人們使用一批殺傷正在生長和分裂的細(xì)胞并以多種方式發(fā)揮功能的治療劑來治療癌癥。常見的化療劑集合已被單獨(dú)或聯(lián)合使用了數(shù)十年，且該常見的試劑集合已成為臨床腫瘤學(xué)實(shí)踐中傳統(tǒng)且常規(guī)的癌癥治療手段。這些傳統(tǒng)的化療劑通過殺傷所有快速分裂的細(xì)胞來發(fā)揮作用，快速分裂是大多數(shù)癌細(xì)胞的主要特性之一。然而，這些試劑也殺傷正在生長的正常細(xì)胞，因此這些試劑不被視作殺傷癌細(xì)胞的“靶向”方法。近年來，已開發(fā)出大量靶向癌細(xì)胞的癌癥治療劑，其中這些治療劑特異性攻擊僅由癌細(xì)胞表達(dá)而正常細(xì)胞不表達(dá)的蛋白質(zhì)。這種方式被視癌癥治療的“靶向”方法。最近，以靶向方式殺傷癌細(xì)胞的另一種方法是特異性調(diào)控免疫系統(tǒng)以增強(qiáng)癌癥患者的免疫系統(tǒng)殺傷癌細(xì)胞的能力。
靶向酪氨酸蛋白激酶受體UFO蛋白質(zhì)(其也可稱作AXL)的治療劑已在早期臨床試驗(yàn)中顯示潛力。然而，僅那些癌細(xì)胞表達(dá)大量AXL蛋白質(zhì)的患者可能受益于這類AXL靶向治療劑。下文的方法提供了基于定量蛋白組學(xué)的試驗(yàn)，其傳遞AXL信號通路激活的相關(guān)測量，因?yàn)锳XL通常不在正常組織和/或正常表皮細(xì)胞中表達(dá)。具體而言，該方法提供一種質(zhì)譜測定，其對來自癌癥患者的福爾馬林固定的組織中的AXL進(jìn)行定量，并使針對癌癥療法的改進(jìn)的治療決定成為可能。
提供了來源于酪氨酸蛋白激酶受體UFO蛋白質(zhì)(其也稱作AXL并在本文中稱作AXL)的亞序列的特定肽。各種肽的肽序列和碎片/過渡離子可具體用于基于質(zhì)譜的選擇性反應(yīng)監(jiān)測(SRM)中，其也稱為多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)測定，且將稱作SRM/MRM。描述了用于AXL蛋白質(zhì)的SRM/MRM定量分析的肽的用途。
可使用該SRM/MRM測定來測量來自AXL蛋白質(zhì)的一種或多種特異性肽的相對或絕對定量水平，并由此提供通過質(zhì)譜測量在從生物樣品中獲得的給定蛋白質(zhì)制備物中AXL蛋白質(zhì)的總量的方法。
更具體地，該SRM/MRM測定可直接測量由從諸如福爾馬林固定的癌癥患者組織的患者組織樣品取得的細(xì)胞制備的復(fù)雜蛋白質(zhì)裂解物樣品中的那些肽。由福爾馬林固定的組織制備蛋白質(zhì)樣品的方法描述在美國專利第7,473,532號中，其內(nèi)容通過引用全文納入本文。該專利描述的方法可使用獲自表達(dá)病理學(xué)公司(Expression Pathology Inc.)(馬里蘭州羅克維爾)的Liquid Tissue試劑和方案方便地進(jìn)行。
可最廣泛且有利地獲得的來自癌癥患者組織的組織形式是福爾馬林固定、石蠟包埋的組織。對手術(shù)移出的組織進(jìn)行甲醛/福爾馬林固定是迄今為止世界范圍內(nèi)最常見的保存癌癥組織樣品的方法且是標(biāo)準(zhǔn)病理學(xué)實(shí)踐中已經(jīng)接受的常規(guī)方法。甲醛水溶液被稱作福爾馬林。“100％”福爾馬林由甲醛在水中的飽和溶液(約40體積％或37重量％)組成，其含有少量用于限制氧化和聚合程度的穩(wěn)定劑，通常為甲醇。保藏組織的最常用方式是將整個組織在通常稱為10％中性緩沖福爾馬林的甲醛水溶液中長時間(8小時至48小時)浸泡，接著在室溫下將固定的整個組織包埋在石蠟中以便長期儲存。因此，分析福爾馬林固定的癌癥組織的分子分析方法將是用于分析癌癥患者組織的最被接受且大量利用的方法。
SRM/MRM測定的結(jié)果可用于關(guān)聯(lián)自其中收集并保藏組織(生物樣品)的患者或受試者的具體組織樣品(例如癌癥組織樣品)內(nèi)AXL蛋白質(zhì)的準(zhǔn)確且精確的定量水平。這不僅提供關(guān)于癌癥的診斷信息，而且容許醫(yī)師或其它醫(yī)療專業(yè)人員確定用于患者的適當(dāng)療法。提供關(guān)于在患病組織或其他患者樣品中蛋白質(zhì)表達(dá)水平的診斷和治療重要信息的這一測定稱為伴隨診斷測定。例如，這一測定可設(shè)計(jì)用于診斷癌癥的階段或程度并確定患者最可能應(yīng)答的治療劑。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明所述的測定測量來自AXL蛋白質(zhì)的特定未修飾的肽的相對或絕對水平并且可測量來自AXL蛋白質(zhì)的特定修飾的肽的絕對或相對水平。修飾的示例包括在這些肽上存在的磷酸化氨基酸殘基和糖基化氨基酸殘基。
AXL蛋白質(zhì)的相對定量水平可通過SRM/MRM方法確定，例如通過比較不同樣品中單個AXL肽的SRM/MRM特征峰面積(signature peak area)(例如，特征峰面積或積分的片段離子強(qiáng)度)來確定?；蛘?，在各種肽具有其自己的特異性SRM/MRM特征峰的情況下，可以比較多種AXL特征肽的多個SRM/MRM特征峰面積，從而用一種或多種額外或不同的生物樣品中的AXL蛋白質(zhì)含量來確定一種生物樣品中的相對AXL蛋白質(zhì)含量。以此方式，可在相同實(shí)驗(yàn)條件下跨越兩個或多個生物樣品，相對于相同的一種或多種AXL肽來確定來自AXL蛋白質(zhì)的一種或多種特定肽的含量并從而確定AXL蛋白質(zhì)的含量。另外，確定單一樣品內(nèi)來自AXL蛋白質(zhì)的一種或多種給定肽的相對定量的方法可以是通過SRM/MRM方法比較該肽的特征峰面積與同一來自生物樣品的蛋白質(zhì)制備物中的來自不同的一種或多種蛋白質(zhì)的其他和不同的一種或多種肽的特征峰面積。以此方式，通過同一樣品內(nèi)相對于一種肽的另一種肽來確定來自AXL蛋白質(zhì)的特定肽的含量并從而確定AXL蛋白質(zhì)的含量。這些方法生成樣品之間或樣品內(nèi)單個或多個來自AXL蛋白質(zhì)的肽相對于另一個或多個肽的定量，其中通過特征峰測定的含量彼此相對，這與來自生物樣品的蛋白質(zhì)制備物中AXL肽的絕對重量：體積或重量：重量含量無關(guān)。不同樣品之間單個特征峰面積的相對定量數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化至每個樣品中所分析的蛋白質(zhì)含量。可跨越來自單個樣品中同時存在的AXL蛋白質(zhì)和多個蛋白質(zhì)的許多肽和/或跨越許多樣品來進(jìn)行相對定量，從而了解相對蛋白質(zhì)含量，如相對于其他肽/蛋白質(zhì)的一種肽/蛋白質(zhì)。
AXL蛋白質(zhì)的絕對定量水平通過例如SRM/MRM方法確定，通過該方法將來自在一種生物樣品中的AXL蛋白質(zhì)的單個肽的SRM/MRM特征峰面積與摻入的(spiked)內(nèi)標(biāo)物的SRM/MRM特征峰面積相比較。在一個實(shí)施方式中，該內(nèi)標(biāo)物為合成形式的完全相同的AXL肽，其含有用一種或多種重同位素標(biāo)記的一個或多個氨基酸殘基。合成這類同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)物，使得通過質(zhì)譜分析時內(nèi)標(biāo)物產(chǎn)生可預(yù)測且一致的SRM/MRM特征峰，其與天然AXL肽特征峰不同且截然不同并可用作比較峰。因此，當(dāng)內(nèi)標(biāo)物以已知含量摻入來自生物樣品的蛋白質(zhì)或肽制劑中并通過質(zhì)譜分析時，將天然肽的SRM/MRM特征峰面積與內(nèi)標(biāo)肽的SRM/MRM特征峰面積相比較，且該數(shù)值比較顯示來自生物樣品的原始蛋白質(zhì)制劑中存在的天然肽的絕對摩爾濃度和/或絕對重量。片段肽的絕對定量數(shù)據(jù)根據(jù)每種樣品中所分析的蛋白質(zhì)的含量來顯示。絕對定量可跨越單個樣品中同時存在的許多肽(且因此許多蛋白質(zhì))和/或跨越許多樣品進(jìn)行，從而了解單個生物樣品中和整個單個樣品的組中的絕對蛋白質(zhì)含量。
該SDM/MRM測定方法可用于輔助診斷例如直接位于患者來源的組織如福爾馬林固定的組織中的癌癥的階段，并輔助確定哪種治療劑將最有利地用于治療該患者。對經(jīng)由手術(shù)(如部分或全部腫瘤的治療性移出)或經(jīng)由為了確定疑似疾病的存在與否而進(jìn)行的活檢方法從患者移出的癌癥組織進(jìn)行分析以確定該患者組織中是否存在特定的一種或多種蛋白質(zhì)以及存在何種形式的蛋白質(zhì)。此外，可確定一種蛋白質(zhì)或多種蛋白質(zhì)的表達(dá)水平并將其與在健康組織中發(fā)現(xiàn)的“正?！被騾⒖妓较啾容^。在健康組織中發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)的正?；騾⒖妓娇蓙碓从诶鐩]有癌癥的一個或多個個體的相關(guān)組織?；蛘撸赏ㄟ^分析未受癌癥影響的相關(guān)組織來獲得具有癌癥的個體的正?；騾⒖妓健５鞍踪|(zhì)水平(例如AXL水平)的測定還可用于診斷通過AXL水平診斷具有癌癥的患者或受試者中癌癥的階段。單個AXL肽的水平定義為單位的所分析蛋白質(zhì)裂解物總量中通過SRM/MRM測定確定的肽的摩爾含量?？赏ㄟ^關(guān)聯(lián)AXL蛋白質(zhì)(或AXL蛋白質(zhì)的片段肽)的水平與正常組織中觀察到的水平來使用AXL相關(guān)的信息幫助確定癌癥的階段或等級。一旦在癌細(xì)胞中確定了AXL蛋白質(zhì)的定量含量，則可將該信息與經(jīng)開發(fā)以特異性治療癌癥組織的治療劑(化學(xué)和生物的)的列表相匹配，該癌癥組織的特征是例如所測定的一種或多種蛋白質(zhì)(例如AXL)的異常表達(dá)。匹配來自AXL蛋白質(zhì)測定的信息與特異性靶向例如AXL蛋白質(zhì)或表達(dá)該蛋白質(zhì)的細(xì)胞/組織的治療劑列表定義了治療疾病的所謂個性化用藥方法。本發(fā)明所述的測定方法使用來自患者自身組織的蛋白質(zhì)的分析作為診斷和治療決定的來源，從而形成個性化用藥方法的基礎(chǔ)。
附圖簡要說明
圖1(A-C)顯示來自AXL蛋白質(zhì)的單個肽的SRM/MRM測定的結(jié)果，其在陽性對照樣品(非福爾馬林固定)和來自福爾馬林固定的生物樣品的Liquid Tissue裂解物上進(jìn)行，且AXL肽的定量在三重四極質(zhì)譜上進(jìn)行。顯示了用于使用SRM/MRM方法測量已在福爾馬林中固定的生物樣品中該肽的前體和過渡離子的具體特征。
發(fā)明詳述
原則上，例如通過使用特異性已知的蛋白酶(例如胰蛋白酶)消化來制備的來源于AXL蛋白質(zhì)的任何預(yù)測的肽均可用作替代性報(bào)告子以使用基于質(zhì)譜的SRM/MRM測定確定樣品中AXL蛋白質(zhì)的豐度。類似地，也可潛在地使用已知在AXL蛋白質(zhì)中潛在被修飾的位點(diǎn)處含有一個氨基酸殘基的任何預(yù)測的肽序列來測定樣品中AXL蛋白質(zhì)的修飾程度。
AXL片段肽可通過多種方法來產(chǎn)生，包括使用在美國專利7,473,532中提供的Liquid Tissue方案。Liquid Tissue方案和試劑能夠通過對組織/生物樣品中的蛋白質(zhì)進(jìn)行蛋白水解消化來由福爾馬林固定的石蠟包埋組織生成適用于質(zhì)譜分析的肽樣品。在Liquid Tissue方案中，將組織/生物制備物在緩沖液中加熱延長的一段時間(例如，約80℃至約100℃，持續(xù)約10分鐘至約4小時的時間)以逆轉(zhuǎn)或釋放蛋白質(zhì)交聯(lián)。所采用的緩沖液為中性緩沖液(例如，基于Tris的緩沖液或含有去垢劑的緩沖液)。熱處理后，將組織/生物樣品用包括但不限于胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶和胞內(nèi)蛋白酶Lys-C的一種或多種蛋白酶處理足以破壞所述生物樣品的組織和細(xì)胞結(jié)構(gòu)并使所述樣品液化的時間(例如，在37℃至65℃的溫度下持續(xù)30分鐘至24小時的時間)。加熱和蛋白水解的結(jié)果為液態(tài)可溶性可稀釋的生物分子裂解物。
令人驚訝的是，發(fā)現(xiàn)來自AXL蛋白質(zhì)的許多潛在肽序列并不適合在基于質(zhì)譜的SRM/MRM測定中使用或者在基于質(zhì)譜的SRM/MRM測定中使用時是失效的，其原因目前不明。由于不可能預(yù)測最適合MRM/SRM測定的肽，因此必須通過實(shí)驗(yàn)在實(shí)際的Liquid Tissue裂解物中鑒定修飾的和未修飾的肽以開發(fā)針對AXL蛋白質(zhì)的可靠且準(zhǔn)確的SRM/MRM測定。不希望受任何理論約束，但認(rèn)為一些肽可能例如難以通過質(zhì)譜檢測，因?yàn)樗鼈儾粫己玫仉婋x或生成與其它蛋白質(zhì)不同的片段。肽也可能無法在分離(例如，液相色譜)中良好地解析，或者附著到玻璃或塑料器具上。
在本發(fā)明的多個實(shí)施方式中發(fā)現(xiàn)的AXL肽(例如，表1和/或表2)通過蛋白酶消化復(fù)雜的Liquid Tissue裂解物內(nèi)的所有蛋白質(zhì)而來源于AXL蛋白質(zhì)，該裂解物由從福爾馬林固定的癌癥組織中取得的細(xì)胞制備。除非另外指出，否則在各種情況下，該蛋白酶都為胰蛋白酶。Liquid Tissue裂解物隨后通過質(zhì)譜分析以確定通過質(zhì)譜檢測并分析的來源于AXL蛋白質(zhì)的那些肽。用于質(zhì)譜分析的具體優(yōu)選的肽亞組的鑒定基于：1)在Liquid Tissue裂解物的質(zhì)譜分析中電離的來自蛋白質(zhì)的一種或多種肽的實(shí)驗(yàn)確定，和2)肽在制備Liquid Tissue裂解物中使用的方案和實(shí)驗(yàn)條件下繼續(xù)存在的能力。后一性質(zhì)的范圍不僅是肽的氨基酸序列，而且是肽內(nèi)的修飾的氨基酸殘基在樣品制備期間以修飾的形式繼續(xù)存在的能力。
從福爾馬林(甲醛)固定的組織中直接取得的細(xì)胞的蛋白質(zhì)裂解物使用Liquid Tissue試劑和方案制備，Liquid Tissue試劑和方案要求經(jīng)由組織顯微解剖將細(xì)胞收集到樣品管中，接著在Liquid Tissue緩沖液中對細(xì)胞加熱延長的一段時間。一旦負(fù)面地影響到福爾馬林誘導(dǎo)的交聯(lián)，則使用蛋白酶(例如包括但不限于胰蛋白酶)以可預(yù)測的形式消化組織/細(xì)胞至完全消化。通過用蛋白酶消化完整的多肽將各蛋白質(zhì)裂解物而轉(zhuǎn)化成肽的集合。分析(例如，通過離子阱質(zhì)譜)各Liquid Tissue裂解物以對肽進(jìn)行多重全局性蛋白組學(xué)研究，其中數(shù)據(jù)表示為來自各蛋白質(zhì)裂解物中存在的所有細(xì)胞蛋白質(zhì)的可通過質(zhì)譜鑒定的盡可能多的肽的鑒定結(jié)果。通常采用離子阱質(zhì)譜或能夠進(jìn)行全局性概要分析的另一形式的質(zhì)譜來鑒定來自單一復(fù)雜蛋白質(zhì)/肽裂解物的盡可能多的肽。但離子阱質(zhì)譜可能是用于對肽進(jìn)行全局性概要分析(global profiling)的最佳的質(zhì)譜形式。盡管可在包括MALDI、離子阱或三重四極質(zhì)譜的任何類型的質(zhì)譜上開發(fā)并進(jìn)行SRM/MRM測定，但通常認(rèn)為對于SRM/MRM測定而言最有利的儀器平臺是三重四極質(zhì)譜儀器平臺。
一旦在所采用的條件下在單一裂解物的單一MS分析中鑒定出盡可能多的肽，則整理肽的列表并將其用于確定在該裂解物中檢測到的蛋白質(zhì)。對于多種Liquid Tissue裂解物重復(fù)該過程，并將非常大的肽列表整理成單一數(shù)據(jù)集?？蓪⒃擃愋偷臄?shù)據(jù)集視為代表可在分析的生物樣品類型中(蛋白酶消化之后)、特別是在生物樣品的Liquid Tissue裂解物中檢測到的肽，且因此包括諸如AXL蛋白質(zhì)的具體蛋白質(zhì)的肽。
在一個實(shí)施方式中，鑒定為可用于確定AXL蛋白質(zhì)的絕對或相對含量的AXL胰蛋白酶肽包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10，其各自列于表1。那些肽各自在由福爾馬林固定的石蠟包埋組織制備的Liquid Tissue裂解物中通過質(zhì)譜檢測。因此，各肽均為用于開發(fā)人生物樣品中AXL蛋白質(zhì)的定量SRM/MRM測定的候選物，該AXL蛋白質(zhì)包括直接在福爾馬林中固定的患者組織中的AXL蛋白質(zhì)。
表1
表1中列出的AXL胰蛋白酶肽包括從包括肺、結(jié)腸和乳腺的不同人類器官的多種不同福爾馬林固定的組織的多種Liquid Tissue裂解物中檢測到的那些。那些肽各自被視為可用于福爾馬林固定的組織中的AXL蛋白質(zhì)的定量SRM/MRM測定。這些實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步數(shù)據(jù)分析表明，并沒有優(yōu)先觀察到來自任何特定器官位點(diǎn)的任何特定肽。因此，這些肽中的每一種都被認(rèn)為是適合對來自來源于任何生物樣品或體內(nèi)的任何器官位點(diǎn)的任何福爾馬林固定的組織的Liquid Tissue裂解物進(jìn)行AXL蛋白質(zhì)的SRM/MRM測定。
在進(jìn)行SRM/MRM測定時一個重要的考慮因素為可用于肽分析的儀器的類型。盡管可在包括MALDI、離子阱或三重四極質(zhì)譜儀的任何類型的質(zhì)譜儀上開發(fā)并進(jìn)行SRM/MRM測定，但用于SRM/MRM測定的最有利的儀器平臺通常被認(rèn)為是三重四極儀器平臺。該類型的質(zhì)譜常被視作最適用于分析可由來自細(xì)胞內(nèi)含有的所有蛋白質(zhì)的數(shù)萬至數(shù)百萬個單個肽組成的很復(fù)雜的蛋白質(zhì)裂解物內(nèi)的單個分離的靶標(biāo)肽。
為了對來源于AXL蛋白質(zhì)的各種肽最有效地實(shí)施SRM/MRM測定，需要在分析中利用除了肽序列之外的信息。該額外信息可用于引導(dǎo)并指導(dǎo)質(zhì)譜(例如，三重四極質(zhì)譜)對特異性靶標(biāo)肽進(jìn)行正確且集中的分析，從而可有效地進(jìn)行測定。
關(guān)于靶標(biāo)肽總體和關(guān)于特定AXL肽的額外信息可包括該肽的單同位素質(zhì)量、其前體電荷狀態(tài)、前體m/z值、m/z過渡離子和各過渡離子的離子類型中的一種或更種?？捎糜陂_發(fā)針對AXL蛋白質(zhì)的SRM/MRM測定的額外肽信息以來自表1中列表的三(3)種AXL肽作為示例顯示并示于表2中?？芍苽洹@得針對表2中作為示例顯示的三(3)種AXL肽進(jìn)行描述的類似額外信息并將其應(yīng)用到表1中包含的其它肽的分析中。
表2
下文所述的方法用于：1)鑒定可用于AXL蛋白質(zhì)的基于質(zhì)譜的SRM/MRM測定的來自AXL蛋白質(zhì)的候選肽，2)針對來自AXL蛋白質(zhì)的靶標(biāo)肽開發(fā)單個SRM/MRM測定或多種SRM/MRM測定以進(jìn)行匹配，和3)將定量測定應(yīng)用于癌癥診斷和/或最佳療法的選擇。
測定方法
1.AXL蛋白質(zhì)的SRM/MRM候選片段肽的鑒定：
a.使用一種或多種蛋白酶(可能包括或可能不包括胰蛋白酶)消化蛋白質(zhì)，從而由福爾馬林固定的生物樣品制備Liquid Tissue蛋白質(zhì)裂解物
b.在離子阱串聯(lián)質(zhì)譜上分析Liquid Tissue裂解物中的所有蛋白質(zhì)片段并鑒定來自AXL蛋白質(zhì)的所有片段肽，其中單個片段肽不含任何諸如磷酸化或糖基化的肽修飾
c.在離子阱串聯(lián)質(zhì)譜上分析Liquid Tissue裂解物中的所有蛋白質(zhì)片段并鑒定來自帶有諸如磷酸化或糖基化殘基的肽修飾的AXL蛋白質(zhì)的所有片段肽
d.可測量由完整的全長AXL蛋白質(zhì)通過具體消化方法可能產(chǎn)生的所有肽，但用于開發(fā)SRM/MRM測定的優(yōu)選肽為在由福爾馬林固定的生物樣品制備的復(fù)雜Liquid Tissue蛋白質(zhì)裂解物中通過質(zhì)譜直接鑒定的那些
e.在分析來自福爾馬林固定的生物樣品的Liquid Tissue裂解物時將在患者組織中特異性修飾(磷酸化、糖基化等)并在質(zhì)譜中電離化且因此被檢測的肽鑒定為用于測定AXL蛋白質(zhì)的肽修飾的候選肽
2.來自AXL蛋白質(zhì)的片段肽的質(zhì)譜測定
a.將針對Liquid Tissue裂解物中鑒定的單個片段肽的三重四極質(zhì)譜上的SRM/MRM測定應(yīng)用于來自AXL蛋白質(zhì)的肽
i.針對包括但不限于以下實(shí)驗(yàn)的最佳色譜條件確定片段肽的最佳保留時間：凝膠電泳、液相色譜、毛細(xì)管電泳、納米反向液相色譜、高效液相色譜或反向高效液相色譜
ii.確定肽的單同位素質(zhì)量、各肽的前體電荷狀態(tài)、各肽的前體m/z值、各肽的m/z過渡離子和各片段肽的各過渡離子的離子類型以開發(fā)用于各肽的SRM/MRM測定。
iii.隨后可使用來自(i)和(ii)的信息在三重四極質(zhì)譜上進(jìn)行SRM/MRM測定，其中各肽均具有特征性且獨(dú)特的SRM/MRM特征峰，該特征峰精確地限定在三重四極質(zhì)譜上進(jìn)行的獨(dú)特的SRM/MRM測定
b.進(jìn)行SRM/MRM分析使得來自SRM/MRM質(zhì)譜分析的獨(dú)特SRM/MRM特征峰面積的函數(shù)形式的所檢測的AXL蛋白質(zhì)的片段肽的含量可指示特定蛋白質(zhì)裂解物中AXL蛋白質(zhì)的相對含量和絕對含量。
i.相對定量可通過以下實(shí)現(xiàn)：
1.通過比較以下數(shù)值來確定AXL蛋白質(zhì)的增加或減少的存在量：來自一種福爾馬林固定的生物樣品的Liquid Tissue裂解物中檢測到的給定AXL肽的SRM/MRM特征峰面積與來自至少第二、第三、第四或更多的福爾馬林固定的生物樣品的至少第二、第三、第四或更多的Liquid Tissue裂解物中相同AXL片段肽的相同SRM/MRM特征峰面積
2.通過比較以下數(shù)值來確定AXL蛋白質(zhì)的增加或減少的存在量：來自一種福爾馬林固定的生物樣品的Liquid Tissue裂解物中檢測到的給定AXL肽的SRM/MRM特征峰面積與由來源于不同且單獨(dú)的生物來源的其它樣品中的其它蛋白質(zhì)的片段肽發(fā)展的SRM/MRM特征峰面積，其中針對肽片段的兩種樣品之間的SRM/MRM特征峰面積的比較標(biāo)準(zhǔn)化至各樣品中分析的蛋白質(zhì)的含量。
3.通過比較以下數(shù)值來確定AXL蛋白質(zhì)的增加或減少的存在量：給定AXL肽的SRM/MRM特征峰面積與來自福爾馬林固定的生物樣品的相同Liquid Tissue裂解物內(nèi)的不同蛋白質(zhì)來源的其它片段肽的SRM/MRM特征峰面積，從而將AXL蛋白質(zhì)的變化水平標(biāo)準(zhǔn)化至多種細(xì)胞條件下都不改變其表達(dá)水平的其它蛋白質(zhì)的水平。
4.這些測定可應(yīng)用于AXL蛋白質(zhì)的未修飾的片段肽和修飾的片段肽，其中修飾包括但不限于磷酸化和/或糖基化，且其中以與確定未修飾的肽的相對含量相同的方式確定修飾的肽的相對水平。
ii.給定肽的絕對定量可通過比較以下數(shù)值來實(shí)現(xiàn)：來自單個生物樣品中的AXL蛋白質(zhì)的給定片段肽的SRM/MRM特征峰面積與摻入來自生物樣品的蛋白質(zhì)裂解物中的內(nèi)部片段肽標(biāo)準(zhǔn)物的SRM/MRM特征峰面積
1.內(nèi)標(biāo)物為測量中的AXL蛋白質(zhì)的片段肽的經(jīng)標(biāo)記的合成形式。將該標(biāo)準(zhǔn)物以已知量摻入樣品中，并可單獨(dú)地確定生物樣品中的天然肽片段和內(nèi)部片段肽標(biāo)準(zhǔn)物的SRM/MRM特征峰面積，接著比較兩個峰面積
2.這可應(yīng)用于未修飾的片段肽和修飾的片段肽，其中這些修飾包括但不限于磷酸化和/或糖基化，且其中可以與確定未修飾的肽的絕對水平相同的方式來確定修飾的肽的絕對水平。
3.將片段肽定量應(yīng)用于癌癥診斷和治療
a.進(jìn)行AXL蛋白質(zhì)的片段肽水平的相對和/或絕對定量并說明證實(shí)了患者腫瘤組織中的AXL蛋白質(zhì)表達(dá)與階段/等級/狀況的先前確定的關(guān)聯(lián)性，如同在癌癥領(lǐng)域中充分理解的那樣
b.進(jìn)行AXL蛋白質(zhì)的片段肽水平的相對和/或絕對定量并說明與來自不同治療策略的臨床結(jié)果的關(guān)聯(lián)性，其中該關(guān)聯(lián)性已經(jīng)在該領(lǐng)域中說明或可在將來說明(通過針對患者群或來自那些患者的組織的關(guān)聯(lián)性研究)。一旦通過該測定證實(shí)了先前確立的關(guān)聯(lián)性或?qū)淼贸龅年P(guān)聯(lián)性，則該測定方法可用于確定最佳治療策略
通過在離子阱和三重四極質(zhì)譜上分析所有AXL肽來開發(fā)特定AXL肽相關(guān)的特定且獨(dú)特的特性。信息包括該肽的單同位素質(zhì)量、其前體電荷狀態(tài)、前體m/z值、該前體的過渡m/z值和各鑒定的過渡離子的離子類型。該信息必須針對在來自福爾馬林固定的樣品/組織的Liquid Tissue裂解物中直接存在的每個和每一個候選SRM/MRM肽通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)行測定；原因在于，有趣的是，并非所有來自AXL蛋白質(zhì)的肽都可使用本發(fā)明所述的SRM/MRM在這里裂解物中檢測，表明未被檢測到的AXL肽無法被視為開發(fā)用于定量來自福爾馬林固定的樣品/組織的Liquid Tissue裂解物中直接存在的肽/蛋白質(zhì)的SRM/MRM測定的候選肽。
在三重四極質(zhì)譜上進(jìn)行特定AXL肽的具體SRM/MRM測定。通過具體的AXL SRM/MRM測定分析的實(shí)驗(yàn)樣品是例如從福爾馬林固定和石蠟包埋的組織中制備的Liquid Tissue蛋白質(zhì)裂解物。來自這類測定的數(shù)據(jù)顯示存在針對福爾馬林固定的樣品中該AXL肽的獨(dú)特SRM/MRM特征峰。
針對該肽的特定的過渡離子特性用于定量測量福爾馬林固定的生物樣品中具體的AXL肽。這些數(shù)據(jù)顯示該AXL肽的絕對含量，其是每毫克分析的蛋白質(zhì)裂解物中該肽摩爾含量的函數(shù)形式?；诟栺R林固定的患者來源的組織的分析對組織中AXL蛋白質(zhì)水平的評價可提供關(guān)于各特定患者的診斷、預(yù)后和治療有關(guān)的信息。在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明描述了一種測量生物樣品中酪氨酸蛋白激酶受體UFO蛋白質(zhì)(AXL)的水平的方法，其包括使用質(zhì)譜檢測和/或定量由所述生物樣品制備的蛋白質(zhì)消化物中一種或多種修飾和/或未修飾的AXL片段肽的含量；和計(jì)算所述樣品中修飾的或未修飾的AXL蛋白質(zhì)的水平；且其中所述水平為相對水平或絕對水平。在一個相關(guān)實(shí)施方式中，定量一種或多種AXL片段肽包括通過與添加的已知含量的內(nèi)標(biāo)肽比較來確定生物樣品中各AXL片段肽的含量，其中該生物樣品中的各AXL片段肽均與添加的具有相同氨基酸序列的內(nèi)標(biāo)肽相比較。在一些實(shí)施方式中，該內(nèi)標(biāo)物為同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)肽，其包含選自18O、17O、34S、15N、13C、2H或其組合的一種或多種重穩(wěn)定同位素。
本發(fā)明所述的測量生物樣品中AXL蛋白質(zhì)(或作為其替代的片段肽)的水平的方法可用作患者或受試者中癌癥的診斷指標(biāo)。在一個實(shí)施方式中，可通過關(guān)聯(lián)(例如比較)組織中發(fā)現(xiàn)的AXL蛋白質(zhì)的水平與正常和/或癌性或癌前期組織中發(fā)現(xiàn)的AXL蛋白質(zhì)的水平來將該蛋白質(zhì)水平的測量結(jié)果用于確定癌癥的診斷階段/等級/狀況。
因?yàn)楹怂岷偷鞍踪|(zhì)兩者都可由相同的Liquid TissueTM生物分子制備物分析，所以可以由用于蛋白質(zhì)分析的相同樣品中的核酸生成關(guān)于疾病診斷和藥物治療判斷的額外信息。例如，如果AXL蛋白質(zhì)由某些細(xì)胞以增加的水平表達(dá)，當(dāng)通過SRM測定時，數(shù)據(jù)可提供關(guān)于細(xì)胞的狀態(tài)及其不受控制地生長的潛在性、潛在的抗藥性和癌癥發(fā)展的信息。同時，可從相同的Liquid TissueTM生物分子制備物中存在的核酸中獲得關(guān)于AXL基因和/或核酸及其編碼的蛋白質(zhì)的狀況的信息(例如，mRNA分子及其表達(dá)水平或剪接變化)，可在AXL蛋白質(zhì)的SRM分析的同時對其進(jìn)行評價?？稍贏XL蛋白質(zhì)的SRM分析的同時對不來自AXL且存在于相同生物分子制備物中的任何基因和/或核酸進(jìn)行評價。在一個實(shí)施方式中，關(guān)于AXL蛋白質(zhì)和/或一種、兩種、三種、四種或更多種額外的蛋白質(zhì)的信息可通過檢查編碼那些蛋白質(zhì)的核酸來評價。那些核酸可例如通過以下方法中的一種或多種、兩種或更多種或三種或更多種檢查：測序方法、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法、限制性片段多態(tài)性分析、插入、缺失的鑒定，和/或是否存在突變的確定，包括但不限于單堿基對多態(tài)性、轉(zhuǎn)換、顛換或其組合。