本發(fā)明涉及用于木質(zhì)纖維素材料的酶促水解和糖的發(fā)酵的方法。
發(fā)明背景
在本文中也被稱之為原料的木質(zhì)纖維素植物材料為可再生能源，其為可被轉(zhuǎn)化為有價值的產(chǎn)物如糖或生物燃料例如生物乙醇的糖的形式。在該過程中，存在于原料中的(木質(zhì)或半)纖維素如麥稈、玉米秸稈、稻殼等通過(半)纖維素分解酶被轉(zhuǎn)化成還原性糖，其隨后可通過微生物如酵母、細(xì)菌和真菌被任選地轉(zhuǎn)化成有價值的產(chǎn)物，如乙醇。
由于(半)纖維素為結(jié)晶的且被截留在木質(zhì)素網(wǎng)狀物中，因此至還原性糖的轉(zhuǎn)化通常是慢且不完全的。通常情況下，未處理原料的酶促水解產(chǎn)生<20％的理論量的糖。通過應(yīng)用化學(xué)和熱物理預(yù)處理，(半)纖維素對于(半)纖維素分解酶更可及，且因此轉(zhuǎn)化更快且產(chǎn)量更高。
來自從預(yù)處理的玉米秸稈得到的葡萄糖的通常的乙醇產(chǎn)量為每1000kg的干玉米秸稈40加侖的乙醇(Badger,P,Ethanol from cellulose:a general review,Trends in new crops and new uses,2002,J.Janick和A.Whipkey(編)ASHS Press,Alexandria,VA)或每g原料0.3g乙醇。纖維素基的乙醇的最大產(chǎn)量大約為90％。
纖維素分解酶-它們中的大多數(shù)是由物種如Trichoderma、Humicola和Aspergillus產(chǎn)生的-被商用于將預(yù)處理的原料轉(zhuǎn)化成含有不可溶的(半)纖維素、由其制成的還原性糖和木質(zhì)素的糊狀物。從Rasamsonia得到的熱穩(wěn)定性纖維素分解酶已被用于降解木質(zhì)纖維素原料且已知這些酶具有熱穩(wěn)定性，見WO 2007/091231。所產(chǎn)生的糊狀物用于發(fā)酵中，在發(fā)酵期間，還原性糖被轉(zhuǎn)化成酵母生物質(zhì)(細(xì)胞)、二氧化碳和乙醇。以這種方式產(chǎn)生的乙醇被稱為生物乙醇。
從預(yù)處理的木質(zhì)纖維素原料進(jìn)行的糖的一般生產(chǎn)，也被稱之為液化、預(yù)糖化或糖化的水解，通常發(fā)生在45至50℃的升高溫度和非無菌條件下持續(xù)6至168小時(Kumar,S.Chem.Eng.Technol.32(2009)517-526)的過程中。在該水解期間，所存在的纖維素被部分(通常為30至95％，這可取決于酶的活性和水解條件)轉(zhuǎn)化成還原性糖。在酶被存在于預(yù)處理的原料中的化合物和釋放的糖抑制以及在使熱滅活盡可能少的情況下，盡可能地減少該升高溫度的時間段。
在一個實施方式中，酶促水解至少包括液化步驟和糖化步驟，所述液化步驟中木質(zhì)纖維素材料在至少第一容器中被水解；所述糖化步驟中經(jīng)液化的木質(zhì)纖維素材料在所述至少第一容器和/或在至少第二容器中被水解。糖化可以在與液化相同的容器(即所述至少第一容器)中進(jìn)行，它還可以在單獨的容器(即所述至少第二容器)中進(jìn)行。因此，在根據(jù)本發(fā)明的方法的酶促水解中，可以將液化和糖化合并?？商娲兀夯吞腔梢允菃为毜牟襟E。液化和糖化可以在不同的溫度下進(jìn)行，但是也可以在單一溫度下進(jìn)行。在一個實施方式中，液化的溫度高于糖化的溫度。液化優(yōu)選地在60℃-75℃的溫度下進(jìn)行，并且糖化優(yōu)選地在50℃-65℃的溫度下進(jìn)行。
酶促水解中使用的酶可以在酶促水解之前和/或期間添加。在酶促水解包括液化步驟和糖化步驟的情況下，另外的酶可以在液化步驟期間和/或之后添加。所述另外的酶可以在糖化步驟之前和/或期間添加。另外的酶也可以在糖化步驟之后添加。
在水解之后的發(fā)酵在相同或不同的容器中發(fā)生在單獨的優(yōu)選為厭氧的方法步驟中，其中溫度被調(diào)整至30至33℃(中溫方法(mesophilic process))以適應(yīng)通過微生物生物質(zhì)通常為酵母進(jìn)行的生長和乙醇生產(chǎn)。在該發(fā)酵方法中，剩余的(半)纖維素材料通過已從水解步驟存在的酶被轉(zhuǎn)化成還原性糖，且同時產(chǎn)生微生物生物質(zhì)和乙醇。一旦(半)纖維素材料被轉(zhuǎn)化成可發(fā)酵糖且所有可發(fā)酵糖被轉(zhuǎn)化成乙醇、二氧化碳和微生物細(xì)胞，則發(fā)酵完成。這可進(jìn)行長達(dá)6天。在一般情況下，水解和發(fā)酵的總處理時間可長達(dá)13天。
如此獲得的經(jīng)發(fā)酵糊狀物由不可發(fā)酵的糖、不可水解的(半)纖維素材料、木質(zhì)素、微生物細(xì)胞(最常見為酵母細(xì)胞)、水、乙醇、溶解的二氧化碳組成。在后續(xù)的步驟中，將乙醇從糊狀物蒸餾出來并進(jìn)一步地純化。干燥剩余的固體懸浮液并將其用作例如，燃燒燃料、肥料或牛飼料。
WO2010/080407提出在厭氧條件下用纖維素酶組合物處理纖維素材料。去除或排除反應(yīng)性氧類可提高纖維素水解酶系統(tǒng)的性能。通過酶組合物進(jìn)行的纖維素材料例如木質(zhì)纖維素的水解可通過對酶組合物的成分的氧化損傷和/或通過例如分子氧進(jìn)行的纖維素材料的氧化而減少。
WO2009/046538公開了一種用于處理木質(zhì)纖維素原料植物材料以釋放可發(fā)酵糖的方法，其使用在真空下處理材料的酶促水解方法并產(chǎn)生富糖處理流，其包含減少的量的揮發(fā)性糖/發(fā)酵抑制化合物，如糠醛和乙酸。除了去除揮發(fā)性的抑制性化合物外，還去除其他化合物和/或分子包括氮、氧、氬和二氧化碳。
對于每批原料，添加酶以使產(chǎn)量和在給定的處理時間內(nèi)從預(yù)處理的木質(zhì)纖維素原料釋放出可發(fā)酵糖的速率最大化。在一般情況下，用于酶生產(chǎn)的成本、原料到乙醇的產(chǎn)率和投資是總生產(chǎn)成本中的主要成本因素(Kumar,S.Chem.Eng.Technol.32(2009)517-526)。迄今，酶使用成本的減少是通過應(yīng)用源于單個或多個微生物來源(WO2008/008793)的酶產(chǎn)物而實現(xiàn)的，該微生物來源具有更廣泛和/或更高(比)水解活性，其使用的目的是更低的酶需求、更快地轉(zhuǎn)化速率和/或更高的轉(zhuǎn)化產(chǎn)量，從而具有整體更低的生物乙醇生產(chǎn)成本。這需要對這些酶產(chǎn)物的研究和開發(fā)進(jìn)行大量投資。在酶產(chǎn)物是由源于多個微生物來源的酶構(gòu)成的情況下，需要大量的資本投資以生產(chǎn)各單酶化合物。
因此期望提高上述涉及水解和發(fā)酵的方法。
發(fā)明概述
因此，本發(fā)明的一個目的是提供這樣的方法，其中水解步驟在改進(jìn)的條件下進(jìn)行。本發(fā)明的另一個目的是提供這樣的方法，其涉及處理時間減少的水解。本發(fā)明的再一目的是提供這樣的方法，其中酶劑量可以減少并且同時有用水解產(chǎn)物的輸出保持在相同水平或甚至提高。另一個目的是提供涉及水解的方法，其中水解的處理條件被優(yōu)化。本發(fā)明的又一個目的是提供涉及水解的方法，其中使用相同的酶劑量使有用水解產(chǎn)物的輸出增加。根據(jù)本發(fā)明達(dá)到這些目的中的一個或多個。
本發(fā)明提供了用于從木質(zhì)纖維素材料制備糖產(chǎn)物的方法，所述方法包括以下步驟：
a)任選地，預(yù)處理所述木質(zhì)纖維素材料，
b)任選地，清洗所述任選地預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料，
c)使用包含至少兩種纖維素酶的酶組合物酶促水解所述任選地經(jīng)清洗的和/或任選地經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料，其中所述酶組合物至少包含LPMO，以及
d)任選地，回收含葡萄糖的組合物，
其中氧以對應(yīng)于20與5000mmol之間的分子氧/kg存在于所述木質(zhì)纖維素材料中的葡聚糖的量被消耗，所述氧在所述木質(zhì)纖維素材料的預(yù)處理之后且在酶促水解之前和/或期間添加，優(yōu)選地以對應(yīng)于至少30mmol分子氧/kg存在于所述木質(zhì)纖維素材料中的葡聚糖的量，更優(yōu)選地以對應(yīng)于至少40mmol分子氧/kg存在于所述木質(zhì)纖維素材料中的葡聚糖的量，并且最優(yōu)選地以對應(yīng)于至少50mmol分子氧/kg存在于所述木質(zhì)纖維素材料中的葡聚糖的量被消耗。
此外，本發(fā)明提供了用于從木質(zhì)纖維素材料制備發(fā)酵產(chǎn)物的方法，所述方法包括以下步驟：
a)任選地，預(yù)處理所述木質(zhì)纖維素材料，
b)任選地，清洗所述任選地預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料，
c)使用包含至少兩種纖維素酶的酶組合物酶促水解所述任選地經(jīng)清洗的和/或任選地經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料，其中所述酶組合物至少包含LPMO，以及任選地純化所述經(jīng)水解的木質(zhì)纖維素材料，
d)發(fā)酵所述經(jīng)水解的木質(zhì)纖維素材料以產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物，以及
e)任選地，回收發(fā)酵產(chǎn)物，
其中氧以對應(yīng)于20與5000mmol之間的分子氧/kg存在于所述木質(zhì)纖維素材料中的葡聚糖的量被消耗，所述氧在所述木質(zhì)纖維素材料的預(yù)處理之后且在酶促水解之前和/或期間添加，優(yōu)選地以對應(yīng)于至少30mmol分子氧/kg存在于所述木質(zhì)纖維素材料中的葡聚糖的量，更優(yōu)選地以對應(yīng)于至少40mmol分子氧/kg存在于所述木質(zhì)纖維素材料中的葡聚糖的量，并且最優(yōu)選地以對應(yīng)于至少50mmol分子氧/kg存在于所述木質(zhì)纖維素材料中的葡聚糖的量被消耗。
優(yōu)選地，所述氧在酶促水解步驟c期間被消耗。
在一個優(yōu)選實施方式中，所述氧以(氣)泡的形式添加。
出人意料地，根據(jù)本發(fā)明，通過添加氧可達(dá)到許多工藝優(yōu)勢，包括最佳溫度條件、減少的處理時間、減少的酶劑量、酶的重復(fù)使用、更高的產(chǎn)率以及其他過程優(yōu)化，從而導(dǎo)致成本降低。
在此方法的一個實施方式中，發(fā)酵時間是5至120小時。在一個實施方式中，使用的穩(wěn)定的酶組合物保持活性30小時或更久。根據(jù)再一個實施方式，優(yōu)選地在45℃或更高的溫度下，更優(yōu)選地在50℃或更高的溫度下并且仍更優(yōu)選地在55℃或更高的溫度下進(jìn)行水解。在一個優(yōu)選實施方式中，所述酶組合物源于真菌，優(yōu)選Rasamsonia屬的微生物，或者所述酶組合物包含真菌酶，優(yōu)選Rasamsonia酶。將在下文更加詳細(xì)地說明本發(fā)明的方法。
發(fā)明詳述
貫穿本說明書和所附權(quán)利要求書，詞語“包括”和“包含”及其變型均被解釋為包括性的。即，在上下文允許的情況下，這些詞語旨在傳達(dá)可包括未具體指出的其他元件或整體。在本文中不使用數(shù)量詞修飾時指代一個或多于一個的(即，一個或至少一個的)語法對象。舉例來說，“元件”可表示一個元件或多于一個的元件。
在本發(fā)明的背景下，“提高的”、“增加的”、“減少的”被用于指示，與除了未添加額外的氧以外相同的情況、方法或處理條件相比，本發(fā)明示出了優(yōu)點。在本發(fā)明的背景下，“在相同的條件下測量”或“在相同的條件下分析”等表示，本發(fā)明的方法和未添加氧的相同方法是在相同的條件下(除了添加氧外)進(jìn)行的，且如果與沒有氧添加的方法相比，本方法的結(jié)果是使用相同的條件測量的，優(yōu)選為使用相同的測定和/或方法進(jìn)行，更優(yōu)選為在相同或平行實驗中進(jìn)行的。水解的條件是這種條件的一個示例。
在現(xiàn)有技術(shù)中，建議通過在酶促水解期間使用厭氧(WO2010/080407)或真空(WO2009/046538)條件而提高纖維素分解材料的水解。在兩個文件的方法中，氧水平被降低。令人驚訝地，現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的水解示出導(dǎo)致改進(jìn)的反應(yīng)產(chǎn)物，其與其中不添加氧的方法相比，在水解后的發(fā)酵中給出更高量(還原的)糖產(chǎn)物和/或期望的發(fā)酵產(chǎn)物。在一般情況下，觀測到葡萄糖轉(zhuǎn)化的增加為5至15w/w％。
可用幾種方式添加氧。例如，氧可作為氧氣、富氧氣體如富氧空氣或空氣而添加?？蛇B續(xù)或不連續(xù)地添加氧?！疤砑印毖醣硎狙醣惶砑又了夥磻?yīng)器中的液相(包含木質(zhì)纖維素材料)，而不是氧存在于液相上方的反應(yīng)器頂部空間中，因而，氧必須從頂部空間擴(kuò)散至液相。優(yōu)選地，氧在水解反應(yīng)器的液相(包含木質(zhì)纖維素材料)中添加或生成。因此，優(yōu)選地，氧作為氣泡添加，最優(yōu)選為作為小的氣泡添加。在一個實施方式中，氣泡的直徑為至少0.5mm、至少1mm、至少1.5mm、至少2mm、至少2.5mm、至少為3mm、至少3.5mm、至少4mm、至少為4.5mm、至少為5mm。在一個實施方式中，氣泡的直徑在0.5mm和500mm之間，優(yōu)選為0.5mm和400mm之間，0.5mm和300mm之間，0.5mm和200mm之間，0.5mm和100mm之間。
發(fā)明人提出了以下假設(shè)，即在(酶促)水解(步驟)中，將無定形和結(jié)晶多糖或纖維素水解為糖(如葡萄糖)。無定形多糖例如被內(nèi)切葡聚糖酶轉(zhuǎn)化為寡糖，這之后所述寡糖可以被纖維二糖水解酶和β-葡糖苷酶(BG)轉(zhuǎn)化為葡萄糖。結(jié)晶多糖的轉(zhuǎn)化可以并行地或順序地進(jìn)行，并且即使當(dāng)大部分無定形多糖被水解時繼續(xù)。根據(jù)本發(fā)明假設(shè)，尤其是與LPMO組合添加氧在結(jié)晶多糖的水解期間是有益的，例如在將多糖降解為寡糖中。因此，添加氧是非常有用的，尤其是在結(jié)晶多糖被酶轉(zhuǎn)化的階段。在此階段之外，不添加氧或添加較少的氧可以更有效。這個假設(shè)僅僅作為發(fā)明人所注意到的效果的可能解釋給出，并且本發(fā)明并不因這個理論的正確性而成立或不成立。
結(jié)晶葡聚糖結(jié)構(gòu)可通過溶解性多糖單加氧酶(LPMO)打開。該類型的酶通過氧化糖苷鍵并使其可用于其他纖維素分解酶而進(jìn)一步地將寡糖水解為葡萄糖而打開該結(jié)構(gòu)。
大多數(shù)已知的LPMO形成醛糖酸，即在裂解位點的末端糖的C1位置被氧化的產(chǎn)物。該氧化的葡萄糖單元是在水解期間作為葡萄糖酸釋放的。此外，已報道了在裂解位點非還原葡萄糖單元的C4和C6的氧化。例如，T.Isaksen等(參見上文)報道了非還原末端結(jié)構(gòu)C4位置的氧化在C4位置上產(chǎn)生酮糖，其與水溶液中的C4偕二醇相平衡。本發(fā)明人提出水解的氧化產(chǎn)物如葡萄糖酸為在木質(zhì)纖維素水解中施加的LPMO的性能的量度。
令人驚訝地，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)可通過在預(yù)處理后和在木質(zhì)纖維素材料的酶促水解之前和/或期間對應(yīng)于每kg存在于木質(zhì)纖維素材料中的葡聚糖20至5000mmol分子氧，優(yōu)選為對應(yīng)于每kg存在于木質(zhì)纖維素材料中的葡聚糖至少30mmol分子氧，更優(yōu)選為對應(yīng)于每kg存在于木質(zhì)纖維素材料中的葡聚糖至少40mmol分子氧，且最優(yōu)選為對應(yīng)于每kg存在于木質(zhì)纖維素材料中的葡聚糖至少50mmol分子氧的氧消耗量獲得最佳的木質(zhì)纖維素水解(多于70％的葡聚糖轉(zhuǎn)化)。
根據(jù)本發(fā)明的又一優(yōu)選實施方式，氧的消耗量對應(yīng)于每kg存在于木質(zhì)纖維素材料中的葡聚糖20至5000mmol分子氧。優(yōu)選地，氧的消耗量對應(yīng)于每kg存在于木質(zhì)纖維素材料中的葡聚糖22至4500mmol分子氧、每kg存在于木質(zhì)纖維素材料中的葡聚糖24至4000mmol分子氧、每kg存在于木質(zhì)纖維素材料中的葡聚糖26至3500mmol分子氧、每kg存在于木質(zhì)纖維素材料中的葡聚糖28至3400mmol分子氧。被添加至系統(tǒng)的所有氧將被傳遞至液體并被用于水解。該量可通過測量和控制被帶入系統(tǒng)中的空氣的量來控制。
根據(jù)本發(fā)明的再一個優(yōu)選實施方式，氧以對應(yīng)于0.17與41.7mmol之間的分子氧/kg存在于所述木質(zhì)纖維素材料中的葡聚糖/小時的量被消耗。優(yōu)選地，氧以對應(yīng)于0.18與37.5mmol之間的分子氧/kg存在于所述木質(zhì)纖維素材料中的葡聚糖/小時、0.20與33.3mmol之間的分子氧/kg存在于所述木質(zhì)纖維素材料中的葡聚糖/小時、0.22與29.2mmol之間的分子氧/kg存在于所述木質(zhì)纖維素材料中的葡聚糖/小時、0.23與28.3mmol之間的分子氧/kg存在于所述木質(zhì)纖維素材料中的葡聚糖/小時的量被消耗。更優(yōu)選地，氧以對應(yīng)于0.36與27.8mmol之間的分子氧/kg存在于所述木質(zhì)纖維素材料中的葡聚糖/小時的量被消耗。添加到體系中的所有氧將被轉(zhuǎn)移到液體中并且用于水解?？梢酝ㄟ^測量并控制帶入體系中的空氣的量來控制這個量。如本文使用的“/小時”意指水解的每小時。
通過木質(zhì)纖維素材料的LPMO進(jìn)行氧化產(chǎn)生氧化的多糖，其在水解期間被水解成葡萄糖和氧化的葡萄糖單元等，如葡萄糖酸或二醇。在一般情況下，1分子氧(O2)產(chǎn)生1mol的氧化產(chǎn)物。氧也可以被原料(例如木質(zhì)素)吸收。將顯而易見的是，當(dāng)(結(jié)晶)纖維素和纖維寡糖實現(xiàn)最佳的水解時，才能實現(xiàn)最佳的木質(zhì)纖維素水解。通過LPMO的作用實現(xiàn)的該最佳水解將導(dǎo)致水解的氧化產(chǎn)物如葡萄糖酸的形成。無氧化表示(結(jié)晶)葡聚糖的效率較低的水解。然而，過高的氧化水平將產(chǎn)生較高水平的產(chǎn)物如葡萄糖酸且將以葡萄糖為代價，因此基于(起始)葡聚糖的葡萄糖產(chǎn)量將下降。
通過根據(jù)本發(fā)明的方法，有利地獲得更高的葡萄糖產(chǎn)率。添加更高量的氧將產(chǎn)生如葡糖酸而非葡萄糖的產(chǎn)物，另一方面在更低量氧的情況下，LPMO不能最佳地起作用。此外，應(yīng)注意的是，過高量的氧化產(chǎn)物(如葡糖酸)可抑制纖維素酶或半纖維素酶，或在隨后發(fā)酵水解物的情況下，葡糖酸可通過抑制發(fā)酵中使用的微生物(如酵母)而對發(fā)酵具有負(fù)面影響。
通常，在預(yù)處理之后且在酶促水解之前和/或期間向所述木質(zhì)纖維素材料中添加的氧的量可以按若干方式控制或改變。通過僅在部分水解時間期間添加氧來限制供應(yīng)的氧是可行的。另一種選擇是通過例如使用空氣和循環(huán)空氣(離開水解反應(yīng)器的空氣)的混合物或通過用惰性氣體“稀釋”空氣來添加低濃度的氧?？梢酝ㄟ^在更長的水解時間段期間添加氧、通過添加更高濃度的氧或通過添加更多的空氣來增加添加的氧的量。用于改變攝氧量的另一種選擇是改變水解溫度，較高的溫度將在反應(yīng)器內(nèi)容物中導(dǎo)致較低的氧最大飽和濃度。用于管理氧濃度的另一種方式是添加耗氧物或產(chǎn)氧物。在酶可被氧的存在或添加損害的情況下，可以使用較溫和的氧供應(yīng)。在這種情況下，可以在改進(jìn)的葡萄糖生產(chǎn)與酶性能之間找到平衡?？梢栽诿复偎庵昂?或期間向纖維素分解材料中添加氧。在以氣態(tài)形式添加氧的情況下，含氧氣體可以被引入，例如吹入纖維素分解材料的液體水解反應(yīng)器內(nèi)容物中。在本發(fā)明的另一個實施方式中，含氧氣體被引入將進(jìn)入水解反應(yīng)器的液體纖維素分解材料流中。在本發(fā)明的仍另一個實施方式中，含氧氣體與進(jìn)入水解反應(yīng)器的纖維素分解材料或與經(jīng)過反應(yīng)器外環(huán)的部分液體反應(yīng)器內(nèi)容物一起被引入。在大多數(shù)情況下，進(jìn)入水解反應(yīng)器之前添加氧并不是足夠的，還可以在水解期間添加氧。在本發(fā)明的另一個實施方式中，用含氧氣體連續(xù)地或不連續(xù)地更新存在于反應(yīng)器上部(頂部空間)中的氣相。在后一種情況下，需要(劇烈)混合或攪拌以使氧作為泡和/或通過擴(kuò)散進(jìn)入液體反應(yīng)器內(nèi)容物，優(yōu)選地與反應(yīng)器中的超壓組合。通常，對于尺寸高達(dá)100升至1m3的反應(yīng)器而言，與(劇烈)混合或攪拌組合，用空氣吹入頂部空間可以將足夠的氧引入水解反應(yīng)器中的纖維素材料中。在更大規(guī)模時，例如在50m3或更大(例如100m3)的反應(yīng)器中，劇烈攪拌需要如此多的能量以至于從經(jīng)濟(jì)學(xué)角度來看這將無法應(yīng)用于商業(yè)操作方法中。
根據(jù)本發(fā)明，可以在水解步驟之前、部分水解步驟期間、整個水解步驟期間或者水解步驟之前或期間的組合中添加氧。有利地，在水解步驟的前半段時間期間添加氧。可以在例如出現(xiàn)酶的氧化損傷的情況下僅在部分水解期間添加氧。在存在于水解反應(yīng)器內(nèi)容物或者在水解步驟中形成的糖產(chǎn)物或水解物中的氧可能在后續(xù)發(fā)酵步驟中造成影響或產(chǎn)生干擾的情況下，可以在除了水解的最后部分之外添加氧，因此(大部分)氧在經(jīng)水解的生物質(zhì)進(jìn)入發(fā)酵反應(yīng)器之前被消耗。
在實施例中給出了在酶促水解方法期間通氣的若干實例，以顯示本發(fā)明的有益效果。針對若干底物或原料發(fā)現(xiàn)了這種有益效果，并且因此認(rèn)為這種有益效果在所有種類的底物或原料的水解中都存在。
在實施例中給出了用于酶促水解方法的酶組合物的若干實例，以顯示本發(fā)明的有益效果。針對若干酶組合物發(fā)現(xiàn)了這種有益效果，并且因此認(rèn)為這種有益效果針對所有種類的水解酶組合物都存在。
對于本發(fā)明的再一個優(yōu)選實施方式，在酶促水解期間存在木質(zhì)纖維素材料的液相中的氧濃度(DO)是至少0.001mol/m3，優(yōu)選地至少0.002mol/m3，更優(yōu)選地至少0.003mol/m3并且甚至更優(yōu)選地多于0.01mol/m3，例如多于0.02mol/m3或0.03mol/m3。在小于1m3的反應(yīng)器中，通過緩慢攪拌將獲得低于0.01mol/m3或0.02mol/m3的DO值。在這種規(guī)模下劇烈混合或攪拌將頂部空間的部分氣相引入反應(yīng)液中。例如，混合或攪拌可以產(chǎn)生將氧卷入液體中的渦流。通常，對于尺寸高達(dá)100升至1m3的反應(yīng)器而言，與(劇烈)混合或攪拌組合，用空氣吹入頂部空間將足夠的氧引入水解反應(yīng)器中的纖維素材料中。在更大規(guī)模時，例如在50m3或更大(例如100m3)的反應(yīng)器中，劇烈攪拌需要如此多的能量以至于從經(jīng)濟(jì)學(xué)角度來看這將無法應(yīng)用于商業(yè)操作方法中。通常，在大反應(yīng)器中，在不引入空氣或氧的情況下攪拌或混合將導(dǎo)致小于0.01mol/m3的DO值。
對于本發(fā)明的又一個優(yōu)選實施方式，在氧生成或產(chǎn)生期間，在酶促水解期間存在木質(zhì)纖維素材料的液相中的氧濃度(通氣或添加氧)優(yōu)選地是在水解反應(yīng)條件下的氧飽和濃度的至多80％，更優(yōu)選地至多0.12mol/m3，仍更優(yōu)選地至多0.09mol/m3，甚至更優(yōu)選地至多0.06mol/m3，甚至仍更優(yōu)選地至多0.045mol/m3并且最優(yōu)選地至多0.03mol/m3。上文考慮了當(dāng)木質(zhì)纖維素材料的氧轉(zhuǎn)化率大于木質(zhì)纖維素材料的攝氧率(OUR)的情況。當(dāng)氧消耗(OUR)高于氧轉(zhuǎn)化率時，氧濃度是0mol/m3。溫度和壓力將影響DO。上文給出的優(yōu)選和示例性mol/m3值涉及正常氣壓和約62℃的溫度。本領(lǐng)域技術(shù)人員將在本發(fā)明教導(dǎo)的基礎(chǔ)上領(lǐng)會到有利的DO值。
根據(jù)本發(fā)明，以空氣或其他含氧氣體的形式添加氧還可以用于至少部分地攪拌或混合水解反應(yīng)器內(nèi)容物。添加氧的其他方式包括原位氧生成。例如，通過電解生成氧，酶促地產(chǎn)生氧(優(yōu)選地通過添加過氧化物)，或通過例如氧生成體系(如KHSO5)用化學(xué)方法產(chǎn)生氧。例如，通過過氧化氫酶由過氧化物產(chǎn)生氧。過氧化物可以按溶解的過氧化物的形式添加或通過酶促或化學(xué)反應(yīng)生成。在過氧化氫酶被用作產(chǎn)生氧的酶的情況下，可以使用存在于用于水解的酶組合物中的過氧化氫酶或可以為此目的添加過氧化氫酶。
本發(fā)明的方法尤其在試驗工廠和工業(yè)規(guī)模顯示出優(yōu)勢。優(yōu)選地，水解反應(yīng)器具有1m3或更大、優(yōu)選超過10m3并且最優(yōu)選50m3或更大的容積。通常，水解反應(yīng)器將小于3000m3或5000m3。本發(fā)明人提出了下述理論，即尤其是在大規(guī)模時，水解可利用的氧并不充足，這可能是由于反應(yīng)器中(例如纖維素分解生物質(zhì)中)的氧傳遞受限。在實驗室規(guī)模實驗中，這種氧不充足可發(fā)揮不太重要的作用。與大規(guī)模實驗相比，表面面積(或反應(yīng)器內(nèi)容物的氧接觸面積)與反應(yīng)器容積的比率對于小規(guī)模實驗而言更有利。此外，小規(guī)模實驗中的混合比大規(guī)模實驗中的混合相對簡單。在那些小規(guī)模實驗期間，從水解反應(yīng)器的頂部空間運(yùn)輸氧也比大規(guī)模實驗中的情況更快。這個理論僅僅作為發(fā)明人所注意到的效果的可能解釋給出，并且本發(fā)明并不因這個理論的正確性而成立或不成立。根據(jù)本發(fā)明的再一個實施方式，氧的添加可以用于至少部分地控制水解過程。
根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方式，用于酶促水解的反應(yīng)器具有1m3或更大的容積。優(yōu)選地，反應(yīng)器具有至少1m3、至少2m3、至少3m3、至少4m3、至少5m3、至少6m3、至少7m3、至少8m3、至少9m3、至少10m3、至少15m3、至少20m3、至少25m3、至少30m3、至少35m3、至少40m3、至少45m3、至少50m3、至少60m3、至少70m3、至少75m3、至少80m3、至少90m3、至少100m3、至少200m3、至少300m3、至少400m3、至少500m3、至少600m3、至少700m3、至少800m3、至少900m3、至少1000m3、至少1500m3、至少2000m3、至少2500m3的容積。通常，反應(yīng)器將小于3000m3或5000m3?？梢允褂萌舾煞磻?yīng)器。在本發(fā)明的方法中使用的反應(yīng)器可以具有相同的容積，但是也可以具有不同的容積。本發(fā)明方法的酶促水解時間優(yōu)選為5到150小時。
本發(fā)明所述方法有利地聯(lián)合熱穩(wěn)定酶的使用被應(yīng)用。
“熱穩(wěn)定”酶表示：酶的最適溫度為60℃或更高，例如70℃或更高，例如75℃或更高，例如80℃或更高，例如85℃或更高。例如，它們可分離自嗜熱微生物，或者可由本領(lǐng)域技術(shù)人員設(shè)計和人工合成。在一個實施方式中，多核苷酸可分離自或獲自嗜熱或耐熱絲狀真菌或者分離自非嗜熱或非耐熱但被發(fā)現(xiàn)熱穩(wěn)定的真菌。
“嗜熱真菌”表示在50℃或以上的溫度下生長的真菌。“耐熱真菌”表示在45℃或以上(最大值接近50℃)的溫度下生長的真菌。
嗜熱真菌菌株的實例是Rasamsonia emersonii(以前被稱為Talaromyces emersoni)。Talaromyces emersonii,Penicillium geosmithia emersonii和Rasamsonia emersonii在本文中可交換使用。
合適的嗜熱或耐熱真菌細(xì)胞可以是Humicola、Rhizomucor、Myceliophthora、Rasamsonia、Talaromyces、Thermomyces、Thermoascus或Thielavia細(xì)胞，優(yōu)選地Rasamsonia emersonii細(xì)胞。優(yōu)選的嗜熱或耐熱真菌是Humicola grisea var.thermoidea、Humicola lanuginosa、Myceliophthora thermophila、Papulaspora thermophilia、Rasamsonia byssochlamydoides、Rasamsonia emersonii、Rasamsonia argillacea、Rasamsonia eburnean、Rasamsonia brevistipitata、Rasamsonia cylindrospora、Rhizomucor pusillus、Rhizomucor miehei、Talaromyces bacillisporus、Talaromyces leycettanus、Talaromyces thermophilus、Thermomyces lenuginosus、Thermoascus crustaceus、Thermoascus thermophilus、Thermoascus aurantiacus和Thielavia terrestris。
嗜熱真菌不限于特定分類學(xué)等級并出現(xiàn)在真菌進(jìn)化樹各處。實例是Mucorales中的Rhizomucor，Sordariales中的Myceliophthora和Eurotiales中的Talaromyces、Thermomyces和Thermoascus(Mouchacca 1997)。Talaromyces物種大部分是嗜溫的，但例外是Emersonii和Thermophila部分(section)的物種。Emersonii部分包括Talaromyces emersonii、Talaromyces byssochlamydoides、Talaromyces bacillisporus和Talaromyces leycettanus，它們?nèi)吭?0℃下生長良好。Talaromyces bacillisporus耐熱，Talaromyces leycettanus耐熱至嗜熱，Talaromyces emersonii和Talaromyces byssochlamydoides尤其嗜熱(Stolkand Samson 1972)。Talaromyces部分Thermophila的唯一成員T.thermophilus在50℃下生長迅速(Evans和Stolk 1971；Evans 1971；Stolk和Samson 1972)。這些嗜熱的Talaromyces物種的目前分類主要基于表型和生理特征，例如它們在高于40℃時生長的能力、囊孢子顏色、子囊果覆蓋物(ascornatal covering)的結(jié)構(gòu)和特定無性型類型的形成。Stolk和Samson(1972)陳述：Emersonii部分的成員具有Paecilomyces(T.byssochlamydoides和T.leycettanus)或Penicillium cylindrosporum系列(T.emersonii和T.bacillisporus)其中之一的無性型。稍后，基于多種特征例如從端孔而非在頸(collula，neck)上形成分生孢子(Penicillium和Paecilomyces的特征)，Pitt(1979)將屬于Penicillium cylindrosporum系列的物種轉(zhuǎn)移至Geosmithia屬。在Geosmithia屬內(nèi)，僅G.argillacea是耐熱的，Stolk等人(1969)和Evans(1971)提出了與Talaromyces部分Emersonii成員的聯(lián)系。Talaromyces內(nèi)的嗜熱Talaromyces物種與Trichocomaceae的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系未知(參見J.Houbraken,Antonie van Leeuwenhoek 2012年2月；101(2):403-21)。
Rasamsonia是包括耐熱的和嗜熱的Talaromyces和Geosmithia物種的新屬(J.Houbraken等人，如上所述)?；诒硇?、生理和分子數(shù)據(jù)，Houbraken等人提出將T.emersonii、T.byssochlamydoides、T.eburneus、G.argillacea和G.cylindrospora物種轉(zhuǎn)移至Rasamsonia新屬。Talaromyces emersonii、Penicillium geosmithia emersonii和Rasamsonia emersonii在本文中可交換使用。
優(yōu)選的嗜熱真菌是Rasamsonia byssochlamydoides、Rasamsonia emersonii、Thermomyces lenuginosus、Talaromyces thermophilus、Thermoascus crustaceus、Thermoascus thermophilus和Thermoascus aurantiacus。
“絲狀真菌”包括Eumycota和Oomycota亞門的所有絲狀形式(如Hawksworth等人,在Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi,第8版,1995,CAB International,University Press,Cambridge,UK中定義)。絲狀真菌的特征為由幾丁質(zhì)、纖維素、葡聚糖、殼聚糖、甘露聚糖和其它復(fù)雜多糖構(gòu)成的菌絲壁。營養(yǎng)生長通過菌絲伸長進(jìn)行且碳分解代謝絕對好氧。絲狀真菌菌株包括但不限于，Acremonium,Agaricus,Aspergillus,Aureobasidium,Beauvaria,Cephalosporium,Ceriporiopsis,Chaetomium paecilomyces,Chrysosporium,Claviceps,Cochiobolus,Coprinus,Cryptococcus,Cyathus,Emericella,Endothia,Endothia mucor,Filibasidium,Fusarium,Geosmithia,Gilocladium,Humicola,Magnaporthe,Mucor,Myceliophthora,Myrothecium,Neocallimastix,Neurospora,Paecilomyces,Penicillium,Piromyces,Panerochaete,Pleurotus,Podospora,Pyricularia,Rasamsonia,Rhizomucor,Rhizopus,Scylatidium,Schizophyllum,Stagonospora,Talaromyces,Thermoascus,Thermomyces,Thielavia,Tolypocladium,Trametes pleurotus,Trichoderma和Trichophyton的菌株。
絲狀真菌的若干菌株在許多培養(yǎng)物保藏機(jī)構(gòu)易于被公眾獲得，例如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection(ATCC)),德國微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSM)),真菌生物多樣性中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures(CBS))和農(nóng)業(yè)研究服務(wù)專利培養(yǎng)物保藏北區(qū)研究中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection,Northern Regional Research Center(NRRL))。這些菌株的實例包括Aspergillus niger CBS 513.88、Aspergillus oryzae ATCC 20423、IFO 4177、ATCC 1011、ATCC 9576、ATCC14488-14491、ATCC 11601、ATCC12892、P.chrysogenum CBS 455.95、Penicillium citrinum ATCC 38065、Penicillium chrysogenum P2、Talaromyces emersonii CBS 393.64、Acremonium chrysogenum ATCC 36225或ATCC 48272、Trichoderma reesei ATCC 26921或ATCC 56765或ATCC 26921、Aspergillus sojae ATCC11906、Chrysosporium lucknowense C1、Garg 27K、VKM-F 3500-D、ATCC44006和其衍生株。
在合適的微生物中表達(dá)和生產(chǎn)酶(例如至少2、3或4種不同纖維素酶)的一個優(yōu)勢可以為高的酶組合物產(chǎn)率，其可被用于本發(fā)明所述方法中。
根據(jù)本發(fā)明，通過加入氧，可以達(dá)到許多方法優(yōu)勢，包括最佳溫度條件、減少處理時間、降低酶劑量、酶的再利用和其它過程優(yōu)化，從而導(dǎo)致成本降低。有利地，本發(fā)明提供這樣的方法，其中水解步驟在改進(jìn)的條件下進(jìn)行。本發(fā)明還提供涉及具有減少的處理時間的水解的方法。此外，本發(fā)明提供這樣的方法，其中酶的劑量可被減少并且同時有用水解產(chǎn)物的輸出被保持在相同水平。本發(fā)明的另一個優(yōu)勢是：涉及水解的本發(fā)明方法可導(dǎo)致被優(yōu)化的處理條件。本發(fā)明的另一個優(yōu)勢是：使用相同的酶劑量，涉及水解的方法的有用水解產(chǎn)物的輸出增加。
穩(wěn)定的酶組合物
本文中的穩(wěn)定酶組合物表示：酶組合物在30小時水解反應(yīng)時間后保持活性，優(yōu)選地，在30小時水解反應(yīng)時間后保持其初始活性的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。優(yōu)選地，酶組合物在40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500小時的水解反應(yīng)時間后保持活性。
在一個實施方式中，用于本發(fā)明方法中的酶組合物衍生自真菌或用于本發(fā)明方法中的酶組合物包含真菌酶。在一個實施方式中，酶組合物衍生自絲狀真菌或酶組合物包含絲狀真菌酶。本發(fā)明的方法有利地是結(jié)合從Rasamsonia屬的微生物衍生的酶組合物應(yīng)用的或酶組合物包含Rasamsonia酶。
可通過用合適的微生物(例如Rasamsonia emersonii或Aspergillus niger)發(fā)酵合適的底物制備酶組合物，其中酶組合物通過微生物生產(chǎn)。可改變微生物以改進(jìn)或制造纖維素酶組合物。例如，可通過傳統(tǒng)菌株改良程序或通過重組DNA技術(shù)使微生物突變。因此，本文提及的微生物可被原樣使用以產(chǎn)生纖維素酶組合物或可被改變以增加產(chǎn)量或產(chǎn)生改變的纖維素酶組合物(其可包含異源纖維素酶，即這種微生物原本不產(chǎn)生的酶)。優(yōu)選地，真菌更優(yōu)選地絲狀真菌被用來產(chǎn)生纖維素酶組合物。有利地，使用嗜熱或耐熱微生物。任選地，在酶組合物生產(chǎn)期間，使用誘導(dǎo)酶組合物中的酶表達(dá)的底物。
酶組合物被用來從包含多糖的木質(zhì)纖維素中釋放糖。主要的多糖為纖維素(葡聚糖)和半纖維素(木聚糖、雜木聚糖(heteroxylans)和木葡聚糖(xyloglucans))。另外，一些半纖維素可在例如得自木材的原料中作為葡甘露聚糖存在。這些多糖向可溶糖(包括單體和多聚體，例如葡萄糖、纖維二糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、果糖、甘露糖、鼠李糖、核糖、半乳糖醛酸、葡糖醛酸以及其它己糖和戊糖)的酶促水解發(fā)生于共同作用(acting in concert)的不同酶的作用下。糖產(chǎn)物表示原料或木質(zhì)纖維素材料的酶促水解產(chǎn)物。糖產(chǎn)物將包含可溶性糖(包含單體和多聚體二者)，優(yōu)選地將包含葡萄糖。其它糖的實例為纖維二糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、果糖、甘露糖、鼠李糖、核糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸以及其它己糖和戊糖。糖產(chǎn)物可被原樣使用或者可被進(jìn)一步加工例如被純化。
另外，果膠和其它果膠類物質(zhì)如阿拉伯聚糖(arabinans)可占來自非木本植物組織典型的細(xì)胞壁干物質(zhì)的可觀的比例(約四分之一到一半的干物質(zhì)可以是果膠)。
纖維素是由通過β-1,4鍵連接的葡萄糖殘基構(gòu)成的線性多糖。纖維素纖維的線性特性以及β-連接的葡萄糖(相對于α)的化學(xué)計量產(chǎn)生比淀粉的高度枝化α-連接結(jié)構(gòu)更傾向于鏈間氫鍵結(jié)合的結(jié)構(gòu)。因此，纖維素聚合物與淀粉中存在的纖維相比通常溶解度更小，并且形成更緊密結(jié)合的纖維。
現(xiàn)更詳細(xì)描述可被包括在用于本發(fā)明的穩(wěn)定酶組合物中的酶：
GH61，內(nèi)切葡聚糖酶(EG)和外切纖維二糖水解酶(CBH)催化不溶性纖維素水解成產(chǎn)物例如纖維寡糖(纖維二糖作為主要產(chǎn)物)，而β-葡糖苷酶(BG)將寡糖(主要是纖維二糖和纖維三糖)轉(zhuǎn)化成葡萄糖。
半纖維素是復(fù)雜聚合物及其組成常常在生物之間、組織類型之間大幅變化。通常，半纖維素的主要成分是β-1,4-連接的木糖(一種五碳糖)。然而，所述木糖通常在木糖的0-3和/或0-2原子枝化，并且可以被與阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、葡糖醛酸、半乳糖醛酸的鍵或者通過乙酸酯化(和阿魏酸對阿拉伯糖的酯化)被取代。半纖維素也可含有葡聚糖，所述葡聚糖是β-連接的六碳糖(例如先前提到的β-(1,3)(1,4)葡聚糖和雜葡聚糖)和另外的葡甘露聚糖(其中葡萄糖和甘露糖均存在于線性主鏈中，彼此通過β-鍵連接)的總稱。
木聚糖酶與其它輔助酶例如α-L-阿拉伯呋喃糖酶、阿魏酸酯酶和乙酰木聚糖酯酶、葡糖醛酸酶和β-木糖苷酶)一起催化半纖維素的水解。
果膠類物質(zhì)包括果膠、阿拉伯聚糖、半乳聚糖和阿拉伯半乳聚糖。果膠是植物細(xì)胞壁中最復(fù)雜的多糖。它們圍繞一定程度上散布著L-鼠李糖的α(1,4)-連接的D-半乳糖醛酸單元的核心鏈構(gòu)建。在任何細(xì)胞壁中都存在符合所述描述的大量結(jié)構(gòu)單元，并且通常認(rèn)為在單個果膠分子中，不同結(jié)構(gòu)單元的核心鏈彼此連續(xù)。
結(jié)構(gòu)單元的主要類型是：半乳糖醛酸(同聚半乳糖醛酸)，其可被甲醇在羧基上取代，被乙酸酯在O-2和O-3上取代；鼠李半乳糖醛酸聚糖I(RGI)，其中半乳糖醛酸單元與帶有(1,4)-連接的半乳聚糖和(1,5)-連接的阿拉伯聚糖側(cè)鏈的鼠李糖交替。阿拉伯聚糖側(cè)鏈可直接與鼠李糖結(jié)合，或者通過半乳聚糖鏈間接結(jié)合；木半乳糖醛酸聚糖(xylogalacturonan)，在半乳糖醛酸的O-3上具有單個木糖基單元(與RGI緊密關(guān)聯(lián))；和鼠李半乳糖醛酸聚糖II(RGII)，含有罕見糖例如芹菜糖的特別復(fù)雜的小型單元。RGII單元可含有兩個芹菜糖殘基，所述芹菜糖殘基在合適的離子條件下能夠與硼酸鹽可逆地形成酯。
在本發(fā)明方法中使用的組合物優(yōu)選地包含至少兩種活性，但典型的組合物將包含多于兩種活性，例如三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種或更多。典型地，本發(fā)明的組合物可包含至少兩種不同的纖維素酶或者兩種纖維素酶和至少一種半纖維素酶。本發(fā)明的組合物可包含纖維素酶，但是不含木聚糖酶。另外，本發(fā)明的組合物可包含輔助酶活性，即直接或間接導(dǎo)致木質(zhì)纖維素降解的額外活性。這種輔助活性的實例在本文中被提及。
因此，在本發(fā)明中使用的組合物可包含GH61，內(nèi)切葡聚糖酶活性和/或纖維二糖水解酶活性和/或β-葡糖苷酶活性。在本發(fā)明中使用的組合物可包含一個或多個這些種類中的多于一種的酶活性。例如，在本發(fā)明中使用的組合物可包含兩種內(nèi)切葡聚糖酶活性，例如內(nèi)切-1,3(1,4)-β葡聚糖酶活性和內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶活性。這種組合物也可包含一種或多種木聚糖酶活性。這種組合物可包含輔助酶活性。
在本發(fā)明中使用的組合物可來源于真菌，例如如Rasamsonia的絲狀真菌例如Rasamsonia emersonii。在一個實施方式中，核心的一組(降解木質(zhì)纖維素的)酶活性可來源于Rasamsonia emersonii。Rasamsonia emersonii能夠提供本文中證明對木質(zhì)纖維素材料的水解而言高度有效的活性組。如果需要，活性組可被來自其它來源的額外的酶活性補(bǔ)充。這種額外的活性可來源于經(jīng)典來源和/或由經(jīng)遺傳改造的生物生產(chǎn)。
本發(fā)明中使用的組合物中的活性可以是熱穩(wěn)定的。本文中這表示：該活性的最適溫度為約60℃或更高，例如約70℃或更高，例如約75℃或更高，例如約80℃或更高，例如85℃℃或更高。本發(fā)明中使用的組合物中的活性一般不具有相同的最適溫度，但是優(yōu)選地將是熱穩(wěn)定的。
另外，本發(fā)明中使用的組合物中的酶活性可以能夠在低pH下起作用。為了本發(fā)明目的，低pH表示約5.5或更低，約5或更低，約4.9或更低，約4.8或更低，約4.7或更低，約4.6或更低，約4.5或更低，約4.4或更低，約4.3或更低，約4.2或更低，約4.1或更低，約4.0或更低，約3.9或更低，或約3.8或更低，約3.7或更低，約3.6或更低，或約3.5或更低的pH。
本發(fā)明中使用的組合物中的活性可以通過任何上述最適溫度和pH值的組合來限定。
除了來源于Rasamsonia的活性以外，本發(fā)明方法中使用的組合物還可包含纖維素酶(例如來源于不同于Rasamsonia的來源的纖維素酶)和/或半纖維素酶(例如來源于不同于Rasamsonia的來源的半纖維素酶)和/或果膠酶。
在當(dāng)前發(fā)明的方法中所用的酶組合物可包含不同于Rasamsonia的來源的纖維素酶和/或半纖維素酶和/或果膠酶。它們可以與一種或更多種Rasamsonia酶一起使用或者它們可以在不存在額外的Rasamsonia酶的情況下使用。
例如，用于本發(fā)明的方法中的酶可包含源于Aspergillus的β-葡糖苷酶(BG)，如Aspergillus oryzae如在WO 02/095014中公開的或具有在WO 2008/057637中公開的β-葡糖苷酶活性的融合蛋白，或Aspergillus fumigatus，如在WO 2005/047499中的SEQ ID NO:2或在WO 2014/130812中的SEQ ID NO:5所公開的或Aspergillus fumigatusβ-葡糖苷酶變體，如在WO 2012/044915中公開的，如具有下列替換的：F100D,S283G,N456E,F512Y(使用WO 2014/130812中的SEQ ID NO:5進(jìn)行編號)或Aspergillusaculeatus,Aspergillus niger或Aspergillus kawachi。在另一個實施方式中，β-葡糖苷酶源自Penicillium，如WO 2007/019442中的SEQ ID NO:2所公開的Penicillium brasilianum或來自Trichoderma，如Trichoderma reesei,，如在US 6,022,725、US 6,982,159、US 7,045,332、US 7,005,289、US2006/0258554、US2004/0102619中描述的那些。在一個實施方式中，甚至可使用細(xì)菌β-葡糖苷酶。在另一個實施方式中，β-葡糖苷酶是從Thielavia terrestris(WO 2011/035029)或Trichophaea saccata(WO 2007/019442)衍生的。
例如，用于本發(fā)明方法中的酶可包含內(nèi)切葡聚糖酶(EG)，其源于Trichoderma,例如Trichoderma reesei；Humicola,例如Humicola insolens的菌株；Aspergillus,例如Aspergillus aculeatus或Aspergillus kawachii；Erwinia,例如Erwinia carotovara；Fusarium,例如Fusarium oxysporum；Thielavia,例如Thielavia terrestris；Humicola,例如Humicola grisea var.thermoidea或Humicola insolens；Melanocarpus,例如Melanocarpus albomyces；Neurospora,例如Neurospora crassa；Myceliophthora,例如Myceliophthora thermophila；Cladorrhinum,例如Cladorrhinum foecundissimum和/或Chrysosporium,例如Chrysosporium lucknowense的菌株。在一個實施方式中，甚至可使用細(xì)菌內(nèi)切葡聚糖酶，其包括但不限于Acidothermus cellulolyticus內(nèi)切葡聚糖酶(見WO 91/05039；WO 93/15186；US 5,275,944；WO 96/02551；US 5,536,655,WO 00/70031,WO 05/093050)；Thermobifida fusca內(nèi)切葡聚糖酶III(見WO 05/093050)；以及Thermobifida fusca內(nèi)切葡聚糖酶V(見WO 05/093050)。
例如，用于本發(fā)明方法的酶可包含纖維二糖水解酶I，其源于Aspergillus，如Aspergillus fumigatus，如在WO 2011/057140中SEQ ID NO:6或WO 2014/130812中SEQ ID NO:6公開的Cel7A CBH I或源于Trichoderma，如Trichoderma reesei。
例如，用于本發(fā)明方法中的酶可包含纖維二糖水解酶II，其源于Aspergillus，如Aspergillus fumigatus，如在WO 2014/130812中SEQ ID NO:7或源于Trichoderma，如Trichoderma reesei或源于Thielavia，如Thielavia terrestris，如源于Thielavia terrestris的纖維二糖水解酶II CEL6A。
例如，用于本發(fā)明方法中的酶可包含GH61多肽(溶解性多糖單加氧酶)，其源于Thermoascus，如Thermoascus aurantiacus，如在WO 2005/074656中作為SEQ ID No:2和在WO2014/130812中SEQ ID NO:1和WO 2010/065830所述的；或源于Thielavia，如Thielavia terrestris，如在WO 2005/074647中作為SEQ ID NO:8或在WO2014/130812中的SEQ ID NO:4，WO 2008/148131和WO 2011/035027中所述的；或源于Aspergillus，如Aspergillus fumigatus，如在WO 2010/138754作為SEQ ID NO:2或在WO2014/130812中的SEQ ID NO:3所述的；或源于Penicillium，如Penicillium emersonii，如作為WO 2011/041397中的SEQ ID NO:2或在WO2014/130812中的SEQ ID NO:2所述的。另一些合適的GH61多肽包括但不限于Trichoderma reesei(見WO 2007/089290)、Myceliophthora thermophila(見WO 2009/085935、WO 2009/085859、WO 2009/085864、WO 2009/085868)、Penicillium pinophilum(見WO 2011/005867)、Thermoascus sp.(見WO 2011/039319)和Thermoascus crustaceous(見WO 2011/041504)。在一個方面，根據(jù)WO 2008/151043在存在有可溶的活化二價金屬陽離子的情況下使用GH61多肽，例如硫酸錳。在一個方面中，在存在有二氧基化合物、雙環(huán)化合物、雜環(huán)化合物、含氮化合物、醌化合物、含硫化合物或從預(yù)處理的纖維素材料如預(yù)處理的玉米秸稈獲得的液體的情況下使用GH61多肽。
僅舉幾例，可用于本發(fā)明方法中的其它纖維素分解酶在WO 98/13465、WO 98/015619、WO 98/015633、WO 99/06574、WO 99/10481、WO 99/025847、WO 99/031255、WO 2002/101078、WO 2003/027306、WO 2003/052054、WO 2003/052055、WO 2003/052056、WO 2003/052057、WO 2003/052118、WO 2004/016760、WO 2004/043980、WO 2004/048592、WO 2005/001065、WO 2005/028636、WO 2005/093050、WO 2005/093073、WO 2006/074005、WO 2006/117432、WO 2007/071818、WO 2007/071820、WO 2008/008070、WO 2008/008793、US 5,457,046、US 5,648,263和US 5,686,593中描述。
此外，在本發(fā)明方法中有用的木聚糖酶的示例包括但不限于源于Aspergillus aculeatus(見WO 94/21785)、Aspergillus fumigatus(見WO 2006/078256)、Penicillium pinophilum(見WO 2011/041405)、Penicilliumsp.(見WO 2010/126772)、Thielavia terrestris NRRL 8126(見WO 2009/079210)和Trichophaea saccata GH10(見WO 2011/057083)的木聚糖酶。在本發(fā)明的方法中有用的β-木糖苷酶的示例包括但不限于源于Neurospora crassa和Trichoderma reesei的β-木糖苷酶。在本發(fā)明方法中有用的乙酰木聚糖酯酶的示例包括但不限于源于Aspergillus aculeatus(見WO 2010/108918)、Chaetomium globosum,Chaetomium gracile,Humicola insolensDSM 1800(見WO 2009/073709)、Hypocrea jecorina(見WO 2005/001036)、Myceliophtera thermophila(見WO 2010/014880)、Neurospora crassa,Phaeosphaeria nodorum和Thielavia terrestris NRRL 8126(見WO 2009/042846)的乙酰木聚糖酯酶。在本發(fā)明方法中有用的阿魏酸酯酶(feruloyl esterases(ferulic acid esterases))的示例包括但不限于源于Humicola insolens DSM 1800(見WO 2009/076122)、Neosartorya fischeri,Neurospora crassa,Penicillium aurantiogriseum(見WO 2009/127729)和Thielavia terrestris(見WO 2010/053838和WO 2010/065448)的阿魏酸酯酶。在本發(fā)明方法中有用的阿拉伯呋喃糖苷酶的示例包括但不限于源于Aspergillus niger,Humicola insolens DSM1800(見WO 2006/114094和WO 2009/073383)和M.giganteus(見WO 2006/114094)的阿拉伯呋喃糖苷酶。在本發(fā)明方法中有用的α-葡萄糖醛酸苷酶的示例包括但不限于源于Aspergillus clavatus,Aspergillus fumigatus,Aspergillus niger,Aspergillus terreus,Humicola insolens(見WO 2010/014706)、Penicillium aurantiogriseum(見WO 2009/068565)和Trichoderma reesei的α-葡萄糖醛酸苷酶。
本發(fā)明中使用的組合物可包含一種、兩種、三種、四種或更多種纖維素酶，例如GH61、內(nèi)切葡聚糖酶(EG)、一種或兩種外切纖維二糖水解酶(CBH)和β-葡糖苷酶(BG)中的一種、兩種、三種或四種或全部。本發(fā)明中使用的組合物可包含兩種或更多種任何這些種類的纖維素酶。
本發(fā)明的組合物可包含下述活性，所述活性與本發(fā)明方法中使用的組合物所提供的活性具有不同種類的纖維素酶活性和/或半纖維素酶活性和/或果膠酶活性。例如，本發(fā)明的組合物可包含一種由本文所述的組合物提供的纖維素酶和/或半纖維素酶活性和/或果膠酶活性，和由額外的纖維素酶/半纖維素酶/果膠酶提供的第二類纖維素酶和/或半纖維素酶活性和/或果膠酶活性。
在本文中，纖維素酶是能夠降解或改性纖維素的任何多肽。能夠降解纖維素的多肽是能夠催化下述過程的多肽：將纖維素降解成更小的單元，部分地例如降解成纖維糊精，或者完全降解成葡萄糖單體。與纖維素酶接觸時，根據(jù)本發(fā)明的纖維素酶可產(chǎn)生纖維素糊精與葡萄糖單體的混合類群。這種降解將典型地通過水解反應(yīng)而發(fā)生。
LPMO’s(溶解性多糖單加氧酶)最近通過AA9家族(輔助活性家族9)或AA10家族(輔助活性家族10)中的CAZy被分類。如上面所提及的，LPMO能夠打開結(jié)晶葡聚糖結(jié)構(gòu)。LPMO也可影響纖維寡糖。PMO和LPMO在本文可互換使用。根據(jù)最新文獻(xiàn)(Isaksen等,Journal of Biological Chemistry,vol.289,no.5,pp.2632-2642)，GH61(糖苷水解酶家族61或有時被稱為EGIV)蛋白是(溶解性)氧依賴性多糖單加氧酶(PMO’s/LPMO’s)。文獻(xiàn)中通常提及這些蛋白增強(qiáng)纖維素酶對木質(zhì)纖維素底物的作用?；谝粋€家族成員中極低的內(nèi)切-1,4-β-d-葡聚糖酶活性測量值，GH61最初被歸類為內(nèi)切葡聚糖酶。本文所使用的術(shù)語“GH61”將被理解為這樣的酶家族，其共有將被歸類到得到確認(rèn)的CAZy GH分類系統(tǒng)(http://www.cazy.org/GH61.html)的家族61中的常見保守序列部分和折疊。糖苷水解酶家族61是糖苷水解酶EC 3.2.1家族的成員。GH61最近被CAZy重新歸類在家族AA9(輔助活性家族9)。GH61在本文中被用作纖維素酶的一部分。CBM33(家族33碳水化合物結(jié)合模塊)為LPMO(Isaksen等，Journal of Biological Chemistry,vol.289,no.5,pp.2632-2642)，CAZy最近已被重新分類為AA10(輔助活性家族10)中的CBM33。
本文中，半纖維素是能夠降解或改性半纖維素的任何多肽。也就是說，半纖維素酶可以能夠降解或改性木聚糖、葡糖醛酸木聚糖、阿拉伯木聚糖、葡甘露聚糖和木葡聚糖的一種或多種。能夠降解半纖維素的多肽是能夠催化下述過程的多肽：將半纖維素降解成更小的多糖，部分地例如降解成寡糖，或者完全降解成糖單體，例如己糖或戊糖單體。與半纖維素酶接觸時，根據(jù)本發(fā)明的半纖維素酶可產(chǎn)生寡糖與糖單體的混合類群。這種降解將典型地通過水解反應(yīng)而發(fā)生。
本文中，果膠酶是能夠降解或改性果膠的任何多肽。能夠降解果膠的多肽是能夠催化下述過程的多肽：將果膠降解成更小的單元，部分地例如降解成寡糖，或者完全降解成糖單體。與果膠酶接觸時，根據(jù)本發(fā)明的果膠酶可產(chǎn)生寡糖與糖單體的混合類群。這種降解將典型地通過水解反應(yīng)而發(fā)生。
因此，本發(fā)明的組合物可包含任何纖維素酶，例如GH61，纖維二糖水解酶，內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶，β-葡糖苷酶或β-(1,3)(1,4)-葡聚糖酶。
本文中，纖維二糖水解酶(EC 3.2.1.91)是能夠催化纖維素或纖維四糖中1,4-β-D-葡糖苷鍵水解、從鏈末端釋放纖維二糖的任何多肽。這種酶也可以被稱作纖維素酶1,4-β-纖維二糖苷酶(1,4-β-cellobiosidase)，1,4-β-纖維二糖水解酶，1,4-β-D-葡聚糖纖維二糖水解酶，微晶纖維素酶(avicelase)，外切-1,4-β-D-葡聚糖酶，外切纖維二糖水解酶或外切葡聚糖酶。
本文中，內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)是能夠催化纖維素、地衣淀粉或谷類β-D-葡聚糖中1,4-β-D-葡糖苷鍵內(nèi)切水解的任何多肽。這種多肽也可以能夠水解也含有1,3-鍵的β-D-葡聚糖中的1,4-鍵。這種酶也可以被稱作纖維素酶、微晶纖維素酶、β-1,4-內(nèi)切葡聚糖水解酶、β-1,4-葡聚糖酶、羧甲基纖維素酶、纖維糊精酶、內(nèi)切-1,4-β-D-葡聚糖酶、內(nèi)切-1,4-β-D-葡聚糖水解酶、內(nèi)切-1,4-β-葡聚糖酶或內(nèi)切葡聚糖酶。
本文中，β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.21)是能夠催化末端、非還原性β-D-葡萄糖殘基水解并釋放β-D-葡萄糖的任何多肽。這種多肽可具有針對β-D-葡糖苷的廣泛特異性，并且也可以水解以下一種或多種：β-D-半乳糖苷、α-L-阿拉伯糖苷、β-D-木糖苷或β-D-巖藻糖苷。這種酶也可以被稱作苦杏仁苷酶、β-D-葡糖苷葡糖水解酶、纖維二糖酶或龍膽二糖酶。
本文中，β-(1,3)(1,4)-葡聚糖酶(EC 3.2.1.73)是能夠催化含有1,3-和1,4-鍵的β-D-葡聚糖中1,4-β-D-葡糖苷鍵水解的任何多肽。這種多肽可作用于地衣淀粉和谷類β-D-葡聚糖，但不作用于僅含1,3-或1,4-鍵的β-D-葡聚糖。這種酶也可以被稱作地衣淀粉酶(licheninase)，1,3-1,4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶，β-葡聚糖酶，內(nèi)切-β-1,3-1,4葡聚糖酶，地衣多糖酶(lichenase)或混合鍵β-葡聚糖酶。這種酶的替代物是被描述為內(nèi)切-1,3(4)-β-葡聚糖酶的EC 3.2.1.6。當(dāng)其還原基團(tuán)參與待水解的鍵的葡萄糖殘基自身在C-3處被取代時，這種酶水解β-D-葡聚糖中的1,3-鍵或1,4-鍵。替代性名稱包括內(nèi)切-1,3-β-葡聚糖酶，昆布多糖酶，1,3-(1,3；1,4)-β-D-葡聚糖3(4)葡聚糖水解酶，底物包括昆布多糖，地衣淀粉和谷類β-D-葡聚糖。
本發(fā)明的組合物可以包含任何半纖維素酶，例如內(nèi)切木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-D-葡糖醛酸酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、香豆酸酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-甘露聚糖酶或β-甘露糖苷酶。
本文中，內(nèi)切木聚糖酶(EC 3.2.1.8)是能夠催化木聚糖中1,4-β-D-木糖苷鍵內(nèi)切水解的任何多肽。這種酶也可以被稱作內(nèi)切-1,4-β-木聚糖酶或1,4-β-D-木聚糖木聚糖水解酶。供替代的選擇是EC 3.2.1.136葡糖醛酸阿拉伯木聚糖內(nèi)切木聚糖酶(glucuronoarabinoxylan endoxylanase)，其能夠水解葡糖醛酸阿拉伯木聚糖中1,4木糖苷鍵。
本文中，β-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)是能夠催化1,4-β-D-木聚糖的水解，從非還原性末端去除相繼的D-木糖殘基的任何多肽。這種酶也可以水解木二糖。這種酶也可以被稱作木聚糖1,4-β-木糖苷酶、1,4-β-D-木聚糖木糖水解酶、外切-1,4-β-木糖苷酶或木二糖酶。
本文中，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(EC 3.2.1.55)是能夠作用于α-L-阿拉伯呋喃糖苷、含(1,2)和/或(1,3)-和/或(1,5)-鍵的α-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖的任何多肽。這種酶也可以被稱作α-N-阿拉伯呋喃糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶或阿拉伯糖苷酶。
本文中，α-D-葡糖醛酸糖苷酶(EC 3.2.1.139)是能夠催化以下形式反應(yīng)的任何多肽：α-D-葡糖醛酸苷+H(2)O＝醇+D-葡糖醛酸(D-glucuronate)。這種酶也被稱作α-葡糖醛酸糖苷酶或α-葡糖苷酸酶(alpha-glucosiduronase)。這些酶也可水解可作為木聚糖中取代基存在的4-O-甲基化的葡糖醛酸。供替代的選擇是EC 3.2.1.131：木聚糖α-1,2-葡糖醛酸糖苷酶，其催化α-1,2-(4-O-甲基)葡糖醛酸基連接的水解。
本文中，乙?；揪厶酋ッ?EC 3.1.1.72)是能夠催化木聚糖和木寡糖脫乙?；娜魏味嚯?。這種多肽可催化來自多聚木聚糖、乙?；咎恰⒁阴；咸烟?、α-萘基乙酸酯或?qū)ο趸交宜狨サ囊阴；?，但是一般不催化來自于三乙?；嫉囊阴；?。這種多肽一般不作用于乙?；母事毒厶腔蚬z。
本文中，阿魏酸酯酶(EC 3.1.1.73)是能夠催化以下形式反應(yīng)的任何多肽：阿魏酸基-糖+H2O＝阿魏酸(ferulate)+糖。糖可以是例如寡糖或多糖。其典型地可以催化來自酯化的糖的4-羥基-3-甲氧基肉桂酰(阿魏酰)基的水解，所述糖通常是“天然”底物中的阿拉伯糖。對硝基苯酚乙酸酯和阿魏酸甲基酯是典型地更弱的底物。這種酶也可以被稱作肉桂?；ニ饷福⑽核狨ッ富蛄u基肉桂?；ッ?。也可以被稱作半纖維素酶輔助酶，因為其可幫助木聚糖酶和果膠酶分解植物細(xì)胞壁半纖維素和果膠。
本文中，香豆酰基酯酶(EC 3.1.1.73)是能夠催化以下形式反應(yīng)的任何多肽：香豆?；?糖+H(2)O＝香豆酸(coumarate)+糖。糖可以是例如寡糖或多糖。這種酶也可以被稱作反式-4-香豆?；ッ浮⒎词?對香豆?；ッ?、對香豆酰基酯酶或?qū)ο愣顾狨ッ?。這種酶也落入EC 3.1.1.73中，從而也可以被稱作阿魏酸酯酶。
本文中，α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)是能夠催化α-D-半乳糖苷(包括半乳糖寡糖、半乳甘露聚糖、半乳聚糖和阿拉伯半乳聚糖)中末端、非還原性α-D-半乳糖殘基水解的任何多肽。這種多肽也可以能夠水解α-D-巖藻糖苷。所述酶也可以被稱作蜜二糖酶。
本文中，β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)是能夠催化β-D-半乳糖苷中末端非還原性β-D-半乳糖殘基水解的任何多肽。這種多肽也可以能夠水解α-L-阿拉伯糖苷。這種酶也可以被稱作外切-(1->4)-β-D-半乳聚糖酶或乳糖酶。
本文中，β-甘露聚糖酶(EC 3.2.1.78)是能夠催化甘露聚糖、半乳甘露聚糖和葡甘露聚糖中1,4-β-D-甘露糖苷鍵隨機(jī)水解的任何多肽。這種酶也可以被稱作甘露聚糖內(nèi)切-1,4-β-甘露糖苷酶或內(nèi)切-1,4-甘露聚糖酶。
本文中，β-甘露糖苷酶(EC 3.2.1.25)是能夠催化β-D-甘露糖苷中末端非還原性β-D-甘露糖殘基水解的任何多肽。這種酶也可以被稱作甘露聚糖酶或甘露糖酶。
本發(fā)明的組合物可包含任何果膠酶，例如內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶，果膠甲基酯酶，內(nèi)切-半乳聚糖酶，β-半乳糖苷酶，果膠乙?；ッ福瑑?nèi)切-果膠裂解酶，果膠酸裂解酶，α-鼠李糖苷酶，外切-半乳糖醛酸酶，外切多聚半乳糖醛酸裂解酶，鼠李半乳糖醛酸聚糖水解酶，鼠李半乳糖醛酸聚糖裂解酶，鼠李半乳糖醛酸聚糖乙?；ッ福罄畎肴樘侨┧峋厶前肴樘侨┧崴饷?，木半乳糖醛酸酶。
本文中，內(nèi)切-多聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.15)是能夠催化果膠酸酯和其它半乳糖醛酸聚糖中1,4-α-D-半乳糖醛酸鍵的隨機(jī)水解的任何多肽。這種酶也可以被稱作多聚半乳糖醛酸酶果膠解聚酶，果膠酶(pectinase)，內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶，果膠酶(pectolase)，果膠水解酶，果膠多聚半乳糖醛酸酶，多聚-α-1,4-半乳糖醛酸苷聚糖水解酶，內(nèi)切半乳糖醛酸酶；內(nèi)切-D-半乳糖醛酸酶或多聚(1,4-α-D-半乳糖醛酸苷)聚糖水解酶。
在本文中，果膠甲基酯酶(EC 3.1.1.11)是能夠催化下述反應(yīng)的任何酶：果膠+n H2O＝n甲醇+果膠酸(pectate)。這種酶也被稱為果膠酯酶(pectinesterase)，果膠脫甲氧基酶，果膠甲氧基酶，果膠甲基酯酶，果膠酶，果膠酯酶(pectinoesterase)或果膠果基水解酶(pectin pectylhydrolase)。
在本文中，內(nèi)切-半乳聚糖酶(EC 3.2.1.89)是能夠催化阿拉伯半乳聚糖中1,4-β-D-半乳糖苷鍵的內(nèi)切水解的任何酶。這種酶也被稱為阿拉伯半乳聚糖內(nèi)切-1,4-β-半乳糖苷酶，內(nèi)切-1,4-β-半乳聚糖酶，半乳聚糖酶，阿拉伯半乳聚糖酶或阿拉伯半乳聚糖4-β-D-半乳聚糖水解酶。
本文中，果膠乙?；ッ冈诒疚闹斜欢x為下述任何酶，所述酶具有催化果膠GaIUA殘基羥基處的乙?；拿撘阴５囊阴；ッ富钚?。
本文中，內(nèi)切-果膠裂解酶(EC 4.2.2.10)是能夠催化(1→4)-α-D-半乳糖醛酸聚糖甲基酯的清除性切割，得到在其非還原末端具有4-脫氧-6-O-甲基-α-D-半乳-4-糖醛?；墓烟堑娜魏蚊?。所述酶也可被稱為果膠裂解酶，果膠反式消除酶(trans-eliminase)，內(nèi)切果膠裂解酶，多聚甲基半乳糖醛酸反式消除酶，果膠甲基反式消除酶，果膠溶解酶，PL，PNL或PMGL或(1→4)-6-O-甲基-α-D-半乳糖醛酸聚糖裂解酶。
本文中，果膠酸裂解酶(EC 4.2.2.2)是能夠催化(1→4)-α-D-半乳糖醛酸聚糖的消除性切割，得到在其非還原性末端具有4-脫氧-α-D-半乳-4-糖醛酸基的寡糖的任何酶。這種酶也可被稱為多聚半乳糖醛酸反式消除酶，果膠酸反式消除酶，多聚半乳糖醛酸酯裂解酶，內(nèi)切果膠甲基反式消除酶，果膠酸反式消除酶，內(nèi)切半乳糖醛酸反式消除酶，果膠酸裂解酶，果膠裂解酶，α-1,4-D-內(nèi)切多聚半乳糖醛酸裂解酶，PGA裂解酶，PPase-N，內(nèi)切-α-1,4-多聚半乳糖醛酸裂解酶，多聚半乳糖醛酸裂解酶，果膠反式消除酶，多聚半乳糖醛酸反式消除酶或(1→4)-α-D-半乳糖醛酸聚糖裂解酶。
本文中，α-鼠李糖苷酶(EC 3.2.1.40)是能夠催化α-L-鼠李糖苷或替代地鼠李半乳糖醛酸聚糖中末端非還原性α-L-鼠李糖殘基水解的任何多肽。這種酶也可被稱為α-L-鼠李糖苷酶T，α-L-鼠李糖苷酶N或α-L-鼠李糖苷鼠李糖水解酶。
本文中，外切-半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.82)是能夠從非還原性末端水解果膠酸，釋放二半乳糖醛酸的任何多肽。所述酶也可被稱為外切-多聚-α-半乳糖醛酸苷酶(exo-poly-α-galacturonosidase)、外切多聚半乳糖醛酸苷酶(exopolygalacturonosidase)或外切多聚聚半乳糖醛酸苷酶(exopolygalacturanosidase)。
本文中，外切-半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.67)是能夠催化以下的任何多肽：(1,4-α-D-半乳糖醛酸苷)n+H2O＝(1,4-α-D-半乳糖醛酸苷)n-1+D-半乳糖醛酸(D-galacturonate)。這種酶也可被稱為半乳糖醛1,4-α-半乳糖醛酸苷酶(galacturan 1,4-α-galacturonidase)，外切多聚半乳糖醛酸酶，多聚(半乳糖醛酸)水解酶，外切-D-半乳糖醛酸酶，外切-D-半乳糖醛酸聚糖酶，外切多聚-D-半乳糖醛酸酶或多聚(1,4-α-D-半乳糖醛酸苷)半乳糖醛酸水解酶。
本文中，外切多聚半乳糖醛酸裂解酶(EC 4.2.2.9)是能夠催化從果膠酸(即脫酯化的果膠)的還原末端消除性切割4-(4-脫氧-α-D-半乳-4-糖醛酸基)-D-半乳糖醛酸的任何多肽。這種酶也可被稱為果膠酸二糖裂解酶，果膠酸外切裂解酶，外切果膠酸反式消除酶，外切果膠酸裂解酶，外切多聚半乳糖醛酸-反式-消除酶，PATE，外切-PATE，外切-PGL或(1→4)-α-D-半乳糖醛酸聚糖還原末端二糖裂解酶。
本文中，鼠李半乳糖醛酸聚糖水解酶是能夠在由二糖[(1,2-α-L-鼠李糖基-(1,4)-α-半乳糖醛酸]組成的嚴(yán)格交替的鼠李半乳糖醛酸聚糖結(jié)構(gòu)中以內(nèi)切方式水解半乳基糖醛酸和吡喃鼠李糖基之間鍵的任何多肽。
本文中，鼠李半乳糖醛酸聚糖裂解酶是能夠以內(nèi)切方式在鼠李半乳糖醛酸聚糖中通過β-消除切割α-L-Rhap-(1→4)-α-D-GalpA鍵的任何多肽。
本文中，鼠李半乳糖醛酸聚糖乙?；ッ甘悄軌虼呋罄畎肴樘侨┧峋厶侵薪惶娴氖罄钐呛桶肴樘侨┧釟埢麈湹拿撘阴；娜魏味嚯?。
本文中，鼠李半乳糖醛酸聚糖半乳糖醛酸水解酶是能夠以外切方式，從嚴(yán)格交替的鼠李半乳糖醛酸聚糖結(jié)構(gòu)的非還原性末端水解半乳糖醛酸的任何多肽。
本文中，木半乳糖醛酸酶是通過以內(nèi)切方式切割β-木糖取代的半乳糖醛酸主鏈而作用于木半乳糖醛酸聚糖的任何多肽。這種酶也可被稱為木半乳糖醛酸聚糖水解酶。
本文中，α-L-阿拉伯糖呋喃糖苷酶(EC 3.2.1.55)是能夠作用于α-L-阿拉伯呋喃糖苷、含有(1,2)和/或(1,3)-和/或(1,5)-鍵的α-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖的任何多肽。這種酶也可以被稱為α-N-阿拉伯糖呋喃糖苷酶，阿拉伯糖呋喃糖苷酶或阿拉伯糖苷酶。
本文中，內(nèi)切阿拉伯聚糖酶(EC 3.2.1.99)是能夠催化1,5-阿拉伯聚糖中1,5-α-阿拉伯呋喃糖苷鍵內(nèi)切水解的任何多肽。這種酶也可被稱為內(nèi)切阿拉伯糖酶，阿拉伯聚糖內(nèi)切-1,5-α-L-阿拉伯糖苷酶，內(nèi)切-1,5-α-L-阿拉伯聚糖酶，內(nèi)切-α-1,5-阿拉伯聚糖酶；內(nèi)切-阿拉伯聚糖酶或1,5-α-L-阿拉伯聚糖1,5-α-L-阿拉伯聚糖水解酶。
本發(fā)明的組合物將一般包含至少兩種纖維素酶和任選地至少一種半纖維素酶和任選地至少一種果膠酶(其中之一是根據(jù)本發(fā)明的多肽)。本發(fā)明的組合物可包含GH61，纖維二糖水解酶，內(nèi)切葡聚糖酶和/或β-葡糖苷酶。這種組合物也可以包含一種或多種半纖維素酶和/或一種或多種果膠酶。
另外，本發(fā)明的組合物中可以存在淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、木質(zhì)酶、己糖基轉(zhuǎn)移酶、葡糖醛酸糖苷酶或擴(kuò)展蛋白(expansin)或纖維素誘導(dǎo)蛋白或纖維素整合蛋白或類似蛋白質(zhì)中的一種或多種(例如兩種、三種、四種或所有)(這些也被稱作上文的輔助活性)。
“蛋白酶”包括水解肽鍵的酶(肽酶)，以及水解肽和其它部分(如糖)之間鍵的酶(糖肽酶)。許多蛋白酶歸類為EC 3.4，它們適合在本發(fā)明中使用并且通過引用并入本文。一些特定類型的蛋白酶包括半胱氨酸蛋白酶(包括胃蛋白酶，木瓜蛋白酶)和絲氨酸蛋白酶(包括糜蛋白酶，羧肽酶和金屬內(nèi)切蛋白酶)。
“脂肪酶”包括水解脂質(zhì)、脂肪酸和?；视王?包括磷酸甘油酯)、脂蛋白、二酰基甘油等等的酶。在植物中，脂質(zhì)被用作結(jié)構(gòu)組分，來限制水損失和病原體感染。這些脂質(zhì)包括來自脂肪酸的蠟質(zhì)，以及角質(zhì)和木栓素(suberin)。
“木質(zhì)酶”包括能夠水解或分解木質(zhì)素聚合物結(jié)構(gòu)的酶。能夠分解木質(zhì)素的酶包括木質(zhì)素過氧化物酶、錳過氧化物酶、漆酶和阿魏酸酯酶，和在本領(lǐng)域中已知解聚或以其它方式分解木質(zhì)素聚合物的描述的其它酶。還包括在內(nèi)的是能夠水解在半纖維素糖(主要是阿拉伯糖)和木質(zhì)素之間形成的鍵的酶。木質(zhì)酶包括但不限于以下組的酶：木質(zhì)素過氧化物酶(EC 1.11.1.14)、錳過氧化物酶(EC 1.11.1.13)、漆酶(EC 1.10.3.2)和阿魏酸酯酶(EC 3.1.1.73)。
“己糖基轉(zhuǎn)移酶”(2.4.1-)包括能夠催化轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)，但是也能夠催化例如纖維素和/或纖維素降解產(chǎn)物的水解反應(yīng)的酶?？梢栽诒景l(fā)明中使用的己糖基轉(zhuǎn)移酶的例子是β-葡聚糖基轉(zhuǎn)移酶。這種酶可以能夠催化(1,3)(1,4)葡聚糖和/或纖維素和/或纖維素降解產(chǎn)物的降解。
“葡糖醛酸糖苷酶”包括催化葡糖醛酸苷(例如β-葡糖醛酸苷)水解得到醇的酶。許多葡糖醛酸糖苷酶已被表征，并可適合在本發(fā)明中使用，例如β-葡糖醛酸糖苷酶(EC 3.2.1.31)，透明質(zhì)酸酶葡糖醛酸糖苷酶(EC 3.2.1.36)，葡糖醛?；?二硫葡糖胺葡糖醛酸糖苷酶(3.2.1.56)，甘草酸β-葡糖醛酸糖苷酶(3.2.1.128)或α-D-葡糖醛酸糖苷酶(EC 3.2.1.139)。
本發(fā)明中使用的組合物可包含擴(kuò)展蛋白或擴(kuò)展蛋白樣蛋白質(zhì)，如膨脹因子(swollenin)(見Salheimo et al.,Eur.J.Biohem.269,4202-4211,2002)或膨脹因子樣蛋白質(zhì)。
擴(kuò)展蛋白參與植物細(xì)胞生長期間細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的松弛。已經(jīng)提出擴(kuò)展蛋白破壞纖維素和其它細(xì)胞壁多糖之間的氫鍵，但不具有水解活性。認(rèn)為它們通過這種方式允許纖維素纖維的滑動和細(xì)胞壁的擴(kuò)大。一種擴(kuò)展蛋白樣蛋白質(zhì)膨脹因子含有N端碳水化合物結(jié)合模塊家族1結(jié)構(gòu)域(CBD)和C端擴(kuò)展蛋白樣結(jié)構(gòu)域。為了本發(fā)明的目的，擴(kuò)展蛋白樣蛋白質(zhì)或膨脹因子樣蛋白質(zhì)可包含這種結(jié)構(gòu)域中的一種或兩種和/或可破壞細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)(如破壞纖維素結(jié)構(gòu))，任選地不生產(chǎn)可檢測量的還原糖。
本發(fā)明中使用的組合物可以包含纖維素誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)，例如cip1或cip2基因或類似基因的多肽產(chǎn)物(見Foreman等人,J.Biol.Chem.278(34),31988-31997,2003)，纖維素/纖維體(cellulosome)整合蛋白質(zhì)，例如cipA或cipC基因的多肽產(chǎn)物，或支架蛋白或支架蛋白樣蛋白質(zhì)。支架蛋白和纖維素整合蛋白是多功能整合亞基，其可將纖維素分解亞基組織成多酶復(fù)合體。這通過兩類互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域(即支架蛋白上的內(nèi)聚結(jié)構(gòu)域(cohesion domain)和每個酶單元上的錨定結(jié)構(gòu)域(dockerin domain))的相互作用完成。支架蛋白亞基還帶有介導(dǎo)纖維體與其底物結(jié)合的纖維素結(jié)合模塊(CBM)。為了本發(fā)明的目的，支架蛋白或纖維素整合蛋白可包含這種結(jié)構(gòu)域中的一種或兩種。
用于本發(fā)明中的組合物還可包含過氧化氫酶。術(shù)語“過氧化氫酶”表示過氧化氫：過氧化氫氧化還原酶(EC 1.11.1.6或EC 1.11.1.21)，其催化兩個過氧化氫至氧和兩個水的轉(zhuǎn)化。過氧化氫酶活性可通過基于下列反應(yīng)監(jiān)控在240nm的過氧化氫的降解而確定：2H2O2→2H2O+O2。該反應(yīng)是在25℃下pH為7.0的50mM磷酸鹽中以10.3mM底物(H2O2)和每ml大約為100單位的酶而進(jìn)行的。在16-24秒內(nèi)用分光光度法監(jiān)控吸光度，這應(yīng)對應(yīng)于0.45至0.4的吸光度減少。一個過氧化氫酶活性單位可被表達(dá)為在pH為7.0且25℃下每分鐘降解的一微摩爾的H2O2。
本發(fā)明方法中使用的組合物可由上文提到的每種酶種類的成員、一個酶種類的若干成員、或這些酶種類或輔助蛋白(即本文提到的本身不具有酶活性，但是幫助木質(zhì)纖維素降解的那些蛋白質(zhì))的任何組合構(gòu)成。
在本發(fā)明的方法中使用的組合物可以由來自以下來源的酶構(gòu)成：(1)供應(yīng)商；(2)經(jīng)克隆的表達(dá)酶的基因；(3)復(fù)合培養(yǎng)液(例如由培養(yǎng)基中微生物菌株的生長得到的，其中所述菌株向培養(yǎng)基中分泌蛋白質(zhì)和酶)；(4)如(3)中培養(yǎng)的菌株的細(xì)胞裂解物；和/或(5)表達(dá)酶的植物材料。本發(fā)明組合物中不同的酶可獲自不同的來源。
酶可以在微生物、酵母、真菌、細(xì)菌或植物中外源產(chǎn)生，然后分離并加入例如木質(zhì)纖維素原料中?；蛘撸缚梢员簧a(chǎn)但不分離，并可將粗制細(xì)胞群發(fā)酵液或植物材料(如玉米稈或麥秸)等等加入例如原料中?；蛘撸梢蕴幚泶种萍?xì)胞群或酶生產(chǎn)培養(yǎng)基或植物材料，以預(yù)防進(jìn)一步的微生物生長(例如通過加熱或添加抗微生物劑)，然后添加至例如原料。這些粗制酶混合物可包含生產(chǎn)酶的生物。或者，酶可以在下述發(fā)酵中生產(chǎn)，所述發(fā)酵使用(預(yù)處理的)原料(例如玉米稈或麥秸)對生產(chǎn)酶的生物提供營養(yǎng)。通過這種方式，生產(chǎn)酶的植物自身可以作為木質(zhì)纖維素原料，并且被添加進(jìn)木質(zhì)纖維素原料中。
在本文所述的用途和方法中，上述組合物的組分可以同時(即本身作為單一組合物)或分別或順次提供。
因此，本發(fā)明涉及其中使用上述組合物的方法，和所述組合物在工業(yè)方法中的用途。
在根據(jù)本發(fā)明的方法的一個實施方式中，所述酶組合物為真菌的完整發(fā)酵液的形式。在一個實施方式中，酶組合物可以是如下所述的完整發(fā)酵液。完整發(fā)酵液可通過非重組和/或重組絲狀真菌的發(fā)酵而制備的。在一個實施方式中，絲狀真菌是包含可以與絲狀真菌同源或異源的一個或多個基因的重組絲狀真菌。在一個實施方式中，絲狀真菌是包含可以與絲狀真菌同源或異源的一個或多個基因的重組絲狀真菌，其中一個或多個基因?qū)山到饫w維素底物的酶進(jìn)行編碼。完整發(fā)酵液可包含任意多肽或其任何組合。
優(yōu)選地，酶組合物為完整發(fā)酵液，其中細(xì)胞被殺死。完整發(fā)酵液可包含有機(jī)酸(用于殺死細(xì)胞)、被殺死的細(xì)胞和/或細(xì)胞碎片和培養(yǎng)基。
一般地，在適于產(chǎn)生能夠水解纖維素底物的酶的細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)絲狀真菌。培養(yǎng)是使用在本領(lǐng)域中已知的程序在包括碳和氮源以及無機(jī)鹽的合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行。合適的培養(yǎng)基、溫度范圍和適于生長和纖維素酶和/或半纖維素酶和/或果膠酶生產(chǎn)的其他條件在本領(lǐng)域中是已知的。完整發(fā)酵液可通過使絲狀真菌生長至穩(wěn)定期并在碳限制條件下將絲狀真菌保持足以表達(dá)一種或多種纖維素酶和/或半纖維素酶和/或果膠酶的時間段而制備的。一旦絲狀真菌將酶如纖維素酶和/或半纖維素酶和/或果膠酶分泌至發(fā)酵培養(yǎng)基中，則可使用完整發(fā)酵液。本發(fā)明的完整發(fā)酵液可包含絲狀真菌。在一些實施方式中，完整發(fā)酵液包含源自發(fā)酵結(jié)束時的發(fā)酵材料的未分級物質(zhì)。通常，完整發(fā)酵液包含已經(jīng)利用過的培養(yǎng)基和在絲狀真菌生長至飽和后存在的細(xì)胞碎片，其在碳限制性條件下進(jìn)行培養(yǎng)以允許蛋白質(zhì)合成(特別地，表達(dá)纖維素酶和/或半纖維素酶和/或果膠酶)。在一些實施方式中，完整發(fā)酵液包含已經(jīng)利用過的細(xì)胞培養(yǎng)基、細(xì)胞外酶和絲狀真菌。在一些實施方式中，存在于完整發(fā)酵液中的絲狀真菌可使用本領(lǐng)域中已知的方法進(jìn)行裂解、透化或殺滅以產(chǎn)生細(xì)胞經(jīng)殺滅的完整發(fā)酵液。在一個實施方式中，完整發(fā)酵液是細(xì)胞經(jīng)殺滅的完整發(fā)酵液，其中含有絲狀真菌的完整發(fā)酵液進(jìn)行了裂解或殺滅。在一些實施方式中，通過化學(xué)和/或pH處理裂解絲狀真菌而殺死細(xì)胞，從而生成絲狀真菌發(fā)酵的細(xì)胞經(jīng)殺滅的完整發(fā)酵液。在一些實施方式中，通過化學(xué)和/或pH處理并將細(xì)胞經(jīng)殺滅的發(fā)酵混合物的pH調(diào)整為合適的pH而殺死細(xì)胞。在一個實施方式中，完整發(fā)酵液包含第一有機(jī)酸成分，其包括至少一個1-5碳有機(jī)酸和/或其鹽，以及第二有機(jī)酸成分，其包括至少6個或更多碳的有機(jī)酸和/或其鹽。在一個實施方式中，第一有機(jī)酸成分為醋酸、甲酸、丙酸、其鹽或其任意組合，第二有機(jī)酸成分為苯甲酸、環(huán)己烷羧酸、4-甲基戊酸、苯乙酸、其鹽或其任意組合。
如本文使用的術(shù)語“完整發(fā)酵液”指通過未進(jìn)行或進(jìn)行了最少回收和/或純化的細(xì)胞發(fā)酵而產(chǎn)生的制備物。例如，完整發(fā)酵液是當(dāng)微生物培養(yǎng)物生長至飽和時并在碳限制性條件下培養(yǎng)以允許蛋白質(zhì)合成(例如，通過宿主細(xì)胞表達(dá)酶)以及分泌至細(xì)胞培養(yǎng)基中而產(chǎn)生的。通常，完整發(fā)酵液是未分級的且包括已經(jīng)使用過的細(xì)胞培養(yǎng)基、細(xì)胞外酶和微生物，優(yōu)選為非存活的細(xì)胞。
如果需要的話，完整發(fā)酵液可以是分級的且可使用經(jīng)分級物質(zhì)中的一個或多個。例如，可從完整發(fā)酵液去除殺死的細(xì)胞和/或細(xì)胞碎片以提供不含這些成分的組合物。
完整發(fā)酵液可進(jìn)一步地包括防腐劑和/或抗微生物劑。這種防腐劑和/或試劑是本領(lǐng)域中是已知的。
通常，如本文所述的完整發(fā)酵液為液體，但也可含有不溶性成分，如殺死的細(xì)胞、細(xì)胞碎片、培養(yǎng)基成分和/或不溶性酶。在一些實施方式中，可去除不溶性成分以提供澄清的完整發(fā)酵液。
在一個實施方式中，完整發(fā)酵液可補(bǔ)充有一個或多個未內(nèi)源性表達(dá)的或通過絲狀真菌在相對低水平進(jìn)行表達(dá)的酶活性以提高纖維素底物降解例如為可發(fā)酵的糖，如葡萄糖或木糖。補(bǔ)充酶可作為完整發(fā)酵液的添加劑而進(jìn)行添加且酶可以是單獨的完整發(fā)酵液的成分或可進(jìn)行純化或最低程度地進(jìn)行回收和/或純化。
在一個實施方式中，完整發(fā)酵液包括過表達(dá)一種或多種酶以提高纖維素底物的降解的重組絲狀真菌的發(fā)酵的完整發(fā)酵液。替代地，完整發(fā)酵液可包括非重組絲狀真菌和過表達(dá)一種或多種酶以提高纖維素底物的降解的重組絲狀真菌的發(fā)酵的完整發(fā)酵液的混合物。在一個實施方式中，完整發(fā)酵液包括過表達(dá)β-葡糖苷酶的絲狀真菌的發(fā)酵的完整發(fā)酵液。替代地，用于本方法和反應(yīng)性組合物中的完整發(fā)酵液可包括非重組絲狀真菌的發(fā)酵的完整發(fā)酵液和過表達(dá)β-葡糖苷酶的重組絲狀真菌的發(fā)酵的完整發(fā)酵液的混合物。
在一個實施方式中，用于從木質(zhì)纖維素材料制備糖產(chǎn)物的方法包括以下步驟：(a)任選地，預(yù)處理所述木質(zhì)纖維素材料；(b)任選地，清洗所述任選地經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料；(c)通過在允許表達(dá)所述酶組合物的條件下培養(yǎng)真菌而產(chǎn)生酶組合物，所述酶組合物包含至少兩種纖維素酶并且其中所述酶組合物至少包含LPMO；(d)使用所述酶組合物酶促水解所述任選地經(jīng)清洗的和/或任選地經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料；以及(e)任選地，回收含葡萄糖的組合物，其中氧以對應(yīng)于20與5000mmol之間的分子氧/kg存在于所述木質(zhì)纖維素材料中的葡聚糖的量被消耗，所述氧在所述木質(zhì)纖維素材料的預(yù)處理之后且在酶促水解之前和/或期間添加，優(yōu)選地以對應(yīng)于至少30mmol分子氧/kg存在于所述木質(zhì)纖維素材料中的葡聚糖的量，更優(yōu)選地以對應(yīng)于至少40mmol分子氧/kg存在于所述木質(zhì)纖維素材料中的葡聚糖的量，并且最優(yōu)選地以對應(yīng)于至少50mmol分子氧/kg存在于所述木質(zhì)纖維素材料中的葡聚糖的量被消耗。
在一個實施方式中，用于從木質(zhì)纖維素材料制備發(fā)酵產(chǎn)物的方法包括以下步驟：(a)任選地，預(yù)處理所述木質(zhì)纖維素材料；(b)任選地，清洗所述任選地經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料；(c)通過在允許表達(dá)所述酶組合物的條件下培養(yǎng)真菌而產(chǎn)生酶組合物，所述酶組合物包含至少兩種纖維素酶并且其中所述酶組合物至少包含LPMO；(d)使用所述酶組合物酶促水解所述任選地經(jīng)清洗的和/或任選地經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料；(e)發(fā)酵所述經(jīng)水解的木質(zhì)纖維素材料以產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物；以及(f)任選地，回收發(fā)酵產(chǎn)物，其中氧以對應(yīng)于20與5000mmol之間的分子氧/kg存在于所述木質(zhì)纖維素材料中的葡聚糖的量被消耗，所述氧在所述木質(zhì)纖維素材料的預(yù)處理之后且在酶促水解之前和/或期間添加，優(yōu)選地以對應(yīng)于至少30mmol分子氧/kg存在于所述木質(zhì)纖維素材料中的葡聚糖的量，更優(yōu)選地以對應(yīng)于至少40mmol分子氧/kg存在于所述木質(zhì)纖維素材料中的葡聚糖的量，并且最優(yōu)選地以對應(yīng)于至少50mmol分子氧/kg存在于所述木質(zhì)纖維素材料中的葡聚糖的量被消耗。
如上文所指出的，在根據(jù)本發(fā)明的方法的一個實施方式中，氧以對應(yīng)于20與5000mmol之間的分子氧/kg存在于所述木質(zhì)纖維素材料中的葡聚糖的量被消耗。優(yōu)選地，氧以對應(yīng)于22與4500mmol之間的分子氧/kg存在于所述木質(zhì)纖維素材料中的葡聚糖、24與4000mmol之間的分子氧/kg存在于所述木質(zhì)纖維素材料中的葡聚糖、26與3500mmol之間的分子氧/kg存在于所述木質(zhì)纖維素材料中的葡聚糖、28與3400mmol之間的分子氧/kg存在于所述木質(zhì)纖維素材料中的葡聚糖的量被消耗。添加到體系中的所有氧將被轉(zhuǎn)移到液體中并且用于水解。可以通過測量并控制帶入體系中的空氣的量來控制這個量。
如上文所指出的，在根據(jù)本發(fā)明的方法的一個實施方式中，氧以對應(yīng)于0.17與41.7mmol之間的分子氧/kg存在于所述木質(zhì)纖維素材料中的葡聚糖/小時的量被消耗。優(yōu)選地，氧以對應(yīng)于0.18與37.5mmol之間的分子氧/kg存在于所述木質(zhì)纖維素材料中的葡聚糖/小時、0.20與33.3mmol之間的分子氧/kg存在于所述木質(zhì)纖維素材料中的葡聚糖/小時、0.22與29.2mmol之間的分子氧/kg存在于所述木質(zhì)纖維素材料中的葡聚糖/小時、0.23與28.3mmol之間的分子氧/kg存在于所述木質(zhì)纖維素材料中的葡聚糖/小時的量被消耗。更優(yōu)選地，氧以對應(yīng)于0.36與27.8mmol之間的分子氧/kg存在于所述木質(zhì)纖維素材料中的葡聚糖/小時的量被消耗。添加到體系中的所有氧將被轉(zhuǎn)移到液體中并且用于水解?？梢酝ㄟ^測量并控制帶入體系中的空氣的量來控制這個量。如本文使用的“/小時”意指水解的每小時。
如上文所指出的，在一個優(yōu)選實施方式中，真菌是絲狀真菌，優(yōu)選地所述真菌屬于Rasamsonia或Aspergillus屬。在一個實施方式中，真菌的培養(yǎng)是在需氧條件下進(jìn)行的。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知用于需氧培養(yǎng)的發(fā)酵罐設(shè)計，例如像攪拌罐和泡罩塔。通常，在適合于產(chǎn)生感興趣的酶組合物的細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)真菌。培養(yǎng)使用本領(lǐng)域中已知的過程在適合的營養(yǎng)培養(yǎng)基中發(fā)生，所述培養(yǎng)基包含碳源和氮源及無機(jī)鹽。適合的培養(yǎng)基、溫度范圍以及適合于生長和酶產(chǎn)生的其他條件在本領(lǐng)域是已知的。在本文描述了其實例?？梢酝ㄟ^使真菌生長到靜止期并且將真菌在限碳條件下維持足以表達(dá)所述酶的時間段來制備酶組合物。一旦真菌將感興趣的酶分泌到發(fā)酵培養(yǎng)基中，便可以使用所述酶組合物?？梢栽谕ㄟ^如本文描述的在允許表達(dá)所述酶組合物的條件下培養(yǎng)真菌來產(chǎn)生酶組合物的方法步驟前進(jìn)行繁殖真菌的過程，所述酶組合物包含至少兩種纖維素酶并且其中所述酶組合物至少包含LPMO。繁殖可以包括搖瓶、小容器和大容器中的若干步驟。
木質(zhì)纖維素材料
本文中的木質(zhì)纖維素材料包括任何木質(zhì)纖維素材料和/或半纖維素材料。適于用作本發(fā)明原料的木質(zhì)纖維素材料包括生物質(zhì)，例如原始生物質(zhì)(virgin biomass)和/或非原始生物質(zhì)如農(nóng)業(yè)生物質(zhì)，商業(yè)有機(jī)物，建筑和拆除碎片，市政固體廢棄物，廢紙和庭院廢棄物。常見的生物質(zhì)形式包括樹木，灌木叢(shrubs)和草，小麥，麥秸，甘蔗、甘蔗桿(cane straw)、甘蔗渣，甘蔗廢料，柳枝稷，芒草(miscanthus)，能源甘蔗(energy cane)，玉米，玉米稈(corn stover)，玉米殼，玉米芯(corn cobs)，蕓苔莖，大豆莖，高粱，玉米粒(包括來自玉米粒的纖維)，來自谷物如玉米、小麥和大麥研磨(包括濕磨和干磨)的通常稱作“麩或纖維”的產(chǎn)物和副產(chǎn)物，以及市政固體廢棄物，廢紙和庭院廢棄物。生物質(zhì)也可以是但不限于草本材料，農(nóng)業(yè)殘余物，林業(yè)殘余物，市政固體廢棄物，廢紙，和漿和造紙廠殘余物?！稗r(nóng)業(yè)生物質(zhì)”包括樹枝，灌木(bushes)，藤蔓(canes)，玉米和玉米殼，能量作物，森林，水果，花，谷物，草，草本作物，樹葉，樹皮，針葉，原木，根，樹苗，短期輪種木本作物(short-rotation woody crops)，灌木叢，柳枝稷，樹木，蔬菜，水果皮，蔓藤(vines)，甜菜漿，小麥麩皮(wheatmidlings)，燕麥殼，和硬木材和軟木材(不包括帶有有害材料的木材)。另外，農(nóng)業(yè)生物質(zhì)包括由農(nóng)業(yè)加工產(chǎn)生的有機(jī)廢棄物材料，所述農(nóng)業(yè)加工包括農(nóng)業(yè)和林業(yè)活動，尤其包括林業(yè)木材廢棄物。農(nóng)業(yè)生物質(zhì)可以是前述任一或其任何組合或混合物。
纖維素是具有式(C6H10O5)n的有機(jī)化合物，一種由幾百到一萬多個β(1→4)連接的D-葡萄糖單元的直鏈組成的多糖。葡聚糖分子是通過糖苷鍵連接的D-葡萄糖單體的多糖。在本文，對于通過糖苷鍵連接的D-葡萄糖單體的多糖而言，葡聚糖和纖維素可互換地使用。用于定量分析葡聚糖或多糖組成的方法在本領(lǐng)域是公知的且進(jìn)行了描述的，并且例如概述于Carvalho de Souza等人，Carbohydrate Polymers 95(2013)657-663中。通常，葡聚糖的50％到70％是結(jié)晶纖維素，剩余部分是無定形纖維素。
預(yù)處理
用于本發(fā)明中的木質(zhì)纖維素材料可進(jìn)行洗滌和/或預(yù)處理。任選地，原料可通過本領(lǐng)域中已知的任何方式用熱、機(jī)械和/或化學(xué)改性或這些方法的任何組合預(yù)處理，以便增強(qiáng)底物對酶促水解的可接近性和/或水解半纖維素和/或使半纖維素和/或纖維素和/或木質(zhì)素溶解。在一種實施方式中，通過用蒸汽噴發(fā)、熱水處理或用稀酸或稀堿處理木質(zhì)纖維素進(jìn)行預(yù)處理。
在一個實施方式中，在酶促水解之前和/或期間對木質(zhì)纖維素材料進(jìn)行預(yù)處理。預(yù)處理方法是本領(lǐng)域中已知的，其包括但不限于熱、機(jī)械、化學(xué)修飾、生物修飾及其任意組合。通常，進(jìn)行預(yù)處理以提高木質(zhì)纖維素材料中木質(zhì)纖維素材料對酶促水解的可接近性和/或水解半纖維素和/或使半纖維素和/或纖維素和/或木質(zhì)素溶解。在一個實施方式中，預(yù)處理包括用蒸汽爆破、熱水處理或稀酸或稀堿處理來處理木質(zhì)纖維素。預(yù)處理方法的示例包括但不限于，蒸汽處理(例如，在100-260℃、7-45巴的壓力和中性pH下處理1-10分鐘)、稀酸處理(例如，在存在或不存在蒸汽的情況下在120-200℃、2-15巴的壓力和酸性pH下用0.1-5％的H2SO4和/或SO2和/或HNO3和/或HCl處理2-30分鐘)、有機(jī)溶劑處理(例如，在存在有機(jī)溶劑和蒸汽的情況下在160-200℃、7-30巴的壓力和酸性pH下用1-1.5％的H2SO4處理30-60分鐘)、石灰處理(例如，在存在水/蒸汽的情況下在60-160℃、1-10巴的壓力和堿性pH下用0.1-2％的NaOH/Ca(OH)2處理60-4800分鐘)、ARP處理(例如，在150-180℃、9-17巴的壓力和堿性pH下用5-15％的NH3處理10-90分鐘)、AFEX處理(例如，在60-140℃、8-20巴的壓力和堿性pH下用>15％的NH3處理5-30分鐘)。
洗滌步驟
任選地，根據(jù)本發(fā)明的方法包括洗滌步驟。任選的洗滌步驟可被用于去除可充當(dāng)發(fā)酵步驟的抑制劑的水溶性化合物?？砂匆阎姆绞竭M(jìn)行洗滌步驟。
木質(zhì)纖維素材料可進(jìn)行洗滌。在一個實施方式中，可在預(yù)處理后洗滌木質(zhì)纖維素材料。洗滌步驟可被用于去除可充當(dāng)發(fā)酵和/或水解步驟的抑制劑的水溶性化合物?？砂醇夹g(shù)人員已知的方式進(jìn)行洗滌步驟。除洗滌之外，存在有其他解毒方法。預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料也可通過包括但不限于固/液分離、真空蒸發(fā)、提取、吸附、中和、加灰過量、添加還原劑、添加解毒酶如漆酶或過氧化物酶、添加能夠?qū)λ馕镞M(jìn)行解毒的微生物的這些方法中的任一個(或任何組合)而進(jìn)行解毒。
酶促水解
本發(fā)明所述方法中使用的酶組合物可極其有效水解木質(zhì)纖維素材料，例如玉米稈、麥秸、甘蔗桿和/或甘蔗渣，然后其可被進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為有用產(chǎn)物，例如乙醇、生物氣、丁醇、乳酸、塑料、有機(jī)酸、溶劑、動物飼料補(bǔ)充劑、藥物、維生素、氨基酸、酶或化學(xué)原料。此外，來自水解之后過程的中間產(chǎn)物(例如作為生物氣生產(chǎn)中的中間體的乳酸)可被用作其它材料的結(jié)構(gòu)單元。本發(fā)明利用乙醇生產(chǎn)進(jìn)行示例，但這僅作為例證而非限制，其它被提及的有用產(chǎn)物可被同樣地良好生產(chǎn)。
根據(jù)本發(fā)明的方法包括酶促水解步驟。酶促水解包括但不限于液化原料的目的的水解和從原料釋放糖的目的的水解或兩者。在該步驟中，使任選地預(yù)處理的和任選地清洗的木質(zhì)纖維素材料與根據(jù)本發(fā)明的酶組合物接觸。根據(jù)木質(zhì)纖維素材料和預(yù)處理，技術(shù)人員可調(diào)節(jié)不同的反應(yīng)條件例如溫度、酶劑量、水解反應(yīng)時間和干物質(zhì)濃度，以實現(xiàn)木質(zhì)纖維素向糖的期望轉(zhuǎn)化。一些指標(biāo)在下文給出。
在本發(fā)明的一個方面中，水解在45℃或更高，50℃或更高，55℃或更高，60℃或更高，65℃或更高，或70℃或更高的溫度下進(jìn)行。水解期間的高溫具有許多優(yōu)勢，所述優(yōu)勢包括在酶組合物的最適溫度下起作用、(細(xì)菌)污染風(fēng)險降低、降低的粘性、需要更少量的冷卻水、使用具有更高溫度的冷卻水、酶的再利用和更多的優(yōu)勢。
將用于酶促水解的一個或多個容器中的木質(zhì)纖維素材料的粘度保持在10與4000cP之間、10與2000cP之間，優(yōu)選10與1000cP之間。
在所述方法包括包含液化步驟和糖化步驟的酶促水解的情況下，將液化步驟中的木質(zhì)纖維素材料粘度保持在10與4000cP之間、10與2000cP之間，優(yōu)選10與1000cP之間，和/或?qū)⑻腔襟E中的木質(zhì)纖維素材料的粘度保持在10與1000cP之間、10與900cP之間，優(yōu)選10與800cP之間。
可以用Brookfield DV III流變儀在用于水解的溫度下確定粘度。
在本發(fā)明的另一個方面中，添加的酶組合物的量(本文中也稱為酶劑量或酶負(fù)載量)低。在一種實施方式中，酶的量是6mg蛋白/g干物質(zhì)重量或更低，5mg蛋白/g干物質(zhì)或更低，4mg蛋白/g干物質(zhì)或更低，3mg蛋白/g干物質(zhì)或更低，2mg蛋白/g干物質(zhì)或更低或1mg蛋白/g干物質(zhì)或更低(表示為mg蛋白/g干物質(zhì)形式的蛋白)。在一種實施方式中，酶的量是0.5mg酶/g干物質(zhì)重量或更低，0.4mg酶組合物/g干物質(zhì)重量或更低，0.3mg酶/g干物質(zhì)重量或更低，0.25mg酶/g干物質(zhì)重量或更低，0.20mg酶/g干物質(zhì)重量或更低，0.18mg酶/g干物質(zhì)重量或更低，0.15mg酶/g干物質(zhì)重量或更低或0.10mg酶/g干物質(zhì)重量或更低(表示為mg酶/g干物質(zhì)形式的總纖維素酶)。低酶劑量是可行的，由于酶的活性和穩(wěn)定性，可以增加水解反應(yīng)時間。
在本發(fā)明的另一個方面中，水解反應(yīng)時間是5小時或更長，10小時或更長，20小時或更長，40小時或更長，50小時或更長，60小時或更長，70小時或更長，80小時或更長，90小時或更長，100小時或更長，120小時或更長，130小時或更長。在另一方面中，水解反應(yīng)時間是5-150小時，40-130小時，50-120小時，60-120小時，60-110小時，60-100小時，70-100小時，70-90小時或70-80小時。由于酶組合物的穩(wěn)定性，更長水解反應(yīng)時間是可以的，這對應(yīng)更高的糖產(chǎn)率。
水解期間的pH可由技術(shù)人員選擇。在本發(fā)明的另一個方面中，水解期間的pH可以是3.0-6.4。本發(fā)明的穩(wěn)定酶可具有高至2個pH單位，高至3個pH單位，高至5個pH單位的寬pH范圍。最適pH可位于pH 2.0至8.0，3.0-8.0，3.5-7.0，3.5-6.0，3.5-5.0，3.5-4.5，4.0-4.5的界限內(nèi)或約4.2。
在本發(fā)明的另一個方面中，進(jìn)行水解步驟直到木質(zhì)纖維素材料中的70％或更多，80％或更多，85％或更多，90％或更多，92％或更多，95％或更多的可利用糖被釋放出。
顯著地，本發(fā)明的方法可在水解反應(yīng)中使用高水平的(木質(zhì)纖維素材料的)干物質(zhì)進(jìn)行。因而，本發(fā)明可用約5重量％或更高，約8重量％或更高，約10重量％或更高，約11重量％或更高，約12重量％或更高，約13重量％或更高，約14重量％或更高，約15重量％或更高，約20重量％或更高，約25重量％或更高，約30重量％或更高，約35重量％或更高或約40重量％或更高的干物質(zhì)含量進(jìn)行。在另一實施方式中，水解步驟中的干物質(zhì)含量是14重量％，15重量％，16重量％，17重量％，18重量％，19重量％，20重量％，21重量％，22重量％，23重量％，24重量％，25重量％，26重量％，27重量％，28重量％，29重量％，30重量％，31重量％，32重量％，33重量％或更多或14-33重量％。
在另一個實施方式中，在水解結(jié)束時的干物質(zhì)含量為5wt％或更高、6wt％或更高、7wt％或更高、8wt％或更高、9wt％或更高、10wt％或更高、11wt％或更高、12wt％或更高、13wt％或更高、14wt％或更高、15wt％或更高、16wt％或更高、17wt％或更高、18wt％或更高、19wt％或更高、20wt％或更高、21wt％或更高、22wt％或更高、23wt％或更高、24wt％或更高、25wt％或更高、26wt％或更高、27wt％或更高、28wt％或更高、29wt％或更高、30wt％或更高、31wt％或更高、32wt％或更高、33wt％或更高、34wt％或更高、35wt％或更高、36wt％或更高、37wt％或更高、38wt％或更高或39wt％或更高。在另一個實施方式中，在酶促水解結(jié)束時的干物質(zhì)含量為5wt％至40wt％、6wt％至40wt％、7wt％至40wt％、8wt％至40wt％、9wt％至40wt％、10wt％至40wt％、11wt％至40wt％、12wt％至40wt％、13wt％至40wt％、14wt％至40wt％、15wt％至40wt％、16wt％至40wt％、17wt％至40wt％、18wt％至40wt％、19wt％至40wt％、20wt％至40wt％、21wt％至40wt％、22wt％至40wt％、23wt％至40wt％、24wt％至40wt％、25wt％至40wt％、26wt％至40wt％、27wt％至40wt％、28wt％至40wt％、29wt％至40wt％、30wt％至40wt％、31wt％至40wt％、32wt％至40wt％、33wt％至40wt％、34wt％至40wt％、35wt％至40wt％、36wt％至40wt％、37wt％至40wt％、38wt％至40wt％和39wt％至40wt％。
發(fā)酵
根據(jù)本發(fā)明的方法可以包括發(fā)酵步驟?？梢栽谝粋€反應(yīng)器中與水解同時進(jìn)行發(fā)酵(SSF)。優(yōu)選地，在水解之后進(jìn)行發(fā)酵，可以選擇對于水解和發(fā)酵二者的最佳條件，所述最佳條件對于水解和發(fā)酵可能是不同的。在另一個方面中，本發(fā)明因而包括分步驟發(fā)酵方法，其中微生物被用于發(fā)酵包含糖(例如葡萄糖、L-阿拉伯糖和/或木糖)的碳源。碳源可包括包含L-阿拉伯糖、木糖或葡萄糖單元的任何碳水化合物寡聚體或多聚體，例如木質(zhì)纖維素、木聚糖、纖維素、淀粉、阿拉伯聚糖等等。為了從這種碳水化合物釋放木糖或葡萄糖單元，可將適宜的碳水化合物酶(例如木聚糖酶、葡聚糖酶、淀粉酶等等)添加至發(fā)酵培養(yǎng)基或其可通過經(jīng)修飾的宿主細(xì)胞對其進(jìn)行生產(chǎn)。在后者的情況下，經(jīng)修飾宿主細(xì)胞可被遺傳工程改造，以生產(chǎn)并分泌這種碳水化合物酶。使用葡萄糖的寡聚體或多聚體來源的另外優(yōu)勢是，其能在發(fā)酵期間保持低的(較低的)游離葡萄糖濃度，例如通過使用限制速率的碳水化合物酶的量。這繼而會防止對非葡萄糖的糖(例如木糖)代謝和運(yùn)送所需體系的抑制。在一個優(yōu)選的方法中，經(jīng)修飾宿主細(xì)胞發(fā)酵L-阿拉伯糖(任選地木糖)和葡萄糖二者，優(yōu)選地同時發(fā)酵，這種情況下優(yōu)選地使用經(jīng)改造的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞對葡萄糖抑制不敏感，以防止二次生長(diauxic growth)。除了L-阿拉伯糖來源，任選地木糖(和葡萄糖)作為碳源之外，發(fā)酵培養(yǎng)基將進(jìn)一步包含經(jīng)修飾宿主細(xì)胞生長所需的適宜成分。用于微生物(例如酵母或絲狀真菌)生長的發(fā)酵培養(yǎng)基的組成在本領(lǐng)域眾所周知。
在相同條件下的發(fā)酵時間可比在常規(guī)發(fā)酵中更短，其中部分酶促水解在發(fā)酵期間仍必須參與。在一個實施方式中，就50g/l葡萄糖和來自木質(zhì)纖維素原料的相應(yīng)其它糖(例如50g/l木糖，35g/l的L-阿拉伯糖和10g/l的半乳糖)的糖組合而言，發(fā)酵時間是100小時或更短，90小時或更短，80小或更短，70小時或更短，或60小時或更短。對于更稀的糖組合物，可相應(yīng)減少發(fā)酵時間。
發(fā)酵方法可以是需氧或厭氧發(fā)酵方法。厭氧發(fā)酵方法在本文中被定義為下述發(fā)酵方法，所述發(fā)酵方法在沒有氧或基本上沒有氧被消耗的情況下進(jìn)行，優(yōu)選地少于5、2.5或1mmol/L/h、更優(yōu)選地0mmol/L/h(即氧消耗未被檢測出)的氧被消耗的情況下進(jìn)行，并且其中有機(jī)分子既作為電子供體又作為電子受體。沒有氧時，在糖酵解和生物質(zhì)形成中產(chǎn)生的NADH不可被氧化磷酸化所氧化。為解決該問題，許多微生物使用丙酮酸鹽或其衍生物之一作為電子和氫受體，因此再產(chǎn)生NAD+。因而，在一個優(yōu)選的厭氧發(fā)酵方法中，丙酮酸鹽被用作電子(和氫受體)并被還原為發(fā)酵產(chǎn)物，例如乙醇、乳酸、3-羥基丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、檸檬酸、蘋果酸、延胡索酸、氨基酸、1,3-丙烷-二醇、乙烯、甘油、丁醇、β-內(nèi)酰胺抗生素和頭孢菌素。在一個優(yōu)選的實施方式中，發(fā)酵方法是厭氧的。厭氧方法是有利的，因為其比需氧方法更便宜：需要較少專門的設(shè)備。而且，預(yù)計厭氧方法給出比需氧方法更高的產(chǎn)品產(chǎn)出。在需氧條件下，通常生物質(zhì)產(chǎn)率比在厭氧條件下更高。結(jié)果，通常在需氧條件下，期望的產(chǎn)物產(chǎn)率比在厭氧條件下低。
在另一實施方式中，發(fā)酵方法在限氧條件下。更優(yōu)選地，發(fā)酵方法是需氧的并在限氧條件下。限氧發(fā)酵方法是這樣的方法，其中氧消耗被氧從氣體至液體的轉(zhuǎn)化所限制。氧限制的程度由進(jìn)入氣流的量和組成以及使用的發(fā)酵設(shè)備的實際的混合/質(zhì)量轉(zhuǎn)移特性確定。優(yōu)選地，在限氧條件下的方法中，氧消耗速率為至少5.5，更優(yōu)選地至少6和甚至更優(yōu)選地至少7mmol/L/h。
發(fā)酵方法優(yōu)選地在對經(jīng)修飾細(xì)胞而言最佳的溫度下運(yùn)行。因而，對于大多數(shù)酵母或真菌細(xì)胞而言，發(fā)酵方法在低于42℃，優(yōu)選地低于38℃下的溫度下進(jìn)行。對于酵母或絲狀真菌宿主細(xì)胞而言，發(fā)酵方法優(yōu)選地在低于35、33、30或28℃的溫度下并在高于20、22或25℃的溫度下進(jìn)行。
在本發(fā)明的一個實施方式中，在步驟中，用能夠發(fā)酵至少一種C5糖的微生物進(jìn)行發(fā)酵。在一個實施方式中，所述方法是用于乙醇生產(chǎn)的方法，其中，所述方法包括下述步驟，所述步驟包括用能發(fā)酵至少一種C5糖的微生物發(fā)酵含糖培養(yǎng)基，其中宿主細(xì)胞能將葡萄糖、L-阿拉伯糖和木糖發(fā)酵為乙醇。微生物可以是原核或真核生物。用于所述方法中的微生物可以是經(jīng)遺傳修飾的微生物。合適生物的實例為酵母，例如Saccharomyces例如Saccharomyces cerevisiae,Saccharomyces pastorianus或Saccharomyces uvarum,Hansenula,Issatchenkia,例如Issatchenkia orientalis,Pichia,例如Pichia stipites或Pichia pastoris,Kluyveromyces,例如Kluyveromyces fagilis,Candida,例如Candida pseudotropicalis或Candida acidothermophilum,Pachysolen,例如Pachysolen tannophilus或細(xì)菌,例如Lactobacillus,例如Lactobacillus lactis,Geobacillus,Zymomonas,例如Zymomonas mobilis,Clostridium,例如Clostridium phytofermentans,Escherichia,例如E.coli,Klebsiella,例如Klebsiella oxytoca。在一個其實施方式中，能發(fā)酵至少一種C5糖的微生物是酵母。在一個實施方式中，酵母屬于Saccharomyces屬，優(yōu)選地是Saccharomyces cerevisiae種，其中已進(jìn)行遺傳修飾。這種微生物及其制備的一個例子被更詳細(xì)地描述在WO 2008/041840和于2010年4月21日提交的歐洲專利申請EP10160622.6中。在一個實施方式中，用于生產(chǎn)乙醇的發(fā)酵方法是厭氧的。厭氧已在本文上文定義過。在另一優(yōu)選的實施方式中，用于生產(chǎn)乙醇的發(fā)酵方法是需氧的。在另一優(yōu)選的實施方式中，用于生產(chǎn)乙醇的發(fā)酵方法在限氧條件下，更優(yōu)選地所述方法是需氧的并在限氧條件下。限氧條件已在本文上文定義過。
在這種方法中，乙醇體積生產(chǎn)率優(yōu)選地為至少0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、5.0或10.0g乙醇/升/小時。方法中基于L-阿拉伯糖和任選的木糖和/或葡萄糖的乙醇產(chǎn)率優(yōu)選地為至少20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、95或98％。乙醇產(chǎn)率在本文中被定義為理論最大產(chǎn)率的百分比，對于葡萄糖、L-阿拉伯糖和任選的木糖，理論最大產(chǎn)率為0.51g乙醇/g葡萄糖或木糖。
在一個方面中，與已知乙醇發(fā)酵方法相比，導(dǎo)致乙醇生產(chǎn)的發(fā)酵方法具有若干優(yōu)勢：
-厭氧方法是可行的；
-限氧條件也是可行的；
-可獲得較高的乙醇產(chǎn)率和乙醇生產(chǎn)速率；
-使用的菌株可以能夠使用L-阿拉伯糖和任選地木糖。
替代上述發(fā)酵方法，可使用至少兩種有區(qū)別的細(xì)胞，這表示該方法是共發(fā)酵方法。如上所述的發(fā)酵方法的所有優(yōu)選實施方式也是該共發(fā)酵方法的優(yōu)選實施方式：發(fā)酵產(chǎn)物類別、L-阿拉伯糖來源和木糖來源類別、發(fā)酵條件(需氧或厭氧條件、限氧條件、方法進(jìn)行的溫度、乙醇生產(chǎn)力、乙醇產(chǎn)率)。
可進(jìn)行發(fā)酵方法而完全無需在發(fā)酵期間調(diào)節(jié)pH。也就是說，所述方法是不用添加任何酸或堿即可進(jìn)行的方法。然而，這排除了可添加酸的預(yù)處理步驟。要點是本發(fā)明的組合物能在低pH下起作用，因而不需要為了糖化或水解可發(fā)生而調(diào)整酸預(yù)處理原料的酸的pH。因此，本發(fā)明的方法可以是僅使用有機(jī)產(chǎn)物不需要無機(jī)化學(xué)輸入的零廢物方法。
總反應(yīng)時間
根據(jù)本發(fā)明，可減少總反應(yīng)時間(或水解步驟和發(fā)酵步驟合起來的反應(yīng)時間)。在一個實施方式中，90％葡萄糖產(chǎn)率下的總反應(yīng)時間為300小時或更少，200小時或更少，150小時或更少，140小時或更少，130小時或更少，120小時或更少，110小時或更少，100小時或更少，90小時或更少，80小時或更少，75小時或更少，或約72小時。相應(yīng)地，在較低的葡萄糖產(chǎn)率下可達(dá)到較少總時間。
發(fā)酵產(chǎn)物
可根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的發(fā)酵產(chǎn)物包括氨基酸、維生素、藥物、動物飼料補(bǔ)充物、特種化學(xué)品、化學(xué)原料、塑料、溶劑、燃料或其它有機(jī)聚合物、乳酸和乙醇包括燃料乙醇(術(shù)語“乙醇”被理解為包括乙基醇(ethyl alcohol)或乙基醇和水的混合物)。
可通過本發(fā)明的方法生產(chǎn)的具體的價值增加產(chǎn)物包括但不限于，生物燃料(包括生物氣、乙醇和丁醇)；乳酸；3-羥基-丙酸；丙烯酸；乙酸；1,3-丙烷-二醇；乙烯；甘油；塑料；特種化學(xué)品；有機(jī)酸，包括檸檬酸、琥珀酸和馬來酸；溶劑；動物飼料補(bǔ)充物；藥物例如β-內(nèi)酰胺抗生素或頭孢菌素；維生素；氨基酸，例如賴氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、蘇氨酸和天冬氨酸；酶例如蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶、葡聚糖酶、乳糖酶、脂肪酶、裂解酶、氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶或木聚糖酶；化學(xué)原料；或動物飼料補(bǔ)充物。
可通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生的發(fā)酵產(chǎn)物可以是源自發(fā)酵的任何物質(zhì)。其包括但不限于醇(如阿拉伯糖醇、丁醇、乙醇、甘油、甲醇、1,3-丙二醇、山梨糖醇和木糖醇)；有機(jī)酸(如乙酸、丙酮酸、己二酸、抗壞血酸、丙烯酸、檸檬酸、2,5-二酮-D-葡糖酸、甲酸、富馬酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羥基丙酸、衣康酸、乳酸、馬來酸、蘋果酸、丙二酸、草酸、草酰乙酸、丙酸、琥珀酸和木糖酸)；酮(如丙酮)；氨基酸(如天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、賴氨酸、絲氨酸、色氨酸和蘇氨酸)；烷烴(如戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷和十二烷)、環(huán)烷烴(如環(huán)戊烷、環(huán)己烷、環(huán)庚烷和環(huán)辛烷)、烯烴(如戊烯、己烯、庚烯和辛烯)；和氣體(如甲烷、氫氣(H2)、二氧化碳(CO2)和一氧化碳(CO))。發(fā)酵產(chǎn)物還可以是蛋白質(zhì)、維生素、藥物、動物飼料補(bǔ)充劑、特殊化學(xué)品、化學(xué)原料、塑料、溶劑、乙烯、酶如蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶、葡聚糖酶、乳糖酶、脂肪酶、裂解酶、氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶或木聚糖酶。
發(fā)酵產(chǎn)物的分離
根據(jù)本發(fā)明的方法任選地包括回收發(fā)酵產(chǎn)物?？梢砸匀魏我阎姆绞綇陌l(fā)酵液中分離發(fā)酵產(chǎn)物。對于每種發(fā)酵產(chǎn)物，技術(shù)人員能選擇合適的分離技術(shù)。例如，可以以常規(guī)方式通過蒸餾(例如蒸汽蒸餾/真空蒸餾)將乙醇從酵母發(fā)酵液中分離出。
以下將更詳細(xì)地描述本發(fā)明的某些實施方式，但絕非限制本發(fā)明的范圍。
在最佳溫度條件下使用熱穩(wěn)定酶
在一個實施方式中，本發(fā)明涉及使用熱穩(wěn)定酶(例如Rasamsonia的纖維素分解酶)用于在(但不限于)乙醇生產(chǎn)中從預(yù)處理的木質(zhì)纖維素原料生產(chǎn)還原糖。應(yīng)用于預(yù)處理的木質(zhì)纖維素原料的Rasamsonia的纖維素分解酶顯示出在50-70℃范圍內(nèi)的溫度下的最大轉(zhuǎn)化速率。酶在這些環(huán)境下保持活性達(dá)14天及更久，而沒有完全停止活性。
通過使用最佳溫度條件，最大量的還原糖能在盡可能短的水解時間內(nèi)從原料(完全水解)釋放出。以這種方式，在不到5天實現(xiàn)了葡萄糖形式的纖維素的100％轉(zhuǎn)化。
發(fā)酵產(chǎn)物的理論最大產(chǎn)率(以g產(chǎn)物/克葡萄糖計的Yps最大)可來源于生物化學(xué)教科書。對乙醇而言，根據(jù)酵母中正常的糖酵解發(fā)酵通路，1摩爾葡萄糖(180g)產(chǎn)生2摩爾乙醇(＝2×46＝92g乙醇)。因此，基于葡萄糖的乙醇的理論最大產(chǎn)率為92/180＝0.511g乙醇/g葡萄糖。
對丁醇(MW 74g/摩爾)或異丁醇而言，理論最大產(chǎn)率是每摩爾葡萄糖1摩爾丁醇。因此，(異)丁醇的Yps最大＝74/180＝0.411g(異)丁醇/g葡萄糖。
對乳酸而言，同型乳酸發(fā)酵(homolactic fermentation)的發(fā)酵產(chǎn)率是每摩爾葡萄糖2摩爾乳酸(MW＝90g/摩爾)。根據(jù)該化學(xué)計量，Yps最大＝1g乳酸/g葡萄糖。
對其它發(fā)酵產(chǎn)物而言，可以進(jìn)行類似的計算。
應(yīng)用Rasamsonia的纖維素分解酶實現(xiàn)的成本降低是總方法時間減少的結(jié)果。
使用Rasamsonia酶，用延長水解時間補(bǔ)償較少的酶劑量
由于穩(wěn)定酶的高穩(wěn)定性，活性不會隨時間停止，盡管較少的還原糖在水解期間被釋出。通過延長水解時間來延長酶的使用和減少酶劑量，從而獲得釋放的還原糖的類似水平是可行的。例如，0.175mL酶/g原料干物質(zhì)導(dǎo)致在72小時內(nèi)從預(yù)處理的原料中釋放還原糖的理論最大值的約90％。當(dāng)使用0.075mL酶/g原料干物質(zhì)時，在120小時內(nèi)實現(xiàn)理論最大值的約90％轉(zhuǎn)化。結(jié)果顯示，由于酶活性的穩(wěn)定性，減少的酶劑量可通過延長水解時間補(bǔ)償，以獲得相同量的還原糖。對在高于10％干物質(zhì)含量下的預(yù)處理原料水解同樣如此，顯示了在15％干物質(zhì)原料下延長水解時間的補(bǔ)償作用。
通過使用穩(wěn)定的(例如Rasamsonia的)纖維素分解酶實現(xiàn)成本降低，這是由于需要較少的酶劑量，從而導(dǎo)致相似的水解轉(zhuǎn)化產(chǎn)率。
用穩(wěn)定酶降低污染風(fēng)險
在將木質(zhì)纖維素材料轉(zhuǎn)化為乙醇的常見方法中，處理步驟優(yōu)選地在腐敗性條件(septic condition)下進(jìn)行以減少操作成本。污染微生物的污染和生長可因而發(fā)生并導(dǎo)致不期望的副作用，這種乳酸、甲酸和乙酸生產(chǎn)，基于底物的乙醇的產(chǎn)率損失，毒素和細(xì)胞外多糖的產(chǎn)生可顯著影響生產(chǎn)成本。高處理溫度和/或短處理時間會限制水解和發(fā)酵期間的污染風(fēng)險。熱穩(wěn)定酶(比如Rasamsonia的那些)能在高于60℃的溫度下水解木質(zhì)纖維素原料。在這些溫度下，污染微生物引起不期望副作用的風(fēng)險會減小至幾乎為零。
在其中乙醇被生產(chǎn)的發(fā)酵步驟期間，溫度典型地在30-37℃之間并且由于產(chǎn)量損失而優(yōu)選地不會被升高。通過應(yīng)用盡可能短的發(fā)酵處理時間，污染的風(fēng)險和作用和/或污染物的生長會盡可能多地被減小。使用穩(wěn)定酶(比如Rasamsonia的那些)，可應(yīng)用盡可能短的發(fā)酵時間(見說明書上文)，因而污染風(fēng)險和/或污染物生長將被盡可能大地降低。以這種方式應(yīng)用Rasamsonia的熱穩(wěn)定纖維素分解酶實現(xiàn)的成本降低起因于降低了由于污染導(dǎo)致的處理失敗的風(fēng)險。
穩(wěn)定酶減少冷卻成本并增加乙醇工廠的生產(chǎn)力
熱預(yù)處理后的第一個步驟是將預(yù)處理的原料冷卻至酶為最佳活性的溫度。大規(guī)模時，這典型地通過添加(冷卻)水完成，這除了降低溫度外，會減少干物質(zhì)含量。通過使用熱穩(wěn)定酶(比如Rasamsonia的那些)，可通過下述事實實現(xiàn)成本降低：i)更少需要對預(yù)處理原料冷卻，因為在水解期間允許更高溫度，和ii)添加更少的水，這會增加水解和發(fā)酵期間的干物質(zhì)含量并因而增加乙醇工廠的乙醇生產(chǎn)能力(每體積每時間單位產(chǎn)生的量)。而且，通過根據(jù)本發(fā)明使用熱穩(wěn)定酶(比如Rasamsonia的那些)，成本降低也可通過使用比用在有非熱穩(wěn)定酶的方法中的水具有更高溫度的冷卻水實現(xiàn)。
利用穩(wěn)定酶水解后再循環(huán)酶
水解結(jié)束時，酶活性表現(xiàn)為低的，因為一旦幾乎所有纖維素被轉(zhuǎn)化，幾乎沒有還原糖被釋放出。但是，存在的酶促活性的量僅減少少許，假設(shè)這主要是由于酶對底物的吸收。通過在水解后應(yīng)用固液分離，例如離心、過濾、沉降等等，溶液中的酶活性的60％或更多，例如70％可被回收并被再利用用于在下一水解期間水解新的預(yù)處理的木質(zhì)纖維素原料。
而且，固液分離后，溶液中的酶可從含有還原糖和來自酶促作用的其它水解產(chǎn)物的溶液中分離出?？山柚虿唤柚紫葘⒚肝降饺魏晤愋偷妮d體上，通過但不限于(超或微)過濾、離心、沉淀、沉降進(jìn)行該分離。
例如，用0.175mL/g原料干物質(zhì)的酶載量對預(yù)處理的原料水解20小時后，還原糖的理論最大量的50％被釋出，相同水解72小時后，還原糖的理論最大量的90％被釋出。通過離心和超濾，在滲余物中回收60-70％的酶活性，而濾液含有超過80％的釋出的還原糖。通過再利用滲余物自身或被進(jìn)一步純化和/或濃縮后的滲余物，在下一水解步驟期間的酶劑量可被減少60-70％。通過這種方式通過使用穩(wěn)定纖維素分解酶(例如Rasamsonia的那些)實現(xiàn)成本降低起因于需要更少的酶劑量。
利用穩(wěn)定酶的水解后酶再循環(huán)與酶生產(chǎn)和酵母細(xì)胞再循環(huán)的組合
包括如上文所述的水解后再循環(huán)酶的方法可與發(fā)酵后再循環(huán)生產(chǎn)乙醇的微生物的方法組合，其中在酶生產(chǎn)發(fā)酵中使用含還原糖的濾液作為底物(純化的和/或濃縮的或稀釋的)和作為底物用于培養(yǎng)生產(chǎn)乙醇的微生物。
利用穩(wěn)定酶的真空蒸餾后再循環(huán)酶
酶(比如來自Rasamsonia的那些)的熱穩(wěn)定性導(dǎo)致在糟水中的水解、發(fā)酵和真空蒸餾后剩余的纖維素分解活性。酶的總活性在三個連續(xù)的方法步驟期間降低。真空蒸餾后獲得的糟水可因而被再利用作為酶來源，用于將預(yù)處理麥秸轉(zhuǎn)化為乙醇的新開始的水解-發(fā)酵-蒸餾處理循環(huán)。糟水可被以濃縮形式或(未)稀釋形式和/或被純化并有或沒有額外的酶補(bǔ)充的形式被使用。
利用熱穩(wěn)定酶的真空蒸餾后酶再循環(huán)與酶補(bǔ)充的組合
在一個最佳方法中，酶在新處理循環(huán)中再利用之前，補(bǔ)充到糟水中的酶量等于在先前處理循環(huán)的三個連續(xù)處理步驟期間損失的活性量。以這種方式，避免超劑量的酶，并因此獲得酶的最有效使用。
而且，通過在第一處理循環(huán)中提供高酶劑量并補(bǔ)充等于在隨后處理循環(huán)中的三個連續(xù)處理步驟期間損失的活性量的酶，可在每個處理循環(huán)中獲得盡可能高的水解速率，導(dǎo)致少于48小時的短的水解時間和酶的最有效使用的組合。
在混合系統(tǒng)中使用穩(wěn)定酶
通過在水解期間應(yīng)用混合，酶變得更經(jīng)常地與底物接觸，這導(dǎo)致催化活性被更有效使用。這將導(dǎo)致酶劑量更低并因而導(dǎo)致成本更低，除非混合對酶具有負(fù)面作用。穩(wěn)定酶(比如來自Rasamsonia的熱穩(wěn)定酶)是穩(wěn)健的并可抵抗(局部)高剪切和高溫環(huán)境，這是漿體劇烈混合期間的情況。在混合系統(tǒng)中使用穩(wěn)定酶因而是有益的并會導(dǎo)致劑量減少并因此導(dǎo)致成本降低。
通過下述實施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，其不應(yīng)被解釋為限制本發(fā)明的范圍。
實施例
實驗信息
菌株
可被用于本發(fā)明的實施例中以展示本發(fā)明的效果和優(yōu)勢的合適的Rasamsonia菌株例如TEC-101,TEC-147,TEC-192,TEC-201或TEC-210。所述菌株在WO2011/000949中描述。
制備酸預(yù)處理的玉米稈底物
如Schell,D.J.,Applied Biochemistry and Biotechnology(2003),105-108卷,69-85頁中所述獲得稀酸預(yù)處理的玉米稈(aCS)。使用中試規(guī)模預(yù)處理反應(yīng)器，并在190℃、1分鐘滯留時間和液相中1.45％(重量/重量)的有效H2SO4酸濃度的穩(wěn)態(tài)條件下操作。
蛋白質(zhì)測量試驗
1.總蛋白
TCA雙縮脲
該方法是使用三氯乙酸(TCA)沉淀蛋白質(zhì)以除去干擾物質(zhì)并允許用比色雙縮脲反應(yīng)測定蛋白質(zhì)濃度的組合。在雙縮脲反應(yīng)中，銅(II)離子被還原為銅(I)，銅(I)在堿性溶液中與肽鍵的氮和碳形成復(fù)合物。紫色表示蛋白質(zhì)的存在。根據(jù)Beer-Lambert定律，顏色強(qiáng)度以及因此的在546nm的吸光度與蛋白質(zhì)濃度直接成正比。使用BSA(牛血清白蛋白)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，蛋白質(zhì)含量被表示為根據(jù)BSA等價物的g蛋白質(zhì)/L或者mg根據(jù)BSA等價物的蛋白質(zhì)/ml。使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)計算方案來計算蛋白質(zhì)含量，其中通過標(biāo)繪相對于濃度已知樣品的濃度的OD546，隨后使用由校準(zhǔn)線生成的方程計算未知樣品的濃度。
2.使用PAGE的個體蛋白質(zhì)
樣品預(yù)處理SDS-PAGE
基于估算的樣品蛋白濃度，進(jìn)行下述樣品制備。向10μl樣品中加入40μl MilliQ水和50μl TCA(20％)以將樣品稀釋5倍(～1mg/ml)和沉淀蛋白。在冰上1小時后，離心樣品(10分鐘，14000rpm)。用500μl丙酮清洗沉淀并離心(10分鐘，14000rpm)。如下所述處理沉淀。
SDS-PAGE
將沉淀溶解于65μl MilliQ水、25μl NuPAGETM LDS樣品緩沖液(4×)Invitrogen和10μl NuPAGETM樣品還原劑(10×)Invitrogen中。在變性步驟之前，使用比率為65:25:10的MilliQ、NuPAGETM LDS樣品緩沖液和10μl NuPAGETM樣品還原劑的混合物將樣品稀釋5倍?；旌现螅?0℃下在熱混合器中孵育樣品10分鐘。將樣品溶液應(yīng)用于4-12％Bis-Tris凝膠(NuPAGETM BisTris,Invitrogen)上。將標(biāo)記M12(Invitrogen)的樣品(10μl)也應(yīng)用于凝膠上。使用外部緩沖室中具有600ml 20×稀釋的SDS緩沖液和內(nèi)部緩沖室中具有含0.5ml抗氧化劑(NuPAGETM Invitrogen)的200ml 20×稀釋的SDS緩沖液的XCELL Surelock，使凝膠在200V下電泳50分鐘。電泳后，用去離子水漂洗凝膠2次，然后用50％甲醇/7％乙酸溶液固定1小時并用Sypro Ruby(每凝膠50ml)染色過夜。用MilliQ水清洗凝膠之后，使用Typhoon9200(610BP 30,綠色(532nm),PMT 600V,100μm)成像。
定量分析蛋白質(zhì)
使用Typhoon掃描儀并使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法測定泳道內(nèi)的蛋白條帶之間的比率。一式三份地應(yīng)用樣品并使用圖像定量(Image quant)程序測定灰度值。使用所選蛋白條帶的灰度值相對于所有蛋白條帶的總灰度值計算值，其被表示為相對于總蛋白的相對％蛋白。
葡聚糖轉(zhuǎn)化計算：
％葡聚糖轉(zhuǎn)化(％)＝(葡萄糖(g/l)×100％)/(葡聚糖(基于DM級分)×dm(g/kg)×1.1)
其中：
葡萄糖(g/l)＝水解后的上清液中的葡萄糖濃度
葡聚糖(基于dm級分)＝預(yù)處理前的底物的葡聚糖含量
dm(g/kg)＝水解的干物質(zhì)(例如20％dm＝200g/kg).
1.1＝水解期間摻入水導(dǎo)致的重量增加
實例計算：
葡萄糖＝60g/l
葡聚糖級分＝0.40(基于干物質(zhì)為40％)
dm＝200g/kg
葡聚糖轉(zhuǎn)化實例＝(60*100)/(0.4×200×1.1)＝68％轉(zhuǎn)化率
必要的話進(jìn)行蒸發(fā)校正。隨后將上清液中的濃度轉(zhuǎn)化成濃度/kg水解物。
通過UPLC-MS/MS測量生物質(zhì)水解物中的葡糖酸
所述試驗是基于用UPLC柱分離葡糖酸并借助MS/MS(基于負(fù)電噴霧電離)進(jìn)行檢測。為了排除由離子抑制、蒸發(fā)和注入效應(yīng)造成的誤差，使用標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)(即13C6-葡糖酸)。
化學(xué)品和參比化合物
將用于樣品制備和UPLC-MS/MS分析的水通過Millipore 0.22μm過濾器進(jìn)行過濾。HPLC級乙腈獲得自Merck(阿姆斯特丹，荷蘭)。水中的0.1％(v/v)甲酸和乙腈中的0.1％甲酸獲得自Biosolve B.V.(范肯斯沃德，荷蘭)。葡糖酸參比化合物獲得自Sigma(茲韋恩德雷赫特，荷蘭)。同位素標(biāo)記的葡糖酸(13C6，用作內(nèi)標(biāo))是通過Buchem B.V.(阿珀爾多倫，荷蘭)定制的。
內(nèi)標(biāo)溶液
通過在10mL容量瓶中稱量10mg 13C6-葡糖酸并溶解于10mL水中來制備原液(約1mg/mL)。通過吸移100μL的內(nèi)標(biāo)原液并添加9.99mL水由此原液制備工作溶液(濃度約10μg/mL)。
標(biāo)準(zhǔn)溶液
通過稱量5mg葡糖酸并添加10mL水制備葡糖酸原液。通過吸移20μL的原液并添加980μL水進(jìn)一步稀釋所述原液(稀釋1，濃度約10μg/mL)。通過吸移100μL的稀釋1并添加900μL水進(jìn)一步稀釋(稀釋2，濃度約1μg/mL)。根據(jù)下表1在HPLC小瓶中制作校準(zhǔn)曲線。
樣品制備
將生物質(zhì)水解物除霜(必要的話)，并且通過在Eppendorf小瓶中用1350μL水稀釋150μL的樣品用水將生物質(zhì)水解物稀釋十倍，隨后在13000rcf下離心15分鐘。通過在HPLC小瓶中吸移20μL的上清液并添加100μL內(nèi)標(biāo)工作溶液和880μL水將所得上清液用水稀釋五十倍。
UPLC-MS/MS
在Waters UPLC iClass體系上分析葡糖酸，所述體系由連接到Waters Xevo TQD質(zhì)譜儀上的Waters iClass Binary Solvent Manager和Water iClass Sample Manager FTN組成(Waters，米爾福德，馬薩諸塞州，美國)。用A)水中的0.1％(v/v)甲酸和B)乙腈中的0.1％甲酸作為流動相，使用梯度洗脫通過Waters Acquity UPLC BEH C18柱(150x2.1mm，1.8μm)實現(xiàn)層析分離。7min梯度以99％A持續(xù)1分鐘開始，隨后在2分鐘內(nèi)直線下降到90％A，然后用20％A清洗2分鐘并且用99％A再平衡2分鐘。使用5μl的注射容積，將流速保持在0.35mL/min，并且將柱溫設(shè)為40℃。
以負(fù)離子化模式操作質(zhì)譜儀。用Masslynx 4.1軟件(Waters)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和峰值積分。以多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)進(jìn)行葡糖酸和13C6-葡糖酸檢測。一般設(shè)置如下：ESI毛細(xì)管電壓是2.0kV，提取器電壓是3.0V，錐孔電壓是30V。去溶劑化氣體(氮)流量是800L/h(溫度設(shè)在350℃)，錐孔氣體(氮)流量是50L/h，并且源溫度是150℃。使用以下MRM設(shè)置：葡糖酸m/z 195.0→129.0，停留時間0.1s，碰撞電壓2V；13C6-葡糖酸m/z 201.0→134.0，停留時間0.08s，碰撞電壓2V。
定量
使用線性回歸計算葡糖酸濃度(以g/L計)：
實施例1
水解期間的氧消耗
在60℃的反應(yīng)器溫度和4.5的pH下酶促水解具有20％干物質(zhì)(基于干物質(zhì)含有36％葡聚糖)的經(jīng)預(yù)處理的玉米秸稈期間，添加5mmol的氧/kg水解物或68mmol的氧/kg葡聚糖。用2.5mg/g玉米秸稈干物質(zhì)的TEC-210纖維素酶酶組合物進(jìn)行水解。根據(jù)WO 2011/000949中描述的接種和發(fā)酵過程產(chǎn)生TEC-210。發(fā)現(xiàn)上清液中的葡糖酸濃度為1.0g/l。
實施例2
大規(guī)模水解期間的氧消耗
在60℃的反應(yīng)器溫度和4.5的pH下，用含有36％葡聚糖的木質(zhì)纖維素原料的20％干物質(zhì)(對應(yīng)于18.000kg的由6480kg葡聚糖組成的干物質(zhì))填充100m3且填料水平為90％的反應(yīng)器。用2.5mg/g干物質(zhì)原料的TEC-210纖維素酶酶組合物進(jìn)行水解。根據(jù)WO 2011/000949中描述的接種和發(fā)酵過程產(chǎn)生TEC-210。
通過添加460摩爾的(分子)氧實現(xiàn)了最佳葡聚糖水解。這產(chǎn)生了1g/kg水解物的葡糖酸水平。
10m3的反應(yīng)器頂部空間含有空氣，并且因此含有約21％的氧，這等于2.1m3或94摩爾的分子氧，其對于最佳葡聚糖轉(zhuǎn)化而言是不夠的。因此，向反應(yīng)混合物中添加額外的氧(至少是最小量)。
盡管反應(yīng)器頂部空間含有一些氧，但是這并不自動地意味著所有氧最后到了反應(yīng)混合物中，這是由于在大規(guī)模(>1m3)時不利的表面面積/反應(yīng)器容積比率造成的質(zhì)量傳遞限制。為了使用此頂部空間的部分氧，可以使用劇烈攪拌(在大規(guī)模時非常昂貴)，或者優(yōu)選地使用將氧(以空氣的形式)泵送通過反應(yīng)混合物。
實施例3
大規(guī)模水解期間的氧消耗
在60℃的反應(yīng)器溫度和4.5的pH下，用含有36％葡聚糖的木質(zhì)纖維素原料的20％干物質(zhì)(對應(yīng)于18.000kg的由6480kg葡聚糖組成的干物質(zhì))填充100m3且填料水平為90％的反應(yīng)器。用2.5mg/g干物質(zhì)原料的TEC-210纖維素酶酶組合物進(jìn)行水解。根據(jù)WO 2011/000949中描述的接種和發(fā)酵過程產(chǎn)生TEC-210。
通過添加460摩爾的(分子)氧實現(xiàn)了最佳葡聚糖水解。這產(chǎn)生了1g/kg水解物的葡糖酸水平。
將原料在60℃的反應(yīng)器溫度下用氧飽和，從而在水解開始時產(chǎn)生0.15mmol/kg的氧濃度。這意味著約14摩爾的氧存在于原料中，這對于最佳葡聚糖轉(zhuǎn)化而言是不夠的。因此，向反應(yīng)混合物中添加額外的氧(至少是最小量)。
實施例4
水解期間的氧消耗
使用濃度為20％(w/w)干物質(zhì)(dm)的經(jīng)酸預(yù)處理的玉米秸稈(aCS)原料進(jìn)行酶促水解。原料溶液是通過用水稀釋濃縮原料漿而進(jìn)行制備的。用25％(w/w)NH4OH-溶液將pH調(diào)整至pH4.5。使用1.5升的反應(yīng)器在1kg規(guī)模上進(jìn)行酶促水解。將pH控制在4.5并將溫度控制在62℃。在該方法中溶解氧是通過頂部空間的氣體再循環(huán)和額外的新鮮空氣(含有20-21％的氧)進(jìn)行控制的。
在添加酶之前，頂部空間的氣體是使用蠕動泵和噴射器按3l/小時的氣體流進(jìn)行再循環(huán)的。由于原料通過化學(xué)反應(yīng)消耗氧的事實，DO水平在一小時內(nèi)達(dá)到0％的DO水平，這產(chǎn)生了厭氧原料以及完全耗盡氧的頂部空間。所產(chǎn)生的惰性頂部空間氣體(無氧的)在整個水解中被用作所導(dǎo)入的新鮮空氣的載氣。
接下來，將纖維素酶的酶混合物TEC210按3.75mg(TCA蛋白質(zhì))/g dm的劑量添加至原料。根據(jù)在WO2011/000949中所述的接種和發(fā)酵程序制造TEC-210?？偹鈺r間為120小時。
在整個水解過程期間分別按每小時每kg反應(yīng)混合物為0-3-6-12-24或48ml的新鮮空氣流將新鮮空氣導(dǎo)入惰性頂部空間氣體的再循環(huán)回路中，這是在添加酶后直接開始的。在所有實驗中不斷地測量DO。在實驗的開始和結(jié)束時取樣以通過HPLC進(jìn)行葡萄糖分析。
在搖瓶中進(jìn)行并行實驗以確定葡聚糖水解的最大水平。該最大水解是通過在過剩的含有氧的頂部空間空氣中以類似條件(pH、溫度和dm)下以非常高的酶劑量(50mg(TCA蛋白質(zhì))/g dm)孵育原料而確定的。在每次實驗中的DO測量不斷示出0％的DO。這可通過在將氧從含氧的再循環(huán)氣體流轉(zhuǎn)移至反應(yīng)器中的液相后氧的直接消耗進(jìn)行解釋。
結(jié)果被列在表2中。通過對每種條件(即新鮮空氣流量(ml/kg/h)0–3–6–12–24–48–96)從水解結(jié)束時的葡萄糖濃度(以g/l計)中減去水解開始時的葡萄糖濃度(以g/l計)并且將對應(yīng)的值除以當(dāng)新鮮空氣流量(ml/kg/h)為0時發(fā)現(xiàn)的值(這個值被設(shè)為100％)來計算葡萄糖產(chǎn)量增加。
數(shù)據(jù)清楚地證明，當(dāng)氧以對應(yīng)于20與5000mmol之間的分子氧/kg所述木質(zhì)纖維素材料中的葡聚糖的量被消耗時，形成更高量的葡萄糖。
實施例5
木質(zhì)纖維素原料水解期間最大耗氧量的測定
如下所述的測量木質(zhì)纖維素原料水解期間的最大耗氧量。用最終濃度為20％w/w DM的經(jīng)酸預(yù)處理的玉米秸稈(aCS)進(jìn)行水解反應(yīng)。經(jīng)由用水稀釋經(jīng)濃縮的原料溶液來制備原料溶液。隨后，用10％(w/w)NH4OH溶液將pH調(diào)節(jié)到pH 4.5。
在工作容積為6l的攪拌的、pH受控的且溫度受控的反應(yīng)器中進(jìn)行水解。用2.5mg/g DM TEC-210纖維素酶混合物進(jìn)行水解。根據(jù)WO 2011/000949中描述的接種和發(fā)酵過程發(fā)酵TEC-210。
將新鮮空氣以0.6VVM的流速吹入通過反應(yīng)混合物。
通過借助質(zhì)譜法經(jīng)由廢氣測量來測量進(jìn)入空氣與離開反應(yīng)器的空氣之間的差異來確定氧消耗。
水解期間的最大耗氧量被確定為2mmol分子氧/kg木質(zhì)纖維素材料/小時或27.8mmol分子氧/kg所述木質(zhì)纖維素材料中的葡聚糖/小時。
表1：校準(zhǔn)曲線
表2.在木質(zhì)纖維素原料的酶促水解中添加氧的作用。
*如下從新鮮空氣流量計算分子氧：例如，96ml的新鮮空氣對應(yīng)于20.2ml氧(空氣含有21％的氧)。20.2ml氧/kg/小時對應(yīng)于20.2/24.5＝0.82mmol氧/kg/小時(在25℃下，氧＝24.5l/mol)。對于120小時的水解而言，在72g/kg水解物的葡聚糖含量下，這等于0.82/0.072＝11.42mmol分子氧/kg葡聚糖/小時或1371mmol分子氧/kg葡聚糖。