AXL，BCL2L1，CD36，ETS1，ICAM2，IL17A，IRS2，PDGFRB，RPL13A，TGFB1，TNFRSF4，TNFSF4，和/或ZBTB16的表達(dá)水平相對于參照水平的降低鑒定出很可能響應(yīng)VEGF拮抗劑治療的患者；并(c)告知該患者他們具有升高的可能性對VEGF拮抗劑治療是響應(yīng)性的。

在第二個方面，本發(fā)明還提供為具有成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的患者優(yōu)化抗癌療法的功效的方法，該方法包括：(a)檢測對患者施用VEGF拮抗劑之前自患者獲得的生物學(xué)樣品中至少一種基因(例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，或27種基因)的表達(dá)，其中該至少一種基因選自下組：AKT3，CDH1，CYP27B1，DNM3，DYNLL1，ERBB3，KLRK1，MBP，MDM2，NCAM1，PDGFRA，PRKCZ，SNCA，TNFRSF21，AXL，BCL2L1，CD36，ETS1，ICAM2，IL17A，IRS2，PDGFRB，RPL13A，TGFB1，TNFRSF4，TNFSF4，和ZBTB16；(b)將該至少一種基因的表達(dá)水平(例如均值表達(dá)水平)與該至少一種基因的參照表達(dá)水平比較，其中(i)患者樣品中AKT3，CDH1，CYP27B1，DNM3，DYNLL1，ERBB3，KLRK1，MBP，MDM2，NCAM1，PDGFRA，PRKCZ，SNCA，和/或TNFRSF21的表達(dá)水平相對于參照水平的升高和/或(ii)患者樣品中AXL，BCL2L1，CD36，ETS1，ICAM2，IL17A，IRS2，PDGFRB，RPL13A，TGFB1，TNFRSF4，TNFSF4，和/或ZBTB16的表達(dá)水平相對于參照水平的降低鑒定出很可能響應(yīng)VEGF拮抗劑治療的患者；并(c)對該患者提供抗癌療法包括VEGF拮抗劑的推薦。

在第三個方面，本發(fā)明包括為具有成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的患者選擇療法的方法，該方法包括：(a)檢測對患者施用VEGF拮抗劑之前自患者獲得的生物學(xué)樣品中至少一種基因(例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，或27種基因)的表達(dá)，其中該至少一種基因選自下組：AKT3，CDH1，CYP27B1，DNM3，DYNLL1，ERBB3，KLRK1，MBP，MDM2，NCAM1，PDGFRA，PRKCZ，SNCA，TNFRSF21，AXL，BCL2L1，CD36，ETS1，ICAM2，IL17A，IRS2，PDGFRB，RPL13A，TGFB1，TNFRSF4，TNFSF4，和ZBTB16；(b)將該至少一種基因的表達(dá)水平(例如均值表達(dá)水平)與該至少一種基因的參照表達(dá)水平比較，其中(i)患者樣品中AKT3，CDH1，CYP27B1，DNM3，DYNLL1，ERBB3，KLRK1，MBP，MDM2，NCAM1，PDGFRA，PRKCZ，SNCA，和/或TNFRSF21的表達(dá)水平相對于參照水平的升高和/或(ii)患者樣品中AXL，BCL2L1，CD36，ETS1，ICAM2，IL17A，IRS2，PDGFRB，RPL13A，TGFB1，TNFRSF4，TNFSF4，和/或ZBTB16的表達(dá)水平相對于參照水平的降低鑒定出很可能響應(yīng)VEGF拮抗劑治療的患者；并(c)如果患者鑒定為很可能響應(yīng)VEGF拮抗劑治療的話，選擇包括VEGF拮抗劑的療法，并任選地對該患者推薦選擇的包括VEGF拮抗劑的療法。

在上文所述方法中，該患者可以在具有成膠質(zhì)細(xì)胞瘤且正在測試對VEGF拮抗劑的響應(yīng)性的患者群體中且該參照水平可以是該患者群體中該至少一種基因(例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，或27種基因)的中值表達(dá)水平。在這些方法的其它實施方案中，該參照水平可以是具有成膠質(zhì)細(xì)胞瘤且鑒定為不響應(yīng)VEGF拮抗劑治療的患者中該至少一種基因(例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，或27種基因)的中值表達(dá)水平。

自患者獲得的生物學(xué)樣品中至少一種基因(例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，或27種基因)的表達(dá)可以通過測量例如mRNA水平和/或血漿蛋白質(zhì)水平來檢測。在一些實施方案中，至少一種基因的表達(dá)水平可以是該至少一種基因的均值(平均)表達(dá)水平。在其它實施方案中，至少一種基因的表達(dá)水平可以是該至少一種基因的中值表達(dá)水平。

該生物學(xué)樣品可以是例如腫瘤組織，諸如腫瘤組織活檢或血漿樣品。

本發(fā)明的這些方法可以進(jìn)一步包括檢測來自患者的生物學(xué)樣品中至少兩種，三種，四種，或更多種基因的表達(dá)。在一些實施方案中，本發(fā)明的方法可以包括檢測來自患者的生物學(xué)樣品中至少13種所述基因的表達(dá)。例如，在一些實施方案中，本發(fā)明的方法可以包括檢測來自患者的生物學(xué)樣品中AXL，BCL2L1，CD36，ETS1，ICAM2，IL17A，IRS2，PDGFRB，RPL13A，TGFB1，TNFRSF4，TNFSF4，和ZBTB16的表達(dá)。在一些實施方案中，本發(fā)明的方法可以包括檢測來自患者的生物學(xué)樣品中至少14種基因的表達(dá)。例如，在一些實施方案中，本發(fā)明的方法可以包括檢測來自患者的生物學(xué)樣品中AKT3，CDH1，CYP27B1，DNM3，DYNLL1，ERBB3，KLRK1，MBP，MDM2，NCAM1，PDGFRA，PRKCZ，SNCA，和TNFRSF21的表達(dá)。在其它實施方案中，本發(fā)明的方法可以包括檢測來自患者的生物學(xué)樣品中所有27種基因的表達(dá)。在還有其它實施方案中，該方法包括在來自患者的生物學(xué)樣品中檢測所有27種基因的表達(dá)并進(jìn)一步檢測至少一種，兩種，三種，四種，或更多種不同基因的表達(dá)。

在上文所述方法中，該VEGF拮抗劑可以是抗VEGF抗體。該抗VEGF抗體可以是例如結(jié)合A4.6.1表位的抗VEGF抗體，貝伐珠單抗，或包含可變重鏈(VH)和可變輕鏈(VL)的抗VEGF抗體，其中所述VH具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列且所述VL具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列。

上文所述方法可以進(jìn)一步包括對該患者施用VEGF拮抗劑的步驟。施用的VEGF拮抗劑可以是抗VEGF抗體，例如結(jié)合A4.6.1表位的抗VEGF抗體，貝伐珠單抗，或包含可變重鏈(VH)和可變輕鏈(VL)的抗VEGF抗體，其中所述VH具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列且所述VL具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列。

上文所述方法可以進(jìn)一步包括對該患者施用：(i)選自抗腫瘤劑，化療劑，生長抑制劑，和細(xì)胞毒劑的藥劑，(ii)放療，或(iii)其組合。在一些實施方案中，施用的化療劑是替莫唑胺(TMZ)。

在上文所述方法中，對VEGF拮抗劑治療的響應(yīng)性可以是例如總體存活(OS)的延長或增長。在一些實施方案中，對VEGF拮抗劑治療的響應(yīng)性可以是例如無進(jìn)展存活(PFS)的延長或增長。

在任何上文所述方法中，可使用檢測選自AXL，BCL2L1，CD36，ETS1，ICAM2，IL17A，IRS2，PDGFRB，RPL13A，TGFB1，TNFRSF4，TNFSF4，和ZBTB16的至少一種基因(例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，或13種基因)的表達(dá)來鑒定很可能響應(yīng)VEGF拮抗劑治療的具有非前神經(jīng)型的成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的患者。在一些實施方案中，患者樣品中AXL，BCL2L1，CD36，ETS1，ICAM2，IL17A，IRS2，PDGFRB，RPL13A，TGFB1，TNFRSF4，TNFSF4，和/或ZBTB16的表達(dá)水平相對于參照水平的降低鑒定出很可能響應(yīng)VEGF拮抗劑(諸如抗VEGF抗體，例如貝伐珠單抗)治療的具有非前神經(jīng)型的成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的患者。

在第四個方面，本發(fā)明特征在于確定具有成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的患者是否很可能響應(yīng)VEGF拮抗劑治療的方法，該方法包括：(a)檢測對患者施用VEGF拮抗劑之前自患者獲得的生物學(xué)樣品中至少一種基因(例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，或27種基因)的表達(dá)，其中該至少一種基因選自下組：AKT3，CDH1，CYP27B1，DNM3，DYNLL1，ERBB3，KLRK1，MBP，MDM2，NCAM1，PDGFRA，PRKCZ，SNCA，TNFRSF21，AXL，BCL2L1，CD36，ETS1，ICAM2，IL17A，IRS2，PDGFRB，RPL13A，TGFB1，TNFRSF4，TNFSF4，和ZBTB16；(b)將該至少一種基因的表達(dá)水平(例如均值表達(dá)水平)與該至少一種基因的參照表達(dá)水平比較，其中(i)患者樣品中AKT3，CDH1，CYP27B1，DNM3，DYNLL1，ERBB3，KLRK1，MBP，MDM2，NCAM1，PDGFRA，PRKCZ，SNCA，和/或TNFRSF21的表達(dá)水平相對于參照水平的升高和/或(ii)患者樣品中AXL，BCL2L1，CD36，ETS1，ICAM2，IL17A，IRS2，PDGFRB，RPL13A，TGFB1，TNFRSF4，TNFSF4，和/或ZBTB16的表達(dá)水平相對于參照水平的降低鑒定出很可能響應(yīng)VEGF拮抗劑治療的患者。在一些實施方案中，第四個方面的方法可進(jìn)一步包括告知該患者他們具有升高的可能性對VEGF拮抗劑治療是響應(yīng)性的。

在第五個方面，本發(fā)明特征在于為具有成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的患者優(yōu)化抗癌療法的治療功效的方法，該方法包括：(a)檢測對患者施用VEGF拮抗劑之前自患者獲得的生物學(xué)樣品中至少一種基因(例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，或27種基因)的表達(dá)，其中該至少一種基因選自下組：AKT3，CDH1，CYP27B1，DNM3，DYNLL1，ERBB3，KLRK1，MBP，MDM2，NCAM1，PDGFRA，PRKCZ，SNCA，TNFRSF21，AXL，BCL2L1，CD36，ETS1，ICAM2，IL17A，IRS2，PDGFRB，RPL13A，TGFB1，TNFRSF4，TNFSF4，和ZBTB16；(b)將該至少一種基因的表達(dá)水平(例如均值表達(dá)水平)與該至少一種基因的參照表達(dá)水平比較，其中(i)患者樣品中AKT3，CDH1，CYP27B1，DNM3，DYNLL1，ERBB3，KLRK1，MBP，MDM2，NCAM1，PDGFRA，PRKCZ，SNCA，和/或TNFRSF21的表達(dá)水平相對于參照水平的升高和/或(ii)患者樣品中AXL，BCL2L1，CD36，ETS1，ICAM2，IL17A，IRS2，PDGFRB，RPL13A，TGFB1，TNFRSF4，TNFSF4，和/或ZBTB16的表達(dá)水平相對于參照水平的降低鑒定出很可能響應(yīng)VEGF拮抗劑治療的患者。在一些實施方案中，第五個方面的方法可進(jìn)一步包括對該患者提供抗癌療法包括VEGF拮抗劑的推薦。

在第六個方面，本發(fā)明特征在于為具有成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的患者選擇療法的方法，該方法包括：(a)檢測對患者施用VEGF拮抗劑之前自患者獲得的生物學(xué)樣品中至少一種基因(例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，或27種基因)的表達(dá)，其中該至少一種基因選自下組：AKT3，CDH1，CYP27B1，DNM3，DYNLL1，ERBB3，KLRK1，MBP，MDM2，NCAM1，PDGFRA，PRKCZ，SNCA，TNFRSF21，AXL，BCL2L1，CD36，ETS1，ICAM2，IL17A，IRS2，PDGFRB，RPL13A，TGFB1，TNFRSF4，TNFSF4，和ZBTB16；(b)將該至少一種基因的表達(dá)水平(例如均值表達(dá)水平)與該至少一種基因的參照表達(dá)水平比較，其中(i)患者樣品中的AKT3，CDH1，CYP27B1，DNM3，DYNLL1，ERBB3，KLRK1，MBP，MDM2，NCAM1，PDGFRA，PRKCZ，SNCA，和/或TNFRSF21的表達(dá)水平相對于參照水平升高和/或(ii)患者樣品中AXL，BCL2L1，CD36，ETS1，ICAM2，IL17A，IRS2，PDGFRB，RPL13A，TGFB1，TNFRSF4，TNFSF4，和/或ZBTB16的表達(dá)水平相對于參照水平的降低鑒定出很可能響應(yīng)VEGF拮抗劑治療的患者。在一些實施方案中，第六個方面的方法可進(jìn)一步包括對該患者提供抗癌療法包括VEGF拮抗劑的推薦。

在第四個，第五個，和第六個方面的任何方法中，該患者可以在具有成膠質(zhì)細(xì)胞瘤且正在測試對VEGF拮抗劑的響應(yīng)性的患者群體中且該參照水平可以是該患者群體中該至少一種基因(例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，或27種基因)的中值表達(dá)水平。在這些方法的其它實施方案中，該參照水平可以是具有成膠質(zhì)細(xì)胞瘤且鑒定為不響應(yīng)VEGF拮抗劑治療的患者中該至少一種基因(例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，或27種基因)的中值表達(dá)水平。

自患者獲得的生物學(xué)樣品中至少一種基因(例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，或27種基因)的表達(dá)可以通過測量例如mRNA水平和/或血漿蛋白質(zhì)水平來檢測。在一些實施方案中，至少一種基因的表達(dá)水平可以是該至少一種基因的均值(平均)表達(dá)水平。在其它實施方案中，至少一種基因的表達(dá)水平可以是該至少一種基因的中值表達(dá)水平。

該生物學(xué)樣品可以是例如腫瘤組織，諸如腫瘤組織活檢或血漿樣品。

本發(fā)明的這些方法可以進(jìn)一步包括檢測來自患者的生物學(xué)樣品中至少兩種，三種，四種，或更多種基因的表達(dá)。在一些實施方案中，本發(fā)明的方法可以包括檢測來自患者的生物學(xué)樣品中至少13種所述基因的表達(dá)。例如，在一些實施方案中，本發(fā)明的方法可以包括檢測來自患者的生物學(xué)樣品中AXL，BCL2L1，CD36，ETS1，ICAM2，IL17A，IRS2，PDGFRB，RPL13A，TGFB1，TNFRSF4，TNFSF4，和ZBTB16的表達(dá)。在一些實施方案中，本發(fā)明的方法可以包括檢測來自患者的生物學(xué)樣品中至少14種基因的表達(dá)。例如，在一些實施方案中，本發(fā)明的方法可以包括檢測來自患者的生物學(xué)樣品中AKT3，CDH1，CYP27B1，DNM3，DYNLL1，ERBB3，KLRK1，MBP，MDM2，NCAM1，PDGFRA，PRKCZ，SNCA，和TNFRSF21的表達(dá)。在其它實施方案中，本發(fā)明的方法可以包括檢測來自患者的生物學(xué)樣品中所有27種基因的表達(dá)。在還有其它實施方案中，該方法包括在來自患者的生物學(xué)樣品中檢測所有27種基因的表達(dá)并進(jìn)一步檢測至少一種，兩種，三種，四種，或更多種不同基因的表達(dá)。

在第四個，第五個，和第六個方面的任何方法中，該VEGF拮抗劑可以是抗VEGF抗體。該抗VEGF抗體可以是例如結(jié)合A4.6.1表位的抗VEGF抗體，貝伐珠單抗，或包含可變重鏈(VH)和可變輕鏈(VL)的抗VEGF抗體，其中所述VH具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列且所述VL具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列。

上文所述方法可以進(jìn)一步包括對該患者施用VEGF拮抗劑的步驟。施用的VEGF拮抗劑可以是抗VEGF抗體，例如結(jié)合A4.6.1表位的抗VEGF抗體，貝伐珠單抗，或包含可變重鏈(VH)和可變輕鏈(VL)的抗VEGF抗體，其中所述VH具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列且所述VL具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列。

上文所述方法可以進(jìn)一步包括對該患者施用：(i)選自抗腫瘤劑，化療劑，生長抑制劑，和細(xì)胞毒劑的藥劑，(ii)放療，或(iii)其組合。在一些實施方案中，施用的化療劑是替莫唑胺(TMZ)。

在上文所述方法中，對VEGF拮抗劑治療的響應(yīng)性可以是例如總體存活(OS)的延長或增長。在一些實施方案中，對VEGF拮抗劑治療的響應(yīng)性可以是例如無進(jìn)展存活(PFS)的延長或增長。

在任何上文所述方法中，可使用檢測選自AXL，BCL2L1，CD36，ETS1，ICAM2，IL17A，IRS2，PDGFRB，RPL13A，TGFB1，TNFRSF4，TNFSF4，和ZBTB16的至少一種基因(例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，或13種基因)的表達(dá)來鑒定很可能響應(yīng)VEGF拮抗劑治療的具有非前神經(jīng)型的成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的患者。在一些實施方案中，患者樣品中AXL，BCL2L1，CD36，ETS1，ICAM2，IL17A，IRS2，PDGFRB，RPL13A，TGFB1，TNFRSF4，TNFSF4，和/或ZBTB16的表達(dá)水平相對于參照水平的降低鑒定出很可能響應(yīng)VEGF拮抗劑(諸如抗VEGF抗體，例如貝伐珠單抗)治療的具有非前神經(jīng)型的成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的患者。

在第七個方面，本發(fā)明特征在于治療具有成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的患者的方法，該方法包括對該患者施用VEGF拮抗劑，其中該患者已經(jīng)預(yù)先測定為具有至少一種基因(例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，或27種基因)的表達(dá)水平相對于該至少一種基因的參照表達(dá)水平的變化，該至少一種基因選自下組：AKT3，CDH1，CYP27B1，DNM3，DYNLL1，ERBB3，KLRK1，MBP，MDM2，NCAM1，PDGFRA，PRKCZ，SNCA，TNFRSF21，AXL，BCL2L1，CD36，ETS1，ICAM2，IL17A，IRS2，PDGFRB，RPL13A，TGFB1，TNFRSF4，TNFSF4，和ZBTB16。

在第八個方面，本發(fā)明特征在于為具有成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的患者優(yōu)化抗癌療法的治療功效的方法，其中該患者已經(jīng)預(yù)先測定為具有至少一種基因(例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，或27種基因)的表達(dá)水平相對于該至少一種基因的參照表達(dá)水平的變化，其中該至少一種基因選自下組：AKT3，CDH1，CYP27B1，DNM3，DYNLL1，ERBB3，KLRK1，MBP，MDM2，NCAM1，PDGFRA，PRKCZ，SNCA，TNFRSF21，AXL，BCL2L1，CD36，ETS1，ICAM2，IL17A，IRS2，PDGFRB，RPL13A，TGFB1，TNFRSF4，TNFSF4，和ZBTB16，且該方法包括基于預(yù)先測定的至少一種基因的表達(dá)水平的變化對該患者提供抗癌療法包括VEGF拮抗劑的推薦。

在第九個方面，本發(fā)明特征在于為具有成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的患者選擇療法的方法，其中該患者已經(jīng)預(yù)先測定為具有至少一種基因(例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，或27種基因)的表達(dá)水平相對于該至少一種基因的參照表達(dá)水平的變化，其中該至少一種基因選自下組：AKT3，CDH1，CYP27B1，DNM3，DYNLL1，ERBB3，KLRK1，MBP，MDM2，NCAM1，PDGFRA，PRKCZ，SNCA，TNFRSF21，AXL，BCL2L1，CD36，ETS1，ICAM2，IL17A，IRS2，PDGFRB，RPL13A，TGFB1，TNFRSF4，TNFSF4，和ZBTB16，且該方法包括基于預(yù)先測定的至少一種基因的表達(dá)水平的變化選擇包含VEGF拮抗劑的療法并對該患者推薦選擇的包含VEGF拮抗劑的療法。

在第七個，第八個，和第九個方面的任何方法中，該變化可以是至少一種基因的表達(dá)水平相對于參照水平的升高，且該至少一種基因可以是AKT3，CDH1，CYP27B1，DNM3，DYNLL1，ERBB3，KLRK1，MBP，MDM2，NCAM1，PDGFRA，PRKCZ，SNCA，和/或TNFRSF21。在一些實施方案中，該方法進(jìn)一步包括基于AKT3，CDH1，CYP27B1，DNM3，DYNLL1，ERBB3，KLRK1，MBP，MDM2，NCAM1，PDGFRA，PRKCZ，SNCA，和/或TNFRSF21的表達(dá)水平的升高施用VEGF拮抗劑。

在第七個，第八個，和第九個方面的任何方法中，該變化可以是至少一種基因的表達(dá)水平相對于參照水平的降低，且該至少一種基因可以是AXL，BCL2L1，CD36，ETS1，ICAM2，IL17A，IRS2，PDGFRB，RPL13A，TGFB1，TNFRSF4，TNFSF4，和/或ZBTB16。在一些實施方案中，該方法進(jìn)一步包括基于AXL，BCL2L1，CD36，ETS1，ICAM2，IL17A，IRS2，PDGFRB，RPL13A，TGFB1，TNFRSF4，TNFSF4，和/或ZBTB16的表達(dá)水平的降低施用VEGF拮抗劑。

在第七個，第八個，和第九個方面的任何方法中，該患者可以在具有成膠質(zhì)細(xì)胞瘤且正在測試對VEGF拮抗劑的響應(yīng)性的患者群體中且該參照水平是該患者群體中該至少一種基因的中值表達(dá)水平。

在第七個，第八個，和第九個方面的任何方法中，該參照水平可以是具有成膠質(zhì)細(xì)胞瘤且鑒定為不響應(yīng)VEGF拮抗劑治療的患者中該至少一種基因的中值表達(dá)水平。

在第七個，第八個，和第九個方面的任何方法中，該方法可以進(jìn)一步包括對該患者施用VEGF拮抗劑，其可以是抗VEGF抗體，例如貝伐珠單抗，結(jié)合A4.6.1表位的抗VEGF抗體，或包含可變重鏈(VH)和可變輕鏈(VL)的抗VEGF抗體，其中所述VH具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列且所述VL具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列。

在第七個，第八個，和第九個方面的任何方法中，該方法可以進(jìn)一步包括對該患者施用：(i)選自抗腫瘤劑，化療劑，生長抑制劑，和細(xì)胞毒劑的藥劑，(ii)放療，或(iii)其組合。在一些實施方案中，施用的化療劑，諸如替莫唑胺(TMZ)。

在第七個，第八個，和第九個方面的任何方法中，該患者可以具有非前神經(jīng)型的成膠質(zhì)細(xì)胞瘤。

在第十個方面，本發(fā)明特征在于用于確定患者是否可受益于VEGF拮抗劑治療的試劑盒，該試劑盒包含：(a)能夠測定至少一種基因(例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，或27種基因)的表達(dá)水平(例如均值表達(dá)水平)的多肽或多核苷酸，其中該至少一種基因選自下組：AKT3，CDH1，CYP27B1，DNM3，DYNLL1，ERBB3，KLRK1，MBP，MDM2，NCAM1，PDGFRA，PRKCZ，SNCA，TNFRSF21，AXL，BCL2L1，CD36，ETS1，ICAM2，IL17A，IRS2，PDGFRB，RPL13A，TGFB1，TNFRSF4，TNFSF4，和ZBTB16；和(b)使用該多肽或多核苷酸測定至少一種基因的表達(dá)水平的說明書，其中該至少一種基因選自下組：AKT3，CDH1，CYP27B1，DNM3，DYNLL1，ERBB3，KLRK1，MBP，MDM2，NCAM1，PDGFRA，PRKCZ，SNCA，TNFRSF21，AXL，BCL2L1，CD36，ETS1，ICAM2，IL17A，IRS2，PDGFRB，RPL13A，TGFB1，TNFRSF4，TNFSF4，和/或ZBTB16，其中該至少一種基因的表達(dá)水平相對于參照水平的變化指示患者可受益于VEGF拮抗劑治療。

附圖簡述

圖1是顯示來自AvaGlio試驗的339份野生型IDH1樣品間193種免疫相關(guān)基因(行)的Nanostring數(shù)據(jù)的熱圖。基因(行)是依照共有聚簇的結(jié)果排序的，而樣品(列)是通過Phillips GBM亞型排序的(Cancer Cell.9(3):157-73,2006)。

圖2是顯示來自AvaGlio的339份野生型IDH1樣品間15個基因簇(行)中每一種的平均表達(dá)的熱圖。樣品(列)是通過Phillips亞型標(biāo)簽排序的，而行是以它們的簇編號的次序顯示的。

圖3是顯示自包括已知預(yù)后共變量和與處理分支相互作用的每一種簇的平均基因表達(dá)的多變量CoxPH模型獲得的p值的圖。柱的高度顯示相互作用項(即，基因表達(dá)對于貝伐珠單抗處理對總體存活(OS)的預(yù)測價值)的p值。虛線指示0.05的原始p值。

圖4是顯示依照Phillips et al.,Cancer Cell.9(3):157-73,2006定義的GBM亞型間簇2的基因表達(dá)(z得分)的分布的箱線圖。

圖5是一張表，顯示了當(dāng)使用臨床共變量和簇2的平均基因表達(dá)作為預(yù)報器將多變量CoxPH模型擬合至完全生物標(biāo)志物可得AvaGlio群體的OS時簇2的平均基因表達(dá)顯著地既是預(yù)后性的又是預(yù)測性的。*指示p值≤0.05；**指示p值≤0.01；而***指示p值≤0.001。

圖6是一張表，顯示了當(dāng)使用臨床共變量和簇2的平均基因表達(dá)作為預(yù)報器將多變量CoxPH模型擬合至AvaGlio群體中的僅前神經(jīng)GBM患者(如通過Phillips分類的)的OS時簇2的平均基因表達(dá)既不是預(yù)后性的也不是預(yù)測性的。*指示p值≤0.05；**指示p值≤0.01；而***指示p值≤0.001。

圖7是一張表，顯示了當(dāng)使用臨床共變量和簇2的平均基因表達(dá)作為預(yù)報器將多變量CoxPH模型擬合至AvaGlio群體中的僅增殖性GBM患者(如通過Phillips分類的)的OS時簇2的平均基因表達(dá)是預(yù)后性的但不是預(yù)測性的。*指示p值≤0.05；**指示p值≤0.01；而***指示p值≤0.001。

圖8是一張表，顯示了當(dāng)使用臨床共變量和簇2的平均基因表達(dá)作為預(yù)報器將多變量CoxPH模型擬合至AvaGlio群體中的僅間充質(zhì)GBM患者(如通過Phillips分類的)的OS時簇2的平均基因表達(dá)既不是預(yù)后性的也不是預(yù)測性的。*指示p值≤0.05；**指示p值≤0.01；而***指示p值≤0.001。

圖9是一張表，顯示了當(dāng)使用臨床共變量和簇2的平均基因表達(dá)作為預(yù)報器將多變量CoxPH模型擬合至AvaGlio群體中的非前神經(jīng)GBM患者(如通過Phillips分類的)的OS時簇2的平均基因表達(dá)既不是預(yù)后性的也不是預(yù)測性的。*指示p值≤0.05；**指示p值≤0.01；而***指示p值≤0.001。

圖10A是顯示AvaGlio試驗的安慰劑處理分支中簇2“生物標(biāo)志物高”(帶有三角形標(biāo)記的線)和“生物標(biāo)志物低”(帶有正方形標(biāo)記的線)患者的OS的Kaplan Meier曲線的圖。對于簇2基因的二元化表達(dá)，AvaGlio中值以上的患者認(rèn)為是“生物標(biāo)志物高”，而AvaGlio中值以下的患者認(rèn)為是“生物標(biāo)志物低”。p值是自單變量CoxPH模型獲得的，沒有并入別的臨床共變量，因為它們無法并入Kaplan-Meier圖。p值＝0.01。

圖10B是顯示AvaGlio試驗的貝伐珠單抗處理分支中簇2“生物標(biāo)志物高”(帶有三角形標(biāo)記的線)和“生物標(biāo)志物低”(帶有正方形標(biāo)記的線)患者的OS的Kaplan Meier曲線的圖。對于簇2基因的二元化表達(dá)，AvaGlio中值以上的患者認(rèn)為是“生物標(biāo)志物高”，而AvaGlio中值以下的患者認(rèn)為是“生物標(biāo)志物低”。p值是自單變量CoxPH模型獲得的，沒有并入別的臨床共變量，因為它們無法并入Kaplan-Meier圖。p值＝0.887。

圖10C是顯示AvaGlio試驗的安慰劑處理分支(虛線)和貝伐珠單抗處理分支(實線)中簇2“生物標(biāo)志物低”患者的OS的Kaplan Meier曲線的圖。對于簇2基因的二元化表達(dá)，AvaGlio中值以上的患者認(rèn)為是“生物標(biāo)志物高”，而AvaGlio中值以下的患者認(rèn)為是“生物標(biāo)志物低”。p值是自單變量CoxPH模型獲得的，沒有并入別的臨床共變量，因為它們無法并入Kaplan-Meier圖。p值＝0.621。

圖10D是顯示AvaGlio試驗的安慰劑處理分支(虛線)和貝伐珠單抗處理分支(實線)中簇2“生物標(biāo)志物高”患者OS的Kaplan Meier曲線的圖。對于簇2基因的二元化表達(dá)，AvaGlio中值以上的患者認(rèn)為是“生物標(biāo)志物高”，而AvaGlio中值以下的患者認(rèn)為是“生物標(biāo)志物低”。p值是自單變量CoxPH模型獲得的，沒有并入別的臨床共變量，因為它們無法并入Kaplan-Meier圖。p值＝0.038。

圖11是顯示依照Phillips et al.,Cancer Cell.9(3):157-73,2006定義的GBM亞型間簇6的基因表達(dá)(z得分)的分布的箱線圖。

圖12是一張表，顯示了當(dāng)使用臨床共變量和簇6的平均基因表達(dá)作為預(yù)報器將多變量CoxPH模型擬合至完全生物標(biāo)志物可得AvaGlio群體的OS時簇6的平均基因表達(dá)顯著地既是預(yù)后性的又是預(yù)測性的。*指示p值≤0.05；**指示p值≤0.01；而***指示p值≤0.001。

圖13是一張表，顯示了當(dāng)使用臨床共變量和簇6的平均基因表達(dá)作為預(yù)報器將多變量CoxPH模型擬合至AvaGlio群體中的僅前神經(jīng)GBM患者(如通過Phillips分類的)的OS時簇6的平均基因表達(dá)既不是預(yù)后性的也不是預(yù)測性的。*指示p值≤0.05；**指示p值≤0.01；而***指示p值≤0.001。

圖14是一張表，顯示了當(dāng)使用臨床共變量和簇6的平均基因表達(dá)作為預(yù)報器將多變量CoxPH模型擬合至AvaGlio群體中的僅增殖性GBM患者(如通過Phillips分類的)的OS時簇6的平均基因表達(dá)是預(yù)后性的但不是預(yù)測性的。*指示p值≤0.05；**指示p值≤0.01；而***指示p值≤0.001。

圖15是一張表，顯示了當(dāng)使用臨床共變量和簇6的平均基因表達(dá)作為預(yù)報器將多變量CoxPH模型擬合至AvaGlio群體中的僅間充質(zhì)GBM患者(如通過Phillips分類的)的OS時簇6的平均基因表達(dá)既不是預(yù)后性的也不是預(yù)測性的。*指示p值≤0.05；**指示p值≤0.01；而***指示p值≤0.001。

圖16是一張表，顯示了當(dāng)使用臨床共變量和簇6的平均基因表達(dá)作為預(yù)報器將多變量CoxPH模型擬合至AvaGlio群體中的非前神經(jīng)GBM患者(如通過Phillips分類的)的OS時簇6的平均基因表達(dá)既是預(yù)后性的又是預(yù)測性的。*指示p值≤0.05；**指示p值≤0.01；而***指示p值≤0.001。

圖17A是顯示AvaGlio試驗的安慰劑處理分支中簇6“生物標(biāo)志物高”(帶有三角形標(biāo)記的線)和“生物標(biāo)志物低”(帶有正方形標(biāo)記的線)患者的OS的Kaplan Meier曲線的圖。對于簇6基因的二元化表達(dá)，AvaGlio中值以上的患者認(rèn)為是“生物標(biāo)志物高”，而AvaGlio中值以下的患者認(rèn)為是“生物標(biāo)志物低”。p值是自單變量CoxPH模型獲得的，沒有并入別的臨床共變量，因為它們無法并入Kaplan-Meier圖。p值＝0.001。

圖17B是顯示AvaGlio試驗的貝伐珠單抗處理分支中簇6“生物標(biāo)志物高”(帶有三角形標(biāo)記的線)和“生物標(biāo)志物低”(帶有正方形標(biāo)記的線)患者的OS的Kaplan Meier曲線的圖。對于簇6基因的二元化表達(dá)，AvaGlio中值以上的患者認(rèn)為是“生物標(biāo)志物高”，而AvaGlio中值以下的患者認(rèn)為是“生物標(biāo)志物低”。p值是自單變量CoxPH模型獲得的，沒有并入別的臨床共變量，因為它們無法并入Kaplan-Meier圖。p值＝0.271。

圖17C是顯示AvaGlio試驗的安慰劑處理分支(虛線)和貝伐珠單抗處理分支(實線)中簇6“生物標(biāo)志物低”患者的OS的Kaplan Meier曲線的圖。對于簇6基因的二元化表達(dá)，AvaGlio中值以上的患者認(rèn)為是“生物標(biāo)志物高”，而AvaGlio中值以下的患者認(rèn)為是“生物標(biāo)志物低”。p值是自單變量CoxPH模型獲得的，沒有并入別的臨床共變量，因為它們無法并入Kaplan-Meier圖。p值＝0.044。

圖17D是顯示AvaGlio試驗的安慰劑處理分支(虛線)和貝伐珠單抗處理分支(實線)中簇6“生物標(biāo)志物高”患者OS的Kaplan Meier曲線的圖。對于簇6基因的二元化表達(dá)，AvaGlio中值以上的患者認(rèn)為是“生物標(biāo)志物高”，而AvaGlio中值以下的患者認(rèn)為是“生物標(biāo)志物低”。p值是自單變量CoxPH模型獲得的，沒有并入別的臨床共變量，因為它們無法并入Kaplan-Meier圖。p值＝0.735。

發(fā)明詳述

I.導(dǎo)言

本發(fā)明提供用于監(jiān)測和/或鑒定對VEGF拮抗劑(例如抗VEGF抗體)治療敏感或響應(yīng)性的具有成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的患者的方法和組合物。本發(fā)明基于如下發(fā)現(xiàn)，即測定VEGF拮抗劑(諸如抗VEGF抗體)治療之前選自AKT3，CDH1，CYP27B1，DNM3，DYNLL1，ERBB3，KLRK1，MBP，MDM2，NCAM1，PDGFRA，PRKCZ，SNCA，TNFRSF21，AXL，BCL2L1，CD36，ETS1，ICAM2，IL17A，IRS2，PDGFRB，RPL13A，TGFB1，TNFRSF4，TNFSF4，和ZBTB16的至少1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，或27種基因的表達(dá)水平對于鑒定對VEGF拮抗劑(例如抗VEGF抗體)治療敏感或響應(yīng)性的患者是有用的。任選地，然后可以為患者選擇VEGF拮抗劑療法，并進(jìn)一步任選地可以對該患者施用VEGF拮抗劑療法。

II.定義

術(shù)語“抗血管發(fā)生劑”或“血管發(fā)生抑制劑”指或是直接或是間接抑制血管發(fā)生(angiogenesis)，血管生成(vasculogenesis)或不想要的血管通透性的小分子量物質(zhì)，多核苷酸，多肽，分離的蛋白質(zhì)，重組蛋白，抗體，或其綴合物或融合蛋白。應(yīng)當(dāng)理解，抗血管發(fā)生劑包括那些結(jié)合血管發(fā)生性因子或其受體并阻斷其血管發(fā)生活性的藥劑。例如，抗血管發(fā)生劑是說明書全文定義的或本領(lǐng)域已知的血管發(fā)生劑的抗體或其它拮抗劑，例如但不限于VEGF-A的抗體，VEGF-A受體(例如KDR受體或Flt-1受體)的抗體，VEGF陷阱，抗PDGFR抑制劑諸如Gleevec^TM(Imatinib Mesylate)?？寡馨l(fā)生劑還包括天然血管發(fā)生抑制劑，例如血管他丁(angiostatin)，內(nèi)皮他丁(endostatin)等。參見例如Klagsbrun and D′Amore,Annu.Rev.Physiol.,53:217-39(1991)；Streit and Detmar,Oncogene,22:3172-3179(2003)(例如列舉惡性黑素瘤中的抗血管發(fā)生療法的表3)；Ferrara&Alitalo,Nature Medicine 5:1359-1364(1999)；Tonini et al.,Oncogene,22:6549-6556(2003)(例如列舉已知的抗血管發(fā)生性因子的表2)；及Sato.Int.J.Clin.Oncol.,8:200-206(2003)(例如列舉臨床試驗中所使用的抗血管發(fā)生劑的表1)。

本文中的術(shù)語“抗體”以最廣義使用，并且涵蓋各種抗體結(jié)構(gòu)，包括但不限于單克隆抗體，多克隆抗體，多特異性抗體(例如雙特異性抗體)，和抗體片段，只要它們展現(xiàn)出期望的抗原結(jié)合活性。

術(shù)語“VEGF”或“VEGF-A”用于指165個氨基酸的人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子及相關(guān)的121個，145個，189個和206個氨基酸的人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子，如例如Leung et al.,Science,246:1306(1989)；及Houck et al.,Mol.Endocrin.,5:1806(1991)所述，及其天然存在的等位基因形式和加工形式。VEGF-A是包括VEGF-B，VEGF-C，VEGF-D，VEGF-E，VEGF-F和PlGF在內(nèi)的基因家族的一部分。VEGF-A主要結(jié)合兩種高親和力受體酪氨酸激酶，即VEGFR-1(Flt-1)和VEGFR-2(Flk-1/KDR)，后者是VEGF-A血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂信號的主要遞質(zhì)。另外，神經(jīng)氈蛋白-1已經(jīng)被鑒定為肝素結(jié)合VEGF-A同等型(isoform)的受體，而且可在血管發(fā)育中發(fā)揮作用。術(shù)語“VEGF”或“VEGF-A”還指來自非人物種諸如小鼠，大鼠或靈長類動物的VEGF。有時，來自特定物種的VEGF表示如下，hVEGF表示人VEGF，mVEGF表示鼠VEGF。通常，VEGF指人VEGF。術(shù)語“VEGF”還用于指包含165個氨基酸的人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子的氨基酸8-109或1-109的多肽的截短形式或片段。本申請中可能通過例如“VEGF(8-109)”，“VEGF(1-109)”或“VEGF165”來鑒別任何此類形式VEGF的提述?！敖囟痰摹碧烊籚EGF的氨基酸位置如天然VEGF序列中所示編號。例如，截短的天然VEGF中的第17位氨基酸(甲硫氨酸)也是天然VEGF中的第17位(甲硫氨酸)。截短的天然VEGF具有與天然VEGF相當(dāng)?shù)膶DR和Flt-1受體的結(jié)合親和力。

“抗VEGF抗體”指以足夠親和力和特異性結(jié)合VEGF的抗體。所選擇的抗體通常會具有對VEGF的結(jié)合親和力，例如，該抗體可以以介于100nM-1pM之間的Kd值結(jié)合hVEGF?？贵w親和力可通過例如基于表面等離振子共振的測定法(諸如PCT申請公開文本No.WO2005/012359中所記載的BIAcore測定法)；酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)；和競爭測定法(例如RIA)來測定。在某些實施方案中，本發(fā)明的抗VEGF抗體可用作治療劑，用于靶向和干擾其中涉及VEGF活性的疾病或疾患。還有，可對該抗體進(jìn)行其它生物學(xué)活性測定法，例如為了評估其作為治療劑的效力。此類測定法是本領(lǐng)域已知的，而且取決于抗體的靶抗原和預(yù)定用途。例子包括HUVEC抑制測定法；腫瘤細(xì)胞生長抑制測定法(如例如WO 89/06692中所記載的)；抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性(ADCC)和補體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(CDC)測定法(美國專利No.5,500,362)；及激動活性或造血測定法(參見WO 95/27062)?？筕EGF抗體通常不會結(jié)合其它VEGF同系物，諸如VEGF-B或VEGF-C，也不會結(jié)合其它生長因子，諸如PlGF，PDGF或bFGF。

依照本發(fā)明的“B20系列抗體”指自B20抗體的序列衍生的抗VEGF抗體或依照PCT公開文本No.WO2005/012359的圖27-29之任一的B20衍生抗體，通過述及將其整個公開內(nèi)容明確收入本文。還可參見PCT公開文本No.WO2005/044853和美國專利申請60/991,302，通過述及將這些專利申請的內(nèi)容明確收入本文。在一個實施方案中，B20系列抗體結(jié)合人VEGF上的功能性表位，其包含殘基F17，M18，D19，Y21，Y25，Q89，I91，K101，E103，和C104。

依照本發(fā)明的“G6系列抗體”指自G6抗體的序列衍生的抗VEGF抗體或依照PCT公開文本No.WO2005/012359的圖7，24-26，和34-35之任一的G6衍生抗體，通過述及將其整個公開內(nèi)容明確收入本文。還可參見PCT公開文本No.WO2005/044853，通過述及將其整個公開內(nèi)容明確收入本文。在一個實施方案中，G6系列抗體結(jié)合人VEGF上的功能性表位，其包含殘基F17，Y21，Q22，Y25，D63，I83和Q89。

抗VEGF抗體“貝伐珠單抗”(Bevacizumab；BV或Bev)是依照Presta et al.,Cancer Res.57:4593-4599(1997)生成的重組人源化抗VEGF單克隆抗體，也稱作“rhuMAb VEGF”或它包含突變的人IgG1框架區(qū)和來自鼠抗hVEGF單克隆抗體A.4.6.1(其阻斷人VEGF對其受體的結(jié)合)的抗原結(jié)合互補決定區(qū)。貝伐珠單抗大約93％的氨基酸序列(包括大部分框架區(qū))衍生自人IgG1，而約7％的序列衍生自鼠抗體A4.6.1。貝伐珠單抗具有約149,000道爾頓的分子量且是糖基化的。其它抗VEGF抗體包括美國專利No.6,884,879和WO 2005/044853中記載的抗體。

“表位A4.6.1”指受抗VEGF抗體貝伐珠單抗(參見Muller et al.,Structure 6:1153-1167,1998)識別的表位。在本發(fā)明的某些實施方案中，抗VEGF抗體包括但不限于與由雜交瘤ATCC HB 10709生成的單克隆抗VEGF抗體A4.6.1；依照Presta et al.,Cancer Res.57:4593-4599,1997生成的重組人源化抗VEGF單克隆抗體結(jié)合相同表位的單克隆抗體。

依照本發(fā)明的“功能性表位”指抗原中有力地促進(jìn)抗體結(jié)合的氨基酸殘基?？乖杏辛ω暙I(xiàn)的殘基中任一個的突變(例如，丙氨酸對野生型VEGF的突變或同系物突變)會破壞抗體的結(jié)合，使得抗體的相對親和力比(IC50突變型VEGF/IC50野生型VEGF)會大于5(參見WO2005/012359的實施例2)。在一個實施方案中，相對親和力比是通過溶液結(jié)合噬菌體展示ELISA測定的。簡言之，將96孔Maxisorp免疫板(NUNC)用Fab形式的待測試抗體以PBS中2μg/ml的濃度于4℃包被過夜，并用PBS，0.5％BSA，和0.05％Tween20(PBT)于室溫封閉2小時。首先將展示hVEGF丙氨酸點突變體(殘基8-109形式)或野生型hVEGF(8-109)的噬菌體在PBT中的連續(xù)稀釋液在Fab包被的板上于室溫溫育15分鐘，并用PBS，0.05％Tween20(PBST)清洗板。用在PBT中1:5000稀釋的抗M13單克隆抗體辣根過氧化物酶(Amersham Pharmacia)綴合物檢測所結(jié)合的噬菌體，用3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB,Kirkegaard&Perry Labs,Gaithersburg,MD)底物顯色大約5分鐘，用1.0M H₃PO₄淬滅，并以分光光度法于450nm讀數(shù)。IC50值的比(IC50,ala/IC50,wt)代表了結(jié)合親和力的降低倍數(shù)(相對結(jié)合親和力)。

抗VEGF抗體雷尼珠單抗(Ranibizumab)或抗體或rhuFab V2是一種人源化的親和力成熟的抗人VEGF Fab片段。雷尼珠單抗是通過大腸桿菌表達(dá)載體中的標(biāo)準(zhǔn)重組技術(shù)方法和細(xì)菌發(fā)酵生成的。雷尼珠單抗不是糖基化的且具有約48,000道爾頓的分子量。參見WO 98/45331及US2003/0190317。

“分離的”抗體指已經(jīng)鑒定且自其天然環(huán)境的成分分開和/或回收的抗體。其天然環(huán)境的污染性成分指會干擾該抗體的研究，診斷或治療用途的物質(zhì)，可包括酶，激素，和其它蛋白質(zhì)性質(zhì)或非蛋白質(zhì)性質(zhì)的溶質(zhì)。在有些實施方案中，將抗體純化至(1)根據(jù)例如Lowry法的測定，抗體重量超過95％，而在有些實施方案中，重量超過99％，(2)足以通過使用例如轉(zhuǎn)杯式測序儀獲得至少15個殘基的N端或內(nèi)部氨基酸序列的程度，或(3)根據(jù)還原性或非還原性條件下的SDS-PAGE及使用例如考馬斯藍(lán)或銀染劑，達(dá)到同質(zhì)。既然抗體天然環(huán)境的至少一種成分不會存在，那么分離的抗體包括重組細(xì)胞內(nèi)的原位抗體。然而，分離的抗體通常會通過至少一個純化步驟來制備。

“天然抗體”指通常由兩條相同的輕(L)鏈和兩條相同的重(H)鏈構(gòu)成的約150,000道爾頓的異四聚體糖蛋白。每條輕鏈通過一個共價二硫鍵與重鏈連接，而二硫化物連接的數(shù)目在不同免疫球蛋白同種型的重鏈間有變化。每條重鏈和輕鏈還具有間隔規(guī)律的鏈內(nèi)二硫橋。每條重鏈在一端具有一個可變域(V_H)，接著是多個恒定域。每條輕鏈在一端具有一個可變域(V_L)，而另一端是一個恒定域。輕鏈的恒定域與重鏈的第一恒定域排列在一起，而輕鏈的可變域與重鏈的可變域排列在一起。認(rèn)為特定的氨基酸殘基在輕鏈和重鏈可變域之間形成界面。

抗體的“可變區(qū)”或“可變域”指抗體重鏈或輕鏈的氨基端結(jié)構(gòu)域。重鏈的可變域可以稱為“VH”。輕鏈的可變域可以稱為“VL”。這些結(jié)構(gòu)域一般是抗體的最易變部分且包含抗原結(jié)合位點。

術(shù)語“可變的”指可變域中的某些部分在抗體間序列差異廣泛且用于每種特定抗體對其特定抗原的結(jié)合和特異性的實情。然而，變異性并非均勻分布于抗體的整個可變域。它集中于輕鏈和重鏈可變域中稱作高變區(qū)(HVR)的三個區(qū)段?？勺冇蛑懈痈叨缺Ｊ氐牟糠址Q作框架區(qū)(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變域各自包含四個FR區(qū)，它們大多采取β-片層構(gòu)象，通過三個HVR連接，HVR形成連接β-片層結(jié)構(gòu)的環(huán)且在有些情況中形成β-片層結(jié)構(gòu)的一部分。每條鏈中的HVR通過FR區(qū)非常接近的保持在一起，并與另一條鏈的HVR一起促成抗體的抗原結(jié)合位點的形成(參見Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,National Institute of Health,Bethesda,MD(1991))。恒定域不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但展現(xiàn)出多種效應(yīng)器功能，諸如抗體在抗體依賴性細(xì)胞的毒性中的參與。

根據(jù)其恒定域的氨基酸序列，來自任何脊椎動物物種的抗體(免疫球蛋白)的“輕鏈”可歸入兩種截然不同的型中的一種，稱作卡帕(κ)和拉姆達(dá)(λ)。

根據(jù)其重鏈恒定域的氨基酸序列，抗體(免疫球蛋白)可歸入不同的類。免疫球蛋白有五大類：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，其中有些可進(jìn)一步分為亞類(同種型)，例如IgG₁，IgG₂，IgG₃，IgG₄，IgA₁和IgA₂。將與不同類的免疫球蛋白對應(yīng)的重鏈恒定域分別稱作α，δ，ε，γ和μ。不同類的免疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)造是眾所周知的，一般性描述于例如Abbas et al.,Cellular and Mol.Immunology,4th ed.(W.B.Saunders,Co.,2000)?？贵w可以是抗體與一種或多種其它蛋白質(zhì)或肽共價或非共價聯(lián)合而形成的更大融合分子的一部分。

術(shù)語“全長抗體”，“完整抗體”和“完全抗體”在本文中可互換使用，指基本上完整形式的抗體而非下文定義的抗體片段。該術(shù)語具體指重鏈包含F(xiàn)c區(qū)的抗體。

“抗體片段”包含完整抗體的一部分，優(yōu)選包含其抗原結(jié)合區(qū)?？贵w片段的例子包括Fab，F(xiàn)ab′，F(xiàn)(ab′)₂和Fv片段；雙抗體(diabody)；線性抗體；單鏈抗體分子；及自抗體片段形成的多特異性抗體。

用木瓜蛋白酶消化抗體產(chǎn)生兩個相同的抗原結(jié)合片段，稱為“Fab”片段，各自具有一個抗原結(jié)合位點，及一個剩余的“Fc”片段，其名稱反映了它易于結(jié)晶的能力。胃蛋白酶處理產(chǎn)生一個F(ab′)₂片段，它具有兩個抗原結(jié)合位點且仍能夠交聯(lián)抗原。

“Fv”是包含完整抗原結(jié)合位點的最小限度抗體片段。在一個實施方案中，雙鏈Fv種類由緊密，非共價聯(lián)合的一個重鏈可變域和一個輕鏈可變域的二聚體組成。在單鏈Fv(scFv)種類中，一個重鏈可變域和一個輕鏈可變域可以通過柔性肽接頭共價連接，使得輕鏈和重鏈可以以與雙鏈Fv種類類似的“二聚體”結(jié)構(gòu)聯(lián)合。正是在這種構(gòu)造中，每個可變域的三個HVR相互作用而在VH-VL二聚體表面上限定了一個抗原結(jié)合位點。六個HVR一起賦予抗體以抗原結(jié)合特異性。然而，即使是單個可變域(或是只包含對抗原特異性的三個HVR的半個Fv)也具有識別和結(jié)合抗原的能力，只是親和力低于完整結(jié)合位點。

Fab片段包含重鏈和輕鏈可變域，而且還包含輕鏈的恒定域和重鏈的第一恒定域(CH1)。Fab′片段與Fab片段的不同之處在于重鏈CH1結(jié)構(gòu)域的羧基末端增加了少數(shù)殘基，包括來自抗體鉸鏈區(qū)的一個或多個半胱氨酸。Fab′-SH是本文中對其中恒定域半胱氨酸殘基攜帶游離硫醇基團(tuán)的Fab′的稱謂。F(ab′)₂抗體片段最初是作為在Fab′片段之間有鉸鏈半胱氨酸的成對Fab′片段生成的。還知道抗體片段的其它化學(xué)偶聯(lián)。

“單鏈Fv”或“scFv”抗體片段包含抗體的VH和VL結(jié)構(gòu)域，其中這些結(jié)構(gòu)域存在于一條多肽鏈上。一般而言，scFv多肽在VH與VL結(jié)構(gòu)域之間進(jìn)一步包含多肽接頭，其使得scFv能夠形成結(jié)合抗原的期望結(jié)構(gòu)。關(guān)于scFv的綜述參見例如Pluckthün，于The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg和Moore編，Springer-Verlag，New York，1994，第269-315頁。

術(shù)語“雙抗體”指具有兩個抗原結(jié)合位點的抗體片段，該片段在同一條多肽鏈(VH-VL)中包含相連的重鏈可變域(VH)和輕鏈可變域(VL)。通過使用過短的接頭使得同一條鏈上的兩個結(jié)構(gòu)域之間不能配對，迫使這些結(jié)構(gòu)域與另一條鏈的互補結(jié)構(gòu)域配對，從而產(chǎn)生兩個抗原結(jié)合位點。雙抗體可以是二價的或雙特異性的。雙抗體更完整的記載于例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson et al.,Nat.Med.9:129-134(2003)；及Hollinger et al.,PNAS USA90:6444-6448(1993)。三抗體(Triabody)和四抗體(tetrabody)也記載于Hudson et al.,Nat.Med.9:129-134(2003)。

如本文中使用的，術(shù)語“單克隆抗體”指從一群基本上同質(zhì)的抗體獲得的抗體，即構(gòu)成群體的各個抗體相同，除了可能以極小量存在的可能的突變，例如天然存在的突變。如此，修飾語“單克隆”表明抗體不是分立的抗體的混合物的特征。在某些實施方案中，此類單克隆抗體典型地包括包含結(jié)合靶物的多肽序列的抗體，其中靶物結(jié)合多肽序列是通過包括從眾多多肽序列中選擇單一靶物結(jié)合多肽序列在內(nèi)的過程得到的。例如，選擇過程可以是從眾多克隆諸如雜交瘤克隆，噬菌體克隆或重組DNA克隆的集合中選擇獨特克隆。應(yīng)當(dāng)理解，所選擇的靶物結(jié)合序列可進(jìn)一步改變，例如為了提高對靶物的親和力，將靶物結(jié)合序列人源化，提高其在細(xì)胞培養(yǎng)物中的產(chǎn)量，降低其在體內(nèi)的免疫原性，創(chuàng)建多特異性抗體等，而且包含改變后的靶物結(jié)合序列的抗體也是本發(fā)明的單克隆抗體。與典型地包含針對不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制備物不同，單克隆抗體制備物的每個單克隆抗體針對抗原上的單一決定簇。在它們的特異性以外，單克隆抗體制備物的優(yōu)勢還在于它們通常未受到其它免疫球蛋白的污染。

修飾語“單克隆”表明抗體從基本上同質(zhì)的抗體群獲得的特征，不應(yīng)解釋為要求通過任何特定方法來生產(chǎn)抗體。例如，要依照本發(fā)明使用的單克隆抗體可通過多種技術(shù)來生成，包括例如雜交瘤法(例如Kohler and Milstein,Nature,256:495-497(1975)；Hongo et al.,Hybridoma,14(3):253-260(1995)；Harlow et al.,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,2^nd ed.(1988)；Hammerling et al.,In:Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas,563-681(Elsevier,N.Y.,1981))，重組DNA法(參見例如美國專利No.4,816,567)，噬菌體展示技術(shù)(參見例如Clackson et al.,Nature,352:624-628(1991)；Marks et al.,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Sidhu et al.,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee et al.,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,PNAS USA 101(34):12467-12472(2004)；及Lee et al.,J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004))，及用于在具有部分或整個人免疫球蛋白基因座或編碼人免疫球蛋白序列的基因的動物中生成人或人樣抗體的技術(shù)(參見例如WO 1998/24893；WO 1996/34096；WO 1996/33735；WO 1991/10741；Jakobovits et al.,PNAS USA 90:2551(1993)；Jakobovits et al.,Nature362:255-258(1993)；Bruggemann et al.,Year in Immunol.7:33(1993)；美國專利No.5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；和5,661,016；Marks et al.,Bio/Technology 10:779-783(1992)；Lonberg et al.,Nature368:856-859(1994)；Morrison,Nature 368:812-813(1994)；Fishwild et al.,Nature Biotechnol.14:845-851(1996)；Neuberger,Nature Biotechnol.14:826(1996)；及Lonberg and Huszar,Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995))。

單克隆抗體在本文中明確包括“嵌合”抗體，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與衍生自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，而鏈的剩余部分與衍生自另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，以及此類抗體的片段，只要它們展現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性(例如美國專利No.4,816,567；Morrison et al.,PNAS USA 81:6851-6855(1984))。嵌合抗體包括抗體，其中抗體的抗原結(jié)合區(qū)衍生自通過例如給獼猴免疫接種感興趣抗原而生成的抗體。

非人(例如鼠)抗體的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗體。在一個實施方案中，人源化抗體指人免疫球蛋白(受體抗體)中的HVR殘基用具有期望特異性，親和力和/或能力的非人物種(供體抗體)諸如小鼠，大鼠，家兔，或非人靈長類動物的HVR殘基替換的免疫球蛋白。在有些情況中，將人免疫球蛋白的FR殘基用相應(yīng)的非人殘基替換。此外，人源化抗體可包含在受體抗體或供體抗體中沒有找到的殘基?？梢赃M(jìn)行這些修飾來進(jìn)一步改進(jìn)抗體的性能。一般而言，人源化抗體將包含至少一個，通常兩個基本上整個如下可變域，其中所有或基本上所有高變環(huán)對應(yīng)于非人免疫球蛋白的高變環(huán)，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗體任選還將包含至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定區(qū)。更多細(xì)節(jié)參見例如Jones et al.,Nature 321:522-525(1986)；Riechmann et al.,Nature 332:323-329(1988)；及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。還可參見例如Vaswani and Hamilton,Ann.Allergy,Asthma&Immunol.1:105-115(1998)；Harris,Biochem.Soc.Transactions 23:1035-1038(1995)；Hurle and Gross,Curr.Op.Biotech.5:428-433(1994)；及美國專利No.6,982,321和7,087,409。

“人抗體”指擁有與由人生成的抗體的氨基酸序列對應(yīng)的氨基酸序列和/或使用本文所公開的用于生成人抗體的任何技術(shù)生成的抗體。人抗體的這種定義明確排除包含非人抗原結(jié)合殘基的人源化抗體。人抗體可使用本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)來生成，包括噬菌體展示文庫。Hoogenboom and Winter,J.Mol.Biol.,227:381(1991)；及Marks et al.,J.Mol.Biol.,222:581(1991)。還可用于制備人單克隆抗體的是以下文獻(xiàn)中記載的方法：Cole et al.,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,p.77(1985)；Boerner et al.,J.Immunol.147(1):86-95(1991)。還可參見van Dijk and van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.,5:368-374(2001)?？赏ㄟ^給已經(jīng)修飾以應(yīng)答抗原性攻擊而生成人抗體但其內(nèi)源基因座已經(jīng)失能的轉(zhuǎn)基因動物例如經(jīng)過免疫的異種小鼠(xenomice)施用抗原來制備人抗體(參見例如美國專利No.6,075,181和6,150,584，關(guān)于XENOMOUSE^TM技術(shù))。還可參見例如Li et al.,PNAS USA,103:3557-3562(2006)，關(guān)于經(jīng)人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)生成的人抗體。

術(shù)語“高變區(qū)”，“HVR”或“HV”在用于本文時指抗體可變域中序列上高度可變和/或形成結(jié)構(gòu)上定義的環(huán)的區(qū)域。通常，抗體包含六個HVR：三個在VH中(H1，H2，H3)，三個在VL中(L1，L2，L3)。在天然抗體中，H3和L3展示這六個HVR的最大多樣性，而且認(rèn)為特別是H3在賦予抗體以精密特異性中發(fā)揮獨特作用。參見例如Xu et al.,Immunity 13:37-45(2000)；Johnson and Wu,In:Methods in Molecular Biology,248:1-25(Lo,ed.,Human Press,Totowa,NJ,2003)。事實上，僅由重鏈組成的天然存在駱駝(camelid)抗體在缺乏輕鏈時是有功能的且穩(wěn)定的。參見例如Hamers-Casterman et al.,Nature363:446-448(1993)；及Sheriff et al.,Nature Struct.Biol.3:733-736(1996)。

本文中使用且涵蓋許多HVR的敘述。作為Kabat互補決定區(qū)(CDR)的HVR是以序列變異性為基礎(chǔ)的，而且是最常用的(Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))。Chothia改為指結(jié)構(gòu)環(huán)的位置(Chothia and Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。AbM HVR代表Kabat CDR與Chothia結(jié)構(gòu)環(huán)之間的折衷，而且得到Oxford Molecular的AbM抗體建模軟件的使用?！敖佑|”HVR是以對可獲得的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)的分析為基礎(chǔ)的。下文記錄了這些HVR中每一個的殘基。

HVR可包括如下“延伸的HVR”：VL中的24-36或24-34(L1)，46-56或50-56(L2)和89-97或89-96(L3)及VH中的26-35(H1)，50-65或49-65(H2)和93-102，94-102或95-102(H3)。對于這些延伸的HVR定義中的每一個，可變域殘基是依照Kabat等,見上文編號的。

“框架”或“FR”殘基指可變域中除本文中所定義的HVR殘基外的那些殘基。

表述“依照Kabat的可變域殘基編號方式”或“依照Kabat的氨基酸位置編號方式”及其變體指Kabat et al.,見上文中的抗體編輯用于重鏈可變域或輕鏈可變域的編號系統(tǒng)。使用此編號系統(tǒng)，實際的線性氨基酸序列可包含或多或少的氨基酸，對應(yīng)于可變域FR或HVR的縮短或插入。例如，重鏈可變域可包含H2殘基52后的單一氨基酸插入(依照Kabat為殘基52a)及重鏈FR殘基82后的插入殘基(例如依照Kabat為殘基82a，82b和82c等)。給定抗體的Kabat殘基編號方式可通過將抗體序列與“標(biāo)準(zhǔn)”Kabat編號序列對比同源區(qū)來確定。

“親和力成熟的”抗體指在抗體的一個或多個HVR中具有一處或多處改變，導(dǎo)致該抗體對抗原的親和力與沒有那些改變的親本抗體相比有所改進(jìn)的抗體。在一個實施方案，親和力成熟的抗體具有納摩爾或甚至皮摩爾量級的對靶抗原的親和力。親和力成熟的抗體可通過本領(lǐng)域已知規(guī)程來生成。例如，Marks et al.,Bio/Technology 10:779-783(1992)記載了通過VH和VL結(jié)構(gòu)域改組進(jìn)行的親和力成熟。以下文獻(xiàn)記載了HVR和/或框架殘基的隨機誘變，例如Barbas et al.,Proc Nat.Acad.Sci.USA 91:3809-3813(1994)；Schier et al.,Gene 169:147-155(1995)；Yelton et al.,J.Immunol.155:1994-2004(1995)；Jackson et al.,J.Immunol.154(7):3310-3319(1995)；及Hawkins et al.,J.Mol.Biol.226:889-896(1992)。

如本文中使用的，“拮抗劑”指抑制或降低它們所結(jié)合的分子的生物學(xué)活性的化合物或藥劑。拮抗劑包括結(jié)合VEGF的抗體，合成或天然序列肽，免疫粘附素，和小分子拮抗劑，任選綴合有或融合至另一分子?！白钄嘈浴笨贵w或“拮抗性”抗體指抑制或降低它所結(jié)合的抗原的生物學(xué)活性的抗體。

“VEGF拮抗劑”指能夠中和，阻斷，抑制，消除，降低或干擾VEGF活性，包括其與VEGF或一種或多種VEGF受體或編碼它們的核酸結(jié)合的分子。優(yōu)選的是，所述VEGF拮抗劑結(jié)合VEGF或VEGF受體。VEGF拮抗劑包括抗VEGF抗體及其抗原結(jié)合片段，結(jié)合VEGF和VEGF受體并阻斷配體-受體相互作用的多肽(例如免疫粘附素，肽體)，抗VEGF受體抗體和VEGF受體拮抗劑諸如VEGFR酪氨酸激酶的小分子抑制劑，結(jié)合VEGF的適體和在嚴(yán)格條件下與編碼VEGF或VEGF受體的核酸序列雜交的核酸(例如RNAi)。依照一個優(yōu)選的實施方案，所述VEGF拮抗劑在體外結(jié)合VEGF并抑制VEGF誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞增殖。依照一個優(yōu)選的實施方案，所述VEGF拮抗劑以大于非VEGF或非VEGF受體的親和力結(jié)合VEGF或VEGF受體。依照一個優(yōu)選的實施方案，所述VEGF拮抗劑以介于1uM和1pM之間的Kd結(jié)合VEGF或VEGF受體。依照另一個優(yōu)選的實施方案，所述VEGF拮抗劑以介于500nM和1pM之間的Kd結(jié)合VEGF或VEGF受體。

依照一個優(yōu)選的實施方案，所述VEGF拮抗劑選自：多肽諸如抗體，肽體，免疫粘附素，小分子或適體。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述抗體是抗VEGF抗體(諸如抗體)或抗VEGF受體抗體(諸如抗VEGFR2或抗VEGFR3抗體)。VEGF拮抗劑的其它例子包括：VEGF陷阱，Mucagen，PTK787，SU11248，AG-013736，Bay 439006(sorafenib)，ZD-6474，CP632，CP-547632，AZD-2171，CDP-171，SU-14813，CHIR-258，AEE-788，SB786034，BAY579352，CDP-791，EG-3306，GW-786034，RWJ-417975/CT6758和KRN-633。

術(shù)語“抗腫瘤組合物”或“抗癌組合物”或“抗癌劑”指可用于治療癌癥的組合物，其包含至少一種活性治療劑，例如“抗癌劑”。治療劑(抗癌劑)的例子包括但不限于例如化療劑，生長抑制劑，細(xì)胞毒劑，放射療法中所使用的藥劑，抗血管發(fā)生劑，凋亡劑，抗微管蛋白劑，和其它用于治療癌癥的藥劑諸如抗HER-2抗體，抗CD20抗體，表皮生長因子受體(EGFR)拮抗劑(例如酪氨酸激酶抑制劑)，HER1/EGFR抑制劑(例如厄洛替尼(Tarceva^TM)，血小板衍生生長因子抑制劑(例如Gleevec^TM(Imatinib Mesylate))，COX-2抑制劑(例如塞來考昔(celecoxib))，干擾素，細(xì)胞因子，能與ErbB2，ErbB3，ErbB4，PDGFR-β，BlyS，APRIL，BCMA，VEGF或VEGF受體中的一種或多種靶物結(jié)合的拮抗劑(例如中和性抗體)，TRAIL/Apo2，及其它生物活性和有機化學(xué)劑等。本發(fā)明還包括它們的組合。

“化療劑”指可用于治療癌癥的化學(xué)化合物?；焺┑睦影捎糜谥委煱┌Y的化學(xué)化合物?；焺┑睦影ㄍ榛瘎╊?，諸如例如替莫唑胺(TMZ)，即烷化劑達(dá)卡巴嗪的咪唑四嗪衍生物?；焺┑膭e的例子包括例如帕利他賽或托泊替康或PEG化脂質(zhì)體多柔比星(PLD)?；焺┑钠渌影ㄍ榛瘎╊?alkylating agents)，諸如塞替派(thiotepa)和環(huán)磷酰胺(cyclosphosphamide)；磺酸烷基酯類(alkyl sulfonates)，諸如白消安(busulfan)，英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶類(aziridines)，諸如苯佐替派(benzodopa)，卡波醌(carboquone)，美妥替派(meturedopa)和烏瑞替派(uredopa)；乙撐亞胺類(ethylenimines)和甲基蜜胺類(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)，三乙撐蜜胺(triethylenemelamine)，三乙撐磷酰胺(triethylenephosphoramide)，三乙撐硫代磷酰胺(triethiylenethiophosphoramide)和三羥甲蜜胺(trimethylolomelamine)；番荔枝內(nèi)酯類(acetogenin)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；喜樹堿(camptothecin)；苔蘚抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括其阿多來新(adozelesin)，卡折來新(carzelesin)和比折來新(bizelesin)合成類似物)；隱藻素類(cryptophycins)(特別是隱藻素1和隱藻素8)；多拉司他汀(dolastatin)；duocarmycin(包括合成類似物，KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海綿抑素(spongistatin)；氮芥類(nitrogen mustards)，諸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)，萘氮芥(chlornaphazine)，膽磷酰胺(cholophosphamide)，雌莫司汀(estramustine)，異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)，雙氯乙基甲胺(mechlorethamine)，鹽酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)，美法侖(melphalan)，新氮芥(novembichin)，苯芥膽甾醇(phenesterine)，潑尼莫司汀(prednimustine)，曲磷胺(trofosfamide)，尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亞硝脲類(nitrosoureas)，諸如卡莫司汀(carmustine)，氯脲菌素(chlorozotocin)，福莫司汀(fotemustine)，洛莫司汀(lomustine)，尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素類，諸如烯二炔類抗生素(enediyne)(如加利車霉素(calicheamicin)，尤其是加利車霉素γ1I和加利車霉素ωI1(參見例如Agnew,Chem.Intl.Ed.Engl.,33:183-186(1994))；蒽環(huán)類抗生素(dynemicin)，包括dynemicin A；二膦酸鹽類(bisphosphonates)，諸如氯膦酸鹽(clodronate)；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌素(neocarzinostatin)發(fā)色團(tuán)和相關(guān)色蛋白烯二炔類抗生素發(fā)色團(tuán))，阿克拉霉素(aclacinomysin)，放線菌素(actinomycin)，氨茴霉素(authramycin)，偶氮絲氨酸(azaserine)，博來霉素(bleomycin)，放線菌素C(cactinomycin)，carabicin，洋紅霉素(caminomycin)，嗜癌霉素(carzinophilin)，色霉素(chromomycinis)，放線菌素D(dactinomycin)，柔紅霉素(daunorubicin)，地托比星(detorubicin)，6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸，多柔比星(doxorubicin)(包括嗎啉代多柔比星，氰基嗎啉代多柔比星，2-吡咯代多柔比星和脫氧多柔比星)，表柔比星(epirubicin)，依索比星(esorubicin)，伊達(dá)比星(idarubicin)，麻西羅霉素(marcellomycin)，絲裂霉素類(mitomycins)諸如絲裂霉素C，霉酚酸(mycophenolic acid)，諾拉霉素(nogalamycin)，橄欖霉素(olivomycin)，培洛霉素(peplomycin)，泊非霉素(potfiromycin)，嘌呤霉素(puromycin)，三鐵阿霉素(quelamycin)，羅多比星(rodorubicin)，鏈黑菌素(streptonigrin)，鏈佐星(streptozocin)，殺結(jié)核菌素(tubercidin)，烏苯美司(ubenimex)，凈司他丁(zinostatin)，佐柔比星(zorubicin)；抗代謝物類，諸如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，諸如二甲葉酸(denopterin)，甲氨蝶呤，蝶酰三谷氨酸(pteropterin)，三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤類似物，諸如氟達(dá)拉濱(fludarabine)，6-巰基嘌呤(mercaptopurine)，硫咪嘌呤(thiamiprine)，硫鳥嘌呤(thioguanine)；嘧啶類似物，諸如安西他濱(ancitabine)，阿扎胞苷(azacitidine)，6-氮尿苷，卡莫氟(carmofur)，阿糖胞苷(cytarabine)，雙脫氧尿苷(dideoxyuridine)，去氧氟尿苷(doxifluridine)，依諾他濱(enocitabine)，氟尿苷(floxuridine)；雄激素類，諸如卡魯睪酮(calusterone)，丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)，表硫雄醇(epitiostanol)，美雄烷(mepitiostane)，睪內(nèi)酯(testolactone)；抗腎上腺類，諸如氨魯米特(aminoglutethimide)，米托坦(mitotane)，曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑，諸如亞葉酸(frolinic acid)；醋葡醛內(nèi)酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依達(dá)曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defosfamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elformithine；依利醋銨(elliptinium acetate)；埃坡霉素(epothilone)；依托格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼達(dá)明(lonidamine)；美登木素生物堿類(maytansinoids)，諸如美登素(maytansine)和安絲菌素(ansainitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌達(dá)醇(mopidanmol)；二胺硝吖啶(nitraerine)；噴司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼(ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；多糖復(fù)合物(JHS Natural Products,Eugene,Oreg.)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西索菲蘭(sizofuran)；螺旋鍺(spirogermanium)；細(xì)交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌(triaziquone)；2,2′,2”-三氯三乙胺；單端孢菌素類(trichothecenes)(尤其是T-2毒素，疣孢菌素(verracurin)A，桿孢菌素(roridin)A和蛇行菌素(anguidine))；烏拉坦(urethan)；長春地辛(vindesine)；達(dá)卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛(wèi)矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)；塞替派(thiotepa)；類紫杉烷(taxoids)，例如帕利他賽(paclitaxel)(Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.)，不含克列莫佛(Cremophor)，清蛋白改造的納米顆粒劑型的帕利他賽(American Pharmaceutical Partners,Schaumberg,Ill.)和多西他塞(docetaxel)(Rhone-Poulenc Rorer,Antony,France)；苯丁酸氮芥(chloranbucil)；吉西他濱(gemcitabine)；6-硫鳥嘌呤(thioguanine)；巰基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤(methotrexate)；鉑類似物，諸如順鉑(cisplatin)，奧沙利鉑(oxaliplatin)和卡鉑(carboplatin)；長春堿(vinblastine)；鉑；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；長春新堿(vincristine)；長春瑞濱(vinorelbine)；能滅瘤(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依達(dá)曲沙(edatrexate)；道諾霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；希羅達(dá)(xeloda)；伊本膦酸鹽(ibandronate)；伊立替康(irinotecan)(Camptosar，CPT-11)(包括伊立替康及5-FU和亞葉酸(leucovorin)的治療方案)；拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥氨酸(DMFO)；類視黃酸(retinoids)，諸如視黃酸(retinoic acid)；卡培他濱(capecitabine)；考布他汀(combretastatin)；亞葉酸(leucovorin)(LV)；奧沙利鉑(oxaliplatin)，包括奧沙利鉑治療方案(FOLFOX)；拉帕替尼(lapatinib)降低細(xì)胞增殖的PKC-α，Raf，H-Ras，EGFR(例如厄洛替尼(erlotinib))和VEGF-A抑制劑；及任何上述物質(zhì)的藥學(xué)可接受鹽，酸或衍生物。

如本文中使用的，術(shù)語“細(xì)胞毒劑”指抑制或防止細(xì)胞的功能和/或引起細(xì)胞破壞的物質(zhì)。該術(shù)語意圖包括放射性同位素，例如At²¹¹，I¹³¹，I¹²⁵，Y⁹⁰，Re¹⁸⁶，Re¹⁸⁸，Sm¹⁵³，Bi²¹²，P³²和Lu的放射性同位素；化療劑，例如甲氨蝶呤(methotrexate)，阿霉素(adriamicin)，長春花生物堿類(vinca alkaloids)(長春新堿(vincristine)，長春堿(vinblastine)，依托泊苷(etoposide))，多柔比星(doxorubicin)，美法侖(melphalan)，絲裂霉素(mitomycin)C，苯丁酸氮芥(chlorambucil)，柔紅霉素(daunorubicin)或其它嵌入劑；酶及其片段，諸如溶核酶；抗生素；和毒素，諸如小分子毒素或者細(xì)菌，真菌，植物或動物起源的酶活毒素，包括其片段和/或變體；及下文披露的各種抗腫瘤劑或抗癌劑。下文記載了其它細(xì)胞毒劑。殺腫瘤劑引起腫瘤細(xì)胞的破壞。

“生長抑制劑”在用于本文時指在體外或在體內(nèi)抑制細(xì)胞(例如表達(dá)Robo4的細(xì)胞)生長和/或增殖的化合物或組合物。如此，生長抑制劑可以是顯著降低處于S期的表達(dá)Robo4的細(xì)胞百分比的藥劑。生長抑制劑的例子包括阻斷細(xì)胞周期行進(jìn)(處于S期以外的位置)的藥劑，諸如誘導(dǎo)G1停滯和M期停滯的藥劑。經(jīng)典的M期阻斷劑包括長春藥類(vincas)(長春新堿(vincristine)和長春堿(vinblastine))，紫杉烷類(taxanes)，和拓?fù)洚悩?gòu)酶II抑制劑諸如蒽環(huán)類抗生素多柔比星(doxorubicin)((8S-順式)-10-[(3-氨基-2,3,6-三脫氧-α-L-來蘇-吡喃己糖基)氧基]-7,8,9,10-四氫-6,8,11-三羥基-8-(羥基乙?；?-1-甲氧基-5,12-萘二酮，即(8S-cis)-10-[(3-amino-2,3,6-trideoxy-α-L-lyxo-hexapyranosyl)oxy]-7,8,9,10-tetra hydro-6,8,11-trihydroxy-8-(hydroxyacetyl)-1-methoxy-5,12-naphthacenedione)，表柔比星(epirubicin)，柔紅霉素(daunorubicin)，依托泊苷(etoposide)和博來霉素(bleomycin)。那些阻滯G1的藥劑也溢出進(jìn)入S期停滯，例如DNA烷化劑類諸如他莫昔芬(tamoxifen)，潑尼松(prednisone)，達(dá)卡巴嗪(dacarbazine)，雙氯乙基甲胺(mechlorethamine)，順鉑(cisplatin)，甲氨蝶呤(methotrexate)，5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)和ara-C。更多信息可參見The Molecular Basis of Cancer,Mendelsohn and Israel編,Chapter 1,題為"Cell cycle regulation,oncogenes,and anti-neoplastic drugs",Murakami et al.(WB Saunders:Philadelphia,1995)，尤其是第13頁。紫杉烷類(帕利他賽(paclitaxel)和多西他賽(docetaxel))是衍生自紫杉樹的抗癌藥。衍生自歐洲紫杉的多西他賽(Rhone-Poulenc Rorer)是帕利他賽(Bristol-Myers Squibb)的半合成類似物。帕利他賽和多西他賽促進(jìn)由微管蛋白二聚體裝配成微管并通過防止解聚使微管穩(wěn)定，導(dǎo)致對細(xì)胞中有絲分裂的抑制。

術(shù)語“生物標(biāo)志物”和“標(biāo)志物”在本文中可互換使用，指基于DNA，RNA，蛋白質(zhì)，碳水化合物，或糖脂的分子標(biāo)志物，它們在受試者的或患者的樣品中的表達(dá)或存在可通過標(biāo)準(zhǔn)方法(或本文中所公開的方法)來檢測，而且可用于監(jiān)測哺乳動物受試者對VEGF拮抗劑的響應(yīng)性或敏感性。此類生物標(biāo)志物包括但不限于下述基因：AKT3，CDH1，CYP27B1，DNM3，DYNLL1，ERBB3，KLRK1，MBP，MDM2，NCAM1，PDGFRA，PRKCZ，SNCA，TNFRSF21，AXL，BCL2L1，CD36，ETS1，ICAM2，IL17A，IRS2，PDGFRB，RPL13A，TGFB1，TNFRSF4，TNFSF4，和ZBTB16。此類生物標(biāo)志物的表達(dá)可測定為自對VEGF拮抗劑敏感或響應(yīng)性的患者獲得的樣品中的比參照水平(包括例如來自患者(例如具有成膠質(zhì)細(xì)胞瘤且正在測試對VEGF拮抗劑的響應(yīng)性的患者)組/群體的樣品中生物標(biāo)志物的中值表達(dá)水平；來自患者(例如具有成膠質(zhì)細(xì)胞瘤且鑒定為不響應(yīng)VEGF拮抗劑治療的患者)組/群體的樣品中生物標(biāo)志物的中值表達(dá)水平；在在先的時間先前自個體獲得的樣品中的水平；或來自在原發(fā)性腫瘤設(shè)置中接受VEGF拮抗劑(諸如抗VEGF抗體)在先治療且現(xiàn)在可能正在經(jīng)歷轉(zhuǎn)移的患者的樣品中的水平)要高或低。具有大于或小于至少一種基因(諸如AKT3，CDH1，CYP27B1，DNM3，DYNLL1，ERBB3，KLRK1，MBP，MDM2，NCAM1，PDGFRA，PRKCZ，SNCA，TNFRSF21，AXL，BCL2L1，CD36，ETS1，ICAM2，IL17A，IRS2，PDGFRB，RPL13A，TGFB1，TNFRSF4，TNFSF4，和/或ZBTB16)的參照表達(dá)水平(例如大于AKT3，CDH1，CYP27B1，DNM3，DYNLL1，ERBB3，KLRK1，MBP，MDM2，NCAM1，PDGFRA，PRKCZ，SNCA，和/或TNFRSF21中一種或多種的參照表達(dá)水平或小于AXL，BCL2L1，CD36，ETS1，ICAM2，IL17A，IRS2，PDGFRB，RPL13A，TGFB1，TNFRSF4，和/或TNFSF4中一種或多種的參照表達(dá)水平)的表達(dá)水平的個體可以鑒定為很可能響應(yīng)VEGF拮抗劑治療的受試者/患者。例如，此類在最極端的情況下相對于(即高于或低于)參照水平(諸如中值水平，如上所述)展現(xiàn)50％，45％，40％，35％，30％，25％，20％，15％，10％，或5％基因表達(dá)水平的受試者/患者可以鑒定為很可能響應(yīng)VEGF拮抗劑(諸如抗VEGF抗體)治療的受試者/患者(例如具有成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的患者)。

術(shù)語“表達(dá)的水平”或“表達(dá)水平”可互換使用，一般指生物學(xué)樣品中多核苷酸或氨基酸產(chǎn)物或蛋白質(zhì)的量。“表達(dá)”一般指基因所編碼的信息轉(zhuǎn)換成細(xì)胞中存在的和運行的結(jié)構(gòu)的過程。因此，依照本發(fā)明，基因的“表達(dá)”可以指轉(zhuǎn)錄成多核苷酸，翻譯成蛋白質(zhì)，或甚至蛋白質(zhì)的翻譯后修飾。轉(zhuǎn)錄得到的多核苷酸的，翻譯得到的蛋白質(zhì)的，或翻譯后修飾得到的蛋白質(zhì)的片段也應(yīng)視為表達(dá)的，無論它們是源自通過可變剪接生成的轉(zhuǎn)錄物或經(jīng)過降解的轉(zhuǎn)錄物，或者是源自蛋白質(zhì)的翻譯后加工(例如通過蛋白水解)?！氨磉_(dá)的基因”包括轉(zhuǎn)錄成多核苷酸(像mRNA)，然后翻譯成蛋白質(zhì)的基因，還有轉(zhuǎn)錄成RNA但不翻譯成蛋白質(zhì)的基因(例如轉(zhuǎn)運RNA或核糖體RNA)。

術(shù)語“樣品”和“生物學(xué)樣品”可互換使用，指任何自個體獲得的生物學(xué)樣品，包括體液，身體組織(例如腫瘤組織)，細(xì)胞，或其它來源。體液是例如淋巴，血清，新鮮全血，外周血單個核細(xì)胞，冷凍的全血，血漿(包括新鮮的或冷凍的)，尿液，唾液，精液，滑液和脊髓液。樣品還包括乳房組織，腎組織，結(jié)腸組織，腦組織，肌肉組織，滑膜組織，皮膚，毛囊，骨髓，和腫瘤組織。用于自哺乳動物獲得組織活檢和體液的方法是本領(lǐng)域公知的。

如本文中使用的，“治療”或“處理”(及其語法變型)指試圖改變所治療個體的自然進(jìn)程的臨床干預(yù)，可以是為了預(yù)防或在臨床病理學(xué)的進(jìn)程中實施的。治療的期望效果包括但不限于預(yù)防疾病的發(fā)生或復(fù)發(fā)，緩解癥狀，削弱疾病的任何直接或間接病理學(xué)后果，防止轉(zhuǎn)移，延長總體存活(OS)，延長無進(jìn)展存活(PFS)，減緩疾病進(jìn)展的速率，改善或減輕疾病狀態(tài)，及消退或改善預(yù)后。

如本文中使用的，就治療而言短語“告知患者”或“對患者提供推薦”指使用涉及患者的樣品中AKT3，CDH1，CYP27B1，DNM3，DYNLL1，ERBB3，KLRK1，MBP，MDM2，NCAM1，PDGFRA，PRKCZ，SNCA，TNFRSF21，AXL，BCL2L1，CD36，ETS1，ICAM2，IL17A，IRS2，PDGFRB，RPL13A，TGFB1，TNFRSF4，TNFSF4，和/或ZBTB16中至少一種(例如AKT3，CDH1，CYP27B1，DNM3，DYNLL1，ERBB3，KLRK1，MBP，MDM2，NCAM1，PDGFRA，PRKCZ，SNCA，和/或TNFRSF21中一種或多種或AXL，BCL2L1，CD36，ETS1，ICAM2，IL17A，IRS2，PDGFRB，RPL13A，TGFB1，TNFRSF4，和/或TNFSF4中一種或多種)的水平或存在生成的信息或數(shù)據(jù)將患者鑒定為用某種療法治療是恰當(dāng)?shù)幕虿磺‘?dāng)?shù)?。在一些實施方案中，療法可包含VEGF拮抗劑(例如抗VEGF抗體，例如貝伐珠單抗)。在一些實施方案中，推薦可包括鑒定需要調(diào)整施用的VEGF拮抗劑(例如抗VEGF抗體，例如貝伐珠單抗)的有效量的患者。在一些實施方案中，推薦治療包括推薦調(diào)整施用的VEGF拮抗劑(例如抗VEGF抗體，例如貝伐珠單抗)的量。如本文中使用的，就治療而言短語“告知患者”或“對患者提供推薦”還可以指使用生成的信息或數(shù)據(jù)為鑒定或選擇為更加可能或不太可能響應(yīng)包含VEGF拮抗劑的療法的患者建議或選擇包含VEGF拮抗劑(例如抗VEGF抗體，例如貝伐珠單抗)的療法。使用或生成的信息或數(shù)據(jù)可以是任何形式的，書面的，口頭的或電子的。在一些實施方案中，使用生成的信息或數(shù)據(jù)包括傳達(dá)，呈現(xiàn)，報告，存儲，發(fā)送，轉(zhuǎn)移，供應(yīng)，傳輸，分發(fā)，或其組合。在一些實施方案中，傳達(dá)，呈現(xiàn)，報告，存儲，發(fā)送，轉(zhuǎn)移，供應(yīng)，傳輸，分發(fā)，或其組合是由計算裝置，分析單元或其組合實施的。在一些進(jìn)一步的實施方案中，傳達(dá)，呈現(xiàn)，報告，存儲，發(fā)送，轉(zhuǎn)移，供應(yīng)，傳輸，分發(fā)，或其組合是由實驗室或醫(yī)學(xué)專業(yè)人員實施的。在一些實施方案中，信息或數(shù)據(jù)包括AKT3，CDH1，CYP27B1，DNM3，DYNLL1，ERBB3，KLRK1，MBP，MDM2，NCAM1，PDGFRA，PRKCZ，SNCA，TNFRSF21，AXL，BCL2L1，CD36，ETS1，ICAM2，IL17A，IRS2，PDGFRB，RPL13A，TGFB1，TNFRSF4，TNFSF4，和/或ZBTB16中至少一種(例如AKT3，CDH1，CYP27B1，DNM3，DYNLL1，ERBB3，KLRK1，MBP，MDM2，NCAM1，PDGFRA，PRKCZ，SNCA，和/或TNFRSF21中的一種或多種或AXL，BCL2L1，CD36，ETS1，ICAM2，IL17A，IRS2，PDGFRB，RPL13A，TGFB1，TNFRSF4，和/或TNFSF4中的一種或多種)的水平與參照水平的比較。在一些實施方案中，信息或數(shù)據(jù)包括樣品中存在或缺失AKT3，CDH1，CYP27B1，DNM3，DYNLL1，ERBB3，KLRK1，MBP，MDM2，NCAM1，PDGFRA，PRKCZ，SNCA，TNFRSF21，AXL，BCL2L1，CD36，ETS1，ICAM2，IL17A，IRS2，PDGFRB，RPL13A，TGFB1，TNFRSF4，TNFSF4，和/或ZBTB16中至少一種(例如AKT3，CDH1，CYP27B1，DNM3，DYNLL1，ERBB3，KLRK1，MBP，MDM2，NCAM1，PDGFRA，PRKCZ，SNCA，和/或TNFRSF21中的一種或多種或AXL，BCL2L1，CD36，ETS1，ICAM2，IL17A，IRS2，PDGFRB，RPL13A，TGFB1，TNFRSF4，和/或TNFSF4中的一種或多種)的指示。在一些實施方案中，信息或數(shù)據(jù)包括患者用包含VEGF拮抗劑(例如抗VEGF抗體，例如貝伐珠單抗)的療法治療恰當(dāng)或不恰當(dāng)?shù)闹甘尽?/p>

如本文中使用的，短語“鑒定患者”指使用涉及患者的樣品中AKT3，CDH1，CYP27B1，DNM3，DYNLL1，ERBB3，KLRK1，MBP，MDM2，NCAM1，PDGFRA，PRKCZ，SNCA，TNFRSF21，AXL，BCL2L1，CD36，ETS1，ICAM2，IL17A，IRS2，PDGFRB，RPL13A，TGFB1，TNFRSF4，TNFSF4，和/或ZBTB16中至少一種(例如AKT3，CDH1，CYP27B1，DNM3，DYNLL1，ERBB3，KLRK1，MBP，MDM2，NCAM1，PDGFRA，PRKCZ，SNCA，和/或TNFRSF21中的一種或多種或AXL，BCL2L1，CD36，ETS1，ICAM2，IL17A，IRS2，PDGFRB，RPL13A，TGFB1，TNFRSF4，和/或TNFSF4中的一種或多種)的水平或存在生成的信息或數(shù)據(jù)鑒定或選擇更加可能或不太可能受益于包含VEGF拮抗劑(例如抗VEGF抗體，例如貝伐珠單抗)的療法的患者。使用或生成的信息或數(shù)據(jù)可以是任何形式的，書面的，口頭的或電子的。在一些實施方案中，使用生成的信息或數(shù)據(jù)包括傳達(dá)，呈現(xiàn)，報告，存儲，發(fā)送，轉(zhuǎn)移，供應(yīng)，傳輸，分發(fā)，或其組合。在一些實施方案中，傳達(dá)，呈現(xiàn)，報告，存儲，發(fā)送，轉(zhuǎn)移，供應(yīng)，傳輸，分發(fā)，或其組合是由計算裝置，分析單元或其組合實施的。在一些進(jìn)一步的實施方案中，傳達(dá)，呈現(xiàn)，報告，存儲，發(fā)送，轉(zhuǎn)移，供應(yīng)，傳輸，分發(fā)，或其組合是由實驗室或醫(yī)學(xué)專業(yè)人員實施的。在一些實施方案中，信息或數(shù)據(jù)包括AKT3，CDH1，CYP27B1，DNM3，DYNLL1，ERBB3，KLRK1，MBP，MDM2，NCAM1，PDGFRA，PRKCZ，SNCA，TNFRSF21，AXL，BCL2L1，CD36，ETS1，ICAM2，IL17A，IRS2，PDGFRB，RPL13A，TGFB1，TNFRSF4，TNFSF4，和/或ZBTB16中至少一種(例如AKT3，CDH1，CYP27B1，DNM3，DYNLL1，ERBB3，KLRK1，MBP，MDM2，NCAM1，PDGFRA，PRKCZ，SNCA，和/或TNFRSF21中的一種或多種或AXL，BCL2L1，CD36，ETS1，ICAM2，IL17A，IRS2，PDGFRB，RPL13A，TGFB1，TNFRSF4，和/或TNFSF4中的一種或多種)的水平與參照水平的比較。在一些實施方案中，信息或數(shù)據(jù)包括樣品中存在或缺失AKT3，CDH1，CYP27B1，DNM3，DYNLL1，ERBB3，KLRK1，MBP，MDM2，NCAM1，PDGFRA，PRKCZ，SNCA，TNFRSF21，AXL，BCL2L1，CD36，ETS1，ICAM2，IL17A，IRS2，PDGFRB，RPL13A，TGFB1，TNFRSF4，TNFSF4，和/或ZBTB16中至少一種的指示。在一些實施方案中，信息或數(shù)據(jù)包括患者更加可能或不太可能響應(yīng)包含VEGF拮抗劑(例如抗VEGF抗體，例如貝伐珠單抗)的療法的指示。

如本文中使用的，短語“選擇療法”指使用涉及患者的樣品中AKT3，CDH1，CYP27B1，DNM3，DYNLL1，ERBB3，KLRK1，MBP，MDM2，NCAM1，PDGFRA，PRKCZ，SNCA，TNFRSF21，AXL，BCL2L1，CD36，ETS1，ICAM2，IL17A，IRS2，PDGFRB，RPL13A，TGFB1，TNFRSF4，TNFSF4，和/或ZBTB16中至少一種(例如AKT3，CDH1，CYP27B1，DNM3，DYNLL1，ERBB3，KLRK1，MBP，MDM2，NCAM1，PDGFRA，PRKCZ，SNCA，和/或TNFRSF21中的一種或多種或AXL，BCL2L1，CD36，ETS1，ICAM2，IL17A，IRS2，PDGFRB，RPL13A，TGFB1，TNFRSF4，和/或TNFSF4中的一種或多種)的水平或存在生成的信息或數(shù)據(jù)為患者鑒定或選擇療法。在一些實施方案中，療法可包含VEGF拮抗劑(例如抗VEGF抗體，例如貝伐珠單抗)。在一些實施方案中，短語“選擇療法”包括鑒定需要調(diào)整施用的VEGF拮抗劑(例如抗VEGF抗體，例如貝伐珠單抗)的有效量的患者。

“單一療法”意指如下的治療方案，其在治療期的過程期間只包括單一治療劑來治療癌癥或腫瘤。使用VEGF拮抗劑(例如抗VEGF抗體，例如貝伐珠單抗)的單一療法意味著在治療期期間在沒有別的抗癌療法的情況中施用所述VEGF拮抗劑。

術(shù)語“有效量”指在受試者或患者(諸如哺乳動物，例如人)中有效治療疾病或病癥(諸如成膠質(zhì)細(xì)胞瘤)的藥物量。在癌癥的情況中，治療有效量的藥物可減少癌細(xì)胞的數(shù)目；縮小腫瘤的尺寸；抑制(即一定程度的減緩，優(yōu)選阻止)癌細(xì)胞浸潤入周圍器官；抑制(即一定程度的減緩，優(yōu)選阻止)腫瘤轉(zhuǎn)移；一定程度的抑制腫瘤生長；和/或一定程度的減輕一種或多種與病癥有關(guān)的癥狀。根據(jù)藥物可阻止現(xiàn)有癌細(xì)胞生長和/或殺死現(xiàn)有癌細(xì)胞的程度，它可以是細(xì)胞抑制性的和/或細(xì)胞毒性的。對于癌癥療法，可以例如通過評估存活持續(xù)時間，無進(jìn)展存活(PFS)持續(xù)時間，總體存活(OS)，響應(yīng)率(RR)，響應(yīng)持續(xù)時間，和/或生活質(zhì)量來測量體內(nèi)功效。

患者對VEGF拮抗劑(例如抗VEGF抗體，例如貝伐珠單抗)治療的“有效響應(yīng)”(effective response)或患者對VEGF拮抗劑治療的“響應(yīng)性”(responsiveness)或“敏感性”(sensitivity)指源自VEGF拮抗劑治療或作為該治療的結(jié)果，給予有成膠質(zhì)細(xì)胞瘤風(fēng)險或具有成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的患者的臨床或治療受益。此類受益包括源自拮抗劑治療或作為該治療的結(jié)果的細(xì)胞或生物學(xué)應(yīng)答，完全響應(yīng)，部分響應(yīng)，穩(wěn)定的病情(沒有進(jìn)展或復(fù)發(fā))，或患者響應(yīng)及稍后復(fù)發(fā)。例如，有效響應(yīng)可以是診斷為表達(dá)與參照水平(包括例如來自正在測試對VEGF拮抗劑的響應(yīng)性的患者組/群體的樣品中生物標(biāo)志物的中值表達(dá)水平；來自具有成膠質(zhì)細(xì)胞瘤且鑒定為不響應(yīng)VEGF拮抗劑治療的患者組/群體的樣品中生物標(biāo)志物的中值表達(dá)水平；在在先的時間先前自個體獲得的樣品中的水平；或來自在原發(fā)性腫瘤設(shè)置中接受VEGF拮抗劑(諸如抗VEGF抗體，例如貝伐珠單抗)在先治療且現(xiàn)在可能正在經(jīng)歷轉(zhuǎn)移的患者的樣品中的水平)相比(a)更高水平的AKT3，CDH1，CYP27B1，DNM3，DYNLL1，ERBB3，KLRK1，MBP，MDM2，NCAM1，PDGFRA，PRKCZ，SNCA，和/或TNFRSF21中一種或多種，(b)更低水平的AXL，BCL2L1，CD36，ETS1，ICAM2，IL17A，IRS2，PDGFRB，RPL13A，TGFB1，TNFRSF4，和/或TNFSF4中一種或多種，或(c)(a)和(b)二者的患者中縮小的腫瘤尺寸，延長的無進(jìn)展存活(PFS)，和/或延長的總體存活(OS)。遺傳生物標(biāo)志物的表達(dá)有效預(yù)示，或以高靈敏度預(yù)示此類有效響應(yīng)。

“存活”指受試者保持活著，包括無進(jìn)展存活(PFS)和總體存活(OS)。存活可通過Kaplan-Meier方法來評估，而且存活的任何差異可使用分層時序檢驗(stratified log-rank test)來計算。

“總體存活”或“OS”指受試者自治療起始或自初始診斷起保持限定時間段活著，諸如約1年，約2年，約3年，約4年，約5年，約10年，等。在本發(fā)明根本的研究中，用于存活分析的事件是任何原因的死亡。

“無進(jìn)展存活”或“PFS”指自治療(或隨機化)至第一次疾病進(jìn)展或死亡的時間。例如，它指如下的時間，即自治療起始或自初始診斷起，例如限定的時間段，諸如約1個月，約2個月，約3個月，約4個月，約5個月，約6個月，約7個月，約8個月，約9個月，約1年，約2年，約3年，等，受試者仍然活著且癌癥沒有復(fù)發(fā)。在本發(fā)明的一個方面，可以通過MacDonald等人描述的MacDonald響應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)(MacDonald et al.,J.Clin.Oncol.8:1277-80,1990)來評估PFS。

“總體響應(yīng)率”或“客觀響應(yīng)率”(ORR)指經(jīng)歷癌(例如成膠質(zhì)細(xì)胞瘤)的尺寸或量降低達(dá)最小時間量的人的百分百，而且ORR可以由完全和部分響應(yīng)率的和來代表。

“延長存活”或“提高存活可能性”意味著使接受治療的受試者(例如用VEGF拮抗劑，例如抗VEGF抗體，例如貝伐珠單抗治療的受試者)或接受治療的受試者群體的PFS和/或OS分別相對于未接受治療的受試者(例如未用抗VEGF抗體治療的受試者)或未接受治療的受試者群體，或者相對于對照治療方案(諸如只用化療劑的治療，諸如成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的標(biāo)準(zhǔn)護(hù)理中使用的那些，諸如例如有或無放療的替莫唑胺(TMZ))有延長。存活在治療啟動之后或在初始診斷之后監(jiān)測至少約1個月，約2個月，約4個月，約6個月，約9個月，或至少約1年，或至少約2年，或至少約3年，或至少約4年，或至少約5年，或至少約10年，等。

危害比(HR)是事件比率的統(tǒng)計定義。為了本發(fā)明的目的，危害比定義為代表任何特定時間點時實驗分支中的事件概率除以對照分支中的事件概率。無進(jìn)展存活分析中的“危害比”是兩條無進(jìn)展存活曲線之間的差異的匯總，代表隨訪期里與對照相比治療的死亡風(fēng)險降低。

本文中的“患者”或“受試者”指適于接受治療的任何單一動物(包括例如哺乳動物，諸如犬，貓，馬，家兔，動物園動物，牛，豬，綿羊，非人靈長動物，和人)，諸如人，他/它正經(jīng)受或者已經(jīng)經(jīng)受疾病或病癥(諸如成膠質(zhì)細(xì)胞瘤(GBM))的一種或多種體征，癥狀，或其它指標(biāo)。意圖包括作為患者的是參與臨床研究試驗且未顯示疾病的任何臨床體征的任何患者，或參與流行病學(xué)研究的患者，或曾經(jīng)用作對照的患者。所述患者可以先前用VEGF拮抗劑(例如抗VEGF抗體，例如貝伐珠單抗)或另一種藥物治療過，或者沒有這樣治療過。患者可以是在開始本文中的治療時未接觸所用別的藥物的，即該患者在“基線”(即在本文中治療方法中施用第一劑VEGF拮抗劑(例如抗VEGF抗體，例如貝伐珠單抗)之前的一個設(shè)定時間點，諸如開始治療之前篩選受試者的日子)時可以先前沒有用例如除VEGF拮抗劑(例如抗VEGF抗體，例如貝伐珠單抗)以外的療法治療過。此類“未接觸(藥物)”患者或受試者一般認(rèn)為是用此類別的藥物進(jìn)行治療的候選。

術(shù)語“癌癥”和“癌性”指或描述哺乳動物中特征通常為細(xì)胞生長不受調(diào)控的生理疾患。此定義中包括良性和惡性癌癥以及休眠腫瘤或微轉(zhuǎn)移。癌癥的例子包括但不限于癌瘤，淋巴瘤，母細(xì)胞瘤，肉瘤，和白血病。此類癌癥的更具體例子包括但不限于成膠質(zhì)細(xì)胞瘤(GBM)，包括例如前神經(jīng)GBM，神經(jīng)GBM，經(jīng)典GBM，和間充質(zhì)GBM。GBM可以是新診斷的，診斷的，或復(fù)發(fā)的。其它癌癥包括例如乳腺癌，鱗狀細(xì)胞癌，肺癌(包括小細(xì)胞肺癌，非小細(xì)胞肺癌，肺的腺癌，和肺的鱗癌)，腹膜癌，肝細(xì)胞癌，胃癌(gastric or stomach cancer)(包括胃腸癌)，胰腺癌，卵巢癌，宮頸癌，肝癌(liver cancer or hepatic carcinoma)，膀胱癌，肝瘤(hepatoma)，結(jié)腸癌，結(jié)腸直腸癌，子宮內(nèi)膜癌或子宮癌，唾液腺癌，腎癌(kidney or renal cancer)，前列腺癌，外陰癌，甲狀腺癌，及各種類型的頭和頸癌，以及B細(xì)胞淋巴瘤(包括低級/濾泡性非何杰金(Hodgkin)氏淋巴瘤(NHL)，小淋巴細(xì)胞性(SL)NHL，中級/濾泡性NHL，中級彌漫性NHL，高級成免疫細(xì)胞性NHL，高級成淋巴細(xì)胞性NHL，高級小無核裂細(xì)胞性NHL，貯積病(bulky disease)NHL，套細(xì)胞淋巴瘤，AIDS相關(guān)淋巴瘤，和瓦爾登斯特倫(Waldenstrom)氏巨球蛋白血癥)，慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)，急性成淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)，毛細(xì)胞性白血病，慢性成髓細(xì)胞性白血病，和移植后淋巴增殖性病癥(PTLD)，以及與瘢痣病(phakomatoses)，水腫(諸如與腦瘤有關(guān)的)和梅格斯(Meigs)氏綜合征有關(guān)的異常血管增殖。

如本文中使用的，“腫瘤”指所有贅生性(neoplastic)細(xì)胞生長和增殖，無論是惡性的還是良性的，及所有癌前(pre-cancerous)和癌性細(xì)胞和組織。術(shù)語“癌癥”，“癌性”，“細(xì)胞增殖性病癥”，“增殖性病癥”和“腫瘤”在本文中提到時并不互相排斥。

術(shù)語“藥物配制劑”指其形式容許藥物的生物學(xué)活性是有效的，且不含對會接受該配制劑施用的受試者產(chǎn)生不可接受的毒性的別的成分的無菌制備物。

“藥學(xué)可接受載劑”指藥物配制劑中除活性組分以外的組分，它對受試者是無毒的。藥學(xué)可接受載劑包括但不限于緩沖劑，賦形劑，穩(wěn)定劑，或防腐劑。

“試劑盒”指包含至少一種試劑(例如用于治療具有成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的患者的藥物，或用于特異性檢測本發(fā)明的生物標(biāo)志物基因或蛋白質(zhì)的探針)的任何制品(例如包裝或容器)。所述制品優(yōu)選以用于實施本發(fā)明方法的單元來宣傳，分發(fā)，或銷售。

如本文中所使用的，術(shù)語“協(xié)變量”指與患者有關(guān)的某些變量或信息。常常在回歸模型中考慮臨床終點，其中終點代表因變量，而生物標(biāo)志物代表主要或目標(biāo)自變量(回歸量)。如果考慮來自臨床數(shù)據(jù)池的別的變量，那么將它們表示為(臨床)協(xié)變量。

術(shù)語“臨床協(xié)變量”在本文中用于描述關(guān)于患者的所有臨床信息，這一般在基線時是可得的。這些臨床協(xié)變量包括人口統(tǒng)計信息(像性別，年齡，等)，其它病歷(anamnestic)信息，并發(fā)的疾病，伴隨的療法，體檢的結(jié)果，得到的常用實驗室參數(shù)，血管發(fā)生性病癥的已知特性，臨床疾病分期，預(yù)治療的時機和結(jié)果，疾病史，以及可能與對治療的臨床響應(yīng)有關(guān)的所有類似信息。

如本文中所使用的，術(shù)語“原始分析”(raw analysis)或“未調(diào)整的分析”(unadjusted analysis)指如下的回歸分析，其中在所考慮的生物標(biāo)志物之外，在該回歸模型中不使用別的臨床協(xié)變量，無論是作為獨立因素還是作為分層協(xié)變量(stratifying covariate)。

如本文中所使用的，術(shù)語“經(jīng)過協(xié)變量調(diào)整的”指如下的回歸分析，其中在所考慮的生物標(biāo)志物之外，在該回歸模型中還使用別的臨床協(xié)變量，或是作為獨立因素或是作為分層協(xié)變量。

如本文中所使用的，術(shù)語“單變量(univariate)”指如下的回歸模型或圖示法，其中作為自變量，只有一項目標(biāo)生物標(biāo)志物是該模型的一部分。可以在有和沒有別的臨床協(xié)變量的情況中考慮這些單變量模型。

如本文中所使用的，術(shù)語“多變量”指如下的回歸模型或圖示法，其中作為自變量，超過一項目標(biāo)生物標(biāo)志物是該模型的一部分?？梢栽谟泻蜎]有別的臨床協(xié)變量的情況中考慮這些多變量模型。

III.鑒定響應(yīng)VEGF拮抗劑的患者的方法

本發(fā)明提供用于鑒定和/或監(jiān)測很可能對VEGF拮抗劑(例如抗VEGF抗體，例如貝伐珠單抗)療法是響應(yīng)性的患者的方法。該方法格外對于提高對患者施用VEGF拮抗劑(例如抗VEGF抗體，例如貝伐珠單抗)會有效的可能性是有用的。該方法包括檢測來自患者的生物學(xué)樣品中一種或多種遺傳生物標(biāo)志物的表達(dá)，其中一種或多種此類生物標(biāo)志物的表達(dá)指示該患者是否對VEGF拮抗劑(諸如抗VEGF抗體)是敏感或響應(yīng)性的。

更具體地，測定來自患者的樣品中選自AKT3，CDH1，CYP27B1，DNM3，DYNLL1，ERBB3，KLRK1，MBP，MDM2，NCAM1，PDGFRA，PRKCZ，SNCA，TNFRSF21，AXL，BCL2L1，CD36，ETS1，ICAM2，IL17A，IRS2，PDGFRB，RPL13A，TGFB1，TNFRSF4，TNFSF4，和ZBTB16的至少一種基因(1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，或27種基因)的表達(dá)水平對于監(jiān)測該患者是否對VEGF拮抗劑(諸如抗VEGF抗體)是響應(yīng)性或敏感的是有用的。對于任何本文所述方法，例如，可以測定選自AKT3，CDH1，CYP27B1，DNM3，DYNLL1，ERBB3，KLRK1，MBP，MDM2，NCAM1，PDGFRA，PRKCZ，SNCA，和TNFRSF21(“簇2基因)的1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，或14種基因的表達(dá)水平。在一些情況中，對于任何本文所述方法，例如，可以測定選自AXL，BCL2L1，CD36，ETS1，ICAM2，IL17A，IRS2，PDGFRB，RPL13A，TGFB1，TNFRSF4，TNFSF4，和ZBTB16(“簇6基因)的1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，或13種基因的表達(dá)水平。

在一些情況中，對于任何本文所述方法，可以測定簇2和簇6基因中一些或全部的組合的表達(dá)水平。在一個例子中，測定來自患者的樣品中選自AKT3，CDH1，CYP27B1，DNM3，DYNLL1，ERBB3，KLRK1，MBP，MDM2，NCAM1，PDGFRA，PRKCZ，SNCA，和TNFRSF21的1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，或14種基因和至少一種不同基因(例如選自AXL，BCL2L1，CD36，ETS1，ICAM2，IL17A，IRS2，PDGFRB，RPL13A，TGFB1，TNFRSF4，TNFSF4，和ZBTB16的1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，或13種不同基因)的表達(dá)水平對于監(jiān)測患者是否對VEGF拮抗劑(諸如抗VEGF抗體，諸如貝伐珠單抗)是響應(yīng)性或敏感的是有用的。在一個例子中，測定來自患者的樣品中所有27種基因(即AKT3，CDH1，CYP27B1，DNM3，DYNLL1，ERBB3，KLRK1，MBP，MDM2，NCAM1，PDGFRA，PRKCZ，SNCA，TNFRSF21，AXL，BCL2L1，CD36，ETS1，ICAM2，IL17A，IRS2，PDGFRB，RPL13A，TGFB1，TNFRSF4，TNFSF4，和ZBTB16)的表達(dá)水平對于監(jiān)測患者是否對VEGF拮抗劑(諸如抗VEGF抗體，諸如貝伐珠單抗)是響應(yīng)性或敏感的是有用的。

所公開的方法和測定法提供方便，有效，且潛在劃算的手段來獲得可用于評估治療患者的適宜或有效療法的數(shù)據(jù)和信息。例如，患者可在VEGF拮抗劑治療之前和/或之后提供組織樣品(例如腫瘤活檢或血液樣品)，而且可通過多種體外測定法來檢查樣品以確定患者的細(xì)胞是否對VEGF拮抗劑(諸如抗VEGF抗體，諸如貝伐珠單抗)是敏感的。

本發(fā)明還提供用于監(jiān)測患者對VEGF拮抗劑(例如抗VEGF抗體，例如貝伐珠單抗)的敏感性或響應(yīng)性的方法。該方法可以多種測定法形式進(jìn)行，包括檢測基因或蛋白質(zhì)表達(dá)的測定法(諸如PCR和酶免疫測定法)和檢測適宜活性的生物化學(xué)測定法?；颊邩悠分写祟惿飿?biāo)志物的表達(dá)或存在的確定預(yù)示患者是否對VEGF拮抗劑(諸如抗VEGF抗體，諸如貝伐珠單抗)的生物學(xué)效應(yīng)是敏感的。本文中申請人的發(fā)明在于來自具有成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的患者的樣品中選自AKT3，CDH1，CYP27B1，DNM3，DYNLL1，ERBB3，KLRK1，MBP，MDM2，NCAM1，PDGFRA，PRKCZ，SNCA，TNFRSF21，AXL，BCL2L1，CD36，ETS1，ICAM2，IL17A，IRS2，PDGFRB，RPL13A，TGFB1，TNFRSF4，TNFSF4，和ZBTB16的1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，或27種基因的表達(dá)相對于參照水平(包括例如來自正在測試對VEGF拮抗劑的響應(yīng)性的患者組/群體的樣品中生物標(biāo)志物的中值表達(dá)水平或來自具有成膠質(zhì)細(xì)胞瘤且鑒定為不響應(yīng)VEGF拮抗劑治療的患者組/群體的樣品中生物標(biāo)志物的中值表達(dá)水平)的差異或變化(即升高或降低)與VEGF拮抗劑(諸如抗VEGF抗體，諸如貝伐珠單抗)對此類患者的治療有關(guān)。

實施例6顯示了AKT3，CDH1，CYP27B1，DNM3，DYNLL1，ERBB3，KLRK1，MBP，MDM2，NCAM1，PDGFRA，PRKCZ，SNCA，和TNFRSF21中至少一種的表達(dá)水平相對于至少一種所評估的生物標(biāo)志物的參照水平的升高鑒定出很可能響應(yīng)VEGF拮抗劑(諸如抗VEGF抗體，諸如貝伐珠單抗)治療的患者。另外，實施例7顯示了AXL，BCL2L1，CD36，ETS1，ICAM2，IL17A，IRS2，PDGFRB，RPL13A，TGFB1，TNFRSF4，TNFSF4，和ZBTB16中至少一種的表達(dá)水平相對于至少一種所評估的生物標(biāo)志物的參照水平的降低鑒定出很可能響應(yīng)VEGF拮抗劑(諸如抗VEGF抗體，諸如貝伐珠單抗)治療的患者。典型地，至少一種基因的表達(dá)相對于參照水平(例如來自具有成膠質(zhì)細(xì)胞瘤且正在測試對VEGF拮抗劑的響應(yīng)性的患者組/群體的樣品中生物標(biāo)志物的中值表達(dá)水平或來自具有成膠質(zhì)細(xì)胞瘤且鑒定為不響應(yīng)VEGF拮抗劑治療的患者組/群體的樣品中生物標(biāo)志物的中值表達(dá)水平)至少約1.5倍，1.6倍，1.8倍，2倍，3倍，4倍，5倍，6倍，7倍，8倍，9倍，或10倍的差異或變化(即升高或降低)或平均對數(shù)比相對于所測量的基因的均值表達(dá)水平至少約-2，-3，-4，-5，或-6個標(biāo)準(zhǔn)偏差的差異或變化(即升高或降低)指示患者會響應(yīng)VEGF拮抗劑治療或?qū)EGF拮抗劑治療是敏感的。

依照本發(fā)明的方法，特定個體(例如患者)很可能響應(yīng)VEGF拮抗劑治療的可能性可以通過檢測選自AKT3，CDH1，CYP27B1，DNM3，DYNLL1，ERBB3，KLRK1，MBP，MDM2，NCAM1，PDGFRA，PRKCZ，SNCA，TNFRSF21，AXL，BCL2L1，CD36，ETS1，ICAM2，IL17A，IRS2，PDGFRB，RPL13A，TGFB1，TNFRSF4，TNFSF4，和ZBTB16的至少一種基因(例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，或27種基因)的表達(dá)水平并將該基因的表達(dá)水平與參照表達(dá)水平比較來確定。在一些情況中，例如，患者樣品中選自AKT3，CDH1，CYP27B1，DNM3，DYNLL1，ERBB3，KLRK1，MBP，MDM2，NCAM1，PDGFRA，PRKCZ，SNCA，和TNFRSF21的1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，或14種基因的表達(dá)水平相對于參照水平的升高鑒定出很可能響應(yīng)VEGF拮抗劑(諸如抗VEGF抗體，諸如貝伐珠單抗)治療的患者。在一些情況中，例如，患者樣品中選自AXL，BCL2L1，CD36，ETS1，ICAM2，IL17A，IRS2，PDGFRB，RPL13A，TGFB1，TNFRSF4，TNFSF4，和/或ZBTB16的1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，或13種基因的表達(dá)水平相對于參照水平的降低鑒定出很可能響應(yīng)VEGF拮抗劑(諸如抗VEGF抗體，諸如貝伐珠單抗)治療的患者。例如，如上所述，參照表達(dá)水平可以是具有成膠質(zhì)細(xì)胞瘤且正在測試對VEGF拮抗劑(例如抗VEGF抗體，例如貝伐珠單抗)的響應(yīng)性的患者組/群體中至少一種基因的中值表達(dá)水平。在一些實施方案中，參照表達(dá)水平是具有成膠質(zhì)細(xì)胞瘤且鑒定為不響應(yīng)VEGF拮抗劑(例如抗VEGF抗體，例如貝伐珠單抗)治療的患者中至少一種基因的中值表達(dá)水平。在一些實施方案中，參照表達(dá)水平是在在先的時間先前自個體獲得的樣品中至少一種基因的表達(dá)水平。在其它實施方案中，個體是在原發(fā)性腫瘤設(shè)置中接受在先VEGF拮抗劑治療的患者。在一些實施方案中，個體是正在經(jīng)歷轉(zhuǎn)移的患者。將至少一種本文所述生物標(biāo)志物基因具有大于或小于參照表達(dá)水平的表達(dá)水平的個體鑒定為很可能響應(yīng)VEGF拮抗劑治療的受試者/患者。將相對于(即高于或低于)中值展現(xiàn)例如50％，45％，40％，35％，30％，25％，20％，15％，10％，或5％基因表達(dá)水平(例如平均/均值基因表達(dá)水平)的受試者/患者鑒定為很可能響應(yīng)VEGF拮抗劑(例如抗VEGF抗體，例如貝伐珠單抗)治療的患者。可以告知受試者/患者他們具有升高的可能性對VEGF拮抗劑治療是響應(yīng)性的和/或提供抗癌療法包括VEGF拮抗劑的推薦。基因表達(dá)水平可以使用本領(lǐng)域已知的及例如Sokal,R.R.and Rholf,F.J.(1995)“Biometry:the principles and practice of statistics in biological research,”W.H.Freeman and Co.New York,NY中記載的方法使用至少一種本文所述生物標(biāo)志物基因或本文所述生物標(biāo)志物基因的任何線性組合(例如均值，加權(quán)均值，或中值)來測定。

在一個方面，本發(fā)明提供確定具有成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的患者是否會響應(yīng)VEGF拮抗劑(諸如抗VEGF抗體，例如貝伐珠單抗)治療的方法，包括作為生物標(biāo)志物評估(i)在任何VEGF拮抗劑施用于患者之前，或(ii)在此類治療之前和之后獲得的來自患者的樣品中選自AKT3，CDH1，CYP27B1，DNM3，DYNLL1，ERBB3，KLRK1，MBP，MDM2，NCAM1，PDGFRA，PRKCZ，SNCA，TNFRSF21，AXL，BCL2L1，CD36，ETS1，ICAM2，IL17A，IRS2，PDGFRB，RPL13A，TGFB1，TNFRSF4，TNFSF4，和ZBTB16的至少一種基因(例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，或27種基因)的表達(dá)。至少一種基因的表達(dá)相對于參照水平(見上文)的變化(即升高或降低)指示患者會很可能響應(yīng)VEGF拮抗劑(諸如抗VEGF抗體，例如貝伐珠單抗)治療。在一些情況中，例如，患者樣品中選自AKT3，CDH1，CYP27B1，DNM3，DYNLL1，ERBB3，KLRK1，MBP，MDM2，NCAM1，PDGFRA，PRKCZ，SNCA，和TNFRSF21的1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，或14種基因的表達(dá)水平相對于參照水平的升高鑒定出很可能響應(yīng)VEGF拮抗劑(諸如抗VEGF抗體，諸如貝伐珠單抗)治療的患者。在一些情況中，例如，患者樣品中選自AXL，BCL2L1，CD36，ETS1，ICAM2，IL17A，IRS2，PDGFRB，RPL13A，TGFB1，TNFRSF4，TNFSF4，和/或ZBTB16的1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，或13種基因的表達(dá)水平相對于參照水平的降低鑒定出很可能響應(yīng)VEGF拮抗劑(諸如抗VEGF抗體，諸如貝伐珠單抗)治療的患者?？筛嬷颊咚麄兙哂猩叩目赡苄皂憫?yīng)VEGF拮抗劑治療和/或提供抗癌療法包括VEGF拮抗劑的推薦。

在另一個方面，本發(fā)明提供為具有成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的患者優(yōu)化抗癌療法的治療功效的方法，包括作為生物標(biāo)志物檢測(i)在任何VEGF拮抗劑施用于患者之前，或(ii)在此類治療之前和之后獲得的來自患者的樣品中選自AKT3，CDH1，CYP27B1，DNM3，DYNLL1，ERBB3，KLRK1，MBP，MDM2，NCAM1，PDGFRA，PRKCZ，SNCA，TNFRSF21，AXL，BCL2L1，CD36，ETS1，ICAM2，IL17A，IRS2，PDGFRB，RPL13A，TGFB1，TNFRSF4，TNFSF4，和ZBTB16的至少一種基因(例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，或27種基因)的表達(dá)。至少一種基因的表達(dá)相對于參照水平(見上文)的變化(即升高或降低)指示患者會很可能響應(yīng)VEGF拮抗劑(諸如抗VEGF抗體，例如貝伐珠單抗)治療。在一些情況中，例如，患者樣品中選自AKT3，CDH1，CYP27B1，DNM3，DYNLL1，ERBB3，KLRK1，MBP，MDM2，NCAM1，PDGFRA，PRKCZ，SNCA，和TNFRSF21的1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，或14種基因的表達(dá)水平相對于參照水平的升高鑒定出很可能響應(yīng)VEGF拮抗劑(諸如抗VEGF抗體，諸如貝伐珠單抗)治療的患者。在一些情況中，例如，患者樣品中選自AXL，BCL2L1，CD36，ETS1，ICAM2，IL17A，IRS2，PDGFRB，RPL13A，TGFB1，TNFRSF4，TNFSF4，和/或ZBTB16的1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，或13種基因的表達(dá)水平相對于參照水平的降低鑒定出很可能響應(yīng)VEGF拮抗劑(諸如抗VEGF抗體，諸如貝伐珠單抗)治療的患者?？筛嬷颊咚麄兙哂猩叩目赡苄皂憫?yīng)VEGF拮抗劑治療和/或提供抗癌療法包括VEGF拮抗劑的推薦。

在另一個方面，本發(fā)明提供為具有成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的患者選擇療法的方法，包括作為生物標(biāo)志物檢測(i)在任何VEGF拮抗劑施用于患者之前，或(ii)在此類治療之前和之后獲得的來自患者的樣品中選自AKT3，CDH1，CYP27B1，DNM3，DYNLL1，ERBB3，KLRK1，MBP，MDM2，NCAM1，PDGFRA，PRKCZ，SNCA，TNFRSF21，AXL，BCL2L1，CD36，ETS1，ICAM2，IL17A，IRS2，PDGFRB，RPL13A，TGFB1，TNFRSF4，TNFSF4，和ZBTB16的至少一種基因(例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，或27種基因)的表達(dá)。至少一種基因的表達(dá)相對于參照水平(見上文)的變化(即升高或降低)指示患者會很可能響應(yīng)VEGF拮抗劑(諸如抗VEGF抗體，例如貝伐珠單抗)治療。在一些情況中，例如，患者樣品中選自AKT3，CDH1，CYP27B1，DNM3，DYNLL1，ERBB3，KLRK1，MBP，MDM2，NCAM1，PDGFRA，PRKCZ，SNCA，和TNFRSF21的1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，或14種基因的表達(dá)水平相對于參照水平的升高鑒定出很可能響應(yīng)VEGF拮抗劑(諸如抗VEGF抗體，諸如貝伐珠單抗)治療的患者。在一些情況中，例如，患者樣品中選自AXL，BCL2L1，CD36，ETS1，ICAM2，IL17A，IRS2，PDGFRB，RPL13A，TGFB1，TNFRSF4，TNFSF4，和/或ZBTB16的1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，或13種基因的表達(dá)水平相對于參照水平的降低鑒定出很可能響應(yīng)VEGF拮抗劑(諸如抗VEGF抗體，諸如貝伐珠單抗)治療的患者。如果患者鑒定為很可能響應(yīng)VEGF拮抗劑治療的話，可以選擇包括VEGF拮抗劑(例如抗VEGF抗體，例如貝伐珠單抗)的療法，并且可以對患者提供所選擇的包括VEGF拮抗劑的療法的推薦。

在另一個實施方案中，本發(fā)明提供監(jiān)測患者對VEGF拮抗劑(諸如抗VEGF抗體)的敏感性或響應(yīng)性的方法。此方法包括評估來自患者的樣品中選自AKT3，CDH1，CYP27B1，DNM3，DYNLL1，ERBB3，KLRK1，MBP，MDM2，NCAM1，PDGFRA，PRKCZ，SNCA，TNFRSF21，AXL，BCL2L1，CD36，ETS1，ICAM2，IL17A，IRS2，PDGFRB，RPL13A，TGFB1，TNFRSF4，TNFSF4，和ZBTB16的至少一種基因(例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，或27種基因)的基因表達(dá)，并預(yù)測患者對VEGF拮抗劑(諸如抗VEGF抗體，例如貝伐珠單抗)的敏感性或響應(yīng)性，其中選自AKT3，CDH1，CYP27B1，DNM3，DYNLL1，ERBB3，KLRK1，MBP，MDM2，NCAM1，PDGFRA，PRKCZ，SNCA，TNFRSF21，AXL，BCL2L1，CD36，ETS1，ICAM2，IL17A，IRS2，PDGFRB，RPL13A，TGFB1，TNFRSF4，TNFSF4，和ZBTB16的至少一種基因的表達(dá)的變化(即升高或降低)與患者對有效VEGF拮抗劑治療的敏感性或響應(yīng)性有關(guān)。依照此方法的一個實施方案，生物學(xué)樣品是在施用任何VEGF拮抗劑之前自患者獲得的，并且提交評估樣品中至少一種基因的表達(dá)產(chǎn)物的水平的測定法。如果選自AKT3，CDH1，CYP27B1，DNM3，DYNLL1，ERBB3，KLRK1，MBP，MDM2，NCAM1，PDGFRA，PRKCZ，SNCA，TNFRSF21，AXL，BCL2L1，CD36，ETS1，ICAM2，IL17A，IRS2，PDGFRB，RPL13A，TGFB1，TNFRSF4，TNFSF4，和ZBTB16的至少一種基因的表達(dá)相對于參照水平(例如見上文)有變化(即升高或降低)的話，確定患者對VEGF拮抗劑(諸如抗VEGF抗體)治療是敏感或響應(yīng)性的。在一些情況中，例如，患者樣品中選自AKT3，CDH1，CYP27B1，DNM3，DYNLL1，ERBB3，KLRK1，MBP，MDM2，NCAM1，PDGFRA，PRKCZ，SNCA，和TNFRSF21的1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，或14種基因的表達(dá)水平相對于參照水平的升高鑒定出很可能響應(yīng)VEGF拮抗劑(諸如抗VEGF抗體，諸如貝伐珠單抗)治療的患者。在一些情況中，例如，患者樣品中選自AXL，BCL2L1，CD36，ETS1，ICAM2，IL17A，IRS2，PDGFRB，RPL13A，TGFB1，TNFRSF4，TNFSF4，和/或ZBTB16的1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，或13種基因的表達(dá)水平相對于參照水平的降低鑒定出很可能響應(yīng)VEGF拮抗劑(諸如抗VEGF抗體，諸如貝伐珠單抗)治療的患者?？筛嬷颊咚麄兙哂猩叩目赡苄詫EGF拮抗劑治療是敏感或響應(yīng)性的和/或提供抗癌療法包括VEGF拮抗劑的推薦。在此方法的另一個實施方案中，生物學(xué)樣品是在施用本文所述VEGF拮抗劑之前和之后自患者獲得的。

在又一個方面，本發(fā)明提供治療具有成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的患者的方法，該方法包括對該患者施用VEGF拮抗劑，其中該患者已經(jīng)預(yù)先測定為具有選自AKT3，CDH1，CYP27B1，DNM3，DYNLL1，ERBB3，KLRK1，MBP，MDM2，NCAM1，PDGFRA，PRKCZ，SNCA，TNFRSF21，AXL，BCL2L1，CD36，ETS1，ICAM2，IL17A，IRS2，PDGFRB，RPL13A，TGFB1，TNFRSF4，TNFSF4，和ZBTB16的至少一種基因(例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，或27種基因)的表達(dá)水平相對于該至少一種基因的參照表達(dá)水平的變化。

在還有又一個方面，本發(fā)明提供為具有成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的患者優(yōu)化抗癌療法的治療功效的方法，其中該患者已經(jīng)預(yù)先測定為具有選自AKT3，CDH1，CYP27B1，DNM3，DYNLL1，ERBB3，KLRK1，MBP，MDM2，NCAM1，PDGFRA，PRKCZ，SNCA，TNFRSF21，AXL，BCL2L1，CD36，ETS1，ICAM2，IL17A，IRS2，PDGFRB，RPL13A，TGFB1，TNFRSF4，TNFSF4，和ZBTB16的至少一種基因(例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，或27種基因)的表達(dá)水平相對于該至少一種基因的參照表達(dá)水平的變化，且該方法包括基于預(yù)先測定的至少一種基因的表達(dá)水平的變化對該患者提供抗癌療法包括VEGF拮抗劑的推薦。在一些情況中，第八個方面的方法可進(jìn)一步包括對該患者提供抗癌療法包括VEGF拮抗劑的推薦。

在仍有又一個方面，本發(fā)明提供為具有成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的患者選擇療法的方法，其中該患者已經(jīng)預(yù)先測定為具有選自AKT3，CDH1，CYP27B1，DNM3，DYNLL1，ERBB3，KLRK1，MBP，MDM2，NCAM1，PDGFRA，PRKCZ，SNCA，TNFRSF21，AXL，BCL2L1，CD36，ETS1，ICAM2，IL17A，IRS2，PDGFRB，RPL13A，TGFB1，TNFRSF4，TNFSF4，和ZBTB16的至少一種基因(例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，或27種基因)的表達(dá)水平相對于該至少一種基因的參照表達(dá)水平的變化，且該方法包括基于預(yù)先測定的至少一種基因的表達(dá)水平的變化選擇包含VEGF拮抗劑的療法并對該患者推薦選擇的包含VEGF拮抗劑的療法。在一些實施方案中，第九個方面的方法可進(jìn)一步包括對該患者提供抗癌療法包括VEGF拮抗劑的推薦。

在任何前述方法中，該變化可以是至少一種基因的表達(dá)水平相對于參照水平的升高，且該至少一種基因(例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，或14種基因)可以是AKT3，CDH1，CYP27B1，DNM3，DYNLL1，ERBB3，KLRK1，MBP，MDM2，NCAM1，PDGFRA，PRKCZ，SNCA，和/或TNFRSF21。在一些實施方案中，該方法進(jìn)一步包括基于AKT3，CDH1，CYP27B1，DNM3，DYNLL1，ERBB3，KLRK1，MBP，MDM2，NCAM1，PDGFRA，PRKCZ，SNCA，和/或TNFRSF21的表達(dá)水平的升高施用VEGF拮抗劑。

在任何前述方法中，該變化可以是至少一種基因的表達(dá)水平相對于參照水平的降低，且該至少一種基因(例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，或13種基因)可以是AXL，BCL2L1，CD36，ETS1，ICAM2，IL17A，IRS2，PDGFRB，RPL13A，TGFB1，TNFRSF4，TNFSF4，和/或ZBTB16。在一些實施方案中，該方法進(jìn)一步包括基于AXL，BCL2L1，CD36，ETS1，ICAM2，IL17A，IRS2，PDGFRB，RPL13A，TGFB1，TNFRSF4，TNFSF4，和/或ZBTB16的表達(dá)水平的降低施用VEGF拮抗劑。

在任何前述方法的一些實施方案中，該患者可以在具有成膠質(zhì)細(xì)胞瘤且正在測試對VEGF拮抗劑的響應(yīng)性的患者群體中且該參照水平是該患者群體中該至少一種基因的中值表達(dá)水平。在一些情況中，該參照水平可以是具有成膠質(zhì)細(xì)胞瘤且鑒定為不響應(yīng)VEGF拮抗劑治療的患者中該至少一種基因的中值表達(dá)水平。

任何前述方法可以進(jìn)一步包括對該患者施用VEGF拮抗劑。在一些情況中，施用的VEGF拮抗劑可以是抗VEGF抗體，例如結(jié)合A4.6.1表位的抗VEGF抗體，貝伐珠單抗，或包含可變重鏈(VH)和可變輕鏈(VL)的抗VEGF抗體，其中所述VH具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列且所述VL具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列。

在任何前述方法中，該方法可以進(jìn)一步包括對該患者施用：(i)選自抗腫瘤劑，化療劑，生長抑制劑，和細(xì)胞毒劑的藥劑，(ii)放療，或(iii)其組合。在一些實施方案中，施用的化療劑是替莫唑胺(TMZ)。

在任何前述方法中，該患者可以具有非前神經(jīng)(proneural)型成膠質(zhì)細(xì)胞瘤。

醫(yī)學(xué)領(lǐng)域(特別是關(guān)于診斷測試和治療劑治療的應(yīng)用)技術(shù)人員會認(rèn)識到，生物學(xué)系統(tǒng)有些易變，而且并非總是全然可預(yù)測的，而且因此許多較好的診斷測試或治療劑偶爾無效。如此，最終由主治內(nèi)科醫(yī)師的判斷來為患者個體決定最適宜的治療過程，這基于測試結(jié)果，患者狀況和歷史，及他或她自己的經(jīng)驗來做出。例如，甚至?xí)羞@樣的情況，即使根據(jù)來自診斷測試的或來自其它標(biāo)準(zhǔn)的數(shù)據(jù)，沒有預(yù)測出患者會對VEGF拮抗劑特別敏感，內(nèi)科醫(yī)師也會選擇用VEGF拮抗劑(諸如抗VEGF抗體，例如貝伐珠單抗)來治療患者，特別是如果所有或大多數(shù)其它明顯的治療選項已經(jīng)失敗，或者如果與另一種治療一起給予時預(yù)見有一些協(xié)同性。

在進(jìn)一步表述的實施方案中，本發(fā)明提供一種預(yù)測患者對VEGF拮抗劑(諸如抗VEGF抗體，例如貝伐珠單抗)治療的敏感性或預(yù)測患者是否會有效響應(yīng)VEGF拮抗劑治療的方法，包括評估樣品中表達(dá)的本文中鑒定的一種或多種遺傳生物標(biāo)志物的水平；并預(yù)測患者對VEGF拮抗劑所致抑制的敏感性，其中一種或多種這些遺傳生物標(biāo)志物的表達(dá)水平與患者有效響應(yīng)VEGF拮抗劑治療的高敏感性有關(guān)。

樣品可以取自懷疑具有或診斷具有成膠質(zhì)細(xì)胞瘤，因此很可能需要治療的患者或沒有懷疑具有任何病癥的正常個體。為了評估標(biāo)志物表達(dá)，可以在本發(fā)明的方法中使用患者樣品(諸如那些含有細(xì)胞的，或由這些細(xì)胞生成的蛋白質(zhì)或核酸)。在本發(fā)明的方法中，生物標(biāo)志物的水平可通過評估樣品(優(yōu)選組織樣品，例如腫瘤組織樣品，諸如活檢)中標(biāo)志物的量(例如絕對量或濃度)來確定。另外，可以在含有可檢測水平的生物標(biāo)志物的體液或分泌物中評估生物標(biāo)志物的水平。可用作本發(fā)明中樣品的體液或分泌物包括例如血液，尿液，唾液，糞便，胸水，淋巴液，痰，腹水，前列腺液，腦脊液(CSF)，或任何其它身體分泌物或其衍生物。詞語“血液”意圖包括全血，血漿，血清，或任何血液衍生物。此類體液或分泌物中生物標(biāo)志物的評估在侵入性取樣方法不適宜或不方便的情況中有時可以是優(yōu)選的。然而，在樣品是體液的情況中，本文中要測試的樣品優(yōu)選血液，滑膜組織，或滑液，最優(yōu)選血液。

樣品可以是冷凍的，新鮮的，固定的(例如福爾馬林固定的)，離心的，和/或包埋的(例如石蠟包埋的)，等。當(dāng)然，細(xì)胞樣品可以在評估樣品中標(biāo)志物的量之前進(jìn)行多種公知的收集后準(zhǔn)備和保存技術(shù)(例如核酸和/或蛋白質(zhì)提取，固定，保存，冷凍，超濾，濃縮，蒸發(fā)，離心，等)。同樣，活檢物也可進(jìn)行收集后準(zhǔn)備和保存技術(shù)，例如固定。

在本文所述任何方法中，可以告知個體(例如患者/受試者)升高的或降低的可能性對VEGF拮抗劑(例如抗VEGF抗體，例如貝伐珠單抗)治療是敏感或響應(yīng)性的；提供抗癌療法(例如包括或不包括VEGF拮抗劑的抗癌療法)的推薦；和/或選擇合適的療法(例如VEGF拮抗劑和/或其它抗血管發(fā)生劑)。

A.基因表達(dá)的檢測

本文中描述的遺傳生物標(biāo)志物可以使用本領(lǐng)域已知的任何方法來檢測。例如，可以使用Northern，點印跡，或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)分析，陣列雜交，RNA酶保護(hù)測定法，或使用商品化的DNA SNP芯片微陣列(包括DNA微陣列急射(snapshot))方便地對來自哺乳動物的組織或細(xì)胞樣品測定例如來自感興趣遺傳生物標(biāo)志物的mRNA或DNA。例如，實時PCR(RT-PCR)測定法(諸如定量PCR測定法)是本領(lǐng)域公知的。在本發(fā)明的一個例示性實施方案中，用于檢測生物學(xué)樣品(諸如腫瘤樣品，例如成膠質(zhì)細(xì)胞瘤腫瘤樣品)中來自感興趣遺傳生物標(biāo)志物的mRNA的方法包括使用至少一種引物通過逆轉(zhuǎn)錄自樣品生成cDNA；擴(kuò)增如此生成的cDNA；并檢測擴(kuò)增cDNA的存在。另外，此類方法可以包括一個或多個如下步驟，其容許測定生物學(xué)樣品中mRNA的水平(例如通過同時檢查“持家”基因(諸如肌動蛋白家族成員)的比較性對照mRNA序列的水平)。任選的是，可以測定擴(kuò)增cDNA的序列。

1.核酸的檢測

在一個具體的實施方案中，本文所述生物標(biāo)志物基因的表達(dá)可通過RT-PCR技術(shù)來實施。用于PCR的探針可以用可檢測標(biāo)記物標(biāo)記，諸如例如放射性同位素，發(fā)熒光化合物，生物發(fā)光化合物，化學(xué)發(fā)光化合物，金屬螯合物，或酶。此類探針和引物可用于檢測樣品中選自AKT3，CDH1，CYP27B1，DNM3，DYNLL1，ERBB3，KLRK1，MBP，MDM2，NCAM1，PDGFRA，PRKCZ，SNCA，TNFRSF21，AXL，BCL2L1，CD36，ETS1，ICAM2，IL17A，IRS2，PDGFRB，RPL13A，TGFB1，TNFRSF4，TNFSF4，和ZBTB16的1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，或27種基因的存在。正如熟練技術(shù)人員會理解的，可制備極其多種不同引物和探針，并有效用于擴(kuò)增，克隆，和/或測定表達(dá)的上文所列一種或多種基因的存在和/或水平。

其它方法包括通過微陣列技術(shù)檢驗或檢測組織(例如腫瘤組織，例如成膠質(zhì)細(xì)胞瘤腫瘤組織)或細(xì)胞樣品中來自選自AKT3，CDH1，CYP27B1，DNM3，DYNLL1，ERBB3，KLRK1，MBP，MDM2，NCAM1，PDGFRA，PRKCZ，SNCA，TNFRSF21，AXL，BCL2L1，CD36，ETS1，ICAM2，IL17A，IRS2，PDGFRB，RPL13A，TGFB1，TNFRSF4，TNFSF4，和/或ZBTB16的至少一種基因(例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，或27種基因)的mRNA的方案。使用核酸微陣列，逆轉(zhuǎn)錄并標(biāo)記來自測試和對照組織樣品的測試和對照mRNA樣品以生成cDNA探針。然后使探針雜交至在固體支持物上固定化的核酸陣列。該陣列配置成該陣列的每個成員的序列和位置是已知的。例如，可以將在某些疾病狀態(tài)中潛在表達(dá)的基因選集在固體支持物上排列成陣列。經(jīng)過標(biāo)記的探針與特定陣列成員的雜交指示衍生該探針的樣品表達(dá)該基因。疾病組織的差異基因表達(dá)分析能提供有價值的信息。微陣列技術(shù)利用核酸雜交技術(shù)和計算技術(shù)在一個實驗內(nèi)評估數(shù)以千計的基因的mRNA表達(dá)概況(參見例如WO 2001/75166)。關(guān)于陣列制作的討論，參見例如美國專利No.5,700,637；美國專利No.5,445,934；和美國專利No.5,807,522；Lockart,Nature Biotechnology,14:1675-1680(1996)；及Cheung et al.,Nature Genetics21(Suppl):15-19(1999)。

另外，可采用利用EP 1753878中記載的微陣列進(jìn)行的DNA概況分析和檢測方法。此方法利用短串聯(lián)重復(fù)(STR)分析和DNA微陣列快速鑒定和區(qū)分不同DNA序列。在一個實施方案中，使經(jīng)過標(biāo)記的STR靶序列雜交至攜帶互補探針的DNA微陣列。這些探針長度不同以覆蓋可能STR的范圍。利用雜交后酶促消化自微陣列表面選擇性去除DNA雜合物的帶標(biāo)記物的單鏈區(qū)。根據(jù)仍然雜交至微陣列的靶DNA的樣式來推導(dǎo)未知靶物中重復(fù)的數(shù)目。

微陣列處理器的一個例子是Affymetrix系統(tǒng)，它是商品化的且包含通過在玻璃表面上直接合成寡核苷酸而制作的陣列?？墒褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員知道的其它系統(tǒng)。

在RT-PCR或其它基于PCR的方法以外，用于測定生物標(biāo)志物水平的其它方法包括蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，以及個性化遺傳概況，這是在分子水平根據(jù)患者響應(yīng)治療血管發(fā)生性病癥所必需的。本文中的專門化微陣列(例如寡核苷酸微陣列或cDNA微陣列)可包含一種或多種生物標(biāo)志物，其具有與對一種或多種抗VEGF抗體的敏感性或耐藥性有關(guān)的表達(dá)概況。供本發(fā)明中使用的可用于檢測核酸的其它方法牽涉高通量RNA序列表達(dá)分析，包括基于RNA的基因組分析，諸如例如RNASeq。

許多參考文獻(xiàn)是可獲得的，它們提供了應(yīng)用上述技術(shù)的指導(dǎo)(Kohler et al.,Hybridoma Techniques(Cold Spring Harbor Laboratory,New York,1980)；Tijssen,Practice and Theory of Enzyme Inimunoassays(Elsevier,Amsterdam,1985)；Campbell,Monoclonal Antibody Technology(Elsevier,Amsterdam,1984)；Hurrell,Monoclonal Hybridoma Antibodies:Techniques and Applications(CRC Press,Boca Raton,FL,1982)；及Zola,Monoclonal Antibodies:A Manual of Techniques,pp.147-158(CRC Press,Inc.,1987))。Northern印跡分析是本領(lǐng)域公知的一種便利的技術(shù)，記載于例如Molecular Cloning,a Laboratory Manual,第2版,1989,Sambrook,Fritch,Maniatis,Cold Spring Harbor Press,10Skyline Drive,Plainview,NY 11803-2500。用于評估基因和基因產(chǎn)物的狀態(tài)的典型方案可見于例如Ausubel et al.編,1995,Current Protocols In Molecular Biology,單元2(Northern印跡)，單元4(Southern印跡)，單元15(免疫印跡)和單元18(PCR分析)。

2.蛋白質(zhì)的檢測

關(guān)于檢測蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物，諸如與選自AKT3，CDH1，CYP27B1，DNM3，DYNLL1，ERBB3，KLRK1，MBP，MDM2，NCAM1，PDGFRA，PRKCZ，SNCA，TNFRSF21，AXL，BCL2L1，CD36，ETS1，ICAM2，IL17A，IRS2，PDGFRB，RPL13A，TGFB1，TNFRSF4，TNFSF4，和ZBTB16的至少一種基因(例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，或27種基因))對應(yīng)的蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物，例如多種蛋白質(zhì)測定法是可獲得的，包括例如基于抗體的方法以及質(zhì)譜術(shù)和本領(lǐng)域已知的其它類似手段。在基于抗體的方法的情況中，例如，可以在足以形成抗體-生物標(biāo)志物復(fù)合物的條件下使樣品接觸對所述生物標(biāo)志物特異性的抗體，然后檢測所述復(fù)合物。蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物的存在的檢測可以以許多方式來實現(xiàn)，諸如通過用于測定多種組織和樣品(包括血漿或血清)的Western印跡(含或不含免疫沉淀)，2維SDS-PAGE，免疫沉淀，熒光激活細(xì)胞分選(FACS)，流式細(xì)胞術(shù)，和ELISA規(guī)程。使用此類測定法形式的一系列免疫測定技術(shù)是可獲得的，參見例如美國專利No.4,016,043，4,424,279及4,018,653。這些包括非競爭類型的單個位點和兩個位點或“三明治式”測定法，以及傳統(tǒng)的競爭性結(jié)合測定法二者。這些測定法也包括經(jīng)標(biāo)記抗體對靶生物標(biāo)志物的直接結(jié)合。

三明治式測定法是最有用且最常用的測定法之一。三明治式測定技術(shù)存在許多變化形式，本發(fā)明意圖涵蓋所有的變化形式。簡言之，在一種典型的正向測定法(forward assay)中，將未標(biāo)記的抗體固定化于固體基片上，并使待測試的樣品與結(jié)合的分子接觸。溫育合適的一段時間后，即足以容許抗體-抗原復(fù)合體形成的一段時間，然后添加經(jīng)能夠產(chǎn)生可檢測信號的報道分子標(biāo)記的，對所述抗原特異性的第二抗體，并溫育，容許足以形成抗體-抗原-經(jīng)標(biāo)記抗體的另一種復(fù)合體的時間。洗掉任何未反應(yīng)的物質(zhì)，并通過觀察由所述報道分子產(chǎn)生的信號來測定所述抗原的存在。結(jié)果可以是定性的(通過對可視信號的簡單觀察來進(jìn)行)，或者可以是定量的(通過與含有已知量的生物標(biāo)志物的對照樣品比較來進(jìn)行)。

正向測定法上的變化包括同時測定法(simultaneous assay)，其中同時將樣品和經(jīng)標(biāo)記的抗體兩者添加至結(jié)合的抗體。這些技術(shù)對本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的，包括會容易明白的任何微小變化。在一種典型的正向三明治式測定法中，將具有對所述生物標(biāo)志物特異性的第一抗體或是共價地或是被動地結(jié)合至固體表面。典型地，所述固體表面是玻璃或聚合物，最常用的聚合物是纖維素，聚丙烯酰胺，尼龍，聚苯乙烯，聚氯乙烯或聚丙烯。固體支持物可以采用試管，珠，微量板盤的形式，或者適于進(jìn)行免疫測定法的任何其它表面。結(jié)合過程是本領(lǐng)域公知的，并且一般包括交聯(lián)，共價結(jié)合，或物理吸附，清洗聚合物-抗體復(fù)合體，為測試樣品做好準(zhǔn)備。然后將測試樣品的等分試樣添加至固相復(fù)合體，并在合適的條件(例如從室溫至40℃，諸如25℃和32℃之間，包括端點在內(nèi))下溫育足夠的一段時間(例如2-40分鐘或者過夜，如果更方便的話)，容許抗體中存在的任何亞基結(jié)合。溫育期后，清洗抗體亞基固相，干燥，并與對生物標(biāo)志物一部分特異性的第二抗體一起溫育。所述第二抗體連接有用于指示第二抗體對分子標(biāo)志物結(jié)合的報道分子。

一種備選的方法包括將樣品中的靶生物標(biāo)志物固定化，然后使固定化的靶物暴露于特異性抗體，該特異性抗體可以是或不是經(jīng)報道分子標(biāo)記的。根據(jù)靶物的量和報道分子信號的強度，可以通過用所述抗體直接標(biāo)記，使結(jié)合的靶物變成可檢測的?；蛘撸箤Φ谝豢贵w特異性的經(jīng)標(biāo)記第二抗體暴露于靶物-第一抗體復(fù)合體以形成靶物-第一抗體-第二抗體三元復(fù)合體。通過報道分子所發(fā)出的信號檢測所述復(fù)合體。如本說明書中使用的，“報道分子”指通過其化學(xué)性質(zhì)提供分析上可鑒定的信號的分子，所述信號容許結(jié)合至抗原的抗體的檢測。這種類型的測定法中最常用的報道分子是酶，熒光團(tuán)，或含發(fā)射性核素的分子(即放射性同位素)和化學(xué)發(fā)光分子。

在酶免疫測定法的情況中，酶是綴合至第二抗體的，一般藉由戊二醛或高碘酸鹽進(jìn)行。然而，會容易認(rèn)可的是，存在極其多種不同的綴合技術(shù)，它們對技術(shù)人員是輕易可獲得的。常用的酶包括辣根過氧化物酶，葡萄糖氧化酶，β-半乳糖苷酶，和堿性磷酸酶等。一般選擇與特定酶一起使用的底物以在相應(yīng)酶的水解作用后產(chǎn)生可檢測的顏色變化。合適酶的例子包括堿性磷酸酶和過氧化物酶。還可能采用產(chǎn)生發(fā)熒光產(chǎn)物的熒光底物而不是上文所記錄的顯色底物。在所有情況中，將酶標(biāo)記的抗體添加至第一抗體-分子標(biāo)志物復(fù)合體，容許結(jié)合，然后洗掉過量的試劑。然后將含有合適底物的溶液添加至抗體-抗原-抗體復(fù)合體。底物會與連接至第二抗體的酶起反應(yīng)，給出定性的視覺信號，其可以被進(jìn)一步地定量(通常通過分光光度法)以給出存在于樣品中的生物標(biāo)志物的量的指標(biāo)?；蛘撸l(fā)熒光化合物(諸如熒光素和羅丹明)可以以化學(xué)方法偶聯(lián)至抗體，而不改變所述抗體的結(jié)合能力。通過使用特定波長的光線照射來激發(fā)時，熒光染料標(biāo)記的抗體吸收光能，在分子中誘導(dǎo)激發(fā)態(tài)，接著發(fā)出光線，其特征性顏色是用光學(xué)顯微鏡在視覺上可檢測的。如在EIA中那樣，容許熒光標(biāo)記的抗體結(jié)合至第一抗體-分子標(biāo)志物復(fù)合體。洗掉未結(jié)合的試劑后，然后使剩余的三元復(fù)合體暴露于適當(dāng)波長的光線，觀察到的熒光表明感興趣的分子標(biāo)志物的存在。免疫熒光和EIA技術(shù)在本領(lǐng)域中都是非常完善建立的。然而，還可以采用其它報道分子，諸如放射性同位素，化學(xué)發(fā)光或生物發(fā)光分子。

B.試劑盒

為了用于檢測生物標(biāo)志物，本發(fā)明還提供了試劑盒或制品。此類試劑盒可用于確定患者是否可受益于VEGF拮抗劑(例如抗VEGF抗體，例如貝伐珠單抗)的治療。這些試劑盒可以包含能夠測定選自AKT3，CDH1，CYP27B1，DNM3，DYNLL1，ERBB3，KLRK1，MBP，MDM2，NCAM1，PDGFRA，PRKCZ，SNCA，TNFRSF21，AXL，BCL2L1，CD36，ETS1，ICAM2，IL17A，IRS2，PDGFRB，RPL13A，TGFB1，TNFRSF4，TNFSF4，和ZBTB16的至少一種基因(例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，或27種基因)的表達(dá)水平的多肽或多核苷酸。如果至少一種上述基因的表達(dá)相對于參照水平(例如見上文)有變化(即升高或降低)或不同于參照水平(例如見上文)，那么患者可受益于VEGF拮抗劑(諸如抗VEGF抗體，例如貝伐珠單抗)治療。隨后可以告知患者他們具有升高的可能性對VEGF拮抗劑是敏感或響應(yīng)性的和/或提供抗癌療法包括VEGF拮抗劑的推薦。

這些試劑盒可包括裝載裝置，裝載裝置被分成小格以接納緊密排列的一個或多個容器裝置，諸如管形瓶，管，等，每個容器裝置裝有所述方法中要使用的不同化合物或成分之一。例如，所述容器裝置之一可以裝有可檢測標(biāo)記的或可以可檢測標(biāo)記的探針。此類探針可以是分別對蛋白質(zhì)或信使(message)特異性的多肽(例如抗體)或多核苷酸。若試劑盒利用核酸雜交來檢測靶核酸，則試劑盒還可具有裝有用于擴(kuò)增靶核酸序列的核苷酸的容器和/或裝有報告手段(諸如結(jié)合至報告分子(諸如酶，熒光，或放射性同位素標(biāo)記物)的生物素結(jié)合蛋白，例如親合素或鏈霉親合素)的容器。

此類試劑盒通常會包括上文所述容器和一個或多個其它容器，其中裝有從商業(yè)和使用者立場看想要的材料，包括緩沖劑，稀釋劑，濾器，針頭，注射器，和印有使用說明的包裝插頁。容器上可存在標(biāo)簽，指示該組合物用于具體的應(yīng)用，而且還可指示體內(nèi)或體外使用的說明，諸如上文所描述的那些。

本發(fā)明的試劑盒有許多實施方案。一個典型的實施方案是一種試劑盒，包括容器，所述容器上的標(biāo)簽，和裝在所述容器內(nèi)的組合物，其中所述組合物包括結(jié)合蛋白質(zhì)或自身抗體生物標(biāo)志物的一抗，而且所述容器上的標(biāo)簽指示該組合物可用于評估樣品中此類蛋白質(zhì)或抗體的存在情況，且其中所述試劑盒包括說明書，其關(guān)于使用該抗體來評估特定樣品類型中生物標(biāo)志物蛋白質(zhì)的存在情況。所述試劑盒可進(jìn)一步包括一套用于制備樣品并將抗體應(yīng)用于樣品的說明書和材料。所述試劑盒可以包括一抗(primary antibody)和二抗(secondary antibody)二者，其中所述二抗綴合有標(biāo)記物，例如酶標(biāo)記物。

另一個實施方案是一種試劑盒，包括容器，所述容器上的標(biāo)簽，和裝在所述容器內(nèi)的組合物，其中所述組合物包括一種或多種在嚴(yán)格條件下與本文所述生物標(biāo)志物的互補物發(fā)生雜交的多核苷酸，而所述容器上的標(biāo)簽指示該組合物可用于評估樣品中本文所述生物標(biāo)志物的存在情況，且其中所述試劑盒包括說明書，其關(guān)于使用該多核苷酸來評估特定樣品類型中生物標(biāo)志物RNA或DNA的存在情況。

試劑盒中的其它任選成分包括一種或多種緩沖液(例如封閉緩沖液，清洗緩沖液，底物緩沖液等)，其它試劑(諸如可以被酶標(biāo)記物化學(xué)改變的底物，例如色原)，表位修復(fù)液，對照樣品(陽性和/或陰性對照)，對照載玻片等。試劑盒還可包括用于解讀使用該試劑盒獲得的結(jié)果的說明書。

在又一些具體的實施方案中，對于基于抗體的試劑盒，所述試劑盒可包括例如：(1)第一抗體(例如附著至固體支持物的)，其結(jié)合生物標(biāo)志物蛋白質(zhì)；和任選的(2)不同的第二抗體，其結(jié)合所述蛋白質(zhì)或所述第一抗體且綴合有可檢測標(biāo)記物。

對于基于寡核苷酸的試劑盒，所述試劑盒可包括例如：(1)寡核苷酸，例如可檢測標(biāo)記的寡核苷酸，其與編碼生物標(biāo)志物蛋白質(zhì)的核酸序列發(fā)生雜交，或(2)一對引物，其可用于擴(kuò)增生物標(biāo)志物核酸分子。所述試劑盒還可包括例如緩沖劑，防腐劑，和蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑。所述試劑盒可進(jìn)一步包括檢測可檢測標(biāo)記物所必需的成分(例如酶或底物)。所述試劑盒還可包括對照樣品或一系列對照樣品，其能被測定并與測試樣品進(jìn)行比較。所述試劑盒的每種成分可以封裝在單獨的容器內(nèi)，而各個容器都可與說明書(用于解讀使用該試劑盒實施的測定法的結(jié)果)一起在單個包裝內(nèi)。

C.統(tǒng)計學(xué)

如本文中所使用的，一般形式的預(yù)測規(guī)則存在于一種或多種生物標(biāo)志物的函數(shù)的說明中，其潛在包括臨床協(xié)變量以預(yù)測響應(yīng)或不響應(yīng)，或更一般地，預(yù)測有益或無益(就適當(dāng)定義的臨床終點而言)。

最簡單形式的預(yù)測規(guī)則由沒有協(xié)變量的單變量模型組成，其中通過截留或閾的手段來確定預(yù)測。這可以表述成特定截留c和生物標(biāo)志物測量x的Heaviside函數(shù)，若要做出二元預(yù)測A或B，則

若H(x-c)＝0，則預(yù)示A；

若H(x-c)＝1，則預(yù)示B。

這是在預(yù)測規(guī)則中使用單變量生物標(biāo)志物測量的最簡單方式。如果這樣一種簡單規(guī)則就足夠了，那么它容許簡單鑒定效果的方向，即高的還是低的表達(dá)水平對患者有益。

如果需要考慮臨床協(xié)變量，和/或，如果多變量預(yù)測規(guī)則中使用多種生物標(biāo)志物，那么情況會更加復(fù)雜。下面的兩個假設(shè)例闡述了所涉及的問題：

協(xié)變量修正(假設(shè)例)：

對于生物標(biāo)志物X，在一個臨床試驗群體中發(fā)現(xiàn)高表達(dá)水平與較差的臨床響應(yīng)有關(guān)(單變量分析)。一項更周密的分析顯示該群體中有兩種類型的臨床響應(yīng)，其中第一組擁有比第二組差的響應(yīng)，而且同時第一組的該生物標(biāo)志物表達(dá)一般在施用至少一劑VEGF拮抗劑(例如抗VEGF抗體，例如貝伐珠單抗)之后較高。一項修正協(xié)變量分析揭示對于每一個組，臨床受益與臨床響應(yīng)之間的關(guān)系被反轉(zhuǎn)了，即在各組內(nèi)，較低的表達(dá)水平與較好的臨床響應(yīng)有關(guān)。整體相反效果被協(xié)變量類型所掩蓋--而且協(xié)變量修正分析(作為預(yù)測規(guī)則的一部分)反轉(zhuǎn)了方向。

多變量預(yù)測(假設(shè)例)：

對于生物標(biāo)志物X，在一個臨床試驗群體中發(fā)現(xiàn)高表達(dá)水平與較差的臨床響應(yīng)微弱有關(guān)(單變量分析)。對于第二生物標(biāo)志物Y，通過單變量分析進(jìn)行了類似的觀察。X與Y的組合揭示了，若這兩種生物標(biāo)志物都低，則看到好的臨床響應(yīng)。這使得規(guī)則在這兩種生物標(biāo)志物都低于一些截留時預(yù)示受益(和--Heaviside預(yù)測函數(shù)的聯(lián)系)。對于組合規(guī)則，一條簡單的規(guī)則不再以單變量意義適用；例如，具有低的X表達(dá)水平不會自動地預(yù)示較好的臨床響應(yīng)。

這些簡單的例子顯示了，不能根據(jù)每一種生物標(biāo)志物的單變量水平來判斷具有和沒有協(xié)變量的預(yù)測規(guī)則。多種生物標(biāo)志物的組合加上由協(xié)變量進(jìn)行的潛在判斷不容許給單一生物標(biāo)志物指派簡單關(guān)系。因為可以在潛在包括其它臨床協(xié)變量的多標(biāo)志物預(yù)測模型中使用多種標(biāo)志物基因(特別是血清中的)，所以不能以簡單方式確定此類模型內(nèi)單一標(biāo)志物基因的有益效果的方向，而且可能與單變量分析中找到的方向矛盾，即關(guān)于單標(biāo)志物基因描述的情況。

臨床醫(yī)師可使用本領(lǐng)域已知的數(shù)種方法之任一來測量VEGF拮抗劑(例如抗VEGF抗體，例如貝伐珠單抗)的特定劑量方案的有效性。例如，可使用體內(nèi)成像(例如MRI)來測定腫瘤大小及鑒定任何轉(zhuǎn)移以確定對該療法的相對有效響應(yīng)性?？烧{(diào)整劑量方案來提供最佳的期望響應(yīng)(例如治療響應(yīng))。例如，可以施用一劑，可以在一段時間里施用數(shù)個分劑，或者可以根據(jù)治療情況的緊急事件成比例地降低或提高劑量。

IV.VEGF拮抗劑治療

A.劑量和施用

一旦鑒定出對本文所述VEGF拮抗劑(例如抗VEGF抗體，例如貝伐珠單抗)治療是響應(yīng)性或敏感的患者，就可以進(jìn)行單獨的或與其它藥物組合的VEGF拮抗劑的治療。此類治療可導(dǎo)致例如腫瘤尺寸(例如成膠質(zhì)細(xì)胞瘤腫瘤尺寸)縮小或無進(jìn)展存活(PFS)和/或總體存活(OS)延長。此外，VEGF拮抗劑(例如抗VEGF抗體，例如貝伐珠單抗)和至少一種第二藥物組合的治療優(yōu)選對患者導(dǎo)致疊加，更優(yōu)選協(xié)同(或大于疊加)的治療受益。優(yōu)選地，在這種組合方法中，本文中第二藥物的至少一次施用和拮抗劑的至少一次施用之間的時機是約1個月或更少，更優(yōu)選約2周或更少。

在一些實施方案中，本發(fā)明提供治療具有成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的患者的方法，該方法包括對該患者施用VEGF拮抗劑，其中該患者已經(jīng)預(yù)先測定為具有選自AKT3，CDH1，CYP27B1，DNM3，DYNLL1，ERBB3，KLRK1，MBP，MDM2，NCAM1，PDGFRA，PRKCZ，SNCA，TNFRSF21，AXL，BCL2L1，CD36，ETS1，ICAM2，IL17A，IRS2，PDGFRB，RPL13A，TGFB1，TNFRSF4，TNFSF4，和ZBTB16的至少一種基因(例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，或27種基因)的表達(dá)水平相對于該至少一種基因的參照表達(dá)水平的變化。該變化可以是至少一種基因的表達(dá)水平相對于參照水平的升高，且該至少一種基因(例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，或14種基因)可以是AKT3，CDH1，CYP27B1，DNM3，DYNLL1，ERBB3，KLRK1，MBP，MDM2，NCAM1，PDGFRA，PRKCZ，SNCA，和/或TNFRSF21。在一些實施方案中，其中該變化可以是至少一種基因的表達(dá)水平相對于參照水平的降低，且該至少一種基因(例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，或13種基因)可以是AXL，BCL2L1，CD36，ETS1，ICAM2，IL17A，IRS2，PDGFRB，RPL13A，TGFB1，TNFRSF4，TNFSF4，和/或ZBTB16。

醫(yī)學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員會領(lǐng)會，在診斷對VEGF拮抗劑的可能響應(yīng)性后對患者施用治療有效量的VEGF拮抗劑(例如抗VEGF抗體，例如貝伐珠單抗)的確切方式會由主治醫(yī)師斟酌。施用的模式(包括劑量，與其它藥劑的組合，施用的時機和頻率，等等)可以受到患者對此類VEGF拮抗劑的可能響應(yīng)性的診斷以及患者的狀況和歷史影響。如此，甚至預(yù)測對VEGF拮抗劑相對不敏感的具有成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的患者仍可受益于其治療，特別是在與其它藥劑(包括可改變患者對拮抗劑的響應(yīng)性的藥劑)的組合時。

會以與優(yōu)良醫(yī)學(xué)實踐一致的方式配制，定劑量，和施用包含VEGF拮抗劑的組合物。在此內(nèi)容中考慮的因素包括所治療的成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的具體類型(例如新診斷的成膠質(zhì)細(xì)胞瘤或復(fù)發(fā)的成膠質(zhì)細(xì)胞瘤，前神經(jīng)型的成膠質(zhì)細(xì)胞瘤，間充質(zhì)型的成膠質(zhì)細(xì)胞瘤，或增殖型的成膠質(zhì)細(xì)胞瘤)，所治療的具體哺乳動物(例如人)，患者個體的臨床狀況，成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的起因，投遞藥劑的部位，可能的副作用，拮抗劑的類型，施用的方法，施用的日程安排，和醫(yī)學(xué)從業(yè)人員知道的其它因素。要施用的VEGF拮抗劑的有效量會取決于此類考量。

根據(jù)諸如具體的拮抗劑類型等因素，具有本領(lǐng)域普通技能的內(nèi)科醫(yī)師能容易地確定所需要的藥物組合物的有效量及開出這樣的處方。例如，內(nèi)科醫(yī)師能以多劑如下VEGF拮抗劑(例如抗VEGF抗體，例如貝伐珠單抗)開始，其在藥物組合物中以比實現(xiàn)期望的治療效果所需水平要低的水平采用，并逐漸提高劑量，直至實現(xiàn)期望的效果。拮抗劑的給定劑量或治療方案的有效性可以例如通過使用標(biāo)準(zhǔn)功效度量評估患者中的體征和癥狀來測定。

在某些例子中，VEGF拮抗劑(例如抗VEGF抗體，例如貝伐珠單抗)可以是施用于受試者的唯一藥物(即作為單一療法)。

在某些例子中，至少兩次用相同的VEGF拮抗劑(例如抗VEGF抗體，例如貝伐珠單抗)治療患者。如此，初始和第二VEGF拮抗劑暴露優(yōu)選用相同的拮抗劑，而且更優(yōu)選地，所有VEGF拮抗劑暴露用相同的VEGF拮抗劑，即頭兩次暴露，優(yōu)選所有暴露的治療用一種類型的VEGF拮抗劑，例如結(jié)合VEGF的拮抗劑，諸如抗VEGF抗體，例如都用貝伐珠單抗。

作為一般建議，每劑胃腸外施用的VEGF拮抗劑的有效量會在約20mg至約5000mg的范圍里，通過一個或多個劑量來實現(xiàn)。用于抗體(諸如抗VEGF抗體，例如貝伐珠單抗)的例示性劑量方案包括每1，2，3，或4周100或400mg，或者每1，2，3，或4周施用約1，3，5，10，15，或20mg/kg的一劑。例如，可以每兩周以10mg/kg施用有效量的抗VEGF抗體(例如貝伐珠單抗)，任選通過靜脈內(nèi)(i.v.)施用。又例如，可以每三周以15mg/kg施用有效量的抗VEGF抗體，任選通過i.v.施用。該劑量可以作為單劑或作為多劑(例如2或3劑)施用，諸如輸注。

在一些情況中，根據(jù)疾病的類型和嚴(yán)重程度，約1μg/kg至100mg/kg(例如0.1-20mg/kg)VEGF拮抗劑(例如抗VEGF抗體，例如貝伐珠單抗)作為初始候選劑量施用于受試者，無論例如通過一次或多次分開的施用或通過連續(xù)輸注。在一個實施方案中，期望的劑量包括例如6mg/kg，8mg/kg，10mg/kg，和15mg/kg。對于持續(xù)數(shù)天或更久的重復(fù)施用或周期，根據(jù)狀況，持續(xù)治療直至癌癥得到治療，如通過上文所述或本領(lǐng)域已知方法測量的。然而，其它劑量方案可能是有用的。在一個例子中，每周，每兩周，或每三周一次施用抗VEGF抗體，劑量范圍為約6mg/kg至約15mg/kg，包括但不限于6mg/kg，8mg/kg，10mg/kg或15mg/kg。本發(fā)明療法的進(jìn)展易于通過常規(guī)技術(shù)和測定法來監(jiān)測。在其它實施方案中，此類劑量給藥方案與化療方案在成膠質(zhì)細(xì)胞瘤中組合使用。

如果提供多次VEGF拮抗劑暴露，那么每次暴露可以使用相同的或不同的施用手段來提供。在一個實施方案中，每次暴露通過靜脈內(nèi)施用。在另一個實施方案中，每次暴露通過皮下施用給予。在還有另一個實施方案中，所述暴露通過靜脈內(nèi)和皮下施用二者給予。

在一個實施方案中，以緩慢的靜脈內(nèi)輸注而非靜脈內(nèi)推注或快速注射來施用VEGF拮抗劑(例如抗VEGF抗體，例如貝伐珠單抗)。例如，在抗VEGF抗體的任何輸注之前約30分鐘施用類固醇，諸如潑尼松龍或甲潑尼龍(例如靜脈內(nèi)約80-120毫克，更具體地，靜脈內(nèi)約100毫克)。例如，可以經(jīng)由專用線路來輸注抗VEGF抗體(諸如貝伐珠單抗)。

對于多劑VEGF拮抗劑(例如抗VEGF抗體，例如貝伐珠單抗)暴露的初始劑，或者對于暴露只包括一劑的情況中的單劑，此類輸注優(yōu)選以約50毫克/小時的速率開始。這可以例如以每約30分鐘增加約50毫克/小時的速率逐步提高至約400毫克/小時的最大值。然而，如果受試者正在經(jīng)歷輸注相關(guān)反應(yīng)，那么輸注速率優(yōu)選降低至例如當(dāng)前速率的一半，例如從100毫克/小時降低至50毫克/小時。例如，VEGF拮抗劑的此類劑量(例如約1000毫克總劑量)的輸注用約255分鐘(4小時15分鐘)完成。任選地，受試者在開始輸注前約30至60分鐘通過口接受醋氨酚/對乙酰氨基酚(例如約1克)和鹽酸苯海拉明(例如約50毫克或相似藥劑的等效劑量)的預(yù)防性處理。

如果給予超過一次VEGF拮抗劑(例如抗VEGF抗體，例如貝伐珠單抗)輸注(劑)以實現(xiàn)整個暴露，那么在此實施方案中以比初始輸注要高的速率開始第二或后續(xù)VEGF拮抗劑輸注，例如以約100毫克/小時。此速率可以例如以每約30分鐘增加約100毫克/小時的速率逐步提高至約400毫克/小時的最大值。經(jīng)歷輸注相關(guān)反應(yīng)的受試者優(yōu)選將輸注速率降低至該速率的一半，例如從100毫克/小時降低至50毫克/小時。優(yōu)選地，VEGF拮抗劑的此類第二或后續(xù)劑量(例如約1000毫克總劑量)的輸注用約195分鐘(3小時15分鐘)完成。

在一個實施方案中，VEGF拮抗劑是抗VEGF抗體(例如貝伐珠單抗)，而且以約0.4至4克的劑量施用，而且更優(yōu)選的是，該抗體以約0.4至1.3克的劑量，以約1個月的時段內(nèi)1至4劑的頻率施用。仍然更加優(yōu)選的是，劑量是約500mg至1.2g，而且在其它實施方案中，是約750mg至1.1g。在此類方面，VEGF拮抗劑優(yōu)選以2至3劑施用，和/或在約2至3周的時段內(nèi)施用。

療法的持續(xù)時間會持續(xù)像醫(yī)囑指示的那樣長時間或直到實現(xiàn)期望的治療效果(例如本文所述那些)。在某些實施方案中，療法持續(xù)1個月，2個月，4個月，6個月，8個月，10個月，1年，2年，3年，4年，5年，或長至受試者終身的時段。

然而，如上所述，對于VEGF拮抗劑的這些建議量要加以諸多治療上的考量。在選擇適宜劑量和日程安排中，關(guān)鍵的因素是獲得的結(jié)果，如上文指示的。在一些實施方案中，盡可能接近成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的首次體征，診斷，表現(xiàn)，或出現(xiàn)，施用VEGF抗體拮抗劑。

1.施用的路徑

VEGF拮抗劑(例如抗VEGF抗體，例如貝伐珠單抗)可以通過任何合適手段來施用，包括胃腸外，表面，皮下，腹膜內(nèi)，肺內(nèi)，鼻內(nèi)，和/或損傷內(nèi)施用。胃腸外輸注包括肌肉內(nèi)，靜脈內(nèi)，動脈內(nèi)，腹膜內(nèi)，或皮下施用。還涵蓋鞘內(nèi)施用。另外，可合適地通過脈沖輸注來施用VEGF拮抗劑，例如用劑量逐漸減少的VEGF拮抗劑。最優(yōu)選地，通過靜脈內(nèi)注射來給予劑量給藥。

如果提供多次抗VEGF抗體暴露，那么每次暴露可以使用相同的或不同的施用手段來提供。在一個實施方案中，每次暴露通過靜脈內(nèi)(i.v.)施用。例如，抗VEGF抗體(諸如貝伐珠單抗)可以經(jīng)由專用線路來輸注。例如，抗VEGF抗體(諸如貝伐珠單抗)可以最初在約90分鐘里靜脈內(nèi)施用，后續(xù)輸注在約60分鐘里，然后在約30分鐘里。在另一個實施方案中，每次暴露通過皮下(s.c.)施用給予。在還有另一個實施方案中，所述暴露通過i.v.和s.c.施用二者給予。

除了通過上文所述傳統(tǒng)路徑將VEGF拮抗劑施用于患者，本發(fā)明還包括通過基因療法進(jìn)行的施用。參見例如WO 1996/07321，其關(guān)注使用基因療法來產(chǎn)生胞內(nèi)抗體。

主要有兩種辦法使核酸(任選包含在載體中)進(jìn)入患者的細(xì)胞，即體內(nèi)(in vivo)和回體(ex vivo)。對于體內(nèi)投遞，通常在需要拮抗劑的部位將核酸直接注射入患者。對于回體治療，取出患者的細(xì)胞，將核酸導(dǎo)入這些分離的細(xì)胞，并將經(jīng)過修飾的細(xì)胞直接施用于患者，或者例如封裝入多孔膜再植入患者(參見例如美國專利No.4,892,538和5,283,187)。有多種技術(shù)可用于將核酸導(dǎo)入活細(xì)胞。這些技術(shù)根據(jù)是將核酸轉(zhuǎn)移入體外培養(yǎng)的細(xì)胞還是目的宿主的體內(nèi)細(xì)胞而有所變化。適合于在體外將核酸轉(zhuǎn)移入哺乳動物細(xì)胞的技術(shù)包括使用脂質(zhì)體，電穿孔，顯微注射，細(xì)胞融合，DEAE-右旋糖苷，磷酸鈣沉淀法等。常用于回體投遞基因的一種載體是逆轉(zhuǎn)錄病毒。

目前優(yōu)選的體內(nèi)核酸轉(zhuǎn)移技術(shù)包括用病毒載體(諸如腺病毒，I型單純皰疹病毒或腺伴隨病毒)和基于脂質(zhì)的系統(tǒng)(例如，可用于脂質(zhì)介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移的脂質(zhì)有DOTMA，DOPE和DC-Chol)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在一些情況中，希望與對靶細(xì)胞特異性的藥劑(諸如對靶細(xì)胞上的細(xì)胞表面膜蛋白特異性的抗體，針對靶細(xì)胞上受體的配體，等)一起提供核酸來源。在采用脂質(zhì)體的情況中，可以使用與胞吞作用有關(guān)的細(xì)胞表面膜蛋白結(jié)合的蛋白質(zhì)靶向和/或促進(jìn)攝取，例如對特定細(xì)胞類型有向性的衣殼蛋白或其片段，針對在循環(huán)中經(jīng)歷內(nèi)在化的蛋白質(zhì)的抗體，和靶向胞內(nèi)定位并延長胞內(nèi)半衰期的蛋白質(zhì)。受體介導(dǎo)的胞吞作用的技術(shù)記載于例如Wu et al.,J.Biol.Chem.262:4429-4432(1987)；及Wagner et al.,PNAS USA 87:3410-3414(1990)。基因標(biāo)記和基因療法方案記載于例如Anderson et al.,Science 256:808-813(1992)及WO1993/25673。

2.組合療法

在一些實施方案中，VEGF拮抗劑(例如抗VEGF抗體，例如貝伐珠單抗)可以與一種或多種別的抗癌劑或抗癌療法組合使用?？拱┋煼ǖ睦影ǖ幌抻谑中g(shù)，放射療法(放療(RT))，生物療法，免疫療法，化療(例如替莫唑胺(TMZ))，或者這些療法的組合。另外，可以與抗VEGF抗體組合使用細(xì)胞毒劑，抗血管發(fā)生劑，和抗增殖劑。一種或多種別的抗癌劑或抗癌療法優(yōu)選具有與VEGF拮抗劑互補的活性，使得它們彼此沒有不利影響。組合施用包括使用分開的配制劑或單一藥物配制劑的共施用，和任一次序的序貫施用，其中優(yōu)選有一段時間所有活性劑同時發(fā)揮它們的生物學(xué)活性。

一種或多種別的抗癌劑可以是化療劑，細(xì)胞毒劑，細(xì)胞因子，生長抑制劑，抗激素劑，及其組合。此類分子恰當(dāng)?shù)匾詫τ陬A(yù)定目的有效的量組合存在。含有VEGF拮抗劑(例如抗VEGF抗體，例如貝伐珠單抗)的藥物組合物還可以包含治療有效量的抗腫瘤劑，化療劑，生長抑制劑，細(xì)胞毒劑，或其組合。

在一個方面，第一化合物是抗VEGF抗體且至少一種別的化合物是除抗VEGF抗體以外的治療性抗體。在一個實施方案中，至少一種別的化合物是結(jié)合癌細(xì)胞表面標(biāo)志物的抗體。在一個實施方案中，至少一種別的化合物是抗HER2抗體，曲妥珠單抗(trastuzumab)(例如Genentech,Inc.，South San Francisco，CA)。在一個實施方案中，至少一種別的化合物是抗HER2抗體，帕妥珠單抗(pertuzumab)(Omnitarg^TM，Genentech,Inc.，South San Francisco，CA，參見USPN 6,949,245)。在一個實施方案中，至少一種別的化合物是抗體(或是裸抗體或是ADC)，且別的抗體是第二，第三，第四，第五，第六或更多抗體，使得此類第二，第三，第四，第五，第六，或更多抗體(或是裸抗體或是ADC)的組合有效治療血管發(fā)生性病癥。

依照本發(fā)明的其它治療方案可以包括施用抗癌劑和(包括但不限于)放射療法和/或骨髓和外周血移植，和/或細(xì)胞毒劑，化療劑，或生長抑制劑。在一個此類實施方案中，化療劑是一種藥劑或藥劑組合，諸如例如環(huán)磷酰胺，羥基柔紅霉素，阿霉素，多柔吡星，長春新堿(ONCOVIN^TM)，潑尼松龍，CHOP，CVP，或COP，或免疫治療劑諸如抗PSCA，抗HER2(例如OMNITARG^TM)。在另一個實施方案中，組合包括多西他賽，多柔吡星，和環(huán)磷酰胺。組合療法可以作為同時或順序方案施用。在順序施用時，組合可以在兩次或更多次施用中施用。組合施用包括使用分開的配制劑或單一藥物配制劑的共施用，和任一次序的序貫施用，其中優(yōu)選有一段時間所有活性劑同時發(fā)揮它們的生物學(xué)活性。

在一個實施方案中，VEGF拮抗劑(例如抗VEGF抗體)治療牽涉本文中鑒定的抗癌劑，和一種或多種化療劑或生長抑制劑的組合施用，包括不同化療劑的混合物的共施用?；焺┌ㄗ仙纪?諸如帕利他賽和多西他賽)和/或蒽環(huán)類抗生素。可以依照制造商的說明書或由熟練從業(yè)人員憑經(jīng)驗確定來使用此類化療劑的制備和劑量給藥日程表。此類化療的制備和劑量給藥日程表還記載于“Chemotherapy Service”(1992)M.C.Perry編,Williams&Wilkins,Baltimore,Md。

任何上述共施用的藥劑的合適劑量就是那些當(dāng)前使用的，而且可以由于VEGF拮抗劑和其它化療劑或治療的組合作用(協(xié)同)而降低。

組合療法可以提供“協(xié)同作用”及證實是“協(xié)同性”的，即當(dāng)一起使用活性組分時所實現(xiàn)的效果大于分開使用化合物時所產(chǎn)生的效果之和。當(dāng)活性組分為如下情況時可以獲得協(xié)同效應(yīng)：(1)共配制和施用或在組合的單位劑量配制劑中同時投遞；(2)作為分開的配制劑交替或平行投遞；或(3)通過一些其它方案。當(dāng)在交替療法中投遞時，在順序施用或投遞化合物時，例如通過不同注射器中的不同注射，可以獲得協(xié)同效應(yīng)。一般地，在交替療法期間，順序即連續(xù)施用有效劑量的每種活性組分，而在組合療法中，一起施用有效劑量的兩種或更多種活性組分。

一般地，對于疾病的預(yù)防或治療，別的治療劑的適宜劑量會取決于要治療的疾病的類型，抗體的類型，疾病的嚴(yán)重程度和進(jìn)程，施用VEGF拮抗劑(例如抗VEGF抗體，例如貝伐珠單抗)和別的藥劑(例如TMZ)是出于預(yù)防還是治療目的，先前的療法，患者的臨床史和對VEGF拮抗劑和別的藥劑的響應(yīng)，及主治醫(yī)師的斟酌。以一次或在一系列治療里將VEGF拮抗劑和別的藥劑恰當(dāng)?shù)厥┯糜诨颊摺EGF拮抗劑通常如上文所述施用。根據(jù)疾病的類型和嚴(yán)重程度，約20mg/m²至600mg/m²別的藥劑是施用于患者的初始候選劑量，無論是例如通過一次或多次分開施用或是通過連續(xù)輸注。根據(jù)上文所述因素，一種典型日劑量的范圍可以是約20mg/m²，85mg/m²，90mg/m²，125mg/m²，200mg/m²，400mg/m²，500mg/m²或更多。對于持續(xù)數(shù)天或更久的重復(fù)施用，根據(jù)狀況，持續(xù)治療直至疾病癥狀發(fā)生期望的抑制。如此，可以對患者施用約20mg/m²，85mg/m²，90mg/m²，125mg/m²，200mg/m²，400mg/m²，500mg/m²，600mg/m²(或其任意組合)的一劑或多劑。此類劑量可以間歇施用，例如每周或每兩，三，四，五，或六周(例如使得患者接受約2劑至約20劑，例如約6劑別的藥劑)。可施用一劑較高的初始加載劑量，接著是一劑或多劑較低劑量。然而，其它劑量方案也可能是有用的。這種療法的進(jìn)展易于通過常規(guī)技術(shù)和測定法來監(jiān)測。

在一個實施方案中，受試者先前從未施用任何藥物來治療成膠質(zhì)細(xì)胞瘤。在另一個實施方案中，受試者或患者先前曾經(jīng)施用一種或多種藥物來治療成膠質(zhì)細(xì)胞瘤。在又一個實施方案中，受試者或患者對先前施用的一種或多種藥物不是響應(yīng)性的。受試者對其可以是非響應(yīng)性的此類藥物包括例如抗腫瘤劑，化療劑，細(xì)胞毒劑，和/或生長抑制劑。更特別地，受試者對其可以是非響應(yīng)性的藥物包括VEGF拮抗劑，諸如抗VEGF抗體，例如貝伐珠單抗。在又一個方面，此類VEGF拮抗劑包括抗體或免疫粘附素，使得涵蓋用受試者以前是非響應(yīng)性的一種或多種抗體或免疫粘附素進(jìn)行的復(fù)治。

B.VEGF拮抗劑

在本文所列所有方法中，VEGF拮抗劑可以是抗VEGF抗體。

在某些實施方案中，抗VEGF抗體可以是嵌合抗體。某些嵌合抗體記載于例如美國專利No.4,816,567及Morrison等,PNAS USA,81:6851-6855,1984。在一個例子中，嵌合抗體包含非人可變區(qū)(例如，自小鼠，大鼠，倉鼠，家兔，或非人靈長類，諸如猴衍生的可變區(qū))和人恒定區(qū)。在又一個例子中，嵌合抗體是“類轉(zhuǎn)換的”抗體，其中類或亞類已經(jīng)自親本抗體的類或亞類改變。嵌合抗體包括其抗原結(jié)合片段。

在某些實施方案中，抗VEGF抗體可以是人源化抗體。通常，將非人抗體人源化以降低對人的免疫原性，同時保留親本非人抗體的特異性和親和力。一般地，人源化抗體包含一個或多個可變域，其中HVR，例如CDR(或其部分)自非人抗體衍生，而FR(或其部分)自人抗體序列衍生。任選地，人源化抗體還會至少包含人恒定區(qū)的一部分。在一些實施方案中，將人源化抗體中的一些FR殘基用來自非人抗體(例如衍生HVR殘基的抗體)的相應(yīng)殘基替代，例如以恢復(fù)或改善抗體特異性或親和力。人源化抗體及其生成方法綜述于例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)，并且進(jìn)一步記載于例如Riechmann等,Nature 332:323-329(1988)；Queen等,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 86:10029-10033(1989)；美國專利No.5,821,337,7,527,791,6,982,321和7,087,409；Kashmiri等,Methods 36:25-34(2005)(描述了SDR(a-CDR)嫁接)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述了“重修表面”)；Dall’Acqua等,Methods 36:43-60(2005)(描述了“FR改組”)；及Osbourn等,Methods 36:61-68(2005)及Klimka等,Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述了FR改組的“引導(dǎo)選擇”辦法)。

在某些實施方案中，抗VEGF抗體可以是人抗體?？梢允褂帽绢I(lǐng)域中已知的多種技術(shù)來生成人抗體。人抗體一般性記載于van Dijk和van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)及Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)?？梢酝ㄟ^對轉(zhuǎn)基因動物施用免疫原來制備人抗體，所述轉(zhuǎn)基因動物已經(jīng)修飾為響應(yīng)抗原性攻擊而生成完整人抗體或具有人可變區(qū)的完整抗體。此類動物通常含有整個或部分人免疫球蛋白基因座，其替換內(nèi)源免疫球蛋白基因座，或者其在染色體外存在或隨機整合入動物的染色體中。在此類轉(zhuǎn)基因小鼠中，一般已經(jīng)將內(nèi)源免疫球蛋白基因座滅活。關(guān)于自轉(zhuǎn)基因動物獲得人抗體的方法的綜述，見Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。還可見例如美國專利No.6,075,181和6,150,584，其描述了XENOMOUSE^TM技術(shù)；美國專利No.5,770,429，其描述了技術(shù)；美國專利No.7,041,870，其描述了技術(shù)，和美國專利申請公開文本No.US 2007/0061900，其描述了技術(shù))?？梢岳缤ㄟ^與不同人恒定區(qū)組合進(jìn)一步修飾來自由此類動物生成的完整抗體的人可變區(qū)。也可以通過基于雜交瘤的方法生成人抗體。已經(jīng)描述了用于生成人單克隆抗體的人骨髓瘤和小鼠-人異源骨髓瘤細(xì)胞系(見例如Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,第51-63頁(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；及Boerner等,J.Immunol.,147:86(1991))。經(jīng)由人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)生成的人抗體也記載于Li等,PNAS USA,103:3557-3562(2006)。別的方法包括那些例如記載于美國專利No.7,189,826(其描述了自雜交瘤細(xì)胞系生成單克隆人IgM抗體)和Ni,Xiandai Mianyixue,26(4):265-268(2006)(其描述了人-人雜交瘤)的。人雜交瘤技術(shù)(Trioma技術(shù))也記載于Vollmers和Brandlein,Histology and Histopathology,20(3):927-937(2005)及Vollmers和Brandlein,Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology,27(3):185-91(2005)。

在某些實施方案中，抗VEGF抗體可以是或已經(jīng)是通過對組合文庫篩選具有期望的一種或多種活性的抗體而分離的。例如，用于生成噬菌體展示文庫并對此類文庫篩選擁有期望結(jié)合特征的抗體的多種方法是本領(lǐng)域中已知的。此類方法綜述于例如Hoogenboom等,于Methods in Molecular Biology178:1-37(O’Brien等編,Human Press,Totowa,NJ,2001)，并且進(jìn)一步記載于例如McCafferty等,Nature 348:552-554；Clackson等,Nature 352:624-628(1991)；Marks等,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks和Bradbury,于Methods in Molecular Biology 248:161-175(Lo編,Human Press,Totowa,NJ,2003)；Sidhu等,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,PNAS USA 101(34):12467-12472(2004)；及Lee等,J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004)。

在一些噬菌體展示方法中，將VH和VL基因的全集分開通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)克隆，并在噬菌體文庫中隨機重組，然后可以對所述噬菌體文庫篩選抗原結(jié)合噬菌體，如記載于Winter等,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)的。噬菌體通常以單鏈Fv(scFv)片段或以Fab片段展示抗體片段。來自經(jīng)免疫的來源的文庫提供針對免疫原的高親和力抗體，而不需要構(gòu)建雜交瘤?；蛘撸梢?例如自人)克隆未免疫全集以在沒有任何免疫的情況中提供針對一大批非自身和還有自身抗原的抗體的單一來源，如由Griffiths等,EMBO J,12:725-734(1993)描述的。最后，也可以通過自干細(xì)胞克隆未重排的V基因區(qū)段，并使用含有隨機序列的PCR引物編碼高度可變的CDR3區(qū)并在體外實現(xiàn)重排來合成生成未免疫文庫，如由Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)所描述的。描述人抗體噬菌體文庫的專利公開文本包括例如：美國專利No.5,750,373，和美國專利公開文本No.2005/0079574,2005/0119455,2005/0266000,2007/0117126,2007/0160598,2007/0237764,2007/0292936和2009/0002360。

在一些實施方案中，在本發(fā)明的方法中有用的抗VEGF抗體包括任何以足夠親和力和特異性結(jié)合VEGF且能降低或抑制VEGF的生物學(xué)活性的抗體或其抗原結(jié)合片段?？筕EGF抗體通常不會結(jié)合其它VEGF同源物，諸如VEGF-B或VEGF-C，也不會結(jié)合其它生長因子，諸如PlGF，PDGF，或bFGF。例如，在本發(fā)明的某些實施方案中，抗VEGF抗體包括但不限于與由雜交瘤ATCC HB 10709生成的單克隆抗VEGF抗體A4.6.1；依照Presta等(1997)Cancer Res.57：4593-4599生成的重組人源化抗VEGF單克隆抗體結(jié)合相同表位的單克隆抗體。在一個實施方案中，抗VEGF抗體是貝伐珠單抗(BV或Bev)，也稱作“rhuMAb VEGF”或它包含經(jīng)過突變的人IgG1框架區(qū)和來自阻斷人VEGF結(jié)合其受體的鼠抗hVEGF單克隆抗體A.4.6.1的抗原結(jié)合互補決定區(qū)。貝伐珠單抗大約93％的氨基酸序列(包括大部分框架區(qū))是自人IgG1衍生，而且約7％的序列是自鼠抗體A4.6.1衍生的。貝伐珠單抗和其它人源化抗VEGF抗體記載于2005年2月26日公告的美國專利No.6,884,879。別的抗體包括G6或B20系列抗體(例如G6-31，B20-4.1)，如記載于PCT公開文本No.WO2005/012359，PCT公開文本No.WO2005/044853，和美國專利申請60/991,302，通過述及明確將這些專利申請的內(nèi)容收入本文。別的抗體參見美國專利No.7,060,269，6,582,959，6,703,020；6,054,297；WO98/45332；WO 96/30046；WO 94/10202；EP 0666868B1；美國專利申請公開文本No.2006009360，20050186208，20030206899，20030190317，20030203409，和20050112126；和Popkov等，Journal ofImmunological Methods288：149-164(2004)。其它抗體包括那些結(jié)合人VEGF上包含殘基F17，M18，D19，Y21，Y25，Q89，I91，K101，E103，和C104或者包含殘基F17，Y21，Q22，Y25，D63，I83和Q89的功能性表位的。

在一些實施方案中，在本文所述任一方法中有用的抗VEGF抗體可以具有輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，該輕鏈可變區(qū)包含下述氨基酸序列：

該重鏈可變區(qū)包含下述氨基酸序列：

本文中的抗VEGF抗體可以是嵌合抗體，人源化抗體，或人抗體，而且可以是例如貝伐珠單抗。

在還有其它實施方案中，抗VEGF抗體可以是未綴合的，諸如裸的抗VEGF抗體，或者可以為進(jìn)一步的有效性與另一分子綴合，諸如例如為了改善半衰期。

V.藥物配制劑

依照本發(fā)明使用的拮抗劑的治療用配制劑通過將具有期望純度的拮抗劑與任選的藥學(xué)可接受載劑，賦形劑或穩(wěn)定劑混合，以凍干配制劑或水溶液的形式制備供貯存。關(guān)于配制劑的一般信息參見例如Gilman et al.,(eds.)(1990),The Pharmacological Bases of Therapeutics,8th Ed.,Pergamon Press；A.Gennaro(ed.),Remington’s Pharmaceutical Sciences,18th Edition,(1990),Mack Publishing Co.,Eastori,Pennsylvania；Avis et al.,(eds.)(1993)Pharmaceutical Dosage Forms:Parenteral Medications Dekker,New York；Lieberman et al.,(eds.)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets Dekker,New York；Lieberman et al.,(eds.)(1990),Pharmaceutical Dosage Forms:Disperse Systems Dekker,New York；及Kenneth A.Walters(ed.)(2002)Dermatological and Transdermal Formulations(Drugs and the Pharmaceutical Sciences),Vol 119,Marcel Dekker。

可接受的載劑，賦形劑或穩(wěn)定劑在所采用的劑量和濃度對接受者是無毒的，包括緩沖劑，諸如磷酸鹽，檸檬酸鹽和其它有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑(諸如氯化十八烷基二甲基芐基銨；氯化己烷雙胺；苯扎氯銨，芐索氯銨；苯酚，丁醇或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷基酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或丙酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇；和間甲酚)；低分子量(少于約10個殘基)多肽；蛋白質(zhì)，諸如血清清蛋白，明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，諸如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，組氨酸，精氨酸或賴氨酸；單糖，二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖，甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖類，諸如蔗糖，甘露醇，海藻糖或山梨醇；成鹽反荷離子，諸如鈉；金屬復(fù)合物(例如Zn-蛋白質(zhì)復(fù)合物)；和/或非離子表面活性劑，諸如TWEEN^TM，PLURONICS^TM或聚乙二醇(PEG)。

例示性的抗VEGF抗體配制劑記載于美國專利No.6,884,879。在某些實施方案中，抗VEGF抗體在單次使用管形瓶中以25mg/ml配制。在某些實施方案中，在240mgα,α-海藻糖二水合物，23.2mg鈉的磷酸鹽(一堿基的，一水合物)，4.8mg鈉的磷酸鹽(二堿基的，無水的)，1.6mg聚山梨酯20，和注射用水(USP)中配制100mg抗VEGF抗體。在某些實施方案中，在960mgα,α-海藻糖二水合物，92.8mg鈉的磷酸鹽(單堿基的，一水合物)，19.2mg鈉的磷酸鹽(二堿基的，無水的)，6.4mg聚山梨酯20，和注射用水(USP)中配制400mg抗VEGF抗體。

適于皮下施用的凍干配制劑記載于例如美國專利No.6,267,958。此類凍干配制劑可以用合適的稀釋劑重建至高蛋白質(zhì)濃度，重建的配制劑可皮下施用于本文中要治療的哺乳動物。

還涵蓋拮抗劑的結(jié)晶形式。參見例如US 2002/0136719A1。

本文中的配制劑還可含有超過一種活性化合物(上文提到的第二藥物)，優(yōu)選那些活性互補且彼此沒有不利影響的。此類藥物的類型和有效量取決于例如配制劑中存在的VEGF拮抗劑(例如抗VEGF抗體，例如貝伐珠單抗)的量和類型，以及受試者的臨床參數(shù)。優(yōu)選的此類第二藥物如上所述。

活性組分還可包載于例如通過凝聚技術(shù)或通過界面聚合制備的微膠囊中(例如分別是羥甲基纖維素或明膠微膠囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)，在膠狀藥物投遞系統(tǒng)中(例如脂質(zhì)體，清蛋白微球體，微乳劑，納米顆粒和納米膠囊)，或在粗滴乳狀液中。此類技術(shù)公開于Remington′s Pharmaceutical Sciences,第16版,Osol,A.Ed.(1980)。

可制備持續(xù)釋放制劑。持續(xù)釋放制劑的合適例子包括含有所述拮抗劑的固體疏水性聚合物半透性基質(zhì)，該基質(zhì)是定型產(chǎn)品的形式，例如薄膜或微膠囊。持續(xù)釋放基質(zhì)的例子包括聚酯，水凝膠(例如聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))，聚交酯(美國專利No.3,773,919)，L-谷氨酸與L-谷氨酸γ乙酯的共聚物，不可降解的乙烯-乙酸乙烯共聚物，可降解的乳酸-乙醇酸共聚物諸如LUPRON DEPOT^TM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林構(gòu)成的可注射微球體)及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。

用于體內(nèi)施用的配制劑必須是無菌的。這可容易地通過使用無菌濾膜過濾來實現(xiàn)。

實施例

提供下述實施例以例示但非限制當(dāng)前要求保護(hù)的發(fā)明。

實施例1：統(tǒng)計方法和微陣列分析

統(tǒng)計方法

統(tǒng)計任務(wù)一般可包含以下步驟：

1.候選生物標(biāo)志物的預(yù)選擇

2.有關(guān)臨床功效響應(yīng)預(yù)測性協(xié)變量的預(yù)選擇

3.單變量水平的生物標(biāo)志物預(yù)測函數(shù)的選擇

4.在單變量水平包括臨床協(xié)變量的生物標(biāo)志物預(yù)測函數(shù)的選擇

5.多變量水平的生物標(biāo)志物預(yù)測函數(shù)的選擇

6.在多變量水平包括臨床協(xié)變量的生物標(biāo)志物預(yù)測函數(shù)的選擇

下文詳述不同步驟：

1：候選生物標(biāo)志物的預(yù)選擇。

候選生物標(biāo)志物的統(tǒng)計學(xué)預(yù)選擇的方向指向與臨床受益各度量的關(guān)聯(lián)強度。為此目的，可以將不同臨床終點變換成推導(dǎo)得出的替代得分，像例如關(guān)于TTP的臨床受益得分程度的依次指派，避免檢查觀察(censored observations)。這些替代變換度量能容易地用于簡單相關(guān)分析，例如通過非參數(shù)Spearman等級相關(guān)辦法。一種備選方法是使用生物標(biāo)志物測量作為時間對事件回歸模型(像例如Cox比例危害回歸)中的計量協(xié)變量。取決于生物標(biāo)志物數(shù)值的統(tǒng)計學(xué)分布，此步驟可要求一些預(yù)加工，像例如變異穩(wěn)定化變換和使用合適的標(biāo)尺，或者標(biāo)準(zhǔn)化步驟諸如使用百分點代替原始測量結(jié)果。另一種辦法是檢查雙變量散布圖，例如通過在單患者基礎(chǔ)上顯示(x軸＝生物標(biāo)志物數(shù)值，y軸＝臨床受益的度量)散布。有些非參數(shù)回歸線(像通過例如平滑樣條而實現(xiàn)的)對于顯現(xiàn)生物標(biāo)志物與臨床受益的關(guān)聯(lián)是有用的。

這些不同辦法的目的是顯示與所采用的至少一項受益度量中臨床受益的一些關(guān)聯(lián)，同時對其它度量的結(jié)果不矛盾的生物標(biāo)志物候選者的預(yù)選擇。若對照組可得，則生物標(biāo)志物與不同分支中臨床受益的關(guān)聯(lián)的差異可以是差異預(yù)測的跡象，使得該生物標(biāo)志物符合進(jìn)入進(jìn)一步考慮的條件。

2：有關(guān)臨床功效響應(yīng)預(yù)測性協(xié)變量的預(yù)選擇。

本文中所定義的臨床協(xié)變量的統(tǒng)計學(xué)預(yù)選擇與用于預(yù)選擇生物標(biāo)志物的辦法平行，而且它的方向也指向與臨床受益各度量的關(guān)聯(lián)強度。所以，原則上，與上文第1點下考慮的方法相同的方法適用。在統(tǒng)計標(biāo)準(zhǔn)之外，來自臨床經(jīng)驗和理論知識的標(biāo)準(zhǔn)可適用于預(yù)選擇有關(guān)臨床協(xié)變量。

臨床協(xié)變量的預(yù)測值可以與生物標(biāo)志物的預(yù)測值相合(interact with)。如果必要，可以考慮它們來改進(jìn)預(yù)測規(guī)則。

3：單變量水平的生物標(biāo)志物預(yù)測函數(shù)的選擇。

術(shù)語“預(yù)測函數(shù)”會以一般意義使用，指生物標(biāo)志物測量的數(shù)值函數(shù)，得出經(jīng)過定標(biāo)的數(shù)值，以暗示目標(biāo)預(yù)測。

一個簡單例子是特定截留c和生物標(biāo)志物測量x的Heaviside函數(shù)選擇，其中要做出二元預(yù)測，即A或B，那么，

若H(x-c)＝0，則預(yù)測A。

若H(x-c)＝1，則預(yù)測B。

這大概是在預(yù)測規(guī)則中使用單變量生物標(biāo)志物測量的最常見方式。如上所述“預(yù)測函數(shù)”的定義包括提到現(xiàn)有的練習(xí)數(shù)據(jù)集，其可用于探索預(yù)測可能性?？刹扇〔煌窂阶跃毩?xí)集獲得合適的截留c。首先，可使用第1點下提到的帶平滑樣條的散布圖來定義截留?；蛘?，可選擇一些分布百分點，例如中值或四分位。也可以通過調(diào)查所有可能截留依照它們關(guān)于臨床受益度量的預(yù)測潛力而系統(tǒng)性提取截留。然后，可以將這些結(jié)果繪圖，以容許手工選擇或為實現(xiàn)最佳而采用一些搜索算法。這可使用Cox模型基于某些臨床終點認(rèn)識到，在Cox模型中，在每一個測試截留，作為二元協(xié)變量使用生物標(biāo)志物。然后，可以一起考慮臨床終點的結(jié)果以選擇根據(jù)兩終點顯示預(yù)測的截留。

選擇預(yù)測函數(shù)的另一種不常用的辦法可基于自練習(xí)集得到的固定參數(shù)Cox回歸模型，其中以生物標(biāo)志物數(shù)值(可能是經(jīng)過轉(zhuǎn)換的)作為協(xié)變量。另一種可能性是將決策基于一些似然比(likelihood ratio)(或其單調(diào)轉(zhuǎn)換(monotonic transform))，其中目標(biāo)概率密度是在用于分拆預(yù)測狀態(tài)的練習(xí)集中預(yù)先確定的。然后，將生物標(biāo)志物塞入預(yù)測標(biāo)準(zhǔn)的一些函數(shù)中。

4：在單變量水平包括臨床協(xié)變量的生物標(biāo)志物預(yù)測函數(shù)的選擇。

單變量指只使用一項生物標(biāo)志物--就臨床協(xié)變量而言，這可以是多變量模型。這種辦法與沒有臨床協(xié)變量的搜索平行，只是此類方法應(yīng)當(dāng)容許摻入有關(guān)協(xié)變量信息。選擇截留的散布圖法只容許協(xié)變量的有限使用，例如二元協(xié)變量可以在圖內(nèi)用顏色編碼。如果分析依賴于一些回歸辦法，那么通常有利于協(xié)變量的使用(也是一次多個)?；谏衔牡?點下描述的Cox模型的截留搜索容許容易地?fù)饺雲(yún)f(xié)變量，并由此導(dǎo)致經(jīng)過協(xié)變量調(diào)整的單變量截留搜索。通過協(xié)變量進(jìn)行的調(diào)整可以像模型中的協(xié)變量那樣或經(jīng)由包括在分層分析中來進(jìn)行。

還有，預(yù)測函數(shù)的其它選項容許摻入多項協(xié)變量。

這對于作為預(yù)測函數(shù)的Cox模型選項是直截了當(dāng)?shù)?。這包括評估協(xié)變量對交互水平的影響的選項，這意味著例如，對于不同年齡組，適用不同預(yù)測標(biāo)準(zhǔn)。

對于似然比型預(yù)測函數(shù)，必須估算預(yù)測密度，包括協(xié)變量。為此目的，可使用多變量樣式識別方法學(xué)，或者可通過協(xié)變量的多重回歸(在密度估計之前)來調(diào)整生物標(biāo)志物數(shù)值。

CART技術(shù)(分類和回歸樹，Breiman et al.,Wadsworth,Inc.；New York,1984)可用于此目的，采用一項生物標(biāo)志物(原始測量水平)加多項臨床協(xié)變量并利用臨床受益度量作為響應(yīng)。搜索截留，會發(fā)現(xiàn)決策樹型的函數(shù)，其涉及預(yù)測的協(xié)變量。通過CART選擇的截留和算法常常是接近最佳的，而且可以通過考慮不同臨床受益度量來組合和統(tǒng)一。

5：多變量水平的生物標(biāo)志物預(yù)測函數(shù)的選擇。

若有數(shù)項生物標(biāo)志物候選者在不同的單變量預(yù)測函數(shù)選項中維持它們的預(yù)測潛力，則可通過生物標(biāo)志物的組合來實現(xiàn)進(jìn)一步改進(jìn)，即考慮多變量預(yù)測函數(shù)。

基于簡單的Heaviside函數(shù)模型，可評估生物標(biāo)志物組合，例如通過考慮生物標(biāo)志物數(shù)值的雙變量散布圖，其中指明了最佳的截留。然后可通過邏輯“和”和“或”運算符組合不同Heaviside函數(shù)來實現(xiàn)生物標(biāo)志物的組合，以實現(xiàn)改良的預(yù)測。

CART技術(shù)可用于此目的，采用多項生物標(biāo)志物(原始測量水平)和臨床受益度量作為響應(yīng)，以獲得生物標(biāo)志物的截留和決策樹型預(yù)測函數(shù)。通過CART選擇的截留和算法常常是接近最佳的，而且可以通過考慮不同臨床受益度量來組合和統(tǒng)一。

可以在不同水平采用Cox回歸。第一種方式是以二元方式摻入多項生物標(biāo)志物(即基于具有一些截留的Heaviside函數(shù))。另一種選擇是(在合適的轉(zhuǎn)換后)以計量方式采用生物標(biāo)志物或二元與計量辦法的混和體。進(jìn)化多變量預(yù)測函數(shù)屬于上文第3點下描述的Cox型。

多變量似然比辦法(likelihood ratio approach)難以執(zhí)行，但是為多變量預(yù)測函數(shù)呈現(xiàn)了另一個選項。

6：在多變量水平包括臨床協(xié)變量的生物標(biāo)志物預(yù)測函數(shù)的選擇。

若有多項有關(guān)臨床協(xié)變量，則可通過組合多項生物標(biāo)志物與多項臨床協(xié)變量來實現(xiàn)進(jìn)一步的改進(jìn)。就包括多項臨床協(xié)變量的可能性而言，評估不同的預(yù)測函數(shù)選項。

基于關(guān)于生物標(biāo)志物的Heaviside函數(shù)的簡單邏輯組合，可以將別的協(xié)變量包括至基于在練習(xí)集中得到的邏輯回歸模型的預(yù)測函數(shù)。

可以容易地與別的協(xié)變量(可以在預(yù)測算法中包括這些)一起使用CART技術(shù)和進(jìn)化決策樹(evolving decision tree)。

所有基于Cox回歸的預(yù)測函數(shù)可使用別的臨床協(xié)變量。存在評估協(xié)變量對交互水平的影響的選擇，這意味著例如，對于不同年齡組，適用不同的預(yù)測標(biāo)準(zhǔn)。

多變量似然比辦法不能直接延伸至別的協(xié)變量的使用。

微陣列分析

使用開放源碼編程語言R(R Core Team(2013)R:A Language and Environment for Statistical Computing.R Foundation for Statistical Computing,Vienna,Austria)實施所有分析步驟。使用RefPlus R包(Harbron et al.Bioinformatics.23(18):2493-2494,2007)將來自所有Affymetrix微陣列的原始數(shù)據(jù)針對共同參照分布標(biāo)準(zhǔn)化。

實施例2：AvaGlio研究

AvaGlio試驗評估貝伐珠單抗與替莫唑胺和放療組合用于新診斷的成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的功效和安全性。這項研究設(shè)計為一項貝伐珠單抗加化療較之單獨的化療的前瞻性，隨機化，雙盲，安慰劑對照的III期評估。要成為合格，患者必須具有新診斷的成膠質(zhì)細(xì)胞瘤，有手術(shù)切除或活檢后建立的組織診斷。通過將貝伐珠單抗添加至化療和放療，AvaGlio試驗的目標(biāo)是改善具有有限的治療選項且面對特別差的預(yù)后的這群患者的總體存活(OS)和無進(jìn)展存活(PFS)。主要目的是比較隨機化至僅替莫唑胺(TMZ)和放療或替莫唑胺和放療加貝伐珠單抗的患者的OS和PFS。

AvaGlio研究的概覽

這項試驗由三個階段(并行，維持，和單一療法)和兩個治療分支(TMZ和放療(RT)(分支1)，和TMZ和RT加貝伐珠單抗(分支2))組成?；颊唠S機指派(1:1)至任一分支。

分支1(單獨的化療和放療)：合格患者接受一周5天的2Gy RT持續(xù)6周和每天的口服75mg/m²TMZ持續(xù)6周(自RT的第一天至最后一天)，與每2周的i.v.10mg/kg安慰劑組合。4周治療休息后，合格患者接受6個周期每個四周日程表的第1-5天的150-200mg/m²TMZ，與每2周的i.v.10mg/kg安慰劑組合?？诜┯肨MZ，始于150mg/m²劑量，可以擴(kuò)大。然后繼續(xù)安慰劑單一療法(每3周15mg/kg)直至疾病進(jìn)展。在疾病進(jìn)展時，根據(jù)調(diào)查人員的斟酌治療患者。

分支2(化療和放療加貝伐珠單抗)：合格患者接受一周5天的2Gy RT持續(xù)6周和每天的口服75mg/m²TMZ持續(xù)6周(自RT的第一天至最后一天)，與每2周的i.v.10mg/kg貝伐珠單抗組合。4周治療休息后，合格患者接受6個周期每個四周日程表的第1-5天的150-200mg/m²TMZ，與每2周的i.v.10mg/kg貝伐珠單抗組合?？诜┯肨MZ，始于150mg/m²劑量，可以擴(kuò)大。然后繼續(xù)貝伐珠單抗單一療法(每3周15mg/kg)直至疾病進(jìn)展。在疾病進(jìn)展時，根據(jù)調(diào)查人員的斟酌治療患者。

初始貝伐珠單抗輸注在90分鐘里，后續(xù)輸注在60分鐘里，然后在30分鐘里，視耐受情況而定。在RT和TMZ治療的最后一天，即TMZ治療休息開始前那天施用貝伐珠單抗。

PFS分析基于使用腦MRI的腫瘤評估MacDonald響應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)(改良WHO標(biāo)準(zhǔn))和Macdonald et al.，J.Clin.Oncol.8:1277-80，1990)記載的神經(jīng)學(xué)評估。在基線時，在4周治療休息結(jié)束時，然后每8周實施腫瘤評估。

研究群體–納入標(biāo)準(zhǔn)

納入年齡≥18歲且具有新診斷的幕上成膠質(zhì)細(xì)胞瘤(GBM)(具有手術(shù)切除或活檢后確立的組織診斷)的患者。這包括具有較低級星形細(xì)胞瘤的在先診斷且已經(jīng)升級至組織學(xué)驗證的GBM的未治療的化療和放療患者。患者必須具有≤2的WHO性能狀態(tài)。

研究群體–排除標(biāo)準(zhǔn)

術(shù)后腦MRI上最近出血的證據(jù)排除候選患者。然而，允許具有含鐵血黃素的臨床無癥狀存在，正在解決中的涉及手術(shù)的出血變化，和腫瘤中點狀出血的存在的患者進(jìn)入研究。先前為登入一項臨床試驗針對MGMT狀態(tài)的集中篩選；用于成膠質(zhì)細(xì)胞瘤和低級星形細(xì)胞瘤的任何在先化療(包括含有卡莫司汀的華夫餅或免疫療法(包括疫苗療法)；任何在先的對腦的放療或在先的導(dǎo)致照射場潛在交疊的放療；在先的高血壓危象或高血壓腦病的歷史；隨機化之前1個月內(nèi)依照NCI-CTC標(biāo)準(zhǔn)的≥2級咳血的歷史；出血素質(zhì)或凝血病(在治療性抗凝缺失下)的證據(jù)；隨機化之前28天內(nèi)的重大手術(shù)規(guī)程，開放式活檢，顱內(nèi)活檢，腦室腹膜分流術(shù)或顯著外傷性損傷；隨機化之前7天內(nèi)的芯活檢(排除顱內(nèi)活檢)或其它微小手術(shù)規(guī)程也排除患者。中央血管通路裝置(CVAD)的安置，如果在貝伐珠單抗/安慰劑施用之前2天內(nèi)實施的話；隨機化之前6個月內(nèi)腹瘺或胃腸穿孔的歷史；隨機化之前6個月內(nèi)顱內(nèi)膿腫的歷史；嚴(yán)重非愈合傷口，活動性潰瘍，或未治療的骨折也排除患者。就妊娠或哺乳女性而言，在研究治療開始之前7天內(nèi)或在14天內(nèi)(在研究治療開始之前7天內(nèi)有確認(rèn)性尿妊娠試驗)評估血清妊娠試驗。還排除生育女性(定義為最后一次月經(jīng)后<2年且未手術(shù)絕育)和不使用高度有效的激素或非激素的避孕手段(即子宮內(nèi)避孕裝置)的男性；具有中風(fēng)的歷史或隨機化之前≤6個月內(nèi)短暫性缺血發(fā)作(TIA)，隨機化之前≤6個月內(nèi)的控制不當(dāng)?shù)母哐獕?持續(xù)的收縮>150mmHg和/或舒張>100mmHg)或重大血管病(包括需要手術(shù)修復(fù)的主動脈瘤或最近的周圍動脈血栓形成)的患者。還排除具有隨機化之前≤6個月內(nèi)的心肌梗死或不穩(wěn)定心絞痛，紐約心臟協(xié)會(NYHA)II級或更高級充血性心力衰竭(CHF)，或已知的對任何研究藥物或賦形劑的超敏感性的患者。

實施例3：AvaGlio數(shù)據(jù)集中具有免疫系統(tǒng)作用的基因的無監(jiān)督分析

為了研究免疫基因表達(dá)對于原發(fā)性GBM中貝伐珠單抗治療的潛在預(yù)測價值，通過無監(jiān)督分析將AvaGlio Nanostring數(shù)據(jù)中的潛在免疫相關(guān)基因細(xì)分成關(guān)聯(lián)基因簇?；蜃⑨屖亲訰eactome數(shù)據(jù)庫(Croft et al.Nucleic Acids Res.42(D1):D472-D477,2014；Croft.Methods Mol.Biol.1021:273-283,2013；和Milacic et al.Cancers.4(4):1180-1211,2012)和基因本體論(GO)數(shù)據(jù)庫(Ashburner et al.Nature Genetics.25:25-29,2000)取得的，如由reactome.db(Ligtenberg W.R package version 1.48.0)和org.Hs.eg.db(Carlson M.R package version 2.14.0)Bioconductor(Fred Hutchinson Cancer Research Center)包提供的。

取得注釋為GO生物學(xué)過程免疫應(yīng)答(或它的子項任一)或Reactome途徑免疫系統(tǒng)的所有1,792種獨特人基因符號。在1,792種由Reactome和GO注釋的基因中，AvaGlio Nanostring代碼集含有193種鑒定為免疫基因的基因。

接下來，我們在AvaGlio數(shù)據(jù)集間檢查193種帶注釋的免疫基因的表達(dá)。對于無監(jiān)督分析(聚簇)，將經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化的AvaGlio Nanostring數(shù)據(jù)集中并在生物標(biāo)志物可評估的所有339份異檸檬酸脫氫酶1(IDH1)野生型樣品間定標(biāo)。為了鑒定在AvaGlio數(shù)據(jù)集間展示一致關(guān)聯(lián)表達(dá)的基因小組，我們使用中心點周圍分割(PAM)算法(Reynolds et al.Journal of Mathematical Modeling and Algorithms.5:475-504,1992)將該數(shù)據(jù)集分割成簇，返回15個簇。使用“共有聚簇”(Monti et al.Machine Learning.52:91-118,2003)獲得了強健的基因小組，由此例如聚簇重復(fù)1,000次，每一次包括80％的可得樣品和80％的可得基因的另一份隨機樣品。無監(jiān)督分析將193種基因分組成15個簇(簇1-15)，其成員在AvaGlio生物標(biāo)志物數(shù)據(jù)集間顯示一致表達(dá)(圖1)。對于顯現(xiàn)，使用Pearson相關(guān)性作為距離度量和用于聚簇的ward.D2方法通過分級聚簇對每個PAM簇內(nèi)的基因排序。

實施例4：基因簇和預(yù)先定義的GBM亞型之間的相關(guān)性

AvaGlio樣品先前已經(jīng)依照Phillips et al.,Cancer Cell.9(3):157-173,2006分類入GBM亞型，將每份樣品與四種標(biāo)簽之一關(guān)聯(lián)：前神經(jīng)，間充質(zhì)，增殖性，或未分類。將樣品依照Phillips亞型重排序揭示了許多基因簇的表達(dá)與一種或多種GBM亞型有關(guān)聯(lián)(圖1)。例如，簇4和5中的基因典型地在間充質(zhì)樣品中以更高水平表達(dá)，而簇2中的基因在前神經(jīng)樣品中顯示最高水平的表達(dá)。

為了描述每個簇的表達(dá)，我們通過計算所有所含基因間的均值，為每個基因小組提供一個連續(xù)數(shù)值表達(dá)得分來總結(jié)表達(dá)(圖2)。如上文概述的，15個基因簇中的許多的平均表達(dá)得分與一種或多種GBM亞型差異有關(guān)聯(lián)(圖2)。例如，來自簇1和15的基因在增殖性腫瘤中最高度表達(dá)；來自簇2的基因在前神經(jīng)腫瘤中最高度表達(dá)；來自簇3的基因顯示前神經(jīng)腫瘤中的高表達(dá)和增殖性腫瘤中的中等表達(dá)；而來自簇4，5，7和13的基因在間充質(zhì)腫瘤中最高度表達(dá)。

實施例5：AvaGlio研究中免疫基因簇對于貝伐珠單抗功效的預(yù)測價值

接下來，我們檢查15個基因簇任一的均值表達(dá)是否預(yù)測在生物標(biāo)志物可得的AvaGlio群體中的總體存活(OS)方面的貝伐珠單抗治療效果。對于每個簇，擬合多變量Cox比例危害(CoxPH)模型，包括已知臨床預(yù)后共變量(例如年齡，皮質(zhì)類固醇，切除范圍，性別，Karnofsky性能得分(KPS)，O-6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(MGMT)啟動子的甲基化狀態(tài)，迷你精神狀態(tài)檢查得分(MMSE)，遞歸分割分析(RPA)類別，和WHO性能得分)和對指派至該簇的基因觀察到的平均基因表達(dá)二者。

如圖3中所示，兩個簇(簇2和簇6)的平均表達(dá)與顯著的基因表達(dá)和處理分支之間相互作用的p值(p<0.05)有關(guān)聯(lián)，指示這兩個簇對于貝伐珠單抗治療效果的預(yù)測價值。

實施例6：簇2基因在AvaGlio中與前神經(jīng)Phillips亞型有關(guān)聯(lián)且是預(yù)后性的和預(yù)測性的

簇2含有下述14種基因：AKT3，CDH1，CYP27B1，DNM3，DYNLL1，ERBB3，KLRK1，MBP，MDM2，NCAM1，PDGFRA，PRKCZ，SNCA，和TNFRSF21。雖然與免疫應(yīng)答間接有關(guān)聯(lián)，但是大多數(shù)這些基因不是免疫細(xì)胞特有的，而是參與例如用于許多不同生物學(xué)背景的信號傳導(dǎo)途徑。在簇2基因中，NCAM1在Nanostring代碼集中可得的由Phillips et al.Cancer Cell.9(3):157-173,2006定義的32種分類器基因之中且代表前神經(jīng)亞型的一種標(biāo)志物。簇2基因中的兩種，PRKCZ和DNM3，也通過Phillips分類得到鑒定，但是沒有包括在分類器的最終列表中。另外，簇2基因中的四種，ERBB3，DNM3，KLRK1，和NCAM1，包括在由TCGA聯(lián)盟(Verhaak et al.Cancer Cell.17(1):98-110，2010)定義的840種GBM亞型標(biāo)志物中，而且所有四種基因定義為與前神經(jīng)TCGA亞型有關(guān)聯(lián)。

平均而言，簇2中的基因在前神經(jīng)腫瘤中最高度表達(dá)(圖4)。平均而言，圖4還顯示簇2基因展現(xiàn)間充質(zhì)腫瘤中的低表達(dá)水平和增殖性腫瘤中的中等表達(dá)水平。

當(dāng)將CoxPH模型擬合至完全生物標(biāo)志物可得AvaGlio群體的總體存活(OS)時，簇2的平均基因表達(dá)顯著地既是預(yù)后性的(p＝0.0204)又是預(yù)測性的(p＝0.0216)(圖5)。比較而言，在每種Phillips GBM亞型內(nèi)分開擬合相同CoxPH模型時沒有檢測到簇2基因表達(dá)的預(yù)測價值(圖6-8)。最后，為了排除由于樣本量縮小引起效力降低導(dǎo)致每種亞型內(nèi)的預(yù)后或預(yù)測效果喪失，我們將一種模型擬合至分類為非前神經(jīng)的樣品(即，增殖性，間充質(zhì)，和未分類樣品)的組合集。再次，當(dāng)排除前神經(jīng)患者時沒有檢測到顯著的預(yù)后及預(yù)測效果(圖9)。

為了展示具有簇2中基因的高/低表達(dá)的患者的OS，我們將簇2基因的表達(dá)二元化，其中AvaGlio中值以上的患者認(rèn)為是“生物標(biāo)志物高”而AvaGlio中值以下的患者認(rèn)為是“生物標(biāo)志物低”。如通過圖10A-10D中的Kaplan-Meier存活曲線所示，特別是，簇2基因的高表達(dá)(“生物標(biāo)志物高”組)預(yù)測受益于將VEGF拮抗劑(例如貝伐珠單抗)添加至標(biāo)準(zhǔn)護(hù)理治療(p＝0.038)。

實施例7：簇6基因在AvaGlio中與間充質(zhì)Phillips亞型有弱關(guān)聯(lián)且是預(yù)后性的和預(yù)測性的

簇6含有下述13種基因：AXL，BCL2L1，CD36，ETS1，ICAM2，IL17A，IRS2，PDGFRB，RPL13A，TGFB1，TNFRSF4，TNFSF4，和ZBTB16。例如，它包括編碼OX40/CD134(TNFRSF4)及其結(jié)合配偶，OX40L/CD252(TNFSF4)二者的基因，它們是在活化的CD4(+)和CD8(+)T細(xì)胞上以及在多種其它淋巴樣和非淋巴樣細(xì)胞上表達(dá)的腫瘤壞死因子受體/腫瘤壞死因子超家族的成員。OX40已知在維持免疫應(yīng)答中具有關(guān)鍵作用。另外，簇6包括牽涉免疫監(jiān)視的別的基因，諸如AXL受體酪氨酸激酶(先天免疫應(yīng)答和凋亡細(xì)胞的吞噬清除的調(diào)節(jié)物)和ICAM2(它牽涉腫瘤發(fā)生期間的免疫監(jiān)視)。簇6中還包括其產(chǎn)物牽涉編程性細(xì)胞死亡的基因，諸如CD36(血管發(fā)生的負(fù)調(diào)節(jié)物，它還參與凋亡細(xì)胞的內(nèi)在化)和BCL2L1(凋亡的調(diào)節(jié)物)。這些基因無一包括在亞型簽名中，也沒有包括在由Phillips等人定義的擴(kuò)充標(biāo)志物集中，而且簇6中只有一種基因，IRS2，是作為如由TCGA聯(lián)盟(Verhaak et al.Cancer Cell.17(1):98-110,2010)定義的經(jīng)典GBM亞型的標(biāo)志物被包括的。

平均而言，簇6中的基因在間充質(zhì)腫瘤中最高度表達(dá)(圖11)。平均而言，圖11還顯示簇6基因展現(xiàn)增殖性和前神經(jīng)腫瘤中的更低表達(dá)水平。

當(dāng)將CoxPH模型擬合至完全生物標(biāo)志物可得AvaGlio群體的總體存活(OS)時，簇6的平均基因表達(dá)顯著地既是預(yù)后性的(p＝1.3x10^-6)又是預(yù)測性的(p＝0.0038)(圖12)。比較而言，在每種Phillips GBM亞型內(nèi)分開擬合相同CoxPH模型時沒有檢測到簇6基因表達(dá)的預(yù)測價值(圖13-15)。最后，為了排除由于樣本量縮小引起效力降低導(dǎo)致每種亞型內(nèi)的預(yù)后或預(yù)測效果喪失，我們將一種模型擬合至分類為非前神經(jīng)的樣品(即，增殖性，間充質(zhì)，和未分類樣品)的組合集，如上文我們對簇2基因進(jìn)行的。然而，與簇2基因相反，簇6基因在非前神經(jīng)組內(nèi)保持顯著是預(yù)后性的(p＝2.9x10^-6)且預(yù)測性的(p＝0.0064)(圖16)。

為了展示具有簇6中基因的高/低表達(dá)的患者的OS，我們將簇6基因的表達(dá)二元化，其中AvaGlio中值以上的患者認(rèn)為是“生物標(biāo)志物高”而AvaGlio中值以下的患者認(rèn)為是“生物標(biāo)志物低”。如通過圖17A-17D中的Kaplan-Meier存活曲線所示，特別是，簇6基因的低表達(dá)(“生物標(biāo)志物低”組)預(yù)測受益于將VEGF拮抗劑(例如貝伐珠單抗)添加至標(biāo)準(zhǔn)護(hù)理治療(p＝0.044)。

雖然為了清楚理解的目的已經(jīng)通過舉例說明較為詳細(xì)地描述了前述發(fā)明，但是說明書和實施例不應(yīng)解釋為限制本發(fā)明的范圍。通過述及明確完整收錄本文中引用的所有專利，專利申請，科學(xué)參考文獻(xiàn)，和Genbank登錄號的公開內(nèi)容用于所有目的，就像通過述及具體和個別收錄每一篇專利，專利申請，科學(xué)參考文獻(xiàn)，和Genbank登錄號。

序列表

<110> 基因泰克公司（Genentech, Inc.）

豪夫邁·羅氏有限公司（F. Hoffmann-La Roche AG）

<120> 診斷方法和用于治療成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的組合物

<130> 50474-096WO2

<150> US 62/024,244

<151> 2014-07-14

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的構(gòu)建物

<400> 1

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile

35 40 45

Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 2

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的構(gòu)建物

<400> 2

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe

50 55 60

Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120