本發(fā)明涉及三種基于整合素β亞基胞內(nèi)保守序列的多肽化合物及其效應(yīng)分子能夠有效地在體內(nèi)體外阻斷新生血管形成并具有抑制小鼠皮下實(shí)體瘤生長(zhǎng)的作用。

背景技術(shù)：

整合素是位于細(xì)胞表面的一類(lèi)重要的細(xì)胞黏附分子，由α和β兩個(gè)亞基通過(guò)非共價(jià)鍵連接而成的跨模異二聚體糖蛋白受體。整合素在人體內(nèi)分布廣泛，幾乎所有不同組織的細(xì)胞上都表達(dá)有一種或幾種整合素分子。在脊椎動(dòng)物中，目前發(fā)現(xiàn)有18個(gè)α及8個(gè)β亞基，α亞基和β亞基的不同組合共形成24個(gè)α/β整合素異二聚體。整合素與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，其通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的分化、黏附、遷移及存活，參與新生血管的形成和血管網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建。腫瘤血管生成離不開(kāi)血管內(nèi)皮細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)黏附，并借此侵入血管周?chē)g質(zhì)，然后通過(guò)細(xì)胞-細(xì)胞的黏附作用促進(jìn)血管條索的形成。作為內(nèi)皮細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)(ecm)連接的橋梁，血管內(nèi)皮細(xì)胞中的整合素在腫瘤新生血管形成中起重要的作用。

整合素αvβ3是目前研究較為深入的整合素家族成員,并參與腫瘤新生血管形成。其在休眠的內(nèi)皮細(xì)胞中低表達(dá)，但在多種腫瘤細(xì)胞及腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)量明顯增加。研究顯示，通過(guò)胞外抑制αvβ3的功能，可誘導(dǎo)新生血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤新生血管的形成，促使腫瘤細(xì)胞凋亡，達(dá)到抗腫瘤的目的，而這個(gè)過(guò)程并不會(huì)對(duì)正常組織的血管造成不良影響。因此，整合素αvβ3成為理想的抑制腫瘤及腫瘤血管生成的靶點(diǎn)。

以阻斷整合素與其胞外配基結(jié)合為靶點(diǎn)的抗腫瘤新生血管形成藥物主要分為以下幾類(lèi)：(1)整合素抗體類(lèi)藥物；(2)含有與整合素有高親和力結(jié)合序列的多肽類(lèi)小分子化合物，其中以含rgd序列(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)的小分子多肽最為典型；(3)整合素為靶點(diǎn)的其他類(lèi)藥物等。其中一部分藥物已顯露出良好的抗血管新生和抗腫瘤作用，并已進(jìn)入臨床研究關(guān)鍵階段(例如，抗體類(lèi)vitaxin[1,2]，多肽類(lèi)cilengitide[3-5])。

通過(guò)阻斷整合素信號(hào)通路抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展，因研究領(lǐng)域內(nèi)一些不一致的研究數(shù)據(jù)，尚存爭(zhēng)議。例如，β3型整合素缺失的小鼠反而促進(jìn)體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)[6]；還有，低濃度的整合素抑制劑rgd擬肽cilengitide對(duì)小鼠體內(nèi)血管新生和腫瘤生長(zhǎng)反而具有促進(jìn)作用[7,8]。另外，來(lái)自于emd/merck公司研究開(kāi)發(fā)的cilengitide是基于阻斷整合素αvβ3和αvβ5胞外配體結(jié)合位點(diǎn)開(kāi)發(fā)的新型治療惡性膠質(zhì)瘤的藥物，但經(jīng)大規(guī)模臨床試驗(yàn)后并未達(dá)到預(yù)期效果[9]。這些發(fā)現(xiàn)增加了以整合素－配基結(jié)合為靶點(diǎn)藥物的功能不確定性。

整合素可介導(dǎo)雙向信號(hào)傳導(dǎo)，并且整合素與胞外配基的結(jié)合受到整合素胞內(nèi)序列的精確調(diào)控。整合素α/β亞基胞內(nèi)序列較短(除β4外)，自身也不具有酶活性，但其在整合素雙向信號(hào)傳導(dǎo)中起著重要作用，尤其是β亞基(β4和β8除外)胞內(nèi)的保守序列，如兩個(gè)nxxy/f區(qū)域[10]，它們可分別識(shí)別結(jié)合多種胞內(nèi)信號(hào)和細(xì)胞骨架蛋白分子。比如，talin可與β亞基胞內(nèi)段近膜區(qū)npxy序列結(jié)合，是整合素激活的關(guān)鍵調(diào)控因子；另外kindlin蛋白家族分子可與整合素β亞基胞內(nèi)區(qū)遠(yuǎn)膜端nxxy/f相互結(jié)合，并協(xié)同talin誘導(dǎo)整合素的激活[11-13]。此外，研究還發(fā)現(xiàn)整合素β3亞基胞內(nèi)遠(yuǎn)膜端nxxy序列(nity)還能夠識(shí)別結(jié)合β3-endonexin。

kindlin家族包含3個(gè)家族成員，分別是kindlin-1，kindlin-2和kindlin-3。它們?cè)诩せ钫纤刂邪l(fā)揮重要作用，在不同的細(xì)胞中參與整合素介導(dǎo)的細(xì)胞遷移、黏附等多項(xiàng)生物學(xué)功能。kindlin蛋白表達(dá)異常還可以導(dǎo)致多種遺傳疾病的發(fā)生，在相關(guān)人類(lèi)疾病和試驗(yàn)小鼠模型中都得到驗(yàn)證[14]。β3-endonexin是一個(gè)含111個(gè)氨基酸的多肽，已知是β3型整合素胞內(nèi)序列的結(jié)合因子，但并不與β1、β2型整合素胞內(nèi)序列結(jié)合[15,16]。目前，β3-endonexin是否參與β3型整合素的激活調(diào)控尚不明確。kindlin與β3-endonexin均在血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)[17-21]。

我們的前期研究發(fā)現(xiàn)kindlin-2參與整合素αvβ3介導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附與遷移，并且在斑馬魚(yú)與小鼠體中具有促進(jìn)新生血管形成的功能[17,20]。有一項(xiàng)研究表明，低氧條件下β3-endonexin通過(guò)hif途徑起到抑制血管新生的作用，過(guò)量表達(dá)β3-endonexin可降低低氧誘導(dǎo)的hif-1αmrna水平，抑制了hif的激活，進(jìn)而抑制內(nèi)皮細(xì)胞形成新生血管的過(guò)程[22]。因?yàn)閗indlin-2與β3-endonexin都參與調(diào)控血管新生且均與β整合素c末端nxxy序列結(jié)合，所以我們推測(cè)包含整合素β胞內(nèi)段c末端nxxy序列的多肽化合物可能具有調(diào)控新生血管形成的功能。據(jù)此，我們?cè)O(shè)計(jì)了6種含有不同整合素β亞基胞內(nèi)保守序列的衍生穿膜多肽化合物(mβctps)，每一種都包含一個(gè)整合素β亞基c末端的nxxy/f序列，并評(píng)估了其在體內(nèi)和體外抗血管形成的能力，最終發(fā)現(xiàn)了有些整合素β亞基胞內(nèi)功能序列可通過(guò)與β3-endonexin相互作用而抑制新生血管形成，從而揭示了開(kāi)發(fā)新一代抗新生血管形成的新型靶位點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一在于提供了基于整合素β亞基胞內(nèi)保守區(qū)域的功能多肽化合物氨基酸序列。

本發(fā)明的目的之二在于提供多肽衍生化合物(mβ3ctp，mβ5ctp，mβ6ctp)能夠抑制體外人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞形成血管狀結(jié)構(gòu)；抑制裸鼠皮下接種基質(zhì)膠中血管的生成；并對(duì)裸鼠皮下接種實(shí)體瘤的生長(zhǎng)有不同程度的抑制作用。并且，功能試驗(yàn)揭示這些具有抗新生血管形成功能的整合素β亞基胞內(nèi)段序列可通過(guò)結(jié)合效應(yīng)蛋白因子β3-endonexin而發(fā)揮作用。

為闡明上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

三種基于整合素β亞基胞內(nèi)保守序列的多肽化合物，其特征在于該多肽化合物為有seqidno:1、seqidno:2或seqidno:3所示的氨基酸序列。

上述的基于整合素β亞基胞內(nèi)保守序列的多肽化合物在制備抗新生血管形成藥物中的應(yīng)用。

上述的基于整合素β亞基胞內(nèi)保守序列的多肽化合物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的這三種小分子多肽化合物可以通過(guò)結(jié)合共同的效應(yīng)信號(hào)蛋白分子來(lái)阻斷新生血管的形成。其在偶聯(lián)具有穿膜功能多肽后具有抑制實(shí)驗(yàn)小鼠體內(nèi)實(shí)體腫瘤生長(zhǎng)的作用，屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明基于功能小分子多肽化合物及其效應(yīng)蛋白分子能夠抑制體外人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞形成血管狀結(jié)構(gòu)，抑制裸鼠皮下接種基質(zhì)膠中血管的生成，和抑制裸鼠皮下接種實(shí)體瘤的生長(zhǎng)。我們的研究發(fā)現(xiàn)不僅提供了多種具有阻抗新生血管形成作用的先導(dǎo)化合物，而且還揭示了一個(gè)調(diào)控新生血管形成的新機(jī)制，從而為開(kāi)發(fā)新一代抗新生血管形成和抗腫瘤藥物提供新的靶位點(diǎn)。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明中小分子多肽化合物mβctp系列的氨基酸序列和組成以及mβctp系列選擇性地抑制臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(huvec)體外形成血管樣小管效果對(duì)比圖。(a)mβctp由兩部分組成：一是穿膜多肽(cpp)，為具有11個(gè)氨基酸的序列，可以介導(dǎo)與之偶聯(lián)的目的多肽分子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)；二是目的多肽(βctp)，為來(lái)自不同整合素β亞基胞內(nèi)保守序列的多肽，其自身不具有穿膜功能。因此，mβctp系列多肽是穿膜多肽與目的多肽的偶聯(lián)復(fù)合物，可穿越細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮功能。(b)被fitc熒光標(biāo)記后的mβ3ctp與huvec孵育后可檢測(cè)到其具有穿膜的能力。(c-d)檢測(cè)mβctp系列多肽抑制臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(huvec)體外形成血管樣小管的能力。

圖2為本發(fā)明中小分子多肽化合物mβctp系列抑制皮下種植基質(zhì)膠(matrigel)團(tuán)塊中血管形成的能力。(a)不同mβctp分別與液態(tài)基質(zhì)膠混合后注射到小鼠皮下，基質(zhì)膠在小鼠體內(nèi)迅速固化并誘導(dǎo)新生血管的形成。7天后取出固態(tài)基質(zhì)膠塊觀(guān)察血管形成的情況。(b)組織化學(xué)染色(he)觀(guān)察基質(zhì)膠內(nèi)形成的血管。(c)測(cè)定基質(zhì)膠內(nèi)的血紅蛋白量。

圖3為本發(fā)明中小分子多肽化合物mβctp抑制裸鼠皮下實(shí)體瘤的生長(zhǎng)及免疫組織化學(xué)分析腫瘤內(nèi)血管分布情況。(a)小鼠皮下植瘤后分別用不同的mβctp處理并觀(guān)察其對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響。(b-c)取出小鼠內(nèi)瘤體并進(jìn)行組化觀(guān)察(cd31+)瘤內(nèi)血管的形成情況和數(shù)量。

圖4為本發(fā)明中鑒定mβ3ctp中目的多肽(β3ctp)的功能核心序列。(a)從β3ctp兩端分別進(jìn)行氨基酸序列的刪減，構(gòu)建含有不同氨基酸序列的mβ3ctp衍生多肽化合物。(b－c)huvec細(xì)胞種植在已鋪好基質(zhì)膠的24孔板中，并與(a)中所示多種mβ3ctp衍生多肽化合物(20μm)共孵育后觀(guān)察形成血管管道樣結(jié)構(gòu)的能力。

圖5為本發(fā)明中整合素β亞基胞內(nèi)序列以及功能mβctp多肽化合物與β3-endonexin和kindlin-2相互作用的情況。(a)利用純化的帶有g(shù)st標(biāo)簽的整合素β亞基胞內(nèi)序列與表達(dá)有外源egfp-β3-endonexin和內(nèi)源kindlin-2的huvec細(xì)胞裂解液孵育，并測(cè)定不同β亞基胞內(nèi)序列與egfp-β3-endonexin和kindlin-2的結(jié)合能力。(b)利用酵母雙雜交系統(tǒng)測(cè)定不同整合素β亞基胞內(nèi)序列與β3-endonexin和kindlin-2的結(jié)合能力。(c)利用競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)測(cè)定功能mβ3ctp和mβ5ctp與β3-endonexin的直接結(jié)合作用。

圖6為本發(fā)明中β3-endonexin調(diào)控臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞血管管道樣結(jié)構(gòu)形成并且促進(jìn)小鼠皮下實(shí)體腫瘤生長(zhǎng)的情況。(a-c)利用兩種特異性sirna分別下調(diào)huvec中內(nèi)源性β3-endonexin的表達(dá)并檢測(cè)其對(duì)huvec形成血管樣小管結(jié)構(gòu)的影響。(d-f)利用慢病毒表達(dá)系統(tǒng)上調(diào)huvec中β3-endonexin的表達(dá)并檢測(cè)其對(duì)huvec形成血管樣小管結(jié)構(gòu)的影響。(g-h)分別用可表達(dá)egfp-β3-endonexin和對(duì)照egfp的慢病毒局部注射小鼠體內(nèi)腫瘤并觀(guān)察其對(duì)小鼠體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的影響。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例一：合成并純化mβctp系列多肽分子

含有目標(biāo)多肽的mβctp系列衍生多肽分子命名和氨基酸序列參見(jiàn)圖1(a)。該系列多肽合成于公司，采用手動(dòng)固相fmoc法，以fmoc-gly-wang樹(shù)脂為起始原料，從c端向n端方向合成。純化采用hp1100型(美國(guó)安捷倫公司)反相高效液相色譜儀，其純度達(dá)99.62％。該方法為小分子多肽常規(guī)合成方法。

實(shí)施例二：臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(huvec)血管樣管道形成實(shí)驗(yàn)研究mβctp系列多肽對(duì)新生血管形成的作用:

參見(jiàn)圖1，體外培養(yǎng)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(huvec)在含生長(zhǎng)因子的基底膜基質(zhì)膠上能自行組裝成類(lèi)似血管的管道樣結(jié)構(gòu)。在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入不同的mβctp(終濃度20μm)，觀(guān)察其抑制huvec細(xì)胞組裝管道的能力。參見(jiàn)圖1(c-d)，結(jié)果顯示，與無(wú)藥處理組相比較，添加衍生多肽mβ3ctp、mβ5ctp、mβ6ctp能夠有效地抑制管道的形成，說(shuō)明這些多肽對(duì)huvec細(xì)胞體外形成血管樣管道結(jié)構(gòu)有顯著的抑制作用。同時(shí)該實(shí)驗(yàn)結(jié)果也說(shuō)明該抑制功能來(lái)自相應(yīng)的整合素β胞內(nèi)序列(βctp)而不是所偶聯(lián)的穿膜多肽(cpp)，因?yàn)橥瑯泳哂衏pp序列的mβ1ctp、mβ2ctp、mβ7ctp對(duì)huvec細(xì)胞形成管道樣結(jié)構(gòu)并無(wú)明顯影響。同時(shí)，沒(méi)有偶聯(lián)穿膜多肽的βctp并不具有抑制功能，說(shuō)明它們是在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用的。

圖1：mβctp系列多肽選擇性地抑制臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(huvec)血管管道樣結(jié)構(gòu)的形成。(a)mβctp系列多肽包含兩部分：一是穿膜多肽(cpp)；二是目標(biāo)多肽，包含整合素β亞基胞內(nèi)含c末端nxxy/f的序列(βctp)。βctp自身不具有穿膜能力,其與穿膜多肽cpp偶聯(lián)后可穿越細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮功能。(b)n端標(biāo)記熒光素fitc的mβ3ctp與huvec共孵育，其穿膜特性通過(guò)熒光顯微鏡觀(guān)察。(c)huvec鋪在基質(zhì)膠上，分別添加mβctp系列多肽藥物(20μm)；不添加組為對(duì)照。孵育12h后倒置顯微鏡下觀(guān)察(5倍物鏡)血管管道樣結(jié)構(gòu)的形成情況。(d)對(duì)形成管道樣結(jié)構(gòu)的數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±sd)表示，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立樣本均值采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，p﹤0.01(**)說(shuō)明數(shù)據(jù)在統(tǒng)計(jì)學(xué)分析中有顯著差異。

實(shí)施例三：小鼠體內(nèi)基底膜基質(zhì)中血管形成實(shí)驗(yàn)：

參見(jiàn)圖2，實(shí)驗(yàn)材料為裸鼠(balb/c)，6周齡，雄性(每組7只裸鼠)，基底膜基質(zhì)膠(matrigel)。先將基底膜基質(zhì)膠放在冰上融化為液態(tài)后，加入600ng/mlbfgf和100u/mlheparin以及不同的mβctp多肽(50μm)。然后在裸鼠皮下注射500μl的基底膜基質(zhì)膠混合物?；啄せ|(zhì)膠進(jìn)入小鼠體內(nèi)迅速固態(tài)化并誘導(dǎo)新生血管的生長(zhǎng)，歷時(shí)7天后，將固態(tài)matrigel塊小心從小鼠皮下剝離取出，測(cè)定基底膜基質(zhì)膠中血紅蛋白的含量；同時(shí)對(duì)固定后的基底膜基質(zhì)膠進(jìn)行組織化學(xué)分析(he染色)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)相同重量的基質(zhì)中，mβ3ctp、mβ5ctp、mβ6ctp處理組相對(duì)于無(wú)藥對(duì)照組所含血紅蛋白含量明顯降低。并且，mβ3ctp和mβ5ctp處理組的新生血管數(shù)量比無(wú)藥處理的對(duì)照組顯著減少。同時(shí)該實(shí)驗(yàn)結(jié)果也說(shuō)明具有抑制功能的mβctp多肽中的效應(yīng)序列來(lái)自相應(yīng)的整合素β胞內(nèi)序列(βctp)而不是所偶聯(lián)的穿膜多肽(cpp)，因?yàn)橥瑯泳哂衏pp序列的mβ1ctp、mβ2ctp、mβ7ctp對(duì)基質(zhì)膠內(nèi)血管的形成無(wú)明顯影響。

圖2：小鼠皮下種植基質(zhì)膠實(shí)驗(yàn)檢測(cè)mβctp系列多肽化合物抑制血管形成的能力。(a)裸鼠皮下注射基質(zhì)膠matrigel(500μl)(含600ng/mlbfgf和100u/mlheparin)，并同時(shí)添加mβctp(50μm)系列多肽藥物；不加藥組作為對(duì)照。膠塊于7天后小心取出并拍照。(b)固定后的基質(zhì)膠matrigel石蠟包埋后經(jīng)he染色并顯微觀(guān)察。染深紅色部分為血管(紅細(xì)胞)，淺粉色背景為基質(zhì)膠matrigel染色。(c)matrigel樣品中血紅蛋白總含量的測(cè)定，統(tǒng)計(jì)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±sd)表示，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立樣本均值采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，p﹤0.05(*)或p﹤0.01(**)說(shuō)明數(shù)據(jù)在統(tǒng)計(jì)學(xué)分析中有顯著差異。

實(shí)施例四：功能mβctp多肽對(duì)小鼠實(shí)體瘤生長(zhǎng)的作用：

參見(jiàn)圖3(a)，實(shí)驗(yàn)材料為裸鼠(balb/c)，6周齡，雄性，隨機(jī)分成2組，對(duì)照組以及mβctp治療組(每組6只)。每只皮下注射小鼠前列腺癌細(xì)胞rm1(1.2x10⁶/只)，并添加1％基質(zhì)膠。荷瘤5天后，治療組隔天皮下局部注射功能mβctp(50μm；100μlpbs溶液)；對(duì)照組皮下注射等量pbs緩沖液，同時(shí)測(cè)量小鼠腫瘤大小(v)(v＝l×w×0.52；其中l(wèi)為腫瘤測(cè)量長(zhǎng)度，w為腫瘤測(cè)量寬度)。由圖3(a)可以看出，相對(duì)于對(duì)照組，mβ3ctp、mβ5ctp處理組的腫瘤體積明顯較?。欢鴐β6ctp處理組對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)無(wú)明顯影響。這種區(qū)別可能是因?yàn)槟康亩嚯呐c其胞內(nèi)效應(yīng)蛋白分子的結(jié)合強(qiáng)弱造成的(見(jiàn)后面實(shí)例)。

圖3(a)：mβ3ctp，mβ5ctp及mβ6ctp抑制裸鼠體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的情況。(a)裸鼠皮下注射rm1細(xì)胞，隔天皮下局部分別給藥mβ3ctp、mβ5ctp以及mβ6ctp(50μm)；不加藥組作為對(duì)照。記錄腫瘤長(zhǎng)(l)與寬(w)，并計(jì)算體積v(v＝l*w*w*0.52)并繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線(xiàn)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±sd)表示，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立樣本均值采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，p﹤0.01(**)說(shuō)明數(shù)據(jù)在統(tǒng)計(jì)學(xué)分析中有顯著差異。

實(shí)施例五：利用免疫組織化學(xué)分析腫瘤組樣，研究mβctp對(duì)實(shí)體瘤內(nèi)血管的形成的影響：

參見(jiàn)圖3(b-c)，小鼠前列腺癌rm-1細(xì)胞接種裸鼠，經(jīng)不同治療后20天后取出形成的腫瘤，經(jīng)pbs清洗，中性甲醛固定，然后制做石蠟切片并進(jìn)行cd31免疫組化檢測(cè)。處理后的組樣用顯微觀(guān)察各組樣本血管腔形成情況。無(wú)藥物處理的對(duì)照組腫瘤組織內(nèi)有明顯的血管生成，并且多數(shù)已經(jīng)形成完整的血管管道樣結(jié)構(gòu)；雖然mβ3ctp和mβ5ctp(圖3，b)給藥組的腫瘤組織經(jīng)免疫組化有cd31陽(yáng)性細(xì)胞，但形成的血管數(shù)目明顯減少，且形成的血管管道不規(guī)整，其血管大小及形態(tài)與對(duì)照組相比有顯著差異。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明mβ3ctp和mβ5ctp對(duì)腫瘤內(nèi)新生血管的形成有著顯著的抑制作用，具有抑制固體腫瘤生長(zhǎng)的作用。相比較而言，mβ6ctp對(duì)腫瘤內(nèi)血管形成的抑制作用較弱。

圖3(b-c)：mβ3ctp，mβ5ctp及mβ6ctp抑制裸鼠體內(nèi)腫瘤血管形成的情況。(b)裸鼠皮下注射rm1細(xì)胞，隔天皮下局部分別給藥mβ3ctp、mβ5ctp以及mβ6ctp(50μm)；不加藥組作為對(duì)照。實(shí)體瘤取出后組化切片并進(jìn)行cd31免疫染色(褐色部分)(c)各組腫瘤組織內(nèi)形成的血管數(shù)量統(tǒng)計(jì)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±sd)表示，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立樣本均值采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，p﹤0.01(**)說(shuō)明數(shù)據(jù)在統(tǒng)計(jì)學(xué)分析中有顯著差異。

實(shí)施例六：鑒定mβ3ctp目的多肽中的核心功能序列：

參見(jiàn)圖4，對(duì)功能多肽mβ3ctp中來(lái)自整合素β3胞內(nèi)序列的目標(biāo)多肽(βctp)中的氨基酸的序列分別從n-端和c-端進(jìn)行截短并合成相應(yīng)的衍生多肽見(jiàn)圖4(a)，然后用臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(huvec)血管樣管道形成實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證這些衍生多肽抗新生血管形成的能力。結(jié)果顯示，mβ3ctp目標(biāo)多肽中的nity序列及其n-端的至少2個(gè)氨基酸殘基形成功能核心序列。

圖-4：mβ3ctp中目的多肽內(nèi)功能核心序列的鑒定。(a)從β3ctp兩端分別進(jìn)行氨基酸序列的刪減，構(gòu)建含有不同氨基酸序列的mβ3ctp衍生多肽化合物。(b-c)huvec細(xì)胞種植在已鋪好基質(zhì)膠的24孔板中，并與(a)中所示多種mβ3ctp衍生多肽化合物(20μm)共孵育；不添加多肽組為對(duì)照。倒置顯微鏡下觀(guān)察(5倍物鏡)拍照，并對(duì)形成的管道樣結(jié)構(gòu)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±sd)表示，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立樣本均值采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，p﹤0.01(**)說(shuō)明數(shù)據(jù)在統(tǒng)計(jì)學(xué)分析中有顯著差異。

實(shí)施例七：利用pulldown試驗(yàn)和酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)研究整合素β亞基胞內(nèi)序列以及功能mβctp多肽與β3-endonexin和kindin-2結(jié)合的情況：

參見(jiàn)圖5，首先，用pulldown鑒定整合素β亞基的胞內(nèi)序列與β3-endonexin和kindin-2的相互作用。huvec細(xì)胞表達(dá)的外源efgp-β3-endonexin及內(nèi)源kindlin-2分別與結(jié)合在介質(zhì)上gst融合的整合素β亞基的胞內(nèi)序列孵育。洗脫掉非特異性結(jié)合蛋白后，用westernblot實(shí)驗(yàn)鑒定結(jié)合上去的efgp-β3-endonexin及kindlin-2。圖5(a)中結(jié)果顯示，β3-endonexin與整合素β3，β5和β6的胞內(nèi)多肽序列結(jié)合，但其中與β6的胞內(nèi)多肽序列結(jié)合較弱。相比較，另一個(gè)胞內(nèi)整合素結(jié)合蛋白kindlin-2與β1，β3和β7的胞內(nèi)多肽序列結(jié)合。由此，β3-endonexin和kindlin-2結(jié)合整合素β亞基的胞內(nèi)序列具有不同的選擇性。然后，用酵母雙雜交系統(tǒng)(matchermarker^tmgold)進(jìn)一步鑒定整合素β亞基的胞內(nèi)序列與β3-endonexin及kindlin-2的相互作用。β3-endonexin及kindlin-2克隆在pgbdt7載體上，構(gòu)建bd(dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域)融合蛋白；同時(shí)，β亞基的胞內(nèi)段序列克隆在pgadt7載體上，構(gòu)建ad(轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域)融合蛋白。如果兩種蛋白具有相互作用，就可以形成有功能的轉(zhuǎn)錄因子(ad-bd)，并激活下游報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致酵母菌株可以在選擇培養(yǎng)基(sd-3)上生長(zhǎng)。如圖5b所示，酵母雙雜交的檢測(cè)結(jié)果與pulldown實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。最后，我們用競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了mβ3ctp與mβ5ctp可與β3-endonexin特異性結(jié)合，見(jiàn)圖5(c)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明功能mβctp多肽對(duì)新生血管和腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用很可能是通過(guò)結(jié)合效應(yīng)信號(hào)蛋白分子β3-endonexin來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

圖-5：整合素β亞基的胞內(nèi)段與β3-endonexin和kindin-2相互作用的檢測(cè)。(a)pulldown實(shí)驗(yàn)：huvec細(xì)胞表達(dá)的efgp-β3-endonexin及kindlin-2分別與結(jié)合在介質(zhì)上gst融合的整合素β亞基的胞內(nèi)序列孵育。洗脫掉非特異性結(jié)合蛋白后，用westernblot實(shí)驗(yàn)鑒定結(jié)合上去的efgp-β3-endonexin及kindlin-2。(b)酵母雙雜交系統(tǒng)(matchermarker^tmgoldyeasttwo-hybridsystem)進(jìn)一步鑒定整合素β亞基的胞內(nèi)序列與β3-endonexin及kindlin-2的相互作用。β3-endonexin及kindlin-2克隆在pgbdt7載體上，構(gòu)建bd(dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域)融合蛋白；同時(shí)，β亞基的胞內(nèi)段序列克隆在pgadt7載體上，構(gòu)建ad(轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域)融合蛋白。如果兩種蛋白具有相互作用，就可以形成有功能的轉(zhuǎn)錄因子(ad-bd)，并激活下游報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致酵母菌株可以在選擇培養(yǎng)基上(sd-3)生長(zhǎng)。(c)mβ3ctp與mβ5ctp能夠與整合素β亞基的胞內(nèi)段競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合efgp-β3-endonexin。huvec細(xì)胞表達(dá)的efgp-β3-endonexin與結(jié)合在介質(zhì)上的gst融合的整合素β3亞基的胞內(nèi)序列孵育，同時(shí)分別加入20μm的mβ3ctp與mβ5ctp。洗脫掉非特異性結(jié)合蛋白后，用westernblot實(shí)驗(yàn)鑒定結(jié)合上去的efgp-β3-endonexin。

實(shí)施例八：β3-endonexin可調(diào)控huvec細(xì)胞血管管道樣結(jié)構(gòu)的形成以及腫瘤的生長(zhǎng)：

參見(jiàn)圖6，我們通過(guò)向huvec細(xì)胞轉(zhuǎn)染靶向β3-endonexin的sirna(001、002)來(lái)沉默內(nèi)源性β3-endonexin的表達(dá)；同時(shí)用非靶向性sicontrol作為對(duì)照，結(jié)果顯示下調(diào)內(nèi)源β3-endonexin表達(dá)后huvec形成血管樣結(jié)構(gòu)的能力明顯變差(見(jiàn)圖6，a-c)。進(jìn)而，我們用慢病毒表達(dá)系統(tǒng)在huvec細(xì)胞中過(guò)表達(dá)egfp-β3-endonexin，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)egfp-β3-endonexin后huvec形成血管管道樣結(jié)構(gòu)的能力明顯增強(qiáng)(見(jiàn)圖6，d-f)。最后，我們對(duì)小鼠皮下實(shí)體瘤分別注射含有可表達(dá)egfp-β3-endonexin和對(duì)照egfp的慢病毒，發(fā)現(xiàn)高表達(dá)egfp-β3-endonexin可顯著促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明β3-endonexin很可能是一種新生血管形成和腫瘤生長(zhǎng)的促進(jìn)因子。結(jié)合前面mβctp的功能以及其與β3-endonexin的結(jié)合能力，我們推斷功能多肽mβctp的抗新生血管形成和抗腫瘤生長(zhǎng)作用很可能是通過(guò)結(jié)合并阻斷β3-endonexin的功能來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

圖-6：β3-endonexin可促進(jìn)huvec細(xì)胞血管管道樣結(jié)構(gòu)的形成和體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)。(a)huvec細(xì)胞轉(zhuǎn)染靶向β3-endonexin的sirna(001、002)來(lái)沉默內(nèi)源性β3-endonexin的表達(dá)；同時(shí)用非靶向性sicontrol作為對(duì)照。轉(zhuǎn)染sirna后48h收集細(xì)胞，并通過(guò)qrt-pcr檢測(cè)huvec細(xì)胞中β3-endonexin的mrna表達(dá)水平。(b-c)轉(zhuǎn)染sirna后，收集huvec細(xì)胞進(jìn)行血管管道樣結(jié)構(gòu)形成實(shí)驗(yàn)，并對(duì)形成管道樣結(jié)構(gòu)的數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。(d)在huvec細(xì)胞中通過(guò)慢病毒系統(tǒng)感染表達(dá)外源egfp和egfp-β3-endonexin。48h后，收集感染后的huvec細(xì)胞，并通過(guò)westernblot實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)egfp表達(dá)水平。(e&f)表達(dá)egfp和egfp-β3-endonexin的huvec細(xì)胞形成血管管道樣結(jié)構(gòu)，并統(tǒng)計(jì)管道數(shù)量。(g&h)實(shí)驗(yàn)材料為裸鼠(balb/c)，6周齡，雄性，隨機(jī)分成2組，每組5只，每只皮下注射小鼠前列腺癌細(xì)胞rm1(1.2x10⁶/只)。從第5天起兩組分別注射分別表達(dá)egfp以及egfp-β3-endonexin的慢病毒(滴度＝2x10⁷iu/ml，一周注射2次，每次注射100μl/只)。15天后，取出腫瘤并測(cè)量。統(tǒng)計(jì)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±sd)表示，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立樣本均值采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，p﹤0.01(**)說(shuō)明數(shù)據(jù)在統(tǒng)計(jì)學(xué)分析中有顯著差異。

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<110>上海大學(xué)

<120>整合素胞內(nèi)多肽序列在抑制新生血管形成中的應(yīng)用

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