一種人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系及其建立方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系及其建立方法和應(yīng)用。該人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCCNO:C201115。該人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系通過(guò)來(lái)自臨床標(biāo)本中的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞經(jīng)原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)建立，可直接用于體外藥物篩選，或在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生人腦膠質(zhì)瘤，建立人腦膠質(zhì)瘤動(dòng)物模型，用于篩選治療人腦膠質(zhì)瘤的候選藥物。該人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系性狀穩(wěn)定，可穩(wěn)定多次傳代，體外傳代至第50代性狀保持穩(wěn)定；可在體外、體內(nèi)分析人腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤的發(fā)病機(jī)制，藥物敏感性及轉(zhuǎn)移性等相關(guān)特性，進(jìn)而建立體外、體內(nèi)兩個(gè)相互關(guān)聯(lián)的抗腦膠質(zhì)瘤藥物篩選平臺(tái)，為人腦膠質(zhì)瘤研究提供新的更接近于臨床腫瘤生物學(xué)特性的實(shí)驗(yàn)材料。
【專利說(shuō)明】一種人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系及其建立方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于細(xì)胞系領(lǐng)域，特別涉及一種人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系及其建立方法和應(yīng)用?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]生長(zhǎng)于顱內(nèi)的腫瘤通稱為腦瘤，包括由腦實(shí)質(zhì)發(fā)生的原發(fā)性腦瘤和由身體其他部位轉(zhuǎn)移至顱內(nèi)的繼發(fā)性腦瘤。原發(fā)性腦瘤依其生物特性又分良性和惡性。良性腦瘤生長(zhǎng)緩慢，包膜較完整，不浸潤(rùn)周?chē)M織及分化良好；惡性腦瘤生長(zhǎng)較快，無(wú)包膜，界限不明顯，呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，分化不良。
[0003]腦腫瘤中膠質(zhì)細(xì)胞瘤發(fā)病率最高，約占40.49%，綜合發(fā)病年齡高峰在30~40歲，或10~20歲。大腦半球發(fā)生的膠質(zhì)瘤約占全部膠質(zhì)瘤的51.4%，以星形細(xì)胞瘤為最多，其次是膠質(zhì)細(xì)胞瘤和少枝膠質(zhì)細(xì)胞瘤,腦室系統(tǒng)也是膠質(zhì)瘤較多的發(fā)生部位，占膠質(zhì)瘤總數(shù)的23.9%，主要為管膜瘤，髓母細(xì)胞瘤，星形細(xì)胞瘤，小腦膠質(zhì)瘤占膠質(zhì)瘤總數(shù)的13%，主要為星形細(xì)胞瘤。腦膠質(zhì)瘤具有發(fā)病率、復(fù)發(fā)率、死亡率高和治愈率低等“三高一低”的特點(diǎn)。近幾十年來(lái)，原發(fā)性惡性腦腫瘤發(fā)生率逐年遞增，中老年人群尤為明顯。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，中國(guó)腦膠質(zhì)瘤年發(fā)病率為3~6人/10萬(wàn)人。在目前的技術(shù)條件下，膠質(zhì)瘤特別是惡性度高的膠質(zhì)瘤預(yù)后還很不樂(lè)觀。美國(guó)最新資料顯示，在所有膠質(zhì)細(xì)胞瘤中占半數(shù)的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者I年生存率約為30%，5年生存率不足5%。
[0004]目前,在腦腫瘤臨床治療常用手段主要有手術(shù)治療、放射治療和化療,另外還有一些比較新的治療方法，如免疫治療、以EGFR、IGFR、I3DGFR等為靶點(diǎn)的靶向治療和抗血管生成的治療方法。這些方 法通常根據(jù)病人的實(shí)際情況進(jìn)行聯(lián)合應(yīng)用，但對(duì)于腦腫瘤的治療效果卻不盡人意。因此臨床上不僅需要新型的治療方法，同時(shí)也需要開(kāi)發(fā)有效的治療藥物。
[0005]然而目前在全世界范圍，用于藥物開(kāi)發(fā)和基礎(chǔ)研究的腦瘤細(xì)胞系屈指可數(shù)，具有亞洲人種遺傳背景的腦瘤細(xì)胞系更是鳳毛麟角。同臨床上種類(lèi)繁多的腦瘤病人相比，腦瘤細(xì)胞系稀少的問(wèn)題嚴(yán)重地制約了相關(guān)的臨床前研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題就是針對(duì)現(xiàn)今尚不存在建立好或可直接購(gòu)買(mǎi)的人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系這一難題，提供一種人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系及其制備方法和應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案之一是:一種人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞，其保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO:C201115。
[0008]本發(fā)明還提供如上所述的人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的子代細(xì)胞。
[0009]本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案之二是:一種本發(fā)明所述的人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞及其子代細(xì)胞的用途，即用于在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生腦膠質(zhì)瘤。
[0010]其中所述用途較佳地包括制備腦膠質(zhì)瘤動(dòng)物模型。其中所述制備動(dòng)物模型的方法為本領(lǐng)域常規(guī)使用的制備方法。所述動(dòng)物模型的制備方法較佳地包括以下步驟:體外大量培養(yǎng)和收集本發(fā)明所述的人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞，將一定量的細(xì)胞懸液皮下接種哺乳動(dòng)物，接種一段時(shí)間后，腫瘤開(kāi)始形成并生長(zhǎng)，并能夠在小鼠皮下進(jìn)行傳代。其中所述的哺乳動(dòng)物較佳地包括各種哺乳動(dòng)物，更佳地是免疫缺陷小鼠，本發(fā)明所述哺乳動(dòng)物優(yōu)選地為嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷小鼠(SCID小鼠)。所述的接種的方式為本領(lǐng)域常規(guī)使用的接種方式。所述接種方式較佳地包括皮下穿刺接種，原位接種或者腎囊膜內(nèi)接種。本發(fā)明所述腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞接種方式優(yōu)選地為皮下穿刺接種。
[0011]本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案之三是:一種篩選治療腦膠質(zhì)瘤的候選藥物的方法，其中較佳地包括以下步驟:將測(cè)試化合物施用于細(xì)胞模型中，施用后抑制細(xì)胞增殖或?qū)е录?xì)胞凋亡的測(cè)試化合物為治療人腦膠質(zhì)瘤的候選化合物，其中所述的細(xì)胞模型是本發(fā)明所述的人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系。
[0012]其中所述篩選方法為本領(lǐng)域常規(guī)使用的篩選方法，所述篩選方法較佳地包括以下步驟:
[0013](I)將一定數(shù)量的人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞或其子代細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板孔中，培養(yǎng)24小時(shí)；
[0014](2)將測(cè)試化合物稀釋成不同濃度施用于細(xì)胞，化合物作用72小時(shí)后通過(guò)測(cè)定細(xì)胞的活力，計(jì)算不同濃度的化合物對(duì)細(xì)胞的增殖抑制能力，計(jì)算化合物半數(shù)抑制濃度，用以判斷測(cè)試化合物的抗腫瘤能力。
[0015]其中步驟(1)所述人腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤或其子代細(xì)胞的接種量較佳地為:5000/孔。步驟(2)所述檢測(cè)不同化合物半數(shù)抑制濃度，用以判斷測(cè)試化合物的抗腫瘤能力的方法為本領(lǐng)域常規(guī)檢測(cè)和計(jì)算方法。其中所述半數(shù)抑制濃度檢測(cè)方法較佳地包括ATP生物發(fā)光法或MTT法，本發(fā)明所述檢測(cè)方法優(yōu)選地為ATP生物發(fā)光法。所述的ATP生物發(fā)光法是通過(guò)對(duì)細(xì)胞中的ATP進(jìn)行定量測(cè) 定來(lái)檢測(cè)培養(yǎng)物中活細(xì)胞數(shù)目的一種均質(zhì)檢測(cè)方法，其中所述的ATP是活細(xì)胞新陳代謝的一個(gè)重要指標(biāo)。
[0016]本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案之四是:一種篩選治療腦膠質(zhì)瘤的候選藥物的方法，其中較佳地包括以下步驟:將測(cè)試化合物施用于動(dòng)物模型，施用后導(dǎo)致腦膠質(zhì)瘤癥狀改善或治愈的測(cè)試化合物就是治療人腦膠質(zhì)瘤的候選化合物，其中所述的動(dòng)物模型具有本發(fā)明所述的人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞所導(dǎo)致的腦膠質(zhì)瘤。
[0017]其中所述藥物篩選方法為本領(lǐng)域常規(guī)的藥物篩選方法。所述藥物篩選方法較佳地包括以下步驟:
[0018](I)將所述的人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞或其子代細(xì)胞制備成細(xì)胞懸液，接種于哺乳動(dòng)物皮下進(jìn)行飼養(yǎng)，獲得人腦膠質(zhì)瘤動(dòng)物模型；
[0019](2)將測(cè)試化合物施用于動(dòng)物模型，施用后導(dǎo)致腦膠質(zhì)瘤癥狀改善或治愈的測(cè)試化合物就是治療人腦膠質(zhì)瘤的候選化合物。
[0020]其中步驟(1)所述的哺乳動(dòng)物較佳地包括免疫缺陷小鼠，本發(fā)明所述的哺乳動(dòng)物優(yōu)選地是嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷小鼠(SCID小鼠)。所述的接種方式為本領(lǐng)域常規(guī)的接種方式。所述接種方式較佳地包括皮下穿刺接種，原位接種或者腎囊膜內(nèi)接種。本發(fā)明所述人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞接種方式優(yōu)選地為皮下穿刺接種，所述接種的細(xì)胞量較佳地為1.0~2X IO7個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞接種量?jī)?yōu)選地為1.0X107個(gè)細(xì)胞。
[0021]其中步驟(2)所述的施用方式為本領(lǐng)域常規(guī)的施用方式，其中所述施用方式較佳地包括:將測(cè)試化合物通過(guò)尾靜脈注射、口服、腹腔注射和腫瘤局部用藥中的一種或幾種方式施用于人腦膠質(zhì)瘤荷瘤動(dòng)物。所述實(shí)驗(yàn)中的對(duì)照例較佳地為:同時(shí)使用不含測(cè)試化合物的溶劑施用于人腦膠質(zhì)瘤荷瘤動(dòng)物作為對(duì)照。
[0022]本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案之五是:一種本發(fā)明所述人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的建立方法，其中包括以下步驟，
[0023]( I)獲得新鮮的臨床人腦膠質(zhì)瘤手術(shù)切除標(biāo)本，剪切成小塊，使用膠原酶消化腫瘤塊；
[0024](2)將步驟(1)所得的分離細(xì)胞進(jìn)行癌細(xì)胞的原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。
[0025]其中步驟(2)所述的原代培養(yǎng)為本領(lǐng)域常規(guī)的原代培養(yǎng)技術(shù)。本發(fā)明所述原代培養(yǎng)方法較佳地包括以下步驟:將步驟(1)所得的人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞重懸于DMEM/F12培養(yǎng)液，所述DMEM/F12培養(yǎng)液較佳地包括:lXB27、20ng/ml人表皮生長(zhǎng)因子、20ng/ml人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、100U/ml青霉素G和100 u g/ml硫酸鏈霉素，置入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度較佳地為37°C，培養(yǎng)時(shí)間較佳地為4~5天，培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)選地為4天，CO2含量較佳地為5%(V/V)進(jìn)行培養(yǎng)。
[0026]其中步驟(2)所述的傳代培養(yǎng)方法為本領(lǐng)域常規(guī)的細(xì)胞傳代培養(yǎng)方法。其中所述傳代方法較佳地包括以下步驟:收集舊培養(yǎng)基，離心去上清，所述離心條件優(yōu)選地為:300g離心3分鐘,細(xì)胞沉淀使用Accutase重懸消化,所述Accutase購(gòu)自sigma貨號(hào)為A6964,待細(xì)胞分散后加入HBSS終止消化；離心收集的細(xì)胞重懸于DMEM/F12培養(yǎng)液中，于新的細(xì)胞培
養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。
[0027]細(xì)胞培養(yǎng)四代后 ，更換為新鮮RPMI 1640培養(yǎng)液，所述RPMI 1640培養(yǎng)液成分優(yōu)選地包括:10%胎牛血清、100U/ml青霉素G和IOOii g/ml硫酸鏈霉素培養(yǎng)。細(xì)胞由懸浮生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變成貼壁生長(zhǎng)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。其中所述傳代培養(yǎng)方法為本領(lǐng)域常規(guī)使用的細(xì)胞傳代培養(yǎng)方法。本發(fā)明所述傳代培養(yǎng)方法較佳地包括以下步驟:吸棄舊培養(yǎng)液，向瓶中加入新鮮的
0.05%胰蛋白酶溶液，待細(xì)胞脫落后，加入新鮮的RPMI 1640培養(yǎng)液，仔細(xì)吹打分散細(xì)胞，少量在瓶壁上變圓但沒(méi)有脫落的細(xì)胞，用無(wú)菌細(xì)胞刮刀輕輕刮擦培養(yǎng)瓶表面，收集全部細(xì)胞，離心，計(jì)數(shù)，接種于新的培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)。
[0028]本發(fā)明所用的原料或試劑除特別說(shuō)明之外，均市售可得。
[0029]相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果如下:本發(fā)明提供的人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞性狀穩(wěn)定，可穩(wěn)定多次傳代，為腦癌研究提供了新的更接近于臨床腫瘤生物學(xué)特性的實(shí)驗(yàn)材料。本發(fā)明所得的細(xì)胞系既可以直接作為體外抗腦膠質(zhì)瘤藥物篩選模型，也可以通過(guò)在哺乳動(dòng)物如免疫缺陷小鼠體內(nèi)多次傳代，獲得高成瘤性人腦膠質(zhì)瘤動(dòng)物模型，進(jìn)而建立體外、體內(nèi)兩個(gè)相關(guān)聯(lián)的抗腦膠質(zhì)瘤藥物篩選平臺(tái)?？衫盟玫钠脚_(tái)進(jìn)行腦膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)理、耐藥性以及轉(zhuǎn)移機(jī)理的研究，進(jìn)而尋找腦膠質(zhì)瘤發(fā)病機(jī)制、耐藥性和轉(zhuǎn)移的特征生物標(biāo)志物，是人腦癌基礎(chǔ)研究和臨床前期應(yīng)用的理想細(xì)胞系。本發(fā)明建立的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系不僅豐富了世界腦瘤細(xì)胞庫(kù)，也為基于中國(guó)人群遺傳背景開(kāi)展的研究提供了有力的科研資料。
[0030]牛物材料的保藏
[0031]本發(fā)明的人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞，于2011年4月26日保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)(地址:中國(guó).武漢.武漢大學(xué))，培養(yǎng)物名稱為人源腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞GLC-001，保藏編號(hào)為 CCTCC NO:C201115o【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0032]以下結(jié)合【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】本發(fā)明的特征和有益效果。
[0033]圖1是GLC-001細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察圖(100X )。
[0034]圖2是GLC-001細(xì)胞的染色體分析圖。A.GLC-001細(xì)胞；B.小鼠細(xì)胞染色體(對(duì)照)。
[0035]圖3是GLC-001細(xì)胞的短片段重復(fù)序列(STR)分析結(jié)果圖。A~D是GLC-001細(xì)胞不同短片段的STR分析結(jié)果圖。
[0036]圖4是GLC-001細(xì)胞免疫組化染色(DAB法)圖譜。A:陰性對(duì)照(100X )，B:膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物標(biāo)志物神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(GFAP 100X )
[0037]圖5是GLC-001細(xì)胞倍增時(shí)間曲線圖。
[0038]圖6是GLC-001細(xì)胞周期分析圖。
[0039]圖7是體外測(cè)試多個(gè)抗癌藥物對(duì)GLC-001細(xì)胞增殖的抑制作用示意圖。A鹽酸伊立替康對(duì)GLC-001細(xì)胞增殖的抑制作用，B鹽酸伊立替康對(duì)U-87MG細(xì)胞增殖的抑制作用，C洛莫司汀對(duì)GLC-001細(xì)胞增殖的抑制作用，D洛莫司汀對(duì)U-87MG細(xì)胞增殖的抑制作用，E尼莫司汀對(duì)GLC-001細(xì)胞增殖的抑制作用，F(xiàn)尼莫司汀對(duì)U-87MG細(xì)胞增殖的抑制作用。
[0040]圖8是GLC-001細(xì) 胞的成瘤性示意圖。
[0041]圖9是GLC-001細(xì)胞在裸小鼠體內(nèi)成瘤的病理組織切片(100X )圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0042]下面用實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件，室溫為25°C。
[0043]實(shí)施例1GLC-001細(xì)胞的制備
[0044]從南通市腫瘤醫(yī)院獲得新鮮的臨床腦膠質(zhì)瘤切除標(biāo)本(男，52歲，多形性膠母細(xì)胞瘤)，立即浸入預(yù)冷的無(wú)菌HBSS緩沖液中(含500U/ml青霉素G、500 u g/ml硫酸鏈霉素和
1.25 u g/ml兩性霉素B)。原代培養(yǎng):在生物安全柜中，用新鮮的無(wú)菌HBSS緩沖液沖洗標(biāo)本，剪切成20~30立方毫米小塊，使用20ml含0.2%11型膠原酶的磷酸緩沖液消化腫瘤塊，將分散的細(xì)胞重懸于5ml DMEM/F12完全培養(yǎng)液，所述DMEM/F12完全培養(yǎng)液的成分包括:I XB27 營(yíng)養(yǎng)因子(StemCell Technology, 07153)、20ng/ml 人表皮生長(zhǎng)因子、20ng/ml 人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、100U/ml青霉素G和100 u g/ml硫酸鏈霉素，置入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，于37°C溫箱5%C02條件下培養(yǎng)4天。
[0045]傳代培養(yǎng)方法:收集舊培養(yǎng)基，300g離心3分鐘去上清，細(xì)胞沉淀使用ImlIXAccutase重懸消化，待細(xì)胞分散后加入HBSS終止消化；離心收集的細(xì)胞重懸于5mlDMEM/F12完全培養(yǎng)液中，于新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。
[0046]細(xì)胞培養(yǎng)四代后，更換為RPMI 1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清、100U/ml青霉素G和IOOy g/ml硫酸鏈霉素)進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞將由懸浮生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變成貼壁生長(zhǎng)，傳代培養(yǎng)方法如下:吸棄舊培養(yǎng)液，向瓶中加入2ml新鮮的0.05%胰蛋白酶溶液，待細(xì)胞脫落后，加入15ml新鮮的RPMI 1640培養(yǎng)液，仔細(xì)吹打分散細(xì)胞，少量在瓶壁上變圓但沒(méi)有脫落的細(xì)胞，用無(wú)菌細(xì)胞刮刀輕輕刮擦培養(yǎng)瓶表面，收集全部細(xì)胞按1:3比例(細(xì)胞數(shù)量比)接種于新的培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)基總體積為15ml。該細(xì)胞生長(zhǎng)良好，形態(tài)較為均一，傳代至50代以上。[0047]本發(fā)明的人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系，于2011年4月26日保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)(地址:中國(guó).武漢.武漢大學(xué)),培養(yǎng)物名稱為人源腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞GLC-001，保藏編號(hào)為 CCTCC N0:C201115。
[0048]實(shí)施例2GLC-001細(xì)胞的生物學(xué)特性及應(yīng)用
[0049]本發(fā)明采用DMEM/F12完全培養(yǎng)液培養(yǎng)純化GLC-001細(xì)胞，然后使用含有胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，使其能體外長(zhǎng)期生長(zhǎng)和穩(wěn)定傳代。當(dāng)細(xì)胞傳至20代以上，細(xì)胞性狀逐漸穩(wěn)定，進(jìn)行相關(guān)的生物學(xué)、遺傳學(xué)和組織來(lái)源鑒定，直至第50代都具有相同的穩(wěn)定的性狀。經(jīng)實(shí)驗(yàn)觀察與驗(yàn)證，體外生長(zhǎng)的GLC-001主體呈梭型，存在不規(guī)則分支或分叉，細(xì)胞密度較大時(shí)失去接觸生長(zhǎng)抑制，呈交叉堆積生長(zhǎng)狀態(tài)，且由聚集處向外輻射生長(zhǎng)。遺傳學(xué)研究證實(shí)該細(xì)胞為異倍體，染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)畸變嚴(yán)重，符合惡性腫瘤的遺傳學(xué)特征。該細(xì)胞能在裸小鼠體內(nèi)可形成腫瘤，具有致瘤性。
[0050]a.形態(tài)學(xué)觀察
[0051]將培養(yǎng)GLC-001細(xì)胞的培養(yǎng)瓶置于倒置顯微鏡下(Olympus)，在明視野下進(jìn)行觀察，結(jié)果見(jiàn)圖1 (100X)，可見(jiàn)GLC-001細(xì)胞主體呈梭型，存在不規(guī)則分支或分叉，細(xì)胞密度較大時(shí)失去接觸生長(zhǎng)抑制，呈交叉堆積生長(zhǎng)狀態(tài)，且由聚集處向外輻射生長(zhǎng)。
[0052]b.染色體的鑒定
[0053]將培養(yǎng)的GLC-001細(xì)胞置于4°C孵育12小時(shí)后，加入秋水仙素，使其終濃度為0.g/ml，再于37°C孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)10小時(shí)。采集分裂中期的細(xì)胞，用固定液進(jìn)行固定，然后將細(xì)胞懸液滴于預(yù)冷的載物片上，用Giemas染色液染色，于顯微鏡下計(jì)數(shù)染色體數(shù)。結(jié)果見(jiàn)圖2，可見(jiàn)GLC-001細(xì)胞連續(xù)傳代后，染色體仍保持人源性腫瘤細(xì)胞染色體的特征，染色體眾數(shù)(M)集中在35~37之間，占70%，比正常人染色體數(shù)少，存在多數(shù)中央及亞中央著絲粒染色體(圖2A，1000X );而小鼠正常體細(xì)胞的染色體數(shù)2n=40，且均為頂端著絲粒(圖2B，1000 X )，據(jù)此可與人類(lèi)染色體相區(qū)別?？梢?jiàn)該GLC-001細(xì)胞為異倍體，染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)畸變嚴(yán)重，符合惡性腫瘤的遺傳學(xué)特征。
[0054]c.短片段重復(fù)序列(STR)鑒定
[0055]短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeat, STR)又稱為微衛(wèi)星DNA,是指染色體上，由數(shù)個(gè)堿基對(duì)作為核心單位(2~6個(gè)堿基對(duì))，串聯(lián)重復(fù)形成的一類(lèi)DNA序列(重復(fù)次數(shù)為10^60多次，基因片段在400堿基對(duì)以下)；每個(gè)核心單位重復(fù)的次數(shù)會(huì)出現(xiàn)個(gè)體差異，從而形成片段長(zhǎng)度不同的等位基因。因此，一組STR序列的重復(fù)次數(shù)在不同個(gè)體中幾乎是唯一的，是個(gè)體的基因身份特征，也是細(xì)胞生物學(xué)對(duì)細(xì)胞身份和來(lái)源進(jìn)行鑒定的主要方法。
[0056]收集新鮮培養(yǎng)的GLC-001細(xì)胞,用AxyPrep基因組DNA小量試劑盒(購(gòu)自Axygen公司的 AxyPrep? Multisource Genomic DNA Miniprep Kit,貨號(hào)為 AP-MN-MS-GDNA)提取細(xì)胞基因組DNA，用5’端熒光標(biāo)記的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)所得產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，計(jì)算各個(gè)短片段重復(fù)序列的重復(fù)數(shù)(表1)。在美 國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)數(shù)據(jù)庫(kù)中，進(jìn)行STR序列檢索，未發(fā)現(xiàn)相同STR檢測(cè)結(jié)果，結(jié)果見(jiàn)圖3A~D。
[0057]表1.GLC-001細(xì)胞STR檢測(cè)結(jié)果
[0058]
【權(quán)利要求】
1.一種人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系，其特征在于，其保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為 CCTCC N0:C201115。
2.如權(quán)利要求1所述的人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的子代細(xì)胞系。
3.如權(quán)利要求1或2任一項(xiàng)所述的人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的用途，其特征在于，用于在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生腦瘤。
4.如權(quán)利要求3所述的人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的用途，其特征在于，所述的哺乳動(dòng)物是免疫缺陷小鼠。
5.一種篩選治療腦膠質(zhì)瘤的候選藥物的方法，其特征在于，包括以下步驟:將測(cè)試化合物施用于細(xì)胞模型中，施用后抑制細(xì)胞增殖或?qū)е录?xì)胞凋亡的測(cè)試化合物為治療腦膠質(zhì)瘤的候選化合物，其中所述的細(xì)胞模型是權(quán)利要求r2任一項(xiàng)所述的人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系。
6.一種篩選治療腦膠質(zhì)瘤的候選藥物的方法，其特征在于，包括以下步驟:將測(cè)試化合物施用于動(dòng)物模型，施用后導(dǎo)致腦膠質(zhì)瘤癥狀改善或治愈的測(cè)試化合物就是治療人腦膠質(zhì)瘤的候選化合物，其中所述的動(dòng)物模型具有權(quán)利要求r2任一項(xiàng)所述的人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系所導(dǎo)致的腦膠質(zhì)瘤。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述的動(dòng)物模型是免疫缺陷小鼠。
8.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，測(cè)試化合物的施用方式選自:局部施用于腦膠質(zhì)瘤病灶處、口服給藥 和注射給藥中的一種或幾種。
9.一種如權(quán)利要求1或2任一項(xiàng)所述人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的建立方法，其特征在于，包括以下步驟， (1)獲得新鮮的臨床人腦膠質(zhì)瘤手術(shù)切除標(biāo)本，剪切成小塊，使用膠原酶消化腫瘤塊； (2)將步驟(1)所得的分離細(xì)胞進(jìn)行癌細(xì)胞的原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，步驟(2)所述的原代培養(yǎng)方法包括以下步驟:將分散的人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞重懸于含有l(wèi)XB27、20ng/ml人表皮生長(zhǎng)因子、20ng/ml人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、100U/ml青霉素G和100 u g/ml硫酸鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)液中，置入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，于37°C溫箱，5% (V/V) CO2條件下培養(yǎng)3~5天； 步驟(2)所述的傳代培養(yǎng)方法包括以下步驟:收集舊培養(yǎng)基，離心去上清，細(xì)胞沉淀后使用Accutase重懸消化，待細(xì)胞分散后加入含有500U/ml青霉素G、500 u g/ml硫酸鏈霉素和1.25 u g/ml兩性霉素的BHBSS培養(yǎng)液中，終止消化；離心收集的細(xì)胞重懸于DMEM/F12培養(yǎng)液中，于新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)；當(dāng)細(xì)胞傳代培養(yǎng)四代后，細(xì)胞由懸浮生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變?yōu)橘N壁生長(zhǎng)，吸棄舊培養(yǎng)液，向瓶中加入新鮮的0.05%胰蛋白酶溶液，待細(xì)胞脫落后，加入含有10%胎牛血清、100U/ml青霉素G和100 u g/ml硫酸鏈霉素的新鮮RPMI 1640培養(yǎng)液，仔細(xì)吹打分散細(xì)胞使之脫離瓶壁形成細(xì)胞懸液；少量在瓶壁上變圓但沒(méi)有脫落的細(xì)胞，用無(wú)菌細(xì)胞刮刀輕輕刮擦培養(yǎng)瓶表面，收集全部細(xì)胞，離心，取適量細(xì)胞懸液接種于新的培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)。
【文檔編號(hào)】A01K67/027GK103627673SQ201210299549
【公開(kāi)日】2014年3月12日 申請(qǐng)日期:2012年8月21日 優(yōu)先權(quán)日:2012年8月21日
【發(fā)明者】秦宵然, 王科, 張一心, 謝付波, 王建紅, 聞丹憶, 季從飛, 趙奇紅 申請(qǐng)人:上海睿智化學(xué)研究有限公司, 南通市腫瘤醫(yī)院