本申請涉及穩(wěn)定化生物學樣本中的核酸的領域。更具體地，本發(fā)明涉及穩(wěn)定化復雜生物學樣本如糞便中存在的人和微生物脫氧核糖核酸(DNA)的方法和組合物。發(fā)明背景糞便長久以來被歸類為來自動物消化道的潛在傳染性廢品，其被收集以測試寄生物如蟯蟲和/或其卵或檢測癥狀性動物和人的病原性細菌和真菌。然而，近來，隨著個性化藥物增加和前生物素和原生物素(pre-andpro-biotics)大規(guī)模商品化，這種“廢”品的診斷價值以及特別是預后價值已逐步上升。僅僅飲食習慣的變化已顯示出對糞便中的小生物群(microbiota)或微生物群體(microbialcommunity)組成的影響(Walker等，2011；Wu等，2011)，其可進而可影響健康和降低某些疾病的發(fā)病率。胃腸(GI)道定居始于出生，并且隨著時間發(fā)展的微生物群體的成形受到多種影響，包括個體的基因組成、年齡、性別、營養(yǎng)、抗生素使用和其它服用藥物、疾病狀態(tài)、生活方式、地理位置/環(huán)境、化學品暴露、外科干預和其它。由在人體健康中——具體地在食物消化、宿主能量代謝、必需維生素合成、上皮成熟、膽鹽降解、藥物和飲食致癌物代謝、以及保護消化道(gut)防止病原定居中——具有重要作用的約100萬億細菌組成的各種微生物群體定居于腸?！牢⑸锝M(gutmicrobiome)’是被給出以描述人GI系統(tǒng)中的共生微生物和其共同相互作用基因組的這種龐大集合的術語。然而，對消化道小生物群和宿主生理之間的這些功能性相互作用的理解是在其嬰兒期。人類微生物組項目(HumanMicrobiomeProject)揭示，消化道微生物組比人基因組大約150倍，由大約介于300和1000個之間細菌物種和多于7000個菌種組成。在大多數(shù)哺乳動物中，消化道微生物組主要有四個細菌門：硬壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actionbacteria)和變形菌門(Proteobacteria)(Ley等.，2007)。一個新的工作領域涉及分析消化道微生物組與消化道寄生物、病毒、酵母、和大量真菌——如念珠菌(念珠菌)、酵母屬(Saccharomyces)、曲霉(Aspergillus)、和青霉(Penicillium)——的相互作用。一些專家已經(jīng)提出，單獨由人基因組編碼的全部信息不足以實施全部的機體生物學功能(Lee和Mazmanian，2010)，并且提到細菌和人之間的共生作為解釋。在僅約10％的人細胞是實際上的人，而微生物組成剩余90％的情況下，人可被認為是微生物客體的宿主或超個體(super-organisms)。多年來，腸微生物已被牽涉到結腸癌的發(fā)生中(Aries等.，1969；Moore和Moore，1995)。最近，幽門螺桿菌(Helicobacterpylori)感染已被確定是胃(胃部)癌、胃淋巴瘤和胃潰瘍疾病的主要原因(Parsonnet等，1991)。然而，發(fā)現(xiàn)消化道微生物對我們的感受和行為具有比我們所知更多的影響。由于消化道和腦之間存在通信的證據(jù)越來越多，消化道已被戲稱為‘第二腦’。證據(jù)表明，多種疾病，如心血管疾病、糖尿病、緊張/焦慮、孤獨癥、克羅恩病、過敏性腸疾病(IBD)、變應性紊亂、代謝綜合征和神經(jīng)系統(tǒng)炎癥可源于消化道微生物組失調。然而，研究人員剛剛開始破譯現(xiàn)在所謂的‘微生物組-消化道-腦軸線’，即，定居在GI道的微生物可如何影響消化道之外的生物學功能，具體地，消化道微生物組影響其宿主的免疫系統(tǒng)、內(nèi)分泌和神經(jīng)系統(tǒng)疾病的分子機制或串擾(crosstalk)(Grenham等，2011；Kinross等，2011)。例如，很多微生物產(chǎn)生神經(jīng)代謝物，該神經(jīng)代謝物是神經(jīng)遞質或神經(jīng)傳遞調節(jié)因子，包括GABA、去甲腎上腺素、血清素、多巴胺和乙酰膽堿，其直接或通過遍布GI道存在的腸嗜鉻細胞作用于消化道中的神經(jīng)末梢。來自飲食纖維的碳水化合物也被微生物分解，導致神經(jīng)活性化學劑(如正丁酸鹽(酯)、乙酸鹽(酯)、氫硫化物和丙酸鹽(酯))產(chǎn)生。另外，微生物排出代謝物，如蛋白質、碳水化合物和其它分子，這些代謝物可留在消化道并具有在整個機體內(nèi)信號傳導疾病的作用。在健康和患病個體中，除確定組成消化道微生物群體的數(shù)百種不同物種外，獲得對整個細菌群的功能性的了解也是非常重要的。例如，小生物群的組成決定飲食成分作為生長基質的競爭、糖向抑制發(fā)酵產(chǎn)物的轉化、生長基質的產(chǎn)生、細菌素的釋放(對其它細菌物種有毒的分子)、天然免疫系統(tǒng)的刺激、與定居在消化道壁的微生物的競爭和消化道屏障功能、和其它。不幸的是，傳統(tǒng)的微生物學培養(yǎng)技術已被證實在協(xié)助確定消化道微生物組成員的身份和功能方面大部分是不成功的，因為其依賴于適當?shù)纳L營養(yǎng)物和復雜條件以使整個腸微生物群在體外繁殖而受到顯著限制。估測表明，整個腸微生物群中僅20-40％(Apajalahti等，2003)可通過標準培養(yǎng)技術來培養(yǎng)，因此培養(yǎng)類方法漏失了大部分微生物生物多樣性。由于需要確保多數(shù)厭氧的體外腸微生物群的生活力，這個因素被進一步加劇(O’Sullivan，2000)。很多培養(yǎng)基本身對一些細菌(具體地，不利于直接從糞便或腸材料培養(yǎng)的生理狀態(tài)的需要附加的或選擇性的試劑或細菌的細菌)有選擇。而且，傳統(tǒng)的用于識別和表征腸微生物群的形態(tài)學檢查和生化測試非常勞動密集、耗時和不精確，因此限制了其對于分析多個個體的樣品和比較來自不同個體的細菌物種之間的相關度的效率。因此，需要在收集時結合不依賴培養(yǎng)的分子工具(如16S核醣體RNA基因類方法、TaqMan探針、數(shù)字和LATEPCR、和宏基因組測序(metagenomicsequencing))捕捉和穩(wěn)定化或“快照(snap-shot)”微生物組的快速方法，來克服這些限制和偏見，因而可顯示這種富集生態(tài)系統(tǒng)的真實而詳細的圖片。目前，每20個住院患者中約1個會遭到醫(yī)院獲得性感染(HAI)。雖然大部分類型的HAI正在衰減，但艱難梭狀芽胞桿菌(Clostridiumdifficile)——一種已知的致病生物(pathobiont)——導致的發(fā)病是逐漸增加的困擾醫(yī)院和長期保健機構中的患者的問題。艱難梭狀芽胞桿菌感染(CDI)被認為源于胃腸道生態(tài)失調，即，定居小生物群的破壞?？股刂委煔⑺繥I道中的大部分細菌，該細菌通?？刂破D難梭狀芽胞桿菌。在這種改變的環(huán)境中，艱難梭狀芽胞桿菌復制并產(chǎn)生攻擊腸內(nèi)層的毒素，導致從腹瀉至危及生命的炎癥的范圍的癥狀和結腸內(nèi)層出血。據(jù)疾病控制和預防中心(CentersforDiseaseControlandPrevention，CDC)所言，僅艱難梭狀芽胞桿菌就與美國每年14,000人的死亡有關。在醫(yī)院中，排在糞便中的艱難梭狀芽胞桿菌孢子主要通過保健人員的接觸過污染的表面或物品的手轉移至患者和表面。針對復發(fā)性艱難梭狀芽胞桿菌感染的有效治療不廣泛可用。矛盾的是，艱難梭狀芽胞桿菌感染的主要療法是給予更多抗生素，其中約20％的患者在一個月內(nèi)有復發(fā)，并且其中很多已經(jīng)反復發(fā)作。非常規(guī)的替代型程序，糞便小生物群移植(FMT)——其中來自一個“供體”的糞便被灌輸?shù)交颊叩哪c中——證明在治療復發(fā)性GI感染時遠比抗生素有效。通過恢復對微生物平衡的干擾，來自健康供體的糞便的灌輸呈現(xiàn)牽制有害細菌如艱難梭狀芽胞桿菌，根除疾病——即使在是已經(jīng)歷反復的使人衰弱的數(shù)回發(fā)作的患者體內(nèi)。在阿姆斯特丹大學(UniversityofAmsterdam)的小型荷蘭研究中，16位復發(fā)性艱難梭狀芽胞桿菌感染患者中的15位通過供體糞便的十二指腸灌輸被治愈，與之相比，被給予抗生素萬古霉素2周方案的患者僅為27％(vanNood，Els等。(2013))。顯示供體糞便的灌輸導致患者GI道中的微生物多樣性提高并且這種多樣性經(jīng)過時間持續(xù)存在。近來，Song等(2013)驗證了此前的報告：復發(fā)性艱難梭狀芽胞桿菌感染(RCDI)患者糞便樣本的降低的小生物群多樣性和富集性在FMT后恢復至與健康供體相似。在這個縱向研究中，F(xiàn)MT主要影響硬壁菌門和變形菌門，并且糞便小生物群在FMT后的患者體內(nèi)持續(xù)改變至少16周。重要地，造成FMT成功治療RCDI的確切作用機制仍然未知，并且沒有臨床驗證的參數(shù)集來限定適當?shù)墓w或理想的供體小生物群。需要在多個時間點從大量個體——健康供體和RCDI患者——在環(huán)境溫度下實地收集糞便樣本和快照組合物中的采樣微生物組的容易而有效的手段，來繪制在群體中健康個體的GI道中發(fā)現(xiàn)的‘核心’微生物組，其上可覆蓋RCDI患者的變化微生物組。最后，未來RCDI患者不用抗生素，而用定制原生物素(包含活細菌、經(jīng)口服以將有益的細菌恢復至機體的制劑/補充劑)和前生物素(促進GI微生物群的目標選定小組的活性的不可消化食物組分，如寡糖)或合生物素(synbiotics)(原生物素和前生物素的協(xié)同組合)治療，以使其微生物組恢復健康狀態(tài)。為規(guī)避引入不確定的潛在有害的微生物的風險，一些醫(yī)院開始建立自主建庫系統(tǒng)?；颊叩募S便可被存庫以在未來針對可能的醫(yī)院獲得性“超級病菌”感染用作解毒劑。利用患者’自己的糞便進行移植在很大程度上降低了引入有害微生物的風險并且避免了無關供體糞便的耗時且高價的可傳遞疾病篩查。然而，不幸地，顯示某些人的“生態(tài)系統(tǒng)”使其比別人更易染病。因此，與再引入患者自己的糞便相關的可能的缺點是其僅可提供短期益處而非治愈其有害微生物，如艱難梭狀芽胞桿菌。最后，微生物組研究可導致識別‘核心’或‘楔石’細菌物種，該‘核心’或‘楔石’細菌物種有助于定義人體健康，并且從而構建由充分表征的有益的細菌“混合物”組成的個性化“細菌療法”以代替移植“原生”糞便的這種粗糙方法。事實上，原生物素療法現(xiàn)已被提出用于多種消化道相關的障礙如IBD和炎性腸綜合征。從根本上，試圖表征供體小生物群的所有物種、識別診斷標志物以預測疾病易感性、和最終提供‘個性化’保健的研究人員和臨床醫(yī)生需要確信測試的糞便樣本提供體外供體微生物組的真實表現(xiàn)或“快照”，而非微生物群體的‘退化’或人為表現(xiàn)。因此，在收集時立刻捕捉和穩(wěn)定或快照糞便微生物組的有效手段至關重要。結腸直腸癌(CRC)在歐洲和美國具有最高癌癥死亡率。已知CRC如果在其早期階段被檢測出來則高度可治愈(>90％)，使得早期癌癥篩查是一件有價值的事。多年來已設計出多種靈敏的檢查方法來檢測癌癥，如雙重對比鋇灌腸、結腸鏡檢查和可屈性乙狀結腸鏡檢查。然而，這些程序相關的經(jīng)濟成本、基礎設施和人力需求呈現(xiàn)巨大阻礙，更不必說對患者的不適性和侵入性。除成本外，這些檢查方法的低通量性也阻礙其實施用于全國范圍的初級篩查。目前，另一篩查結腸直腸癌的方法是糞便隱血測試(FOBT)。此測試檢測糞便樣本中血紅蛋白的存在以確定GI道是否存在出血，作為CRC的間接預測。雖然此測試不貴，但其靈敏性和陽性預測價值很低，并且假陽性結果的發(fā)生率高。因此，非常需要靈敏、可靠、成本有效、可規(guī)?；姆椒ㄓ糜陲L險性和/或癥狀性個體的疾病診斷以及癥狀性群體的常規(guī)診斷篩查。理想地，個體將在其家中的隱私場所常規(guī)地收集和穩(wěn)定化其部分糞便，然后將其郵寄至測試機構以篩查CRC和其它疾病。已公認脫落到結腸腔中并從糞便回收的腫瘤細胞的直接檢測和檢查是比隱血更陽性的結腸直腸癌預測。然而，指示癌癥或其它疾病的“目標”或突變?nèi)祟怐NA通常在生物學樣本中以低頻率存在(例如，對于CRC，為全部人類DNA的1％)，通常相對于高本底的野生型DNA(例如，細菌DNA和來自正常結腸細胞的人類DNA)，并且暴露于內(nèi)源性人類DNA酶(例如，脫氧核糖核酸酶I)和/或細菌核酸酶(例如，微球菌核酸酶)。在這種復雜樣品中，存在于糞便樣本中的僅有的一點“目標”人類DNA可因核酸酶和環(huán)境條件甚至在其到達實驗室前被快速降解，不利地影響診斷測試的臨床靈敏度。不僅核酸酶豐富，構成消化道中99％以上細菌的厭氧細菌在糞便從消化道排出時就暴露于空氣?？諝猓貏e是氧氣，對于厭氧細菌是有毒的環(huán)境，在4-5分鐘內(nèi)殺死50％的厭氧生物并且在僅僅20分鐘后殺死95-97％的厭氧生物(Brusa等，1989)。再一次，考慮到大多數(shù)糞便樣本在家中而非在實驗室或保健機構中收集，獲得糞便中的完整微生物組和人類DNA的代表視圖或“快照”是個挑戰(zhàn)。穩(wěn)定化生物學樣本中的總核酸以使其在樣本處理、運輸和儲存過程中不降解是必要的。為最小化生物學樣本中的核酸降解，標準實踐是將全部樣本或其部分在干冰上(-78℃)運輸至集中檢測機構，在此將其立即解凍和處理或維持冷凍儲存(-80℃至-20℃)。確保收集的樣本被立即冷凍、在運輸至測試機構期間維持冷凍、和分析前在最佳條件下儲存所需的成本、后勤(logistics)和基礎設施提出了巨大挑戰(zhàn)和風險，特別是在大規(guī)模的和以群體為基礎的篩查應用中。提供用于分散式樣本分析的‘代表性’樣本并仍維持最大限度的樣本完整性甚至可能更具挑戰(zhàn)。非常需要開發(fā)一種更可靠和標準化的樣本處理方法和組合物捕捉和維持每個樣本核酸譜的真實表現(xiàn)。對微生物組與其健康和疾病人宿主之間的關系的研究依賴于識別和經(jīng)過一段時間監(jiān)測微生物群體。近來的發(fā)現(xiàn)證明這些微生物譜可用作生物標志物，具有預后和診斷價值。在文獻中更加明確，由于消化道微生物組的動態(tài)屬性，隨時間對大型群體反復取樣對于開發(fā)這種生物標志物是至關重要的。這些研究，被稱為Microbiome-WideAssociationStudies(MWAS)，因供體服從性低、生物學樣本自我收集不可靠、成本高和貨運和處理程序繁瑣而具有挑戰(zhàn)。當前的糞便取樣和小生物群分析方法涉及在有可能使樣本暴露于與微生物組穩(wěn)定不相容的溫度的條件下運輸樣品。在樣本收集、運輸、處理和分析過程中不能適當?shù)胤€(wěn)定化微生物組有掩蓋微生物組譜的生物學和臨床意義的風險。因此，需要適當?shù)姆治銮俺绦騺泶_保體內(nèi)微生物組譜盡可能最佳的表現(xiàn)。需要在環(huán)境溫度下的運輸和儲存過程中穩(wěn)定化復雜生物學樣本如糞便中的核酸(具體地人和微生物)的組合物和方法。提供這個背景信息的目的是傳達申請人認為與本發(fā)明可能相關的已知信息。不一定意圖也不應被解釋為承認任何前述信息構成本發(fā)明的現(xiàn)有技術。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的一個目的是提供用于在環(huán)境溫度下穩(wěn)定化生物學樣本中包含的核酸的組合物、方法和試劑盒。一方面，提供在環(huán)境溫度下穩(wěn)定化生物學樣本中包含的核酸的方法，包括如下步驟：a)獲得生物學樣本；b)使生物學樣本與包括螯合劑的水性組合物接觸以形成混合物，其中螯合劑以至少約150mM的濃度存在并且其中組合物具有至少約9.5的pH；c)均化(b)中的混合物以形成均勻的混合物；和d)在環(huán)境溫度下儲存均勻的混合物。另一方面，提供用于在環(huán)境溫度下穩(wěn)定化生物學樣本中包含的核酸的水性組合物，其包括螯合劑，其中螯合劑以至少約150mM的濃度存在，其中組合物具有至少約9.5的pH。再另一方面，提供用于在環(huán)境溫度下穩(wěn)定化生物學樣本中包含的核酸的試劑盒，該試劑盒包括：a)樣本容器，具有可重復密封的封閉物；b)水性組合物，包括螯合劑，其中螯合劑以至少約150mM的濃度存在，其中組合物具有至少約9.5的pH，其中所述組合物任選地被包含在樣本容器內(nèi)；c)均化裝置，任選地被包含在樣本容器內(nèi)；d)將生物學樣本或其部分轉移到樣本容器中的裝置；和d)使用說明書。在一個實施方式中，核酸是脫氧核糖核酸(DNA)。在另一實施方式中，生物學樣本選自糞便樣本、土壤樣本、污水樣本、廢水樣本、或水樣本。在另一實施方式中，生物學樣本是糞便樣本。在另一實施方式中，糞便樣本源自哺乳動物。在再另一實施方式中，哺乳動物是人。在另一實施方式中，螯合劑選自1,2-環(huán)己二胺四乙酸(CDTA)、二乙三胺五乙酸(DTPA)、四氮雜環(huán)十二烷四乙酸(DOTA)、四氮雜環(huán)十四烷四乙酸(TETA)、去鐵胺(desferioximine)、或其螯合劑類似物。在另一實施方式中，螯合劑是CDTA。在另一實施方式中，螯合劑的濃度是約150mM至約500mM、或約250mM至約350mM。在再另一實施方式中，螯合劑的濃度是約300mM。在再另一實施方式中，組合物的pH為約9.5至約11.5、或約10.5至約11.5。在另一實施方式中，組合物的pH為約11。在還再另一實施方式中，組合物進一步包括至少一種能夠在9.5至11.5的pH范圍內(nèi)緩沖的緩沖劑。在另一實施方式中，緩沖劑是β-丙氨酸。在再另一實施方式中，組合物進一步包括水溶性有機溶劑，如C1-C6烷醇。在另一實施方式中，水溶性有機溶劑是乙醇。在再另一實施方式中，乙醇在組合物中以小于約30體積％的濃度存在。在還再另一實施方式中，乙醇在組合物中以小于約24體積％的濃度存在。在另一實施方式中，組合物進一步包括洗滌劑，如十二烷基硫酸鈉。在再另一實施方式中，組合物進一步包括消泡劑，如AntifoamA。在還再另一實施方式中，組合物進一步包括抗微生物劑，如三氯生(Triclosan)或Proclin。在再另一實施方式中，核酸是微生物DNA。在再另一實施方式中，核酸是微生物DNA，并且該方法穩(wěn)定化生物學樣本的微生物組譜。在再另一實施方式中，該方法使生物學樣本的微生物組譜在室溫下穩(wěn)定至少7天、至少14天、至少30天、或至少60天；在約37℃至約50℃的溫度下至少7天、或至少14天；和/或在-20℃下至少30天。在再另一實施方式中，核酸是微生物DNA，并且組合物/試劑盒用于穩(wěn)定化生物學樣本的微生物組譜。在再另一實施方式中，核酸是人類DNA。在再另一實施方式中，方法使人類DNA穩(wěn)定：在室溫下至少7天，至少14天，至少30天、或至少60天；在約37℃至約50℃的溫度下至少7天、或至少14天；和/或在-20℃下至少30天。在還再另一實施方式中，方法包括利用均化裝置均化生物學樣本和水性組合物的混合物。在另一實施方式中，上述方法和試劑盒的均化裝置是至少一個混合球。在再另一實施方式中，至少一個混合球是不銹鋼混合球或碳化鎢混合球。在再另一實施方式中，至少一個混合球是直徑為約5.6-11.1mm并且密度為至少約7.6g/cm3的不銹鋼混合球。在還再另一實施方式中，不銹鋼混合球的直徑為約7.1–8.7mm，并且樣本容器是內(nèi)徑為約12.9mm的圓底管。在另一實施方式中，方法包括在包含至少一個混合球的樣本容器中形成生物學樣本和水性組合物的混合物，密封樣本容器，和在存在至少一個混合球的情況下通過振蕩混合物來均化混合物。在再另一實施方式中，振蕩提供手動完成。在其它實施方式中，穩(wěn)定化核酸包括在環(huán)境溫度下儲存期間保全(preserve)生物學樣本中包含的核酸的相對豐度。在再另一實施方式中，提供在環(huán)境溫度下穩(wěn)定化糞便樣本中包含的DNA的方法，包括如下步驟：a)獲得來自哺乳動物的糞便樣本；b)使糞便樣本接觸pH為約10.5至約11.5的水性組合物，并且其中組合物包括下列、主要由下列組成、或由下列組成：數(shù)量為約250mM至約350mM的CDTA；數(shù)量為約30mM至約70mM的β-丙氨酸；按體積計約21.5％至約23.5％數(shù)量的乙醇；約0至約1％(w/v)數(shù)量的十二烷基硫酸鈉；和約0至約0.2％(v/v)數(shù)量的AntifoamA；c)均化(b)中的混合物以形成均勻的混合物；和d)在環(huán)境溫度下儲存均勻的混合物。在再另一實施方式中，水性組合物的pH為約11，并且包括下列、主要由下列組成、或由下列組成：約300mM數(shù)量的CDTA；約50mM數(shù)量的β-丙氨酸；約23.5體積％數(shù)量的乙醇；約0.5％(w/v)數(shù)量的十二烷基硫酸鈉；和約0.1％(v/v)數(shù)量的AntifoamA。在再另一實施方式中，方法包括在圓底管中形成糞便樣本和水性組合物的混合物，該圓底管的內(nèi)徑為約12.9mm并且包含直徑為約5.6-11.1mm并且密度為至少約7.6g/cm3的至少一個不銹鋼混合球；密封圓底管；和在存在至少一個不銹鋼混合球的情況下通過手動振蕩混合物來均化混合物。在另一實施方式中，DNA是微生物DNA，并且方法穩(wěn)定化糞便樣本的微生物組譜。在再另一實施方式中，提供用于在環(huán)境溫度下穩(wěn)定化糞便樣本中包含的DNA的水性組合物，其中糞便樣本源自哺乳動物，其中組合物的pH為約10.5至約11.5，并且包括下列、主要由下列組成、或由下列組成：數(shù)量為約250mM至約350mM的CDTA；數(shù)量為約30mM至約70mM的β-丙氨酸；數(shù)量為按體積計約21.5％至約23.5％的乙醇；數(shù)量為約0至約1％(w/v)的十二烷基硫酸鈉；和數(shù)量為約0至約0.2％(v/v)的AntifoamA。在再另一實施方式中，水性組合物的pH為約11，并且包括下列、主要由下列組成、或由下列組成：數(shù)量為約300mM的CDTA；數(shù)量為約50mM的β-丙氨酸；數(shù)量為約23.5體積％的乙醇；數(shù)量為約0.5％(w/v)的十二烷基硫酸鈉；和數(shù)量為約0.1％(v/v)的AntifoamA。在另一實施方式中，DNA是微生物DNA，并且組合物用于穩(wěn)定化糞便樣本的微生物組譜。在還再另一實施方式中，提供用于在環(huán)境溫度下穩(wěn)定化生物學樣本中包含的核酸的試劑盒，試劑盒包括：a)樣本容器，具有可重復密封的封閉物；b)水性組合物，具有約10.5至約11.5的pH，并且包括下列、主要由下列組成、或由下列組成：數(shù)量為約250mM至約350mM的CDTA；數(shù)量為約30mM至約70mM的β-丙氨酸；數(shù)量為按體積計約21.5％至約23.5％的乙醇；數(shù)量為約0至約1％(w/v)的十二烷基硫酸鈉；和數(shù)量為約0至約0.2％(v/v)的AntifoamA，其中所述組合物任選地被包含在樣本容器內(nèi)；c)均化裝置，任選地被包含在樣本容器內(nèi)；d)將生物學樣本或其部分轉移到樣本容器中的裝置；和d)使用說明書。在另一實施方式中，水性組合物的pH為約11，并且包括下列、主要由下列組成、或由下列組成：數(shù)量為約300mM的CDTA；數(shù)量為約50mM的β-丙氨酸；數(shù)量為約23.5體積％的乙醇；數(shù)量為約0.5％(w/v)的十二烷基硫酸鈉；和數(shù)量為約0.1％(v/v)的AntifoamA。在再另一實施方式中，核酸是微生物DNA，并且試劑盒用于穩(wěn)定化生物學樣本的微生物組譜。在還再另一實施方式中，均化裝置是直徑為約5.6-11.1mm并且密度為至少約7.6g/cm3的至少一個不銹鋼混合球，和樣本容器是內(nèi)徑為約12.9mm的圓底管。附圖說明為更好地理解本發(fā)明及其其它方面和進一步特征，參考下列描述，下列描述結合附圖使用，其中：圖1圖形顯示來自2個供體的糞便樣本的微生物組譜差異(PCR-DGGE分析)；圖2顯示瓊脂糖凝膠，顯示T＝0和之后14天時在室溫下的糞便樣本中的高分子量DNA在下列中的性質：1)包含不同濃度的CDTA(150-500mM)的組合物，2)包含不同濃度的EDTA(150-500mM)的組合物，和3)無穩(wěn)定化溶液儲存的糞便(未穩(wěn)定化)；圖3圖形顯示微生物組譜穩(wěn)定性對樣本均化和本發(fā)明組合物的pH的依賴性；圖4顯示在不同組合物中在室溫下儲存14天的糞便樣本的DGGE分析；圖5顯示在不同組合物中在室溫下儲存4天的糞便樣本的DGGE分析；圖6顯示瓊脂糖凝膠，顯示在組合物中在室溫下在不同pH值下儲存9天的糞便樣本中的高分子量DNA的性質；圖7顯示瓊脂糖凝膠，顯示在本發(fā)明組合物中用(A)多個玻璃珠和(B)不銹鋼球混合糞便樣本的結果；圖8顯示瓊脂糖凝膠，顯示在本發(fā)明組合物中在室溫下儲存后的DNA性質：(A)第0天，(B)第6天，(C)第7天，(D)第14天，(E)1個月，和(F)2個月；圖9顯示儲存在本發(fā)明組合物中的相同供體的樣品的三份糞便樣本等份的DGGE凝膠；圖10顯示儲存在本發(fā)明組合物中的糞便樣本的微生物組譜的代表性DGGE凝膠和相似度％(凝膠底部)：(A)在室溫下14天，和(B)在室溫下7天和2個月；圖11A和11B顯示在37℃下儲存在本發(fā)明組合物中的來自2個供體的糞便樣本的瓊脂糖凝膠；圖12A和12B顯示在37℃下儲存在本發(fā)明組合物中的來自2個供體的糞便樣本的DGGE分析；圖13A-E顯示在-20℃、室溫和50℃下儲存在本發(fā)明組合物中的來自3個供體的糞便樣本的瓊脂糖凝膠；圖14A-D顯示在50℃和-20℃下儲存在本發(fā)明組合物中的來自3個供體的糞便樣本的瓊脂糖凝膠電泳；圖15A-B顯示在50℃下儲存在本發(fā)明組合物中14天的來自2個供體的糞便樣本的DGGE分析；圖16A-B顯示在-20℃下儲存在本發(fā)明組合物中11天的來自2個供體的糞便樣本的DGGE分析；圖17顯示在本發(fā)明組合物中并且暴露于5個冷凍/解凍循環(huán)的糞便樣本的瓊脂糖凝膠；圖18顯示在本發(fā)明組合物中并且暴露于5個冷凍/解凍循環(huán)的糞便樣本的DGGE分析；圖19顯示主坐標分析(PCoA)，顯示經(jīng)過不同溫度和時間(3和14天)儲存在穩(wěn)定化溶液中的樣本在OTU豐度方面呈現(xiàn)高水平的相似度；和圖20顯示有和無穩(wěn)定化溶液經(jīng)過不同溫度和時間(3和14天)儲存的樣本的科水平豐度比例。圖21顯示新制樣本和104BpH11穩(wěn)定化樣本之內(nèi)和之間的Bray-Curtis相異度距離。Mann-Whitney檢驗顯示在所有條件下相當?shù)南喈惗?，未觀察到統(tǒng)計學差異。圖22示例104BpH11穩(wěn)定化樣本保全豐富度。豐富度通過分配存在/不存在個體OTU來評估和利用Shannon-指數(shù)來比較。Mann-Whitney檢驗顯示新制樣本和104BpH11樣本之間無顯著差異。圖23示例104BpH11樣本賦予高度可再現(xiàn)的微生物組譜。對Bray-Curtis距離進行的Mann-Whitney檢驗顯示在三份樣本中相當?shù)南喈惗?。圖24顯示與新制樣本相比時，未穩(wěn)定化糞便樣本和104BpH11(在23℃下14天)和冷凍(在-80℃下14天)糞便樣本之間的Bray-Curtis相異度距離。顯著相異度利用Mann-Whitney來評估(*P≤0.05)。圖25顯示代表性供體微生物組加權Unifrac相似度％的樹狀圖。針對每個條件進行從三個生物復制品的提取。與新制樣本的低相似度％表明微生物組譜隨時間而變。圖26示例經(jīng)歷模擬運輸條件的104BpH11樣本的DNA完整性。代表性供體樣本在23℃下儲存14天，在50℃下1天，在37℃下3天或暴露于多個冷凍-解凍循環(huán)。新制樣本也在-80℃下儲存14天作為對照。圖27示例暴露于模擬貨運條件的104BpH11樣本的Bray-Curtis相異度距離。Mann-Whitney檢驗顯示儲存在不同溫度下的104BpH11樣本和儲存在-80℃下那些樣本之間無差異。與配對-80℃樣本相比時，在維持在37℃下或經(jīng)歷冷凍-解凍(F/T)條件的未穩(wěn)定化樣本中觀察到顯著相異度(分別P≤0.05和P≤0.01)。圖28顯示用包含不同CDTA濃度的本發(fā)明組合物和用不包含CDTA的組合物在40℃下處理5天的來自2個供體的糞便樣本的細菌群體譜的DGGE分析。圖29顯示用本發(fā)明組合物“104BpH11”或TEN緩沖劑在環(huán)境溫度下處理21天的來自2個供體的糞便樣本的細菌群體譜的DGGE分析。具體實施方式應注意，本文描述的用于穩(wěn)定化核酸的組合物的作用是在環(huán)境溫度下在諸如糞便樣本的生物學樣本中長期穩(wěn)定化核酸和‘快照’總DNA譜。在利用本文描述的組合物穩(wěn)定化糞便樣本包含的核酸后，在后續(xù)步驟中利用市售提取試劑盒進行諸如DNA的核酸的提取和分離。優(yōu)選地，本文描述的用于穩(wěn)定化核酸的組合物不包含離液鹽(例如，胍鹽，如硫氰酸胍(GuSCN)或鹽酸胍(GuHCl))、尿素、固定劑(例如，福爾馬林、多聚甲醛等)、還原劑、聚陽離子(如聚賴氨酸或聚丙烯酰胺)、苯酚或氯仿。不需要酶如蛋白酶(例如，蛋白酶K)、溶酶體等來實施利用本文描述的組合物進行的糞便樣本包含的核酸的穩(wěn)定化，因此優(yōu)選不被包括在本文描述的組合物中。因此，本發(fā)明的穩(wěn)定化核酸的組合物和方法避免了高成本和/或有毒化合物的使用，高成本和/或有毒化合物通常需要特殊的儲存和運輸條件。除非另外定義，本文使用的所有技術和科學術語均與本發(fā)明所屬領域技術人員的普遍理解具有相同含義。說明書和權利要求書中采用的單數(shù)形式的“一個(a)”、“一種(an)”和“所述(the)”包括復數(shù)指代，除非上下文明確另外說明。本文使用的術語“包括”將被理解意為后續(xù)列舉是非排他性的，并且可包括或可不包括任何其它另外的適當?shù)捻?，例如，如適當，一種或多種其它特征、組分和/或成分。本文使用的術語“樣本”將被理解意為任何這樣的樣品：可能包含目標物質，具體地核酸，和任選地蛋白質或其它目標生物分子。術語“樣本”可包括溶液，如水溶液、細胞、組織、活檢、粉末、或其中一種或多種的組合。樣本可以是生物學樣本，如唾液、痰、口腔拭子樣品、血清、血漿、血液、血沉棕黃層、咽部、鼻部/鼻咽部或鼻竇拭子或分泌物、喉部拭子或刮出物、尿液、粘液、糞便/大便/排泄物、直腸拭子、損傷拭子、食糜、嘔吐物、胃液、胰液、胃腸(GI)道液或固體、精液/精子、尿道拭子和分泌物、腦脊液、哺乳期或經(jīng)期產(chǎn)物、卵黃、羊水、房水、玻璃體液、宮頸分泌物或拭子、陰道液/分泌物/拭子或刮出物、骨髓樣本和抽取物(aspirates)、胸膜液和滲出液、汗液、膿、眼淚、淋巴液、支氣管或肺灌洗液或抽取物、腹膜滲出液、細胞培養(yǎng)物和細胞懸浮液、結締組織、上皮、上皮拭子和涂片、粘膜、肌肉組織、胎盤組織、活檢、滲出物、器官組織、神經(jīng)組織、毛發(fā)、皮膚、或指甲，其中前述的樣本可得自例如脊椎動物，包括哺乳動物。哺乳動物可以是例如人、非人靈長類、家畜(如牛、山羊、或綿羊)、以及狗、貓、馬等。在一個實施方式中，生物學樣本是糞便樣本，并且對象是是哺乳動物。在另一實施方式中，生物學樣本是糞便樣本，并且對象是人。其它類型的生物學樣本包括植物、植物提取物、藻類、土壤樣本、污水、廢水、水、環(huán)境樣本、食品、家畜飼料、魚飼料、動物飼料、被污染或可能傳染性的表面或設備(例如，肉類加工表面)的拭子、醫(yī)院、療養(yǎng)院、門診設施、醫(yī)療機構的‘觸摸’表面的拭子、或類似物。在再其它實施方式中，生物學樣本選自土壤樣本、污水樣本、廢水樣本、或水樣本，其中任一種可被糞便污染。本文使用的術語“微生物”(microorganism或microbe)將被理解意為任何微觀的生物體和孢子，包括所有原核生物，即真細菌和古細菌，和各種形式的真核生物，包括原生動物門、真菌(例如，酵母)、藻類和動物如輪蟲和渦蟲。例如，利用16SrRNA基因測序在人糞便中最常檢測到的細菌群包括硬壁菌門、擬桿菌門、螺旋體門(Spirochaetes)、梭桿菌門(Fusobacteria)、δ變形菌門(Deltaproteobacteria)、ε變形菌門(Epsilonproteobacteria)、α變形菌門(Alphaproteobacteria)、β變形菌門(Betaproteobacteria)、γ變形菌門(Gammaproteobacteria)、廣古菌門(Euryarchaeota)、真核生物(Eukarya)、脫硫弧菌屬(Desulfothiovibrio)、Tm7、藍藻門(Cyanobacteria)、放線菌門、疣微菌門(Verrucomicrobia)和粘膠球形菌門(Lentisphaerae)。本文使用的術語“病毒”或“病毒體”將被理解意為僅在其它生物體的活細胞內(nèi)復制的任何小型感染劑。病毒可感染從動物和植物至細菌和古細菌的所有類型的生命形式，并且?guī)缀踉诿恳环N生態(tài)系統(tǒng)中生存。當前已知21族病毒在人體內(nèi)引起疾?。合俨《究?、皰疹病毒科(Herpesviridae)、乳頭瘤病毒科(Papillomaviridae)、多瘤病毒科(Polyomaviridae)、痘病毒科(Poxviridae)、肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)、細小病毒科(Parvoviridae)、星狀病毒科(Astroviridae)、杯狀病毒科(Caliciviridae)、小RNA病毒科(Picomaviridae)、冠狀病毒科(Coronaviridae)、黃病毒科(Flaviviridae)、披膜病毒科(Togaviridae)、肝炎病毒科(Hepeviridae)、逆轉錄病毒科(Retroviridae)、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)、沙粒病毒科(Arenaviridae)、布尼亞病毒科(Bunyaviridae)、絲狀病毒科(Filoviridae)、副粘病毒科(Paramyxoviridae)、彈狀病毒科(Rhabdoviridae)、呼腸孤病毒科(Reoviridae)(和丁型肝炎，當前未分配)。病毒的遺傳物質可以是脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。通過本文描述的組合物穩(wěn)定化的核酸可以是DNA或RNA，包括mRNA或病毒RNA。在一個實施方式中，核酸是DNA。在另一實施方式中，DNA是人源、病毒源和微生物源的。在再另一實施方式中，通過本文描述的組合物穩(wěn)定化的核酸包括人類DNA和微生物DNA。本文使用的術語“環(huán)境溫度”意指生物學樣本(例如，糞便樣本)和本文描述的核酸穩(wěn)定化組合物的混合物從收集時開始，在運輸期間(可涉及相對極端溫度——盡管通常時間較短(例如，<5天))，以及在分析前長期儲存期間可遭遇的溫度范圍。在一個實施方式中，溫度是約-20℃至約60℃范圍內(nèi)的環(huán)境溫度。在另一實施方式中，環(huán)境溫度是室溫并且在約15℃至約30℃范圍內(nèi)。為穩(wěn)定化糞便樣本中包含的核酸，使糞便樣本與本文描述的水性組合物接觸形成混合物的步驟應在糞便排泄后盡快進行，并且混合物均化以形成均勻混合物應盡快進行，優(yōu)選立即進行?？傮w上，諸如唾液、血液、痰、糞便/大便、和尿液的生物學樣本中的DNA和RNA的化學穩(wěn)定化通過使用緩沖劑維持適當?shù)膒H，以及使用螯合劑防止金屬氧化還原循環(huán)或金屬離子結合至核酸磷酸骨架現(xiàn)象來實現(xiàn)。本文使用的術語“螯合劑”將被理解意為這樣的化學品：將與特定金屬離子(例如，Ca2+和Mg2+)一起形成可溶的穩(wěn)定絡合物，隔離離子以使其通常無法與其它組分如脫氧核糖核酸酶(DNA酶)或核酸內(nèi)切酶(例如，I、II和III型限制性核酸內(nèi)切酶)和核酸外切酶(例如，3’至5’核酸外切酶)——GI道中豐富的酶——發(fā)生反應。GI道中DNA酶的主要來源是胰腺以及寄居微生物的分泌物。在本發(fā)明組合物中，螯合劑(一種或多種)參與生物學樣本中的DNA酶抑制和微生物生長。螯合劑可以是例如乙二醇四乙酸(EGTA)、(2-羥乙基)乙二胺四乙酸(HEDTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、次氮基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、1,2-環(huán)己二胺四乙酸(CDTA)、N,N-雙(羧甲基)甘氨酸、三乙烯四胺(TETA)、四氮雜環(huán)十二烷四乙酸(DOTA)、去鐵胺、無水枸櫞酸鹽(酯)、檸檬酸鈉、檸檬酸鈣、檸檬酸銨、檸檬酸氫銨(ammoniumbicitrate)、檸檬酸、檸檬酸二銨、檸檬酸鐵銨、和檸檬酸鋰。這些螯合劑可單獨使用或其兩種或更多種組合使用。在優(yōu)選實施方式中，期望單獨或組合使用的、強于EDTA的螯合劑(即，在結合至金屬時解離常數(shù)高于EDTA的螯合劑)，包括但不限于，CDTA、DTPA、DOTA、TETA和去鐵胺或其螯合劑類似物，其數(shù)量為約150mM至約600mM，優(yōu)選地數(shù)量為約150mM至約500mM，還更優(yōu)選數(shù)量為約250mM至約350mM，最優(yōu)選數(shù)量為約300mM。最期望本發(fā)明組合物中的螯合劑是CDTA。EDTA是在工業(yè)、實驗室、化妝品、藥物和一些食品中廣泛使用的化學品。其應用性是基于其能夠‘螯合’金屬離子——具體地二價和更高價。CDTA較不常用于這些領域，但其與EDTA都具有螯合金屬離子的能力。重要的是，兩種螯合劑對于不同金屬離子的親和力顯著相異。K1——以對數(shù)尺度表達的親和力度量——顯示在表1(下文)中。列舉的前5種螯合劑具有不同數(shù)量和構型的附接至氮基團的羧酸酯(R-COO-)基團。在表1中，OPT作為僅基于氮基團的螯合劑顯示，以進行比較。表1中CDTA和EDTA的比較顯示其差別很大。logK1數(shù)值差異為2.3(Mg2+)；2.6(Ca2+)；2.4(Mn2+)；約3(Fe3+)；3.6(Co2+)；0.8(Cu2+)；2.9(Zn2+)。也就是說，CDTA比EDTA更緊密200至4,000倍地結合大多數(shù)金屬。表1.螯合劑對于不同金屬離子的親和力在存在同等濃度的CDTA或EDTA的情況下，CDTA的這種較強絡合金屬的能力的一個結果是任何游離金屬離子的濃度更低。然而，更重要地，可絡合至諸如核酸或蛋白質的生物分子的金屬離子數(shù)量將顯著較低。已知溶液中的核酸結合金屬離子，而移除這種金屬有可能提高其化學穩(wěn)定性。這可對于可通過從諸如雙分子氧、超氧陰離子和過氧化氫的物種獲得或失去電子以不同氧化狀態(tài)存在的過渡金屬如Mn、Fe、Co和Cu尤其重要。最后，CDTA較強的絡合金屬的能力在研發(fā)抑制生物學樣本中的核酸降解的組合物中非常有益，該生物學樣本是已知天然包含大量需要Ca2+和Mg2+來穩(wěn)定化其活性構象的DNA酶的生物學樣本，如糞便。表2：CDTA和EDTA的pK值CDTA和EDTA之間的其它差異在于實驗室或研究環(huán)境中的實際后果?？赡苡捎贓DTA的k1和k2pKa值較低(參見上表2)，制備pH7.0的二鈉形式(始于酸形式)明顯更困難。可制備比EDTA更濃的CDTA溶液。最后，與EDTA二鈉形式的有限溶解度相比，CDTA的二鈉形式易溶于乙醇。這些差異致使CDTA從制造角度來說是最佳的螯合劑選擇?？傮w上，可利用一種或多種適當?shù)木彌_劑將本發(fā)明組合物的pH維持在期望的堿性范圍內(nèi)；其中使組合物緩沖以將生物學樣本的pH維持在適當?shù)膒H，并且所述組合物在環(huán)境溫度下穩(wěn)定化所述核酸。根據(jù)一個實施方式，組合物包括25℃下的pKa值(對數(shù)酸解離常數(shù))在8.0至12.5范圍內(nèi)的一種、兩種或更多種緩沖劑(提供的非限制性實例，參見表3)以使pH維持在約9.5至約11.5的優(yōu)選范圍內(nèi)。酸解離常數(shù)，Ka，是溶液中的酸強度的定量度量。Ka值越大，溶液中的分子解離越多，從而酸越強。由于Ka值跨越多個量級，實踐中更常使用酸解離常數(shù)的對數(shù)度量，pKa。pKa值越大，任何給定pH下的解離程度越小，即，酸越弱。在活生物體中，酸-堿穩(wěn)態(tài)和酶動力學取決于細胞和機體中存在的多種酸和堿的pKa值。在化學方面，制備緩沖溶液需要了解pKa值，并且了解pKa值是定量了解酸或堿和金屬離子之間的相互作用形成絡合物的前提。本領域技術人員將理解，給定化合物/緩沖劑只有在其濃度充足和溶液pH接近(在約1個pH單位內(nèi))其pKa時才可緩沖溶液的pH。在一個實施方式中，本發(fā)明組合物的pH在約9.5至約11.5范圍內(nèi)。在優(yōu)選實施方式中，組合物的pH在約10.5至約11.5范圍內(nèi)，優(yōu)選pH為約11。緩沖劑(一種或多種)的數(shù)量可例如在約1mM和約1M之間。根據(jù)某些實施方式，組合物包括β-丙氨酸作為主要緩沖劑，以維持pH在約9.5至約11.5的期望范圍內(nèi)。為將pH維持在約11，可從表3選擇pKa在10-12范圍內(nèi)的緩沖劑。值得注意，羧酸酯(鹽)螯合劑，如CDTA和EDTA，也可貢獻在此范圍內(nèi)的緩沖能力。然而，CDTA和EDTA的pKa(k4)值(表2)存在顯著差別。EDTA的pKa(k4)較低(表2)使其可能有效協(xié)助使本發(fā)明組合物維持在期望pH范圍的下限。然而，CDTA的pKa(k4)值越高，其越適于增強β-丙氨酸(或表3列出的其它緩沖劑)的緩沖能力——在期望范圍的上限(即，pH11)。表3.本發(fā)明組合物的適當緩沖劑β-丙氨酸是特別適于本申請組合物的緩沖劑。在一個實施方式中，組合物的pH為約10.5至約11.5，并且β-丙氨酸的存在量為約10mM至約100mM、或約30mM至約70mM，最優(yōu)選存在量為約50mM。本文使用的術語“水溶性”或“水混溶性有機溶劑”將被理解意為溶解溶質(化學上不同的液體、固體或氣體)的任何含碳物質或化合物，通常是液體。水溶性有機溶劑可以是，例如，一種或多種短鏈(例如，C1-C6)烷醇(可以是直鏈的或支鏈的)，如甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、丁醇、正丁醇、戊醇、己醇、或其任意組合。在本發(fā)明組合物的一個實施方式中，優(yōu)選醇是乙醇。在另一實施方式中，水溶性有機溶劑(例如，乙醇)在組合物中存在的濃度小于約30體積％，優(yōu)選小于約24體積％，如約21.5％至約23.5體積％，最優(yōu)選約23.5體積％。在其它實施方式中，水混溶性有機溶劑可以不存在。本領域公知，變性大多數(shù)蛋白質需要多于30％的乙醇。從溶液析出DNA需要超過60％的乙醇或50％的異丙醇。純乙醇或甲醇在組織學、病理學和細胞生物學中常用作固定劑以終止生化反應。一些蛋白質可通過添加20-50％(vol./vol.)范圍內(nèi)的水混溶性有機溶劑如乙醇和丙酮而析出。乙醇造成蛋白質脫水或水活性降低，然后蛋白質之間靜電吸引、聚集和不溶。雖然不希望被理論束縛，發(fā)明人認為本發(fā)明組合物中相對小百分比的水混溶性有機溶劑具有極少至不具有固定劑特性，相反，促進生物樣本(例如，糞便)的混合和分散并提高本發(fā)明組合物可包括的其它化學化合物的溶解度。另外，關于可燃性液體的貨運/運輸，期望溶液中的有機溶劑如乙醇維持在24體積％以下以豁免危險物品運輸(TDG)規(guī)定(美國(UN)編號1170)；否則，>24％乙醇的溶液被歸類為第3類(可燃性液體)，強制特殊包裝，增加運輸復雜性和成本。本文使用的術語“洗滌劑”或“表面活性劑”將被理解意為任何這樣的兩性有機化合物：可中斷蛋白質中的非共價鍵，使其變性，和致使分子喪失其天然二級、三級和/或四級結構。適當?shù)南礈靹┛衫缡顷庪x子型洗滌劑(如，例如，十二烷基硫酸鈉(SDS)、十二烷基硫酸鋰、月桂基硫酸鈉(SLS)、月桂基硫酸銨)、陽離子型洗滌劑(季銨鹽，如，例如，西曲溴銨/十六烷基三甲基溴化銨/十六烷基-三甲基-溴化銨或CTAB、十六烷基三甲基氯銨(CTAC)、西吡氯銨(CPC)、苯扎氯銨(BAC))、兩性離子型表面活性劑(例如，甜菜堿、3-[(3-膽酰胺丙基)二甲基氨]-1-丙磺酸酯(鹽)(CHAPS)、卵磷脂)或非離子型洗滌劑(如，例如，吐溫、TritonX、或Brij)。然而，CTAB在作用于DNA時不太理想。洗滌劑可抑制DNA酶的作用——通過破壞這些酶的復合結構，促進生物學樣本在本發(fā)明組合物中的分散，和有助于增溶多種化學物種。在本發(fā)明組合物的某些實施方式中，洗滌劑是SDS。在其它實施方式中，洗滌劑(例如，SDS)在水性組合物中的存在量可以為約0-4％(w/v)，優(yōu)選約0-1％(w/v)，最優(yōu)選約0.5％(w/v)。本文使用的術語“消泡劑”將被理解意為減少或阻礙泡沫形成的化學添加劑。發(fā)明人觀察到在包含本發(fā)明組合物某些實施方式(包括洗滌劑)的管中快速和充分分散一些生物學樣本(具體地，糞便)所需的劇烈振蕩期間泡沫形成。在使用和不使用均化裝置的情況下，所述泡沫阻礙，并且在一些樣本中阻止，完全混合。消泡劑，如AntifoamA濃縮物(Sigma-Aldrich；目錄號A-5633)，作為一種活性硅酮聚合物，顯著減少所述生物學樣本和本發(fā)明組合物混合期間的泡沫形成。因此，為最小化泡沫形成，消泡劑應優(yōu)選被包括在包含洗滌劑的組合物中?？蓡为毷褂没騼煞N或更多種組合使用的適當消泡劑的其它實例包括不可溶性油、聚二甲基硅氧烷類和其它硅酮類、某些醇、硬脂酸酯和二醇。在其它實施方式中，消泡劑(例如，AntifoamA)在水性組合物中的存在量可以約0-1％(v/v)，優(yōu)選約0-0.2％(v/v)。本文使用的術語“抗微生物劑”將被理解意為與其不存在情況下的生物體生長速率相比降低生物體生長速率的物質或物質群。生物體生長速率的降低可以是至少5％，更期望至少10％，還更期望至少20％、50％、或75％，最期望90％或更多。該定義還擴展至影響生物體的生活力、毒力或致病力的物質?？刮⑸飫┛梢允翘烊?例如，源自細菌)、合成、或重組的。抗微生物劑可以是抑菌性，殺菌性、或兩者兼之的。抗微生物劑是抑菌性的——如果其抑制細胞分裂，而不影響被抑制細胞的生活力?？刮⑸飫┦菤⒕缘摹绻鋵е录毎劳?。細胞死亡通常通過在液體生長介質(例如，不存在混濁)中或在固體表面上(例如，瓊脂上不存在菌落形成)不存在細胞生長來檢測。本領域技術人員已知在給定濃度下具有抑菌性的物質或物質群可在更高濃度下具有殺菌性。本領域已知的常見抗微生物劑包括某些醇、三氯生或Irgasan、和Proclin950。任選地，本發(fā)明組合物可包括抗微生物劑，如三氯生。在其它實施方式中，抗微生物劑(例如，三氯生)在水性組合物中的存在量可以為約0-2％(w/v)，優(yōu)選約0-0.5％(w/v)。本文描述的組合物，在與生物學樣本(具體地，糞便樣本)混合時，使其中包含的核酸在環(huán)境溫度下穩(wěn)定，使得核酸在長期儲存均勻混合物后被穩(wěn)定。在一個實施方式中，生物學樣本是得自人對象的糞便樣本，并且核酸是DNA。本領域技術人員將理解，樣本中存在高分子量DNA可給出樣本中的DNA在儲存條件下穩(wěn)定的總體指示。這可通過瓊脂糖凝膠電泳評估，瓊脂糖凝膠電泳可提供高分子量DNA的品質的指示(例如，干凈帶vs拖尾)以及高分子量DNA數(shù)量的定量度量(通過密度計量學分析)。除穩(wěn)定化高分子量DNA外，本文描述的組合物還在與生物學樣本(具體地，糞便樣本)混合時使其中包含的核酸在環(huán)境溫度下穩(wěn)定，使得微生物和/或人核酸的相對豐度在長期儲存均勻混合物后維持。本領域技術人員已知的多種技術可用于確定微生物和/或人核酸的相對豐度是否得到維持，例如利用核酸擴增或雜交的技術。可用于評估微生物和/或人核酸的相對豐度是否在均勻混合物長期儲存后被維持的另一技術是PCR-DGGE分析，下文進一步詳細描述。還可采用目標16S譜(確定運算分類單位(operationaltaxonomicunits)的相對豐度(OTU’s))以及基因組DNA的全宏基因組鳥槍法測序(WMS；確定微生物基因/核酸的相對豐度)。在一個示例性實施方式中，人類DNA的穩(wěn)定化具體地可通過如下評估：確定根據(jù)本文描述的方法并且與組合物一起培育了時間(t儲存)的得自生物學樣本(如糞便樣本)的DNA是否保留支持目標人基因PCR擴增成可測產(chǎn)物的能力，更具體地PCR產(chǎn)物的擴增水平是否與在時間零時從相同均勻混合物或其它對照混合物提取和純化的DNA相似。如下文實施例中進一步描述，在T＝0和T＝t儲存時從根據(jù)本文描述的方法并且與組合物一起培育的糞便樣本純化的人類DNA可利用靶向人基因的引物在實時定量PCR(qPCR)中被擴增，并且來自T＝0和T＝t儲存純化DNA等份的Ct值變化(ΔCt)可提供人類DNA穩(wěn)定性的定量度量。ΔCt值小于約2指示人類DNA在整個儲存時期被賦予穩(wěn)定性。ΔCt值小于約1指示優(yōu)越的穩(wěn)定化。在一個實施方式中，根據(jù)本文描述的方法并且與組合物一起培育的糞便樣本中包含的人類DNA被賦予在室溫下穩(wěn)定至少7天、至少14天、至少21天、至少30天、或至少60天。在另一實施方式中，根據(jù)本文描述的方法并且與組合物一起培育的糞便樣本中包含的人類DNA被賦予在升高的溫度下(如37℃或50℃)穩(wěn)定至少7天、或至少14天。在再另一實施方式中，根據(jù)本文描述的方法并且與組合物一起培育的糞便樣本中包含的人類DNA被賦予在-20℃下穩(wěn)定至少一個月(即，30天)。在另一實施方式中，核酸是微生物DNA，并且方法穩(wěn)定化生物學樣本(例如，糞便樣本)的微生物組譜。如本文所用，術語"微生物組譜"總體上意指限定環(huán)境內(nèi)的所有微生物群體和生物分子和其相對數(shù)量。如下文進一步詳細描述，微生物組譜的穩(wěn)定性可例如通過如下確定：利用靶向細菌16SrRNA基因的引物對和變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析，對從生物學樣本和本文所述組合物的均勻混合物(在該均勻混合物在環(huán)境溫度下儲存具體時間(t儲存)后)提取和純化的DNA實施PCR。本領域技術人員將理解，可靶向具有可變區(qū)和不可變區(qū)的其它細菌基因，條件是目標物種之間存在差異。然后將所得PCR-DGGE譜與通過在時間零時以相同方式對從生物學樣本和組合物的相同均勻混合物或其它對照混合物提取和純化的DNA實施PCR-DGGE分析而得到的譜進行比較。在一個實施方式中，如果在環(huán)境溫度下(t儲存)后的PCR-DGGE譜呈現(xiàn)與T＝0時的PCR-DGGE譜至少75％的相似度(最優(yōu)選與T＝0時的PCR-DGGE譜至少82％的相似度)，可認為生物學樣本如糞便樣本的微生物組譜已在環(huán)境溫度下被穩(wěn)定化一定時間(t儲存)。在另一實施方式中，微生物組譜的穩(wěn)定性可例如通過如下確定：由從生物學樣本和本文所述組合物的均勻混合物(該均勻混合物在環(huán)境溫度下儲存具體時間后)提取和純化的DNA擴增和測序細菌16SrRNA基因(如V4高變區(qū))的可變區(qū)。然后將所得測序信息與通過對在時間零時從相同均勻混合物提取和純化的DNA或其它對照以相同方式實施擴增和測序細菌16SrRNA基因的可變區(qū)而得到的信息進行比較。本領域技術人員已知的對獲得的測序數(shù)據(jù)進行生物信息學分析的不同形式可用于評估微生物組在儲存條件下的穩(wěn)定性，如實施例中進一步詳細描述。在一個實施方式中，根據(jù)本文描述的方法并且與組合物一起培育的糞便樣本的微生物組譜被賦予在室溫下穩(wěn)定至少7天、至少14天、至少21天、至少30天、或至少60天。在另一實施方式中，根據(jù)本文描述的方法并且與組合物一起培育的糞便樣本的微生物組譜被賦予在升高的溫度下(如37℃或50℃)穩(wěn)定至少7天、或至少14天。在再另一實施方式中，根據(jù)本文描述的方法并且與組合物一起培育的糞便樣本的微生物組譜被賦予在-20℃下穩(wěn)定至少一個月(即，30天)。發(fā)明人驚訝地發(fā)現(xiàn)，緩沖至堿性pH(pH≥9.5，優(yōu)選pH11)的非常高濃度的不常使用的螯合劑CDTA可用于快速且有效地捕捉和在環(huán)境溫度下長期穩(wěn)定生物學樣本中的核酸和‘快照’總DNA譜。具體地，發(fā)明人驚訝地發(fā)現(xiàn)，緩沖至較強堿性pH(約pH10.5-11.5，優(yōu)選約pH11)的組合物顯示微生物組DNA的穩(wěn)定性相對于緩沖至較低pH值的穩(wěn)定化組合物提高。這是無法預料的，并且事實上鑒于以下是預想不到的。公知在較高pH下會促進胞嘧啶脫氨。還已知DNA在較高pH下更容易變性。DNA中的脫嘌呤位點(低頻率發(fā)生)也更容易被斷開。因此，令人驚訝地，基于瓊脂糖凝膠電泳、細菌16SrRNA基因測序和DGGE，發(fā)明人觀察到DNA/微生物組譜呈現(xiàn)在較高pH值下更加穩(wěn)定。不被理論束縛，認為穩(wěn)定性顯著提高的原因不是純“化學”的。也就是說，較強堿性pH顯示微生物組DNA穩(wěn)定性提高可能是多種原因的結合，下文提出其中一些。觀察到CDTA在本文描述的組合物中對于DNA/微生物組穩(wěn)定化而言作用遠優(yōu)于EDTA。EDTA和CDTA的4個pKa顯示在上表2中。基于這些值，這意味著在堿性pH下，隨著pH接近11，CDTA將具有3個負電荷，而EDTA將具有4個負電荷。再一次，不被理論束縛，認為CDTA與EDTA相比性能顯著更優(yōu)的原因可能是由于負電荷較少。微生物組研究的目的是穩(wěn)定化和最終從所有細胞等比例釋放DNA，優(yōu)選地從100％的細胞釋放100％的DNA。釋放的DNA的‘譜’的穩(wěn)定性可在較高pH下較優(yōu)，因為這可更接近實現(xiàn)此目的。換句話說，與pH9.5相比，在pH11下更高程度的細菌DNA可被穩(wěn)定化和最終被釋放。在DNA被釋放后，其需要受到保護以免被糞便樣本中的DNA酶降解。一些DNA酶需要金屬離子作為輔因子；其他則不需。再一次，不被理論束縛，較高pH可更有效抑制第二類DNA酶，是可能的。糞便中的未知因子(例如，抑制劑)可結合至DNA，并且將其隔離或阻止PCR擴增。較高pH可減少這些可能性中的任一者或兩者，是可能的。最后，在將糞便樣本收集到穩(wěn)定化組合物中后必須防止細菌生長。否則，DNA/微生物組的‘譜’會改變。較高pH可比較低pH(9.5)更有效抑制一些微生物物種的生長。對于復雜的、高變的固體和半固體樣本類型如糞便，還需要提供在收集時立即混合樣本與組合物的機械或物理裝置。新收集生物學樣本在本發(fā)明組合物中的快速均化和完全瓦解(disruption)確保樣本中的總DNA譜的代表性快照在環(huán)境溫度下長期穩(wěn)定。如下文實施例所示，如果本發(fā)明組合物被添加到收集的固體糞便樣本，但未充分混合，則DNA的品質相對于混合均勻的那些樣本受損。因此，為穩(wěn)定化DNA使得其代表體內(nèi)(T＝0)狀態(tài)，適當混合樣本是至關重要的。例如，從這種樣本提取然后經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳的DNA，可顯示來自一些供體的樣本中的高分子量DNA被降解。而且，如下文實施例所示，根據(jù)細菌16SrRNAPCR和DGGE分析所測，來自一些供體的糞便樣本的不充分混合導致微生物組譜發(fā)生不利變化。在很多實例中，生物學樣本收集(具體地糞便收集)最好由供體在其自己家里的隱私場所完成。在這種設定下，供體更加輕松，并且如果被提供以說明書和包含穩(wěn)定化化學劑或溶液的適當生物學樣本收集裝置或試劑盒，供體可立即收集和穩(wěn)定化新鮮生物學樣本。以這種方式收集樣本有助于確保最佳品質核酸用于后續(xù)提取和分析，并且DNA譜盡可能接近地匹配體內(nèi)狀態(tài)。然而，為在家里或遠程地區(qū)收集場地收集和穩(wěn)定化生物學樣本，供體必須被提供以簡單、安全和直觀，但高度有效的裝置，從而自己手動或物理混合其收集的樣本與穩(wěn)定化溶液。優(yōu)選地，這種混合裝置成本低并且不需要電力、設備或專門培訓。生物學樣本(例如，糞便)中的DNA在暴露于空氣后可快速降解——如果不與穩(wěn)定化溶液混合或在收集時不立即在干冰上冷凍時。與均勻液體生物學樣本(如血液和尿液)的混合不是大問題；然而，在有限量溶液和時間內(nèi)瓦解固體和半固體的非均勻生物學樣本(如糞便)可能非常有問題。通過多種混合手段(例如，玻璃/二氧化硅顆粒(≤1mm；2.65g/cm3)、玻璃/二氧化硅小球(2-4mm；2.65g/cm3)、彈珠(marbles)(12.7mm)、氧化鋁小球(7.9mm；3.95g/cm3)和氮化硅小球(7.1-7.9mm；3.21g/cm3))的大量實驗，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在包含本發(fā)明組合物的標準市售實驗或運輸管(例如，10mL圓底管(92x15.3mm)，目錄號60.610；Sarstedt)中收集的所有糞便樣本類型(1-7，基于布里斯托大便分類法(BristolStoolscale))的充分瓦解和均化可通過如下實現(xiàn)：手動與管中的內(nèi)含物——尺寸小于管內(nèi)徑(例如，12.9mm)的至少一個大型(5.6-11.1mm，優(yōu)選7.9mm)致密(7.6-15.63g/cm3)金屬小球——混合。發(fā)明人確定的標準市售實驗管的均化裝置的最佳選擇包括：1)管的形狀(例如，管內(nèi)底部或基底)匹配均化裝置的形狀(例如，圓底管用于作為至少一個混合球如不銹鋼混合球的均化裝置)以防止固體材料壓實和/或陷入管或容器中難以觸及的區(qū)域；2)對于均化裝置(例如，碳化鎢(15.63g/cm3)，不銹鋼(7.6-8.0g/cm3)可能的最致密材料的選擇；3)外徑略小于管或容器內(nèi)徑的均化裝置的選擇(例如，當均化裝置是混合球時，混合球的直徑為約4-6mm，優(yōu)選約4-5mm，最優(yōu)選約5mm，小于混合管的內(nèi)徑)；和4)樣本上方具有‘頂部空間’并且具有穩(wěn)定化溶液以允許均化裝置在手動振蕩期間獲得動量的管或容器的選擇。應注意，混合球可具有規(guī)則或不規(guī)則形狀(例如，可具有結點、尖狀物等，無需是完美球形)，并且如上所述，優(yōu)選密度是至少5.0g/cm3，最優(yōu)選至少7.6g/cm3。如果均化裝置/球相對于管過小，則樣本繞過均化裝置/球，而不在穩(wěn)定化溶液中分散。相比之下，如果均化裝置/球(例如，>11.1mm)相對于管(12.9mm內(nèi)徑)過大，則樣本不被分散或在均化裝置/球和管壁之間‘被擠壓’，均化裝置/球得不到充分動量，樣本在管一端或兩端變得密實。理想地，當均化裝置外徑(例如，7.9mm碳化鎢或不銹鋼球)正好與管內(nèi)垂直壁(例如，內(nèi)徑為12.9mm的10mL上述Sarstedt管)相差約5mm(球任一側2.5mm)時，均化裝置有效充當均化器，快速分解或瓦解收集到本發(fā)明組合物(例如，2mL)中的固體和半固體糞便樣本(例如，400mg；類型1-7)，以形成均勻液體樣本，該均勻液體樣本可容易移液或在實驗室中操作和處理。這種均化裝置確保收集的生物學樣本(甚至固體糞便)快速和充分瓦解，并且在這樣做時迅速暴露于本發(fā)明組合物。重要地，發(fā)明人確定，與管/容器相比，均化裝置的密度——不止其直徑——對于僅通過手動振蕩管以適時方式(20-30秒)實現(xiàn)樣本充分瓦解而言至關重要。由于糞便(例如，類型4)通常具有粘性、韌性，在利用球形均化裝置時，此樣本的充分均化在平底或錐底管中難以實現(xiàn)。因此，圓底管用于球形均化裝置表現(xiàn)最佳。本發(fā)明提供新型通用方法和組合物，用于在環(huán)境溫度下穩(wěn)定化總DNA(具體地復雜的非均勻的生物學樣本中)以備后續(xù)用于人和動物醫(yī)學診斷和臨床研究(例如，疾病和感染診斷、微生物在人健康中的作用、研究微生物進化的群體基因組學、毒力、藥物抗性和流行病學)、食物安全性(食物/肉類加工廠)、土壤和廢水取樣(環(huán)境檢測)、生物安全或生物防御(生物武器)、動物飼料檢測、植物和動物科學/工業(yè)，等)。研究人員和臨床醫(yī)生的新的并且快速擴張的關注點是腸小生物群或消化道微生物組。健康供體糞便中的微生物譜如何區(qū)別于患病個體？人消化道微生物組的操縱可有益于健康？基于研究、環(huán)境、和經(jīng)濟原因，對多種家畜(尤其被飼養(yǎng)提供肉類和乳制品的那些動物)的瘤胃中的數(shù)千種不同微生物的分析也存在濃厚興趣。本發(fā)明簡化和加快了生物學樣本收集和制備，提供高品質樣本用于人、動物和微生物DNA的后續(xù)檢測，而無需在運輸或儲存期間維持冷鏈。本發(fā)明可用于a)具有高通量或自動系統(tǒng)的中心實驗室或測試機構，b)具有最低程度實驗室基礎設施和設備的農(nóng)村或流動診所，和c)無電力的遠程位置。另外，生病和潛在傳染性個體不必前去診所或醫(yī)院以提供生物學樣本，最小化傳染性疾病的傳播，促進發(fā)病(outbreak)控制和監(jiān)視，和能夠實現(xiàn)患者治療響應的快速評估和監(jiān)測。本文描述的封閉的收集和均化系統(tǒng)/試劑盒制造成本低并且不需要購買另外的實驗室設備(例如，渦流器)。最重要地，手動振蕩包含本發(fā)明組合物、一個或多個均化小球、和甚至硬質的糞便(1-2類，布里斯托大便分類法)樣本的封蓋管可實現(xiàn)樣本在數(shù)秒內(nèi)充分瓦解，產(chǎn)生均勻的混合物。供體自行收集減少了感染的傳播和與其它供體樣本潛在交叉污染。顯然，這種樣本收集和均化過程可由無實驗室或臨床經(jīng)驗的業(yè)外人士在其自己家里的隱私場所進行，很大程度上提高了供體參與性和依從性。對于下游測試結果質量重要的是，本發(fā)明能夠實現(xiàn)“新制”生物學樣本被安全收集和穩(wěn)定化，大幅減少在原生物學樣本或未處理生物學樣本運送到測試機構期間和/或在可變儲存條件期間觀察到的降解。至關重要地，本發(fā)明向研究人員和臨床醫(yī)生提供迫切需要的穩(wěn)定化的代表性生物學樣本，從該生物學樣本中可提取無偏DNA。無偏DNA輸入——即消化道微生物組在樣本收集時的代表性快照——將增強下游分析的品質和準確度，實現(xiàn)對象間和對象內(nèi)差異以及研究間差異的更準確比較性評估，以研究健康和疾病人腸微生物群體變異。完整、無偏、富集的高分子量DNA對于宏基因組文庫構建和完整遺傳途徑表征至關重要——通過基于序列或基于功能篩選的方法。另外，生物學樣本中DNA的過度降解降低鳥槍法測序的效率。僅在最近幾年，關于新制糞便中的細菌群體，對從糞便提取的DNA的種系發(fā)生組成給予了大量關注。通常的做法是——主要出于實際的原因——在收集后冷凍糞便樣本，和在高度可變的時間后，提取DNA用于下游分析，如測序或定量PCR(qPCR)。然而，至關重要地，已公開的研究之間和之內(nèi)呈現(xiàn)相當?shù)娜缦伦兓裕?)排便和‘新制’糞便冷凍之間的時間；2)運輸條件和持續(xù)時間；3)分析前冷凍糞便的時長；4)用于解凍冷凍糞便的時長和溫度；和5)分離和處理第一等份的DNA前距收集的可變時間。在這些研究中，T＝0表示這些被收集、冷凍和通常儲存的樣本被解凍以備處理的時間，而非排便時間。然而，在人小生物群的宏基因組研究中，研究明確顯示，糞便樣本的儲存條件可不利地影響推斷的群體組成。例如，Bahl等(2012)利用靶向大細菌群的16SrRNA基因的qPCR和6種不同引物對證明：提取前在-20℃下冷凍53±5天的糞便樣本影響最主要的兩門(即硬壁菌門和擬桿菌門，消化道微生物學中常用的生物標志物)之間的比例。具體地，硬壁菌門與擬桿菌門的16SrRNA基因之比在冷凍過的糞便樣本中——與未冷凍過的相同樣本相比——明顯較高。迫切需要一定手段來捕捉或快照被收集的糞便樣本中的原始或體內(nèi)微生物群落的至少三個關鍵方面，穩(wěn)定化i)每種微生物的豐度，ii)整個群體的豐富度，和iii)總微生物DNA譜。來自復雜糞便樣本的總基因組細菌DNA的有效且無偏的穩(wěn)定化(和提取)是對消化道內(nèi)細菌群體的分子基礎研究的至關重要的第一步驟，例如，生成代表供體體內(nèi)狀態(tài)的微生物組譜。具體地，微生物群體的研究需要在收集后立即捕捉小生物群譜的“快照”。很明顯現(xiàn)場收集糞便樣本是不實際，成本高和不可規(guī)模擴大的(notscalable)(McInnes&Cutting，2010)。本領域還公知，與樣本收集相關的問題導致結果不符和再現(xiàn)性低。此外，固體樣本的處理提出自動化挑戰(zhàn)，增加成本和限制縱向研究的尺寸。為消除所有實驗室研究之間和之內(nèi)的強偏差，需要開發(fā)和實施標準化的或通用的方法，用于在運輸和長期儲存期間經(jīng)歷不利的通常極端的溫度之前、在收集時收集和穩(wěn)定化生物學樣本。本發(fā)明的在樣本收集時使液體至硬質固體范圍的生物學樣本(具體地，類型多樣、復雜、非均勻的樣本)在有效DNA穩(wěn)定化組合物中均化的方法確保整個樣本中DNA最大限度的完整性，盡可能接近地代表體內(nèi)狀態(tài)。當前，很多研究招募供體以收集糞便樣本，并且在運輸期間不提供穩(wěn)定化手段或需要使用冰袋。人類微生物組項目(HumanMicrobiomeProject，HMP)——國家衛(wèi)生研究院(NationalInstitutesofHealth，NIH)路線圖(Roadmap)發(fā)起的項目——發(fā)起了表征人類微生物組和分析其在人健康和疾病中的作用的研究。所有參與HMP核心微生物組取樣研究的成員必須遵守概述自GI道樣品收集(參見第7.3.3章)等的程序手冊(McInnes&Cutting，2010)。對象被提供以糞便收集試劑盒并被要求在將樣品返回診所前的24小時時間內(nèi)收集糞便樣品。HMP試劑盒包括類似于大黃油盒的兩個糞便收集容器(一個備份)、熱安全貨運容器(硬紙板箱中的大苯乙烯泡沫塑料箱)、用于運輸樣品(在約4℃下)的8-10個冷藏包(polarpack)、說明書、標簽、和其它包裝材料。在收集樣品前，對象必須將凝膠包裝置于其冷凍裝置中至少12小時。將糞便直接置于收集容器中，加蓋，并將整個容器密封在Ziplock袋中，然后封裝在被8-10個冷凍凝膠包裝完全包圍的苯乙烯泡沫塑料箱中。將苯乙烯泡沫塑料箱封閉，密封在硬紙板箱中，對象將該龐大包裝物運輸至臨床實驗室?，F(xiàn)有的對新制樣品封裝在冰或干冰上、密封在龐大苯乙烯泡沫塑料和硬紙板容器/冷卻器中進行貨運的冷鏈要求是非常高成本的，甚至抑制研究人員進行需要中等到大量供體的研究。簡單地，使用美國境內(nèi)的UPS次日送達服務，市售糞便收集容器在硬紙板貨運箱或外包裝(16x13x14英寸)內(nèi)、苯乙烯泡沫塑料容器中、由冷凍冰袋包圍的貨運的成本為每個約$175。該估價未考慮糞便收集容器和任何貨運材料的成本。而且，很多測試機構要求生物學樣本在干冰上進行貨運，這使該貨運估價又增加可觀的考慮成本。一旦實驗室收到這些大型貨運容器，工作人員必須立即拆封并迅速處理生物學樣本或將收集容器置于大型儲存冷凍裝置，直到可進行批量處理。相比之下，本發(fā)明降低了大部分的當前貨運成本和不便，并且最重要地，確保收集的生物學樣本中的DNA在環(huán)境溫度下收集時被穩(wěn)定化。從供體角度而言，在其家里的隱私場所收集生物學樣本，將小部分樣品轉移至已包含穩(wěn)定化溶液的常見管或容器，將管加蓋，并手動振蕩混合，將管密封在生物危害袋中，并在氣泡封袋或小盒子里以目前成本的一小部分郵寄至測試機構。實施例材料和方法以下通常的材料和方法用于下文實施例，除非其中指定不同條件。糞便樣本收集給予每一位健康供體下列收集用品：a)糞便收集容器(坐在馬桶上)；b)約400mg容量糞便收集注射器(即，尖端截斷、活塞調節(jié)至400mg收集體積的3mL注射器)；c)包含本發(fā)明組合物(2mL)和各種均化裝置(例如，7.9mm不銹鋼球軸承，420/440SSGrade25，AimarkTraversLTD、或下文注明的其它裝置)的圓底Sarstedt管(10mL圓底管(92x15.3mm)，目錄號60.610；Sarstedt)；和d)糞便收集說明書。在收集之前和之后將管稱重，確定糞便樣本實際收集量。要求每一位供體將注射器尖端用糞便填充至標示體積(400mg)并將糞便樣本轉移至管。為樣本充分均化，將管手動振蕩20-30秒。由本發(fā)明組合物中糞便樣本進行DNA提取除非另外說明，將400mg糞便轉移至包含2mL本發(fā)明組合物(下文在實施例中指明)和7.9mm不銹鋼球軸承的Sarstedt管(10mL圓底管(92x15.3mm)，目錄號60.610；Sarstedt)。利用若干市售DNA分離試劑盒容易從250μL等份的收集和儲存在本發(fā)明組合物中的糞便樣本提取DNA。發(fā)現(xiàn)本發(fā)明組合物中的糞便樣本可與DNA分離試劑盒(MOBIOLaboratories，Inc.，目錄號12888-100)、PowerFecalTMDNA分離試劑盒(MOBIOLaboratories，Inc.，目錄號12830-50)、結合珠跳動(bead-beating)的ZymoResearchFecalDNAMiniPrep(ZymoResearch，目錄號D6010)、QIAampDNA糞便微型試劑盒(Qiagen，目錄號51504)和PSPSpinFecesDNAPlus試劑盒(Invitek，目錄號1038110200)兼容。按照DNA分離試劑盒說明書，執(zhí)行下列程序[注意：刪除65℃加熱步驟]：1.向提供的PowerBead管，加入750μL小珠溶液和本發(fā)明組合物中的250μL糞便樣本。將管溫和地渦流混合。2.加入60μL溶液C1，并將管倒置幾次或短暫渦流。3.將PowerBead管固定在渦流器適配器上，并以最大速度渦流10分鐘。4.將PowerBead管在10,000xg下離心30秒。5.將上清液轉移至干凈的2mL收集管(已提供)。6.加入250μL溶液C2，并將管渦流5秒，然后在4℃下培育5分鐘。7.將收集管在13,000xg下在室溫離心1分鐘。8.避免成粒，將上至但不多于600μL的上清液轉移至干凈的2mL管。9.加入200μL溶液C3，并將管短暫渦流，然后在4℃下培育5分鐘。10.將管在13,000xg下在室溫離心1分鐘。11.避免成粒，將上至但不多于750μL的上清液轉移到干凈的2mL管中。12.在使用前混合溶液C4。將1200μL的溶液C4加入上清液，并將管渦流5秒。13.將675μL上清液加載到旋轉過濾器上并在13,000xg下離心1分鐘。丟棄通過流，并再將675μL上清液加入旋轉過濾器并在13,000xg下離心1分鐘。將其余上清液加載到旋轉過濾器上并在13,000xg下離心1分鐘。14.將500μL溶液C5添加到旋轉過濾器上并在13,000xg下在室溫離心30秒。丟棄通過流。15.在13,000xg下在室溫再次離心1分鐘。16.將旋轉過濾器小心地置于干凈的2mL收集管(已提供)中。17.將100μL溶液C6添加到白色過濾膜的中央。18.將管在13,000xg下在室溫離心30秒。19.冷凍儲存DNA(-20至-80℃)。純化樣本中DNA濃度的確定A.DNA濃度的吸光度測定260nm下的吸光度測量(A260nm)常被用于定量DNA。在260nm下1.0的吸光度對應于50ng/μL濃度的純雙鏈DNA。利用NanoDrop2000c分光光度計(ThermoFisherScientificInc.)確定在各種條件下經(jīng)過或不經(jīng)本發(fā)明組合物處理的純化糞便樣本的DNA收率。將2μL體積的各DNA樣本置于底座上并經(jīng)220nm至350nm掃描，并測量在230nm、260nm和280nm下的吸光度。通過NanoDrop2000c軟件報告樣本DNA濃度(ng/μL)、A260/A280比和A260/A230比。通過樣本濃度乘以各自的DNA洗脫體積，計算每份樣本的總DNA收率。B.DNA濃度的熒光法測定采用A260nm的缺點包括(i)分析的不靈敏性和(ii)非DNA組分如RNA的干擾，特別是在非高度純化的樣本中。利用熒光染料(200x；Invitrogen，目錄號P7581)定量純化樣本的DNA收率；利用LambdaDNA(Invitrogen，目錄號25250-010)生成標準曲線[一式三份；0-50ng/μL]。是熒光雙鏈DNA結合染料(485nm激發(fā)/535nm放射)，其能夠靈敏地定量亞納克數(shù)量的雙鏈DNA(dsDNA)。在黑色平底96孔微平板(GreinerBio-One，目錄號655209)中處理三等份各純化樣本和LambdaDNA標準品，并利用InfiniteM200微平板讀取器(TECAN)測量熒光。儲存在穩(wěn)定化組合物中的樣本中的DNA的完整性基于通過PicoGreen(上述)確定的濃度，將等份的各純化樣本稀釋至10ng/μL。為評估DNA完整性，將約80ng各稀釋的純化糞便樣本在100伏特下通過電泳在1％瓊脂糖凝膠上分離30分鐘。將凝膠在室溫下在蒸餾水中的1μg/mL溴化乙錠(EtBr)中染色15分鐘，沖洗并在UV透射器上利用DigiDoc-ITTM成像系統(tǒng)(UVPLLC)照相。當凝膠上的染色帶清晰并且與DNA梯相比>23Kb時，確定DNA被穩(wěn)定化并且完整。1Kb+DNA梯(LifeTechnologies，目錄號10787-018)或LambdaDNA/HindIII片段(LifeTechnologies，目錄號15612-013)用作尺寸參考。a.制備1％瓊脂糖凝膠(80mL1xTAC+0.8g瓊脂糖)。b.向8μL的10ng/μL純化樣本添加2μL的5x加載緩沖劑。c.向制備的1％瓊脂糖凝膠的孔中加載10μL制備樣本(步驟b)；5μLLambdaDNA/HindIII片段和/或5μL1KbDNA梯。d.使凝膠在100V下運行30分鐘。e.將凝膠在EtBr(500μL1mg/mLEtBr+500mL水)中染色15分鐘。f.使凝膠在水中脫色5分鐘。g.在UV下拍攝圖像。變性梯度凝膠電泳(DGGE)為準確并且可再現(xiàn)地評價各種微生物組(糞便、唾液、痰、皮膚等)在本發(fā)明組合物中的穩(wěn)定性，采用被稱為變性梯度凝膠電泳(DGGE)的新方法。這種方法基于如下思路：如果獲取了細菌16SrRNA基因的可變區(qū)(在本例中為V3區(qū))并利用PCR和側翼保守區(qū)引物將其擴增，則擴增子將具有細菌物種獨特的熔點(甚至核苷酸差異將影響熔融，因此提供不同譜)。當這種方法應用于包含多個細菌物種的樣本時，利用保守引物的擴增將產(chǎn)生擴增子陣列，其中全部擴增子都具有大致相同的長度，但在非保守區(qū)中具有不同的核苷酸組成。接下來，使這些擴增子在包含梯度變性溶液(尿素和甲酰胺)的凝膠上運行。擴增子將在凝膠上的不同階段變性——取決于其核苷酸組成，因此提供樣本中存在的所有物種的解析(resolution)。為不使DNA擴增子變性成單鏈形式，將～30核苷酸CG夾加入正向引物，其阻止擴增子在可變區(qū)變性后在凝膠上遷移?？傮w上，凝膠上40％-60％變性梯度提供了良好的帶解析度，同時捕捉大部分消化道物種。為促進擴增子變性并且使凝膠在整個運行過程中維持同等溫度，使凝膠在恒定60℃下運行。利用SyngeneGeneTools軟件(4.03.00版，Syngene)分析DGGE凝膠圖像。利用半徑為30像素的滾盤法(rollingdiscmethod)減去圖像背景。手動檢測和設置泳道。將Rf起始和結束位置和角度設置成手動，以在凝膠中針對“微笑(smiling)”進行調節(jié)。自動檢測每個泳道的待分析帶；峰檢測設置在默認情況(最小寬度7像素，最小峰高度3，和最小峰體積1％)下。設定公差為1％，利用匹配參數(shù)菜單下的"譜"類型匹配譜。譜比較產(chǎn)生自動生成的相似度矩陣，其中相似度值在0至100范圍內(nèi)。一般來說，關于相似度％，這意指兩個譜之間的任何變化，通常是帶強度差異。因此，相似度％提供了物種豐度差異的度量。當譜之間不存在帶時，比起該帶強度只是減少時，對相似度％的影響更高。圖1所示DGGE凝膠示例了兩個不同供體的糞便樣本的微生物組譜可呈現(xiàn)怎樣的差異；第一糞便樣本(供體A)和第二(供體B)樣本之間僅存在22％相似度。PCR-DGGE按照下文描述的程序進行。用于DGGE的PCR擴增(利用正向引物上具有5’夾的16S引物)a.將2μL的10ng/μLDNA加入12條-PCR管。b.制備MasterMix(98μL/反應ion)：76.7μL水、10μL10xPCR緩沖劑、4μL50mMMgCl2、2.5μL10mMdNTPs、2μL10pmol反向引物(PPUN518R，5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3')、2μL10pmol正向引物(PRBA338F，5'-CGCCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3')、和0.8μL5U/μLTaq。c.將98μL主混合物加入各管。d.在常規(guī)PCR機器上運行PCR：92℃下2分鐘，1個循環(huán)；在92℃下60秒，在55℃下30秒，在72℃下60秒，28個循環(huán)；然后在72℃下6分鐘，1個循環(huán)。PCR擴增子的DGGEa.制備40％和60％變性溶液中的8％丙烯酰胺/Bis凝膠的原液：b.按照DCode系統(tǒng)(Bio-Rad)的說明書，組裝玻璃板和間隔器。c.為利用40％和60％變性溶液制備和灌注具有平行梯度的8％丙烯酰胺/Bis凝膠，采用下列程序：·將20mL40％和60％變性溶液量入2個單獨的燒杯，該燒杯分別標記“低密度”和“高密度”；·將200μL10％過硫酸銨(APS)加入各溶液；·將20μLTEMED加入各溶液；·通過旋流充分混合溶液；·將各溶液裝入單獨的20mL注射器；·將注射器附接至凝膠加載設備，其中指定的“低密度”或“高密度”頂部裝料；·注意：帶有1.0mm間隔器的16x16cm凝膠的體積調節(jié)設置為18.5mL；·將Y型管附接至各注射器，管另一端具有針；·將針置于玻璃板之間；·通過轉動轉輪使得梯度有時間平穩(wěn)起來，緩慢并且一致地灌注凝膠；·使凝膠聚合幾小時；·用水沖洗Y型管。d.利用1xTAE緩沖劑，將凝膠運行系統(tǒng)預熱至55℃。e.將8μLFermentas6x加載燃料加入至42μLPCR產(chǎn)物。f.使凝膠在200V下運行5分鐘，然后開啟再循環(huán)泵，從而使樣本脫離孔并進入凝膠。g.在再循環(huán)泵開啟的情況下，使凝膠在70V下運行14小時。h.將凝膠在1xSybrGold中染色30分鐘(250mL1xTAE+25μL10,000xSybrGold)。i.使凝膠在1xTAE中脫色5分鐘。j.在UV下拍攝圖像。利用通用引物(V3區(qū))進行16SrRNAPCR，然后利用DCode通用突變檢測系統(tǒng)(DCodeUniversalMutationDetectionSystem)(Bio-Rad)進行DGGE。16SrRNA測序實施16SrRNA測序文庫制備、測序和生物信息學分析。利用(250個循環(huán))進行V4高變區(qū)配對末端擴增子測序。利用QIIME和自定義腳本，對序列進行品質過濾。將配對末端讀取結果組合，并針對Greengenes參考數(shù)據(jù)庫進行檢索，通過UCLUST以97％聚類。在數(shù)據(jù)標準化后，利用對OTU(運算分類單位)豐度數(shù)據(jù)的加權Unifrac(利用樣本之間的分類豐度差異——利用配對標準化，通過差異之和除以全部豐度之和)和未加權Unifrac關聯(lián)(incidence)數(shù)據(jù)(僅考慮分類存在/不存在)，測量樣本-與-樣本的差距。來自儲存在本發(fā)明組合物中的純化糞便樣本的人類DNA的擴增在實時或定量PCR(qPCR)中，利用靶向單拷貝人胸苷酸合成酶基因(TYMS位點；NM001071.2)的引物，評價收集到本發(fā)明組合物(下文詳述)并且在總DNA提取(MoBioPowerSoil或PowerFecalDNA分離試劑盒)前在室溫下儲存2周的糞便樣本中的人類DNA的穩(wěn)定性。關于各反應，在包含下列的25μL體積中擴增50ng純化DNA：1xPCR緩沖劑(20mMTris，50mMKCl)、2mMMgCl2、200μMdNTPs(Invitrogen)、50μg/mLBSA(SigmaAldrich)、1μMSYTO9染料(Invitrogen)、各0.4μM的引物hTSm143F(5’-GCCCTCTGCCAGTTCTA-3’)和hTSm143R(5’-TTCAGGCCCGTGATGT-3’；Invitrogen)、1UTaq聚合酶(Invitrogen)。TS143靶的擴增條件為：在95℃下5分鐘，1個循環(huán)；在95℃下20秒，在55℃下20秒，在72℃下30秒，35個循環(huán)；然后在72℃下10分鐘，1個循環(huán)。熔融曲線程序包括下列和由下列組成：1個循環(huán)，在95℃下30秒——升溫速率為4.4℃/秒(無采集)，在72℃下10分鐘——升溫速率為2.2℃/秒(無采集)，在95℃下——升溫速率為0.11℃/秒(連續(xù)采集)。將三份DNA樣本在CorbettRotorgeneRG-6000中運行，并利用Rotorgene6000系列軟件1.7計算各樣本的Ct值。Ct值意指擴增曲線跨過檢測閾值時的分數(shù)循環(huán)數(shù)。通過設置閾值線和計算各樣本曲線的交叉點，建立各樣本Ct值。閾值線在運行的指數(shù)階段設置，顯著高于背景水平以避免噪聲并且低于后續(xù)循環(huán)中的信號平穩(wěn)期發(fā)生水平。總體上，Ct值與樣本中的DNA數(shù)量成反比.，ΔCt表示在不同時間(例如，樣本收集后T＝0和T＝14天)取自相同樣本的兩等份產(chǎn)生的Ct值差異。實施例1-用于穩(wěn)定化糞便樣本中的DNA的組合物中不同螯合劑的比較由于糞便中有大量核酸酶(大部分是細菌來源)，發(fā)明人在研發(fā)本發(fā)明組合物的過程中采用不同螯合劑及其濃度進行了實驗。本實施例描述的組合物包含23.5％乙醇、0.5％SDS和0.1％AntifoamA，以及不同量的EDTA或CDTA，通過50mMβ-丙氨酸緩沖至pH11。在本實施例和后續(xù)實施例中，乙醇和AntifoamA的百分比以(％v/v)表示，并且其它組分(SDS，三氯生)的百分比以(％w/v)表示。參考圖2，由健康供體收集糞便，并將400mg樣本在不同穩(wěn)定化溶液中均化或在不存在穩(wěn)定化緩沖劑(未穩(wěn)定化)的情況下在室溫下(RT，19-23℃)儲存14天，然后利用市售試劑盒(PowerSoil或PowerFecalDNA分離試劑盒，MoBio)進行DNA提取。比較純化DNA在T＝0和T＝14天時的品質或完整性，瓊脂糖凝膠清楚顯示未經(jīng)處理的糞便中的高分子量DNA在RT儲存期間顯著降解(對照，瓊脂糖凝膠的最后兩個泳道)，在凝膠上形成拖尾。來自相同供體糞便的樣本(400mg)還被均化在下列中：1)本發(fā)明組合物，包括遞增量的CDTA(150、300、500mM)；和2)本發(fā)明組合物，其中用EDTA(150、300、500mM)替代CDTA。令人驚訝地，在關于糞便樣本的所有測試濃度(150、300、500mM)下，無論在新收集的樣本中(T＝0)還是RT暴露14天后，對于穩(wěn)定化高分子量DNA而言，CDTA的表現(xiàn)都顯著優(yōu)于EDTA(圖2)。事實上，EDTA意想不到地在超過150mM的濃度下不利于穩(wěn)定化(和提取)高分子量DNA，但CDTA不是。另外，較高濃度(150、300和500mM)的EDTA和CDTA的比較(表4)證實了如下驚人的發(fā)現(xiàn)：對于穩(wěn)定化微生物組譜而言，CDTA優(yōu)于EDTA——通過細菌16SrRNA基因的PCR和擴增子的DGGE分析示例，如上文材料和方法章節(jié)所述。在RT下14和30天后，來自在具有CDTA的本發(fā)明組合物中儲存的糞便樣本的DNA維持與在T＝0時處理的對照樣本高百分比的相似度。相比之下，來自在代用EDTA的本發(fā)明組合物中儲存的相同糞便的DNA的微生物組譜顯示，與對照樣本(在T＝0時處理；表4)相比，相異度隨著在RT下時間過去而增加，。表4.在螯合劑濃度遞增的組合物中儲存的糞便的微生物組穩(wěn)定性。因此，CDTA在其穩(wěn)定化完整、高品質、高分子量DNA和快照復雜非均勻糞便中的微生物組譜的能力方面令人驚訝地勝過EDTA。因此，解離常數(shù)高于EDTA的螯合劑如CDTA提供DNA在生物學樣本(如糞便樣本)中最佳的穩(wěn)定化，并且特別優(yōu)選用于本文描述的組合物。這種在樣本收集時穩(wěn)定化樣本的能力將有助于消除當前在各實驗室研究之間和之內(nèi)可見的強烈偏差。實施例2-pH和螯合劑在本發(fā)明組合物中的糞便樣本穩(wěn)定性中的作用考察糞便樣本混合、pH和螯合劑濃度之間的復雜關系對于微生物組譜穩(wěn)定性的影響——通過細菌16SrRNA基因的PCR和擴增子的DGGE分析示例。在四個實驗的第一個實驗中，健康供體收集糞便，并將400mg糞便轉移到四個管中，每個管包含一個7.9mm不銹鋼球和2mL組合物“104BpH9.5”(300mMCDTA、23.5％乙醇、0.5％SDS、0.1％AntifoamA，pH9.5)或“104BpH11”(300mMCDTA、50mMβ-丙氨酸、23.5％乙醇、0.5％SDS、0.1％AntifoamA，pH11)。使管中的樣本維持靜置(不混合)或通過手動振蕩均化(混合)，然后在環(huán)境溫度條件下送回實驗室。在樣本收集3-4小時內(nèi)，將250μL等份從各管取出用于DNA提取(T＝0)，然后使樣本應激(stressed)——在30℃下儲存24小時，然后在-20℃下儲存11天(T＝11)，然后由第二等份進行DNA提取。定量純化的DNA，然后利用DGGE分離16SrRNA基因PCR擴增子而作為細菌群體譜或指紋進行解析。分別利用SyngeneGeneTools軟件計算，與針對各組合物在T＝0時的對照樣本相比，樣本(DGGE凝膠上的泳道)之間的相似度百分比(參見材料和方法)。圖3示例在本發(fā)明組合物的pH從9.5增加至11時‘第11天不混合’樣本和‘第0天混合’樣本之間的提高的相似度百分比或微生物組譜穩(wěn)定性，表明pH11與pH9.5相比提供額外的DNA穩(wěn)定性。而且，采用當前均化裝置——致密的鋼球——的管中的‘第11天混合’樣本，在兩種測試pH值下，并且尤其在pH11下，總是導致微生物組譜穩(wěn)定性相對于‘第11天不混合’樣本提高。在第二個實驗中，涉及pH和CDTA濃度之間的關系。將健康供體糞便等份(400mg)轉移到管中，該管包含7.9mm不銹鋼金屬球和2mL下列三種組合物中的一種：1)104BpH9.5(如上)；2)50mMCDTA、50mMβ-丙氨酸、23.5％乙醇、0.5％SDS、0.2％三氯生、0.1％AntifoamA，pH11.5；和3)50mMCDTA、23.5％乙醇、0.5％SDS、0.2％三氯生、0.1％AntifoamA，pH9.5。通過手動混合使樣本均化，并將其在環(huán)境溫度條件下送回實驗室，其中收集T＝0等份(250μL)并提取DNA。其余樣本在室溫下儲存4和14天，并且在每個時間點取出等份并提取DNA。瓊脂糖凝膠電泳表明，pH9.5下的300mMCDTA組合物(104BpH9.5)使高分子量DNA穩(wěn)定至少14天，并且顯示高分子量DNA的穩(wěn)定化優(yōu)于pH9.5或11.5下包含50mMCDTA組成的其它兩種組合物(數(shù)據(jù)未顯示)。然而，完整高分子量DNA的存在并不一定表明實現(xiàn)了微生物組快照。在不存在有效穩(wěn)定化溶液的情況下，細菌物種可復制或死亡，而沒有改變DNA總量以及其品質。因此，通過細菌16SrRNA基因的PCR和擴增子的DGGE分析考察樣本的微生物組譜，如上文材料和方法章節(jié)所述。參考圖4和表5，DGGE分析揭示，pH9.5的300mMCDTA組合物呈現(xiàn)微生物組譜(與t＝0對照相比，94-96％相似度)在室溫下至少14天的優(yōu)越穩(wěn)定化。pH9.5的300mMCDTA組合物在穩(wěn)定化微生物組譜方面的有效性令人驚訝地優(yōu)于pH9.5的50mMCDTA組合物，pH9.5的50mMCDTA組合物在室溫下14天后與t＝0對照相比呈現(xiàn)僅15％相似度。具有50mMCDTA的pH11.5組合物看起來在一定程度上‘挽救’在具有50mMCDTA的pH9.5組合物中所見到的每個微生物組譜的顯著DNA降解。因此，穩(wěn)定化糞便樣本的微生物組譜需要高濃度CDTA和顯著堿性pH的組合。表5：在室溫下在各種組合物中儲存14天的糞便樣本的微生物組譜分析。在第三個實驗中，進一步涉及本發(fā)明組合物的pH和CDTA濃度之間的關系。將健康供體糞便等份(400mg)轉移到包含7.9mm不銹鋼金屬球和2mL以下兩種組合物其中之一的管中：1)300mMCDTA、23.5％乙醇、0.5％SDS、0.2％三氯生、0.1％AntifoamA，pH9.5；和2)50mMCDTA、23.5％乙醇、0.5％SDS、0.2％三氯生、0.1％AntifoamA，pH7.4。將樣本通過手動混合均化并在對T＝0等份(250μL)進行收集和DNA提取的環(huán)境條件下送回實驗室。其余樣本在室溫下儲存4天，然后取出并處理第二等份。瓊脂糖凝膠電泳揭示，在RT下經(jīng)過4天后，pH9.5的300mMCDTA組合物致使糞便中的完整高分子量DNA穩(wěn)定化的程度高于pH7.4的50mMCDTA組合物，并且DGGE分析指示，這種組合物還呈現(xiàn)較優(yōu)的糞便微生物組譜穩(wěn)定化(分別相對于T＝0的97％相似度vs相對于T＝0的10％相似度，參見圖5和表6)。與pH7.4組合物一起均化的糞便的微生物組譜穩(wěn)定性(在RT下4天后相對于T＝0的10％相似度)也顯著低于與pH9.5的50mMCDTA組合物一起均化的糞便的微生物組譜穩(wěn)定性(在RT下4天后相對于T＝0的91％相似度，如上所述)。表6：在室溫下在各種組合物中儲存4天的糞便樣本的微生物組譜分析。在第四個實驗中，涉及在本發(fā)明組合物的固定高濃度的CDTA下pH之間的關系。將健康供體糞便等份(400mg)轉移到包含7.9mm不銹鋼金屬球和2mL以下兩種組合物其中之一的管中：1)300mMCDTA、23.5％乙醇、0.5％SDS、0.2％三氯生、0.1％AntifoamA，pH7.4；和2)300mMCDTA、23.5％乙醇、0.5％SDS、0.2％三氯生、0.1％AntifoamA，pH9.5。將樣本通過手動混合均化，并在T＝0、24小時和9天時對等份(250μL)進行收集和DNA提取的環(huán)境條件下送回實驗室。瓊脂糖凝膠電泳證明，相比于與近中性pH條件(pH7.4)的組合物混合的糞便樣本，與pH9.5的組合物混合的糞便樣本呈現(xiàn)較優(yōu)的高分子量DNA穩(wěn)定化——即使在存在高(300mM)濃度的CDTA時(參見圖6)。結合實施例1所示結果，這些實驗表明，在室溫儲存期間保全完整高分子量DNA和穩(wěn)定微生物組譜的最佳條件存在于在組合物的pH高于或等于9.5，優(yōu)選為約pH10.5-11.5或約pH11，和CDTA濃度高于50mM，優(yōu)選為至少約150mM，最優(yōu)選約300mM之時。實施例3–與玻璃珠和不銹鋼小球混合后糞便的穩(wěn)定化將健康供體糞便以400mg等份轉移到四個管中，該管包含：1)2mL穩(wěn)定化溶液104BpH9.5(如上限定)和四個4mm玻璃珠加十個2mm玻璃珠；2)2mL穩(wěn)定化溶液104BpH11(如上限定)和四個4mm玻璃珠加十個2mm玻璃珠；3)2mL穩(wěn)定化溶液104BpH9.5和一個6mm不銹鋼球；4)2mL穩(wěn)定化溶液104BpH11和一個6mm不銹鋼球。四個管全部由供體手動振蕩直到混合，并在環(huán)境條件下帶回實驗室。在樣本收集3-4小時內(nèi)，對DNA進行提取、定量，并將80ng各純化樣本在瓊脂糖凝膠上運行(參見材料和方法以及圖7)。在取出等份前對玻璃珠樣本進行渦流，和對含鋼球樣本進行振蕩。本實施例證明了使用不銹鋼混合球對于在室溫下穩(wěn)定化新收集的糞便中的完整高分子量DNA(>23Kb)的益處。在比較瓊脂糖凝膠上高分子量DNA的品質時，證實在包含pH9.5和11的本發(fā)明組合物和一個高密度不銹鋼球實驗管中混合糞便樣本(圖7B)優(yōu)于與兩種尺寸的多個小玻璃珠混合(圖7A)。糞便與多個玻璃珠和本發(fā)明組合物(104BpH9.5)的手動混合比與不銹鋼球混合明顯耗費更多時間，并且后者證明在保全完整高分子量DNA方面的效果較優(yōu)。關于還更堿性(pH11)的組合物，令人驚訝地觀察到與玻璃珠混合的樣本的DNA完整性提高，表明混合/均化裝置和穩(wěn)定化溶液的pH都是至關重要的。實施例4–本發(fā)明組合物的體積限度糞便是非均勻的生物學樣本，其表觀或硬度可根據(jù)消化系統(tǒng)的狀態(tài)、飲食和總體健康狀況而顯著相異。正常情況下，大便是半固體，有粘液覆層。布里斯托大便分類法或圖表是一種醫(yī)學輔助手段，其被設計以將人類糞便形式分成范圍從類型1(獨立的硬塊，如堅果般)至類型7(完全液體，無固體塊，超過90％的水)的七個種類?？傮w上，糞便由約70-80％水、20-30％的固體物質組成，但該百分比根據(jù)樣本類型(1-7)或糞便在腸中的停留時間而相異。糞便之間在硬度和水含量方面的相異度對于糞便收集和與穩(wěn)定化溶液的一致充分混合提出了顯著挑戰(zhàn)。類型1-3樣本尤其難以在不過度稀釋用于下游分析的樣本(因此，DNA)的情況下在穩(wěn)定化溶液中充分分散而產(chǎn)生均勻液體。而且，類型1-3樣本比其它樣本類型更容易緩慢吸收液體，例如，穩(wěn)定化溶液，產(chǎn)生濃稠半固體懸浮液，該濃稠半固體懸浮液在實驗室中可能難以移液。類型4-7樣本的較高水含量和較軟堅固性使得這些樣本容易混合在穩(wěn)定化溶液中和移液。在處理期間，用于從糞便樣本提取DNA的方法(或商品試劑盒)可帶來相異性?？紤]到糞便的非均勻性，下列比例實驗中對本發(fā)明組合物穩(wěn)定化完整高分子量全DNA的強壯性(robustness)進行了比較。在兩個獨立的實驗中，三個健康供體將糞便樣本(400mg)收集到包含7.9mm不銹鋼球和各種體積的104BpH11穩(wěn)定化溶液(上文限定)的管中，以實現(xiàn)下列糞便：穩(wěn)定化溶液比例——1：3、1：4、1：5、1：6、1：8和1：10。注意，在凝膠上顯示了“實際比例”和目標“比例”，因為很難用粗糙的工具重復收集精確400mg的糞便。在樣本收集之前和之后對管進行稱重，確定單位體積組合物的糞便確切收集量。將管手動振蕩，并在T＝0時(圖8A)和在室溫下6天(圖8B)、7天(圖8C)、14天(圖8D)、1個月(圖8E)和2個月(圖8F)后取出250μL等份。在一些情況下，提取兩個等份，證明復本的再現(xiàn)性(圖8A，C-F)。提取DNA，并將80ng在1％瓊脂糖凝膠上運行(圖8A-F)。在星號(*)標記的泳道中，鑒于事實上一些樣本的DNA濃度在純化后小于10ng/μL，加載小于80ng的DNA。DGGE凝膠(圖10A和10B)也在這些實驗中進行，并且分析相似度百分比以確定這些樣本中的微生物組譜的穩(wěn)定性。本實施例證明，寬范圍的糞便：穩(wěn)定化溶液比例導致從T＝0至在室溫下儲存至少2個月的樣本中高分子量DNA完整的結果(圖8A-F)。少到0.8mL至多達5.4mL本發(fā)明組合物成功地使400mg糞便中包含的DNA和微生物組譜在這些條件下穩(wěn)定至少2個月(圖8A-F和10A-B)。這種寬‘工作’范圍有便于研究人員，因為供體可轉移高度差異數(shù)量的糞便樣本到包含固定體積的穩(wěn)定化溶液的管中，而樣本將在室溫下穩(wěn)定至少2個月。利用DGGE分析的三個樣本等份(圖9)證明，取自相同糞便樣品的等份之間微生物組譜非常一致(≥97％)。另外，比例實驗樣本的DGGE凝膠分析顯示，在寬范圍的糞便：本發(fā)明組合物穩(wěn)定化溶液(1：1.8至1：10.6)中，微生物組譜在室溫下被長期高度穩(wěn)定(在7天時≥88％；在14天時≥91％；在2個月時≥79％)(圖10A和10B)。因此，優(yōu)選的糞便：穩(wěn)定化溶液比例可在如下范圍內(nèi)：約1：1至1：20，優(yōu)選1：1至1：10，更優(yōu)選1：3至1：8，最優(yōu)選糞便：穩(wěn)定化溶液之比為約1：5。本文描述的組合物允許研究人員對其如何收集大量糞便樣本進行變革。其不再需要因在干冰上貨運樣本或在冷凍裝置中儲存數(shù)百至數(shù)千糞便樣本數(shù)月的成本和后勤而限制研究。收集到包含本發(fā)明組合物的管中的樣本可在環(huán)境溫度下在氣泡封袋中貨運并且在實驗室中在室溫下儲存，以備在研究人員方便時批量處理。實施例5–本發(fā)明組合物中并且在極端溫度下的樣本穩(wěn)定化本文描述的各種組合物在‘環(huán)境’溫度下有效并且快速地穩(wěn)定化人類健康供體糞便中的高分子量DNA和微生物組譜。如上所述，‘環(huán)境’意為在生物學樣本收集、運輸、儲存和處理期間觀察到的一般的暴露溫度。根據(jù)生物學樣本在世界上被收集/運輸/儲存的地點，溫度可容易在-20℃至50℃變動——有時在短時間內(nèi)。本領域已知未處理生物學樣本隨著這些溫度(特別是升高的溫度)降解。需要穩(wěn)健的通用的生物學樣本穩(wěn)定化溶液來維持收集樣本中的DNA盡可能接近體內(nèi)狀態(tài)，即，防止存在的完整高分子量DNA降解和/或防止部分降解的核酸(如糞便樣本中的人DNA)進一步降解，和穩(wěn)定化糞便樣本的微生物組譜。表7.測試組合物。利用復雜的非均勻的可變的糞便樣本，在寬范圍的環(huán)境溫度(例如，-20℃、室溫(一般19-23℃)、37℃和50℃)，對發(fā)明人研發(fā)的6種DNA穩(wěn)定化組合物(表7)的性能進行了測試和比較。在第一個實驗中，2個健康供體每個人將400mg糞便轉移到包含2mL不同組合物(表7)和一個7.9mm不銹鋼球的6個管中。將管手動振蕩以均化糞便樣本，立即取出一個等份(250μL)進行DNA提取(T＝0)，然后將管在37℃下儲存7和21天。圖11A和11B證明，當糞便樣本在37℃下儲存時，所有測試組合物均使完整高分子量DNA穩(wěn)定至少3周。在37℃下21天后，從在CBS、CBSA1和CBSA2組合物中儲存的大便樣本回收的DNA的濃度低于其它組合物中的樣本，導致供體A和B的瓊脂糖凝膠上的帶較暗(圖11A和11B)。令人驚訝地，DGGE分析(圖12A和12B)顯示這些樣本的微生物組譜在37℃(糞便細菌生長最佳溫度)下第一周也是穩(wěn)定的，并且在21天時間點前開始變化。除緩沖至pH11的300mMCDTA外，乙醇也呈現(xiàn)有益于穩(wěn)定化或回收高分子量DNA和微生物組譜。在第二個實驗中，3個健康供體每個人將400mg糞便轉移到包含2mL104B和一個7.9mm不銹鋼球的3個管中。將管手動振蕩以均化糞便樣本，立即取出一個等份(250μL)進行DNA提取(T＝0)，然后將管在50℃下儲存3和5天，在室溫下儲存1個月，和在-20℃下儲存1個月(圖13A-E)。圖13A-E證明，104B使高分子量DNA在50℃下穩(wěn)定5天(圖13B-C)，在室溫下穩(wěn)定1個月(圖13D)，和在-20℃下穩(wěn)定1個月(圖13E)。每個供體收集的三份糞便樣本都包含完整高分子量DNA，而不論測試溫度或時間。在第三個實驗中，3個健康供體每個人將400mg糞便轉移到3個管中；2個管每管包含2mL104B和CBE(表7)和一個7.9mm不銹鋼球；第三個管是空的(無)。手動振蕩有穩(wěn)定化溶液的管以均化糞便樣本，從每個管立即取出一個等份(250μL或250mg)進行DNA提取(T＝0)，然后將管在50℃下儲存5天和14天或在-20℃下儲存11天(圖14A-D)。圖14A-C證明，104B和CBE都使完整高分子量DNA在50℃下維持至少2周，而對照(無)樣本顯示隨時間降解的跡象。令人驚訝地，DGGE分析(圖15A和15B)顯示這些樣本的微生物組譜在50℃(對于生物分子如DNA而言的極端溫度)下也穩(wěn)定2周。值得注意的是，在50℃下儲存5天而非14天的樣本的相似度百分比較高，表明長期暴露于這種極端溫度可導致DNA本身一定程度的化學不穩(wěn)定性。圖14D顯示，104B和CBE都使-20℃冷凍(和隨后解凍)樣本中的高分子量DNA維持至少11天。然而，在不存在穩(wěn)定化溶液的情況下，糞便顯示在-20℃下DNA降解的特征跡象。在供體A(無)樣本中，大部分高分子量DNA降解并且呈現(xiàn)在瓊脂糖凝膠上拖尾。相比之下，供體B和C樣本中仍可檢測到少量高分子量DNA，表明供體差異性。無穩(wěn)定化溶液的樣本的DGGE分析確認微生物組譜在-20℃下不穩(wěn)定；供體A和C相對于對照T＝0的相似度％分別為52％和69％。相比之下，根據(jù)相對于對照(無)樣本的高相似度百分比(圖16A和16B)顯示，微生物組譜在104B和CBE中在-20℃下穩(wěn)定11天。結合這些實施例證明，104B和CBE都使在極端溫度下長時間儲存的糞便樣本中的DNA穩(wěn)定。實施例6–關于在本發(fā)明組合物中培育的糞便樣本的冷凍/解凍循環(huán)的穩(wěn)定性如上所述，本領域已知，在儲存或庫存目的的糞便暴露于僅一輪冷凍和解凍時微生物組譜就會發(fā)生變化。這種降解對所有在零下溫度運輸和/或儲存的收集樣本增添了不必要的偏差。在本實施例中，從3個健康供體收集糞便，并且將400mg樣本轉移至空管和包含2mL本發(fā)明組合物(“104BpH9.5”；如上限定)和玻璃珠(四個4mm和十個2mm小球)的管。將包含穩(wěn)定化溶液和玻璃珠的管劇烈渦流直到充分混合。在第0天取出250mg或μL等份進行DNA提取后，將樣本管儲存在-20℃冷凍裝置中，并在十天的過程中，在冷凍裝置和室溫之間循環(huán)五次——每個溫度24小時。將樣本管在50℃解凍3小時——工業(yè)標準方法。第0天等份的瓊脂糖凝膠分析證明，每個供體的糞便在被收集到本發(fā)明組合物中時均包含高分子量DNA(圖17)。令人驚訝地，冷凍/解凍(F/T)5個循環(huán)后，DNA仍然完整(圖17)。DGGE分析確認本發(fā)明組合物中的樣本的微生物組譜在5個F/T循環(huán)后保持穩(wěn)定在94％(圖18)。與之形成鮮明對比，未受保護樣本顯示微生物組譜顯著降解。僅一個F/T個循環(huán)后，譜與-20℃暴露前第0天‘新收集’樣本譜僅52％相似。因此，本發(fā)明組合物不僅經(jīng)過多輪冷凍和解凍保全完整的高分子量DNA，其還穩(wěn)定化微生物組譜，顯著減少與這些儲存條件有關的偏差。實施例7–收集在本發(fā)明組合物中的糞便樣本的均化如上所述，發(fā)明人以可在標準市售10mL實驗室管和/或運輸管(92mmx15.3mm，內(nèi)徑約12.9mm)中用于充分和可靠均化所有類型(1-7，布里斯托大便分類法)的糞便樣本的多種不同材料進行了實驗。確定混合應手動并且在相對短時間內(nèi)(180秒內(nèi)完成)以確保供體服從和堅持提供穩(wěn)定化的生物學樣本。本領域技術人員將知道如何選擇適于比本實施例所用更大或更小的容器的均化裝置(參見詳細描述)。將標準一次性3mL注射器改裝以將小體積量的糞便收集和轉移到包含本發(fā)明組合物(“104BpH11”；上文限定)和均化裝置的上述收集管中。注射器針的錐形末端或配件切除，暴露直徑均勻的筒體。將活塞預先設置到有助于在其被推入包含糞便的容器中時收集一致量糞便的位置，例如400mg。在注射器筒體中鉆有供空氣在糞便樣本收集過程中逸出的小通氣孔。將加載了樣本的注射器轉移至管口處，并壓下活塞，將400mg樣本置于包含2mL穩(wěn)定化溶液和均化裝置(例如，均化球，下文詳述)的管中。將管加蓋，并手動振蕩約20-40秒——堅硬類型1樣本(參見下文)更久(1-3分鐘)。在存在均化裝置的情況下前后運動劇烈振蕩樣本后，糞便樣本被分散在穩(wěn)定化溶液中。當所選容器是實驗室或運輸管/小瓶時，適當尺寸、形狀和密度的均化“球”或“球形物”對于在本發(fā)明組合物中充分分散非均勻的復雜樣本至關重要。在收集時徹底均化收集樣本也對于最佳穩(wěn)定化人和微生物DNA至關重要(如存在完整高分子量DNA以及微生物組譜穩(wěn)定化所證明，如細菌16SrRNA基因的PCR和擴增子的DGGE分析示例)。如上所述，對于球形均化裝置而言，運輸管/小瓶的底部應當也是圓潤的——反映均化裝置的形狀，從而防止固體物質被壓實在管中的死角中。例如，通過球形均化裝置使糞便樣本(具體地，類型1-3)最佳均化通過圓錐底或平底管很難實現(xiàn)。球形均化裝置無法直接接觸圓錐形表面和垂直管壁與底部相交的90度角，導致糞便物壓實在這些死角/死區(qū)中。下列表8-10示例發(fā)明人測試找到標準實驗室/運輸管(例如，目錄號60.610，Sarstedt)的最佳均化裝置的不同市售材料中的一些。表8.不同材料、直徑和數(shù)量的小球的混合時間(秒)。ND，未測定；X，>180秒表9.不同直徑的不銹鋼球的混合時間(秒)。ND，未測定；X，>180秒表10.不同直徑和數(shù)量的不銹鋼球的混合時間(秒)。ND，未測定；X，>180秒樣本類型1和2的糞便密度很高并且包含極少的水，導致其在無均化裝置的情況下不可穿透而不能在合理時間內(nèi)(<3分鐘)在本發(fā)明組合物中手動分散。對于較軟的糞便(類型3-6)而言，仍需要均化裝置并且手動混合管的持續(xù)時間隨樣本類型升高而顯著減少(表8-10)。均化裝置對于用本發(fā)明組合物分散樣本類型7或腹瀉物不是必需的。在這種情況下，“均化器”的目的是在不使用電離或電池的情況下使非均勻的固體或半固體樣本充分瓦解和分散遍布穩(wěn)定化溶液。均化裝置的重要特征包括1)材料密度、2)相對于生物學樣本容器內(nèi)徑的尺寸、和3)相對于容器的形狀。玻璃(約2.0-4.5g/cm3)/聚(甲基丙烯酸甲酯)或PMMA(約1.2g/cm3)/二氧化硅(約1.6-2.0g/cm3)/氧化鋯(約6.02g/cm3)/乙酸纖維素(約1.3g/cm3)/聚乙烯(約0.9-1.3g/cm3)顆粒(<1.2mm)和小球(≤4mm)的尺寸和密度不足以在內(nèi)徑為12.9mm的標準實驗室管中充當類型1-4糞便的均化器(表8)。重要地，甚至由氧化鋁(3.95g/cm3)制成的7.9mm大球或7.1-7.9mm氮化硅(3.21g/cm3)和12.7mm玻璃彈珠也不能在少于180秒內(nèi)在2mL本發(fā)明組合物中分散類型1-3的糞便樣本(400mg)(表8)。令人驚訝地，甚至在管振蕩180秒后，本發(fā)明組合物中的固體物質仍然完整。這些實驗結果引導測試更高密度的材料，即，密度>3.95g/cm3。不幸的是，密度在3.95g/cm3和7.6g/cm3之間的球是購買不到的，因此無法進行關于糞便樣本的測試。接下來，關于圓底管內(nèi)2mL本發(fā)明組合物中的400mg糞便樣本，測試不銹鋼球(7.6-7.9g/cm3，表9和10)和碳化鎢球(15.63g/cm3，表8)。令人驚訝地，通過7.1-7.9mm碳化鎢和7.1-8.7mm不銹鋼球，甚至堅硬的堅果狀類型1糞便樣本也分別在≤140和≤180秒內(nèi)被均化。通過7.1-7.9mm碳化鎢和7.1-8.7mm不銹鋼球，類型2樣本分別在≤40秒和≤80秒內(nèi)被均化。碳化鎢(7.1-7.9mm)和不銹鋼球(7.1-8.7mm)分別使類型3樣本在≤30和≤80秒內(nèi)，使類型4樣本在≤15和≤55秒內(nèi)，使類型5樣本在≤15和50秒內(nèi)，和使類型6樣本在≤10和≤22秒內(nèi)均化。類似地，無法找到或測試密度在7.9g/cm3至15.63g/cm3之間的小球；然而，本領域技術人員預期這種均化裝置在7.1-8.7mm尺寸范圍內(nèi)必定在少于180秒內(nèi)將糞便樣本擾散。僅僅出于成本和來源容易考慮，不銹鋼球比碳化鎢球更優(yōu)選，并且最佳直徑為直徑7.1-8.7mm。相同尺寸的第二球的添加總體上證實有益于減少混合時間(表8和9)。在一些實例中，多于一種尺寸的小球的組合有益于減少均化糞便樣本所需的時間(表10)。鑒于7.1-8.7mm球在12.9mm內(nèi)徑的管中表現(xiàn)最好，球任一側約2.1-2.9mm的間隙(clearance)提供在管中短時間內(nèi)均化樣本的最佳配合。當不銹鋼球直徑≤5.6mm或≥9.5mm時，硬質類型(1-4)糞便樣本的混合時間增加。因此，鑒于堅固性范圍從固體至液體的糞便樣本的這些結果，7.9mm不銹鋼球被優(yōu)選用作本文描述的實施例中的均化裝置，除非另外說明。實施例8–利用本發(fā)明組合物穩(wěn)定化消化道小生物群譜消化道小生物群的分析已得到研究人員越來越多的關注，研究微生物在人類健康中的有益和有害作用。對于消化道小生物群的任何分析，都必須準確捕捉表示體內(nèi)狀態(tài)的小生物群譜的“快照”(即，確保運算分類單位[OTU]的相對豐度從收集時到樣本處理和分析時保持不變)；因此，收集時的樣本穩(wěn)定化是這種研究的重中之重。當前的大便樣本收集和小生物群分析方法涉及樣本在環(huán)境溫度下、4℃或冷凍運輸。然而，這些方法有可能使樣本暴露于與微生物組穩(wěn)定化不相容的溫度，并且冷凍大便樣品此前已顯示使硬壁菌門(Firmicutes)與擬桿菌屬(Bacteroides)的比例發(fā)生改變(Bahl等，(2012)FEMSMicrobiolLetters329：193-197)。在本實施例中，利用靈敏的商業(yè)可得方法，V4高變區(qū)16SrRNA測序，來評估微生物組的穩(wěn)定性。關于本研究，四個供體每個人收集一個大便樣品，并將等量樣本(400mg)置于三個無穩(wěn)定化溶液的管中和六個有穩(wěn)定化溶液(300mMCDTA、0.5％SDS、23.5％乙醇、0.1％AntifoamA、0.2％三氯生，pH9.5)和.9mm不銹鋼混合球的管中。供體將樣本在去除T＝0等份(250μL或250mg)并利用PowerFecalTMDNA分離試劑盒(MoBioLaboratories)進行DNA提取的環(huán)境溫度下運送至實驗室。將每種穩(wěn)定化條件每個供體一個樣本儲存在每一種測試溫度(-20℃、4℃、23℃、37℃——僅穩(wěn)定化溶液中)下3和14天，然后進行DNA提取。使一個處于穩(wěn)定化溶液中樣本暴露于五個冷凍-解凍循環(huán)。在指示時間點，提取來自等份的DNA，并送去進行16SrRNA測序文庫制備、測序和生物信息分析。利用進行V4高變區(qū)配對末端擴增子測序(250個循環(huán))。圖19和20展示指示完全保存在穩(wěn)定化溶液中的樣本具有高相似度的OTU豐度的數(shù)據(jù)。在圖19中，基于加權unifrac相異度值的主坐標分析(PCoA)在兩個供體(B和D)中證實，經(jīng)各種溫度(-20℃、4℃、環(huán)境溫度、37℃)和時間(3和14天)儲存在穩(wěn)定化溶液中的樣本在OTU豐度方面均呈現(xiàn)高水平的相似度——如通過PcoA制圖上的緊密聚類顯示(儲存在穩(wěn)定化緩沖劑中的樣本具有如下樣本識別編號：4–9作為第一個數(shù)字，例如，D4和B4，并且分組到每個供體的“有穩(wěn)定劑”圈中)。相比之下，無穩(wěn)定化溶液儲存的樣本(樣本具有如下識別編號：0–3作為第一個數(shù)字，例如，D3-1和B3-1，并且分組到每個供體的“無穩(wěn)定化”圈中)證實OTU豐度的相似度減少——通過樣本之間較大距離顯示。重要地，當評估存在或不存在OTU時，四個供體全部都存在穩(wěn)定化樣本和無穩(wěn)定化溶液樣本之間的統(tǒng)計學顯著差異(分別p＝0.002，0.002，0.002和0.009，Unifrac測量)。在無穩(wěn)定化溶液儲存在-20℃下的樣本(PcoA制圖上的樣本B2-1、B2-2、D2-1和D2-2)中觀察到最大譜變化，其與在-20℃下儲存在穩(wěn)定化溶液中的樣本顯著不同(p＝0.028，加權Unifrac測量)；從而證明在新型穩(wěn)定化溶液中儲存樣本可防止在非穩(wěn)定化冷凍樣本中觀察到的微生物譜變化(圖19)。在圖20中，科水平(family-level)的比例豐度證實了在無本發(fā)明穩(wěn)定化溶液的情況下在不同溫度儲存一段時間(3和14天)的樣本的組成變化。具體地，在供體D的無穩(wěn)定化溶液樣本中觀察到，與基線相比，毛螺菌科(Lachnospiraceae)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)和普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)增加并且擬桿菌科(Bacteroidaceae)減少。相比之下，經(jīng)不同溫度和時間與穩(wěn)定化溶液一起儲存的樣本與基線樣本相比維持樣本的微生物組成。該數(shù)據(jù)表明，為將消化道小生物群的變化可靠地關聯(lián)至目標表型，擁有在收集時穩(wěn)定化譜的可再現(xiàn)方式是非常重要的，這在當前的基于溫度的穩(wěn)定化方法是不能有效實現(xiàn)的。此處證明的穩(wěn)定化化學具有在各種運輸溫度下維持體內(nèi)消化道小生物群譜的能力(即，OTU緊密聚類)，允許研究人員提高數(shù)據(jù)可靠性和研究間對比。這種穩(wěn)定化化學還將增加無監(jiān)督自行收集的便利性，和獨一無二地能夠實現(xiàn)目前后勤困難的大群體研究。實施例9–人DNA在本發(fā)明組合物中的穩(wěn)定化關于糞便樣本收集、DNA提取和定量、和人DNA擴增的進一步詳細內(nèi)容參見材料和方法章節(jié)。向三個健康供體提供以在家收集糞便樣本的說明書和材料。在排便到洗手間附屬的大容器中后，將約400mg糞便立即轉移到包含2mL本發(fā)明組合物(“104BpH11”；上文限定)和一個7.9mm不銹鋼球的10mL圓底管中。在管加蓋后，供體將密封管振蕩約20秒以在組合物中均化樣本。供體大概在收集3-4小時內(nèi)將均化樣本在環(huán)境溫度下送回實驗室。在實驗室中，T＝0等份(250μL)從每個管中被移除，并且剩余物在室溫(RT)下儲存14天，此時抽出第二個等份(250μL)。利用DNA分離試劑盒從每個等份純化DNA；利用熒光染料和熒光法(參見材料和方法)定量DNA收率。利用靶向單拷貝人胸苷酸合成酶基因的引物在實時或定量PCR(qPCR)中擴增從T＝0和T＝14天糞便樣本純化的人DNA。Ct變化值(ΔCt)，即取自相同樣本的T＝0和T＝14天純化等份得到的三份Ct值的差異，顯示在下表11中。對于每個供體，T＝0和T＝14天的純化樣本中檢測到的人DNA量相同。通過立即處理或RT儲存2周的糞便樣本的DNA的小于一個循環(huán)差異，本實施例證明三個供體的人DNA在本發(fā)明組合物中全部穩(wěn)定。表11.在室溫下儲存14天或在T＝0時處理的糞便樣本中的人DNA的Ct值變化。ΔCt(C14-C0)供體A0.94供體B0.11供體C0.77實施例10–本發(fā)明組合物使微生物組譜在室溫下和在模擬運輸件下穩(wěn)定14天本發(fā)明組合物能夠容易自行收集糞便和穩(wěn)定化糞便的微生物DNA用于消化道微生物組表征。其獨一無二地能夠在收集時獲得微生物譜的快照，并且使其在室溫下維持14天。在本實施例中，向六個健康供體提供以在家收集糞便樣本的說明書和材料。在排便到洗手間附屬的大容器中后，將約400mg糞便立即轉移至包含2mL本發(fā)明組合物(“104BpH11”；上文限定)和一個7.9mm不銹鋼球的10mL圓底管。在管加蓋后，供體將密封管振蕩約20秒以在組合物中均化樣本。6個供體每個人從同批糞便樣本收集3個樣本(總共n＝18)到本發(fā)明組合物中。另外，每個供體從同批糞便樣本收集400mg等份的新制糞便，并按照人類微生物組項目(HumanMicrobiomeProject)標準程序(ManualofProcedures-HumanMicrobiomeProject，2010)將其在冰凍冷包裝的苯乙烯泡沫塑料箱中的空白10mL管中運輸。在收集3小時內(nèi)進行基線DNA提取。關于基線分析，將0.25mL等份從104BpH11樣本取出，并利用DNA分離試劑盒(MOBIOLaboratories，Inc.)進行提取。每個0.25mL樣本包含約50mg糞便和200μL穩(wěn)定化液體，104BpH11。從新制未穩(wěn)定化樣本提取等量糞便(約50mg)。將其余104BpH11和新制未穩(wěn)定化樣本分成等份并在室溫(23±3℃)下儲存14天或暴露于模擬運輸條件(50℃1天，37℃3天或3個冷凍-解凍循環(huán)，其中一個循環(huán)由在-20℃下至少3小時和在30℃下至少3小時組成)。另外，將每個供體的一個等份的新制大便儲存在-80℃下作為對照。在保持在室溫下、模擬運輸條件或-80℃14天后，利用PowerFecalDNA分離試劑盒從全部樣本進行第二等份的提取。利用Quant-iTTM試劑(LifeTechnologies)確定DNA濃度和收率。通過在0.8％瓊脂糖凝膠上運行約50ng純化DNA和用溴化乙錠染色，評價DNA隨著時間的完整性和穩(wěn)定性。利用LambdaHindIII梯確定純化DNA的大小。通過Metanome，MicrobiomeDiscoveryService進行16SrRNA測序文庫制備、測序和生物信息學。利用進行V4高變區(qū)配對末端擴增子測序。利用QIIME和自定義腳本，對序列進行品質過濾。將配對末端讀取結果組合并與Greengenes數(shù)據(jù)庫進行比較，通過UCLUST以96％聚類。在數(shù)據(jù)標準化后，利用對操作分類單位(OTU)豐度數(shù)據(jù)(利用樣本之間的分類豐度差異，利用配對標準化——通過差異總和除以全部豐度總和)進行加權UniFrac，測量樣本與樣本的距離。利用配對標準化——通過差異總和除以全部檢測的OTU豐度總和，測量Bray-Curtis距離。在所有Bray-Curtis測量中，在收集后立即提取的供體匹配的新制樣本用作配對比較的一方。通過如下進行每種穩(wěn)定化方法的Shannon指數(shù)(SI)分析：測量每種OTU相對于OTU總數(shù)的比例，然后乘以該比例的自然對數(shù)。所有OTU的所得乘積總和產(chǎn)生每個樣本的SI。利用Mann-Whitney檢驗比較樣本收集方法。結果本發(fā)明組合物維持收集時微生物組譜的中立性(不變性，neutrality)。微生物組研究要求生成的譜代表體內(nèi)供體中存在的微生物群體；因此，收集和穩(wěn)定化方法應不對微生物組引入變化?；瘜W穩(wěn)定化緩沖劑的使用可通過促進一些微生物生長同時使得其它微生物衰退潛在地改變樣本的微生物組成。在理想條件下，穩(wěn)定化液體應是中立的(即，其應不對微生物組引入任何偏差)。新制的與104BpH11-穩(wěn)定化的t＝0樣本的16SrRNA微生物組譜比較顯示，本發(fā)明組合物維持中立譜并且不引入偏差(圖21)。通過不同統(tǒng)計學方法(例如，加權UniFrac)的相對OTU豐度研究提供了對微生物群體有價值的描述；然而，其可能因通過最小化低豐度微生物的貢獻而阻礙了對微生物群體的理解。微生物組譜的恰當研究需要保全微生物群體的“豐富度”。豐富度被定義為樣本中存在的微生物物種(OTU)計數(shù)，并且高度受環(huán)境條件(包括溫度、pH、氧濃度和化學組成變化)影響。這些和其它因素可引起細菌生長或衰退，從而改變樣本中檢測到的OTU數(shù)。在收集后立即對來自6個供體的新制的和104BpH11穩(wěn)定化的樣本進行提取。將在104BpH11樣本中識別的微生物OTU與相應新制樣本中存在的OTU進行比較。通過將OTU豐度數(shù)據(jù)轉換成存在/不存在呼叫(calls)，計算多樣性Shannon指數(shù)(SI)。SI值的Mann-Whitney檢驗顯示104BpH11樣本和新制樣本之間無顯著差異，表明104BpH11對樣本豐富度無影響(圖22)。糞便樣本收集的差異性來源Bray-Curtis分析顯示新制和104BpH11t＝0樣本復本內(nèi)的系統(tǒng)相異度。為理解這種相異度的來源，評價在糞便樣本收集和處理期間引入的差異性。通過生成從同批樣本內(nèi)的不同位點收集的三個新制樣本和三個104BpH11樣本的微生物組譜，評估生物差異性。利用104BpH11收集的樣本研究技術差異性，因為這種收集系統(tǒng)提供均化的液體樣本，減少處理期間的實驗誤差。對來自相同管的復本DNA提取物的譜(提取差異性)和來自相同DNA的復本PCR/測序的譜(測序差異性)進行比較。生成復本小組內(nèi)的BrayCurtis相異度距離，并顯示在圖23中。在新制樣本和104BpH11收集樣本(Bray-Curtis距離分別為0.14±0.01和0.11±0.01)的生物學復本中觀察到相似度差異性。分析顯示，技術和生物差異性對16SrRNA微生物組譜引入一定相異度(Bray-Curtis距離生物差異度0.11；提取差異度0.09和測序差異度0.08)?？傊?，觀察到的相異度來源可通過技術或生物差異性來解釋，并且104BpH11不引入任何偏差。104BpH11在室溫下有效保全微生物組譜至少14天除維持譜中立性外，微生物組研究還要求微生物群體結構經(jīng)過時間后準確保全。我們評價了104BpH11在23℃儲存14天期間穩(wěn)定化樣本的能力。對配對104BpH11-穩(wěn)定化樣本和新制樣本在時間零(T0)進行提取，并且在室溫(23℃)下儲存14天后再次進行提取。還將新制樣本在-80℃下儲存14天作為對照。利用Bray-Curtis距離評價樣本相似度。Mann-Whitney分析顯示，與相應新制本樣相比，23℃14天的104BpH11樣本和-80℃樣本之間無顯著差異(圖24)。相比之下，與-80℃對照或在室溫下104BpH11儲存相比，未穩(wěn)定化樣本顯示顯著相異度。為理解復本再現(xiàn)性，利用新制樣本、104BpH11收集樣本(T0和T14天)和未穩(wěn)定化樣本(T14天)進行加權Unifrac的聚類分析。所得樹狀圖(圖25)顯示，新制樣本和104BpH11穩(wěn)定化樣本之間緊密聚類——甚至是14天后(96％相似度)。未穩(wěn)定化樣本與從新制譜高度分離聚類在一起(～63％相似度)。因此，恰當?shù)姆€(wěn)定化對于經(jīng)過時間的譜聚類具有巨大影響。104BpH11在模擬運輸條件下有效保全微生物組譜樣本通常在從收集地點運輸至處理實驗室期間暴露于不期望的條件。為模擬標準貨運條件，使未穩(wěn)定化樣本和104BpH11穩(wěn)定化樣本暴露于50℃1天，37℃3天或多次冷凍-解凍(F/T)循環(huán)。104BpH11保全高分子量DNA帶，而未穩(wěn)定化樣本顯示不同程度的降解，特別在暴露于50℃或冷凍-解凍循環(huán)時(圖26)。最后，16SrRNA分析確認，104BpH11保全微生物群體結構——甚至在極端溫度下。Mann-Whitney檢驗——比較經(jīng)過普通貨運溫度的104BpH11樣本和保持在–80℃的配對樣本的Bray-Curtis距離——顯示無顯著差異。相反，保持在37℃下或經(jīng)過冷凍-解凍循環(huán)的未穩(wěn)定化樣本，與保持-80℃的樣本相比，顯示顯著差異(圖27)。結論穩(wěn)定化，在宏基因組學背景中，是多維屬性，包括：經(jīng)過時間測量的a)中立性(捕捉無偏差譜的能力)，b)再現(xiàn)性(從中可取出高度一致等份的均勻樣本材料)，和c)完整性(分子量)?；趪栏窨刂频膶嶒灪蛧乐?shù)姆治觯?04BpH11有效穩(wěn)定化經(jīng)過現(xiàn)實貨運和處理條件的人類糞便中的消化道小生物群。這對于MWAS的成本有效規(guī)模擴大以及優(yōu)化數(shù)據(jù)品質以備生物標志物發(fā)現(xiàn)和發(fā)展具有極大重要性。實施例11–對升高溫度下螯合劑在樣本穩(wěn)定化中的作用的進一步研究樣本中的微生物譜的穩(wěn)定性對溫度升高也敏感。在這些條件下，有害核酸酶不僅有可能被活化，而且一些物種可開始增殖。為抑制DNA酶作用以及抑制細菌生長，螯合劑(CDTA)的存在在這種情況下尤其有益。在本實驗中，健康供體收集糞便并轉移400mg糞便到管中，該管包含一個7.9mm不銹鋼球和2mL具有不同最終濃度的螯合劑CDTA的本發(fā)明組合物：a)300mMCDTA、50mMβ-丙氨酸、23.5％乙醇、0.5％SDS、0.1％AntifoamA，pH11(“104BpH11”)；b)150mMCDTA、50mMβ-丙氨酸、23.5％乙醇、0.5％SDS、0.1％AntifoamA，pH11、或c)50mMβ-丙氨酸、23.5％乙醇、0.5％SDS、0.1％AntifoamA，pH11(無螯合劑)。通過手動振蕩使樣本均化(混合)，然后在室溫條件下送回實驗室。在樣本收集24小時內(nèi)，從各管取出250μL等份進行DNA提取(T＝0)。然后將收集的樣本在40℃下儲存5天(T＝5)，然后進行第二等份的DNA提取。定量純化的DNA，然后利用DGGE分離16SrRNA基因PCR擴增子而作為細菌群體譜或指紋進行解析。利用SyngeneGeneTools軟件(參見材料和方法)，分別計算樣本(DGGE凝膠上的泳道)之間的相似度百分比(與各組合物T＝0的對照樣本相比)。圖28證明，在升高的溫度下，CDTA存在濃度為150mM或300mM時本發(fā)明組合物的‘第5天’和‘第0天’樣本之間的相似度百分比或微生物組譜穩(wěn)定性與無CDTA的組合物相比較優(yōu)。這表明，為在升高的溫度下維持微生物譜穩(wěn)定性，本發(fā)明組合物中需有螯合劑。關于具有300mM和150mMCDTA的組合物，當糞便樣本儲存在40℃時，‘第5天’的微生物譜與‘第0天’相比分別為96％和95％相似。相比之下，當糞便樣本儲存在40℃時，與‘第0天’相比，無CDTA的組合物中‘第5天’的微生物譜為71％。實施例12–本發(fā)明組合物中的樣本穩(wěn)定化優(yōu)于現(xiàn)有技術組合物患者樣本中的核酸在其從患者排出后容易降解。這種降解可降低核酸完整性分析(基于完整核酸的存在將樣本評為病性(例如，癌性))的有效性。APShuber和DHWhitney(US2008/0124714)描述了用于穩(wěn)定化組織和機體流體樣本中核酸的方法，其中穩(wěn)定化溶液包括緩沖劑、鹽和螯合劑(例如，“TEN緩沖劑”)。在本實驗中，健康供體收集糞便并將400mg糞便轉移到包含一個7.9mm不銹鋼球和2mL本發(fā)明組合物(組合物1；300mMCDTA、50mMβ-丙氨酸、23.5％乙醇、0.5％SDS、0.1％AntifoamA，pH11(“104BpH11”))的管中，或ii)將約400mg糞便轉移到包含2mL“TEN緩沖劑”(組合物2；10mMTris-HCl、1mMEDTA、150mMNaCl，pH8，US2008/0124714)的管中。將兩管中的樣本均通過手動振蕩均化(混合)，然后在室溫條件下送回實驗室。在樣本收集24小時內(nèi)，從各管取出250μL等份進行DNA提取(T＝0)，然后在室溫條件下儲存21天(T＝21)，然后從第二等份進行DNA提取。將純化的DNA定量，然后利用DGGE分離16SrRNA基因PCR擴增子而作為細菌群體譜或指紋進行解析。利用SyngeneGeneTools軟件(參見材料和方法)，分別計算樣本(DGGE凝膠上的泳道)之間的相似度百分比(與各組合物T＝0的對照樣本相比)。圖29示例，與TEN緩沖劑組合物相比，本發(fā)明組合物的‘第21天’和‘第0天’樣本之間較優(yōu)的相似度百分比或微生物組譜穩(wěn)定性，表明本發(fā)明組合物，相對于本領域其它已知組合物，提高了DNA穩(wěn)定性。當糞便樣本儲存在本發(fā)明“104BpH11”組合物中時，‘第21天’的供體A和B微生物譜與‘第0天’相比分別為82％和94％相似。相比之下，當糞便樣本儲存在US2008/0124714的組合物中時，‘第21天’的供體A和B微生物譜與‘第0天’相比分別為70％和50％相似。US2008/0124714還在第[0059]段的材料和方法章節(jié)談及由0.5MTris、0.15MEDTA和10mMNaCl(pH9.0)組成的“穩(wěn)定化緩沖劑”。然而，注意到，在后來的實施例中具體談及的唯一穩(wěn)定化緩沖劑/溶液是上述“TEN緩沖劑”，并且關于穩(wěn)定化溶液，權利要求書和說明書的教導也針對的是圍繞“TEN緩沖劑”的實施方式。由此，并不清楚“穩(wěn)定化緩沖劑”是否被測試或其在US2008/0124714教導的方法中是否發(fā)揮作用。然而，比較性研究已被進行，比較在實施例1描述的相同條件下上述US2008/0124714的“穩(wěn)定化緩沖劑”相對于本發(fā)明組合物(包含150mMCDTA、50mMβ-丙氨酸、23.5％乙醇、0.5％SDS、0.1％AntifoamA，pH11)的性能。在用組成和時間評估微生物組穩(wěn)定性期間，利用細菌16SrRNA基因的PCR進行的擴增和擴增子的DGGE分析顯示，pH11的具有150mMCDTA的本發(fā)明組合物在30天培育后比US2008/0124714的pH9.0的包含150mMEDTA的“穩(wěn)定化緩沖劑”(79％)維持更高的相似度百分比(86％)——相對于對照(T＝0)。因此，本申請的組合物相對于US2008/0124714公開的組合物提供更優(yōu)的、糞便樣本中的微生物組譜的穩(wěn)定化。參考文獻1.LeeYKandMazmanianSK(2010)Hasthemicrobiotaplayedacriticalroleintheevolutionoftheadaptiveimmunesystem？Science24:1768-1773.2.AriesV,CrowtherJS,DrasarBS,HillMJ,WilliamsREO(1969)Bacteriaandtheaetiologyofcancerofthelargebowel.Gut10:334-335.3.MooreWECandMooreLH(1995)Intestinalflorasofpopulationsthathaveahighriskofcoloncancer.AppliedEnvirMicrobiol61(9):3202-3207.4.ParsonnetJ,FriedmanGD,VandersteenDP,ChangY,VogelmanJH,OrentreichN,SibleyRK(1991)Helicobacterpyloriinfectionandtheriskofgastriccarcinoma.NEnglJMed325:1127-1131.5.GrenhamS,ClarkeG,CryanJF,DinanTG(2011)Brain-gut-microbecommunicationinhealthanddisease.FrontPhysio2:94.6.KinrossJM,DarziAW,NicholsonJK(2011)Gutmicrobiome-hostinteractionsinhealthanddisease.GenomeMedicine3:14.7.VanNoodElsetal.(2013)DuodenalinfusionofdonorfecesforrecurrentClostridiumdifficile.NEnglJMed368(5):407-415.8.ApajalahtiJHA,KettunenA,NurminenPH,JatilaH,HolbenWE(2003)SelectiveplatingunderestimatesabundanceandshowsdifferentialrecoveryofBifidobacterialspeciesfromhumanfeces.ApplEnvironMicrobiol69(9):5731-5735.9.O’SullivanD(2000)Methodsforanalysisoftheintestinalmicroflora.CurrentIssuesinIntestinalMicrobiology1(2):39-50.10.WalkerAW,InceJ,DuncanSH,WebsterLM,HoltropG,ZeX,BrownD,StaresMD,ScottP,BergeratA,LouisP,McIntoshF,JohnstoneAM,LobleyGE,ParkhillJ,FlintHJ(2011)InternationalSocietyforMicrobialEcologyJournal5:220-230.11.WuGD,ChenJ,HoffmannC,BittingerK,ChenY-Y,KeilbaughSA,BewtraM,KnightsD,WaltersWA,KnightR,SinhaR,GilroyE,GuptaK,BaldassanoR,NesselL,LiH,BushmanFD,LewisJD(2011)Linkinglong-termdietarypatternswithgutmicrobialenterotypes.Science334:105-108.12.LeyRE,KnightR,GordonJI(2007)Thehumanmicrobiome:eliminatingthebiomedical/environmentaldichotomyinmicrobialecology.EnvironMicrobiol9:3-4.13.BahlMI,BergstromA,LichtTR(2012)FreezingfecalsamplespriortoDNAextractionaffectstheFirmicutestoBacteroidetesratiodeterminedbydownstreamquantitativePCRanalysis.FEBSMicrobiolLett329:193-197.14.OlsonJ,WhitneyDH,DurkeeK,ShuberAP(2005)DNAstabilizationiscriticalformaximizingperformanceoffecalDNA-basedcolorectalcancertests.DiagnMolPathol14(3):183-191.15.SongY,GargS,GirotraM,MaddoxC,vonRosenvingeEC,DuttaA,DuttaS,FrickeWF(2013)MicrobiotadynamicsinpatientstreatedwithfecalmicrobiotatransplantationforrecurrentClostridiumdifficileinfection.PLOSONE8(11):1-11.16.VanderGiessenJWB,EgerA,HaagsmaJ,HaringRM,GaastraW,vanderZeijstBAM(1992)Amplificationof16SrRNAsequencestodetectMycobacteriumparatuberculosis.JMedMicrobiol36:255-263.17.HurleySS,SplitterGA,WelchRA.TestforJohne’sDisease.US4,918,17818.KojimaK.Processofextractingnucleicacidandprocessofsimultaneouslycarryingoutextractionandpurificationofnucleicacid.US6,852,49519.AriefdjohanMW,SavaianoDA,NakatsuCH(2010)ComparisonofDNAextractionkitsforPCR-DGGEanalysisofhumanintestinalmicrobialcommunitiesfromfecalspecimens.NutrJ9:23.20.SmithB,LiN,AndersenAS,SlotvedHC,KrogfeltKA(2011)OptimisingbacterialDNAextractionfromfaecalsamples:comparisonofthreemethods.OpenMicrobiolJ5:14-17.21.McInnesP,CuttingM(2010)Manualofproceduresforhumanmicrobiomeproject.CoreMicrobiomeSamplingProtocolA；Protocol#07-001(version12.0)22.BrusaT,CanziE,PaciniN,ZanchoR,FarrariA(1989)Oxygentoleranceofanaerobicbacteriaisolatedfromhumanfeces.CurrMicrobiol19:39-43.23.US2008/0124714(A.P.ShuberandD.H.Whitney).本說明書提及的所有出版物、專利和專利申請均表示本發(fā)明所屬領域技術人員的水平，并且通過引用并入本文中，達到如同具體而且分別地指出各所述出版物、專利或專利申請通過引用并入的相同程度。本發(fā)明經(jīng)此描述，可以多種方式變型是顯而易見的。這種變型不被認為脫離本發(fā)明的精神和范圍，并且對于本領域技術人員而言顯而易見的這種改動全部意圖囊括在所附權利要求的范圍內(nèi)。權利要求的范圍不應受限于以描述為目的的優(yōu)選實施方式，而應根據(jù)整體描述被給予最寬泛的解釋。當前第1頁1 2 3