本發(fā)明屬于生物制劑領(lǐng)域，涉及一種促生長(zhǎng)、增強(qiáng)免疫作用的促生長(zhǎng)復(fù)合多肽及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：生長(zhǎng)激素（growthhormone，gh）是動(dòng)物自身垂體合成分泌的具有種屬特異性的單鏈多肽類激素，廣泛存在于脊椎動(dòng)物中，通過(guò)促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，加速脂肪代謝，間接刺激骨的生長(zhǎng)等促進(jìn)機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育。gh的分泌受其他生長(zhǎng)因子以自分泌或旁分泌方式相互作用，共同調(diào)節(jié)。在這些生長(zhǎng)因子中g(shù)h釋放激素（ghrh）、gh釋放抑制激素（ghrih）和生長(zhǎng)激素釋放肽（ghrelin）起主要調(diào)節(jié)作用，其中g(shù)hrelin和ghrh對(duì)促進(jìn)下丘腦相關(guān)區(qū)域活動(dòng)有協(xié)同作用，都能夠刺激機(jī)體釋放生長(zhǎng)激素。ghrelin的發(fā)現(xiàn)是一個(gè)逆向的過(guò)程。首先報(bào)道的化學(xué)合成，是1982年由bowers等合成的生長(zhǎng)激素釋放肽-6（ghrps-6）。1993年smith等在ghrps-6的基礎(chǔ)上合成出生長(zhǎng)激素促分泌激素（ghss）。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，1996年howard等克隆生長(zhǎng)激素促分泌激素相應(yīng)受體（growthhormonesecretagogues，ghs-r）cdna，證明ghs-r在人、豬、牛、大鼠中高度保守。1999年kojima等通過(guò)對(duì)大鼠不同內(nèi)臟器官提取物檢測(cè)，從胃組織中得到最高活性的促生長(zhǎng)激素分泌激素并純化出由28個(gè)氨基酸殘基組成具有相同活性的多肽，命名為ghrelin（ghre為原歐語(yǔ)，是生長(zhǎng)的意思）。研究發(fā)現(xiàn)人和大鼠的ghrelin前體蛋白共117個(gè)氨基酸殘基，n端的前23肽為分泌信號(hào)肽；ghrelin最小活性中心由n端前4個(gè)氨基酸片段組成，c末端的p-r（脯氨酸-精氨酸）結(jié)構(gòu)為其識(shí)別部位。ghrelin具有內(nèi)源性活性位點(diǎn)的是第三個(gè)氨基酸殘基，因該氨基酸羧基被辛酰酯化，最初的研究表明辛酰酯化是ghrelin相關(guān)活性必需結(jié)構(gòu)，但并非是唯一的，其他類型的酰酯化也有相應(yīng)的功能。人和大鼠ghrelin第11和第12位氨基酸不同，具有89%的同源性。隨著研究深入，有報(bào)道表明人類血液中非辛酰酯化的ghrelin量遠(yuǎn)大于辛酰酯化的ghrelin量，非辛酰酯化的ghrelin同樣具有內(nèi)分泌功能，可以促進(jìn)細(xì)胞增殖。在ghrps-6氨基酸序列中第二個(gè)氨基酸t(yī)rp和第五個(gè)氨基酸phe均為d型氨基酸，即d-trp和d-phe，具有生物活性?，F(xiàn)在應(yīng)用的類似ghrps-6合成肽還有六肽生長(zhǎng)激素釋放肽-2（ghrps-2），七肽生長(zhǎng)激素釋放肽-1（ghrps-1）和d-2-methyltrp取代了d-trp的衍生物hexa。已知四種ghrps氨基酸序列如下：ghrps-1:ala-his-d-betanal-ala-trp-d-phe-lys-nh2ghrps-2:d-ala-d-betanal-ala-trp-d-phe-lys-nh2ghrps-6:his-d-trp-ala-trp-d-phe-lys-nh2hexa:his-d-2-methyltrp-ala-trp-d-phe-lys-nh2smith等認(rèn)為這類肽中芳香族氨基酸如trp，d-phe和末端ala，his是肽活性重要組成部分。walker等通過(guò)ghrps-6po非腸道給藥和十二指腸內(nèi)給藥方式，通過(guò)比較對(duì)猴子、狗和大鼠體內(nèi)生長(zhǎng)激素（gh）釋放活性的影響，表明ghrps-6進(jìn)入腸道可促進(jìn)gh釋放，即ghrps-6有望作為一種代替非腸道給藥的藥物使用。比較這四種肽，發(fā)現(xiàn)都有ala-trp-d-phe-lys-nh2結(jié)構(gòu)。將合成肽共有部分（awfk）整合到ghrelin序列中，取代ghrelin序列第10位到第13位的氨基酸，得到一種新的具有促生長(zhǎng)作用的多肽。釀酒酵母（saccharomycesserevisiae），是一種單細(xì)胞真核生物，長(zhǎng)期應(yīng)用在食品工業(yè)，最早的應(yīng)用可追溯到幾千年前的釀酒業(yè)和面包業(yè)中，含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、糖類、維生素和其他代謝產(chǎn)物的生理性物質(zhì)，是認(rèn)定的gras生物（generallyrecognizedassafe）。因其在發(fā)酵過(guò)程中不產(chǎn)生毒素，安全可靠，成為最先使用的酵母表達(dá)系統(tǒng)。釀酒酵母表達(dá)外源蛋白優(yōu)點(diǎn)在于：（1）菌體繁殖快，生長(zhǎng)周期短，工藝簡(jiǎn)單，培養(yǎng)條件普通，生產(chǎn)成本低。（2）遺傳背景清晰，基因組全序列測(cè)序早在1996年完成。（3）對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行修飾，使重組蛋白結(jié)構(gòu)接近天然構(gòu)象，使之保持相應(yīng)功能。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足而發(fā)明的一種促生長(zhǎng)復(fù)合多肽及其應(yīng)用。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的：一種促生長(zhǎng)復(fù)合多肽，其特征在于：包含ghrelin和ghrps多肽序列。所述的促生長(zhǎng)復(fù)合多肽的氨基酸序列如sqeidno.1所示。一種促生長(zhǎng)復(fù)合多肽的制備方法，其特征在于：包括以下步驟：步驟1）、促生長(zhǎng)復(fù)合多肽的設(shè)計(jì)ghrelin一級(jí)結(jié)構(gòu)為：gssflspehqrvqqrkeskkppaklqpr，ghrps的共有部分一級(jí)結(jié)構(gòu)為：awfk；將ghrps共有氨基酸序列置換出ghrelin序列中第10個(gè)至第13個(gè)氨基酸序列；步驟2）、重組表達(dá)載體的構(gòu)建1)引物設(shè)計(jì)根據(jù)多肽序列，參照釀酒酵母偏愛(ài)密碼子得到核苷酸序列，利用ncbiprimer-blast設(shè)計(jì)引物，得到引物序列如下：f:cgcgcatccggttcttctttcttgcatcc標(biāo)記為酶切位點(diǎn)bamhir:tgcagatcatcttggttgcaactagatca標(biāo)記為酶切位點(diǎn)xbaim1-f:cttctttcttgtctccagaacacgcttggttm1-r:ttagattcctttctttgcttgaaccaagcgtm2-f:gaaaggaatctaagaagccaccagctaagtm2-r:ttgcaacttagctggtggcttcttagattc2）pcr反應(yīng)根據(jù)設(shè)計(jì)的引物，試驗(yàn)中分4次pcr擴(kuò)增得到目的基因；具體反應(yīng)條件如下：m1基因片段擴(kuò)增冰上操作混勻pcr反應(yīng)體系：10×pcrbuffer5μl，dntp4μl，pfu酶0.25μl，m1-f1μl，m1-r1μl，補(bǔ)加滅菌水達(dá)到反應(yīng)體積為50μl；放入預(yù)熱好的pcr擴(kuò)增儀，按照以下程序進(jìn)行擴(kuò)增：94℃5min，94℃45s，65℃30s，72℃45s，35個(gè)循環(huán)，最后72℃10min，4℃保存；pcr產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，反應(yīng)產(chǎn)物瓊脂糖凝膠回收，目的基因記為m1；m2基因片段擴(kuò)增冰上操作混勻pcr反應(yīng)體系：10×pcrbuffer5μl，dntp4μl，pfu酶0.25μl，m2-f1μl，m2-r1μl，補(bǔ)加滅菌水達(dá)到反應(yīng)體積為50μl；放入預(yù)熱好的pcr擴(kuò)增儀，按照以下程序進(jìn)行擴(kuò)增：94℃5min，94℃45s，66℃30s，72℃45s，35個(gè)循環(huán)，最后72℃10min，4℃保存；pcr產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，反應(yīng)產(chǎn)物瓊脂糖凝膠回收，目的基因記為m2；g基因片段擴(kuò)增冰上操作混勻pcr反應(yīng)體系：10×pcrbuffer5μl，dntp4μl，pfu酶0.25μl，m11μl，m21μl，補(bǔ)加滅菌水達(dá)到反應(yīng)體積為50μl；放入預(yù)熱好的pcr擴(kuò)增儀，按照以下程序進(jìn)行擴(kuò)增：94℃5min，94℃45s，65℃30s，72℃45s，10個(gè)循環(huán)，最后72℃10min，4℃保存；pcr產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，反應(yīng)產(chǎn)物瓊脂糖凝膠回收，目的基因記為g；gm基因片段擴(kuò)增冰上操作混勻pcr反應(yīng)體系：10×pcrbuffer5μl，dntp4μl，pfu酶0.25μl，f1μl，r1μl，補(bǔ)加滅菌水達(dá)到反應(yīng)體積為50μl；放入預(yù)熱好的pcr擴(kuò)增儀，按照以下程序進(jìn)行擴(kuò)增：94℃5min，94℃45s，65℃30s，72℃45s，30個(gè)循環(huán)，最后72℃10min，4℃保存；pcr產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，反應(yīng)產(chǎn)物瓊脂糖凝膠回收，目的基因記為gm；將pcr擴(kuò)增得到的gm基因連接pmd19-t載體，轉(zhuǎn)入dh5α感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行藍(lán)白斑篩選和單克隆擴(kuò)增；同時(shí)將pyes2載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入dh5α感受態(tài)細(xì)胞中在氨芐青霉素培養(yǎng)基上進(jìn)行單克隆擴(kuò)增；3）表達(dá)載體的構(gòu)建提取pmd19-t質(zhì)粒和pyes2載體質(zhì)粒；同時(shí)分別用bamhi和xbai雙酶切37℃條件下作用5h；瓊脂糖凝膠電泳后，凝膠回收試劑盒回收酶切后的目的基因gm＇和pyes2＇載體；兩種酶切后的dna片段gm＇和pyes2＇，在t4連接酶作用下37℃條件下12h；將連接產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，得到大小約為5.9kb的條帶，記為pyes2/gm＇；將pyes2/gm＇轉(zhuǎn)入dh5α中，在氨芐青霉素培養(yǎng)基上篩選表達(dá)載體成功轉(zhuǎn)入的菌體，并進(jìn)行單克隆擴(kuò)增；提取質(zhì)粒，測(cè)序，測(cè)序結(jié)果和正確的堿基序列比對(duì)，序列一致的質(zhì)粒標(biāo)為pyes2/gm；步驟3）、工程菌的表達(dá)構(gòu)建質(zhì)粒提取試劑盒中提pyes2/gm質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)化到感受態(tài)釀酒酵母中，涂布sd固體培養(yǎng)基培養(yǎng)72h后，挑取一個(gè)單克隆菌落，用yepd液體培養(yǎng)基培養(yǎng)72h后，按照1%的比例接種到y(tǒng)epd新鮮的液體培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)；步驟4）、表達(dá)產(chǎn)物的鑒定工程菌發(fā)酵結(jié)束后，離心分離菌體和上清液；將誘導(dǎo)表達(dá)促生長(zhǎng)復(fù)合多肽的菌體和同條件下誘導(dǎo)的原始菌體稀釋到同樣體積下同等菌體數(shù)，同條件破碎，離心后經(jīng)hplc檢測(cè)，確定復(fù)合蛋白的表達(dá)況；步驟5）、發(fā)酵產(chǎn)物粗制備發(fā)酵結(jié)束后，將培養(yǎng)基靜置，使培養(yǎng)物靜置沉淀，過(guò)濾后得到含有復(fù)合蛋白的菌體；干燥，得到促生長(zhǎng)復(fù)合多肽和酵母活菌混合的多肽菌粉。作為飼料添加劑添加在飼料或飲水中。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：1、本發(fā)明在酵母細(xì)胞內(nèi)重組促生長(zhǎng)肽的融合基因并表達(dá)出具有活性的促生長(zhǎng)復(fù)合多肽，這種促生長(zhǎng)復(fù)合多肽可以增加畜禽的抵抗力，加快畜禽生長(zhǎng)，提高飼料利用率；2、促生長(zhǎng)復(fù)合多肽表達(dá)菌株釀酒酵母可以直接作為飼料添加劑，可以調(diào)節(jié)胃腸菌群平衡，補(bǔ)充菌體蛋白，提高畜禽免疫力等作用；3、可將純化或未純化的促生長(zhǎng)復(fù)合多肽直接制備成飼料添加劑，簡(jiǎn)化生產(chǎn)過(guò)程，縮短生產(chǎn)周期，降低生產(chǎn)成本。附圖說(shuō)明圖1為重組促生長(zhǎng)復(fù)合多肽載體連接過(guò)程示意圖。具體實(shí)施方式實(shí)施例1：一種促生長(zhǎng)復(fù)合多肽的制備方法，其特征在于：包括以下步驟：步驟1）、促生長(zhǎng)復(fù)合多肽的設(shè)計(jì)ghrelin一級(jí)結(jié)構(gòu)為：gssflspehqrvqqrkeskkppaklqpr，ghrps的共有部分一級(jí)結(jié)構(gòu)為：awfk；將ghrps共有氨基酸序列置換出ghrelin序列中第10個(gè)至第13個(gè)氨基酸序列；形成一種具有g(shù)hrelin和ghrps活性位點(diǎn)復(fù)合氨基酸多肽鏈。其一級(jí)結(jié)構(gòu)為：gssflspehawfkqrkeskkppaklqpr，等電點(diǎn)為5.46，分子的量為6815da；步驟2）、重組表達(dá)載體的構(gòu)建1)引物設(shè)計(jì)根據(jù)多肽序列，參照釀酒酵母偏愛(ài)密碼子得到核苷酸序列，利用ncbiprimer-blast設(shè)計(jì)引物，得到引物序列如下：f:cgcgcatccggttcttctttcttgcatcc標(biāo)記為酶切位點(diǎn)bamhir:tgcagatcatcttggttgcaactagatca標(biāo)記為酶切位點(diǎn)xbaim1-f:cttctttcttgtctccagaacacgcttggttm1-r:ttagattcctttctttgcttgaaccaagcgtm2-f:gaaaggaatctaagaagccaccagctaagtm2-r:ttgcaacttagctggtggcttcttagattc2）pcr反應(yīng)根據(jù)設(shè)計(jì)的引物，試驗(yàn)中分4次pcr擴(kuò)增得到目的基因；具體反應(yīng)條件如下：m1基因片段擴(kuò)增冰上操作混勻pcr反應(yīng)體系：10×pcrbuffer5μl，dntp4μl，pfu酶0.25μl，m1-f1μl，m1-r1μl，補(bǔ)加滅菌水達(dá)到反應(yīng)體積為50μl；放入預(yù)熱好的pcr擴(kuò)增儀，按照以下程序進(jìn)行擴(kuò)增：94℃5min，94℃45s，65℃30s，72℃45s，35個(gè)循環(huán)，最后72℃10min，4℃保存；pcr產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，反應(yīng)產(chǎn)物瓊脂糖凝膠回收，目的基因記為m1；m2基因片段擴(kuò)增冰上操作混勻pcr反應(yīng)體系：10×pcrbuffer5μl，dntp4μl，pfu酶0.25μl，m2-f1μl，m2-r1μl，補(bǔ)加滅菌水達(dá)到反應(yīng)體積為50μl；放入預(yù)熱好的pcr擴(kuò)增儀，按照以下程序進(jìn)行擴(kuò)增：94℃5min，94℃45s，66℃30s，72℃45s，35個(gè)循環(huán)，最后72℃10min，4℃保存；pcr產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，反應(yīng)產(chǎn)物瓊脂糖凝膠回收，目的基因記為m2；g基因片段擴(kuò)增冰上操作混勻pcr反應(yīng)體系：10×pcrbuffer5μl，dntp4μl，pfu酶0.25μl，m11μl，m21μl，補(bǔ)加滅菌水達(dá)到反應(yīng)體積為50μl；放入預(yù)熱好的pcr擴(kuò)增儀，按照以下程序進(jìn)行擴(kuò)增：94℃5min，94℃45s，65℃30s，72℃45s，10個(gè)循環(huán)，最后72℃10min，4℃保存；pcr產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，反應(yīng)產(chǎn)物瓊脂糖凝膠回收，目的基因記為g；gm基因片段擴(kuò)增冰上操作混勻pcr反應(yīng)體系：10×pcrbuffer5μl，dntp4μl，pfu酶0.25μl，f1μl，r1μl，補(bǔ)加滅菌水達(dá)到反應(yīng)體積為50μl；放入預(yù)熱好的pcr擴(kuò)增儀，按照以下程序進(jìn)行擴(kuò)增：94℃5min，94℃45s，65℃30s，72℃45s，30個(gè)循環(huán)，最后72℃10min，4℃保存；pcr產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，反應(yīng)產(chǎn)物瓊脂糖凝膠回收，目的基因記為gm；將pcr擴(kuò)增得到的gm基因連接pmd19-t載體，轉(zhuǎn)入dh5α感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行藍(lán)白斑篩選和單克隆擴(kuò)增；同時(shí)將pyes2載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入dh5α感受態(tài)細(xì)胞中在氨芐青霉素培養(yǎng)基上進(jìn)行單克隆擴(kuò)增；3）表達(dá)載體的構(gòu)建提取pmd19-t質(zhì)粒和pyes2載體質(zhì)粒；同時(shí)分別用bamhi和xbai雙酶切37℃條件下作用5h；瓊脂糖凝膠電泳后，凝膠回收試劑盒回收酶切后的目的基因gm＇和pyes2＇載體；兩種酶切后的dna片段gm＇和pyes2＇，在t4連接酶作用下37℃條件下12h；將連接產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，得到大小約為5.9kb的條帶，記為pyes2/gm＇；將pyes2/gm＇轉(zhuǎn)入dh5α中，在氨芐青霉素培養(yǎng)基上篩選表達(dá)載體成功轉(zhuǎn)入的菌體，并進(jìn)行單克隆擴(kuò)增；提取質(zhì)粒，測(cè)序，測(cè)序結(jié)果和正確的堿基序列比對(duì)，序列一致的質(zhì)粒標(biāo)為pyes2/gm；步驟3）、工程菌的表達(dá)構(gòu)建質(zhì)粒提取試劑盒中提pyes2/gm質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)化到感受態(tài)釀酒酵母中，涂布sd固體培養(yǎng)基培養(yǎng)72h后，挑取一個(gè)單克隆菌落，用yepd液體培養(yǎng)基培養(yǎng)72h后，按照1%的比例接種到y(tǒng)epd新鮮的液體培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)；步驟4）、表達(dá)產(chǎn)物的鑒定工程菌發(fā)酵結(jié)束后，離心分離菌體和上清液；將誘導(dǎo)表達(dá)促生長(zhǎng)復(fù)合多肽的菌體和同條件下誘導(dǎo)的原始菌體稀釋到同樣體積下同等菌體數(shù)，同條件破碎，離心后經(jīng)hplc檢測(cè)，確定復(fù)合蛋白的表達(dá)況；檢測(cè)得出發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)的最大表達(dá)量達(dá)到1.3g/l；步驟5）、發(fā)酵產(chǎn)物粗制備發(fā)酵結(jié)束后，將培養(yǎng)基靜置，使培養(yǎng)物靜置沉淀，過(guò)濾后得到含有復(fù)合蛋白的菌體；干燥，得到促生長(zhǎng)復(fù)合多肽和酵母活菌混合的多肽菌粉。實(shí)施例2：促生長(zhǎng)復(fù)合多肽效果實(shí)驗(yàn)1）對(duì)保育豬促生長(zhǎng)效果的試驗(yàn)選用40頭體重約為30kg的健康三元雜交豬，按照公母各半的原則隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)日糧，不添加任何添加劑；試驗(yàn)組在飼喂基礎(chǔ)日糧同時(shí)，加入促生長(zhǎng)復(fù)合多肽菌粉日糧，添加量為基礎(chǔ)日糧總量的0.5‰。對(duì)比飼養(yǎng)試驗(yàn)期間保證實(shí)驗(yàn)豬自由采食和自由飲水，并按照豬場(chǎng)常規(guī)方法進(jìn)行飼養(yǎng)管理。試驗(yàn)先進(jìn)行7d預(yù)試期，觀察試驗(yàn)豬對(duì)實(shí)驗(yàn)條件的適應(yīng)情況，確定適應(yīng)后進(jìn)行42d正式試驗(yàn)期。試驗(yàn)開(kāi)始前和結(jié)束后分別停止喂料12h，對(duì)試驗(yàn)豬進(jìn)行空腹稱重。表1基礎(chǔ)日糧配方成分含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）玉米60%豆餅25%魚(yú)粉1%麩皮12.5%貝殼粉0.5%骨粉0.7%食鹽0.3%表2促生長(zhǎng)復(fù)合多肽對(duì)保育豬生長(zhǎng)性能的影響組別日增重（g/頭）日均耗料（g/頭）料肉比對(duì)照組424.80±21.01250±1202.95±0.13實(shí)驗(yàn)組453.28±29.61230±1102.72±0.14結(jié)果表明：促生長(zhǎng)復(fù)合多肽可以有效的改善保育豬生長(zhǎng)性能。在試驗(yàn)期，添加促生長(zhǎng)復(fù)合多肽的試驗(yàn)組平均日增重顯著高于對(duì)照組平均日增重，兩組差異顯著（p<0.05）。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組平均日耗料量較接近，差異不顯著（p>0.05）；料肉比實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組降低了7.8%，兩者差異顯著（p<0.05）。試驗(yàn)結(jié)果表明，添加促生長(zhǎng)復(fù)合多肽飼料可在不改變豬采食量情況下，提高飼料轉(zhuǎn)化率，提高日增重，顯著促進(jìn)保育豬生長(zhǎng)。序列表<110>河南金大眾生物工程有限公司<120>促生長(zhǎng)復(fù)合多肽及其應(yīng)用<160>1<170>patentinversion3.5<210>1<211>28<212>prt<213>人工序列<400>1glyserserpheleuserprogluhisalatrpphelysglnarglys151015gluserlyslysproproalalysleuglnproarg2025當(dāng)前第1頁(yè)12