本公開涉及重組表達(dá)
技術(shù)領(lǐng)域：
。其中涉及改變的脊椎動物細(xì)胞和其在重組表達(dá)方法中的應(yīng)用等。所述經(jīng)改變細(xì)胞中重組表達(dá)感興趣多肽在隨后分泌入細(xì)胞培養(yǎng)基時，重組表達(dá)的感興趣多肽在細(xì)胞培養(yǎng)基中的剪切顯著減少或甚至完全防止。發(fā)明背景隨著生物醫(yī)藥對當(dāng)今醫(yī)學(xué)越來越重要，生物醫(yī)藥市場持續(xù)高速增長。目前，越來越多的生物藥品在脊椎動物細(xì)胞，例如尤其是哺乳動物中制備。生物藥品包括但不限于抗體、抗體片段、ADC(抗體-藥物偶聯(lián)物)、納米抗體、Fc-融合蛋白、生長因子、激素、細(xì)胞因子、酶和其它治療多肽。特別是表達(dá)重組非抗體治療蛋白的重要性日益增加。此外，在哺乳動物細(xì)胞中重組表達(dá)多肽也用于其它高度感興趣的領(lǐng)域。考慮到重組表達(dá)多肽的生產(chǎn)成本，具有高表達(dá)哺乳動物系是重要的。感興趣多肽由哺乳動物表達(dá)和分泌到細(xì)胞培養(yǎng)基中，隨后從中收獲所述多肽。用脊椎動物細(xì)胞如哺乳動物作為重組表達(dá)的宿主細(xì)胞時遇到的一個主要問題是表達(dá)和分泌的感興趣多肽在細(xì)胞培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)降解，也稱為“剪切”。源自生產(chǎn)用脊椎動物細(xì)胞的蛋白酶在細(xì)胞培養(yǎng)基中有活性，其蛋白水解活性可降解重組表達(dá)和分泌的感興趣多肽，從而產(chǎn)生改變的，如非功能性或功能較低的感興趣多肽。此宿主細(xì)胞相關(guān)蛋白質(zhì)降解是多肽重組表達(dá)中的一個主要難題。雖然IgG抗體也可能受影響，例如因?yàn)镮gG抗體能在可變區(qū)被剪切，非IgG多肽蛋白質(zhì)降解即剪切的頻率高得多。由于相對暴露的三維結(jié)構(gòu)，這類非IgG多肽尤其是糖多肽可能對蛋白質(zhì)降解非常敏感。重組表達(dá)的非IgG多肽的剪切值能達(dá)到多至100％。剪切能導(dǎo)致無益于預(yù)期目的的失活和/或免疫原性多肽。此外，即使蛋白質(zhì)降解僅以一定百分比發(fā)生，經(jīng)剪切的多肽無法用于預(yù)期目的并因而降低有用的重組感興趣多肽的收率。另外，對于許多應(yīng)用，經(jīng)剪切的多肽必須在純化期間移出。這可能需要專門開發(fā)能將剪切物與完整多肽分離的純化方法，這費(fèi)力且成本高，有時甚至不成功，從而經(jīng)剪切多肽仍作為雜質(zhì)。因此，在脊椎動物細(xì)胞中重組生成感興趣多肽時，細(xì)胞培養(yǎng)基中所表達(dá)感興趣多肽的蛋白質(zhì)降解是主要問題。為提供此問題的解決方式，一些研究調(diào)查了剪切現(xiàn)象。發(fā)現(xiàn)剪切取決于時間和溫度且能通過熱處理滅活。然而，關(guān)于重組表達(dá)用脊椎動物宿主細(xì)胞表達(dá)的蛋白酶，關(guān)于負(fù)責(zé)剪切的蛋白酶，目前為止所知甚少。一個主要挑戰(zhàn)是脊椎動物宿主細(xì)胞表達(dá)的蛋白酶數(shù)量。例如，已知超過700種蛋白酶存在于嚙齒動物細(xì)胞基因組，其中許多能參與剪切?，F(xiàn)有技術(shù)提出一些方式來克服剪切問題。一種防止剪切的方式是再造受影響蛋白以消除傾向于剪切的氨基酸基序。然而，此方式耗時，需要大量測試看所選方式是否成功且不保證再造蛋白是否仍具有功能，不顯示其它位點(diǎn)的剪切并且不具有免疫原性。一種控制細(xì)胞培養(yǎng)中蛋白酶活性的不同方法是向培養(yǎng)基加入抑制劑或替代底物。然而，在大規(guī)模制造工藝中，這種添加劑昂貴且必須在純化期間移出，這可能需要專門開發(fā)純化方法和敏感試驗(yàn)來監(jiān)控沒有添加劑剩余。其他降低細(xì)胞培養(yǎng)基中感興趣表達(dá)多肽的蛋白質(zhì)降解的方法包括定時收獲(早期收獲)以限制細(xì)胞培養(yǎng)基中感興趣多肽對蛋白酶的暴露，降低培養(yǎng)溫度，優(yōu)化pH條件或提高細(xì)胞活力以減少胞內(nèi)蛋白酶釋放到細(xì)胞培養(yǎng)基中。此外，發(fā)現(xiàn)用作生產(chǎn)宿主細(xì)胞的脊椎動物細(xì)胞系的選擇可對剪切產(chǎn)生影響，該影響取決于各細(xì)胞系表達(dá)的蛋白酶和待表達(dá)的感興趣個體多肽。因此，一個選擇是篩選不同細(xì)胞系以鑒定如下細(xì)胞系：感興趣多肽的剪切不發(fā)生或較少發(fā)生，然而這耗時且可能需要使生產(chǎn)工藝適應(yīng)所選細(xì)胞系。盡管這些不同選擇能減少剪切，其很少完全消除蛋白質(zhì)降解。此外，許多情況下，需要使表達(dá)和生產(chǎn)工藝適應(yīng)待表達(dá)的感興趣多肽個體，以開發(fā)避免或至少減少剪切問題并提供有足夠收率和純度的完整感興趣多肽的生產(chǎn)方法。然而，這種適應(yīng)耗時且昂貴。因此，需要針對剪切問題的改進(jìn)方法。因此，本發(fā)明的一個目的是提供在脊椎動物細(xì)胞中重組生成感興趣多肽的改良方法，其中細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)所表達(dá)和分泌感興趣多肽的剪切有減少或消除。特別地，本發(fā)明的一個目的是提供新型脊椎動物細(xì)胞，其中所述細(xì)胞所表達(dá)和分泌感興趣多肽的剪切有減少或消除。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本公開的基礎(chǔ)包括以下意外發(fā)現(xiàn)：改變脊椎動物細(xì)胞以削弱內(nèi)源蛋白酶間質(zhì)蛋白酶(matriptase)的效果，例如通過減少或消除間質(zhì)蛋白酶基因的功能表達(dá)，可顯著降低細(xì)胞培養(yǎng)基中所述細(xì)胞所表達(dá)和分泌重組感興趣多肽的蛋白質(zhì)降解(“剪切”)。因此，相較間質(zhì)蛋白酶效果未受損的對應(yīng)脊椎動物細(xì)胞，削弱間質(zhì)蛋白酶在所述細(xì)胞中的效果可減少所分泌重組感興趣多肽的剪切。鑒定間質(zhì)蛋白酶，這是負(fù)責(zé)剪切重組表達(dá)和分泌多肽的關(guān)鍵蛋白酶。改變脊椎動物細(xì)胞以削弱間質(zhì)蛋白酶的效果，能通過減少或消除細(xì)胞培養(yǎng)基中重組表達(dá)和分泌的感興趣多肽的剪切來顯著提高感興趣多肽的重組制備。因而，完整感興趣多肽的收率增加。如示例所證明，削弱其它蛋白酶功能時未發(fā)現(xiàn)這些有利效果，證明間質(zhì)蛋白酶是負(fù)責(zé)剪切的主要蛋白酶。本公開提供的新型脊椎動物細(xì)胞避免以下需求：再造待表達(dá)的感興趣多肽以消除蛋白水解位點(diǎn)，或費(fèi)力地改變生產(chǎn)工藝來減少或防止剪切，或者設(shè)計(jì)特定純化工藝以移出經(jīng)剪切的蛋白。有利地，本文所述的這些經(jīng)改變脊椎動物細(xì)胞能用作通用宿主細(xì)胞來表達(dá)不同感興趣多肽，包括特別傾向于剪切的感興趣多肽。待表達(dá)多肽或表達(dá)系統(tǒng)的特異性適應(yīng)得以廢棄，這節(jié)約時間和成本。此外，如示例所證明，本公開提供的經(jīng)改變脊椎動物細(xì)胞顯示良好生長和表達(dá)特征。因此，削弱間質(zhì)蛋白酶的效果仍為宿主細(xì)胞提供對重組表達(dá)感興趣多肽重要的有利表達(dá)特征。由此，本發(fā)明對本領(lǐng)域作出重要貢獻(xiàn)。根據(jù)第一方面，本公開提供適于重組表達(dá)感興趣多肽的經(jīng)分離脊椎動物細(xì)胞，其中該脊椎動物細(xì)胞改變成削弱間質(zhì)蛋白酶效果且包括至少一種編碼感興趣多肽的異源多核苷酸，其中脊椎動物細(xì)胞分泌感興趣多肽。脊椎動物細(xì)胞改變成削弱間質(zhì)蛋白酶效果，例如通過減少或消除所述脊椎動物細(xì)胞中間質(zhì)蛋白酶基因的功能表達(dá)，如通過基因沉默、基因缺失或突變間質(zhì)蛋白酶基因，從而表達(dá)非功能性或功能降低的蛋白。相較間質(zhì)蛋白酶效果未受損的對應(yīng)脊椎動物細(xì)胞，削弱間質(zhì)蛋白酶在脊椎動物細(xì)胞中的效果可減少所分泌重組感興趣多肽的剪切。如示例等所示，基于跟蹤標(biāo)定實(shí)驗(yàn)等，當(dāng)分別培養(yǎng)間質(zhì)蛋白酶效果受損的各經(jīng)改變脊椎動物細(xì)胞時，在所得細(xì)胞培養(yǎng)基上清中，重組感興趣多肽的剪切意外大幅減少，即使其它蛋白酶在上清中仍有活性。在間質(zhì)蛋白酶效果削弱的各改變細(xì)胞中表達(dá)數(shù)種感興趣多肽證實(shí)這些結(jié)果。這些結(jié)果證實(shí)間質(zhì)蛋白酶是負(fù)責(zé)剪切重組表達(dá)和分泌的感興趣多肽的關(guān)鍵蛋白酶。因此，第一方面所述脊椎動物細(xì)胞尤其適合作為重組生成技術(shù)的宿主細(xì)胞并能用于重組生成由脊椎動物細(xì)胞分泌到細(xì)胞培養(yǎng)基的感興趣多肽，隨后能從培養(yǎng)基中收獲所述多肽。根據(jù)第二方面，本公開提供制備第一方面所述脊椎動物細(xì)胞的方法，包括改變脊椎動物細(xì)胞以削弱間質(zhì)蛋白酶效果并引入編碼待表達(dá)感興趣多肽的多核苷酸，其中所述感興趣多肽由脊椎動物細(xì)胞分泌。效果削弱能如下實(shí)現(xiàn)：例如，通過減少或消除所述細(xì)胞中間質(zhì)蛋白酶基因的功能表達(dá)，如通過基因沉默、基因缺失或突變間質(zhì)蛋白酶基因，從而表達(dá)非功能性或功能降低的蛋白。根據(jù)第三方面，提供重組生成感興趣多肽的方法，包括采用第一方面所述脊椎動物細(xì)胞作為重組表達(dá)感興趣多肽的宿主細(xì)胞。如上所述，由于細(xì)胞培養(yǎng)基中實(shí)現(xiàn)多肽剪切水平降低，這些經(jīng)改變脊椎動物細(xì)胞尤其適合作為重組生成感興趣多肽的宿主細(xì)胞，特別是傾向于剪切的多肽如糖多肽。作為優(yōu)選實(shí)施方式，提供重組生成感興趣多肽的方法，包括(a)在一定條件下培養(yǎng)第一方面所述脊椎動物宿主細(xì)胞，所述條件允許感興趣多肽表達(dá)和分泌入細(xì)胞培養(yǎng)基；(b)從細(xì)胞培養(yǎng)基中分離感興趣多肽；和(c)可選加工分離的感興趣多肽。根據(jù)第四方面，提供重組生成感興趣多肽的方法，包括(a)在一定條件下培養(yǎng)脊椎動物宿主細(xì)胞，所述細(xì)胞包括至少一種編碼感興趣多肽的異源多核苷酸，所述條件允許感興趣多肽表達(dá)和分泌入細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)基包括對間質(zhì)蛋白酶有選擇性的蛋白酶抑制劑；(b)從細(xì)胞培養(yǎng)基中分離感興趣多肽；和(c)可選加工分離的感興趣多肽。根據(jù)第五方面，提供選擇重組表達(dá)感興趣多肽的宿主細(xì)胞的方法，包括(a)提供第一方面所述脊椎動物細(xì)胞作為宿主細(xì)胞；和(b)選擇一種或多種表達(dá)感興趣多肽的宿主細(xì)胞。根據(jù)第六方面，本公開涉及脊椎動物細(xì)胞在重組生成由該脊椎動物細(xì)胞分泌的感興趣多肽中的應(yīng)用，其中所用細(xì)胞改變成削弱內(nèi)源蛋白酶間質(zhì)蛋白酶的效果。例如，各改變細(xì)胞可以用編碼感興趣多肽的多核苷酸轉(zhuǎn)染，所述多肽應(yīng)該由所述細(xì)胞表達(dá)和分泌。用內(nèi)源蛋白酶間質(zhì)蛋白酶效果削弱的各脊椎動物細(xì)胞時，細(xì)胞培養(yǎng)基中沒有具活性的間質(zhì)蛋白酶或量減少。這顯著減少或甚至消除由細(xì)胞分泌入細(xì)胞培養(yǎng)基的重組感興趣多肽的蛋白質(zhì)降解。因此，就重組蛋白表達(dá)使用這類經(jīng)改變脊椎動物細(xì)胞是有利的。根據(jù)第七方面，本公開涉及選擇脊椎動物細(xì)胞以重組生成感興趣多肽的方法，包括分析內(nèi)源蛋白酶間質(zhì)蛋白酶是否在脊椎動物細(xì)胞中功能性表達(dá)并選擇該內(nèi)源間質(zhì)蛋白酶效果被削弱的脊椎動物細(xì)胞用于重組生成感興趣多肽。此選擇過程可鑒定能夠生成重組感興趣多肽的脊椎動物細(xì)胞，其中細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)的感興趣多肽剪切減少。各脊椎動物細(xì)胞尤其適合重組蛋白生產(chǎn)。通過以下描述和所附權(quán)利要求，本申請的其他目的、特征、優(yōu)勢和方面對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見。然而，應(yīng)理解，盡管指示本申請的優(yōu)選實(shí)施方式，以下描述、所附權(quán)利要求和特定實(shí)施例僅通過實(shí)例說明方式給出。通過閱讀以下內(nèi)容，在所公開發(fā)明精神和范圍內(nèi)的多種變化及修飾對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見。附圖簡要說明圖1顯示在條件培養(yǎng)基中孵育數(shù)天的2種治療蛋白的蛋白質(zhì)印跡(上排：IgG(mAb)，下排：Fc-融合蛋白)，其通過用針對不同蛋白酶靶基因的siRNA轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞培養(yǎng)所得(對于mAb，孵育7天，對于Fc-融合蛋白，孵育3天)。第一對照“(+)”代表在純化學(xué)培養(yǎng)基中孵育相同時間的感興趣多肽樣品，所述培養(yǎng)基不接觸細(xì)胞。用作對照的純化學(xué)培養(yǎng)基與培養(yǎng)細(xì)胞以獲得條件培養(yǎng)基的培養(yǎng)基相同。第二對照“(-)”代表在取自CHO細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中孵育的感興趣多肽樣品，其CHO細(xì)胞轉(zhuǎn)染有用作siRNA陰性對照的無效siRNA(125pmol)。通過siRNA轉(zhuǎn)染沉默的目標(biāo)類胰蛋白酶絲氨酸蛋白酶和同系物的名稱在上排上方給出(MT-SP1(間質(zhì)蛋白酶，本文也稱為St14)、C1r(也稱為C1ra)、C1s(也稱為Gm5077)、Plat和Prss35)。對于各組合“感興趣多肽/蛋白酶表達(dá)被沉默細(xì)胞的條件培養(yǎng)基”，顯示siRNA濃度不同的2種實(shí)驗(yàn)設(shè)置結(jié)果。測定并示于圖1下括號內(nèi)的是與siRNA陰性對照細(xì)胞中蛋白酶基因表達(dá)(設(shè)為100％)相比的剩余蛋白酶基因表達(dá)百分比。這意味著，例如，涉及MT-SP1(18.6％)時，沉默后有18.6％剩余基因表達(dá)。MT-SP1:125pmol(18.6％)和150pmol(18.2％),C1r(C1ra):125pmol(6.3％)和150pmol(6.7％),C1s(Gm5077):100pmol(11.9％)和125pmol(14.4％),Plat:125pmol(8.3％)和150pmol(5.1％)和Prss35:100pmol(18.4％)and125pmol(14.8％)。結(jié)果證明當(dāng)MT-SP1mRNA水平通過RNA干擾下調(diào)時，條件培養(yǎng)基中出現(xiàn)顯著更少的剪切(就mAb和Fc-融合蛋白檢測)。其它表達(dá)的類胰蛋白酶絲氨酸蛋白酶下調(diào)時，剪切保持相同。因此，結(jié)果證明間質(zhì)蛋白酶是負(fù)責(zé)剪切的關(guān)鍵蛋白酶。圖2顯示CHO-K1衍生細(xì)胞的間質(zhì)蛋白酶基因外顯子2加側(cè)翼內(nèi)含子區(qū)的序列。測序引物(草體，加粗和帶下劃線)設(shè)計(jì)成靶向側(cè)翼內(nèi)含子以確認(rèn)源自CHO-K1的MT-SP1外顯子2序列(灰色陰影)。用于獲得間質(zhì)蛋白酶敲除細(xì)胞的TALEN的DNA結(jié)合域結(jié)合位點(diǎn)加粗顯示并帶下劃線，敲除突變的靶區(qū)域加粗顯示并帶雙下劃線。圖3所示直方圖代表CHO-K1衍生間質(zhì)蛋白酶敲除細(xì)胞克隆KO-1到KO-9和克隆Δ7/Δ15以及CHO-K1衍生野生型細(xì)胞系(WT)中測量的間質(zhì)蛋白酶mRNA相對表達(dá)。野生型CHO-K1衍生細(xì)胞系的間質(zhì)蛋白酶mRNA表達(dá)定義為100％?？梢钥闯?，間質(zhì)蛋白酶mRNA表達(dá)在所有敲除克隆和克隆Δ7/Δ15中都減少。圖4顯示在野生型CHO-K1細(xì)胞(WT)及多種不同CHO-K1衍生細(xì)胞克隆的細(xì)胞培養(yǎng)基上清中孵育的3種不同的傾向于剪切的感興趣多肽的蛋白質(zhì)印跡，所述衍生細(xì)胞克隆中間質(zhì)蛋白酶通過不同突變而敲除(參見實(shí)施例2，尤其是表5)。感興趣多肽(濃度各為0.7μM)在獲自野生型CHO-K1細(xì)胞(WT)、表5所示敲除克隆KO-1到KO-9(圖4中分別以數(shù)字1-9指示)的條件培養(yǎng)基中孵育，或在未接觸細(xì)胞的純化學(xué)培養(yǎng)基(+)中孵育。圖4A的感興趣多肽是IgG(mAb)且孵育時間是48小時。圖4B的感興趣多肽是Fc-融合蛋白，孵育時間是24小時。圖4C的感興趣多肽是有2個糖變體的另一重組蛋白，孵育時間是1小時。2個糖變體在獲自野生型CHO-K1細(xì)胞(WT)的條件培養(yǎng)基中都被剪切。完整和經(jīng)剪切蛋白如箭頭所示。圖4D顯示用mAb的實(shí)驗(yàn)重復(fù)結(jié)果，采用從培養(yǎng)3個月的各細(xì)胞獲得的條件培養(yǎng)基。孵育條件與圖4A相同。結(jié)果證明剪切在獲自間質(zhì)蛋白酶敲除細(xì)胞克隆KO-1到KO-9的條件培養(yǎng)基中得到有效預(yù)防，這些有利結(jié)果在長時間培養(yǎng)期間得以維持。圖5A和B顯示傾向于剪切的2種不同病毒糖蛋白(感興趣多肽)的蛋白質(zhì)印跡。在從表達(dá)間質(zhì)蛋白酶的CHO-K1衍生細(xì)胞系(WT)和間質(zhì)蛋白酶敲除的不同細(xì)胞克隆(KO-1到KO-3)獲得的條件培養(yǎng)基中孵育感興趣多肽。在獲自野生型細(xì)胞(WT)的條件培養(yǎng)基、獲自表5所示(分別由數(shù)字1-3指示)敲除克隆KO-1到KO-3的條件培養(yǎng)基或未接觸細(xì)胞的純化學(xué)培養(yǎng)基(+)中以0.7μM濃度孵育感興趣多肽。D1指示孵育時間為24小時且D2指示孵育時間為48h小時。完整和經(jīng)剪切蛋白如箭頭所示(白色和黑色箭頭)。圖5B左側(cè)數(shù)字代表以kDa計(jì)的所測分子量。結(jié)果再次證明剪切在獲自間質(zhì)蛋白酶KO克隆的條件培養(yǎng)基中顯著減少。圖6顯示在表達(dá)野生型間質(zhì)蛋白酶的CHO細(xì)胞(“WT1”和“WT2”)和間質(zhì)蛋白酶突變使得間質(zhì)蛋白酶功能表達(dá)減少的CHO克隆(“Δ7/Δ15”)所得細(xì)胞培養(yǎng)基上清中孵育的Fc-融合蛋白(圖6A)及IgG(mAb)(圖6B)的蛋白質(zhì)印跡。未接觸細(xì)胞的對應(yīng)純化學(xué)培養(yǎng)基(+)用作陽性對照。Fc-融合蛋白和mAb(濃度各為0.7μM)分別孵育2小時和24小時。蛋白質(zhì)印跡側(cè)的數(shù)字代表凝膠所測以kDa計(jì)的大致分子量。結(jié)果證明剪切在，活性間質(zhì)蛋白酶的功能表達(dá)降低的突變細(xì)胞克隆Δ7/Δ15所得條件培養(yǎng)基中有減少間質(zhì)蛋白酶。圖7顯示不同感興趣多肽與2種不同胰酶樣蛋白酶，即來自小鼠的間質(zhì)蛋白酶(MT-SP1)和人Htra1，共孵育的結(jié)果。圖7A顯示mAb(孵育時間24小時)的蛋白質(zhì)印跡分析，圖7B顯示Fc-融合蛋白(孵育時間2小時)的毛細(xì)管凝膠電泳分析(Caliper)，圖7C顯示另一重組蛋白(孵育時間1小時)的蛋白質(zhì)印跡分析。所有實(shí)驗(yàn)設(shè)置中的感興趣多肽濃度是0.7μM。各感興趣多肽用遞減MT-SP1和Htra1測試：蛋白酶與感興趣多肽的摩爾比從左至右，對于MT-SP1為1/10,1/100和1/1000，對于Htra1為1/3,1/10和1/100。感興趣多肽在純化學(xué)培養(yǎng)基“(+)”和獲自CHO-K1衍生野生型細(xì)胞的條件培養(yǎng)基(上清)“(-)”中孵育相同時間。完整蛋白(較大)和經(jīng)剪切蛋白(較小)在圖7A和7C中如箭頭所示。圖7B中，除了完整多肽，還有2類剪切多肽(均以箭頭指示并在一側(cè)說明)。圖7A-圖7C證明剪切在間質(zhì)蛋白酶存在下發(fā)生，從而確認(rèn)間質(zhì)蛋白酶是負(fù)責(zé)剪切的關(guān)鍵蛋白酶。圖8A顯示2種感興趣多肽即單克隆IgG-抗體(上排，孵育時間24小時)和重組蛋白(下排，孵育時間1小時)的蛋白質(zhì)印跡分析。感興趣多肽(濃度各為0.7μM)在純化學(xué)培養(yǎng)基“(+)”、獲自CHO-K1衍生野生型細(xì)胞的條件培養(yǎng)基“(-)”、或加有小家鼠(MusMusculus)的重組間質(zhì)蛋白酶的純化學(xué)培養(yǎng)基((+)+MT-SP1)中孵育。如所示向數(shù)個樣品加入抗MT-SP1抑制Fab片段(“+Fab”)。樣品中的Fab濃度如泳道上方所示(1μM、10μM或50μM)。箭頭指示代表完整或經(jīng)剪切蛋白的蛋白帶。在加入Fab片段的泳道中約25kD處的蛋白帶代表Fab片段。結(jié)果證明向間質(zhì)蛋白酶具有活性的細(xì)胞培養(yǎng)基加入抗MT-SP1Fab片段(選擇性間質(zhì)蛋白酶抑制劑)可減少或甚至防止剪切。結(jié)果進(jìn)一步確認(rèn)間質(zhì)蛋白酶是負(fù)責(zé)剪切的關(guān)鍵蛋白酶。圖9顯示微芯片毛細(xì)管電泳(Caliper)的結(jié)果。重組mAb在CHO-K1衍生野生型細(xì)胞(WT)或間質(zhì)蛋白酶敲除細(xì)胞(KO-4，也參見表5)中表達(dá)，并用親和色譜(蛋白A)純化。泳道上方的數(shù)字代表獲自平行轉(zhuǎn)染和選擇過程的不同mAb生產(chǎn)細(xì)胞池。各泳道中，可見3條蛋白帶，如箭頭所示。上面的蛋白帶代表完整mAb重鏈，第二條帶(第一條正下方)代表經(jīng)剪切的抗體重鏈，底部帶代表mAb輕鏈。結(jié)果顯示當(dāng)感興趣多肽在間質(zhì)蛋白酶敲除細(xì)胞中表達(dá)時，剪切顯著減少。發(fā)明詳述本公開基于以下意外發(fā)現(xiàn)等：經(jīng)改變脊椎動物細(xì)胞能表達(dá)并分泌重組感興趣多肽到細(xì)胞培養(yǎng)基中，然而其中細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)的重組感興趣多肽剪切顯著減少，所述經(jīng)改變細(xì)胞中的內(nèi)源蛋白酶間質(zhì)蛋白酶效果削弱，例如通過減少或消除間質(zhì)蛋白酶基因的功能表達(dá)。因此，在數(shù)百種不同蛋白酶中，鑒定出負(fù)責(zé)剪切重組表達(dá)和分泌多肽的主要蛋白酶。同樣令人非常驚訝的是，靶向和削弱單一蛋白酶活性足以明顯減少或甚至消除細(xì)胞培養(yǎng)基中的剪切。使用例如本發(fā)明所述各個經(jīng)改變脊椎動物細(xì)胞，能顯著提高感興趣多肽的重組生成，這是通過增加能在表達(dá)和分泌后從細(xì)胞培養(yǎng)基獲得的完整感興趣多肽收率來提高。因此，使用本發(fā)明所述經(jīng)改變脊椎動物細(xì)胞以重組生成感興趣多肽時，不必要進(jìn)行額外措施以減少蛋白質(zhì)降解并因而防止感興趣多肽剪切。因此，本發(fā)明對本領(lǐng)域作出重要貢獻(xiàn)。下面詳細(xì)描述本公開的各方面以及合適和優(yōu)選的實(shí)施方式。A.經(jīng)改變的脊椎動物細(xì)胞根據(jù)第一方面，本公開提供適于重組表達(dá)感興趣多肽的經(jīng)分離脊椎動物細(xì)胞，其中所述脊椎動物細(xì)胞被改變成削弱間質(zhì)蛋白酶效果并包括至少一種編碼感興趣多肽的異源多核苷酸，其中該脊椎動物細(xì)胞分泌感興趣多肽。相較間質(zhì)蛋白酶效果未受損的對應(yīng)脊椎動物細(xì)胞，削弱間質(zhì)蛋白酶在脊椎動物細(xì)胞中的效果可減少所分泌重組感興趣多肽的剪切。1993年，間質(zhì)蛋白酶作為所培養(yǎng)乳腺癌細(xì)胞中新的凝膠分解活性而被首次描述。間質(zhì)蛋白酶屬于II型跨膜絲氨酸蛋白酶(TTSP)家族。間質(zhì)蛋白酶的直系同源物存在于不同脊椎動物種中，包括哺乳動物，并在諸如人、黑猩猩、狗、小鼠、大鼠、雞、斑馬魚、斑點(diǎn)綠河豚和虎斑河豚中得以鑒定，這表明是保守進(jìn)化的功能。間質(zhì)蛋白酶根據(jù)IUBMB酶命名法列為EC3.4.21.109。間質(zhì)蛋白酶也稱為膜型絲氨酸蛋白酶1(MT-SP1)和腫瘤發(fā)生抑制物14(ST14)(參見Chen等,《跨膜絲氨酸蛋白酶間質(zhì)蛋白酶：對細(xì)胞生物學(xué)和人類疾病的含義》(TheTransmembraneSerineProteaseMatriptase:ImplicationsforCellularBiologyandHumanDiseases)JMedSci2012；32(3):097-108)。其是膜內(nèi)在蛋白，有接近胞質(zhì)N末端的單跨膜結(jié)構(gòu)域。胞外部分由干區(qū)(包括單一SEA、2個CUB和4個LDLRA結(jié)構(gòu)域)和結(jié)構(gòu)高度類似其它TTSP的C末端絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域組成，且包括對催化活性必要的保守組氨酸/天冬氨酸/絲氨酸(HDS)催化三聯(lián)體(參見例如List等,《間質(zhì)蛋白酶：細(xì)胞表面的有效蛋白水解》(Matriptase:PotentProteolysisonthecellSurface)；MOLMED12(1-3)1-7,2006年1月-3月和Chen等,《跨膜絲氨酸蛋白酶間質(zhì)蛋白酶：對細(xì)胞生物學(xué)和人類疾病的含義》JMedSci2012；32(3):097-108)。間質(zhì)蛋白酶被描述為在許多器官系統(tǒng)的上皮中表達(dá)，如皮膚、乳房、肺、表皮、角膜、唾液腺、口腔和鼻腔、甲狀腺、胸腺、食管、氣管、細(xì)支氣管、肺泡、胃、胰腺、膽囊、十二指腸、小腸、結(jié)腸、直腸、腎、腎上腺、膀胱、尿管、精囊、附睪、前列腺、卵巢、子宮和陰道(參見List等,2006和Chen等,2012)。間質(zhì)蛋白酶合成為無活性酶原并通過復(fù)雜過程轉(zhuǎn)變成其活性形式。關(guān)于活化過程的細(xì)節(jié)涉及內(nèi)切蛋白水解切割，就人間質(zhì)蛋白酶而言描述于List等2006和Chen等2012。間質(zhì)蛋白酶結(jié)合膜作為II型跨膜蛋白，催化結(jié)構(gòu)域朝向胞外空間。此外，文獻(xiàn)描述間質(zhì)蛋白酶的明顯脫落在體內(nèi)發(fā)生，其胞外部分各自脫落(參見List等,2006和Chen等,2012)。文獻(xiàn)描述間質(zhì)蛋白酶以復(fù)合物形式脫落，例如與Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑HAI-1復(fù)合。不同研究表明在人細(xì)胞中，特異抑制劑HAI-1促進(jìn)間質(zhì)蛋白酶轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜，因?yàn)轱@示移出HAI-1或甚至其中的單點(diǎn)突變引起間質(zhì)蛋白酶在高爾基區(qū)室中積聚。除了HAI-1之外，文獻(xiàn)已描述間質(zhì)蛋白酶的數(shù)種不同內(nèi)源抑制劑，如HAI-2、抗凝血酶、α-1抗胰蛋白酶和α-2-抗纖維蛋白溶酶。此外，也已描述其它間質(zhì)蛋白酶抑制劑(參見例如Chen等,2012)。文獻(xiàn)描述間質(zhì)蛋白酶可在正常生理和人體病理學(xué)方面發(fā)揮重要作用，前者如皮膚屏障功能、上皮完整性、毛囊發(fā)育和胸腺內(nèi)穩(wěn)態(tài)，后者如骨關(guān)節(jié)炎、動脈粥樣硬化以及腫瘤進(jìn)展、侵襲和轉(zhuǎn)移。針對所述與重組生成感興趣多肽無關(guān)的科學(xué)背景，本發(fā)現(xiàn)令人非常驚訝：間質(zhì)蛋白酶是負(fù)責(zé)剪切重組生成感興趣多肽的關(guān)鍵蛋白酶，所述感興趣多肽由宿主細(xì)胞分泌到細(xì)胞培養(yǎng)基中。鑒于在脊椎動物細(xì)胞例如尤其是哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)大量和多種蛋白酶，削弱此單一蛋白酶-間質(zhì)蛋白酶-的功能足以顯著減少或甚至消除細(xì)胞培養(yǎng)基中所分泌感興趣多肽的剪切這一發(fā)現(xiàn)更為出乎意料。用其它、甚至密切相關(guān)蛋白酶未見這些有利效果，這支持以下發(fā)現(xiàn)的重要性：間質(zhì)蛋白酶是負(fù)責(zé)剪切細(xì)胞培養(yǎng)基中所分泌重組多肽的關(guān)鍵酶。如示例所示，用內(nèi)源蛋白酶間質(zhì)蛋白酶效果削弱的經(jīng)改變脊椎動物細(xì)胞時，重組感興趣多肽的剪切顯著減少，所述多肽由細(xì)胞分泌入細(xì)胞培養(yǎng)基。例如，通過基因沉默(如實(shí)施例1所示的RNAi)或突變內(nèi)源間質(zhì)蛋白酶(如實(shí)施例2和5所示的敲除2種間質(zhì)蛋白酶等位基因之一或兩種)來削弱間質(zhì)蛋白酶功能，引起細(xì)胞培養(yǎng)基中重組表達(dá)和分泌的感興趣多肽的剪切顯著減少或甚至完全消除。對于傾向于剪切的所有測試多肽如IgG抗體、Fc-融合蛋白、糖基化病毒蛋白和其它治療活性蛋白，都發(fā)現(xiàn)剪切顯著減少。因此，用間質(zhì)蛋白酶缺陷型細(xì)胞系通過重組表達(dá)生成感興趣多肽是有利的。通過示例進(jìn)一步顯現(xiàn)的是，間質(zhì)蛋白酶直接切割分泌入細(xì)胞培養(yǎng)基的感興趣多肽。因此，間質(zhì)蛋白酶效果削弱可減少分泌入細(xì)胞培養(yǎng)基的重組表達(dá)多肽的剪切。此外，如示例所證明，向細(xì)胞培養(yǎng)基加入選擇性間質(zhì)蛋白酶抑制劑也能減少剪切。由于內(nèi)源蛋白酶間質(zhì)蛋白酶在本公開第一方面所述脊椎動物細(xì)胞中的效果被削弱，培養(yǎng)所述細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基中不存在功能活性間質(zhì)蛋白酶或量更少，例如因?yàn)檫@類細(xì)胞不在細(xì)胞表面上呈遞功能性間質(zhì)蛋白酶或呈遞量減少和/或不釋放(如歸因于脫落)功能性間質(zhì)蛋白酶到細(xì)胞培養(yǎng)基中或釋放量減少。由此，分泌入細(xì)胞培養(yǎng)基的重組感興趣多肽的蛋白質(zhì)降解顯著減少或甚至消除，這在重組生成感興趣多肽時是重要優(yōu)勢。由于剪切顯著減少，完整感興趣多肽的收率增加。生成的無功能和潛在免疫原性的經(jīng)剪切副產(chǎn)物更少或甚至沒有。另外，發(fā)現(xiàn)這些新型脊椎動物宿主細(xì)胞一般顯示良好表達(dá)收率且具有良好生長特征，這使其特別適合作為生產(chǎn)細(xì)胞系。下面描述其它優(yōu)勢且通過示例也得以顯現(xiàn)。因此，這些有利的脊椎動物細(xì)胞能重組生成感興趣多肽，產(chǎn)物質(zhì)量和收率提高。此外，使用本發(fā)明所述脊椎動物細(xì)胞優(yōu)選哺乳動物細(xì)胞，可減少開發(fā)生產(chǎn)細(xì)胞系用于重組生成感興趣多肽所需的時間。需要更少或甚至不需要優(yōu)化感興趣多肽以避免或減少剪切，如通過改變氨基酸序列。特別地，移出剪切位點(diǎn)已淘汰。此外，用這些細(xì)胞作為生產(chǎn)細(xì)胞系時，能避免去除經(jīng)剪切蛋白的耗時純化過程。因此，這些脊椎動物細(xì)胞用作重組生成技術(shù)的宿主細(xì)胞系時，具有重要優(yōu)勢。序列表顯示不同脊椎動物種的間質(zhì)蛋白酶示范性氨基酸序列，如倉鼠(SEQIDNO:1–NCBI參考序列:XP_003495890)、人(SEQIDNO:2–NCBI參考序列:NP_068813)、小鼠(SEQIDNO:3–NCBI參考序列:NP_035306)、大鼠(SEQIDNO:4–NCBI參考序列:NP_446087)和黑猩猩(SEQIDNO:5–NCBI參考序列:NP_001189434)。如表1所示，間質(zhì)蛋白酶目前也稱為“腫瘤發(fā)生抑制物14蛋白”(如用于人)和“腫瘤發(fā)生抑制物14蛋白同源物”(如小鼠和中國倉鼠中)。本文所用的術(shù)語“間質(zhì)蛋白酶”具體包括與作為間質(zhì)蛋白酶參照蛋白的SEQIDNO:1-5所示蛋白中一種或多種共有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同性的任何蛋白，且具有與所述間質(zhì)蛋白酶參照蛋白同樣的蛋白水解活性。本文所用的相同性在參照蛋白完整長度上計(jì)算。間質(zhì)蛋白酶不同于其它蛋白酶。文獻(xiàn)中賦予間質(zhì)蛋白酶多個名稱，一些選擇提供于表1。編碼間質(zhì)蛋白酶的對應(yīng)基因也被賦予多個名稱，一些選擇提供于表1。本發(fā)明上下文中，簡單方便起見，所述蛋白酶稱為“間質(zhì)蛋白酶”、“MT-SP1”、“腫瘤發(fā)生抑制物14蛋白”或“腫瘤發(fā)生抑制物14蛋白同源物”。然而，術(shù)語“間質(zhì)蛋白酶”也指并涵蓋所述蛋白或?qū)?yīng)基因的任何別名，如用于表征不同物種中的對應(yīng)蛋白或基因。具有相同功能的間質(zhì)蛋白酶同源物和直系同源物納入術(shù)語“間質(zhì)蛋白酶”。此上下文中，提到間質(zhì)蛋白酶-2和間質(zhì)蛋白酶-3涉及的蛋白酶不同于間質(zhì)蛋白酶(盡管結(jié)構(gòu)相關(guān))，并因而不被本文所用的術(shù)語“間質(zhì)蛋白酶”涵蓋。表1：文獻(xiàn)所用間質(zhì)蛋白酶基因和/或所編碼蛋白產(chǎn)物間質(zhì)蛋白酶的示范性別名(按英語的字母順序排列)編碼間質(zhì)蛋白酶蛋白的基因也在本文稱為“間質(zhì)蛋白酶基因”。已知不同哺乳動物的基因組基因序列，例如描述于中國倉鼠(NCBIGene-ID:100755225)；智人(Homosapiens)(NCBIGene-ID:6768)；小家鼠(Musmusculus)(NCBIGene-ID:19143)；褐家鼠(Rattusnorvegicus)(NCBIGene-ID:114093)；黑猩猩(PanTroglodytes)(NCBIGene-ID:100188950)等。間質(zhì)蛋白酶基因的同義詞列于表1，常用的是“ST14”或“St14”。本文所用的術(shù)語“間質(zhì)蛋白酶基因”具體包括任何下述脊椎動物細(xì)胞內(nèi)源基因：其編碼SEQIDNO:1-5所示間質(zhì)蛋白酶基因，或編碼的間質(zhì)蛋白酶蛋白與作為間質(zhì)蛋白酶參照蛋白的SEQIDNO:1-5所示間質(zhì)蛋白酶蛋白中一種或多種共有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同性且具有與所述間質(zhì)蛋白酶參照蛋白同樣的蛋白水解活性。本文所用的相同性在參照蛋白完整長度上計(jì)算。本公開涉及經(jīng)修飾脊椎動物細(xì)胞等，如優(yōu)選哺乳動物細(xì)胞，其中內(nèi)源間質(zhì)蛋白酶的效果在所述細(xì)胞中削弱，該間質(zhì)蛋白酶通常由對應(yīng)未修飾脊椎動物細(xì)胞內(nèi)源表達(dá)。由于此改變削弱內(nèi)源蛋白酶間質(zhì)蛋白酶的效果，本文所述經(jīng)改變脊椎動物細(xì)胞不呈遞或釋放功能性間質(zhì)蛋白酶到細(xì)胞培養(yǎng)基中或者呈遞或釋放量減少，其中細(xì)胞培養(yǎng)基中所分泌感興趣多肽的剪切減少或甚至完全防止。如示例所證明，此改變可以是短暫或永久的，顯著減少重組感興趣多肽的蛋白質(zhì)降解，所述多肽由所述經(jīng)改變細(xì)胞分泌入細(xì)胞培養(yǎng)基。有數(shù)種可能性來改變并因而調(diào)整脊椎動物細(xì)胞以削弱內(nèi)源間質(zhì)蛋白酶在所述細(xì)胞中的效果。間質(zhì)蛋白酶的效果可削弱，如在基因或蛋白水平。間質(zhì)蛋白酶的效果可削弱，如通過修飾間質(zhì)蛋白酶結(jié)構(gòu)/序列、間質(zhì)蛋白酶轉(zhuǎn)錄、翻譯和/或細(xì)胞運(yùn)輸。下面描述非限制性選項(xiàng)。根據(jù)一個實(shí)施方式，間質(zhì)蛋白酶的效果削弱是因?yàn)殚g質(zhì)蛋白酶基因的功能表達(dá)在所述細(xì)胞中被降低或消除。如示例所示，通過減少或消除間質(zhì)蛋白酶基因的功能表達(dá)，例如通過基因沉默或基因敲除來改變間質(zhì)蛋白酶基因表達(dá)，是提供如下脊椎動物細(xì)胞的極有效措施：此類細(xì)胞適于表達(dá)重組感興趣多肽，然而細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)所分泌感興趣多肽的剪切減少或甚至完全避免。發(fā)現(xiàn)當(dāng)間質(zhì)蛋白酶基因的功能表達(dá)在脊椎動物細(xì)胞中降低或消除時，細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)所分泌重組感興趣多肽的剪切同樣減少。此關(guān)聯(lián)是意外發(fā)現(xiàn)。降低或消除間質(zhì)蛋白酶基因的功能表達(dá)可通過多種方式實(shí)現(xiàn)。例如，功能表達(dá)能如下減少：降低間質(zhì)蛋白酶表達(dá)水平或降低間質(zhì)蛋白酶催化活性或兩者的組合。根據(jù)一個實(shí)施方式，改變所述細(xì)胞，從而間質(zhì)蛋白酶基因的功能表達(dá)通過基因敲除、基因突變、基因缺失、基因沉默或前述的任意組合來減少或消除。根據(jù)一個實(shí)施方式，脊椎動物細(xì)胞的基因組改變成削弱間質(zhì)蛋白酶效果。根據(jù)一個實(shí)施方式，間質(zhì)蛋白酶基因在細(xì)胞中的功能表達(dá)通過基因敲除減少或消除。基因敲除是一種遺傳技術(shù)，通過破壞基因功能使其無效。例如，核酸能插入編碼序列，從而破壞基因功能。此外，完整間質(zhì)蛋白酶基因或其部分可缺失，其中各經(jīng)改變細(xì)胞不表達(dá)蛋白或不表達(dá)功能蛋白。另一選擇是向編碼序列引入一種或多種敲除突變，其提供非功能或功能更少的表達(dá)產(chǎn)物。例如，能引入一種或多種移碼突變，其產(chǎn)生非功能或功能更少的蛋白。替代或補(bǔ)充地，一個或多個終止密碼子能引入編碼序列，從而獲得截短、非功能或功能更少的蛋白。因此，根據(jù)一個實(shí)施方式，間質(zhì)蛋白酶基因包括一種或多種突變，其提供非功能或功能更少的表達(dá)產(chǎn)物。根據(jù)一個實(shí)施方式，所述一種或多種突變是移碼或終止密碼子突變。根據(jù)一個實(shí)施方式，由于引入一種或多種突變，不存在位于間質(zhì)蛋白酶C末端的所有或部分蛋白酶結(jié)構(gòu)域。其他選擇包括但不限于在啟動子、5’UTR、3’UTR和/或其它調(diào)控元件中引入一種或多種突變。根據(jù)一個實(shí)施方式，間質(zhì)蛋白酶基因的啟動子功能被破壞，例如通過引入啟動子缺失或在啟動子與轉(zhuǎn)錄起始之間引入構(gòu)建體。實(shí)現(xiàn)基因缺失以抑制或消除靶基因功能表達(dá)的方法為技術(shù)人員熟知，因而不需要本文任何詳述。盡管如此，下面描述一些非限制性示例。根據(jù)一個實(shí)施方式，間質(zhì)蛋白酶基因通過遺傳工程而在功能上敲除。示例包括但不限于基因組編輯，如工程核酸酶介導(dǎo)的基因組編輯(GEEN)。這是一類遺傳工程，其中在基因組內(nèi)插入、取代或移出DNA，使用人工工程核酸酶或“分子剪刀”。所述核酸酶在所需基因組位置產(chǎn)生特異雙鏈斷裂(DSB)，利用細(xì)胞內(nèi)源機(jī)制通過同源重組(HR)和非同源末端連接(NHEJ)天然過程修復(fù)所誘導(dǎo)的斷裂。有至少4個能用于此目的的工程核酸酶家族：鋅指核酸酶(ZFN)、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(TALEN)、識別規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)(CRISPR)的核酸酶以及工程大范圍核酸酶再改造歸巢核酸內(nèi)切酶。TALEN技術(shù)也用于示例以提供經(jīng)改變哺乳動物細(xì)胞，其中間質(zhì)蛋白酶基因完全或部分敲除，從而削弱間質(zhì)蛋白酶在所述細(xì)胞中的效果。根據(jù)一個實(shí)施方式，脊椎動物細(xì)胞基因組中存在的一個或多個間質(zhì)蛋白酶基因改變，例如敲除或缺失，以減少或消除并因而削弱間質(zhì)蛋白酶在脊椎動物細(xì)胞中的效果。因此，根據(jù)一個實(shí)施方式，至少一個間質(zhì)蛋白酶基因拷貝在脊椎動物細(xì)胞基因組中缺失或功能失活。根據(jù)一個實(shí)施方式，脊椎動物細(xì)胞包括至少一個間質(zhì)蛋白酶基因拷貝中的一種或多種突變以提供非功能或功能更少的表達(dá)產(chǎn)物。一般，脊椎動物細(xì)胞包括間質(zhì)蛋白酶基因的2個等位基因拷貝。一種或多種突變可插入1個或2個間質(zhì)蛋白酶基因拷貝。優(yōu)選地，一種或多種突變插入2個、所有間質(zhì)蛋白酶基因拷貝以提供非功能或功能更少的表達(dá)產(chǎn)物，因而削弱間質(zhì)蛋白酶在脊椎動物細(xì)胞中的效果。由此，基因組中的所有間質(zhì)蛋白酶基因拷貝基本受損或失活。如示例所示，可向間質(zhì)蛋白酶基因的不同等位基因引入不同突變以實(shí)現(xiàn)削弱。根據(jù)一個實(shí)施方式，間質(zhì)蛋白酶基因編碼區(qū)包括所述一種或多種突變并產(chǎn)生非功能或功能更少的表達(dá)產(chǎn)物。例如，間質(zhì)蛋白酶功能可削弱，因?yàn)榻?jīng)改變脊椎動物細(xì)胞包括間質(zhì)蛋白酶基因區(qū)的一種或多種突變，所述區(qū)編碼存在于大于一種催化活性和由此的間質(zhì)蛋白酶功能剪接變體中的氨基酸序列。已在不同物種中鑒定數(shù)種間質(zhì)蛋白酶剪接變體。在大部分或甚至所有鑒定的功能剪接變體中發(fā)現(xiàn)數(shù)種間質(zhì)蛋白酶外顯子。向間質(zhì)蛋白酶基因下述區(qū)引入一種或多種突變是有利的，所述區(qū)編碼大于一種，優(yōu)選大部分或甚至所有各脊椎動物細(xì)胞功能性間質(zhì)蛋白酶剪接變體中存在的外顯子。根據(jù)一個實(shí)施方式，編碼間質(zhì)蛋白酶外顯子2的多核苷酸序列包括一種或多種突變。選擇外顯子2作為改變靶標(biāo)以削弱內(nèi)源蛋白酶間質(zhì)蛋白酶在經(jīng)改變脊椎動物細(xì)胞中的功能具有以下優(yōu)勢：此方法涵蓋數(shù)種不同功能剪接變體。接近間質(zhì)蛋白酶N末端的外顯子如外顯子1、外顯子2和外顯子3是有利的靶標(biāo)，用于引入一種或多種突變，尤其是一種或多種移碼突變。這些外顯子之一中的移碼突變最可能在序列前部產(chǎn)生終止密碼子。由突變基因編碼的截?cái)嗟鞍鬃羁赡苁嵌痰牟⒓俣ㄎ挥诎麅?nèi)和/或無活性。失活的截?cái)嗟鞍资怯欣?，因?yàn)槟芗俣ㄆ浔磉_(dá)對于細(xì)胞而言無毒。然而，一種或多種突變也可被引入后續(xù)外顯子之一，如選自外顯子4-19。所述示例中，產(chǎn)生含外顯子2內(nèi)不同移碼突變的CHO細(xì)胞。示例顯示各經(jīng)改變細(xì)胞維持細(xì)胞生長。因此，示例測試的所編碼間質(zhì)蛋白酶截?cái)嘈问斤@然對于細(xì)胞而言無毒。此外，發(fā)現(xiàn)各突變間質(zhì)蛋白酶基因的總mRNA表達(dá)較低，從而獲得更低水平的截?cái)嘈问?見圖3)。由此，示例證明各改變有效以削弱間質(zhì)蛋白酶在脊椎動物細(xì)胞如優(yōu)選哺乳動物細(xì)胞中的功能，同時維持對重組生成感興趣多肽重要的其它特征。因此，根據(jù)一個實(shí)施方式，分離的脊椎動物細(xì)胞包括間質(zhì)蛋白酶基因外顯子2中的至少一種移碼突變，引起非功能或功能更少的截?cái)喽嚯谋磉_(dá)。根據(jù)一個優(yōu)選實(shí)施方式，所述脊椎動物細(xì)胞是CHO細(xì)胞，其包括間質(zhì)蛋白酶基因等位基因之一或優(yōu)選兩者的外顯子2中的一種或多種移碼突變，從而削弱間質(zhì)蛋白酶在所述CHO細(xì)胞中的效果。根據(jù)一個實(shí)施方式，所述脊椎動物細(xì)胞包括間質(zhì)蛋白酶基因多核苷酸序列中的一種或多種突變，所述序列編碼至少部分間質(zhì)蛋白酶催化結(jié)構(gòu)域，從而獲得非功能或功能更少的表達(dá)產(chǎn)物。催化結(jié)構(gòu)域是酶與其底物相互作用引起酶反應(yīng)的區(qū)域。一種或多種突變可被引入此結(jié)構(gòu)域，從而蛋白的催化活性降低或消除。催化結(jié)構(gòu)域由外顯子16、17、18和19中的氨基酸編碼。因此，根據(jù)一個實(shí)施方式，所述脊椎動物細(xì)胞包括選自外顯子16、外顯子17、外顯子18和外顯子19中一個或多個外顯子內(nèi)的一種或多種突變。根據(jù)一個實(shí)施方式，催化結(jié)構(gòu)域的一種或多種突變導(dǎo)致間質(zhì)蛋白酶催化活性降低或消除。這可實(shí)現(xiàn)，例如通過移碼突變，通過定點(diǎn)突變、終止密碼子突變和/或催化結(jié)構(gòu)域缺失或插入。根據(jù)一個實(shí)施方式，引入一種或多種突變，從而改變間質(zhì)蛋白酶催化三聯(lián)體，由此提供非功能或功能更少的蛋白。間質(zhì)蛋白酶的催化失活突變體如G827R-間質(zhì)蛋白酶或S805A-間質(zhì)蛋白酶也描述于文獻(xiàn)(參見Désilets等,TheJournalofBiologicalChemistry283卷,第16號,10535-10542頁,2008)。此外，已知重組間質(zhì)蛋白酶催化結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)。根據(jù)此結(jié)構(gòu)和序列數(shù)據(jù)，技術(shù)人員能推斷用于突變的進(jìn)一步特異靶標(biāo)以削弱間質(zhì)蛋白酶的催化功能。間質(zhì)蛋白酶功能表達(dá)削弱的經(jīng)改變細(xì)胞也可用隨機(jī)突變或篩選方法獲得。本領(lǐng)域已知各方法，因此不需要詳述。隨后，可鑒定間質(zhì)蛋白酶功能表達(dá)削弱的經(jīng)改變細(xì)胞，如用第七方面所述方法。間質(zhì)蛋白酶功能表達(dá)也能如下影響：改變間質(zhì)蛋白酶基因的啟動子和/或增強(qiáng)子，從而生成更少轉(zhuǎn)錄本或不生成，或者通過基因沉默技術(shù)如轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后基因沉默。根據(jù)一個實(shí)施方式，所述分離的脊椎動物細(xì)胞包括間質(zhì)蛋白酶基因啟動子區(qū)的一種或多種突變。例如，啟動子區(qū)可改變成提供功能更少或非功能啟動子區(qū)，啟動子也可完全去除。替代或補(bǔ)充地，能在間質(zhì)蛋白酶基因啟動子與起始密碼子之間加入編碼多肽、含終止密碼子的多核苷酸序列，這引起表達(dá)其它多肽而不是間質(zhì)蛋白酶。例如，由啟動子與起始密碼子之間所插入多核苷酸序列編碼的多肽可以是報告多肽，如綠色熒光蛋白(GFP)。報告子的信號指示編碼該報告子的異源多核苷酸得以表達(dá)，而不是表達(dá)間質(zhì)蛋白酶，從而能容易鑒定間質(zhì)蛋白酶功能表達(dá)削弱的細(xì)胞。功能性基因表達(dá)的降低可達(dá)到甚至消除功能表達(dá)的水平。能實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄后基因沉默，例如用反義分子或介導(dǎo)RNA干擾的分子。下面簡要介紹非限制性示例。反義多核苷酸可設(shè)計(jì)成特異結(jié)合RNA，引起RNA-DNA或RNA-RNA雜交體形成，阻滯逆轉(zhuǎn)錄或信使RNA翻譯。已開發(fā)許多反義形式并能大致分為酶依賴性反義或空間阻斷反義。酶依賴性反義包括取決于核糖核酸酶H降解靶mRNA活性的形式，包括單鏈DNA、RNA和硫代磷酸反義。反義多核苷酸一般通過從反義構(gòu)建體表達(dá)而在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生，所述構(gòu)建體包含反義鏈作為轉(zhuǎn)錄鏈。反式剪切催化RNA(核酶)是具有內(nèi)切核糖核酸酶活性的RNA分子。核酶可特異設(shè)計(jì)用于特定靶標(biāo)且可改造成在細(xì)胞RNA背景下位點(diǎn)特異性切割任何RNA種類。切割事件使得mRNA不穩(wěn)定并防止蛋白表達(dá)。脊椎動物細(xì)胞基因組能改變成表達(dá)相應(yīng)反義分子例如永久表達(dá)。另一用于在轉(zhuǎn)錄后水平降低間質(zhì)蛋白酶基因功能表達(dá)的合適選擇是基于RNA干擾(RNAi)。如基于跟蹤標(biāo)定實(shí)驗(yàn)的示例所示，通過RNAi減少間質(zhì)蛋白酶表達(dá)可有效用于降低重組感興趣多肽的剪切程度，所述多肽由相應(yīng)經(jīng)改變脊椎動物細(xì)胞表達(dá)和分泌入細(xì)胞培養(yǎng)基。明顯更多的重組多肽在RNAi沉默間質(zhì)蛋白酶基因后于上清/細(xì)胞培養(yǎng)基中保持完整，并能從中收獲。相比之下，降低其它蛋白酶甚至密切相關(guān)絲氨酸蛋白酶的表達(dá)水平對剪切沒有影響或影響很少。這強(qiáng)調(diào)在脊椎動物細(xì)胞優(yōu)選哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)感興趣多肽時，鑒定間質(zhì)蛋白酶是負(fù)責(zé)剪切的主要蛋白酶的重要性。通過RNAi沉默靶基因的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知，因而不需在此任何詳述。誘導(dǎo)RNAi的化合物能用于沉默間質(zhì)蛋白酶基因表達(dá)從而提供間質(zhì)蛋白酶效果削弱的經(jīng)改變細(xì)胞，所述化合物示例包括但不限于短干擾核酸(siNA)、短干擾RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、小發(fā)夾RNA(shRNA)以及其前體，所述前體在細(xì)胞中加工成實(shí)際誘導(dǎo)RNAi的化合物。根據(jù)一個實(shí)施方式，siRNA用于沉默。siRNA可作為各鏈有3’突出的雙鏈分子提供。也可使用鈍端分子。所述siRNA可包括脫氧-以及核糖核苷酸，進(jìn)一步包括經(jīng)修飾核苷酸。siRNA化合物的一些實(shí)施方式和變化為本領(lǐng)域并能用于降低間質(zhì)蛋白酶表達(dá)。在RNA水平靶向靶基因中選定/鑒定靶序列的合適siRNA能用適當(dāng)計(jì)算方法鑒定，應(yīng)用某些設(shè)計(jì)-算法。為獲得針對靶轉(zhuǎn)錄本的siRNA，雙鏈分子能直接轉(zhuǎn)染入細(xì)胞。如示例所示，即使這種降低間質(zhì)蛋白酶表達(dá)的瞬時法仍可有效防止感興趣多肽在這類脊椎動物細(xì)胞所得條件培養(yǎng)基中剪切?；蛘撸瑂iRNA可通過dicer加工產(chǎn)生，dicer是將長dsRNA或小發(fā)夾RNA(shRNA)轉(zhuǎn)變成siRNA的酶。這些前體或終siRNA分子能外源(人工)生成，然后能通過多種轉(zhuǎn)染方法引入脊椎動物細(xì)胞。根據(jù)另一個實(shí)施方式，誘導(dǎo)RNAi的化合物由轉(zhuǎn)染入脊椎動物細(xì)胞的載體表達(dá)。對于siRNA，這可如下完成：例如通過在2條鏈之間引入環(huán)，從而生成單一轉(zhuǎn)錄本，其隨后能在脊椎動物細(xì)胞中加工成功能siRNA。這類轉(zhuǎn)錄盒一般使用RNA聚合酶III啟動子(例如U6或H1)，所述啟動子通常指導(dǎo)小核RNA轉(zhuǎn)錄(如用于表達(dá)shRNA)。假定自載體所得shRNA轉(zhuǎn)錄本隨后由dicer加工，從而生成雙鏈siRNA分子，優(yōu)選具有特征性3’突出。根據(jù)一個實(shí)施方式，這種提供shRNA的載體穩(wěn)定整合入脊椎動物細(xì)胞基因組。此實(shí)施方式有利，因?yàn)殚g質(zhì)蛋白酶基因下調(diào)歸因于不斷生成的siRNA，相當(dāng)穩(wěn)定且非瞬時。例如，含提供shRNA的相應(yīng)載體的細(xì)胞隨之能用表達(dá)載體轉(zhuǎn)染，所述載體包括待由脊椎動物細(xì)胞表達(dá)和分泌的感興趣多肽的編碼多核苷酸。此外，可采用共轉(zhuǎn)染策略，其中產(chǎn)生shRNA的載體與含感興趣多肽編碼多核苷酸的表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染。例如，轉(zhuǎn)錄基因沉默可包括表觀遺傳修飾。此外，間質(zhì)蛋白酶基因序列能改變成縮短mRNA半衰期。這也能實(shí)現(xiàn)間質(zhì)蛋白酶功能表達(dá)減少。根據(jù)一個實(shí)施方式，通過靶向參與間質(zhì)蛋白酶基因表達(dá)調(diào)節(jié)的調(diào)控元件，減少或消除間質(zhì)蛋白酶表達(dá)。例如，能靶向轉(zhuǎn)錄因子、啟動子(也見上)、增強(qiáng)子、UTR或其它調(diào)控元件，如通過敲除、缺失、突變、下調(diào)或使所述調(diào)控元件滅活或活性降低的任何其它改變，從而防止或減少間質(zhì)蛋白酶基因功能表達(dá)并由此削弱間質(zhì)蛋白酶在所述細(xì)胞中的效果。根據(jù)一個實(shí)施方式，所述脊椎動物細(xì)胞改變成通過異源表達(dá)突變間質(zhì)蛋白酶來削弱間質(zhì)蛋白酶功能，所述突變間質(zhì)蛋白酶是非功能或功能小于內(nèi)源間質(zhì)蛋白酶。在此實(shí)施方式中，除了編碼感興趣多肽的異源多核苷酸以外，所述分離的脊椎動物細(xì)胞還包括編碼突變間質(zhì)蛋白酶的另一異源多核苷酸。突變間質(zhì)蛋白酶的催化活性相較內(nèi)源間質(zhì)蛋白酶減小或甚至沒有。通過過表達(dá)相應(yīng)的突變間質(zhì)蛋白酶，所述突變、失活形式而不是內(nèi)源間質(zhì)蛋白酶插入質(zhì)膜的可能性增加，用于產(chǎn)生顯性負(fù)表型。另一削弱并因而減少細(xì)胞正常所表達(dá)間質(zhì)蛋白酶效果的選擇是異源表達(dá)蛋白如抗體或間質(zhì)蛋白酶抑制劑，其中和和/或抑制間質(zhì)蛋白酶并因此削弱間質(zhì)蛋白酶效果。根據(jù)一個實(shí)施方式，通過改變與細(xì)胞內(nèi)間質(zhì)蛋白酶功能性相互作用的分子的功能表達(dá)，削弱間質(zhì)蛋白酶在細(xì)胞中的效果。根據(jù)一個實(shí)施方式，通過削弱間質(zhì)蛋白酶胞內(nèi)運(yùn)輸，削弱間質(zhì)蛋白酶在細(xì)胞中的功能。根據(jù)另一實(shí)施方式，通過妨礙間質(zhì)蛋白酶酶原激活，削弱間質(zhì)蛋白酶功能。根據(jù)一個實(shí)施方式，通過上調(diào)一個或多個內(nèi)源細(xì)胞間質(zhì)蛋白酶抑制劑和/或共表達(dá)間質(zhì)蛋白酶抑制劑，削弱間質(zhì)蛋白酶功能。迄今已描述不同脊椎動物細(xì)胞中的數(shù)種間質(zhì)蛋白酶內(nèi)源抑制劑，如HAI-1、HAI-2、α1-抗胰蛋白酶,α2-抗纖維蛋白溶酶、抗凝血酶(參見Chen等,2012的綜述)。如果由待改變的脊椎動物細(xì)胞表達(dá)，上調(diào)這些抑制劑表達(dá)和/或共表達(dá)這些抑制劑也可削弱內(nèi)源蛋白酶間質(zhì)蛋白酶的功能，從而減少細(xì)胞培養(yǎng)基中所分泌感興趣多肽的剪切。根據(jù)一個實(shí)施方式，通過重組表達(dá)拮抗劑如抗體或其結(jié)合域，削弱間質(zhì)蛋白酶的功能表達(dá)。例如，各拮抗劑能由脊椎動物細(xì)胞過表達(dá)。根據(jù)一個實(shí)施方式，改變間質(zhì)蛋白酶編碼序列，從而蛋白保留在ER中。例如，間質(zhì)蛋白酶蛋白能改變成包括KDEL基序，其具有使間質(zhì)蛋白酶保留于ER的效果。還可采用類似方式。削弱內(nèi)源蛋白酶間質(zhì)蛋白酶的效果可產(chǎn)生經(jīng)改變細(xì)胞，其中相較內(nèi)源蛋白酶間質(zhì)蛋白酶功能未受損的對應(yīng)脊椎動物細(xì)胞，由所述經(jīng)改變細(xì)胞表達(dá)和分泌的重組感興趣多肽的剪切減少或甚至沒有。如本文所述，用間質(zhì)蛋白酶效果削弱的各經(jīng)改變細(xì)胞作為重組表達(dá)的宿主細(xì)胞時，沒有或更少功能性間質(zhì)蛋白酶在含所述宿主細(xì)胞且感興趣多肽分泌入其中的細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)具有活性。根據(jù)一個實(shí)施方式，相較間質(zhì)蛋白酶效果未受損的未改變對應(yīng)參照脊椎動物細(xì)胞(設(shè)為100％)，間質(zhì)蛋白酶基因的表達(dá)為40％或更少，35％或更少，30％或更少，25％或更少，20％或更少，15％或更少，12.5％或更少，10％或更少，5％或更少，2.5％或更少，1.5％或更少，1％或更少或者0.05％或更少。根據(jù)一個實(shí)施方式，在第一方面所述經(jīng)改變細(xì)胞中，相較所述細(xì)胞中的18SRNA表達(dá)(設(shè)為100％)，間質(zhì)蛋白酶基因表達(dá)為0.1％或更少，0.075％或更少，0.05％或更少，0.045％或更少，0.04％或更少，0.035％或更少，0.03％或更少，0.025％或更少，0.02％或更少，0.015％或更少，0.01％或更少，0.0075％或更少，0.005％或更少，0.0045％或更少，0.004％或更少，0.0035％或更少，0.003％或更少，0.0025％或更少，0.002％或更少，0.0015％或更少或者0.001％或更少。根據(jù)一個實(shí)施方式，相較所述細(xì)胞中的18SRNA表達(dá)(設(shè)為100％)，間質(zhì)蛋白酶基因表達(dá)為0.00075％或更少，0.0005％或更少或者0.0004％或更少。間質(zhì)蛋白酶基因的功能表達(dá)減少或消除，從而相較間質(zhì)蛋白酶基因的功能表達(dá)未減少或消除的對應(yīng)參照脊椎動物細(xì)胞(從中獲得經(jīng)改變細(xì)胞)，由所述細(xì)胞分泌入細(xì)胞培養(yǎng)基的重組感興趣多肽的剪切減少。例如，間質(zhì)蛋白酶功能表達(dá)減少的經(jīng)改變CHO細(xì)胞與作為參照脊椎動物細(xì)胞的CHO野生型細(xì)胞作比較以分析所述特征。作為測試多肽，使用在由參照脊椎動物細(xì)胞表達(dá)時傾向于剪切的多肽。根據(jù)一個實(shí)施方式，相較間質(zhì)蛋白酶基因的功能表達(dá)未減少或消除的對應(yīng)參照脊椎動物細(xì)胞，剪切降低至少2倍、至少3倍、至少5倍、至少7.5倍、至少8倍或至少10倍。這能用實(shí)施例所述測定檢測。所述經(jīng)改變脊椎動物細(xì)胞獲自內(nèi)源表達(dá)間質(zhì)蛋白酶的物種和細(xì)胞類型。所述脊椎動物細(xì)胞優(yōu)選是哺乳動物細(xì)胞。因此，本文就脊椎動物細(xì)胞所述的全部實(shí)施方式普遍適用且特定指采用哺乳動物細(xì)胞的優(yōu)選實(shí)施方式。術(shù)語“分離”僅用于明確脊椎動物細(xì)胞不包含于活生物體如動物或人。如本文所述，脊椎動物細(xì)胞能以細(xì)胞培養(yǎng)物、細(xì)胞系、細(xì)胞克隆等的形式提供。示例也如下所述。如上所述，所述脊椎動物細(xì)胞改變成相較內(nèi)源表達(dá)間質(zhì)蛋白酶的對應(yīng)未改變脊椎動物細(xì)胞，削弱間質(zhì)蛋白酶效果。削弱優(yōu)選通過減少或消除間質(zhì)蛋白酶基因的功能表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。實(shí)施方式如上所述。為提供有穩(wěn)定、一致并因而可預(yù)測特征的生產(chǎn)細(xì)胞系，優(yōu)選改變脊椎動物細(xì)胞基因組以達(dá)到間質(zhì)蛋白酶削弱。合適的實(shí)施方式如上所述。然后，各經(jīng)改變脊椎動物細(xì)胞能用含感興趣多肽編碼多核苷酸的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染以提供本公開所述宿主細(xì)胞，其包括編碼感興趣多肽的異源多核苷酸并分泌感興趣多肽到細(xì)胞培養(yǎng)基中。所述脊椎動物細(xì)胞優(yōu)選是哺乳動物細(xì)胞，且可例如選自嚙齒動物細(xì)胞、人細(xì)胞和猴細(xì)胞。優(yōu)選的脊椎動物細(xì)胞是嚙齒動物細(xì)胞，如衍生自倉鼠或小鼠的細(xì)胞。嚙齒動物細(xì)胞可以是選自以下的細(xì)胞系：中國倉鼠細(xì)胞系(如中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞)、BHK細(xì)胞系、NS0細(xì)胞系、C127細(xì)胞系、小鼠3T3成纖維細(xì)胞系和SP2/0細(xì)胞系。尤其優(yōu)選CHO細(xì)胞，如CHO-K1衍生CHO細(xì)胞。如示例所示，降低或消除間質(zhì)蛋白酶在CHO細(xì)胞中的功能表達(dá)可提供條件細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所分泌感興趣多肽的剪切顯著減少或甚至消除。間質(zhì)蛋白酶還表達(dá)于人細(xì)胞。因此，根據(jù)一個實(shí)施方式，所述脊椎動物細(xì)胞衍生自人細(xì)胞，其可例如選自HEK293細(xì)胞、MCF-7細(xì)胞、PerC6細(xì)胞、CAP細(xì)胞、造血細(xì)胞和HeLa細(xì)胞。另一替代選擇是猴細(xì)胞，其可例如選自COS細(xì)胞、COS-1、COS-7細(xì)胞和Vero細(xì)胞。根據(jù)一個實(shí)施方式，所述脊椎動物細(xì)胞作為細(xì)胞克隆、細(xì)胞系或細(xì)胞培養(yǎng)物提供?！案信d趣多肽”是應(yīng)由脊椎動物細(xì)胞大量表達(dá)和分泌的重組多肽。感興趣多肽由所述細(xì)胞所含異源多核苷酸編碼。所述宿主細(xì)胞可包括一種以上編碼感興趣多肽的異源多核苷酸。感興趣多肽由脊椎動物細(xì)胞分泌入細(xì)胞培養(yǎng)基，從培養(yǎng)基中可收獲所述多肽，例如分離和純化。本文所用的“異源多核苷酸”或“異源核酸”等表達(dá)特定指引入脊椎動物細(xì)胞的多核苷酸序列，例如通過用重組技術(shù)如轉(zhuǎn)染?！岸嗪塑账帷碧囟ㄖ竿ǔＣ撗鹾颂腔蚝颂且粋€一個連接而成的核苷酸聚合物，并根據(jù)上下文指DNA和RNA。術(shù)語“多核苷酸”不包括任何大小限制。在至少一種編碼感興趣多肽的異源多核苷酸以外，所述脊椎動物細(xì)胞可包括編碼選擇性標(biāo)記的異源多核苷酸和/或編碼報告子的異源多核苷酸。這簡化對成功轉(zhuǎn)染并因而表達(dá)感興趣多肽的宿主細(xì)胞的選擇。此外，所述脊椎動物細(xì)胞可包括編碼不同選擇性標(biāo)記和/或報告多肽的數(shù)種多核苷酸?！斑x擇性標(biāo)記”允許在合適選擇性培養(yǎng)條件下選擇表達(dá)所述選擇性標(biāo)記的宿主細(xì)胞。選擇性標(biāo)記為所述標(biāo)記的運(yùn)載體提供選擇性培養(yǎng)條件下的存活和/或生長優(yōu)勢。通常，選擇性標(biāo)記會賦予對選擇劑如藥物例如抗生素或其它毒劑的抗性，或補(bǔ)償宿主細(xì)胞的代謝或分解代謝缺陷。其可以是正或負(fù)選擇性標(biāo)記。根據(jù)一個實(shí)施方式，所述選擇性標(biāo)記是編碼蛋白的耐藥標(biāo)記，賦予對涉及所述藥物的選擇性條件的抗性。已描述多種選擇性標(biāo)記基因(參見例如WO92/08796、WO94/28143、WO2004/081167、WO2009/080759、WO2010/097240)。例如，可使用至少一種選擇性標(biāo)記，其賦予對一種或多種抗生素制劑的耐受性。根據(jù)一個實(shí)施方式，所述選擇性標(biāo)記可以是可擴(kuò)增選擇性標(biāo)記。可擴(kuò)增選擇性標(biāo)記允許選擇含宿主細(xì)胞的載體且可促進(jìn)所述載體在宿主細(xì)胞中的基因擴(kuò)增。常用于脊椎動物細(xì)胞的選擇性標(biāo)記基因包括以下的基因：氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶(APH)、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(hyg)、二氫葉酸還原酶(DHFR)、胸苷激酶(tk)、谷氨酰氨合成酶、天冬酰胺合成酶，以及編碼耐受以下的基因：新霉素(G418)、嘌呤霉素、潮霉素,博萊霉素、烏本苷、殺稻瘟菌素、組氨醇D、爭光霉素、腐草霉素和霉酚酸。根據(jù)一個實(shí)施方式，葉酸受體用作選擇性標(biāo)記，聯(lián)合本文所述新型脊椎動物細(xì)胞(參見例如WO2009/080759)，優(yōu)選哺乳動物細(xì)胞。葉酸受體能與DHFR聯(lián)用作選擇性標(biāo)記，如WO10/097240所述?！皥蟾娑嚯摹痹试S根據(jù)報告特征(如熒光)鑒定表達(dá)所述報告多肽的細(xì)胞。報告基因通常不為宿主細(xì)胞提供生存優(yōu)勢。然而，表達(dá)報告多肽能用于區(qū)分表達(dá)報告多肽的細(xì)胞與不表達(dá)的細(xì)胞。因此，報告基因也允許選擇成功轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。例如，合適的報告多肽包括但不限于綠色熒光蛋白(GFP)、YFP、CFP和螢光素酶。根據(jù)一個實(shí)施方式，所述報告多肽具有能通過流式細(xì)胞術(shù)選擇的特征。根據(jù)一個實(shí)施方式，至少一種編碼感興趣多肽的異源多核苷酸整合入所述細(xì)胞基因組，其中可選地，至少一種編碼選擇性標(biāo)記或報告多肽的異源多核苷酸額外整合入所述細(xì)胞基因組。表達(dá)載體能用于向宿主引入異源多核苷酸。所述多核苷酸能包括于表達(dá)盒中。編碼感興趣多肽的多核苷酸與編碼選擇性標(biāo)記或報告多肽的多核苷酸可位于同一或不同表達(dá)載體。如果其位于不同表達(dá)載體，這些表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞。如本領(lǐng)域熟知，這種共轉(zhuǎn)染策略同樣允許進(jìn)行選擇。例如，通過將含感興趣多肽編碼多核苷酸的合適表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞，可實(shí)現(xiàn)引入脊椎動物細(xì)胞。表達(dá)載體優(yōu)選整合入宿主細(xì)胞基因組(穩(wěn)定轉(zhuǎn)染)。在異源核酸不插入基因組的情況下，所述異源核酸可能在后期喪失，如當(dāng)細(xì)胞經(jīng)歷有絲分裂時(瞬時轉(zhuǎn)染)。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染優(yōu)選用于產(chǎn)生高表達(dá)細(xì)胞克隆，從而以工業(yè)規(guī)模生成感興趣多肽。這對治療活性或診斷性感興趣多肽尤其重要。本領(lǐng)域已知數(shù)種合適方法用于向脊椎動物宿主細(xì)胞優(yōu)選哺乳動物宿主細(xì)胞引入異源核酸如表達(dá)載體，因而不需要本文任何詳述。各個方法包括但不限于磷酸鈣轉(zhuǎn)染、電穿孔、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染、基因槍和聚合物介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移等。除了基于隨機(jī)整合的傳統(tǒng)方法，重組介導(dǎo)方法也能用于轉(zhuǎn)移異源多核苷酸到宿主細(xì)胞基因組。由于各方法為本領(lǐng)域熟知，其不需要在此任何詳述。合適載體設(shè)計(jì)的非限制性實(shí)施方式也隨后描述并參考各公開。用于實(shí)現(xiàn)宿主細(xì)胞中感興趣多肽表達(dá)的表達(dá)載體通常包含適于驅(qū)動轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄控制元件，如啟動子、增強(qiáng)子、聚腺苷酸化信號、轉(zhuǎn)錄暫?；蚪K止信號常作為表達(dá)盒元件。合適的翻譯控制元件優(yōu)選納入載體，如5’非翻譯區(qū)(引起適合募集核糖體的5’帽結(jié)構(gòu))以及終止翻譯過程的終止密碼子。所得轉(zhuǎn)錄本包含促進(jìn)蛋白表達(dá)(即翻譯)和合適翻譯終止的功能翻譯元件。能恰當(dāng)驅(qū)動所納入多核苷酸表達(dá)的功能表達(dá)單元也稱為“表達(dá)盒”。技術(shù)人員熟知表達(dá)盒應(yīng)如何設(shè)計(jì)以允許感興趣多肽在脊椎動物細(xì)胞中表達(dá)和分泌。為實(shí)現(xiàn)重組感興趣多肽分泌入細(xì)胞培養(yǎng)基，在感興趣多肽中提供合適前導(dǎo)肽。實(shí)現(xiàn)感興趣多肽分泌的前導(dǎo)序列和表達(dá)盒設(shè)計(jì)為本領(lǐng)域熟知，因此不需要在本文描述。任何感興趣多肽能表達(dá)于本發(fā)明所述脊椎動物細(xì)胞。術(shù)語“多肽”指含氨基酸聚合物的分子，這些氨基酸由肽鍵相連。多肽包括任意長度的多肽，包括蛋白(如具有大于50個氨基酸)和肽(如2-49個氨基酸)。多肽包括具有任意活性、功能或尺寸的蛋白和/或肽，且包括例如酶(如激酶、磷酸酶)、受體、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、殺菌和/或內(nèi)毒素結(jié)合蛋白、結(jié)構(gòu)多肽、膜結(jié)合多肽、糖多肽、球蛋白、免疫多肽、毒素、抗生素、激素、生長因子、血液因子、疫苗、病毒糖多肽等。根據(jù)本文所教授表達(dá)的感興趣多肽也可以是多肽亞基或結(jié)構(gòu)域，如抗體重鏈或輕鏈或者其功能片段或衍生物。根據(jù)上下文，術(shù)語“感興趣多肽”可指這種個體亞基或結(jié)構(gòu)域或者由各亞基或結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的終蛋白。根據(jù)一個實(shí)施方式，所述感興趣多肽選自治療或診斷多肽。治療和因而治療活性多肽尤其重要。術(shù)語治療多肽也包括預(yù)防多肽，如用于疫苗接種。所述多肽可選自肽激素、白介素、組織纖溶酶原激活物、細(xì)胞因子、生長因子、免疫球蛋白，尤其是抗體或其功能抗體片段或變體或衍生物以及Fc-融合蛋白。在一個實(shí)施方式中，感興趣多肽是免疫球蛋白分子如抗體。本文所用的術(shù)語“抗體”具體指含至少2條重鏈和2條輕鏈的蛋白，所述鏈由二硫鍵連接。術(shù)語“抗體”包括天然出現(xiàn)的抗體以及所有抗體重組形式，例如人源化抗體、全人抗體和嵌合抗體。各重鏈通常由重鏈可變區(qū)(VH)和重鏈恒定區(qū)(CH)組成。各輕鏈通常由輕鏈可變區(qū)(VL)和輕鏈恒定區(qū)(CL)組成。然而，術(shù)語“抗體”也包括其它抗體類型，如單域抗體、重鏈抗體和納米抗體，重鏈抗體即抗體僅由一條或多條特別是2條重鏈組成，納米抗體即抗體僅由一個單體可變域組成。納米抗體也可連接形成多價結(jié)構(gòu)。如上所討論，編碼感興趣多肽的多核苷酸還可編碼一個或多個抗體亞基或結(jié)構(gòu)域，如重鏈或輕鏈或其功能片段或衍生物，作為感興趣多肽。所述亞基或結(jié)構(gòu)域能表達(dá)自同一或不同表達(dá)盒。抗體“功能片段或衍生物”具體指衍生自某抗體且能與該抗體結(jié)合同一抗原尤其是相同表位的多肽。已顯示抗體的抗原結(jié)合功能可由全長抗體的片段或其衍生物執(zhí)行。抗體片段或衍生物的示例包括(i)Fab片段，由各重鏈和輕鏈的第一恒定結(jié)構(gòu)域以及可變區(qū)組成的單價片段；(ii)F(ab)2片段，含2個Fab片段的二價片段，所述Fab片段由二硫鍵在鉸鏈區(qū)連接；(iii)Fd片段，由重鏈第一恒定結(jié)構(gòu)域CH1和可變區(qū)組成；(iv)Fv片段，由抗體單臂重鏈和輕鏈可變區(qū)組成；(v)scFv片段，由單一多肽鏈組成的Fv片段；(vi)(Fv)2片段，由2個共價相連的Fv片段組成；(vii)重鏈可變結(jié)構(gòu)域；和(viii)多抗體，由共價相連的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)組成，相連方式使得重鏈與輕鏈可變區(qū)的聯(lián)合僅能在分子間發(fā)生，而非分子內(nèi)。根據(jù)一個實(shí)施方式，經(jīng)改變脊椎動物細(xì)胞表達(dá)的感興趣多肽受蛋白酶剪切影響。根據(jù)一個實(shí)施方式，所述感興趣多肽包括至少一個由間質(zhì)蛋白酶識別的剪切位點(diǎn)。已鑒定傾向于剪切的數(shù)種多肽，所述多肽選自糖蛋白、抗體、非IgG蛋白、Fab片段、蛋白質(zhì)復(fù)合體、肽酶、信號肽、Fc-融合蛋白、納米抗體、生長因子、激素、細(xì)胞因子、病毒糖多肽、血液因子和酶。這些多肽很多包含一個以上剪切位點(diǎn)，對剪切特別敏感。在本公開所述經(jīng)改變脊椎動物細(xì)胞中表達(dá)傾向于剪切的多肽作為感興趣多肽是有利的，因?yàn)榧?xì)胞培養(yǎng)基中所分泌感興趣多肽的剪切顯著減少或甚至消除，如示例所證明。所述脊椎動物細(xì)胞可包括或不包括與編碼感興趣多肽的多核苷酸對應(yīng)、相應(yīng)等同的內(nèi)源多核苷酸。根據(jù)一個實(shí)施方式，所述脊椎動物細(xì)胞不包括對應(yīng)感興趣多肽的內(nèi)源基因。根據(jù)一個實(shí)施方式，所述感興趣多肽不是或不包括間質(zhì)蛋白酶。根據(jù)一個實(shí)施方式，所述感興趣多肽不是或不包括HAI-1。所述脊椎動物細(xì)胞所含表達(dá)載體或表達(dá)載體組合可額外包括其它載體元件。例如，可包括至少一種編碼另一感興趣產(chǎn)物的額外多核苷酸。如上所解釋且通過能根據(jù)本教授內(nèi)容表達(dá)的上述多肽示例顯見，待由宿主細(xì)胞生成和分泌的最終多肽也可以是由數(shù)種個體亞基或結(jié)構(gòu)域組成的蛋白。相應(yīng)蛋白的示例是免疫球蛋白分子，尤其是含例如重鏈和輕鏈的抗體。有數(shù)種選擇來生產(chǎn)由不同個體亞基或結(jié)構(gòu)域組成的蛋白，且本領(lǐng)域已知合適載體設(shè)計(jì)。根據(jù)一個實(shí)施方式，2個或更多所述蛋白亞基或結(jié)構(gòu)域從一個表達(dá)盒表達(dá)。在此實(shí)施方式中，從包括蛋白個體亞基或結(jié)構(gòu)域編碼區(qū)的相應(yīng)表達(dá)盒獲得一個長轉(zhuǎn)錄本。根據(jù)一個實(shí)施方式，至少一個IRES元件(內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn))功能性定位于個體亞基或結(jié)構(gòu)域的那些編碼區(qū)之間，各編碼區(qū)之前是分泌前導(dǎo)序列。因此，確保從所述轉(zhuǎn)錄本得到分開的翻譯產(chǎn)物且終蛋白能正確組裝和分泌。本領(lǐng)域已知各技術(shù)，因此不需本文任何詳述。對于一些實(shí)施方式如抗體表達(dá)，甚至優(yōu)選從不同表達(dá)盒表達(dá)個體亞基或結(jié)構(gòu)域。根據(jù)一個實(shí)施方式，用于表達(dá)感興趣產(chǎn)物的表達(dá)盒是單順反子表達(dá)盒。表達(dá)載體或表達(dá)載體組合所含的全部表達(dá)盒可以是單順反子。因此，根據(jù)一個實(shí)施方式，設(shè)計(jì)用于表達(dá)感興趣產(chǎn)物的各表達(dá)盒包括編碼一個蛋白亞基或結(jié)構(gòu)域的多核苷酸，所述蛋白待表達(dá)為感興趣多肽。例如，在抗體情況下，一個表達(dá)盒可編碼抗體輕鏈且另一表達(dá)盒可編碼抗體重鏈。從個體表達(dá)盒表達(dá)個體亞基或結(jié)構(gòu)域后，終蛋白如抗體從所述亞基或結(jié)構(gòu)域組裝并由宿主細(xì)胞分泌。此實(shí)施方式特別適合表達(dá)免疫球蛋白分子如抗體。如上所述，編碼感興趣多肽的多核苷酸和編碼選擇性標(biāo)記和/或報告多肽的多核苷酸優(yōu)選包含在表達(dá)盒內(nèi)。數(shù)個實(shí)施方式是合適的。例如，各所述多核苷酸能包括在分開的表達(dá)盒中。這也稱為單順反子設(shè)置。然而，以下也在本發(fā)明范圍內(nèi)：一個表達(dá)盒包括至少2個相應(yīng)多核苷酸。根據(jù)一個實(shí)施方式，至少一個內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)元件功能性定位于表達(dá)自同一表達(dá)盒的多核苷酸之間。熟知基于IRES的相應(yīng)表達(dá)技術(shù)和其它雙或多順反子系統(tǒng)，因此不需要在此進(jìn)一步描述。B.生成第一方面所述脊椎動物細(xì)胞的方法根據(jù)第二方面，提供方法生成第一方面所述脊椎動物細(xì)胞，所述方法包括改變脊椎動物細(xì)胞以削弱間質(zhì)蛋白酶效果和向所述細(xì)胞引入編碼感興趣多肽的多核苷酸，其中所述感興趣多肽隨后由脊椎動物細(xì)胞分泌。削弱內(nèi)源蛋白酶間質(zhì)蛋白酶功能的合適和優(yōu)選實(shí)施方式如前文結(jié)合第一方面的脊椎動物細(xì)胞所述，并參考上面的公開內(nèi)容，該內(nèi)容此處同樣適用。因此，所述方法可包括上述削弱間質(zhì)蛋白酶效果，結(jié)合第一方面所述經(jīng)改變脊椎動物細(xì)胞。下面再次簡要描述非限制性實(shí)施方式。根據(jù)一個實(shí)施方式，所述方法包括降低或消除間質(zhì)蛋白酶基因的功能表達(dá)，從而削弱間質(zhì)蛋白酶效果。如上所述，此削弱產(chǎn)生如下影響：在含經(jīng)改變細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基中沒有以活性形式存在的功能性間質(zhì)蛋白酶或存在量減少，例如因?yàn)榧?xì)胞表面沒有呈遞和/或釋放(例如脫落)的功能性間質(zhì)蛋白酶或呈遞/釋放量減少。因此，重組感興趣多肽分泌其中的培養(yǎng)基內(nèi)以蛋白水解活性形式存在的間質(zhì)蛋白酶減少或沒有。本公開顯示間質(zhì)蛋白酶是負(fù)責(zé)剪切所分泌感興趣多肽的關(guān)鍵蛋白酶，此細(xì)胞改變有利地減少或甚至消除感興趣多肽剪切。降低或消除間質(zhì)蛋白酶功能表達(dá)的合適方式如前文結(jié)合第一方面的脊椎動物細(xì)胞所述，并且參考其記載。根據(jù)一個實(shí)施方式，所述脊椎動物細(xì)胞基因組改變成降低或消除間質(zhì)蛋白酶基因的功能表達(dá)。例如，基因敲除可被引入間質(zhì)蛋白酶基因中。根據(jù)一個實(shí)施方式，向所有間質(zhì)蛋白酶基因拷貝引入這種基因敲除。根據(jù)一個實(shí)施方式，通過引入一種或多種突變例如移碼和/或終止密碼子突變，使間質(zhì)蛋白酶基因缺失或敲除。所有間質(zhì)蛋白酶基因拷貝可分別在基因組中改變。根據(jù)一個實(shí)施方式，所述一種或多種突變包括在間質(zhì)蛋白酶基因編碼區(qū)中并產(chǎn)生非功能或功能更少的表達(dá)產(chǎn)物。細(xì)節(jié)如前文結(jié)合第一方面的經(jīng)改變脊椎動物細(xì)胞所述，并且參考各公開內(nèi)容，該內(nèi)容此處同樣適用。根據(jù)一個實(shí)施方式，將一種或多種突變引入編碼下述氨基酸序列的間質(zhì)蛋白酶基因區(qū)，所述序列存在于一種或多種間質(zhì)蛋白酶催化活性剪接變體。在大部分或甚至所有鑒定的催化活性剪接變體中發(fā)現(xiàn)數(shù)種間質(zhì)蛋白酶外顯子。如上所述和示例所證明，編碼間質(zhì)蛋白酶外顯子2的間質(zhì)蛋白酶多核苷酸序列是引入一種或多種突變?nèi)缫拼a突變的合適靶標(biāo)，因?yàn)橥怙@子2在大部分間質(zhì)蛋白酶剪接變體中表達(dá)且相應(yīng)突變產(chǎn)生非功能或功能更少的表達(dá)產(chǎn)物。此外，接近間質(zhì)蛋白酶N末端的外顯子如外顯子2是用于引入一種或多種移碼突變的有利靶標(biāo)，引起非功能或功能更少的截?cái)嗟鞍妆磉_(dá)。此外，一種或多種突變能引入催化結(jié)構(gòu)域以破壞間質(zhì)蛋白酶功能。根據(jù)一個實(shí)施方式，所述脊椎動物細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞。根據(jù)一個實(shí)施方式，所述脊椎動物細(xì)胞是嚙齒動物細(xì)胞。所述嚙齒動物細(xì)胞優(yōu)選是倉鼠細(xì)胞，如CHO細(xì)胞。根據(jù)一個實(shí)施方式，用CHO細(xì)胞優(yōu)選衍生自細(xì)胞系K1來提供經(jīng)改變脊椎動物細(xì)胞，其中優(yōu)選通過降低或消除間質(zhì)蛋白酶基因的功能表達(dá)來削弱內(nèi)源蛋白酶間質(zhì)蛋白酶效果。如果宿主細(xì)胞基因組被改變來實(shí)現(xiàn)削弱，優(yōu)選首先改變脊椎動物細(xì)胞以基本永久削弱內(nèi)源蛋白酶間質(zhì)蛋白酶的效果和由此削弱其功能，隨后引入編碼感興趣多肽的異源多核苷酸。在改變不是永久的情況下，例如通過RNAi使間質(zhì)蛋白酶基因短暫沉默的情況下，可首先引入編碼感興趣多肽的異源多核苷酸，隨后改變脊椎動物細(xì)胞以削弱內(nèi)源蛋白酶間質(zhì)蛋白酶效果，如通過轉(zhuǎn)錄后基因沉默。合適方法如上所述并為技術(shù)人員已知。如上所述，根據(jù)一個優(yōu)選實(shí)施方式，所述脊椎動物細(xì)胞基因組被改變以實(shí)現(xiàn)削弱。能用第七方面所述方法鑒定和選擇間質(zhì)蛋白酶效果被削弱的宿主細(xì)胞。根據(jù)一個實(shí)施方式，第二方面所述方法還包括將至少一種編碼感興趣多肽的多核苷酸和優(yōu)選至少一種編碼選擇性標(biāo)記的多核苷酸引入脊椎動物細(xì)胞，所述細(xì)胞改變成降低或消除間質(zhì)蛋白酶基因的功能表達(dá)。根據(jù)一個實(shí)施方式，編碼感興趣多肽的多核苷酸和編碼選擇性標(biāo)記的多核苷酸位于同一或不同表達(dá)載體。合適和優(yōu)選的實(shí)施方式如上所述并且參考各公開內(nèi)容，該內(nèi)容此處同樣適用。引入能通過轉(zhuǎn)染實(shí)現(xiàn)，其中優(yōu)選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，成功表達(dá)感興趣多肽的脊椎動物宿主細(xì)胞能用例如第五方面所述方法選擇。參考后面的公開內(nèi)容。C.重組生成感興趣多肽的方法根據(jù)第三方面，提供重組生成感興趣多肽的方法，包括采用第一方面所述脊椎動物細(xì)胞作為重組表達(dá)感興趣多肽的宿主細(xì)胞。如上所述，由于用這些新型脊椎動物細(xì)胞重組表達(dá)時實(shí)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)基中感興趣多肽的蛋白質(zhì)降解水平減少，這些新型脊椎動物細(xì)胞(優(yōu)選哺乳動物細(xì)胞)尤其適合作為重組生成感興趣多肽的宿主細(xì)胞。合適和優(yōu)選的脊椎動物宿主細(xì)胞示例以及合適和優(yōu)選的感興趣多肽示例如上詳述并且參考上面的公開內(nèi)容，該內(nèi)容此處同樣適用，所述細(xì)胞改變成削弱間質(zhì)蛋白酶效果，優(yōu)選通過降低或消除間質(zhì)蛋白酶基因的功能表達(dá)。根據(jù)一個實(shí)施方式，所述方法包括將至少一種編碼感興趣多肽的多核苷酸引入脊椎動物宿主細(xì)胞并選擇重組表達(dá)感興趣多肽的脊椎動物宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞改變成削弱內(nèi)源蛋白酶間質(zhì)蛋白酶效果。引入能通過轉(zhuǎn)染完成，如所熟知并也在本文描述。選擇可用本公開第五方面所述方法進(jìn)行。優(yōu)選地，選擇宿主細(xì)胞，其中編碼感興趣多肽的異源多核苷酸穩(wěn)定整合入宿主細(xì)胞基因組。根據(jù)一個實(shí)施方式，所述方法包括(a)在一定條件下培養(yǎng)第一方面所述脊椎動物宿主細(xì)胞，所述條件允許表達(dá)和分泌感興趣多肽；(b)從細(xì)胞培養(yǎng)基中分離感興趣多肽；和(c)可選加工分離的感興趣多肽。因此，作為第三方面所述方法的優(yōu)選實(shí)施方式，提供重組生成感興趣多肽的方法，包括(a)在一定條件下培養(yǎng)第一方面所述脊椎動物宿主細(xì)胞，所述條件允許感興趣多肽表達(dá)和分泌入細(xì)胞培養(yǎng)基；(b)從細(xì)胞培養(yǎng)基中分離感興趣多肽；和(c)可選加工分離的感興趣多肽。所述宿主細(xì)胞可在無血清條件下培養(yǎng)。所述多肽表達(dá)和分泌入培養(yǎng)基并能從中獲得。出于分泌目的，提供合適的前導(dǎo)肽，從而分泌感興趣多肽。實(shí)現(xiàn)分泌的前導(dǎo)序列和表達(dá)盒設(shè)計(jì)為本領(lǐng)域熟知并因此不需在本文描述。如上所述，用第一方面所述經(jīng)改變脊椎動物細(xì)胞生成宿主細(xì)胞時，在含所述細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基中沒有功能性間質(zhì)蛋白酶或量減少，從而分泌入細(xì)胞培養(yǎng)基的重組感興趣多肽的蛋白質(zhì)水解性降解顯著減少或甚至完全避免。意外發(fā)現(xiàn)在脊椎動物細(xì)胞表達(dá)的數(shù)百種不同蛋白酶中，間質(zhì)蛋白酶是引起細(xì)胞培養(yǎng)基中重組表達(dá)多肽剪切的關(guān)鍵蛋白酶。因此，用本公開所述新型脊椎動物宿主細(xì)胞作為生產(chǎn)宿主細(xì)胞時，不需要進(jìn)行額外措施以減少或防止細(xì)胞培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)水解性降解和由此的感興趣多肽剪切。因此，根據(jù)一個實(shí)施方式，不向細(xì)胞培養(yǎng)基加入蛋白酶抑制劑。根據(jù)一個實(shí)施方式，不為減少細(xì)胞培養(yǎng)基中的蛋白水解活性而降低培養(yǎng)溫度。本公開包括再改造感興趣多肽的方法，以去除一個或多個傾向于通過蛋白酶剪切的基序。然而，根據(jù)一個實(shí)施方式，感興趣多肽不為了降低或防止剪切進(jìn)行再改造以去除一個或多個傾向于通過間質(zhì)蛋白酶剪切的氨基酸基序。根據(jù)此實(shí)施方式，可按需要進(jìn)行相應(yīng)再改造以去除一個或多個傾向于通過不同于間質(zhì)蛋白酶的蛋白酶剪切的氨基酸基序。然而，根據(jù)一個實(shí)施方式，感興趣多肽完全不進(jìn)行目的為降低或防止剪切的再改造以通過間質(zhì)蛋白酶去除一個或多個傾向于剪切的氨基酸基序。如示例所示，用本文所述經(jīng)改變細(xì)胞時，有效減少或完全消除剪切，從而各個再改造方法已基本淘汰?？捎媒?jīng)改變脊椎動物細(xì)胞生成的感興趣多肽示例如前文結(jié)合本發(fā)明第一方面所述，并且參考各公開內(nèi)容，該內(nèi)容此處同樣適用。根據(jù)一個實(shí)施方式，所述生產(chǎn)方法用于生成具有以下一個或多個特征的感興趣多肽：a)其是治療或診斷多肽；b)其受蛋白酶剪切影響；c)其包括至少一個間質(zhì)蛋白酶剪切位點(diǎn)；d)其是糖多肽；e)其選自糖蛋白、抗體、非IgG蛋白、Fab片段、蛋白質(zhì)復(fù)合體、肽酶、信號肽、Fc-融合蛋白、納米抗體、生長因子、激素、細(xì)胞因子、血液因子和酶；f)其不是或不包括間質(zhì)蛋白酶；和/或g)其不是或不包括HAI-1。生成的感興趣多肽分離自細(xì)胞培養(yǎng)基且可選由本領(lǐng)域已知方法進(jìn)一步加工。例如，所述多肽可通過常規(guī)程序從營養(yǎng)培養(yǎng)基回收，包括但不限于離心、過濾、超濾、提取或沉淀。其它加工步驟如純化步驟可通過本領(lǐng)域已知的多種過程進(jìn)行，包括但不限于色譜(如離子交換、親和、疏水、色譜聚焦、蛋白A或蛋白G色譜和大小排阻)、電泳過程(如制備式等電聚焦)、差異溶解度(如硫酸銨沉淀)或提取。此外，所分離和純化的感興趣多肽可進(jìn)一步加工，例如修飾和/或配制成組合物，例如藥物組合物。根據(jù)第四方面，提供重組生成感興趣多肽的方法，包括(a)在一定條件下培養(yǎng)脊椎動物宿主細(xì)胞，所述細(xì)胞包括至少一種編碼感興趣多肽的異源多核苷酸，所述條件允許感興趣多肽表達(dá)和分泌入細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)基包括對間質(zhì)蛋白酶有選擇性的蛋白酶抑制劑；(b)從細(xì)胞培養(yǎng)基中分離感興趣多肽；和(c)可選加工分離的感興趣多肽。第四方面所述方法也基于本文所述重要發(fā)現(xiàn)，即間質(zhì)蛋白酶是負(fù)責(zé)所分泌重組感興趣多肽在細(xì)胞培養(yǎng)基中蛋白質(zhì)降解的關(guān)鍵蛋白酶。在第四方面所述方法中，通過向細(xì)胞培養(yǎng)基加入對間質(zhì)蛋白酶有選擇性的蛋白酶抑制劑，避免細(xì)胞培養(yǎng)基中感興趣多肽的蛋白質(zhì)降解，也稱為“剪切”(見上)。對間質(zhì)蛋白酶有選擇性的蛋白酶抑制劑在本文也稱為選擇性間質(zhì)蛋白酶抑制劑。當(dāng)然，還能加入一種以上選擇性間質(zhì)蛋白酶抑制劑。如實(shí)施例4所證明，即使當(dāng)用正常表達(dá)間質(zhì)蛋白酶的脊椎動物細(xì)胞時，向細(xì)胞培養(yǎng)基加入選擇性間質(zhì)蛋白酶抑制劑能顯著降低或甚至消除感興趣多肽的剪切。因此，此實(shí)施方式允許使用未改變的脊椎動物細(xì)胞，其中相應(yīng)地，間質(zhì)蛋白酶效果未受損，因?yàn)槭窃诩?xì)胞培養(yǎng)基中實(shí)現(xiàn)削弱。細(xì)胞培養(yǎng)基中存在的選擇性間質(zhì)蛋白酶抑制劑導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)基中間質(zhì)蛋白酶的蛋白水解活性減少或消除。例如，間質(zhì)蛋白酶抑制劑可以是與底物競爭間質(zhì)蛋白酶活性位點(diǎn)的競爭性抑制劑或修飾間質(zhì)蛋白酶結(jié)構(gòu)以降低其活性的別構(gòu)抑制劑。間質(zhì)蛋白酶抑制劑被視作選擇性，只要其針對間質(zhì)蛋白酶的抑制活性高于其針對其它絲氨酸蛋白酶的抑制活性，尤其是其它II型跨膜絲氨酸蛋白酶。選擇性間質(zhì)蛋白酶抑制劑可以是任何類型，只要其對用于生成重組感興趣多肽的宿主細(xì)胞不顯示有害影響。選擇性間質(zhì)蛋白酶抑制劑可選自i)生物間質(zhì)蛋白酶抑制劑，包括但不限于基于抗體或抗體衍生的選擇性間質(zhì)蛋白酶抑制劑、肽或蛋白和ii)化學(xué)間質(zhì)蛋白酶抑制劑，如小分子。根據(jù)一個實(shí)施方式，選擇性間質(zhì)蛋白酶抑制劑對間質(zhì)蛋白酶的選擇性比其它蛋白酶高至少5倍、至少10倍、至少25倍、至少50倍、至少100倍或至少250倍，因此對間質(zhì)蛋白酶特異。然而，該選擇性還可顯著更高，如至少500倍、至少5000倍、至少10000倍、至少50000倍、至少500000倍和至少5000000倍。范圍包括但不限于5倍-10000000倍，10倍-5000000倍，25倍-1000000倍，50倍-5000000倍。可實(shí)現(xiàn)更高選擇性，例如至少5000倍或至少10000倍和更高，如用選擇性生物間質(zhì)蛋白酶抑制劑，例如間質(zhì)蛋白酶特異抗體或Fab-片段?？蓽y定選擇性，例如基于ki值，就選擇性間質(zhì)蛋白酶抑制劑而言低于其它所測蛋白酶。根據(jù)一個實(shí)施方式，間質(zhì)蛋白酶抑制劑可選擇性抑制間質(zhì)蛋白酶，ki值為200nM或更小，150nM或更小，100nM或更小，50nM或更小，25nM或更小，20nM或更小，15nM或更小，10nM或更小，7.5nM或更小，5nM或更小，2.5nm或更小，1nM或更小或者0.75nM或更小。如上所示，本領(lǐng)域描述數(shù)種選擇性間質(zhì)蛋白酶抑制劑。例如，F(xiàn)araday等描述基于不同抗體的選擇性間質(zhì)蛋白酶抑制劑，即Fab片段(Farady等,2008J.Mol.Biol.(2008)380,351-360)和2個scFv抗體抑制劑(JMolBiol.2007年6月15日；369(4):1041-1051)。單鏈可變區(qū)片段(scFv)抗體抑制劑E2和S4被描述為特別有選擇性，ki值為12pM和160pM?；诳贵w的選擇性間質(zhì)蛋白酶抑制劑可對衍生自不同物種的間質(zhì)蛋白酶有活性。如實(shí)施例4所證明，例如，針對人間質(zhì)蛋白酶的Fab-片段也對衍生自小鼠和倉鼠的間質(zhì)蛋白酶有效。然而，也可針對有關(guān)宿主細(xì)胞所表達(dá)的特定間質(zhì)蛋白酶產(chǎn)生相應(yīng)基于抗體的選擇性間質(zhì)蛋白酶抑制劑，以確保最大抑制效果并允許在細(xì)胞培養(yǎng)基中使用更低濃度的選擇性間質(zhì)蛋白酶抑制劑。此外，已描述間質(zhì)蛋白酶催化位點(diǎn)特異性抗體(US2006/171884A1)。擬肽類分子選擇性間質(zhì)蛋白酶抑制劑如3-脒苯基-丙氨酸類分子CJ-730和CJ-697對間質(zhì)蛋白酶的ki值分別為46nM和26nM(描述于等.InternationalJournalofOncology27:1061-10702005)。如所述，向腫瘤細(xì)胞系的細(xì)胞培養(yǎng)物加入這些化合物可顯著降低間質(zhì)蛋白酶活性，而不影響細(xì)胞增殖。選擇性間質(zhì)蛋白酶抑制劑也描述于Steinmetzer等,J.Med.Chem.2006,49,4116-4126和Goswami等,ACSMed.Chem.Lett.,20134(12)1152-1157頁。此外，水蛭素c的結(jié)構(gòu)變體是作為絲氨酸蛋白酶抑制劑的小單體蛋白質(zhì)，其已鑒定為相應(yīng)的間質(zhì)蛋白酶抑制劑(Desilets等.FEBSLetters580(2006)2227-2232)。在此，在篩選試驗(yàn)中，形成水蛭素c的不同結(jié)構(gòu)變體并測試其對間質(zhì)蛋白酶的特異性。反應(yīng)位點(diǎn)環(huán)的單氨基酸交換(L45R)使水蛭素c對間質(zhì)蛋白酶特異(ki＝18nM)。因此，已知許多選擇性間質(zhì)蛋白酶抑制劑能用于本公開目的以選擇性抑制細(xì)胞培養(yǎng)基中的間質(zhì)蛋白酶，從而降低或防止感興趣多肽的剪切，所述多肽由脊椎動物宿主細(xì)胞重組表達(dá)和分泌入細(xì)胞培養(yǎng)基。為削弱間質(zhì)蛋白酶在細(xì)胞培養(yǎng)基中的效果，可向培養(yǎng)表達(dá)宿主細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基加入選擇性間質(zhì)蛋白酶抑制劑。能根據(jù)常規(guī)實(shí)驗(yàn)測定在細(xì)胞培養(yǎng)基中達(dá)到足夠間質(zhì)蛋白酶抑制所需的個體選擇性間質(zhì)蛋白酶抑制劑濃度，從而感興趣多肽的蛋白質(zhì)降解減少?？稍诩尤胨拗骷?xì)胞之前或之后向細(xì)胞培養(yǎng)基加入選擇性間質(zhì)蛋白酶抑制劑。根據(jù)一個實(shí)施方式，選擇性間質(zhì)蛋白酶抑制劑在細(xì)胞培養(yǎng)開始時加入。根據(jù)一個實(shí)施方式，選擇性間質(zhì)蛋白酶抑制劑在宿主細(xì)胞開始分泌感興趣多肽的時間點(diǎn)加入。選擇性間質(zhì)蛋白酶抑制劑也可連續(xù)加入。例如，在補(bǔ)料分批培養(yǎng)中，選擇性間質(zhì)蛋白酶抑制劑可納入進(jìn)料。涉及感興趣多肽、從細(xì)胞培養(yǎng)基分離感興趣多肽以及后續(xù)處理的細(xì)節(jié)如上所述，例如結(jié)合第三方面所述方法且參考上面的公開內(nèi)容，該內(nèi)容此處同樣適用?？紤]大規(guī)模生產(chǎn)所需的細(xì)胞培養(yǎng)體積，必須向細(xì)胞培養(yǎng)基加入大量所述(一種或多種)選擇性間質(zhì)蛋白酶抑制劑，即使使用高選擇性的間質(zhì)蛋白酶抑制劑，這是為了有效降低或防止感興趣多肽在細(xì)胞培養(yǎng)基中的剪切。這可能花費(fèi)大。另外，對于許多感興趣多肽如生物藥品，所加入的選擇性間質(zhì)蛋白酶抑制劑必須在后續(xù)分離和純化感興趣多肽期間去除以避免間質(zhì)蛋白酶抑制劑對最終感興趣多肽的污染。這種移除步驟可包括任何已知純化步驟，如離子交換、親和、體積排阻或反相色譜。合適的移除方法取決于所用選擇性間質(zhì)蛋白酶抑制劑類型。由于這類步驟可能費(fèi)力且增加成本，優(yōu)選第三方面所述方法，其涉及使用經(jīng)改變脊椎動物細(xì)胞。D.選擇方法根據(jù)第五方面，提供選擇重組表達(dá)感興趣多肽的宿主細(xì)胞的方法，包括(a)提供本發(fā)明第一方面所述脊椎動物細(xì)胞作為宿主細(xì)胞；和(b)選擇表達(dá)感興趣多肽的一種或多種宿主細(xì)胞。包括合適和優(yōu)選實(shí)施方式在內(nèi)的第一方面所述脊椎動物宿主細(xì)胞以及其優(yōu)勢如上詳述并且參考各公開內(nèi)容，該內(nèi)容此處同樣適用。所述脊椎動物細(xì)胞優(yōu)選是哺乳動物細(xì)胞。根據(jù)一個實(shí)施方式，第五方面所述選擇方法的階段(a)包括用至少一種編碼感興趣多肽的多核苷酸轉(zhuǎn)染脊椎動物細(xì)胞，所述細(xì)胞改變成削弱內(nèi)源蛋白酶間質(zhì)蛋白酶效果，以提供第一方面所述脊椎動物宿主細(xì)胞。根據(jù)一個實(shí)施方式，所述細(xì)胞不包括編碼感興趣多肽的異源多核苷酸，然后轉(zhuǎn)染編碼感興趣多肽的多核苷酸，所述多肽待由宿主細(xì)胞表達(dá)和分泌。如所述，哺乳動物細(xì)胞優(yōu)選用作脊椎動物宿主細(xì)胞。表達(dá)載體可包括編碼感興趣產(chǎn)物的多核苷酸，所述載體隨后轉(zhuǎn)染入脊椎動物細(xì)胞。根據(jù)一個實(shí)施方式，階段(a)提供的所述宿主細(xì)胞額外包括至少一種編碼選擇性標(biāo)記的異源多核苷酸且階段(b)包括在針對選擇性標(biāo)記為選擇性的條件下培養(yǎng)所述多數(shù)量宿主細(xì)胞。選擇階段(b)可以是多步驟選擇過程，包括數(shù)個選擇步驟以選擇并因而鑒定表達(dá)感興趣多肽的宿主細(xì)胞。因此，根據(jù)一個實(shí)施方式，選擇階段(b)可包括數(shù)個選擇步驟。例如，階段(b)可包括一個或多個選擇步驟以選擇成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以及一個或多個后續(xù)選擇步驟以從成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞庫中選擇高表達(dá)細(xì)胞。合適的選擇策略取決于用于引入感興趣多肽編碼多核苷酸的表達(dá)載體設(shè)計(jì)，尤其取決于所用選擇標(biāo)記和/或報告子。下面描述非限制性實(shí)施方式。如上所述，脊椎動物宿主細(xì)胞可包括至少一種編碼選擇性標(biāo)記的異源多核苷酸。編碼選擇性標(biāo)記的多核苷酸能與編碼感興趣多肽的多核苷酸一起引入宿主細(xì)胞，采用同一或不同的共轉(zhuǎn)染表達(dá)載體。然后，階段(b)包括在向宿主細(xì)胞提供選擇壓力的條件下培養(yǎng)所述多種宿主細(xì)胞，以選擇成功轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，例如用合適選擇培養(yǎng)基。本文所用的“選擇培養(yǎng)基”具體指用于選擇表達(dá)選擇性標(biāo)記的宿主細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基。其可包括例如選擇劑，如能選擇成功轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞的毒劑?；蛘?，選擇培養(yǎng)基中必需化合物可缺失或其濃度可降低。根據(jù)一個實(shí)施方式，未成功轉(zhuǎn)染并因而不表達(dá)選擇標(biāo)記或其中表達(dá)較低的宿主細(xì)胞在選擇性培養(yǎng)條件下無法增殖或死亡。相比之下，成功轉(zhuǎn)染有表達(dá)載體并以足夠產(chǎn)率表達(dá)選擇標(biāo)記(和相應(yīng)的共引入感興趣多肽)的宿主細(xì)胞耐受選擇壓力或不太受其影響，并因此能增殖，從而生長超過未成功轉(zhuǎn)染或其中細(xì)胞基因組內(nèi)整合位點(diǎn)不利的宿主細(xì)胞。選擇性標(biāo)記可選自抗生素抗性標(biāo)記、藥物抗性標(biāo)記和代謝標(biāo)記。選擇性標(biāo)記的合適示例和選擇原理如前文結(jié)合第一方面所述，用于個體選擇性標(biāo)記的合適選擇條件也為技術(shù)人員熟知。如上所述，替代或補(bǔ)充地，能進(jìn)行基于報告多肽的選擇。根據(jù)一個實(shí)施方式，階段(a)提供的脊椎動物細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞。根據(jù)一個實(shí)施方式，所述哺乳動物細(xì)胞是嚙齒動物細(xì)胞，優(yōu)選倉鼠細(xì)胞如CHO細(xì)胞。合適和優(yōu)選的實(shí)施方式結(jié)合第一方面如上所述，且參考上面的公開內(nèi)容。其它優(yōu)選實(shí)施方式，尤其涉及第一方面所述脊椎動物宿主細(xì)胞、表達(dá)載體或表達(dá)載體組合同樣如上詳述。參考上面的公開內(nèi)容。由第五方面所述選擇方法獲得的細(xì)胞能作為個體細(xì)胞分離并培養(yǎng)。然而，在下游過程中也可使用基因不同的宿主細(xì)胞富集群，即細(xì)胞池。所得宿主細(xì)胞還能進(jìn)行額外定性或定量分析，或能用于例如開發(fā)克隆細(xì)胞系以生成蛋白?？寺〖?xì)胞系可建立自以高收率穩(wěn)定表達(dá)感興趣多肽的選定宿主細(xì)胞。根據(jù)一個實(shí)施方式，培養(yǎng)選定細(xì)胞以提供細(xì)胞克隆，尤其是克隆細(xì)胞培養(yǎng)物形式?？寺〖?xì)胞培養(yǎng)物是從單個祖細(xì)胞衍生的細(xì)胞培養(yǎng)物。在克隆細(xì)胞培養(yǎng)物中，所有細(xì)胞是彼此的克隆。優(yōu)選地，細(xì)胞培養(yǎng)物中的所有細(xì)胞包含相同或基本相同的遺傳信息。在某些實(shí)施方式中，測定細(xì)胞培養(yǎng)物中的感興趣多肽量或濃度以評估生產(chǎn)率。例如，效價能通過分析培養(yǎng)物上清來測量。此外，可用所得細(xì)胞克隆進(jìn)行穩(wěn)定性研究。E.使用經(jīng)改變脊椎動物細(xì)胞以重組制備根據(jù)第六方面，提供經(jīng)分離脊椎動物細(xì)胞在重組生成分泌自脊椎動物細(xì)胞的感興趣多肽中的應(yīng)用，其中所用細(xì)胞改變成削弱內(nèi)源蛋白酶間質(zhì)蛋白酶的效果。根據(jù)第六方面的一個實(shí)施方式，間質(zhì)蛋白酶的效果削弱，結(jié)合第一方面如上詳述，優(yōu)選通過降低或消除間質(zhì)蛋白酶基因的功能表達(dá)，如上進(jìn)一步詳述。所述脊椎動物細(xì)胞優(yōu)選是哺乳動物細(xì)胞。因此，根據(jù)一個實(shí)施方式，內(nèi)源蛋白酶間質(zhì)蛋白酶的效果如前文結(jié)合第一方面所述經(jīng)改變脊椎動物細(xì)胞所述而被削弱。根據(jù)一個實(shí)施方式，向所述細(xì)胞引入編碼感興趣多肽的多核苷酸。引入后，提供脊椎動物細(xì)胞，所述細(xì)胞包括編碼感興趣多肽的異源多核苷酸，該多肽隨后從脊椎動物細(xì)胞分泌入細(xì)胞培養(yǎng)基。因此，所述應(yīng)用可包括向所述脊椎動物細(xì)胞引入編碼感興趣多肽的異源多核苷酸，其中所述感興趣多肽由脊椎動物細(xì)胞分泌。涉及感興趣多肽的細(xì)節(jié)同樣如上詳述且參考各公開內(nèi)容，該內(nèi)容此處同樣適用。技術(shù)人員已知向所述脊椎動物細(xì)胞引入多核苷酸的方法并且如上簡述。根據(jù)一個實(shí)施方式，在引入編碼待表達(dá)感興趣多肽的多核苷酸前，所述脊椎動物細(xì)胞不包括編碼感興趣多肽的異源多核苷酸。根據(jù)一個實(shí)施方式，所述細(xì)胞還不包括編碼選擇性標(biāo)記的異源多核苷酸和/或編碼報告多肽的異源多核苷酸。根據(jù)一個實(shí)施方式，在引入編碼感興趣多肽的多核苷酸前，所述脊椎動物細(xì)胞不包括任何異源多核苷酸。能使用改變成削弱內(nèi)源蛋白酶間質(zhì)蛋白酶效果的相應(yīng)“空”脊椎動物細(xì)胞，例如用作重組生產(chǎn)技術(shù)的克隆細(xì)胞系。相應(yīng)細(xì)胞系能轉(zhuǎn)染有編碼感興趣多肽的異源多核苷酸，例如用合適表達(dá)載體。這種“空”脊椎動物細(xì)胞尚不表達(dá)和分泌重組產(chǎn)物，因此能用不同表達(dá)載體轉(zhuǎn)染，這取決于應(yīng)得以重組生成的所需感興趣多肽。由此，這種脊椎動物細(xì)胞能用于不同項(xiàng)目，即用于生成不同的感興趣多肽。根據(jù)一個實(shí)施方式，所述脊椎動物細(xì)胞是第一方面所述脊椎動物細(xì)胞。細(xì)節(jié)如上所述且參考上面的公開內(nèi)容。F.選擇間質(zhì)蛋白酶功能受損的脊椎動物宿主細(xì)胞的方法根據(jù)第七方面，本公開涉及選擇脊椎動物細(xì)胞以重組生成感興趣多肽的方法，包括分析內(nèi)源蛋白酶間質(zhì)蛋白酶是否在脊椎動物細(xì)胞中功能性表達(dá)并選擇這類內(nèi)源間質(zhì)蛋白酶效果削弱的脊椎動物細(xì)胞來用于重組生成感興趣多肽。此選擇過程允許鑒定能夠表達(dá)和分泌重組感興趣多肽的宿主細(xì)胞，其中細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)的所分泌感興趣多肽的剪切有減少。相應(yīng)宿主細(xì)胞尤其適合重組制備。例如，此分析方法可與本公開第二方面所述方法有利地聯(lián)用，以鑒定是否生成間質(zhì)蛋白酶效果削弱的脊椎動物細(xì)胞。根據(jù)一個優(yōu)選實(shí)施方式，所述方法包括分析間質(zhì)蛋白酶基因在所述細(xì)胞中的功能表達(dá)是否降低或消除。下面描述非限制性實(shí)施方式。哪種分析方法合適也取決于細(xì)胞如何改變來實(shí)現(xiàn)間質(zhì)蛋白酶功能表達(dá)降低或消除。例如，當(dāng)向間質(zhì)蛋白酶基因引入基因敲除以降低或消除間質(zhì)蛋白酶功能表達(dá)時，能擴(kuò)增對應(yīng)DNA區(qū)段和測序所擴(kuò)增DNA，從而確認(rèn)基因敲除被引入間質(zhì)蛋白酶基因。一種或多種突變的引入可以檢出，通過例如測序。如果間質(zhì)蛋白酶功能表達(dá)通過完全或部分缺失所述基因而降低或消除，可在DNA水平檢測缺失，例如用基于擴(kuò)增的合適檢測方法以檢測缺失(技術(shù)人員已知這類方法)。此外，所述方法能用于選擇合適細(xì)胞系，其中間質(zhì)蛋白酶的天然功能表達(dá)降低或消除，例如因?yàn)榭偙磉_(dá)減少或消除和/或因?yàn)樗磉_(dá)間質(zhì)蛋白酶的活性減小或消除，如歸因于至少一種突變。相應(yīng)細(xì)胞能用第七方面所述方法鑒定，如本文所述。例如，間質(zhì)蛋白酶表達(dá)能用基于PCR的技術(shù)分析，如RT-PCR和/或測序。替代或補(bǔ)充地，間質(zhì)蛋白酶活性能用獲自待分析細(xì)胞的條件培養(yǎng)基分析。根據(jù)一個實(shí)施方式，細(xì)胞表面沒有間質(zhì)蛋白酶或量減少的細(xì)胞通過流式細(xì)胞術(shù)來選擇。例如，結(jié)合間質(zhì)蛋白酶的抗體或其它檢測劑能用于標(biāo)示表達(dá)間質(zhì)蛋白酶的細(xì)胞。相應(yīng)細(xì)胞隨后能如下標(biāo)記：加入結(jié)合所述抗體或其它檢測劑的帶標(biāo)記試劑，或所述抗體或其它檢測劑可有直接標(biāo)記。根據(jù)一個實(shí)施方式，所述標(biāo)記是熒光標(biāo)記。因此，所述細(xì)胞根據(jù)其間質(zhì)蛋白酶表達(dá)水平標(biāo)示，這允許隨后鑒定和分選顯示間質(zhì)蛋白酶表達(dá)減少或沒有表達(dá)的細(xì)胞，例如通過熒光激活細(xì)胞分選(FACS)。根據(jù)一個實(shí)施方式，分析所述脊椎動物細(xì)胞的表達(dá)概況以確定間質(zhì)蛋白酶基因的功能表達(dá)是否降低或消除。例如，分析可包括進(jìn)行定性或定量RT(反轉(zhuǎn)錄)PCR以檢測間質(zhì)蛋白酶mRNA的存在、缺失、含量或長度。在分析細(xì)胞中功能性間質(zhì)蛋白酶表達(dá)之外或替代地，選擇過程可包括測試獲自所述細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中是否有間質(zhì)蛋白酶活性的步驟。例如，可進(jìn)行示例所述跟蹤標(biāo)定實(shí)驗(yàn)。因此，細(xì)胞培養(yǎng)基可收集自多種潛在細(xì)胞系以分析相應(yīng)所得條件培養(yǎng)基中是否有間質(zhì)蛋白酶活性。例如，可測試條件培養(yǎng)基對傾向于剪切的多肽的剪切活性。通過使用一種或多種已知會被剪切的多肽作為測試剪切活性的標(biāo)準(zhǔn)，能定性或定量潛在細(xì)胞系相對于彼此或標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞系的剪切活性。根據(jù)一個實(shí)施方式，第七方面所述方法用于選擇哺乳動物細(xì)胞，尤其是嚙齒動物細(xì)胞如倉鼠細(xì)胞，優(yōu)選CHO細(xì)胞。根據(jù)一個實(shí)施方式，第七方面所述方法包括選擇至少一個間質(zhì)蛋白酶功能受損的細(xì)胞，優(yōu)選通過降低或消除間質(zhì)蛋白酶基因的功能表達(dá)，以重組表達(dá)感興趣多肽。具有相應(yīng)特征的細(xì)胞尤其適合示例所示重組表達(dá)。相應(yīng)細(xì)胞的其它實(shí)施方式也如上詳述且參考各公開內(nèi)容。本文所述數(shù)值范圍包括界定范圍的數(shù)字。本文提供的標(biāo)題不對本公開的多個方面或?qū)嵤┓绞綐?gòu)成限制，其可通過總體參考說明書來閱讀。根據(jù)一個實(shí)施方式，本文描述為包括某些要素的主題也指由各要素組成的主題。特別地，本文描述為包括某些序列的多核苷酸也可由相應(yīng)序列組成。優(yōu)選選擇并組合本文所述優(yōu)選實(shí)施方式，從優(yōu)選實(shí)施方式的相應(yīng)組合產(chǎn)生的特定主題也屬于本公開。本文引用的所有文獻(xiàn)通過引用納入。實(shí)施例以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，而不以任何方式限制其范圍。實(shí)施例具體涉及本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式。I.材料與方法1.細(xì)胞培養(yǎng)除非本文另有描述，作為細(xì)胞培養(yǎng)物，衍生自CHO-K1的懸浮生長CHO細(xì)胞在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)工藝如WO2011/134920所公開。細(xì)胞每周傳代2次到新鮮培養(yǎng)基中并在整個研究期間維持于指數(shù)生長期。用于培養(yǎng)細(xì)胞的同一培養(yǎng)基用作實(shí)施例的陽性對照。2.用條件培養(yǎng)基的跟蹤標(biāo)定實(shí)驗(yàn)不含編碼感興趣多肽的異源多核苷酸的細(xì)胞以2x105活細(xì)胞/ml密度傳代到標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基內(nèi)(30ml培養(yǎng)物)并在37℃生長。在活細(xì)胞密度頂峰(通常傳代后7或8天；活力仍高于95％)，從培養(yǎng)基移出細(xì)胞。在這些條件下且在此細(xì)胞生長期，預(yù)期最大量的分泌蛋白酶在細(xì)胞培養(yǎng)基中有活性，而不由于細(xì)胞死亡而釋放胞內(nèi)蛋白酶。如果轉(zhuǎn)染細(xì)胞以表達(dá)重組感興趣多肽，在這些條件下也預(yù)期最大量的所分泌感興趣多肽。為獲得條件培養(yǎng)基，細(xì)胞培養(yǎng)物在90g離心15分鐘(足夠溫和，從而細(xì)胞不由于離心壓力而釋放胞內(nèi)蛋白酶)。離心后，轉(zhuǎn)移上清并通過0.22μm濾器以從條件培養(yǎng)基中移出剩余細(xì)胞顆粒。向所得條件培養(yǎng)基加入感興趣多肽，終濃度為0.7μM，并在500rpm連續(xù)振蕩下37℃孵育。各感興趣多肽的孵育時間先前測得：通過在野生型樣品中定期移出等分樣品并用SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡來分析。就各感興趣多肽選擇在野生型條件培養(yǎng)基中觀察到至少50％降解的時間點(diǎn)。孵育后，所有感興趣多肽樣品通過SDS-PAGE分析，通常之后是蛋白質(zhì)印跡分析以測定剪切的量。在實(shí)施例中，不同治療多肽用作感興趣多肽以分析剪切。3.SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡蛋白樣品稀釋于皮爾斯(Pierce)還原性泳道標(biāo)記物上樣緩沖液(10mMDTT,商品號39000)并在95℃煮沸5分鐘。將約0.1-0.6μg蛋白/泳道上樣到預(yù)制4-12％Bis-Tris膠(英杰公司(Invitrogen),商品號NP0322BOX)。電泳后，膠轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜(英杰公司,LC2001)，用伯樂(Bio-Rad)濕性電轉(zhuǎn)印跡系統(tǒng)。感興趣多肽用HRP偶聯(lián)特異抗體和ECL(皮爾斯,商品號32109)檢測。II.實(shí)施例1：通過RNA干擾(RNAi)使不同蛋白酶表達(dá)沉默時，不同感興趣多肽的剪切首先，傾向于剪切的不同重組蛋白的蛋白質(zhì)水解切割位點(diǎn)用不同技術(shù)分析，包括CE-SDS分析、質(zhì)譜分析和計(jì)算機(jī)模擬分析(數(shù)據(jù)未顯示)。此分析聯(lián)合采用不同蛋白酶抑制劑的其它分析，揭示傾向于剪切的大部分所測蛋白由胰酶樣蛋白酶切割，所述酶是絲氨酸蛋白酶亞家族。實(shí)施例1的RNAi實(shí)驗(yàn)設(shè)置成證明間質(zhì)蛋白酶是負(fù)責(zé)剪切的關(guān)鍵蛋白酶且間質(zhì)蛋白酶基因沉默可顯著減少剪切，而編碼不同蛋白酶的其它基因的沉默不減少感興趣多肽的剪切。針對CHO細(xì)胞表達(dá)的以下靶mRNA來設(shè)計(jì)siRNA：間質(zhì)蛋白酶(MT-SP1；本文也稱為St14),2.C1r(激活的補(bǔ)體組分C1r；也稱為Ctra),3.C1s(補(bǔ)體組分C1sB；也稱為Gm5077),4.Plat(t纖溶酶原激活物)和5.Prss35(蛋白酶,絲氨酸,35)。這些目標(biāo)基因編碼分泌的或跨膜的胰酶樣蛋白酶，因此參與剪切分泌到細(xì)胞培養(yǎng)基中的重組表達(dá)蛋白。事先已證實(shí)CHO細(xì)胞表達(dá)這些蛋白。表2提供所述各目標(biāo)基因的概況。表2表3列出針對間質(zhì)蛋白酶以及其它靶蛋白酶的siRNA正義和反義序列。表3下面描述實(shí)驗(yàn)詳細(xì)設(shè)置。1.1siRNA轉(zhuǎn)染RNAi轉(zhuǎn)染CHO-K1衍生細(xì)胞用RNAiMAX試劑(生命技術(shù)公司(LifeTechnology),商品號13778)進(jìn)行，遵循手冊MAN0001182的‘反向轉(zhuǎn)染操作’，按比例放大用于6孔板。對于各mRNA靶標(biāo)，在100、125和150pmol中使用2種最有效RNAi雙鏈分子濃度：125和150pmol用于MT-SP1(St14)，125和150pmol用于C1r(C1ra)，100和125pmol用于C1s(Gm5077)，125和150pmol用于Plat以及100和125pmol用于Prss35。2種選定濃度的RNAi雙鏈分子稀釋在1ml(吉布可(Gibco),商品號31985-062)中。作為RNAi陰性對照(siRNA陰性對照)，使用陰性對照1號siRNA(AM4611)(125pmol)。向各孔加入5μlRNAiMAX試劑。加入濃度為0.5x106細(xì)胞/ml的2ml細(xì)胞懸液，板在37℃和10％CO2下孵育。轉(zhuǎn)染后3天，測量細(xì)胞密度，用RNeasyPlus迷你試劑盒提取3x106活細(xì)胞的總RNA(凱杰(Qiagen),cat.74134)，并從各孔收集條件培養(yǎng)基。為控制對靶基因的沉默影響，通過實(shí)時RT-PCR測定mRNA表達(dá)。表4：測定蛋白酶mRNA表達(dá)的引物和探針序列相對于siRNA陰性對照中蛋白酶基因表達(dá)(設(shè)為100％)的剩余蛋白酶基因表達(dá)如下：MT-SP1:125pmol(18.6％)和150pmol(18.2％),C1r(C1ra):125pmol(6.3％)和150pmol(6.7％),C1s(Gm5077):100pmol(11.9％)和125pmol(14.4％),Plat:125pmol(8.3％)和150pmol(5.1％)以及Prss35:100pmol(18.4％)和125pmol(14.8％)。1.2條件培養(yǎng)基中的跟蹤標(biāo)定實(shí)驗(yàn)為收集條件培養(yǎng)基，來自6孔板的200μl細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行離心(300g持續(xù)3分鐘)，所得上清用作跟蹤標(biāo)定實(shí)驗(yàn)的條件培養(yǎng)基，如上面材料與方法所述。感興趣多肽是單克隆IgG抗體(mAb)或Fc-融合蛋白。如上所述，就各感興趣多肽選擇野生型條件培養(yǎng)基中觀察到至少50％降解的時間點(diǎn)。所述結(jié)果使得Fc-融合蛋白的孵育時間為3天(然而其中降解遠(yuǎn)高于50％)且mAb的孵育時間為7天。孵育后，條件培養(yǎng)基中的感興趣多肽樣品通過SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡法分析以測定材料與方法部分所述的剪切量。1.3蛋白剪切：跟蹤標(biāo)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖1顯示不同的被分析的感興趣多肽在如上所述孵育后的蛋白質(zhì)印跡，上排是mAb且下排是Fc-融合蛋白。上排蛋白質(zhì)印跡的第一泳道顯示未處理(純化學(xué))培養(yǎng)基(相同培養(yǎng)基也用于培養(yǎng)細(xì)胞)中孵育7天后的mAb，其中相應(yīng)地沒有剪切發(fā)生，因?yàn)榧?xì)胞培養(yǎng)基不接觸細(xì)胞并因而所述培養(yǎng)基中不存在細(xì)胞蛋白酶(陽性對照(+))。mAb展示為單一強(qiáng)蛋白帶(用箭頭標(biāo)記)且無剪切發(fā)生。第二泳道顯示在陰性對照細(xì)胞((-))條件培養(yǎng)基中孵育7天后的mAb樣品，所述細(xì)胞轉(zhuǎn)染有siRNA陰性對照(對基因表達(dá)無影響)。由于siRNA陰性對照對基因表達(dá)無影響，條件培養(yǎng)基本質(zhì)上對應(yīng)未改變細(xì)胞和因而顯示正常靶基因表達(dá)的細(xì)胞孵育后所得的條件培養(yǎng)基，其中所編碼蛋白酶相應(yīng)正常表達(dá)?？梢姡送暾鹠Ab的蛋白帶，下方顯示代表剪切mAb的第二強(qiáng)蛋白帶(用箭頭標(biāo)記)。2條蛋白帶具有類似強(qiáng)度，因此可以推斷約50％的mAb被剪切。相同結(jié)果-顯著剪切也見于在C1r(C1ra)、C1s(Gm5077)、Plat和Prss35通過RNAi沉默的細(xì)胞上清中孵育的mAb(見泳道5-12)。通過實(shí)時RT-PCR確認(rèn)靶基因有效沉默。對于C1r(C1ra)，發(fā)現(xiàn)93.7％和93.3％的最強(qiáng)mRNA降低。就Plat發(fā)現(xiàn)的降低為91.7％和94.9％，C1s(Gm5077)為88.1％和85.6％，Prss35為81.6％和85.2％。因此，所有靶基因都成功沉默超過80％。然而，所有這些情況下，剪切mAb的蛋白帶具有與完整mAb的蛋白帶至少大致相同的信號強(qiáng)度。因此，在陰性對照((-))中，至少約50％的mAb被剪切。由此，下調(diào)這些蛋白酶基因不降低條件培養(yǎng)基中感興趣多肽的剪切。相比之下，通過RNAi降低間質(zhì)蛋白酶(MT-SP1)表達(dá)(見泳道3和4)可顯著減少mAb剪切。2種設(shè)置中MT-SP1相較陰性對照抑制81.4％和81.8％(剩余MT-SP1表達(dá)為18.6％和18.2％)，經(jīng)剪切mAb的蛋白帶比完整mAb的蛋白帶弱許多。這證明顯著更少的mAb被剪切，并且顯示改變脊椎動物細(xì)胞以降低間質(zhì)蛋白酶功能表達(dá)(在此是通過RNAi)明顯減少感興趣多肽在獲自所述細(xì)胞的條件細(xì)胞培養(yǎng)基中的剪切。圖1下排顯示Fc-融合蛋白的結(jié)果，作為感興趣多肽的另一示例。與mAb不同，F(xiàn)c-融合蛋白的比較樣品“(+)”還包含完整蛋白條帶以外對應(yīng)單獨(dú)Fc部分的第二強(qiáng)帶，這也是主要剪切產(chǎn)物(2條帶都用箭頭標(biāo)記)。陽性對照中也發(fā)現(xiàn)剪切的Fc部分，因?yàn)槠鹗疾牧?CHO細(xì)胞中生成的Fc-融合蛋白)甚至在純化后仍包含高百分比的經(jīng)剪切Fc-融合蛋白。在Fc-蛋白純化過程中，無法去除所有經(jīng)剪切材料。因此，用于陽性對照作為起始材料的Fc-融合蛋白已包含大量經(jīng)剪切Fc部分作為雜質(zhì)。在C1r(C1ra)、C1s(Gm5077)、Plat或Prss35表達(dá)沉默型細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中，完整Fc-融合蛋白的信號范圍從弱(Plat)到極弱(Prss35)。因此，這些情況下的Fc-融合蛋白剪切極高，達(dá)到高至幾乎100％的值，即使這些蛋白酶的表達(dá)被抑制。因而，使這些蛋白酶基因沉默對減少剪切無效。相反，在從間質(zhì)蛋白酶(MT-SP1)表達(dá)沉默(僅使用一種siRNA濃度)的細(xì)胞獲得的條件培養(yǎng)基中，發(fā)現(xiàn)完整蛋白的強(qiáng)度與陽性對照(+)大致相同。因此，剪切有顯著減少。代表siRNA陰性對照(-)的泳道也包含完整蛋白。然而，此結(jié)果是陽性對照污染siRNA陰性對照泳道，前者在上樣后溢出?？傊?，該RNAi實(shí)驗(yàn)證明宿主細(xì)胞中的間質(zhì)蛋白酶表達(dá)沉默導(dǎo)致不同示范性感興趣多肽在獲自所述細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中的剪切顯著減少。相比之下，宿主細(xì)胞所表達(dá)其它胰蛋白酶樣蛋白酶的表達(dá)沉默對剪切沒有任何積極效果。因此，實(shí)施例1支持以下發(fā)現(xiàn)的重要性：間質(zhì)蛋白酶是負(fù)責(zé)剪切重組表達(dá)和分泌感興趣多肽的主要蛋白酶。此外，發(fā)現(xiàn)間質(zhì)蛋白酶由RNAi下調(diào)的細(xì)胞具有與siRNA陰性對照細(xì)胞相同的生長特征。因此，下調(diào)間質(zhì)蛋白酶表達(dá)不影響細(xì)胞生長。III.實(shí)施例2：CHO細(xì)胞中的間質(zhì)蛋白酶基因敲除(KO)引起剪切減少A.用TALEN技術(shù)進(jìn)行的KO在CHO-K1衍生細(xì)胞基礎(chǔ)上產(chǎn)生9個間質(zhì)蛋白酶(MT-SP1)敲除細(xì)胞克隆，采用TALEN(轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶)技術(shù)。對于敲除，靶向間質(zhì)蛋白酶外顯子2位于跨膜結(jié)構(gòu)域編碼區(qū)之前的區(qū)域。選擇外顯子2，因?yàn)槠涓采w不同可變剪接變體。在外顯子2中加入移碼突變具有以下優(yōu)勢：截?cái)嗟鞍纵^短并位于胞內(nèi)，此外，不穩(wěn)定且對細(xì)胞無毒。2.A.1.間質(zhì)蛋白酶外顯子2特異性TALEN的設(shè)計(jì)/制備和應(yīng)用在CHO-K1衍生親代細(xì)胞系中測序間質(zhì)蛋白酶外顯子2和側(cè)翼內(nèi)含子(見圖2,SEQIDNO:31)。設(shè)計(jì)2個靶向間質(zhì)蛋白酶外顯子2的截?cái)郥ALFokI。各TALEN分別靶向和結(jié)合DNA鏈上5’(正向)或3’(反向)的19個核苷酸。2個結(jié)合位點(diǎn)被切割位點(diǎn)的16個核苷酸分開。合成各設(shè)計(jì)的TAL，克隆于進(jìn)入載體并亞克隆入pEXP3-DEST_A302目的載體。產(chǎn)品描述和方法可獲自生命技術(shù)公司/GeneArt。生成識別TALEN的5’(左)或3’(右)鏈的編碼質(zhì)粒(亞克隆入骨架質(zhì)粒pEXP3-DEST)。pEXP3-DEST包含TALEN編碼序列上游的T7啟動子，允許體外轉(zhuǎn)錄(IVT)TAL-FokI的編碼mRNA。2.A.2.TALEN載體的體外轉(zhuǎn)錄TALENmRNA通過體外轉(zhuǎn)錄(IVT)TALEN載體制備。TALEN載體之前用HindIII限制性酶(羅氏(Roche),商品號10656321001)線性化并用異丙醇然后70％乙醇沉淀來純化。mRNA用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知程序產(chǎn)生。加帽IVT產(chǎn)物用NH4-Ac沉淀純化，產(chǎn)生的mRNA(含polyA尾和5’帽)用凱杰RNeasyMicro試劑盒(商品號74004)純化。2.A.3.TALENmRNA轉(zhuǎn)染活力大于95％、處于指數(shù)生長期的親代CHO-K1細(xì)胞用于轉(zhuǎn)染。電穿孔(核轉(zhuǎn)染)用AmaxaTM,NucleofectorTM技術(shù)根據(jù)廠商(龍沙(Lonza))說明進(jìn)行。轉(zhuǎn)染細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后第4天擴(kuò)增，單細(xì)胞在第7天分開在30x96孔板中。單克隆性和融合用CloneSelectTM成像儀(Genetix)控制。2.A.4.Cel-I-試驗(yàn)和篩選策略Cel-I-試驗(yàn)根據(jù)SAFC生物科技公司(SAFCBiosciences)手冊進(jìn)行。Cel-I-試驗(yàn)是用于測定切割效率的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)。簡言之，轉(zhuǎn)染3天后，從細(xì)胞分離基因組DNA并用以下引物進(jìn)行PCR：Fwd：ttttttgcccagtcctggtt(SEQIDNO:32)Rev：ccctttggtctgtcctctga(SEQIDNO:33)使擴(kuò)增產(chǎn)物變性并允許復(fù)性。然后，加入核酸酶S和核酸酶S增強(qiáng)子并孵育。分析所消化產(chǎn)物。出現(xiàn)2條較小帶，指示該基因組區(qū)域內(nèi)的TALEN活性并因而支持所分析的細(xì)胞池內(nèi)，存在間質(zhì)蛋白酶基因通過突變而被改變的細(xì)胞。自最陽性的細(xì)胞池(2條較小帶的強(qiáng)度更高的)分選單細(xì)胞至96孔板。從96孔板的各孔中提取基因組DNA(gDNA)，采用Extract-N-AmpTM血液PCR試劑盒(商品號XNAB2R,西格瑪(Sigma))。gDNA提取物用于在‘CutSitePCR’試驗(yàn)中篩選突變克隆，采用上示反向引物(Rev)(SEQIDNO:33)以及結(jié)合切割位點(diǎn)的引物(稱為切割引物)，序列如下：切割引物：GTGGAGTTTCTGCCTGTGAA(SEQIDNO:34)如果切割位點(diǎn)區(qū)內(nèi)由于TALEN活性而出現(xiàn)突變，則切割引物不結(jié)合，導(dǎo)致未獲得PCR產(chǎn)物。無PCR產(chǎn)物的克隆經(jīng)測序分析以確定引入的突變。替代或補(bǔ)充地，進(jìn)行Surveyor突變檢測試驗(yàn)(轉(zhuǎn)基因組有限公司(Transgenomics),商品號706025)，采用上示正向(Fwd)和反向(Rev)引物。有突變的克隆轉(zhuǎn)入125ml搖瓶并測序。在所述篩選試驗(yàn)中，鑒定出克隆Δ7/Δ15。此外，用Cel-I-試驗(yàn)完成第一輪轉(zhuǎn)染和篩選后，產(chǎn)生基因型wt/Δ4的克隆，其在間質(zhì)蛋白酶的1個等位基因中有移碼突變。為獲得等位基因中都含移碼突變的敲除克隆，進(jìn)行2輪TALENmRNA轉(zhuǎn)染和克隆。為獲得MT-SP1等位基因中都含移碼突變的敲除克隆，帶基因型wt/Δ4的克隆用于第二輪TALENmRNA轉(zhuǎn)染-克隆(如上所述)以同樣在第二等位基因中產(chǎn)生移碼突變?？傮w上，產(chǎn)生等位基因中都含移碼突變的9個間質(zhì)蛋白酶敲除克隆(KO-1到KO-9)。表5公開了這9個克隆的基因型。表6顯示MT-SP1外顯子2序列，參考野生型和這些突變。表7顯示這些突變所得MT-SP1產(chǎn)物的部分序列。外顯子2編碼的氨基酸以粗體突出顯示。根據(jù)表5，KO-1、KO-4以及KO-7和KO-9這4個克隆帶基因型Δ4/Δ4。這些克隆的間質(zhì)蛋白酶基因型相同。KO-1、KO-4和KO-7衍生自同一TALEN再轉(zhuǎn)染池，KO-9衍生自不同的池?？寺〉腇ISH分析顯示KO-1、KO-4和KO-7的核型圖有一些差異。因此，推斷其并非衍生自同一母細(xì)胞。所有克隆KO-1到KO-9的間質(zhì)蛋白酶基因的2個等位基因內(nèi)都插入了移碼突變。此外，獲得突變克隆Δ7/Δ15，其具有基因型Δ7/Δ15且僅在1個等位基因中含移碼突變(Δ7)。在第二等位基因中，缺失15個堿基對的突變Δ15導(dǎo)致缺失5個氨基酸的較短間質(zhì)蛋白酶胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。然而，Δ15缺失不引起移碼。受影響結(jié)構(gòu)域似乎對催化功能而言不必需，因?yàn)楫?dāng)含催化蛋白酶結(jié)構(gòu)域的胞外部分脫落時，其仍保持附于膜。因此，推斷表達(dá)自Δ15等位基因的間質(zhì)蛋白酶仍具有催化活性。因而，在細(xì)胞克隆Δ7/Δ15中，間質(zhì)蛋白酶的功能表達(dá)降低，但未消除。進(jìn)一步推斷所述克隆表達(dá)的剩余mRNA約一半包含移碼突變。表5：間質(zhì)蛋白酶基因2個等位基因的外顯子2中的突變表6：編碼來自CHO-K1衍生WT和不同KO克隆的外顯子2的間質(zhì)蛋白酶基因序列。Δ指示缺失。Δ后的數(shù)字指示有多少個核苷酸缺失。缺失的核苷酸在括號內(nèi)和標(biāo)粗顯示。表7：CHOWT和KO克隆的部分間質(zhì)蛋白酶氨基酸序列，包括外顯子1、2和3，外顯子2的氨基酸以粗體顯示。表7中星號*代表終止密碼子。2.A.5.間質(zhì)蛋白酶mRNA表達(dá)為檢測所引入突變對間質(zhì)蛋白酶表達(dá)的影響，實(shí)施定量反轉(zhuǎn)錄實(shí)時PCR(qRT-PCR)。個體克隆的qRT-PCR所測間質(zhì)蛋白酶mRNA表達(dá)與野生型CHO-K1衍生細(xì)胞的mRNA表達(dá)作比較。圖3顯示此實(shí)驗(yàn)結(jié)果。根據(jù)圖3，相較野生型，有突變間質(zhì)蛋白酶的細(xì)胞克隆中的mRNA的表達(dá)范圍僅5-40％。此結(jié)果表明突變間質(zhì)蛋白酶的表達(dá)降低。因此，細(xì)胞表達(dá)功能更少(非功能)的間質(zhì)蛋白酶蛋白。細(xì)胞克隆Δ7/Δ15也僅顯示細(xì)胞中的低間質(zhì)蛋白酶mRNA表達(dá)。2.A.6.用來自9個間質(zhì)蛋白酶(MT-SP1)敲除克隆的細(xì)胞上清的跟蹤標(biāo)定實(shí)驗(yàn)為評估間質(zhì)蛋白酶敲除的影響，用5個傾向于剪切的不同感興趣多肽進(jìn)行跟蹤標(biāo)定實(shí)驗(yàn)。根據(jù)材料與方法所述操作從CHO敲除克隆獲得細(xì)胞培養(yǎng)物的條件培養(yǎng)基。對于跟蹤標(biāo)定實(shí)驗(yàn)，向條件培養(yǎng)基加入感興趣多肽，終濃度為0.7μM，并在500rpm連續(xù)振蕩下37℃孵育。孵育時間取決于所測試感興趣多肽類型。孵育后，條件培養(yǎng)基中的感興趣多肽樣品通過SDSpage和蛋白質(zhì)印跡法分析，如材料與方法所述。圖4A顯示跟蹤標(biāo)定實(shí)驗(yàn)的蛋白質(zhì)印跡分析，用單克隆IgG抗體(mAb)作為感興趣多肽。作為參考對照，蛋白質(zhì)印跡左邊第一泳道(由“(+)”指示)顯示純化學(xué)培養(yǎng)基(同一培養(yǎng)基也用于獲得條件培養(yǎng)基)孵育后的mAb。未檢測到產(chǎn)物剪切；完整蛋白用箭頭標(biāo)記。第二泳道(WT)顯示在獲自CHO-K1衍生細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中孵育48小時后的單克隆抗體，所述細(xì)胞正常表達(dá)間質(zhì)蛋白酶。在此，檢測到第二強(qiáng)帶，代表經(jīng)剪切抗體(用箭頭標(biāo)記)。由于經(jīng)剪切抗體的蛋白帶強(qiáng)于完整蛋白的蛋白帶，大于50％的蛋白被剪切。相反，單克隆抗體分別在獲自敲除細(xì)胞系KO-1到KO-9(圖4的1-9)的條件培養(yǎng)基中孵育后，未檢測到剪切產(chǎn)物。因此，脊椎動物宿主細(xì)胞中的間質(zhì)蛋白酶敲除是明顯改善，因?yàn)槟苡行Х乐辜?xì)胞培養(yǎng)基中的mAb剪切。圖4B顯示用Fc-融合蛋白的對應(yīng)跟蹤標(biāo)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果。孵育時間是24小時。與單克隆抗體不同，純化學(xué)培養(yǎng)基的陽性對照(+)已包含大量剪切蛋白(用箭頭標(biāo)記)。這是因?yàn)樽鳛楦信d趣多肽加入的Fc-融合蛋白在CHO細(xì)胞中生成并在收獲其的培養(yǎng)基內(nèi)被大幅剪切。并非所有經(jīng)剪切蛋白都能在純化過程期間移出，從而起始材料已含有一些剪切蛋白污染。而在用間質(zhì)蛋白酶敲除克隆(1-9)的實(shí)驗(yàn)中，完整蛋白和剪切蛋白含量與陽性對照(+)中孵育的起始材料相當(dāng)，在未改變CHO-K1衍生野生型細(xì)胞(WT)的條件培養(yǎng)基內(nèi)孵育完全消除并因而降解完整蛋白。因此，在未改變成削弱間質(zhì)蛋白酶功能的細(xì)胞所得條件培養(yǎng)基中觀察到基本100％剪切。條件培養(yǎng)基中孵育1小時的另一重組治療蛋白發(fā)現(xiàn)相當(dāng)結(jié)果(圖4C)。所述蛋白存在2種糖變體。再次，野生型CHO-K1細(xì)胞(WT)的條件培養(yǎng)基中，大于50％的2種蛋白糖變體被剪切(用箭頭標(biāo)記)，而KO-1到KO-9細(xì)胞(1-9)的條件培養(yǎng)基孵育可保持純化學(xué)培養(yǎng)基(陽性對照(+))孵育后所觀察到的完整蛋白狀態(tài)，這些細(xì)胞中內(nèi)源蛋白酶間質(zhì)蛋白酶的功能由于基因敲除而削弱。KO克隆的分析還持續(xù)數(shù)月以分析防止、相應(yīng)減少剪切是否是經(jīng)改變脊椎動物細(xì)胞的穩(wěn)定特征，所述細(xì)胞中的間質(zhì)蛋白酶基因敲除。因此，以mAb的跟蹤標(biāo)定實(shí)驗(yàn)用獲自間質(zhì)蛋白酶敲除細(xì)胞克隆的條件培養(yǎng)基重復(fù)，所述克隆已培養(yǎng)3個月。圖4D顯示實(shí)驗(yàn)結(jié)果，再次與以下相比較：來自CHO野生型細(xì)胞的條件培養(yǎng)基作為陰性對照“(WT)”且純化學(xué)培養(yǎng)基作為陽性對照“(+)”。蛋白質(zhì)印跡揭示完全相同的蛋白帶譜，如圖4A所見。對于Fc-融合蛋白，3個月后也發(fā)現(xiàn)相同結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，確認(rèn)用KO克隆時，數(shù)月后沒有剪切出現(xiàn)。此外，發(fā)現(xiàn)KO細(xì)胞系生長良好且細(xì)胞生長甚至在3個月培養(yǎng)中有改善。圖5顯示孵育24小時(D1)和48小時(D2)后，用2種糖基化病毒蛋白的跟蹤標(biāo)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用間質(zhì)蛋白酶敲除克隆KO-1到KO-3(1-3)的條件培養(yǎng)基，蛋白質(zhì)印跡(圖5A)第一泳道代表純化學(xué)培養(yǎng)基(+)孵育后的蛋白，其中可見2條蛋白帶。上帶代表完整蛋白，下帶是構(gòu)成樣品中約5％總蛋白的剪切形式蛋白。在CHO-K1野生型的條件培養(yǎng)基(WT泳道)中，孵育24小時(D1)后出現(xiàn)完整蛋白的量大幅減小。48小時(D2)后，該蛋白帶幾乎看不到，即幾乎所有蛋白被剪切。另外，剪切蛋白的蛋白帶完全消失則表明蛋白進(jìn)一步降解。相比之下，對于間質(zhì)蛋白酶敲除克隆KO-1到KO-3(見1-3)的條件培養(yǎng)基中孵育24小時或48小時的蛋白，沒有發(fā)現(xiàn)蛋白帶譜差異。因此，用獲自間質(zhì)蛋白酶敲除細(xì)胞系的條件培養(yǎng)基，未檢測到治療蛋白的蛋白質(zhì)降解或顯著減少。第二病毒蛋白顯示相當(dāng)結(jié)果(圖5B)。在此，完整蛋白由泳道“(+)”所示單一蛋白帶表示。在CHO-K1衍生野生型細(xì)胞(WT,D1)的條件培養(yǎng)基中孵育24小時后，幾乎檢測不到完整蛋白的跡象。相反，出現(xiàn)2條較小蛋白帶，代表剪切形式蛋白。采用獲自間質(zhì)蛋白酶敲除克隆KO-1到KO-3的培養(yǎng)基的實(shí)驗(yàn)中也觀察到這些蛋白帶。然而，即使孵育48小時后，所測試全部敲除克隆中的大部分病毒蛋白得以保存。用傾向于剪切的5種額外Fc-融合蛋白如上所述進(jìn)行跟蹤標(biāo)定實(shí)驗(yàn)，確認(rèn)前述實(shí)驗(yàn)。無細(xì)胞的收獲上清通過蛋白A液相親和色譜捕獲，采用1mLHiTrapMabSelectSure(通用電氣醫(yī)療集團(tuán)(GEHealthcare))。2分鐘的停留時間應(yīng)用于平衡、上樣和洗滌。對于洗脫，應(yīng)用4分鐘的停留時間。洗脫液用1MTris滴定到pH5，然后用Millex-GV注射頭過濾器(0.22μm,PVDF,13mm；密理博(Millipore))無菌過濾。蛋白濃度用NanoDrop2000分光光度計(jì)(賽默飛世爾(ThermoScientific))以280nm波長測定。所有步驟室溫進(jìn)行。表8顯示質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)?？梢?，所有測試的Fc-融合蛋白在親代細(xì)胞中表達(dá)時，完全或幾乎完全被剪切。與之相比，在敲除細(xì)胞系中表達(dá)時，剪切顯著減少。表8：不同F(xiàn)c-融合蛋白的剪切分析這些實(shí)施例證明本公開所述經(jīng)改變脊椎動物細(xì)胞不向細(xì)胞培養(yǎng)基呈遞或釋放功能性間質(zhì)蛋白酶或呈遞量減少，所述細(xì)胞中的內(nèi)源蛋白酶間質(zhì)蛋白酶功能受損。因此，采用這些細(xì)胞以生成感興趣多肽時，細(xì)胞培養(yǎng)基中存在(正常分泌入)的重組感興趣多肽的蛋白質(zhì)水解性降解顯著減少。2.A.7.用來自間質(zhì)蛋白酶突變克隆Δ7/Δ15的細(xì)胞上清的跟蹤標(biāo)定實(shí)驗(yàn)為評估減少功能性間質(zhì)蛋白酶表達(dá)的效果，以獲自Δ7/Δ15克隆的條件培養(yǎng)基重復(fù)Fc-融合蛋白和單克隆IgG抗體(mAb)的跟蹤標(biāo)定實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞培養(yǎng)物的條件培養(yǎng)基根據(jù)材料與方法所述操作獲得。對于跟蹤標(biāo)定實(shí)驗(yàn)，向條件培養(yǎng)基加入感興趣多肽，終濃度為0.7μM，并在500rpm連續(xù)振蕩下37℃孵育。Fc-融合蛋白孵育2小時，mAb孵育24小時。孵育后，條件培養(yǎng)基中的感興趣多肽樣品通過SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡分析，如材料與方法所述。圖6A顯示Fc-融合蛋白的跟蹤標(biāo)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果。作為參照，蛋白質(zhì)印跡的第一泳道顯示純化學(xué)培養(yǎng)基(由“(+)”表示)孵育后的Fc-融合蛋白。第二和第三泳道(“WT1”和“WT2”)顯示2個不同CHO-K1衍生野生型細(xì)胞系所得條件培養(yǎng)基孵育后的Fc-融合蛋白，所述細(xì)胞系正常表達(dá)未修飾的功能性間質(zhì)蛋白酶。如上所討論，起始材料包含完整Fc-融合蛋白以及作為雜質(zhì)的經(jīng)剪切Fc-融合蛋白。在來自具有野生型間質(zhì)蛋白酶(“WT1”和“WT2”)的CHO細(xì)胞所得條件培養(yǎng)基孵育的蛋白樣品中，基本沒有觀察到完整Fc-融合蛋白。相比之下，獲自Δ7/Δ15細(xì)胞克隆(“Δ7/Δ15”)的條件培養(yǎng)基孵育后，剪切顯著減少(如可從代表完整Fc-融合蛋白的強(qiáng)蛋白帶得出)，所述細(xì)胞克隆中的間質(zhì)蛋白酶功能表達(dá)顯著減少(有關(guān)該克隆詳情見實(shí)施例2.4)。圖6B顯示跟蹤標(biāo)定實(shí)驗(yàn)的蛋白質(zhì)印跡分析，用IgGmAb作為感興趣多肽。作為參照，蛋白質(zhì)印跡的第一泳道(由“(+)”表示)顯示純化學(xué)培養(yǎng)基孵育后的mAb。可見一條代表完整抗體的強(qiáng)蛋白帶。第二和第三泳道(“WT1”和“WT2”)顯示來自2個不同CHO-K1衍生野生型細(xì)胞系的條件培養(yǎng)基孵育后的單克隆抗體，所述細(xì)胞系表達(dá)未修飾的間質(zhì)蛋白酶。此第二和第三泳道中，具有較低分子量的額外強(qiáng)蛋白帶看來代表經(jīng)剪切抗體。根據(jù)信號強(qiáng)度，大于50％抗體顯示被剪切。第四泳道(“Δ7/Δ15”)顯示來自細(xì)胞克隆Δ7/Δ15的條件培養(yǎng)基孵育后的mAb，信號強(qiáng)度逆轉(zhuǎn)。因此，盡管剪切未完全消除，其相較間質(zhì)蛋白酶野生型細(xì)胞克隆有大幅降低。此結(jié)果證實(shí)，降低間質(zhì)蛋白酶功能表達(dá)可顯著減少感興趣多肽在細(xì)胞培養(yǎng)基中的剪切。這些實(shí)驗(yàn)顯示，使用僅敲除一個間質(zhì)蛋白酶等位基因且功能性間質(zhì)蛋白酶表達(dá)降低的細(xì)胞克隆，也導(dǎo)致感興趣多肽在細(xì)胞培養(yǎng)基中剪切減少。因此，能推斷剪切活性與功能性間質(zhì)蛋白酶表達(dá)程度成比例。B.用ZFN技術(shù)進(jìn)行的KO基于CHO親代細(xì)胞的1個ZFN(MT-SP1)敲除細(xì)胞克隆用ZFN(鋅指核酸酶)技術(shù)產(chǎn)生。對于敲除，靶向間質(zhì)蛋白酶外顯子2位于跨膜結(jié)構(gòu)域編碼區(qū)之前的區(qū)域(如實(shí)施例2A所述)。2.B.1.間質(zhì)蛋白酶外顯子2特異性TALEN的設(shè)計(jì)/制備和應(yīng)用設(shè)計(jì)一對靶向間質(zhì)蛋白酶外顯子2的ZFN。一個ZFN靶向和結(jié)合12個核苷酸，另一個靶向18個核苷酸。2個結(jié)合位點(diǎn)被切割位點(diǎn)的5個核苷酸分開。2.B.2.TALEN載體的體外轉(zhuǎn)錄ZFNmRNA通過體外轉(zhuǎn)錄(IVT)ZFN載體制備。mRNA用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知程序產(chǎn)生。加帽IVT產(chǎn)物用NH4-Ac沉淀純化，產(chǎn)生的mRNA(含polyA尾和5’帽)用凱杰RNeasyMicro試劑盒(商品號74004)純化。2.B.3.ZFNmRNA轉(zhuǎn)染活力大于95％、處于指數(shù)生長期的親代CHO細(xì)胞用于轉(zhuǎn)染。電穿孔(核轉(zhuǎn)染)用AmaxaTM,NucleofectorTM技術(shù)根據(jù)廠商(龍沙)說明進(jìn)行。2.B.4.Cel-I-試驗(yàn)和篩選策略Cel-I-試驗(yàn)根據(jù)SAFC生物科技公司手冊進(jìn)行，完成與實(shí)施例2A.4所述類似的篩選。為獲得等位基因中都含移碼突變的敲除克隆，進(jìn)行2輪ZFNmRNA轉(zhuǎn)染和克隆。產(chǎn)生1個間質(zhì)蛋白酶敲除克隆(KO-10)，其等位基因中都含移碼突變(Δ13/Δ13)。2.B.5.用來自間質(zhì)蛋白酶(MT-SP1)敲除克隆的細(xì)胞上清的跟蹤標(biāo)定實(shí)驗(yàn)為評估間質(zhì)蛋白酶敲除的影響，用2個傾向于剪切的不同感興趣多肽進(jìn)行跟蹤標(biāo)定實(shí)驗(yàn)。根據(jù)材料與方法所述操作獲得來自CHO敲除克隆的細(xì)胞培養(yǎng)條件培養(yǎng)基。對于跟蹤標(biāo)定實(shí)驗(yàn)，向條件培養(yǎng)基加入感興趣多肽(一個Fc-融合蛋白和一個重組治療蛋白)，終濃度為0.7μM，并在500rpm連續(xù)振蕩下37℃孵育。孵育時間取決于所測試感興趣多肽類型。孵育后，條件培養(yǎng)基中的感興趣多肽樣品通過SDSpage和蛋白質(zhì)印跡法分析，如材料與方法所述。結(jié)果對應(yīng)于用TALEN技術(shù)所產(chǎn)生KO克隆進(jìn)行的跟蹤標(biāo)定實(shí)驗(yàn)。使用實(shí)施例2.A.6節(jié)所述的Fc-融合蛋白和重組治療蛋白。在用間質(zhì)蛋白酶敲除克隆的實(shí)驗(yàn)中，完整蛋白和經(jīng)剪切蛋白含量與陽性對照(+)中孵育的起始材料相當(dāng)，在未改變CHO-K1衍生野生型細(xì)胞(WT)的條件培養(yǎng)基內(nèi)孵育可完全破壞并因而降解完整蛋白。KO克隆的分析還持續(xù)數(shù)月的以分析防止、相應(yīng)減少剪切是否是敲除間質(zhì)蛋白酶基因的經(jīng)改變脊椎動物細(xì)胞的穩(wěn)定特征。因此，用獲自間質(zhì)蛋白酶敲除細(xì)胞克隆的條件培養(yǎng)基重復(fù)Fc-融合蛋白的跟蹤標(biāo)定實(shí)驗(yàn)，所述克隆已培養(yǎng)6個月。實(shí)驗(yàn)結(jié)果確認(rèn)用KO克隆時，即使數(shù)月后仍沒有剪切出現(xiàn)。此外，發(fā)現(xiàn)KO細(xì)胞系生長良好且細(xì)胞生長甚至在培養(yǎng)時間中改善。IV.實(shí)施例3：重組蛋白由間質(zhì)蛋白酶直接切割為進(jìn)一步證明間質(zhì)蛋白酶直接切割重組表達(dá)和分泌的蛋白(剪切靶標(biāo))，使用市售可得的蛋白酶，即小鼠MT-SP1和人Htra1。單克隆IgG抗體mAb(圖7A)、Fc-融合蛋白(圖7B)和另一重組蛋白(圖7C)分別孵育24小時、2小時和1小時，2個胰酶樣蛋白酶即小鼠MT-SP1和人Htra1加入純化學(xué)培養(yǎng)基。共孵育在500rpm連續(xù)振蕩下37℃進(jìn)行。感興趣多肽各以0.7μM濃度使用。各感興趣多肽用遞減量的蛋白酶MT-SP1和Htra1測試：蛋白酶/感興趣多肽從左到右的摩爾比，就MT-SP1而言是1/10,1/100,1/1000，Htra1是1/3,1/10和1/100。作為對照，額外的感興趣多肽樣品用來自CHO-K1野生型衍生細(xì)胞的條件培養(yǎng)基和不接觸細(xì)胞的純化學(xué)培養(yǎng)基孵育，前者作為陰性對照(泳道“(-)”)，后者作為陽性對照(泳道“(+)”)。根據(jù)圖7A-C的蛋白質(zhì)印跡，顯然向細(xì)胞培養(yǎng)基加入的重組Htra1不切割測試的感興趣多肽。即使在較高的Htra1濃度下，蛋白帶與陽性對照(“(+)”)完全一樣。相反，即使加入最低濃度的MT-SP1，所有重組感興趣多肽也明顯被剪切。蛋白帶類似陰性對照(“(-)”)或甚至更差。因此，加入MT-SP1時，在所有測試條件下發(fā)生顯著程度的剪切。在用Fc-融合蛋白的實(shí)驗(yàn)中，觀察到蛋白酶MT-SP1的濃度依賴性效果(圖7B)。間質(zhì)蛋白酶/MT-SP1濃度最低時，約85kDa的完整Fc-融合蛋白的蛋白帶相較陽性對照僅略微下降，MT-SP1濃度較高時，約85kDa的蛋白帶完全消失。因此，F(xiàn)c-融合蛋白剪切程度與細(xì)胞培養(yǎng)基中的間質(zhì)蛋白酶/MT-SP1濃度相關(guān)。為確定該實(shí)施例所用商業(yè)小鼠MT-SP1誘導(dǎo)的剪切位點(diǎn)，MT-SP1濃度為1/100的抗體樣品(mAb)進(jìn)行質(zhì)譜分析。所鑒定剪切位點(diǎn)與mAb由野生型CHO細(xì)胞系生成時相同。這顯示，mAb上的小鼠間質(zhì)蛋白酶剪切位點(diǎn)與在CHO細(xì)胞中生成mAb時負(fù)責(zé)剪切的蛋白酶剪切位點(diǎn)相同。這些結(jié)果進(jìn)一步確認(rèn)間質(zhì)蛋白酶是剪切蛋白酶。V.實(shí)施例4：通過選擇性間質(zhì)蛋白酶抑制劑來抑制間質(zhì)蛋白酶剪切作用為進(jìn)一步確認(rèn)重組感興趣多肽的剪切由間質(zhì)蛋白酶引起，該酶是負(fù)責(zé)剪切的關(guān)鍵蛋白酶，用特異抗MT-SP1Fab片段進(jìn)行跟蹤標(biāo)定實(shí)驗(yàn)，所述片段特異性抑制人間質(zhì)蛋白酶/MT-SP1。抑制性Fab結(jié)構(gòu)和對人MT-SP1的結(jié)合細(xì)節(jié)公開于Farady等,2008J.Mol.Biol.(2008)380,351-360)。此情況下，作為剪切靶標(biāo)的治療性感興趣多肽是單克隆IgG抗體(mAb)和有2個糖變體的重組非抗體糖蛋白。各情況下，感興趣多肽以0.7μM濃度加入。表9描述與圖8所示蛋白質(zhì)印跡結(jié)果對應(yīng)的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)設(shè)置細(xì)節(jié)，針對mAb(圖8，上排)和重組蛋白(圖8，下排)：表9條件培養(yǎng)基如材料與方法所述制備。在單克隆IgG抗體情況下，孵育時間是24小時，重組非抗體蛋白是1小時。圖8(見上排)顯示陽性對照(+)中存在完整mAb的強(qiáng)蛋白帶(見泳道2)。沒有觀察到經(jīng)剪切mAb。陰性對照(-)(見泳道3和8)中，更高強(qiáng)度的第二蛋白帶出現(xiàn)在完整蛋白的偏下方，表明單克隆抗體在CHO-K1衍生野生型細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中顯著剪切。完整和經(jīng)剪切mAb用箭頭標(biāo)記。在加入小鼠MT-SP1的純化學(xué)培養(yǎng)基中觀察到與陰性對照(-)相同的帶譜(見泳道4)。對于重組非抗體蛋白(見圖8，下排)，陽性對照(+)(見泳道2)中，就2種完整蛋白糖變體觀察到強(qiáng)帶，約37kDa。陽性對照中就完整蛋白糖變體所見的蛋白帶在陰性對照(-)中消失，出現(xiàn)經(jīng)剪切蛋白糖變體的新蛋白帶(見泳道3和8)。對于抗MT-SP1Fab存在下孵育的樣品，1μMFab已足以完全消除小鼠MT-SP1對mAb的降解(圖8，上排，泳道5)。1μM抗MT-SP1Fab也減少，但不能完全防止條件培養(yǎng)基中的mAb剪切(見上排，泳道9)。mAb剪切在Fab濃度為10μM和50μM的條件培養(yǎng)基中消除(圖8，上排，泳道10和11)。對于純化學(xué)培養(yǎng)基中用重組小鼠MT-SP1孵育的重組蛋白，剪切在1μMFab濃度下已然減少(見圖8，下排，泳道5)。在加入重組小鼠MT-SP1的純化學(xué)培養(yǎng)基和條件培養(yǎng)基中，于10μMFab觀察到剪切進(jìn)一步減少且50μMFab下觀察到剪切完全停止(見圖8，下排，泳道6、7以及10和11)。因此，針對人間質(zhì)蛋白酶得到的Fab也有效抑制小鼠以及倉鼠間質(zhì)蛋白酶。然而，需要較高濃度以觀察到完全抑制小鼠和倉鼠間質(zhì)蛋白酶。推測這歸因于人與小鼠和倉鼠間質(zhì)蛋白酶之間在表位結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)的氨基酸差異，使得針對人間質(zhì)蛋白酶的抑制性Fab對小鼠和倉鼠間質(zhì)蛋白酶的效力較小，使得需要更高濃度Fab來抑制。VI.實(shí)施例5：間質(zhì)蛋白酶敲除細(xì)胞系中的蛋白制備為確認(rèn)跟蹤標(biāo)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在補(bǔ)料分批培養(yǎng)的間質(zhì)蛋白酶敲除細(xì)胞克隆中表達(dá)數(shù)種感興趣多肽，分析所表達(dá)和分泌感興趣多肽的剪切并與對應(yīng)CHO野生型細(xì)胞系所得結(jié)果作比較，所述野生型細(xì)胞系內(nèi)源表達(dá)完整間質(zhì)蛋白酶。5.1.mAb編碼載體轉(zhuǎn)染表達(dá)間質(zhì)蛋白酶的CHO野生型細(xì)胞系(衍生自CHO-K1)和間質(zhì)蛋白酶敲除CHO細(xì)胞克隆4(KO-4，見表5)用表達(dá)載體轉(zhuǎn)染，所述載體包括編碼單克隆抗體(mAb)和2個選擇性標(biāo)記基因即neo和DHFR的多核苷酸。對于轉(zhuǎn)染，細(xì)胞生長到指數(shù)期且5x106細(xì)胞用3μg載體DNA轉(zhuǎn)染。用野生型細(xì)胞系進(jìn)行5次轉(zhuǎn)染重復(fù)并用KO-4細(xì)胞系進(jìn)行4次轉(zhuǎn)染重復(fù)。用G418(G418濃度0.8mg/ml)隨后2個連續(xù)MTX選擇步驟(500nM和1μMMTX)進(jìn)行選擇，選出的細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染有編碼感興趣蛋白的載體。對于所有細(xì)胞池和2種細(xì)胞系，選擇條件相同。選擇結(jié)束時(細(xì)胞活力>95％)，冷凍細(xì)胞。選擇過程期間，測定培養(yǎng)基中所表達(dá)mAb的效價。間質(zhì)蛋白酶敲除細(xì)胞上清中的效價與CHO野生型細(xì)胞的效價作比較。結(jié)果證明間質(zhì)蛋白酶敲除對細(xì)胞生產(chǎn)力沒有負(fù)面影響，甚至有增加效價的傾向。5.2.補(bǔ)料分批生產(chǎn)過程對于補(bǔ)料分批生產(chǎn)，選擇抗體效價最高的所有4個間質(zhì)蛋白酶敲除克隆KO-4池和3個CHO野生型細(xì)胞系池。7個池的冷凍細(xì)胞同時解凍，在接種到個體補(bǔ)料分批反應(yīng)器前傳代一次。細(xì)胞培養(yǎng)于補(bǔ)料分批搖床，包含富集氨基酸、維生素和微量元素的純化學(xué)培養(yǎng)基(補(bǔ)料分批培養(yǎng)基)。補(bǔ)料分批培養(yǎng)在37℃溫度和振蕩下完成。補(bǔ)料分批培養(yǎng)期間，含葡萄糖和氨基酸的進(jìn)料(補(bǔ)料分批進(jìn)料)隨著該過程定期添加。補(bǔ)料分批培養(yǎng)過程期間，定期收集補(bǔ)料分批培養(yǎng)材料樣品以用Vi-Cell細(xì)胞活力分析儀(貝克曼庫爾特(BeckmanCoulter))測定活細(xì)胞密度(vcd)并測定細(xì)胞培養(yǎng)基的蛋白效價。補(bǔ)料分批結(jié)束時(第13或14天)，停止培養(yǎng)工藝。收獲來自搖瓶的條件培養(yǎng)基(100ml培養(yǎng)物)并用0.22μmSteriflip濾器過濾。從過濾的條件培養(yǎng)基中純化單克隆抗體，采用蛋白A液相親和色譜(蛋白A微型柱,普洛透斯(Proteus),商品號.PUR008)。用供應(yīng)商操作進(jìn)行純化。蛋白A純化后的樣品蛋白濃度用NanoDropTM系統(tǒng)(賽默飛世爾)根據(jù)供應(yīng)商操作測定。補(bǔ)料分批培養(yǎng)分析揭示在14天培養(yǎng)期中，KO-4庫培養(yǎng)基中所表達(dá)mAb的效價與CHO野生型細(xì)胞庫培養(yǎng)基類似或甚至更高。此外，對于KO-4細(xì)胞庫，細(xì)胞活力類似或甚至更高。KO細(xì)胞還以類似或甚至更高細(xì)胞密度生長。這些結(jié)果表明間質(zhì)蛋白酶敲除不會負(fù)面影響蛋白表達(dá)率且可能甚至使其提高。另外，細(xì)胞生長不受到負(fù)面影響，甚至可能改善。5.3.剪切分析對于剪切分析，使用2種平行方法：微芯片電泳(ME)-SDS和質(zhì)譜。微芯片電泳5μL純化蛋白用于樣品制備。蛋白的量根據(jù)樣品濃度而不同。對于還原微芯片試驗(yàn)的樣品制備，5μL與35μL還原樣品緩沖液混合。然后，混合溶液在加熱塊中70℃孵育15分鐘。冷卻后，加入70μLMilliQ水至終體積110μL。系統(tǒng)采用來自珀金埃爾默(PerkinElmer)的GXII儀器。所用操作是供應(yīng)商操作的修訂版。主要區(qū)別在于樣品/還原樣品緩沖液之比，本操作為了更好變性取1:7，而不是供應(yīng)商操作的1:3.5。圖9顯示微芯片電泳結(jié)果。左起前3個泳道(標(biāo)識為WT1、2和3)代表蛋白A純化細(xì)胞培養(yǎng)物的蛋白樣品組成，這些培養(yǎng)物來自采用CHO野生型細(xì)胞庫的3次生產(chǎn)。各樣品中，觀察到同一蛋白帶譜。觀察到代表單克隆抗體完整重鏈(HC)的寬蛋白帶(來自Labchip試驗(yàn)的尺寸不精確且通常高估)。此蛋白帶正下方觀察到第二條稍窄蛋白帶，代表經(jīng)剪切重鏈。經(jīng)剪切HC物質(zhì)與非糖基化HC共移動。另外，在約29kDa觀察到代表輕鏈的第三蛋白帶。間質(zhì)蛋白酶敲除細(xì)胞庫(標(biāo)識為KO-41、2、3和4)所生成單克隆抗體的蛋白樣品中，完整重鏈和輕鏈的蛋白帶與CHO野生型細(xì)胞系所生成樣品的蛋白帶至少相當(dāng)，如果不比其更強(qiáng)。然而，由從上往下第二箭頭標(biāo)識的經(jīng)剪切重鏈帶在圖9的所有4個抗體樣品KO4-1、KO4-2、KO4-3、KO4-4中很難發(fā)現(xiàn)。這證明當(dāng)在間質(zhì)蛋白酶敲除細(xì)胞系中生成時，mAb剪切幾乎消除。為定量結(jié)果，測定經(jīng)剪切抗體重鏈和完整抗體重鏈的蛋白帶強(qiáng)度，并從中計(jì)算剪切百分比。表10概括了該分析結(jié)果。顯示用間質(zhì)蛋白酶敲除克隆作為生產(chǎn)細(xì)胞系時，單克隆抗體的剪切量大幅下降。根據(jù)分析，由3個CHO野生型細(xì)胞庫生成的單克隆抗體重鏈平均有16.1％被剪切。相比之下，對于4個間質(zhì)蛋白酶敲除補(bǔ)料分批培養(yǎng)所生成的mAbHC，出現(xiàn)平均僅1％或更少的剪切。由于非糖基化HC共移動，無法基于分析確定精確值。表10：基于蛋白帶強(qiáng)度的剪切分析因此，使用微芯片電泳，在間質(zhì)蛋白酶KO細(xì)胞所表達(dá)mAb中僅檢測到1％或更少剪切，而表達(dá)相同mAb的WT細(xì)胞中測得12％-20％剪切(HC中所測剪切)。質(zhì)譜分析樣品在質(zhì)譜分析前去糖基化并還原。來自7個蛋白A純化蛋白樣品的每一個，總蛋白為50μg的等分樣品在37℃用1.25μlPNGaseF(50mMTris/HClpH7.5中，濃度為0.3mg/ml)孵育過夜。樣品終濃度是約0.5mg/ml。去糖基化后，88μlPNGaseF已消化樣品如下還原：加入112μl還原緩沖液(8MGuHCl、10μl1MTris/HClpH7.5和2μl1MDTT)并37℃孵育1小時。通過加入2μl10％三氟乙酸來淬滅還原。然后，如此所得樣品用于液相色譜與質(zhì)譜組合分析，樣品總體積為202μl且濃度為約0.22mg/ml蛋白。LC/MS儀器是UPLC耦合沃特世(Waters)SynaptG2系統(tǒng)(軟件：MassLynx4.1)。LC法使用0.2mL/min流速和緩沖液MPA(溶于水的0.1％TFA)及MPB(溶于乙腈的0.09％TFA)。UV檢測在214nm和280nm進(jìn)行。樣品溫度是～5℃。將14μl去糖基化已還原樣品(蛋白量3μg)上樣到BEHC41.7μm,2.1X100mm柱(沃特世)。柱溫度是80℃。上樣前，柱用緩沖液MPA平衡。洗脫用緩沖液MPB進(jìn)行。洗脫的蛋白隨后通過質(zhì)譜進(jìn)一步分析。采用LC/MS數(shù)據(jù)，鑒定剪切位點(diǎn)和定量剪切物質(zhì)百分比。表11顯示各蛋白樣品中基于LC/MS試驗(yàn)的經(jīng)剪切抗體重鏈百分比。盡管在野生型樣品中觀察到20-29％剪切，當(dāng)用間質(zhì)蛋白酶敲除細(xì)胞生產(chǎn)時，僅2％或更少抗體重鏈被剪切。根據(jù)UV214nm數(shù)據(jù)計(jì)算的結(jié)果略高于還原LabChip試驗(yàn)所得(見表10)。然而，再次確認(rèn)應(yīng)用本公開教授內(nèi)容時實(shí)現(xiàn)剪切大幅減少。LC/MS結(jié)果證明間質(zhì)蛋白酶敲除細(xì)胞系所生成mAb的剪切減少15倍。分析剪切位點(diǎn)揭示，間質(zhì)蛋白酶敲除細(xì)胞生成的mAb重鏈在與CHO野生型細(xì)胞系生成的mAbHC相同的位置剪切。蛋白建模進(jìn)一步揭示，剪切位點(diǎn)位于暴露于細(xì)胞培養(yǎng)基的mAb極靈活區(qū)域。因此，即使對該剪切位點(diǎn)親和性低的蛋白酶能容易接觸并切割該位點(diǎn)。這些發(fā)現(xiàn)可解釋間質(zhì)蛋白酶敲除株中的剩余剪切事件。表11：基于LC/MS試驗(yàn)的剪切分析5.4.WT和KO-4轉(zhuǎn)染以其它糖蛋白實(shí)施其它示例以再次證明所引入間質(zhì)蛋白酶敲除不會負(fù)面影響重組糖蛋白的生產(chǎn)水平和產(chǎn)品質(zhì)量。表達(dá)2種不同于抗體的糖蛋白(這里是Fc-融合蛋白以及1種重組治療蛋白)。間質(zhì)蛋白酶敲除細(xì)胞系KO-4和KO-4得以衍生的CHO野生型細(xì)胞系用合適表達(dá)載體轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染和選擇后，進(jìn)行效價和蛋白分析(如上面第5.3章所述)。間質(zhì)蛋白酶KO細(xì)胞系KO-4達(dá)到的蛋白效價與KO-4得以衍生的對應(yīng)WT細(xì)胞系所得在相同范圍或更高(也見表12)。再次，在獲自KO細(xì)胞的蛋白如Fc-融合蛋白中的剪切相比獲自WT細(xì)胞的蛋白如Fc-融合蛋白顯著減少(也見表13)。這清楚顯示間質(zhì)蛋白酶基因的KO可降低多種其它多肽的蛋白質(zhì)降解。表12：Fc-融合蛋白和重組治療蛋白的表達(dá)分析候選物WTKO-4Fc-融合蛋白1.32g/L1.24g/L重組治療蛋白0.59g/L1.11g/L表13：Fc-融合蛋白和重組治療蛋白的剪切分析一般，間質(zhì)蛋白酶KO細(xì)胞系顯示就糖蛋白生成而言類似或甚至改善的特征。因此，相應(yīng)細(xì)胞系適合生成蛋白水解敏感性多肽，以及對蛋白水解不敏感的多肽。因而，提供簡化不同感興趣多肽生產(chǎn)的通用細(xì)胞系。VII.實(shí)施例6：上游工藝適用性和生物反應(yīng)器放大為顯示間質(zhì)蛋白酶敲除細(xì)胞系的待放大用于大規(guī)模治療生產(chǎn)的適用性，以三階段篩選法評估獲自2種不同間質(zhì)蛋白酶KO法(ZFN和TALEN技術(shù))的12個親代克隆。CHO野生型細(xì)胞系用于比較。6.1.評價親代克隆性能6.1.1.比較細(xì)胞擴(kuò)增期間的親代克隆性能為評價12個未轉(zhuǎn)染KO克隆(7個ZFN亞克隆(通過實(shí)施例2b所述ZFNKO克隆的單細(xì)胞分選產(chǎn)生)和5個TALEN衍生亞克隆)和比較野生型細(xì)胞系在用于大規(guī)模生產(chǎn)的擴(kuò)增期間的性能，用2種細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增培養(yǎng)基評估搖瓶中的種子培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基在必需維生素的濃度上有差異。因此，克隆以確定活細(xì)胞密度接種到2種擴(kuò)增培養(yǎng)基內(nèi)并在36.5℃培養(yǎng)4天。分析克隆，涉及終活細(xì)胞密度、平均生長率，如表14所述。連同用生產(chǎn)階段培養(yǎng)基(第6.1.2章)的親代克隆適宜性評價結(jié)果，選擇7個最佳性能克隆以進(jìn)一步比較生產(chǎn)能力(見第6.2章)。表14：細(xì)胞擴(kuò)增期間的親代克隆性能結(jié)果6.1.2.在生產(chǎn)條件下比較親代克隆性能在搖瓶補(bǔ)料分批生產(chǎn)過程中進(jìn)一步比較12個親代克隆和參照野生型細(xì)胞系。來自第6.1.1.章所述擴(kuò)增研究的細(xì)胞在36.5℃培養(yǎng)14天，用2種不同培養(yǎng)條件(2種不同純化學(xué)生產(chǎn)培養(yǎng)基，接種細(xì)胞密度和加料方案)。在整個過程期間按預(yù)定概況用2種獨(dú)立料液加料，應(yīng)用溫度變化。每天監(jiān)控細(xì)胞密度、活力和關(guān)鍵代謝物并用于在生產(chǎn)適宜性方面比較KO克隆與WT克隆。鑒定出7個克隆，其生長性能類似或超越野生型細(xì)胞系，而代謝概況相當(dāng)。6.2.轉(zhuǎn)染池的搖瓶篩選第6.1章鑒定的7個最佳親代克隆和CHO野生型用單克隆IgG抗體作為感興趣多肽進(jìn)行一式三份轉(zhuǎn)染，所述多肽已知在野生型細(xì)胞系背景下對蛋白質(zhì)水解性降解敏感。轉(zhuǎn)染細(xì)胞用搖瓶培養(yǎng)和2種不同條件評價，如第6.1.2章所述。培養(yǎng)期間監(jiān)控細(xì)胞生長(活細(xì)胞密度，細(xì)胞活力)，產(chǎn)物形成。獲自TALEN-敲除法的細(xì)胞顯示細(xì)胞生長與CHO野生型細(xì)胞類似或增加，而ZFN衍生庫顯示指數(shù)期中的細(xì)胞生長略低于TALEN衍生庫。然而，培養(yǎng)結(jié)束時的細(xì)胞活力就所有克隆而言相當(dāng)。相較CHO野生型庫的生產(chǎn)率，就培養(yǎng)結(jié)束時的容積生產(chǎn)率而言，TALEN平均高出19％而鋅指核酸酶庫高出9％。培養(yǎng)結(jié)束時(第14天)，分析單克隆IgG抗體的完整性。因此，上清通過離心收獲并無菌過濾。從上清捕獲單克隆IgG抗體，并通過CE-SDS(毛細(xì)管電泳-十二烷基硫酸鈉)分析蛋白水解性降解和通過CEC(陽離子交換色譜)評價電荷變體分布。獲自敲除克隆的所有池顯示約1％的類似地低水平多肽剪切，而獲自CHO野生型的產(chǎn)物剪切約21％。6.3.親代亞克隆和轉(zhuǎn)染池的生物反應(yīng)器篩選選擇第6.1.和6.2.章鑒定的4個最佳性能親代克隆和轉(zhuǎn)染池用于深入鑒定，采用7L玻璃生物反應(yīng)器的控制培養(yǎng)條件。培養(yǎng)過程基本如第6.1.2.章所述，盡管僅使用第6.2.章鑒定的優(yōu)選培養(yǎng)條件。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染池的生長相較未轉(zhuǎn)染親代克隆略低，這是歸因于多肽表達(dá)所導(dǎo)致代謝負(fù)荷的已知現(xiàn)象。然而，未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞生長行為相較WT細(xì)胞系有顯著差異。代謝物如乳酸和銨在常見范圍內(nèi)并類似野生型細(xì)胞系。分析評估產(chǎn)物質(zhì)量，通過SEC、CEC以及CE-SDS評價純度和通過專門方法評價N-糖基化。結(jié)果顯示所有KO克隆在集聚和降解產(chǎn)物、電荷變體分布和糖基化模式方面實(shí)現(xiàn)相當(dāng)?shù)漠a(chǎn)物質(zhì)量。CE-SDS還原結(jié)果顯示，就所有KO亞克隆而言存在0.7％低水平的剪切物質(zhì)。所有KO克隆不僅顯示與參照野生型細(xì)胞系類似或優(yōu)選的生長特征，而且生成始終具有更好質(zhì)量的多肽?！　⌒蛄斜怼　?lt;110>諾華股份有限公司（NovartisAG)　　<120>用于重組表達(dá)感興趣多肽的新型脊椎動物細(xì)胞和方法　　<130>PAT056118-WO-PCT　　<150>US61/985,589　　<151>2014-04-29　　<150>US61/994,310　　<151>2014-05-16　　<160>69　　<170>PatentIn3.5版本　　<210>1　　<211>855　　<212>PRT　　<213>灰倉鼠(Cricetulusgriseus)　　<400>1　　MetGlySerAsnArgGlyArgLysAlaGlyGlySerSerLysAspPhe　　151015　　GlyAlaArgLeuLysTyrSerSerGlyLeuGluAsnMetAsnGlyPhe　　202530　　GluGluGlyValGluPheLeuProValAsnAsnAlaLysLysValGlu　　354045　　LysArgGlyProArgArgCysValValLeuValValLeuLeuValSer　　505560　　PheLeuPheLeuSerLeuValAlaGlyPheLeuValTrpHisPheLeu　　65707580　　TyrSerAsnValArgIleGlnLysValPheAsnGlyHisLeuArgVal　　859095　　ThrAsnGluAsnPheLeuAspAlaTyrGluAsnSerAsnSerThrGlu　　100105110　　PheLysAspLeuAlaAsnGlnValLysGluAlaLeuLysLeuLeuTyr　　115120125　　SerGluValProValLeuGlyProTyrHisLysArgSerAlaValThr　　130135140　　AlaPheSerGluGlySerValIleAlaTyrTyrTrpSerGluPheSer　　145150155160　　IleProProHisLeuAlaGluGluValAspArgAlaMetAlaValGlu　　165170175　　ArgValValThrLeuProProArgAlaArgAlaLeuLysSerPheVal　　180185190　　LeuThrSerValValAlaPheProThrAspProArgLeuLeuGlyArg　　195200205　　ThrGlnAspAsnSerCysAsnPheAlaLeuHisAlaHisGlyGlyGlu　　210215220　　ValMetArgPheThrThrProGlyPheProAsnSerProTyrProAla　　225230235240　　HisAlaArgCysGlnTrpValLeuArgGlyAspAlaAspSerValLeu　　245250255　　SerLeuThrPheArgSerPheAspValAlaProCysAspGluLeuGly　　260265270　　AsnAspLeuValThrValTyrAspThrLeuSerProMetGluProHis　　275280285　　AlaValValArgLeuCysGlyThrTyrProProSerTyrAsnLeuThr　　290295300　　PheLeuSerSerGlnAsnValPheLeuValThrLeuIleThrAsnThr　　305310315320　　AspArgArgHisProGlyPheGluAlaThrPhePheGlnLeuProLys　　325330335　　MetArgSerCysGlyGlySerLeuSerGluAlaGlnGlyLeuPheSer　　340345350　　SerProTyrTyrProGlyHisTyrProProAsnIleAspCysThrTrp　　355360365　　AsnIleLysValProAsnAsnArgAsnValLysValArgPheLysLeu　　370375380　　PheTyrLeuValAspProAsnIleProLeuGlyThrCysProLysAsp　　385390395400　　TyrValGluIleAsnGlyGluArgTyrCysGlyGluLysSerGlnPhe　　405410415　　ValValSerSerAsnSerSerLysIleThrValArgPheHisSerAsp　　420425430　　HisSerTyrThrAspThrGlyPheLeuAlaGluTyrLeuSerTyrAsp　　435440445　　SerAsnAspProCysProGlyMetPheMetCysAsnThrGlyArgCys　　450455460　　IleArgLysAspLeuArgCysAspGlyTrpAlaAspCysProAspTyr　　465470475480　　SerAspGluHisPheCysArgCysAsnThrThrHisGlnPheMetCys　　485490495　　LysAsnLysLeuCysLysProLeuPheTrpValCysAspAsnIleAsn　　500505510　　AspCysGlyAspGlySerAspGluGluGlyCysSerCysProAlaGlu　　515520525　　ThrPheLysCysSerAsnGlyLysCysLeuProGlnSerGlnLysCys　　530535540　　AspGlyLysAspAsnCysGlyAspGlySerAspGluAlaSerCysAsp　　545550555560　　ArgValLysValValSerCysThrLysTyrThrTyrArgCysHisAsn　　565570575　　GlyLeuCysLeuSerLysGlyAsnProGluCysAspGlyLysLysAsp　　580585590　　CysSerAspGlySerAspGluLysAsnCysAspCysGlyLeuArgSer　　595600605　　PheThrLysGlnAlaArgValValGlyGlyThrAsnAlaAspGluGly　　610615620　　GluTrpProTrpGlnValSerLeuHisAlaLeuGlyGlnGlyHisLeu　　625630635640　　CysGlyAlaSerLeuIleSerProAsnTrpLeuValSerAlaAlaHis　　645650655　　CysPheMetAspAspArgAsnPheLysTyrSerAspHisThrLysTrp　　660665670　　ThrAlaPheLeuGlyLeuLeuAspGlnSerLysArgSerSerThrGly　　675680685　　ValGlnGluHisLysLeuLysArgIleIleThrHisProLeuPheAsn　　690695700　　GluIleThrPheAspTyrAspIleAlaLeuLeuGluLeuGluLysPro　　705710715720　　AlaGluTyrSerThrValValArgProIleCysLeuProAspThrThr　　725730735　　HisValPheProAlaGlyLysAlaIleTrpValThrGlyTrpGlyHis　　740745750　　ThrGlnGluGlyGlyThrGlyAlaLeuIleLeuGlnLysGlyGluIle　　755760765　　ArgValIleAsnGlnThrThrCysGluAspLeuMetProGlnGlnIle　　770775780　　ThrProArgMetMetCysValGlyPheLeuSerGlyGlyValAspSer　　785790795800　　CysGlnGlyAspSerGlyGlyProLeuSerSerValGluThrGluGly　　805810815　　ArgIlePheGlnAlaGlyValValSerTrpGlyGluGlyCysAlaGln　　820825830　　ArgAsnLysProGlyValTyrThrArgLeuProAlaValArgAspTrp　　835840845　　IleLysGluGlnThrGlyVal　　850855　　<210>2　　<211>855　　<212>PRT　　<213>智人(Homosapiens)　　<400>2　　MetGlySerAspArgAlaArgLysGlyGlyGlyGlyProLysAspPhe　　151015　　GlyAlaGlyLeuLysTyrAsnSerArgHisGluLysValAsnGlyLeu　　202530　　GluGluGlyValGluPheLeuProValAsnAsnValLysLysValGlu　　354045　　LysHisGlyProGlyArgTrpValValLeuAlaAlaValLeuIleGly　　505560　　LeuLeuLeuValLeuLeuGlyIleGlyPheLeuValTrpHisLeuGln　　65707580　　TyrArgAspValArgValGlnLysValPheAsnGlyTyrMetArgIle　　859095　　ThrAsnGluAsnPheValAspAlaTyrGluAsnSerAsnSerThrGlu　　100105110　　PheValSerLeuAlaSerLysValLysAspAlaLeuLysLeuLeuTyr　　115120125　　SerGlyValProPheLeuGlyProTyrHisLysGluSerAlaValThr　　130135140　　AlaPheSerGluGlySerValIleAlaTyrTyrTrpSerGluPheSer　　145150155160　　IleProGlnHisLeuValGluGluAlaGluArgValMetAlaGluGlu　　165170175　　ArgValValMetLeuProProArgAlaArgSerLeuLysSerPheVal　　180185190　　ValThrSerValValAlaPheProThrAspSerLysThrValGlnArg　　195200205　　ThrGlnAspAsnSerCysSerPheGlyLeuHisAlaArgGlyValGlu　　210215220　　LeuMetArgPheThrThrProGlyPheProAspSerProTyrProAla　　225230235240　　HisAlaArgCysGlnTrpAlaLeuArgGlyAspAlaAspSerValLeu　　245250255　　SerLeuThrPheArgSerPheAspLeuAlaSerCysAspGluArgGly　　260265270　　SerAspLeuValThrValTyrAsnThrLeuSerProMetGluProHis　　275280285　　AlaLeuValGlnLeuCysGlyThrTyrProProSerTyrAsnLeuThr　　290295300　　PheHisSerSerGlnAsnValLeuLeuIleThrLeuIleThrAsnThr　　305310315320　　GluArgArgHisProGlyPheGluAlaThrPhePheGlnLeuProArg　　325330335　　MetSerSerCysGlyGlyArgLeuArgLysAlaGlnGlyThrPheAsn　　340345350　　SerProTyrTyrProGlyHisTyrProProAsnIleAspCysThrTrp　　355360365　　AsnIleGluValProAsnAsnGlnHisValLysValArgPheLysPhe　　370375380　　PheTyrLeuLeuGluProGlyValProAlaGlyThrCysProLysAsp　　385390395400　　TyrValGluIleAsnGlyGluLysTyrCysGlyGluArgSerGlnPhe　　405410415　　ValValThrSerAsnSerAsnLysIleThrValArgPheHisSerAsp　　420425430　　GlnSerTyrThrAspThrGlyPheLeuAlaGluTyrLeuSerTyrAsp　　435440445　　SerSerAspProCysProGlyGlnPheThrCysArgThrGlyArgCys　　450455460　　IleArgLysGluLeuArgCysAspGlyTrpAlaAspCysThrAspHis　　465470475480　　SerAspGluLeuAsnCysSerCysAspAlaGlyHisGlnPheThrCys　　485490495　　LysAsnLysPheCysLysProLeuPheTrpValCysAspSerValAsn　　500505510　　AspCysGlyAspAsnSerAspGluGlnGlyCysSerCysProAlaGln　　515520525　　ThrPheArgCysSerAsnGlyLysCysLeuSerLysSerGlnGlnCys　　530535540　　AsnGlyLysAspAspCysGlyAspGlySerAspGluAlaSerCysPro　　545550555560　　LysValAsnValValThrCysThrLysHisThrTyrArgCysLeuAsn　　565570575　　GlyLeuCysLeuSerLysGlyAsnProGluCysAspGlyLysGluAsp　　580585590　　CysSerAspGlySerAspGluLysAspCysAspCysGlyLeuArgSer　　595600605　　PheThrArgGlnAlaArgValValGlyGlyThrAspAlaAspGluGly　　610615620　　GluTrpProTrpGlnValSerLeuHisAlaLeuGlyGlnGlyHisIle　　625630635640　　CysGlyAlaSerLeuIleSerProAsnTrpLeuValSerAlaAlaHis　　645650655　　CysTyrIleAspAspArgGlyPheArgTyrSerAspProThrGlnTrp　　660665670　　ThrAlaPheLeuGlyLeuHisAspGlnSerGlnArgSerAlaProGly　　675680685　　ValGlnGluArgArgLeuLysArgIleIleSerHisProPhePheAsn　　690695700　　AspPheThrPheAspTyrAspIleAlaLeuLeuGluLeuGluLysPro　　705710715720　　AlaGluTyrSerSerMetValArgProIleCysLeuProAspAlaSer　　725730735　　HisValPheProAlaGlyLysAlaIleTrpValThrGlyTrpGlyHis　　740745750　　ThrGlnTyrGlyGlyThrGlyAlaLeuIleLeuGlnLysGlyGluIle　　755760765　　ArgValIleAsnGlnThrThrCysGluAsnLeuLeuProGlnGlnIle　　770775780　　ThrProArgMetMetCysValGlyPheLeuSerGlyGlyValAspSer　　785790795800　　CysGlnGlyAspSerGlyGlyProLeuSerSerValGluAlaAspGly　　805810815　　ArgIlePheGlnAlaGlyValValSerTrpGlyAspGlyCysAlaGln　　820825830　　ArgAsnLysProGlyValTyrThrArgLeuProLeuPheArgAspTrp　　835840845　　IleLysGluAsnThrGlyVal　　850855　　<210>3　　<211>855　　<212>PRT　　<213>小家鼠(Musmusculus)　　<400>3　　MetGlySerAsnArgGlyArgLysAlaGlyGlyGlySerGlnAspPhe　　151015　　GlyAlaGlyLeuLysTyrAsnSerArgLeuGluAsnMetAsnGlyPhe　　202530　　GluGluGlyValGluPheLeuProAlaAsnAsnAlaLysLysValGlu　　354045　　LysArgGlyProArgArgTrpValValLeuValAlaValLeuPheSer　　505560　　PheLeuLeuLeuSerLeuMetAlaGlyLeuLeuValTrpHisPheHis　　65707580　　TyrArgAsnValArgValGlnLysValPheAsnGlyHisLeuArgIle　　859095　　ThrAsnGluIlePheLeuAspAlaTyrGluAsnSerThrSerThrGlu　　100105110　　PheIleSerLeuAlaSerGlnValLysGluAlaLeuLysLeuLeuTyr　　115120125　　AsnGluValProValLeuGlyProTyrHisLysLysSerAlaValThr　　130135140　　AlaPheSerGluGlySerValIleAlaTyrTyrTrpSerGluPheSer　　145150155160　　IleProProHisLeuAlaGluGluValAspArgAlaMetAlaValGlu　　165170175　　ArgValValThrLeuProProArgAlaArgAlaLeuLysSerPheVal　　180185190　　LeuThrSerValValAlaPheProIleAspProArgMetLeuGlnArg　　195200205　　ThrGlnAspAsnSerCysSerPheAlaLeuHisAlaHisGlyAlaAla　　210215220　　ValThrArgPheThrThrProGlyPheProAsnSerProTyrProAla　　225230235240　　HisAlaArgCysGlnTrpValLeuArgGlyAspAlaAspSerValLeu　　245250255　　SerLeuThrPheArgSerPheAspValAlaProCysAspGluHisGly　　260265270　　SerAspLeuValThrValTyrAspSerLeuSerProMetGluProHis　　275280285　　AlaValValArgLeuCysGlyThrPheSerProSerTyrAsnLeuThr　　290295300　　PheLeuSerSerGlnAsnValPheLeuValThrLeuIleThrAsnThr　　305310315320　　AspArgArgHisProGlyPheGluAlaThrPhePheGlnLeuProLys　　325330335　　MetSerSerCysGlyGlyPheLeuSerAspThrGlnGlyThrPheSer　　340345350　　SerProTyrTyrProGlyHisTyrProProAsnIleAsnCysThrTrp　　355360365　　AsnIleLysValProAsnAsnArgAsnValLysValArgPheLysLeu　　370375380　　PheTyrLeuValAspProAsnValProValGlySerCysThrLysAsp　　385390395400　　TyrValGluIleAsnGlyGluLysTyrCysGlyGluArgSerGlnPhe　　405410415　　ValValSerSerAsnSerSerLysIleThrValHisPheHisSerAsp　　420425430　　HisSerTyrThrAspThrGlyPheLeuAlaGluTyrLeuSerTyrAsp　　435440445　　SerAsnAspProCysProGlyMetPheMetCysLysThrGlyArgCys　　450455460　　IleArgLysGluLeuArgCysAspGlyTrpAlaAspCysProAspTyr　　465470475480　　SerAspGluArgTyrCysArgCysAsnAlaThrHisGlnPheThrCys　　485490495　　LysAsnGlnPheCysLysProLeuPheTrpValCysAspSerValAsn　　500505510　　AspCysGlyAspGlySerAspGluGluGlyCysSerCysProAlaGly　　515520525　　SerPheLysCysSerAsnGlyLysCysLeuProGlnSerGlnLysCys　　530535540　　AsnGlyLysAspAsnCysGlyAspGlySerAspGluAlaSerCysAsp　　545550555560　　SerValAsnValValSerCysThrLysTyrThrTyrArgCysGlnAsn　　565570575　　GlyLeuCysLeuSerLysGlyAsnProGluCysAspGlyLysThrAsp　　580585590　　CysSerAspGlySerAspGluLysAsnCysAspCysGlyLeuArgSer　　595600605　　PheThrLysGlnAlaArgValValGlyGlyThrAsnAlaAspGluGly　　610615620　　GluTrpProTrpGlnValSerLeuHisAlaLeuGlyGlnGlyHisLeu　　625630635640　　CysGlyAlaSerLeuIleSerProAspTrpLeuValSerAlaAlaHis　　645650655　　CysPheGlnAspAspLysAsnPheLysTyrSerAspTyrThrMetTrp　　660665670　　ThrAlaPheLeuGlyLeuLeuAspGlnSerLysArgSerAlaSerGly　　675680685　　ValGlnGluLeuLysLeuLysArgIleIleThrHisProSerPheAsn　　690695700　　AspPheThrPheAspTyrAspIleAlaLeuLeuGluLeuGluLysSer　　705710715720　　ValGluTyrSerThrValValArgProIleCysLeuProAspAlaThr　　725730735　　HisValPheProAlaGlyLysAlaIleTrpValThrGlyTrpGlyHis　　740745750　　ThrLysGluGlyGlyThrGlyAlaLeuIleLeuGlnLysGlyGluIle　　755760765　　ArgValIleAsnGlnThrThrCysGluAspLeuMetProGlnGlnIle　　770775780　　ThrProArgMetMetCysValGlyPheLeuSerGlyGlyValAspSer　　785790795800　　CysGlnGlyAspSerGlyGlyProLeuSerSerAlaGluLysAspGly　　805810815　　ArgMetPheGlnAlaGlyValValSerTrpGlyGluGlyCysAlaGln　　820825830　　ArgAsnLysProGlyValTyrThrArgLeuProValValArgAspTrp　　835840845　　IleLysGluHisThrGlyVal　　850855　　<210>4　　<211>855　　<212>PRT　　<213>褐家鼠(Rattusnorvegicus)　　<400>4　　MetGlyAsnAsnArgGlyArgLysAlaGlyGlyGlySerGlnAspPhe　　151015　　GlyAlaGlyLeuLysTyrAsnSerArgLeuGluAsnMetAsnGlyPhe　　202530　　GluGluGlyValGluPheLeuProValAsnAsnAlaLysGlnValGlu　　354045　　LysArgGlyProArgArgTrpValValMetValAlaValValPheSer　　505560　　PheLeuLeuLeuSerLeuMetAlaGlyLeuLeuValTrpHisPheHis　　65707580　　TyrArgAsnValArgIleGlnLysValPheAsnGlyHisLeuArgIle　　859095　　ThrAsnGluAsnPheLeuAspAlaTyrGluAsnSerThrSerThrGlu　　100105110　　PheIleSerLeuAlaSerGlnValLysGluAlaLeuLysLeuMetTyr　　115120125　　SerGluValProValLeuGlyProTyrHisLysLysSerThrValThr　　130135140　　AlaPheSerGluGlySerValIleAlaTyrTyrTrpSerGluPheSer　　145150155160　　IleProProHisLeuGluGluGluValAspArgAlaMetAlaValGlu　　165170175　　ArgValValThrLeuProProArgAlaArgAlaLeuLysSerPheVal　　180185190　　LeuThrSerValValAlaPheProIleAspProArgMetLeuGlnArg　　195200205　　ThrGlnAspAsnSerCysSerPheAlaLeuHisAlaArgGlyArgThr　　210215220　　ValThrArgPheThrThrProGlyPheProAsnSerProTyrProAla　　225230235240　　HisAlaArgCysGlnTrpValLeuArgGlyAspAlaAspSerValLeu　　245250255　　SerLeuThrPheArgSerPheAspValAlaProCysAspGlyHisAsp　　260265270　　SerAspLeuValThrValTyrAspSerLeuSerProMetGluProHis　　275280285　　AlaValValArgLeuCysGlyThrPheSerProSerTyrAsnLeuThr　　290295300　　PheLeuSerSerGlnAsnValPheLeuValThrLeuIleThrAsnThr　　305310315320　　AspArgArgHisProGlyPheGluAlaThrPhePheGlnLeuProLys　　325330335　　MetSerSerCysGlyGlyLeuLeuSerGluAlaGlnGlyThrPheSer　　340345350　　SerProTyrTyrProGlyHisTyrProProAsnIleAsnCysThrTrp　　355360365　　AsnIleLysValProAsnAsnArgAsnValLysValArgPheLysLeu　　370375380　　PheTyrLeuValAspProAsnIleProValGlySerCysThrLysAsp　　385390395400　　TyrValGluIleAsnGlyGluLysPheCysGlyGluArgSerGlnPhe　　405410415　　ValValSerSerAsnSerSerLysIleThrValHisPheHisSerAsp　　420425430　　HisSerTyrThrAspThrGlyPheLeuAlaGluTyrLeuSerTyrAsp　　435440445　　SerAsnAspProCysProGlyMetPheMetCysLysThrGlyArgCys　　450455460　　IleArgLysAspLeuArgCysAspGlyTrpAlaAspCysProAspTyr　　465470475480　　SerAspGluArgHisCysArgCysAsnAlaThrHisGlnPheMetCys　　485490495　　LysAsnGlnPheCysLysProLeuPheTrpValCysAspSerValAsn　　500505510　　AspCysGlyAspGlySerAspGluGluGlyCysSerCysProAlaGly　　515520525　　SerPheLysCysSerAsnGlyLysCysLeuProGlnSerGlnGlnCys　　530535540　　AsnGlyLysAspAspCysGlyAspGlySerAspGluAlaSerCysAsp　　545550555560　　AsnValAsnAlaValSerCysThrLysTyrThrTyrArgCysGlnAsn　　565570575　　GlyLeuCysLeuAsnLysGlyAsnProGluCysAspGlyLysLysAsp　　580585590　　CysSerAspGlySerAspGluLysAsnCysAspCysGlyLeuArgSer　　595600605　　PheThrLysGlnAlaArgValValGlyGlyThrAsnAlaAspGluGly　　610615620　　GluTrpProTrpGlnValSerLeuHisAlaLeuGlyGlnGlyHisLeu　　625630635640　　CysGlyAlaSerLeuIleSerProAspTrpLeuValSerAlaAlaHis　　645650655　　CysPheGlnAspGluThrIlePheLysTyrSerAspHisThrMetTrp　　660665670　　ThrAlaPheLeuGlyLeuLeuAspGlnSerLysArgSerAlaSerGly　　675680685　　ValGlnGluHisLysLeuLysArgIleIleThrHisProSerPheAsn　　690695700　　AspPheThrPheAspTyrAspIleAlaLeuLeuGluLeuGluLysPro　　705710715720　　AlaGluTyrSerThrValValArgProIleCysLeuProAspAsnThr　　725730735　　HisValPheProAlaGlyLysAlaIleTrpValThrGlyTrpGlyHis　　740745750　　ThrLysGluGlyGlyThrGlyAlaLeuIleLeuGlnLysGlyGluIle　　755760765　　ArgValIleAsnGlnThrThrCysGluGluLeuLeuProGlnGlnIle　　770775780　　ThrProArgMetMetCysValGlyPheLeuSerGlyGlyValAspSer　　785790795800　　CysGlnGlyAspSerGlyGlyProLeuSerSerValGluLysAspGly　　805810815　　ArgIlePheGlnAlaGlyValValSerTrpGlyGluGlyCysAlaGln　　820825830　　ArgAsnLysProGlyValTyrThrArgIleProGluValArgAspTrp　　835840845　　IleLysGluGlnThrGlyVal　　850855　　<210>5　　<211>855　　<212>PRT　　<213>黑猩猩(Pantroglodytes)　　<220>　　<221>雜項(xiàng)特征　　<222>(561)..(561)　　<223>Xaa可以是任何天然產(chǎn)生的氨基酸　　<400>5　　MetGlySerAspArgAlaArgLysGlyGlyGlyGlyProLysAspPhe　　151015　　GlyAlaGlyLeuLysTyrAsnSerArgHisGluLysValAsnGlyLeu　　202530　　GluGluGlyValGluPheLeuProValAsnAsnValLysLysValGlu　　354045　　LysHisGlyProGlyArgTrpValValLeuAlaAlaValLeuIleGly　　505560　　LeuLeuLeuValLeuLeuGlyIleGlyPheLeuValTrpHisLeuGln　　65707580　　TyrArgAspValArgValGlnLysValPheAsnGlyTyrMetArgIle　　859095　　ThrAsnGluAsnPheValAspAlaTyrGluAsnSerAsnSerThrGlu　　100105110　　PheValSerLeuAlaSerLysValLysAspAlaLeuLysLeuLeuTyr　　115120125　　SerGlyValProPheLeuGlyProTyrHisLysGluSerAlaValThr　　130135140　　AlaPheSerGluGlySerValIleAlaTyrTyrTrpSerGluPheSer　　145150155160　　IleProGlnHisLeuValGluGluAlaGluArgValMetAlaGluGlu　　165170175　　ArgValValMetLeuProProArgAlaArgSerLeuLysSerPheVal　　180185190　　ValThrSerValValAlaPheProThrAspSerLysThrValGlnArg　　195200205　　ThrGlnAspAsnSerCysSerPheGlyLeuHisAlaArgGlyValGlu　　210215220　　LeuMetArgPheThrThrProGlyPheProAspSerProTyrProAla　　225230235240　　HisAlaArgCysGlnTrpAlaLeuArgGlyAspAlaAspSerValLeu　　245250255　　SerLeuThrPheArgSerPheAspLeuAlaSerCysAspGluArgGly　　260265270　　SerAspLeuValMetValTyrAsnThrLeuSerProMetGluProHis　　275280285　　AlaLeuValGlnLeuCysGlyThrTyrProProSerTyrAsnLeuThr　　290295300　　PheHisSerSerGlnAsnValLeuLeuValThrLeuIleThrAsnThr　　305310315320　　ArgArgArgHisProGlyPheGluAlaThrPhePheGlnLeuProArg　　325330335　　MetArgSerCysGlyGlyArgLeuArgLysAlaGlnGlyThrPheAsn　　340345350　　SerProTyrTyrProGlyHisTyrProProAsnIleAspCysThrTrp　　355360365　　AsnIleGluValProAsnAsnGlnHisValLysValArgPheLysPhe　　370375380　　PheTyrLeuLeuGluProGlyValProAlaGlyThrCysProLysAsp　　385390395400　　TyrValGluIleAsnGlyGluLysTyrCysGlyGluArgSerGlnPhe　　405410415　　ValValThrSerAsnSerAsnLysIleThrValArgPheHisSerAsp　　420425430　　GlnSerTyrThrAspThrGlyPheLeuAlaGluTyrValSerTyrAsp　　435440445　　SerSerAspProCysProGlyGlnPheThrCysArgThrGlyArgCys　　450455460　　IleArgLysGluLeuArgCysAspGlyTrpAlaAspCysThrAspHis　　465470475480　　SerAspGluLeuAsnCysSerCysAspAlaSerHisGlnPheThrCys　　485490495　　LysAsnLysPheCysLysProLeuPheTrpValCysAspSerValAsn　　500505510　　AspCysGlyAspAsnSerAspGluGlnGlyCysSerCysProAlaGln　　515520525　　ThrPheArgCysSerAsnGlyLysCysLeuSerLysSerGlnGlnCys　　530535540　　AsnGlyLysAspAspCysGlyAspGlySerAspGluAlaSerCysPro　　545550555560　　XaaValAsnValValThrCysThrLysHisThrTyrArgCysLeuAsn　　565570575　　GlyLeuCysLeuSerLysGlyAsnProGluCysAspGlyLysGluAsp　　580585590　　CysSerAspGlySerAspGluLysAspCysAspCysGlyLeuArgSer　　595600605　　PheThrArgGlnAlaArgValValGlyGlyThrAspAlaAspGluGly　　610615620　　GluTrpProTrpGlnValSerLeuHisAlaLeuGlyGlnGlyHisIle　　625630635640　　CysGlyAlaSerLeuIleSerProAsnTrpLeuValSerAlaAlaHis　　645650655　　CysTyrIleAspAspArgGlyPheArgTyrSerAspProThrGlnTrp　　660665670　　ThrAlaPheLeuGlyLeuHisAspGlnSerGlnArgSerAlaProGly　　675680685　　ValGlnGluArgArgLeuLysArgIleIleSerHisProPhePheAsn　　690695700　　AspPheThrPheAspTyrAspIleAlaLeuLeuGluLeuGluLysPro　　705710715720　　AlaGluTyrSerSerMetValArgProIleCysLeuProAspAlaSer　　725730735　　HisValPheProAlaGlyLysAlaIleTrpValThrGlyTrpGlyHis　　740745750　　ThrGlnTyrGlyGlyThrGlyAlaLeuIleLeuGlnLysGlyGluIle　　755760765　　ArgValIleAsnGlnThrThrCysGluAsnLeuLeuProGlnGlnIle　　770775780　　ThrProArgMetMetCysValGlyPheLeuSerGlyGlyValAspSer　　785790795800　　CysGlnGlyAspSerGlyGlyProLeuSerSerValGluAlaAspGly　　805810815　　ArgIlePheGlnAlaGlyValValSerTrpGlyAspGlyCysAlaGln　　820825830　　ArgAsnLysProGlyValTyrThrArgLeuProLeuPheArgAspTrp　　835840845　　IleLysGluAsnThrGlyVal　　850855　　<210>6　　<211>21　　<212>DNA　　<213>人工序列　　<220>　　<223>蛋白裂解酶/MT-SP1-siRNA正義序列　　<400>6　　gcaagaucacuguucgcuutt21　　<210>7　　<211>21　　<212>DNA　　<213>人工序列　　<220>　　<223>蛋白裂解酶/MT-SP1siRNA反義序列　　<400>7　　aagcgaacagugaucuugctg21　　<210>8　　<211>21　　<212>DNA　　<213>人工序列　　<220>　　<223>C1ra-siRNA正義序列　　<400>8　　gaugucuuuucucaaaauatt21　　<210>9　　<211>21　　<212>DNA　　<213>人工序列　　<220>　　<223>C1ra-siRNA反義序列　　<400>9　　uauuuugagaaaagacaucat21　　<210>10　　<211>21　　<212>DNA　　<213>人工序列　　<220>　　<223>Gm5077-siRNA正義序列　　<400>10　　cgcugaacgugugauuauutt21　　<210>11　　<211>21　　<212>DNA　　<213>人工序列　　<220>　　<223>Gm5077-siRNA反義序列　　<400>11　　aauaaucacacguucagcggt21　　<210>12　　<211>21　　<212>DNA　　<213>人工序列　　<220>　　<223>Plat-siRNA正義序列　　<400>12　　gaaacaagaugaagacagatt21　　<210>13　　<211>21　　<212>DNA　　<213>人工序列　　<220>　　<223>Plat-siRNA反義序列　　<400>13　　ucugucuucaucuuguuuccc21　　<210>14　　<211>21　　<212>DNA　　<213>人工序列　　<220>　　<223>Prss35-siRNA正義序列　　<400>14　　ggccuuagacuacgacuautt21　　<210>15　　<211>21　　<212>DNA　　<213>人工序列　　<220>　　<223>Prss35-siRNA反義序列　　<400>15　　auagucguagucuaaggccgg21　　<210>16　　<211>21　　<212>DNA　　<213>人工序列　　<220>　　<223>蛋白裂解酶/MT-SP1-正向引物序列　　<400>16　　cgctgagtacctgtcctacga21　　<210>17　　<211>23　　<212>DNA　　<213>人工序列　　<220>　　<223>蛋白裂解酶/MT-SP1-反向引物序列　　<400>17　　accgtccagtgttacacatgaac23　　<210>18　　<211>16　　<212>DNA　　<213>人工序列　　<220>　　<223>蛋白裂解酶/MT-SP1報告子1序列　　<400>18　　ccaatgacccatgccc16　　<210>19　　<211>20　　<212>DNA　　<213>人工序列　　<220>　　<223>C1ra正向引物序列　　<400>19　　acctgcaaacaaggctacca20　　<210>20　　<211>20　　<212>DNA　　<213>人工序列　　<220>　　<223>C1ra反向引物序列　　<400>20　　tggcaaacagctgtgaagga20　　<210>21　　<211>15　　<212>DNA　　<213>人工序列　　<220>　　<223>C1ra報告子1序列　　<400>21　　cagcacctggtttcc15　　<210>22　　<211>24　　<212>DNA　　<213>人工序列　　<220>　　<223>Gm5077正向引物序列　　<400>22　　tgcgaggagccatattactacatg24　　<210>23　　<211>17　　<212>DNA　　<213>人工序列　　<220>　　<223>Gm5077反向引物序列　　<400>23　　gcagcgcagcgatactc17　　<210>24　　<211>16　　<212>DNA　　<213>人工序列　　<220>　　<223>Gm5077報告子1序列　　<400>24　　ccgccgtgttcttcat16　　<210>25　　<211>24　　<212>DNA　　<213>人工序列　　<220>　　<223>Plat正向引物序列　　<400>25　　agctgacatgggaatactgtgatg24　　<210>26　　<211>25　　<212>DNA　　<213>人工序列　　<220>　　<223>Plat反向引物序列　　<400>26　　cctttaattcgaaactgtggctgtt25　　<210>27　　<211>15　　<212>DNA　　<213>人工序列　　<220>　　<223>Plat報告子1序列　　<400>27　　ccgtgctccacctgc15　　<210>28　　<211>21　　<212>DNA　　<213>人工序列　　<220>　　<223>Prss35正向引物序列　　<400>28　　aggagagcaccacacaaagac21　　<210>29　　<211>20　　<212>DNA　　<213>人工序列　　<220>　　<223>Prss35反向引物序列　　<400>29　　acacgagtccactggaagga20　　<210>30　　<211>16　　<212>DNA　　<213>人工序列　　<220>　　<223>Prss35報告子1序列　　<400>30　　ccccggacccctcctg16<210>31<211>345<212>DNA<213>灰倉鼠(Cricetulusgriseus)<400>31ttttttgcccagtcctggttcttccaaactcacaggtgtcactgaacctccggggctggg60aagctattgtcggggagcgtctctgagtcctgaaatatctttctgtttagaacatgaatg120gctttgaggagggtgtggagtttctgcctgtgaataatgccaagaaagtggagaagcgag180gcccccggcgctgtgtggtgcttgtggtcctgctggtcagtttcctctttctctcactcg240tggctggcttcctggtgtggcacttcctctgtgagtacagtgggggctgtgggagggcga300cagaggggtagtgttctctcttctctcagaggacagaccaaaggg345<210>32<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>正向引物序列<400>32ttttttgcccagtcctggtt20<210>33<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>反向引物序列<400>33ccctttggtctgtcctctga20<210>34<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>切割引物<400>34gtggagtttctgcctgtgaa20<210>35<211>160<212>DNA<213>灰倉鼠(Cricetulusgriseus)<400>35aacatgaatggctttgaggagggtgtggagtttctgcctgtgaataatgccaagaaagtg60gagaagcgaggcccccggcgctgtgtggtgcttgtggtcctgctggtcagtttcctcttt120ctctcactcgtggctggcttcctggtgtggcacttcctct160<210>36<211>156<212>DNA<213>灰倉鼠(Cricetulusgriseus)<400>36aacatgaatggctttgaggagggtgtggagttcctgtgaataatgccaagaaagtggaga60agcgaggcccccggcgctgtgtggtgcttgtggtcctgctggtcagtttcctctttctct120cactcgtggctggcttcctggtgtggcacttcctct156<210>37<211>156<212>DNA<213>灰倉鼠(Cricetulusgriseus)<400>37aacatgaatggctttgaggagggtgtggagtttctgtgaataatgccaagaaagtggaga60agcgaggcccccggcgctgtgtggtgcttgtggtcctgctggtcagtttcctctttctct120cactcgtggctggcttcctggtgtggcacttcctct156<210>38<211>143<212>DNA<213>灰倉鼠(Cricetulusgriseus)<400>38aacatgaatggctttgaggagggtgaataatgccaagaaagtggagaagcgaggcccccg60gcgctgtgtggtgcttgtggtcctgctggtcagtttcctctttctctcactcgtggctgg120cttcctggtgtggcacttcctct143<210>39<211>17<212>DNA<213>灰倉鼠(Cricetulusgriseus)<400>39tggagtttctgcctgtg17<210>40<211>146<212>DNA<213>灰倉鼠(Cricetulusgriseus)<400>40aacatgaatggctttgaggagggtgtggaataatgccaagaaagtggagaagcgaggccc60ccggcgctgtgtggtgcttgtggtcctgctggtcagtttcctctttctctcactcgtggc120tggcttcctggtgtggcacttcctct146<210>41<211>14<212>DNA<213>灰倉鼠(Cricetulusgriseus)<400>41gtttctgcctgtga14<210>42<211>156<212>DNA<213>灰倉鼠(Cricetulusgriseus)<400>42aacatgaatggctttgaggagggtgtggagtgcctgtgaataatgccaagaaagtggaga60agcgaggcccccggcgctgtgtggtgcttgtggtcctgctggtcagtttcctctttctct120cactcgtggctggcttcctggtgtggcacttcctct156<210>43<211>149<212>DNA<213>灰倉鼠(Cricetulusgriseus)<400>43aacatgaatggctttgaggagggtgtggagtaataatgccaagaaagtggagaagcgagg60cccccggcgctgtgtggtgcttgtggtcctgctggtcagtttcctctttctctcactcgt120ggctggcttcctggtgtggcacttcctct149<210>44<211>11<212>DNA<213>灰倉鼠(Cricetulusgriseus)<400>44ttctgcctgtg11<210>45<211>153<212>DNA<213>灰倉鼠(Cricetulusgriseus)<400>45aacatgaatggctttgaggagggtgtgggcctgtgaataatgccaagaaagtggagaagc60gaggcccccggcgctgtgtggtgcttgtggtcctgctggtcagtttcctctttctctcac120tcgtggctggcttcctggtgtggcacttcctct153<210>46<211>145<212>DNA<213>灰倉鼠(Cricetulusgriseus)<400>46aacatgaatggctttgaggagggtgtgaataatgccaagaaagtggagaagcgaggcccc60cggcgctgtgtggtgcttgtggtcctgctggtcagtttcctctttctctcactcgtggct120ggcttcctggtgtggcacttcctct145　　<210>47　　<211>15　　<212>DNA　　<213>灰倉鼠(Cricetulusgriseus)　　<400>47　　gagtttctgcctgtg15　　<210>48　　<211>124　　<212>PRT　　<213>灰倉鼠(Cricetulusgriseus)　　<400>48　　MetGlySerAsnArgGlyArgLysAlaGlyGlySerSerLysAspPhe　　151015　　GlyAlaArgLeuLysTyrSerSerGlyLeuGluAsnMetAsnGlyPhe　　202530　　GluGluGlyValGluPheLeuProValAsnAsnAlaLysLysValGlu　　354045　　LysArgGlyProArgArgCysValValLeuValValLeuLeuValSer　　505560　　PheLeuPheLeuSerLeuValAlaGlyPheLeuValTrpHisPheLeu　　65707580　　TyrSerAsnValArgIleGlnLysValPheAsnGlyHisLeuArgVal　　859095　　ThrAsnGluAsnPheLeuAspAlaTyrGluAsnSerAsnSerThrGlu　　100105110　　PheLysAspLeuAlaAsnGlnValLysGluAlaLeu　　115120　　<210>49　　<211>39　　<212>PRT　　<213>灰倉鼠(Cricetulusgriseus)　　<400>49　　MetGlySerAsnArgGlyArgLysAlaGlyGlySerSerLysAspPhe　　151015　　GlyAlaArgLeuLysTyrSerSerGlyLeuGluAsnMetAsnGlyPhe　　202530　　GluGluGlyValGluPheLeu　　35　　<210>50　　<211>52　　<212>PRT　　<213>灰倉鼠(Cricetulusgriseus)　　<400>50　　IleMetProArgLysTrpArgSerGluAlaProGlyAlaValTrpCys　　151015　　LeuTrpSerCysTrpSerValSerSerPheSerHisSerTrpLeuAla　　202530　　SerTrpCysGlyThrSerSerThrGlnMetPheGlySerLysArgSer　　354045　　SerMetValIle　　50　　<210>51　　<211>25　　<212>PRT　　<213>灰倉鼠(Cricetulusgriseus)　　<400>51　　GlySerGlnMetArgThrPheTrpMetProMetArgThrGlnThrPro　　151015　　GlnSerSerLysThrTrpProThrArg　　2025　　<210>52　　<211>39　　<212>PRT　　<213>灰倉鼠(Cricetulusgriseus)　　<400>52　　MetGlySerAsnArgGlyArgLysAlaGlyGlySerSerLysAspPhe　　151015　　GlyAlaArgLeuLysTyrSerSerGlyLeuGluAsnMetAsnGlyPhe　　202530　　GluGluGlyValGluPheLeu　　35　　<210>53　　<211>52　　<212>PRT　　<213>灰倉鼠(Cricetulusgriseus)　　<400>53　　IleMetProArgLysTrpArgSerGluAlaProGlyAlaValTrpCys　　151015　　LeuTrpSerCysTrpSerValSerSerPheSerHisSerTrpLeuAla　　202530　　SerTrpCysGlyThrSerSerThrGlnMetPheGlySerLysArgSer　　354045　　SerMetValIle　　50　　<210>54　　<211>25　　<212>PRT　　<213>灰倉鼠(Cricetulusgriseus)　　<400>54　　GlySerGlnMetArgThrPheTrpMetProMetArgThrGlnThrPro　　151015　　GlnSerSerLysThrTrpProThrArg　　2025　　<210>55　　<211>36　　<212>PRT　　<213>灰倉鼠(Cricetulusgriseus)　　<400>55　　MetGlySerAsnArgGlyArgLysAlaGlyGlySerSerLysAspPhe　　151015　　GlyAlaArgLeuLysTyrSerSerGlyLeuGluAsnMetAsnGlyPhe　　202530　　GluGluGlyGlu　　35　　<210>56　　<211>55　　<212>PRT　　<213>灰倉鼠(Cricetulusgriseus)　　<400>56　　CysGlnGluSerGlyGluAlaArgProProAlaLeuCysGlyAlaCys　　151015　　GlyProAlaGlyGlnPheProLeuSerLeuThrArgGlyTrpLeuPro　　202530　　GlyValAlaLeuProLeuLeuLysCysSerAspProLysGlyLeuGln　　354045　　TrpSerSerGluGlyHisLys　　5055　　<210>57　　<211>6　　<212>PRT　　<213>灰倉鼠(Cricetulusgriseus)　　<400>57　　GluLeuSerGlyCysLeu　　15　　<210>58　　<211>23　　<212>PRT　　<213>灰倉鼠(Cricetulusgriseus)　　<400>58　　GluLeuLysLeuHisArgValGlnArgProGlyGlnProGlyGluGly　　151015　　SerAlaGluAlaValValGln　　20　　<210>59　　<211>37　　<212>PRT　　<213>灰倉鼠(Cricetulusgriseus)　　<400>59　　MetGlySerAsnArgGlyArgLysAlaGlyGlySerSerLysAspPhe　　151015　　GlyAlaArgLeuLysTyrSerSerGlyLeuGluAsnMetAsnGlyPhe　　202530　　GluGluGlyValGlu　　35　　<210>60　　<211>55　　<212>PRT　　<213>灰倉鼠(Cricetulusgriseus)　　<400>60　　CysGlnGluSerGlyGluAlaArgProProAlaLeuCysGlyAlaCys　　151015　　GlyProAlaGlyGlnPheProLeuSerLeuThrArgGlyTrpLeuPro　　202530　　GlyValAlaLeuProLeuLeuLysCysSerAspProLysGlyLeuGln　　354045　　TrpSerSerGluGlyHisLys　　5055　　<210>61　　<211>6　　<212>PRT　　<213>灰倉鼠(Cricetulusgriseus)　　<400>61　　GluLeuSerGlyCysLeu　　15　　<210>62　　<211>23　　<212>PRT　　<213>灰倉鼠(Cricetulusgriseus)　　<400>62　　GluLeuLysLeuHisArgValGlnArgProGlyGlnProGlyGluGly　　151015　　SerAlaGluAlaValValGln　　20　　<210>63　　<211>39　　<212>PRT　　<213>灰倉鼠(Cricetulusgriseus)　　<400>63　　MetGlySerAsnArgGlyArgLysAlaGlyGlySerSerLysAspPhe　　151015　　GlyAlaArgLeuLysTyrSerSerGlyLeuGluAsnMetAsnGlyPhe　　202530　　GluGluGlyValGluCysLeu　　35　　<210>64　　<211>52　　<212>PRT　　<213>灰倉鼠(Cricetulusgriseus)　　<400>64　　IleMetProArgLysTrpArgSerGluAlaProGlyAlaValTrpCys　　151015　　LeuTrpSerCysTrpSerValSerSerPheSerHisSerTrpLeuAla　　202530　　SerTrpCysGlyThrSerSerThrGlnMetPheGlySerLysArgSer　　354045　　SerMetValIle　　50　　<210>65　　<211>25　　<212>PRT　　<213>灰倉鼠(Cricetulusgriseus)　　<400>65　　GlySerGlnMetArgThrPheTrpMetProMetArgThrGlnThrPro　　151015　　GlnSerSerLysThrTrpProThrArg　　2025　　<210>66　　<211>37　　<212>PRT　　<213>灰倉鼠(Cricetulusgriseus)　　<400>66　　MetGlySerAsnArgGlyArgLysAlaGlyGlySerSerLysAspPhe　　151015　　GlyAlaArgLeuLysTyrSerSerGlyLeuGluAsnMetAsnGlyPhe　　202530　　GluGluGlyValGlu　　35　　<210>67　　<211>55　　<212>PRT　　<213>灰倉鼠(Cricetulusgriseus)　　<400>67　　CysGlnGluSerGlyGluAlaArgProProAlaLeuCysGlyAlaCys　　151015　　GlyProAlaGlyGlnPheProLeuSerLeuThrArgGlyTrpLeuPro　　202530　　GlyValAlaLeuProLeuLeuLysCysSerAspProLysGlyLeuGln　　354045　　TrpSerSerGluGlyHisLys　　5055　　<210>68　　<211>6　　<212>PRT　　<213>灰倉鼠(Cricetulusgriseus)　　<400>68　　GluLeuSerGlyCysLeu　　15　　<210>69　　<211>23　　<212>PRT　　<213>灰倉鼠(Cricetulusgriseus)　　<400>69　　GluLeuLysLeuHisArgValGlnArgProGlyGlnProGlyGluGly　　151015　　SerAlaGluAlaValValGln　　20當(dāng)前第1頁1 2 3