本申請(qǐng)涉及核酸提取領(lǐng)域。更具體地，本申請(qǐng)涉及用于從諸如細(xì)菌、病毒和真菌等微生物中最大化或改善核酸提取的方法和系統(tǒng)。

背景

提高核酸從堅(jiān)韌的微生物和病毒中的釋放的組合物/方法。

微生物(包括細(xì)菌、藻類(lèi)和真菌)都是非常多種多樣的，并且生活在生物圈中的所有部分。一些微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)循環(huán)是關(guān)鍵的并且與較大的生物體具有親密的、互惠互利的關(guān)系，而其他的是致病的，感染且有時(shí)殺害宿主，即人類(lèi)、其他動(dòng)物和植物。微生物、病毒和朊病毒引起疾病，例如鼠疫、炭疽、結(jié)核病、麻風(fēng)病、瘧疾、霍亂、傷寒、昏睡病、破傷風(fēng)、弓形蟲(chóng)病(toxoplamosis)、組織胞漿菌病、肉毒桿菌、白喉、獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)、流感、脊髓灰質(zhì)炎、麻疹、腮腺炎、風(fēng)疹、甲型和乙型肝炎、1型和2型皰疹、黃熱病、登革熱、狂犬病、乳頭狀瘤/癌(由人類(lèi)乳頭狀瘤病毒引起)、腺病毒介導(dǎo)的呼吸道感染、和傳染性海綿狀腦病(例如，克羅伊茨費(fèi)爾特-雅各布(Creutzfeldt-Jakob)疾病)。

醫(yī)療相關(guān)的感染(HAI)或醫(yī)院感染是病人在接受針對(duì)其他病癥的醫(yī)療保健治療過(guò)程中獲得的感染或者在醫(yī)院工作人員之間發(fā)展出的一種感染。醫(yī)療環(huán)境可以被能夠長(zhǎng)時(shí)間生存的醫(yī)院病原體變成高污染的環(huán)境。這些可預(yù)防的感染可以是毀滅性的和全世界發(fā)病率和死亡率的顯著起因。

現(xiàn)代醫(yī)療采用許多類(lèi)型的侵入設(shè)備和程序來(lái)治療患者。HAI的三分之二與在醫(yī)學(xué)程序中使用的設(shè)備有關(guān)，例如中心導(dǎo)管相關(guān)血流感染、導(dǎo)尿管相關(guān)的尿路感染、和呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎。HAI也可能在手術(shù)部位及開(kāi)放性創(chuàng)傷處發(fā)生。此外，受難辨梭菌(Clostridium difficile)細(xì)菌和孢子污染的表面可引起胃腸道感染和嚴(yán)重的疾病。引起HAI的微生物的其他實(shí)例包括不動(dòng)桿菌(Acinetobacter)、洋蔥伯克霍爾德桿菌(Burkholderia cepacia)、白色念珠菌(Candida albicans)、索氏梭菌(Clostridium Sordellii)、腸桿菌科(Enterobacteriasceae)、大腸桿菌、A-C型肝炎、人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV)、流感、克雷伯菌屬(Klebsiella)、嗜肺軍團(tuán)菌(Legionella pneumophila)、甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌(MRSA)、膿腫分枝桿菌(Mycobacterium abscessus)、諾羅病毒(Norovirus)、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)、萬(wàn)古霉素(Vancomycin)中間體和萬(wàn)古霉素抗性金黃色葡萄球菌、和嗜麥芽窄食單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)。由這些微生物引起的感染通過(guò)延長(zhǎng)患者在醫(yī)院停留占據(jù)稀缺的衛(wèi)生部門(mén)資源。

HAI是發(fā)達(dá)國(guó)家中重要的公共健康問(wèn)題。在美國(guó)，疾病控制和預(yù)防中心(CDC)估計(jì)來(lái)自所有類(lèi)型的微生物(包括細(xì)菌)加在一起大約170萬(wàn)HAI每年引起或促成99,000人死亡。根據(jù)CDC，在美國(guó)每天每20名住院患者中約1名具有通過(guò)接受醫(yī)學(xué)治療引起的感染。僅在美國(guó)，對(duì)于醫(yī)院的HAI的整體年度直接醫(yī)療費(fèi)用(包括住院病人服務(wù))大約是$450億(基于由CDC分析的2007年數(shù)據(jù)；RD·斯科特II(RD Scott II)，2009)。

醫(yī)院有關(guān)于制服、器械消毒、清洗和其他預(yù)防措施的消毒試驗(yàn)方案。所有醫(yī)務(wù)人員在與每位患者接觸前后徹底洗手和/或使用酒精涂擦是與一些HAI戰(zhàn)斗的最有效的方法之一。在器械和表面上的微生物可以通過(guò)暴露于化學(xué)品、電離輻射、干熱或在壓力下的蒸汽被殺死或進(jìn)行滅菌。然而，頑強(qiáng)的微生物(例如葡萄球菌、MRSA和萬(wàn)古霉素抗性腸球菌)已知在“接觸”表面(如床欄、電話(huà)、呼叫按鈕、地板、床頭窗簾、坐便器、椅子、門(mén)把手、電燈開(kāi)關(guān)、靜脈內(nèi)磁極、計(jì)數(shù)器、聽(tīng)診器、TV遙控器、和桌面)連同在空氣和灰塵中生存，持續(xù)延長(zhǎng)的時(shí)間段。

這些表面的消毒經(jīng)常被忽視、然而還打破醫(yī)療環(huán)境中的感染周期的關(guān)鍵組成部分。現(xiàn)代消毒方法，例如在二氧化碳中的不可燃酒精蒸氣(NAV-CO₂)系統(tǒng)已經(jīng)針對(duì)腸胃炎、MRSA、流感劑稍微有效。而且，過(guò)氧化氫蒸氣降低感染率，針對(duì)內(nèi)生孢子形成的細(xì)菌(例如難辨梭菌)尤其有效，其中酒精已被證明是無(wú)效的。因此，為了避免和戰(zhàn)勝HAI兩者，在醫(yī)院、醫(yī)療機(jī)構(gòu)、療養(yǎng)院和長(zhǎng)期護(hù)理設(shè)施中極度需要安全和有效的抗菌藥劑來(lái)常規(guī)地消毒常見(jiàn)的接觸表面、可重復(fù)使用的醫(yī)療設(shè)備、和醫(yī)療/牙科器械。

研究人員和感染控制專(zhuān)家正在提倡更為嚴(yán)格的清洗試驗(yàn)方案和程序，以及針對(duì)不同的傳染性病原體定制的材料。福利(Fawley)和同事(2001)發(fā)現(xiàn)一些通用的、基于清潔劑(離子和非離子表面活性劑)的消毒劑(沒(méi)有充足的消毒)實(shí)際上可能增加對(duì)環(huán)境的污染。而且，一項(xiàng)美國(guó)的研究(馬丁內(nèi)斯(Martinez)等人，2003)推斷日常的20-30分鐘清洗(使用酚消毒劑)不足以消滅在患者的房間中的萬(wàn)古霉素抗性腸球菌(VRE)。它采取了更徹底的4小時(shí)清洗試驗(yàn)方案以從內(nèi)科重癥監(jiān)護(hù)病房(ICU)清除VRE。今天，存在對(duì)安全、快速、有效、廉價(jià)且對(duì)環(huán)境無(wú)害的消毒器械、工具和接觸表面的方式的需求，而不需要使用有毒或腐蝕性化學(xué)品。理想的消毒劑應(yīng)當(dāng)具有寬的抗菌譜，引起快速的殺滅，無(wú)毒，無(wú)味，應(yīng)當(dāng)在處理的表面上留下經(jīng)濟(jì)的、可溶于水的、穩(wěn)定的抗微生物膜，并且不應(yīng)當(dāng)破壞環(huán)境。

在醫(yī)療設(shè)施中使用的大多數(shù)醫(yī)療和手術(shù)設(shè)備是由熱穩(wěn)定的材料制成，并且因此經(jīng)受熱(主要是蒸汽)滅菌。然而，自1950年以來(lái)，由需要低溫滅菌的材料制成的醫(yī)療設(shè)備和儀器不斷增加。在過(guò)去的15年中，許多新的低溫滅菌系統(tǒng)(例如，環(huán)氧乙烷(ETO)、過(guò)氧化氫氣體等離子、過(guò)乙酸浸泡、臭氧)已經(jīng)被開(kāi)發(fā)且被用來(lái)消毒醫(yī)療設(shè)備(例如，外科手術(shù)儀器、移植物、血液培養(yǎng)管、皮下注射器、活檢鉗)和牙科儀器，以及用來(lái)凈化微生物廢物。正在開(kāi)發(fā)用于在醫(yī)療設(shè)施中使用而沒(méi)有被FDA明確的技術(shù)包括汽化的過(guò)氧化氫、汽相過(guò)乙酸、氣態(tài)二氧化氯、電離輻射、或脈沖光。為了保護(hù)患者免受感染，同時(shí)對(duì)工作人員最小化風(fēng)險(xiǎn)并保留正在被再處理的物品的價(jià)值，還需要另外的新的低溫環(huán)境友好的滅菌技術(shù)，該滅菌技術(shù)具有對(duì)于活性微生物和孢子出色的殺微生物活性。

結(jié)核病(TB)是由“結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)復(fù)合體”的成員所造成的人類(lèi)主要的傳染病，該“結(jié)核分枝桿菌復(fù)合體”包括，例如，結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌(M.bovis)、非洲分枝桿菌(M.africanum)、田鼠分枝桿菌(M.microti)、卡內(nèi)堤分枝桿菌(M.cannetti)、山羊分枝桿菌(M.caprae)和鰭腳目分枝桿菌(M.pinnipedi)物種的致病性菌株。結(jié)核分枝桿菌(MT)感染約三分之一的世界人口，其中的90％在感染后幾年能夠保持無(wú)癥狀。TB在>50％的感染人群中是致命的，多重耐藥(MDR)菌株的出現(xiàn)使得結(jié)核病的診斷和治療在發(fā)展中的非洲人群中高度優(yōu)先。MT生長(zhǎng)緩慢，其意味著這種生物體和其他臨床上重要的分枝桿菌的分離、鑒定、和藥敏試驗(yàn)非常困難并且可能需要數(shù)周或數(shù)月。如果生物安全3級(jí)實(shí)驗(yàn)室在這樣的遠(yuǎn)程位置不可用，測(cè)試的難度被使樣品在處理和分子測(cè)試之前不感染以減少傳遞和發(fā)病率的需求所混淆。然而，MT感染的早期和準(zhǔn)確診斷對(duì)隔離患者，從而減少對(duì)密切接觸者的疾病傳播，并確保適當(dāng)和有效治療的開(kāi)始很關(guān)鍵?？股丿煼ǖ脑缙诮o予顯著降低了疾病的嚴(yán)重性，增加了緩解率，并且旨在避免MDR TB的發(fā)展。目前的方法具有從懷疑感染MT的患者中安全地收集、運(yùn)輸、穩(wěn)定和/或提取“好的”/代表性的樣本(如痰標(biāo)本)的困難相關(guān)的缺點(diǎn)。

目前使用痰來(lái)診斷MT感染的方法涉及將痰收集到空容器中，將可能感染的痰樣品遞送到實(shí)驗(yàn)，在那里將容器打開(kāi)并用氫氧化鈉(NaOH)和N-乙?；?L-半胱氨酸(NALC)來(lái)處理樣品。NaOH/NALC被廣泛用于液化痰并減少其他微生物的背景，同時(shí)保持MT的生存能力。MT是如此頑強(qiáng)以至于大多數(shù)在這種嚴(yán)酷的處理下生存，允許這種微生物的選擇性培養(yǎng)。然而，MT在體外生長(zhǎng)非常緩慢，其延長(zhǎng)了檢測(cè)和診斷的時(shí)間。在NaOH/NALC處理之后，包含MT的沉積物在進(jìn)一步的處理之前可以進(jìn)行濃縮，該進(jìn)一步的處理包括a)抗酸染色法，以鑒定在涂片上的“耐酸”細(xì)菌，b)常規(guī)的微生物培養(yǎng)方法，以及c)基于分子的測(cè)定用于物種鑒定和抗生素抗性分析。

在原則上，分子診斷方法的使用避免了培養(yǎng)MT的需要，因此，避免了將原始樣品中的細(xì)菌維持在存活狀態(tài)的需要。此外，全世界存在對(duì)結(jié)核病實(shí)施比用于MT的常規(guī)的實(shí)驗(yàn)室測(cè)試更靈敏和快速的分子診斷測(cè)試(使用DNA和/或RNA)的需要，以使患者的分離和有效治療的更早開(kāi)始成為可能?？缮藤?gòu)的、FDA批準(zhǔn)的用于MT的分子檢測(cè)的測(cè)定(例如，來(lái)自羅氏診斷系統(tǒng)(Roche Diagnostic Systems)(巴塞爾，瑞士)的Amplicor結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)(Amplicor Mycobacterium Tuberculosis Test)和來(lái)自Gen-Probe公司(圣地亞哥，加利福尼亞州，美國(guó))的“增強(qiáng)擴(kuò)增結(jié)核分枝桿菌直接(E-MTD)測(cè)試(Enhanced Amplified Mycobacterium Tuberculosis Direct(E-MTD)Test)”)具有被標(biāo)準(zhǔn)化和可再現(xiàn)的優(yōu)點(diǎn)，并在涂片陽(yáng)性樣品中表現(xiàn)出高靈敏度(>95％)和特異性。然而，所有新的肺TB病例的一半在初步診斷時(shí)是涂片陰性的。不幸的是，F(xiàn)DA批準(zhǔn)的分子測(cè)定法還顯示了在涂片陰性和非呼吸樣本中的低靈敏度(40.0-92.9％，MTD測(cè)試；40.0-73.1％，Amplicor測(cè)試)。此外，高器械和測(cè)試成本限制了它們?cè)谶b遠(yuǎn)的、低資源配置的發(fā)展中國(guó)家的實(shí)施(“針對(duì)用于診斷結(jié)核病的核酸擴(kuò)增的使用的專(zhuān)家咨詢(xún)報(bào)告(Report of an Expert Consultation on the Uses of Nucleic Acid Amplification Tests for the Diagnosis of Tuberculosis)”，疾病控制和預(yù)防中心；“用于對(duì)來(lái)自臨床標(biāo)本的分枝桿菌進(jìn)行診斷和抗生素抗性檢測(cè)的分子遺傳學(xué)方法(Molecular genetic methods for diagnosis and antibiotic resistance detection of mycobacteria from clinical specimens)”，APMIS(2004)112：728-752)。一種增加MT檢測(cè)的靈敏度并因此分子診斷測(cè)試的準(zhǔn)確性的手段是增加從給定的樣品中提取核酸(特別是從臨床樣品中病原菌中提取DNA和RNA)的有效性。來(lái)自具有活動(dòng)和/或休眠感染的患者的樣本，特別是具有HIV/TB共同感染的個(gè)體，可能只包含少數(shù)嵌入厚的(往往是‘實(shí)的’)粘液中的分枝桿菌。高效的提取方法可以通過(guò)增加檢測(cè)MT的敏感性，從而允許早期干預(yù)來(lái)徹底改變結(jié)核病的診斷和治療。

分枝桿菌的蠟狀細(xì)胞壁中含有霉菌酸，使其難以破壞并且大大減少了大多數(shù)化學(xué)或酶提取過(guò)程的核酸提取效率。強(qiáng)壯的細(xì)菌細(xì)胞壁阻礙了細(xì)胞裂解和DNA的有效提取兩者(卡瑟(Kaser)等人，2009)。目前，臨床市場(chǎng)缺乏從處于適合PCR和其他復(fù)雜的分子分析(例如微陣列)的形式的大量樣品中提取/分離核酸的有效的方法。用于微生物/細(xì)胞破碎的物理方法包括機(jī)械細(xì)胞分裂(珠粒打漿、破碎和研磨、濕磨、超聲波、液壓剪、凍結(jié)壓力)、液體或流體剪切(弗細(xì)胞壓碎器(French press)、Chaikoff壓碎器、均質(zhì)器、濕磨碎機(jī)、振動(dòng)磨碎機(jī)、過(guò)濾器、超聲波分解)和固體剪切(研磨、休斯壓碎器(Hughes press))。例如，在E-MTD測(cè)試中，超聲被用于從靶細(xì)胞中釋放分枝桿菌的rRNA。細(xì)菌和其他微生物(如真菌)的機(jī)械破碎產(chǎn)生高度可變的DNA釋放，很大程度上取決于使用的具體技術(shù)。

相比于機(jī)械手段(如珠粒打漿)，一些類(lèi)型的臨床樣品中頑強(qiáng)的細(xì)菌/孢子的化學(xué)/酶裂解會(huì)更容易和更安全地集成到現(xiàn)有的高通量、自動(dòng)化的樣品處理系統(tǒng)和工作流程中。微生物/細(xì)胞分解的化學(xué)方法都旨在修改細(xì)胞壁，所以由于膨壓的影響細(xì)胞變成有漏洞的或爆裂。方法包括反滲透、干燥和提取、自溶、細(xì)胞壁合成的抑制、酶對(duì)細(xì)胞壁、噬菌體和其他裂解因素的攻擊、和電離輻射。

典型地，使用瓊脂和液體培養(yǎng)方法測(cè)定MT的耐藥性，其分別需要6至8周和4至5周提供結(jié)果。對(duì)來(lái)自MT陽(yáng)性標(biāo)本的RNA的可靠檢測(cè)預(yù)期徹底改變TB(特別是和多重耐藥和廣泛耐藥的結(jié)核病(MDR/XDR TB))的診斷和治療。利用分子生物學(xué)方法的耐藥性快速檢測(cè)需要一到兩天，其能夠使有效治療的早期開(kāi)始成為可能，從而減少M(fèi)DR TB病例的傳染性的時(shí)期多達(dá)6周和全面地改善患者的結(jié)果；這兩者都可能對(duì)努力控制MDR TB具有很大的影響(參考文獻(xiàn)：“關(guān)于在美國(guó)檢測(cè)耐藥結(jié)核病的迅速分子測(cè)試的專(zhuān)家咨詢(xún)報(bào)告(Report of Expert Consultations on Rapid Molecular Testing to Detect Drug-Resistant Tuberculosis in the United States)”，疾病控制和預(yù)防中心)。

在TB陽(yáng)性患者標(biāo)本中的MT DNA水平的定量測(cè)定在大多數(shù)患者中不是用于成功治療的可靠標(biāo)志，因?yàn)镸T DNA可在治療完成后在TB患者的痰中繼續(xù)存在長(zhǎng)達(dá)一年。相比之下，原核mRNA具有短的半衰期，因此將被預(yù)測(cè)僅僅在活生物體中找到。相比mRNA，核糖體RNA(rRNA)是相對(duì)穩(wěn)定的RNA靶標(biāo)，比mRNA具有基本上更長(zhǎng)的半衰期和比mRNA更豐富，具有mRNA的總池的100倍的評(píng)估水平。因此，RNA穩(wěn)定化、提取和分析對(duì)于診斷和治療以前錯(cuò)過(guò)的涂片陰性的、TB陽(yáng)性的樣品和快速測(cè)量新的用藥方案或當(dāng)前的抗TB治療的治療優(yōu)勢(shì)或有效性將是特別有價(jià)值的。MT mRNA從TB陽(yáng)性患者的痰中迅速消失表明，它是微生物的生存能力的良好指標(biāo)和對(duì)治療響應(yīng)的快速評(píng)估的有用標(biāo)記(LE·加鼎(LE Desjardin)等人，“痰結(jié)核分枝桿菌信使RNA作為替代物對(duì)化療響應(yīng)的測(cè)定(Measurement of sputum Mycobacterium tuberculosis messenger RNA as a surrogate for response to chemotherapy)”(1999)美國(guó)呼吸和重癥監(jiān)護(hù)醫(yī)學(xué)雜志(Am J Respir Crit Care Med)160：203-210)。

對(duì)于DNA提取目前可用的‘非機(jī)械’的方法包括‘快速提取’(將樣品與包括Tris、EDTA和Triton X-100的裂解緩沖液混合，煮沸15分鐘，用異丙醇沉淀DNA)、‘有機(jī)提取’(將樣品與苯酚-氯仿-異戊醇混合，DNA從水層中沉淀)、‘基于二氧化硅的提取’(將樣品與包括硫氰酸胍、EDTA和Triton X-100的裂解緩沖液混合，與二氧化硅一起孵育、洗滌、從二氧化硅中洗脫DNA)以及磁性粒子，例如‘MagaZorb^TM’(將樣品與蛋白酶K和裂解緩沖液混合，孵育，添加結(jié)合緩沖液和磁性顆粒，洗滌，從顆粒中洗脫DNA)。目前，RNA可以通過(guò)僅物理或機(jī)械破碎(如珠粒打漿)從MT中釋放，并且它通常被降解。

提供此背景信息是出于介紹本申請(qǐng)人認(rèn)為與本發(fā)明可能相關(guān)的已知信息的目的。目的不是必須承認(rèn)，也不應(yīng)被理解為任何前述信息構(gòu)成針對(duì)本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。

概述

本發(fā)明的目的是提供使用高碘酸鹽用于從微生物中釋放DNA和RNA的方法和系統(tǒng)。依照本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了包含氧化劑和緩沖劑的組合物，其中該氧化劑是高碘酸、高碘酸鹽或過(guò)硫酸鹽。

依照本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了用于從微生物中提取核酸的方法，該方法包括將懷疑包含該微生物的樣品與氧化劑混合并加熱所得的混合物，其中該氧化劑是高碘酸、高碘酸鹽或過(guò)硫酸鹽。

依照本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了用于核酸提取的試劑盒，其中該試劑盒包括(i)提取組合物，該提取組合物包含濃度從約5mM至約300mM的高碘酸鹽或過(guò)硫酸鹽和pH從約7至約13的緩沖液；和(ii)使用的說(shuō)明。

依照本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了定量在樣品中的總核酸的方法，該方法包括(i)用酸處理樣品并加熱該酸化樣品；(ii)中和該酸化樣品；和(iii)用反相柱使該中和的樣品經(jīng)過(guò)HPLC并且通過(guò)UV光譜法監(jiān)測(cè)洗脫液以鑒定對(duì)應(yīng)于腺嘌呤的峰；(iv)計(jì)算該腺嘌呤峰的曲線(xiàn)下的面積作為樣品中的總核酸的測(cè)量。

附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明

為了更好地理解本發(fā)明以及其他方面和其進(jìn)一步的特征，可參考下面的描述，該描述是與附圖結(jié)合使用的，其中：

圖1圖解地描述了從酸處理至從純的DNA釋放腺嘌呤的結(jié)果；

圖2圖解地描述了從存在于完整的枯草桿菌細(xì)胞的懸浮液中的DNA釋放的腺嘌呤作為酸濃度的函數(shù)的結(jié)果；

圖3圖解地描述了通過(guò)酸提取方法和通過(guò)珠粒打漿方法檢測(cè)的總DNA的比較的結(jié)果；

圖4是顯示使用本申請(qǐng)的組合物從釀酒酵母(S.cerevisiae)釋放核酸的瓊脂糖凝膠的照片；

圖5是顯示從使用高碘酸鹽和加熱從枯草桿菌(Bacillus subtilis)釋放DNA和RNA的瓊脂糖凝膠的照片。

圖6是顯示從使用高碘酸鹽和加熱從恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis)釋放DNA和RNA的瓊脂糖凝膠的照片。

圖7圖解地描述了相對(duì)于商購(gòu)的分離試劑盒(羅氏公司(Roche))，使用高碘酸鹽提取的來(lái)自孢子的肉毒桿菌(C.Botulinum)特定的-DNA的檢測(cè)。

圖8圖解地描述了相對(duì)于商購(gòu)的分離試劑盒(羅氏公司(Roche))，使用高碘酸鹽提取的來(lái)自孢子的梭狀芽孢桿菌(C.difficile)特定的-DNA的檢測(cè)。

圖9圖解地描述了rtPCR的“高碘酸鹽”方法和“護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)”方法靈敏度的比較。

圖10圖解地描述了低、中、高TB負(fù)荷的痰樣品的rtPCR分析。

圖11圖解地描述了使用不同的提取方法從痰樣品中回收的aMTB DNA的百分比。

圖12是用高碘酸鹽處理的純的胰核糖核酸酶A的SDS-PAGE的照片。

圖13是用高碘酸鹽處理的恥垢分枝桿菌(M.smegmatis)的SDS-PAGE的照片。

圖14是顯示通過(guò)用高碘酸鹽預(yù)處理的RNA酶A的抑制的瓊脂糖凝膠電泳的照片。

圖15圖解地描述了標(biāo)準(zhǔn)凈化和用高碘酸鹽處理后炭疽桿菌(B.Anthracis)孢子生存能力。

圖16圖解地描述了標(biāo)準(zhǔn)凈化和用高碘酸鹽處理后肉毒桿菌(C.botulinum)孢子生存能力。

圖17圖解地描述了標(biāo)準(zhǔn)凈化和用高碘酸鹽處理后難辨梭菌(C.difficile)孢子生存能力。

詳細(xì)說(shuō)明

除非另外定義，否則在此所使用的全部技術(shù)與科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有如本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。

如說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中使用，單數(shù)形式“一個(gè)/種(a/an)”和“該/所述(the)”包括復(fù)數(shù)指代物，除非上下文另有清楚規(guī)定。

如在此所使用的術(shù)語(yǔ)“包括”將被理解為意指以下的列表是非詳盡的并且在適當(dāng)情況下可以包括或可以不包括任何其它附加的合適項(xiàng)目，例如一個(gè)或多個(gè)另外的特征、成分和/或要素。

如在此所使用的術(shù)語(yǔ)“樣品”將被理解為意指可能含有感興趣的物質(zhì)的任何樣品，其任選地是核酸、蛋白質(zhì)或其它感興趣的生物分子。術(shù)語(yǔ)“樣品”可涵蓋溶液(如水性溶液)、細(xì)胞、組織、活組織檢查、粉末、或其一個(gè)或更多的群體。該樣品可以是生物樣品，如唾液、痰、頰拭子樣品、血清、血漿、血液、血沉棕黃層、咽、鼻腔/鼻咽或竇拭樣或分泌物、咽拭樣或刮屑、尿、黏液、糞便、直腸拭樣、病灶拭樣、食糜、嘔吐物、胃液、胰液、胃腸液、精液/精子、尿道拭樣和分泌物、腦脊髓液、乳產(chǎn)品或月經(jīng)、蛋黃、羊水、房水、玻璃狀液、宮頸分泌物或拭樣、陰道液/分泌物/拭樣或刮屑、骨髓樣本和抽出物、胸膜液體和胸腔積液、汗液、膿、淚、淋巴液、支氣管或肺灌洗液或抽出物、腹膜積液、細(xì)胞培養(yǎng)物和細(xì)胞懸液、結(jié)締組織、上皮細(xì)胞、上皮拭子和涂片、粘膜、肌肉組織、胎盤(pán)組織、活組織檢查、滲出液、器官組織、神經(jīng)組織、毛發(fā)、皮膚、指甲、植物、植物提取物、藻類(lèi)、土壤樣品、污水、廢水、食品、肉類(lèi)加工設(shè)備拭樣等。樣品也可以是穩(wěn)定化的或保藏的樣品，其中包含原始核酸的樣本已經(jīng)與存儲(chǔ)溶液混合或以其他方式被存儲(chǔ)溶液處理，例如在試劑盒中發(fā)現(xiàn)的存儲(chǔ)溶液，例如但不限于，·DNA收集試劑盒、·RNA收集試劑盒、·發(fā)現(xiàn)感染的疾病收集試劑盒、Performagene^TM·牲畜(LIVESTOCK)DNA收集試劑盒、和·動(dòng)物DNA收集試劑盒、或組合物，例如描述于美國(guó)專(zhuān)利號(hào)7,482,116、8,158,357和美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)2010/0099149，其各自通過(guò)引用結(jié)合在此。優(yōu)選地，將在這樣的穩(wěn)定化樣品中的核酸保持基本上完整和非降解持續(xù)延長(zhǎng)的時(shí)間段，例如，從樣品收集、運(yùn)輸?shù)牡攸c(diǎn)到測(cè)試實(shí)驗(yàn)室，以及本發(fā)明的處理。

如在此所使用的術(shù)語(yǔ)“微生物”將被理解為意指任何微觀(guān)生物體和孢子，包括所有的原核生物，即真細(xì)菌和古細(xì)菌，以及各種形式的真核生物，包括原生動(dòng)物、真菌(如酵母)、藻類(lèi)和動(dòng)物(如輪蟲(chóng)和真渦蟲(chóng))。

如在此所使用的術(shù)語(yǔ)“螯合劑”將被理解為意指將與某些金屬離子一起形成可溶的穩(wěn)定的復(fù)合體，螯合這些離子以至于它們不能正常與其它組分進(jìn)行反應(yīng)的化學(xué)品。螯合劑可以是，例如，乙二醇四乙酸(EGTA)、(2-羥乙基)乙二胺三乙酸(HEDTA)、二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)、次氮基三乙酸(NTA)、乙二胺三乙酸(EDTA)、環(huán)己烷二胺四乙酸(CDTA)，N,N-雙(羧基甲基)甘氨酸、無(wú)水檸檬酸、檸檬酸鈉、檸檬酸鈣、檸檬酸銨、二檸檬酸銨、檸檬酸、檸檬酸二銨、檸檬酸鐵銨、檸檬酸鋰、或它們的任意組合。

如在此所使用的術(shù)語(yǔ)“變性劑”將被理解為意指可以引起蛋白質(zhì)失去它們的天然二級(jí)和/或三級(jí)結(jié)構(gòu)的任何化學(xué)品。變性劑可以是，例如，陰離子洗滌劑(例如，十二烷基硫酸鈉(SDS)、十二烷基硫酸鋰、或月桂硫酸鈉(SLS))、陽(yáng)離子洗滌劑(例如，十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)，其可以適用于一些核酸應(yīng)用；十六烷基溴化吡啶或烷基芐二甲基氯化銨)、或非離子型洗滌劑(例如，吐溫(Tween)、Triton X、或布里杰(Brij))。

本申請(qǐng)?zhí)峁┝擞糜趶奈⑸镏刑崛『怂岬姆椒?、組合物和系統(tǒng)。本發(fā)明的方法、組合物和系統(tǒng)能夠從抵抗一般標(biāo)準(zhǔn)核酸提取技術(shù)的微生物和孢子中釋放核酸，例如，分枝桿菌屬的一個(gè)或多個(gè)物種，結(jié)核分枝桿菌復(fù)合體的一個(gè)或多個(gè)物種、結(jié)核分枝桿菌的MDR菌株、梭菌屬的一個(gè)或多個(gè)物種、芽孢桿菌的一個(gè)或多個(gè)物種、以及具有頑強(qiáng)的細(xì)胞壁的其他微生物。

本提取方法、組合物和系統(tǒng)具有超出結(jié)核病市場(chǎng)的應(yīng)用。該方法、組合物和系統(tǒng)在人類(lèi)和動(dòng)物的醫(yī)學(xué)診斷和研究中是有用的(例如，研究微生物進(jìn)化、毒性、耐藥性、和流行病學(xué)的群體基因組學(xué))。另外，許多市場(chǎng)/行業(yè)正在尋找有效的方法來(lái)破開(kāi)堅(jiān)韌的小蟲(chóng)和孢子，包括食品安全(食品/肉類(lèi)加工廠(chǎng))、土壤和水樣采集(環(huán)境測(cè)試)、生物安全或生物防御(炭疽孢子和其他生物武器)、動(dòng)物飼料測(cè)試、農(nóng)業(yè)/植物科學(xué)/工業(yè)、酒精生產(chǎn)等。

新的和迅速擴(kuò)大的研究焦點(diǎn)是腸道菌群或腸道微生物組和在健康和患病的人類(lèi)糞便中的微生物分析。出于研究和經(jīng)濟(jì)上的原因，對(duì)在許多家畜(尤其是為了乳制品和肉被飼養(yǎng)的那些動(dòng)物)的瘤胃中的數(shù)千種不同的微生物的分析也有巨大的興趣。

本發(fā)明人已意外地發(fā)現(xiàn)，常見(jiàn)的實(shí)驗(yàn)室化學(xué)品高碘酸鹽在弱堿性pH和升高的溫度下使用，可以用來(lái)從在生長(zhǎng)和休眠(例如，內(nèi)生孢子和孢子)兩種狀態(tài)中的微生物中快速和有效地釋放核酸。核酸的驚人釋放似乎是高碘酸鹽特異性的并且在較小的程度上是過(guò)硫酸鹽特異性的。相關(guān)的化合物(如碘酸鹽)不會(huì)顯著地提高核酸從細(xì)菌或真菌中的釋放。

本化學(xué)組合物和方法具有簡(jiǎn)化和加快用于檢測(cè)微生物的樣品制備或加工的潛力，而不需要冷鏈或昂貴且費(fèi)時(shí)的樣品凈化和乳化。本發(fā)明可以用于具有高通量系統(tǒng)的中心實(shí)驗(yàn)室或具有最少的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)設(shè)施和設(shè)備的農(nóng)村或流動(dòng)診所。這種用途有利于流行病學(xué)和疫情監(jiān)測(cè)，從田間樣本在收集現(xiàn)場(chǎng)的流行性疾病和傳染病跟蹤，以及用于快速評(píng)估和監(jiān)測(cè)患者對(duì)治療的反應(yīng)。

分枝桿菌頑強(qiáng)的細(xì)胞壁由厚的、蠟質(zhì)的、疏水的、霉菌酸酯層和肽聚糖層通過(guò)多糖結(jié)合在一起組成。為了確定細(xì)胞壁的蠟質(zhì)組分是否可以剝?nèi)?，?duì)各種溶劑(例如，瓦索爾(Varsol)、DMSO和Hemo-)進(jìn)行了嘗試，但沒(méi)有觀(guān)察到DNA的釋放增加。同樣地，各種洗滌劑(如SDS)、甲酸、和硼酸鹽在升高的溫度下進(jìn)行了測(cè)試。這些化合物沒(méi)有一種甚至在100℃下被發(fā)現(xiàn)從分枝桿菌中釋放10％以上的DNA。

除了從微生物釋放非常高級(jí)分的DNA/RNA，本非機(jī)械提取組合物和方法可具有使該樣品不被感染的另外的優(yōu)點(diǎn)，這將對(duì)實(shí)驗(yàn)室工作人員的安全是有利的。驚奇地，在基本上全部DNA被釋放的條件下，本發(fā)明的組合物和方法仍然可以允許分枝桿菌的抗酸染色和顯微鏡觀(guān)察。與此相反，本發(fā)明人觀(guān)察到酵母在使用本發(fā)明的組合物和方法處理時(shí)即快速分解以至于它們不能夠通過(guò)染色或顯微鏡進(jìn)行進(jìn)一步的分析。

本申請(qǐng)的方法和系統(tǒng)在從細(xì)菌和孢子釋放DNA/RNA方面是有用的。該細(xì)菌可以是，例如，結(jié)核分枝桿菌、結(jié)核分枝桿菌復(fù)合體的物種、恥垢分枝桿菌、牛分枝桿菌、非洲分枝桿菌、田鼠分枝桿菌、卡內(nèi)蒂分枝桿菌、山羊分枝桿菌、鰭腳目分枝桿菌、海魚(yú)分枝桿菌(Mycobacterium marinum)、麻風(fēng)分枝桿菌(Mycobacterium leprae)、彌漫型麻瘋分枝桿菌(Mycobacterium Lepromatosis)、鳥(niǎo)分枝桿菌(Mycobacterium avium)，鳥(niǎo)細(xì)胞內(nèi)分枝桿菌(Mycobacterium avium-intra-cellulare)、鳥(niǎo)類(lèi)結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium avium paratuberculosis)、潰瘍分枝桿菌(Mycobacterium ulcerans)、戈登分枝桿菌(Mycobacterium gordonae)、芽孢桿菌屬物種、枯草桿菌、幽門(mén)螺桿菌(Helicobacter pylori)、肺炎衣原體(Chlamydia pneumoniae)、沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis)、剛地弓形蟲(chóng)(Toxoplasma gondii)、鏈球菌屬物種、葡萄球菌屬物種、脆雙核阿米巴(Dientamoeba fragilis)、伯氏疏螺旋體(Borrelia burgdorferi)和其他物種、梭狀芽胞桿菌物種、具核梭桿菌(Fusobacterium nucleatum)、沙門(mén)氏菌物種、彎曲桿菌物種、厚壁菌門(mén)(Firmicutes)細(xì)菌，巴爾通氏體屬(Bartonella)物種，立克次氏體(Rickettsia)物種、耶爾森菌屬(Yersinia)物種、弗朗西絲菌屬(Francisella)物種、布魯桿菌屬(Brucella)物種、博德特菌屬(Bordetella)物種、伯霍爾德桿菌屬(Burkholderia)物種、假單胞菌屬(Pseudomonas)物種、志賀菌屬(Shigella)物種、衣原體屬(Chlamydophila)物種、軍團(tuán)菌屬(Legionella)物種，李斯特菌屬(Listeria)物種、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)物種、腸球菌(Enterococcus)物種、埃希氏菌屬(Escherichia)物種、嗜血桿菌屬(Haemophilus)物種、螺桿菌屬(Helicobacter)物種、鉤端螺旋體屬(Leptospira)物種、支原體(Mycoplasma)物種、奈瑟球菌屬(Neisseria)物種、密螺旋體屬(Treponema)物種、或弧菌屬(Vibrio)物種。

本申請(qǐng)的方法和系統(tǒng)在從真菌中釋放DNA/RNA是有用的。真菌可以是(例如)酵母菌屬、念珠菌屬、曲霉屬、組織胞漿菌屬、肺囊蟲(chóng)屬、葡萄穗霉屬或隱球菌屬。

高碘酸鹽提取組合物

高碘酸鹽可以許多形式存在，這些形式包括，間-和鄰-高碘酸鹽(分別是IO₄^-和IO₆^-5)，其是從碘和氧形成的陰離子并且通常作為具有鉀(如KIO₄)或鈉(如NaIO₄)的鹽被發(fā)現(xiàn)。至少四個(gè)系列的高碘酸鹽已知處于水溶液中，即鄰高碘酸(H₅IO₆)、高碘酸(HIO₄)、偏高碘酸鹽(H₃IO₅)、和三高碘酸(H₇I₃O₁₄)[N.N.·格林伍德(N.N.Greenwood)和A.·恩肖(A.Earnshaw)，元素的化學(xué)(Chemistry of the Elements)，第2版，巴特沃思海涅曼公司(Butterworth Heinemann)，牛津，第17章，第872-875頁(yè)(1998)]。在溶液中，高碘酸鹽可以是氧化劑并且被應(yīng)用于分子生物化學(xué)用于打開(kāi)糖環(huán)和標(biāo)記的RNA的目的。高碘酸鹽切割在合成的聚合物和天然的多糖和單糖中具有羥基基團(tuán)(順式乙二醇)的相鄰的碳原子之間的鍵，從而生成兩個(gè)醛基基團(tuán)。這些醛可以被用于與伯胺或酰肼活化的標(biāo)記/標(biāo)簽、固定支撐和交聯(lián)試劑進(jìn)行的兩種類(lèi)型的偶聯(lián)反應(yīng)。高碘酸也被用于組織學(xué)染色(高碘酸-希夫(PAS))，用于檢測(cè)組織中的糖原和其他多糖的一種染色方法。然而，據(jù)本發(fā)明人所知，高碘酸鹽以前從未被用于從微生物中提取DNA和/或RNA。

高碘酸鹽提取組合物是高碘酸鹽的水性溶液，當(dāng)與樣品混合時(shí)，該水性溶液包括從約0.1mM至約100mM，優(yōu)選地5mM至約30mM的高碘酸鹽，該高碘酸鹽可以是間-高碘酸鹽、鄰-高碘酸鹽或其任意組合。具有在弱堿性pH下濃度低至5M高碘酸鹽的高碘酸鹽的組合物，在加熱條件下，從頑強(qiáng)的細(xì)菌和孢子中釋放大量的DNA，這些細(xì)菌和孢子包括但不限于分枝桿菌屬、梭菌屬和芽孢桿菌屬物種。樣品中高達(dá)25-30mM的高碘酸鹽的濃度也成功地從所述樣品中的微生物中有效地釋放DNA。甚至更高濃度的高碘酸鹽可能是成功的，但可能會(huì)發(fā)生不希望的副反應(yīng)。高碘酸鈉的最大實(shí)際溶解度為約400mM，使得可能難以產(chǎn)生高度濃縮的組合物或儲(chǔ)備溶液用于制造的目的。

為了規(guī)避高濃度的高碘酸鹽的溶解度問(wèn)題，它們可以高碘酸的形式被添加到組合物中，該高碘酸可以用堿(如NaOH)中和。可替代地，高碘酸鹽是以高碘酸鹽的形式引入，如高碘酸鈉(在此也稱(chēng)為NPI)、高碘酸鉀或高碘酸鋰。因?yàn)槠漭^高的溶解度，高碘酸鹽的鈉鹽(NaIO₄)的使用比鉀鹽和鋰鹽優(yōu)選?？商娲?，過(guò)硫酸鈉(Na₂S₂O₈)、過(guò)硫酸鉀和過(guò)硫酸銨可用于從微生物和孢子中釋放核酸。

雖然高碘酸鈉在水中并與樣品混合的簡(jiǎn)單溶液確實(shí)從微生物中提取核酸，但是高碘酸鹽的作用是pH依賴(lài)性的。在pH從約5至約11，觀(guān)察到DNA和RNA提取，其中在接近中性的pH值時(shí)RNA完整性更好地被保留。在某些實(shí)施例中，將本申請(qǐng)的提取組合物緩沖至pH為從約6.5至約11、或從約8.0至約10.5、或約9.5至約10.5。在一個(gè)實(shí)施例中，為了確定最佳的pH范圍，提取組合物是使用緩沖劑的組合來(lái)緩沖的。例如，該組合物可使用磷酸(pKa為2.15、7.20、12.38)、乙酸(pKa 4.76)和硼酸的組合(pKa 9.24)進(jìn)行緩沖。

任選地，高碘酸鹽提取組合物可包含附加組分，包括鋰鹽，洗滌劑和/或螯合劑。在一個(gè)具體的實(shí)施例中，高碘酸鹽提取組合物另外包括LiCl、SDS和/或CDTA。任選地，該組合物另外包括甘氨酸或硼酸作為緩沖劑。有利的是，這些附加組分有助于確保核酸從微生物中提取過(guò)程中和生物樣品的處理過(guò)程中保持完整用于隨后的下游分子測(cè)試(例如，PCR、微陣列)。這些附加組分也可協(xié)助液化樣品和在處理過(guò)程中賦予穩(wěn)定性。如果該樣品被立即收集到具有這些附加組分的高碘酸鹽組合物中，核酸將最佳地得以保存免受收集點(diǎn)、樣品的運(yùn)輸和儲(chǔ)存過(guò)程中的傷害，允許樣品的處理以提取核酸，并且以感興趣的測(cè)試結(jié)束。

任選地，不含高碘酸鹽，含有LiCl、SDS和/或CDTA和/或甘氨酸或硼酸作為緩沖劑的提取組合物可以被用于保存樣品中的核酸免受采集點(diǎn)、運(yùn)輸和儲(chǔ)存過(guò)程的傷害，直到需要核酸提取。在那時(shí)，可加入高碘酸鹽并且進(jìn)行樣品的處理來(lái)提取核酸，最終進(jìn)行感興趣的測(cè)試。

核酸提取的方法

本申請(qǐng)進(jìn)一步提供了從含有微生物的樣品中提取核酸的方法。該方法包括使含有微生物的樣品與包含高碘酸鹽的組合物接觸和加熱所得的混合物。

依據(jù)具體的實(shí)施例中，該方法包括以下步驟：

-準(zhǔn)備微生物的懸浮液：在一個(gè)實(shí)例中，例如，當(dāng)微生物是細(xì)菌的肉湯培養(yǎng)物時(shí)，將細(xì)胞通過(guò)離心收集并洗滌(例如，用鹽水洗兩次)以去除可能會(huì)存在于復(fù)雜培養(yǎng)基中的干擾污染物。洗滌的細(xì)胞(約5-20×10⁸)應(yīng)該被很好地懸浮于水(如約200μL)。

-添加高碘酸鹽提取組合物：典型地將等體積的提取組合物與等體積的細(xì)胞懸浮液混合(如，200μL的提取試劑與200μL的細(xì)胞懸浮液混合)。

-加熱該懸浮液：該加熱步驟通常用來(lái)自前一步驟的懸浮液在封閉管中進(jìn)行。典型地，該加熱步驟是在45℃或更高的溫度下或在從約50℃至約100℃的溫度下，并在從約15分鐘至約60分鐘的時(shí)間中進(jìn)行。較長(zhǎng)的時(shí)間和較高的溫度可以在釋放DNA中更有效，但釋放的DNA可能被部分降解。在80℃下加熱約20分鐘時(shí)，幾乎100％DNA從高碘酸鹽處理的恥垢分枝桿菌中釋放，具有最小的DNA降解。

在一個(gè)具體的實(shí)施例中，在添加高碘酸鹽提取組合物之前，樣品首先用穩(wěn)定或預(yù)處理組合物處理。在這種方法的一個(gè)實(shí)例中，可以執(zhí)行以下步驟：

1)在穩(wěn)定試劑(例如或)中收集樣品，例如痰樣品，(例如，在遠(yuǎn)程設(shè)置中)，該穩(wěn)定試劑在環(huán)境條件下穩(wěn)定核酸；

2)運(yùn)送穩(wěn)定的樣品到實(shí)驗(yàn)室，不需要冷鏈(如，無(wú)制冷)；

3)添加高碘酸鹽組合物至穩(wěn)定化的樣品并且加熱以從頑強(qiáng)的微生物(例如，結(jié)核分枝桿菌)和孢子中迅速和有效地釋放基本上所有核酸并且使樣本不被感染；

4)快速地、成本有效地加工處理過(guò)的樣品以分離在步驟3中釋放的核酸；并且任選地

5)使用釋放的核酸進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)診斷測(cè)試。

作為與現(xiàn)有的技術(shù)相比的核酸釋放的改進(jìn)的結(jié)果，本發(fā)明的高碘酸鹽處理可導(dǎo)致增加的診斷測(cè)試的敏感性和更準(zhǔn)確的診斷或?qū)χ委煼桨傅挠行缘拇_定。

本申請(qǐng)進(jìn)一步提供了用于DNA提取的試劑盒。該試劑盒包括提取組合物，該組合物包括濃度為從約5mM至約30mM的高碘酸鹽和pH為約7至約13的緩沖液。如上所述，該提取組合物可包括附加組分，包括鋰鹽、變性劑和/或螯合劑。該試劑盒可以另外包括用于執(zhí)行上述的提取方法的說(shuō)明、一個(gè)或多個(gè)試劑容器和/或樣品接收容器。

用于凈化/消毒的方法

本申請(qǐng)進(jìn)一步提供了用于(例如)設(shè)備、儀器或結(jié)構(gòu)的表面的凈化或消毒的方法。該方法包括使表面與包含高碘酸鹽的組合物接觸和加熱該表面。

如在此已經(jīng)證明的，用包括高碘酸鹽的組合物和加熱來(lái)處理微生物方法導(dǎo)致DNA從微生物中的釋放。DNA的這種釋放的后果是微生物不再是有生活力的。以下實(shí)例12證明了本發(fā)明的高碘酸鹽組合物加上加熱使三種頑強(qiáng)的細(xì)菌無(wú)生活力的能力。

典型地，在凈化或消毒的方法中的加熱步驟是在45℃或更高的溫度下或在從約50℃至約100℃的溫度下，并在從約15分鐘至約60分鐘的時(shí)間中進(jìn)行。較長(zhǎng)的時(shí)間和較高的溫度也可以在本方法中使用，因?yàn)樗鼈冊(cè)卺尫臘NA和凈化或消毒表面中可以更加有效。加熱可以使用各種手段(例如，但不限于，加熱燈、輻射加熱系統(tǒng)和烘箱)應(yīng)用于表面。

在微生物懸浮液中定量總DNA的方法

本申請(qǐng)?zhí)峁┯糜诙繕悠分械目侱NA的方法，該樣品包括微生物的樣品。這種方法被用于建立樣品中的DNA的總量，以被用作參考來(lái)計(jì)算通過(guò)在此所述組合物釋放DNA的效率。

眾所周知，暴露于相對(duì)溫和的酸性條件可以引起DNA降解(骨架斷裂)。降解在兩個(gè)步驟中發(fā)生。首先，酸催化DNA的脫嘌呤，即釋放嘌呤核堿基(腺嘌呤和鳥(niǎo)嘌呤)，但不釋放嘧啶核堿基(胸腺嘧啶和胞嘧啶)。其結(jié)果是一種稱(chēng)為無(wú)嘌呤酸的相當(dāng)穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。最終，骨架在嘌呤位點(diǎn)通過(guò)β-消除斷裂，釋放脫氧核糖和磷酸鹽；這個(gè)過(guò)程通過(guò)用堿或某些催化劑處理被加速[例如，K.·伯頓(K.Burton)、M.R.·倫特(M.R.Lunt)、G.B.·彼得森(G.B.Petersen)、J.C.Siebke，對(duì)脫氧核糖核酸中的核苷酸序列的研究(Studies of Nucleotide Sequences in Deoxyribonucleic Acid)，冷泉港定量生物學(xué)研討會(huì)(Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology)，第28卷，第28-34頁(yè)(1963)]。

與此相反，通過(guò)溫和酸處理的RNA的脫嘌呤以前沒(méi)有在任何細(xì)節(jié)方面被研究過(guò)。人們普遍理解的是RNA的嘌呤比DNA的更穩(wěn)定，但是尚未作出并排比較。相反，已知RNA很容易通過(guò)用溫和的堿處理降解，而DNA的骨架在這些條件下是非常穩(wěn)定的[(例如，G.·施密特(G.Schmidt)和S.J.·坦豪澤(S.J.Thannhauser)，用于在動(dòng)物組織中確定脫氧核糖核酸、核糖核酸和磷蛋白的一種方法(A method for the determination of deoxyribonucleic acid,ribonucleic acid,and phosphoproteins in animal tissues)，生物化學(xué)雜志(Journal of Biological Chemistry)第161卷，第83-89頁(yè)(1945)]。堿催化的RNA骨架的分解在兩個(gè)步驟中發(fā)生。首先，將一個(gè)核苷酸的核糖3’-羥基連接到鄰近核苷酸的5’-羥基的磷酸二酯鍵被轉(zhuǎn)移(未斷開(kāi))到該第一個(gè)核苷酸的2’-羥基。這導(dǎo)致斷鏈而未水解裂解磷酸酯鍵。所得的2’、3’-環(huán)狀磷酸二酯是相對(duì)穩(wěn)定的，但它在進(jìn)一步的堿處理中可以以大約相同的頻率緩慢的裂解為2’-磷酸單酯或3’-磷酸單酯。在這些條件下，DNA骨架是很穩(wěn)定的，因?yàn)樗奶?脫氧核糖)缺少相鄰3’-羥基的2’-羥基，所以容易的第一步驟，形成2’、3’-環(huán)磷酸二酯，是不可能的。

雖然科學(xué)文獻(xiàn)包含有關(guān)上述反應(yīng)的一般背景信息，產(chǎn)生DNA的鄰近定量脫嘌呤同時(shí)引起很少或沒(méi)有RNA的脫嘌呤的詳細(xì)的、具體的酸處理?xiàng)l件以前還沒(méi)有被描述。

具有腺嘌呤和鳥(niǎo)嘌呤定量地從DNA釋放但不能從RNA釋放的良好定義的條件具有很大的實(shí)用性。它允許對(duì)在復(fù)雜生物樣品和微生物中的DNA的靈敏和可再現(xiàn)的定量(目前這是困難的)，在檢測(cè)之前無(wú)擴(kuò)增步驟。例如，在測(cè)定方法(例如UV吸收或熒光DNA結(jié)合染色)可以應(yīng)用之前，樣品制備和DNA純化是必要的第一步驟?；诙桨坊駾ABA(氨基苯甲酸)的化學(xué)方法受到生物樣品中的化合物(包括復(fù)雜的多糖)的干擾[G.M.·理查茲(G.M.Richards)，二苯胺反應(yīng)的改進(jìn)在DNA的評(píng)估中產(chǎn)生增加的靈敏度和簡(jiǎn)便性(Modifications of the diphenylamine reaction giving increased sensitivity and simplicity in the estimation of DNA)，分析生物化學(xué)(Analyt.Biochem.)57，369-376(1974)；J.M.Kissane、E.·羅賓斯(E.Robins)，動(dòng)物組織特別是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的脫氧核糖核酸的熒光測(cè)量(The fluorometric measurement of deoxyribonucleic acid in animal tissues with special reference to the central nervous system)，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)233，184-188(1958)]。意外地，目前沒(méi)有簡(jiǎn)單的、精確的方法確定存在于完整的、未處理的微生物的懸浮液中的DNA(或RNA)的量。具有這樣的信息對(duì)確定任何現(xiàn)有或新的方法或組合物實(shí)際上從微生物的懸浮液中釋放DNA的效率是至關(guān)重要的。提取的效率(E)被定義為通過(guò)處理提取的DNA的量(DNAe)除以最初存在于未處理的樣品中的DNA的總量(DNAt)。

$E=\frac{DNAe}{DNAt}$

建立了目前描述的酸提取/HPLC方法以允許這樣的測(cè)定。

因此，本申請(qǐng)?zhí)峁┯糜诖_定在樣品中的總DNA的方法。該方法在以下實(shí)例1中詳細(xì)描述。通常，該方法包括使用HCl(“酸水解”步驟)或另一種酸(例如，濃的甲酸)加熱含有核酸的樣品的步驟，隨后在使用反相HPLC柱(如，Gemini-NX柱)進(jìn)行HPLC分析之前中和該樣品。流動(dòng)相可基于所使用的柱從各種溶劑或溶劑的混合物等選擇，選擇適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)相將是在本領(lǐng)域的技術(shù)工人的標(biāo)準(zhǔn)能力范圍內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施例中，流動(dòng)相為2％甲醇、1mM CDTA、30mM乙酸銨，用單磷酸酸鈉調(diào)整到pH 6.3。任選地，該方法另外包括允許RNA的定量的步驟。為了確定樣品中的RNA的量在用HCl加熱樣品的步驟之后，添加NaOH至相對(duì)所添加的HCl的量0.1N過(guò)量，并在100℃下孵育15分鐘。

對(duì)應(yīng)于腺嘌呤(代表DNA)和對(duì)應(yīng)于2’或3’單磷酸腺苷(2’-和3’-AMP)(代表RNA)的HPLC峰的曲線(xiàn)下面積(“AUC”)使用TotalChrom Navigator軟件(珀金埃爾默公司(Perkin Elmer))來(lái)計(jì)算。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)可以利用這些純分析物(來(lái)自阿法埃莎公司(Alfa Aesar)的腺嘌呤；來(lái)自西格瑪-奧德里奇公司(Sigma-Aldrich)的2’-3’-AMP(混合物))的已知濃度來(lái)生成。

為了更好地理解在此所描述的本發(fā)明，列出以下實(shí)例。應(yīng)當(dāng)理解的是，這些實(shí)例僅用于說(shuō)明的目的。因此，它們不應(yīng)該以任何方式限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)例

實(shí)例1：用于測(cè)量樣品中總DNA的酸提取HPLC方法

表1概括了由本發(fā)明人發(fā)展的酸提取/HPLC方法以精確地測(cè)量在未加工的或未處理的微生物/樣品中的核酸的總量，以及由本發(fā)明的處理引起的從這樣的微生物/樣品中釋放的核酸的詳情。

表1.用于使用本發(fā)明描述的提取方法從頑強(qiáng)的微生物中釋放核酸和用于測(cè)量在完整的和處理的微生物中的DNA和RNA的典型試驗(yàn)方案

實(shí)例1A：純的DNA。用于從DNA完全釋放腺嘌呤的最佳的酸提取條件

在這個(gè)實(shí)例中，測(cè)量了在不同時(shí)間段通過(guò)酸處理從純的基因組中釋放的腺嘌呤的量。在60℃下，將460納克純的犬齒DNA(Novagen公司)經(jīng)受酸提取方法持續(xù)指示的時(shí)間。結(jié)果顯示于圖1中。誤差棒表示一式三份樣品的SEM。

該結(jié)果表明在60℃下孵育60分鐘時(shí)間足以從DNA釋放最大量的腺嘌呤。極大多數(shù)的腺嘌呤是在40分鐘時(shí)釋放的，在處理的80分鐘時(shí)不再釋放腺嘌呤，表明在60分鐘時(shí)腺嘌呤的完全脫嘌呤。

實(shí)例1B：用于從完整的細(xì)菌細(xì)胞中釋放腺嘌呤的最佳酸濃度

如圖2所示，將枯草桿菌細(xì)胞在60℃下與不同濃度(標(biāo)準(zhǔn))的HCl一起孵育60分鐘。誤差棒，一式兩份的平均值和范圍；在沒(méi)有顯示誤差棒的地方，范圍的值是在符號(hào)范圍內(nèi)。

這些結(jié)果表明腺嘌呤從完整的枯草桿菌的最大釋放發(fā)生在約0.20–0.25N的HCl濃度的范圍內(nèi)。

實(shí)例1C：與酸提取HPLC方法相比估計(jì)DNA含量的CFU方法

這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)被設(shè)計(jì)來(lái)比較通過(guò)計(jì)數(shù)細(xì)菌細(xì)胞的數(shù)量(如通過(guò)菌落形成單位(CFU)估計(jì)的)存在于細(xì)菌培養(yǎng)物中的DNA的量與使用酸提取HPLC方法從對(duì)腺嘌呤的AUC計(jì)算的DNA的量。

CFU方法是用于估計(jì)樣品中有生活力的細(xì)菌細(xì)胞的數(shù)量的經(jīng)典方法。然而，它很費(fèi)時(shí)并且具有理論局限性。典型地，細(xì)菌在小團(tuán)塊中生長(zhǎng)。因此，被評(píng)分為細(xì)菌的有生活力的“菌落”實(shí)際上可以從單個(gè)細(xì)胞或從2個(gè)或多個(gè)細(xì)胞的團(tuán)塊產(chǎn)生。而且，在培養(yǎng)物中的任何無(wú)生活力的細(xì)胞將包括DNA但不會(huì)形成菌落。這兩個(gè)因素趨于低估懸浮液中細(xì)菌細(xì)胞的實(shí)際數(shù)量。從對(duì)細(xì)胞的估計(jì)和每個(gè)細(xì)胞中DNA的“文獻(xiàn)”知識(shí)，可以計(jì)算在細(xì)胞懸浮液中的DNA的總量。

相反，酸提取HPLC方法是估計(jì)細(xì)胞懸浮液中的DNA的總量的直接的化學(xué)的方法。本發(fā)明人建立這個(gè)方法主要證明本發(fā)明對(duì)于從頑強(qiáng)的微生物和孢子中釋放核酸的有效性。該方法(如上詳細(xì)概括的)是基于腺嘌呤從DNA的釋放和腺嘌呤從細(xì)胞的提取，以及然后使用HPLC對(duì)腺嘌呤的檢測(cè)和定量。已知量的腺嘌呤可以從DNA的堿基組成被轉(zhuǎn)換為已知量的DNA。例如，對(duì)于具有48％的GC含量的DNA，從腺嘌呤至DNA的轉(zhuǎn)換因子是10。

這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)對(duì)于CFU和酸提取HPLC方法測(cè)量在枯草桿菌的懸浮液中DNA的能力進(jìn)行了比較。為了估計(jì)CFU，將對(duì)數(shù)期細(xì)菌(生長(zhǎng)于胰蛋白酶大豆液體培養(yǎng)基(TSB))的懸浮液用冷的25mM Tris、150mM NaCl(pH 7.6)的溶液洗滌并且分成2部分。將一個(gè)部分在TSB中系列稀釋(一式三份)，并且涂抹于胰蛋白酶大豆瓊脂板上。在37℃下生長(zhǎng)18小時(shí)后，計(jì)算有生活力的菌落的數(shù)量。將另一部分分到3只管中并離心。將沉淀溶解在200μL的0.2N HCl中，在60℃下孵育60分鐘，用ADA中和并通過(guò)HPLC進(jìn)行分析。

從公布的基因組序列數(shù)據(jù)，采取枯草桿菌的基因組大小為4880ng/10⁹個(gè)細(xì)胞。

表2：標(biāo)準(zhǔn)的CFU方法

表3：酸提取HPLC方法

*AUC，曲線(xiàn)下的面積；**ade，腺嘌呤

CFU和酸提取HPLC方法提供了在枯草桿菌的純培養(yǎng)物中的細(xì)菌計(jì)數(shù)的非常相似的估計(jì)。酸水解HPLC方法提供的估計(jì)高出約20％，該估計(jì)與通過(guò)如上討論的CFU方法的細(xì)胞數(shù)的預(yù)期低估一致。這個(gè)實(shí)例支持了酸提取HPLC方法有效地從細(xì)胞內(nèi)的DNA釋放腺嘌呤，允許用HPLC檢測(cè)它的見(jiàn)解。

實(shí)例1D：與酸提取HPLC方法相比估計(jì)DNA含量的溶菌酶/洗滌劑方法

這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)被設(shè)計(jì)來(lái)比較通過(guò)酶裂解方法從革蘭氏陽(yáng)性(即，溶菌酶敏感)枯草桿菌釋放的DNA量與使用酸提取HPLC方法在完整的細(xì)胞中測(cè)量的DNA量。革蘭氏陽(yáng)性生物體(例如枯草桿菌)已知對(duì)通過(guò)用溶菌酶處理接著用SDS處理的細(xì)胞溶解非常敏感(例如，B.M.·沙西(B.M.Chassy)，用于口腔鏈球菌的細(xì)胞溶解的溫和方法(A gentle method for the lysis of oral streptococci)，生物化學(xué)生物物理學(xué)研究通訊(Biochem Biophys Res Commun)68：603-608(1976))。溶菌酶是通過(guò)攻擊在細(xì)菌(尤其是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌)的細(xì)胞壁中發(fā)現(xiàn)的肽聚糖而起作用的糖苷水解酶。如果酸提取HPLC方法的確有效，通過(guò)全細(xì)胞的酸處理釋放并通過(guò)HPLC檢測(cè)的腺嘌呤的量應(yīng)該與通過(guò)用溶菌酶加SDS溶解細(xì)胞釋放的量相似。

溶菌酶試驗(yàn)方案：

-將枯草桿菌在1mL LB液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期并通過(guò)離心收獲。

-將細(xì)胞在冰冷的TE緩沖液(10mM Tris、1mM EDTA、pH 8.0)中洗滌。將沉淀溶解在1mL TE緩沖液中，分為四個(gè)等分試樣并用TE再洗滌一次。

-將沉淀中的兩份重懸于950μL的溶菌酶(1mg/mL于TE中)中，并在37℃下孵育45分鐘。

-將50μL的10％SDS添加到0.5％的終濃度。

-通過(guò)添加KCl(終濃度0.1M)除去SDS，在0℃下孵育5分鐘并且離心5分鐘。將上清液轉(zhuǎn)移至新的管；丟棄沉淀。

-使樣品經(jīng)受酸提取HPLC方法。

-將剩下的兩份未處理的沉淀溶解在500μL H₂O中并且經(jīng)受酸提取HPLC方法。

表4：酸提取HPLC方法檢測(cè)到在完整的枯草桿菌細(xì)胞中當(dāng)溶菌酶/SDS處理相同的細(xì)胞后被釋放的相同的量的DNA

*重復(fù)樣品

通過(guò)酸處理從完整的枯草桿菌釋放的腺嘌呤的量與通過(guò)溶菌酶/SDS處理(預(yù)計(jì)通過(guò)細(xì)胞的100％溶解釋放100％的DNA的過(guò)程)釋放的腺嘌呤的量基本上相同。這提供了強(qiáng)有力的證據(jù)表明，酸提取HPLC方法是用于確定在完整的、革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞中的DNA的量的非常有效的工具。

實(shí)例1E：與酸提取HPLC方法相比估計(jì)來(lái)自枯草桿菌的DNA含量的珠粒打漿方法

進(jìn)行這項(xiàng)研究是為了比較在完整的細(xì)菌細(xì)胞中DNA的初始量(通過(guò)酸提取HPLC法估計(jì))與使用‘珠粒打漿’方法從相同的細(xì)菌釋放的DNA的量。用于酸提取HPLC的程序如上所描述。用于珠粒打漿方法的程序總結(jié)如下：

-將多個(gè)2mL等分試樣的枯草桿菌穩(wěn)定期培養(yǎng)物通過(guò)離心收集并在25mM Tris、150mM NaCl、pH 7.6(TBS)的冷溶液中通過(guò)離心洗滌兩次。

-根據(jù)制造商的說(shuō)明在一個(gè)微型珠粒打漿機(jī)-16(Mini-BeadBeater-16)(BioSpec公司)進(jìn)行珠粒打漿。簡(jiǎn)而言之，將洗滌的細(xì)菌沉淀懸浮于500μL的TBS中并轉(zhuǎn)移至含有約100μL的100μm的玻璃珠粒(Polyscience公司)的螺旋蓋聚丙烯微型管。

-將管固定到儀器，并且在3,450振動(dòng)/分鐘以?xún)蓚€(gè)1分鐘周期進(jìn)行劇烈攪拌。在周期之間將樣品在冰上冷卻1分鐘。

-將懸浮液轉(zhuǎn)移至1.5mL微型離心管中，并且在微型離心機(jī)中在14,000rpm下通過(guò)離心5分鐘除去未破裂的細(xì)胞和殘骸。

-除去上清液，并且添加HCl至0.2N的終濃度。在60℃下孵育樣品60分鐘。

-為了比較在完整的細(xì)胞中的DNA量與通過(guò)珠粒打漿產(chǎn)生的細(xì)胞裂解物，將完整的枯草桿菌細(xì)胞的等分試樣在0.2N HCl中在60℃下孵育60分鐘(酸提取法)。

-在14,000rpm下將所有樣品離心4分鐘以除去殘骸，并且將40μL的小部分應(yīng)用于反相Gemini-NX柱(菲羅門(mén)公司(Phenomenex))且通過(guò)HPLC進(jìn)行分析。

在圖3中提供了這項(xiàng)研究的結(jié)果。誤差棒代表一式兩份分析的范圍。

盡管人們普遍假定“珠粒打漿”在破壞細(xì)菌細(xì)胞和釋放DNA方面是高效的，這并不一定如此。這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)提供了另外的證據(jù)表明，酸提取HPLC方法比珠粒打漿提供了在初始細(xì)胞懸浮液中的DNA的實(shí)際量的更真實(shí)和更一致的表現(xiàn)。在其他實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)珠粒打漿釋放的DNA的量已經(jīng)達(dá)到100％，即，處于與酸提取方法相等的量。因?yàn)樗峁┝瞬煌慕Y(jié)果，該珠粒打漿方法不是估計(jì)存在于完整的細(xì)菌細(xì)胞的懸浮液中的DNA的量的可靠方法。

實(shí)例2：對(duì)高碘酸鹽與其他過(guò)鹵化和氧化化合物進(jìn)行比較

在這項(xiàng)實(shí)例中，評(píng)估了一系列過(guò)全鹵化和氧化化合物在從細(xì)菌細(xì)胞中釋放核酸的有效性。(間)高碘酸鈉、過(guò)硼酸鈉四水合物、高氯酸鈉、過(guò)硫酸鈉(各為15mM)被用來(lái)處理枯草桿菌營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞(即不是孢子)的懸浮液的等分試樣。在70℃下孵育20分鐘后，有或沒(méi)有測(cè)試化合物的情況下，將每個(gè)懸浮液的上清液級(jí)分(以及未經(jīng)處理的細(xì)菌細(xì)胞)經(jīng)受酸水解HPLC方法，并且計(jì)算了通過(guò)每種處理從細(xì)菌中釋放的DNA的百分比。

實(shí)驗(yàn)方法和材料

-制備的BD緩沖液(2％SDS、5mM Li-CDTA、250mM LiCl、50mM甘氨酸、pH 10.5)。

-對(duì)以下各項(xiàng)測(cè)試化合物在蒸餾水中新鮮制備300mM的儲(chǔ)備溶液：(間)高碘酸鈉(西格瑪-奧德里奇公司(Sigma-Aldrich)，目錄號(hào)S-1878)、過(guò)硼酸鈉四水合物(西格瑪-奧德里奇公司，目錄號(hào)71840)、高氯酸鈉(西格瑪-奧德里奇公司，目錄號(hào)410241)、和過(guò)硫酸鈉(西格瑪-奧德里奇公司，目錄號(hào)216232)。

-通過(guò)將100μL(或?qū)τ陉幮詫?duì)照100μL的水)轉(zhuǎn)移到含有0.8mL的BD緩沖器的五個(gè)管來(lái)制得來(lái)自上述步驟的各個(gè)儲(chǔ)備溶液的10倍稀釋液。

-工作測(cè)試溶液。將水(100μL)添加到每個(gè)管使各儲(chǔ)備溶液的終濃度在80％BD緩沖液中達(dá)到30mM的終濃度。

-從等體積的穩(wěn)定期的枯草桿菌懸浮液中制備洗滌的沉淀。

-將每份沉淀懸浮在300μL的水中。

-將等體積(300μL)的每種工作測(cè)試溶液(即，在80％BD緩沖液或水(陰性對(duì)照)中的30mM(間)高碘酸鈉、過(guò)硼酸鈉四水合物、高氯酸鈉、或過(guò)硫酸鈉)添加到每個(gè)細(xì)菌懸浮液并混勻。

-將混合物在70℃下加熱20分鐘。

-加熱后，每個(gè)混合物在14,000rpm下離心4分鐘。保留上清液。丟棄不溶性物質(zhì)的沉淀。

-將鹽酸添加到上清液級(jí)分至0.2N的終濃度。

-將混合物在60℃下加熱60分鐘。

-將每個(gè)樣品的150μL等分試樣用100μL的ADA緩沖液(pH 8.0)中和。

-然后每個(gè)樣品通過(guò)HPLC進(jìn)行分析來(lái)確定腺嘌呤的AUC。使未經(jīng)處理的細(xì)胞(步驟5)的三份洗滌的沉淀直接經(jīng)受酸水解HPLC方法以確定在每份細(xì)菌沉淀中的DNA(腺嘌呤)的總量。

結(jié)果

結(jié)果總結(jié)在如下表5中：

表5.比較由過(guò)全鹵化和氧化化合物從枯草桿菌釋放的DNA。

結(jié)論

在單一濃度(15mM)的測(cè)試的4種化合物中，只有(間)高碘酸鈉和過(guò)硫酸鈉釋放了比對(duì)照更多的DNA：分別從枯草桿菌釋放了44％和15％的總DNA。相反，其他過(guò)全鹵化/氧化化合物沒(méi)有釋放比對(duì)照更多的DNA(6.7％)。

這項(xiàng)實(shí)例證明，過(guò)硫酸鹽也可以類(lèi)似于高碘酸鹽的方式起到增加核酸釋放的作用。

實(shí)例3：pH在高碘酸鹽提取中的作用

在跨越一系列pH值測(cè)試NPI((間)高碘酸鈉)的有效性和劑量依賴(lài)性中，有必要考慮各種因素，包括(i)NPI與緩沖液本身的可能反應(yīng)(ⅱ)在不同的pH值可能存在NPI的不同形式(例如，偏高碘酸鹽、鄰高碘酸鹽)和(iii)NPI在升高的pH值下具有降低的溶解度。

對(duì)于這些研究，使用了一個(gè)緩沖液系統(tǒng)，該緩沖液系統(tǒng)包括3個(gè)不同的覆蓋一系列pKa值的緩沖弱酸并用單堿調(diào)節(jié)到所需的pH。酸(pKa值)是磷酸(2.15、7.20、12.38)、醋酸(4.76)和硼酸(9.24)。結(jié)合酸的初始溶液(各為20mM)具有pH 1.9(表6)(在此被稱(chēng)為“PAB”緩沖溶液)。PAB緩沖溶液用5N NaOH調(diào)節(jié)以達(dá)到所需的pH值用于實(shí)驗(yàn)(表7)。

在pH 3.7、5.5、7.4和9.4的PAB緩沖溶液?jiǎn)为?dú)測(cè)試和與在三種不同的濃度(最終6、12和18mM)的NPI聯(lián)合測(cè)試。將有或沒(méi)有NPI的緩沖液添加至洗滌的恥垢分枝桿菌的沉淀。對(duì)三種不同濃度的NPI進(jìn)行了測(cè)試以確定在這個(gè)濃度范圍內(nèi)對(duì)于從細(xì)菌細(xì)胞中釋放DNA是否存在劑量反應(yīng)。因此，恥垢分枝桿菌細(xì)胞用含有不同濃度的NPI的在一定范圍的pH值內(nèi)的PAB緩沖溶液加熱以測(cè)量使用在此所述的酸提取HPLC方法釋放的DNA的量。

PAB緩沖溶液

混合在表6中列出的成分，并且將所得的混合物攪拌過(guò)夜以允許硼酸完全溶解。初始pH測(cè)量為1.9。

表6.PAB緩沖體系的組成

表7.PAB緩沖系統(tǒng)溶液的最終pH值

制備后，該P(yáng)AB緩沖溶液儲(chǔ)存在4℃。

實(shí)驗(yàn)方法

新鮮工作溶液(PAB緩沖溶液±NPI)的制備是通過(guò)(分別)添加0、20、40或60μL的300mM NPI儲(chǔ)備(在水中)至1,000、980、960或940μL的每個(gè)PAB緩沖溶液。工作溶液在制備的3小時(shí)內(nèi)使用。

洗滌的沉淀從恥垢分枝桿菌的均勻分布的、洗滌的懸浮液中制備(其中，水用于最后一次洗滌)。

將每份沉淀懸浮在200μL的PAB緩沖溶液±NPI(最終6、12和18mM)中，一式三份。將所得的混合物在70℃下加熱20分鐘。

將該混合物在14,000rpm下離心4分鐘。保留上清液并丟棄不溶性物質(zhì)的沉淀。

將HCl添加到上清液級(jí)分至0.2N的最終濃度，在60℃下，將酸化級(jí)分加熱60分鐘。

每150μL樣品用100μL的ADA緩沖液(N-(2-乙酰氨基)亞氨基二乙酸)(pH 8.0)中和。然后樣品通過(guò)HPLC進(jìn)行分析。

結(jié)果

將結(jié)果總結(jié)于下面的表8和表9中。

表8.在來(lái)自用NPI處理的恥垢分枝桿菌的上清液中的作為pH的函數(shù)的DNA釋放*

*在分析使用在此所述的酸提取HPLC方法釋放的DNA之前，用和不用6、12和18mM NPI(最終)在指示的pH和加熱下用PAB緩沖溶液處理細(xì)菌。顯示了每個(gè)重復(fù)分析的結(jié)果。

**對(duì)于腺嘌呤的AUC(曲線(xiàn)下面積)是在指定的pH下通過(guò)所指示的處理釋放的并通過(guò)HPLC測(cè)量的DNA的量的量度。

***釋放的DNA的百分比是從對(duì)于在每個(gè)pH條件和NPI的濃度下釋放到上清液中的腺嘌呤的平均的AUC，除以從未處理的細(xì)菌中酸提取的腺嘌呤的平均量計(jì)算出的(表9)。

表9.在表8的實(shí)驗(yàn)中使用的3個(gè)重復(fù)的恥垢分枝桿菌細(xì)胞的沉淀中的DNA的量。

**對(duì)于腺嘌呤的AUC(曲線(xiàn)下面積)，在未處理的細(xì)胞的沉淀存在的DNA的量的量度。

結(jié)論

使用3組分緩沖系統(tǒng)來(lái)證明對(duì)NPI介導(dǎo)的從恥垢分枝桿菌釋放DNA的pH依賴(lài)效應(yīng)。在沒(méi)有NPI的情況下，在70℃下在20分鐘的孵育過(guò)程中從恥垢分枝桿菌釋放了2.1-11.5％的DNA。與此相反，向緩沖溶液中添加甚至很低濃度的NPI(6mM)以pH依賴(lài)性的方式顯著地增加從相同的微生物釋放的總DNA約9倍至37.4-59.4％。驚奇地，NPI的濃度從6mM增加至12mM甚至18mM僅導(dǎo)致DNA從細(xì)菌適度額外的釋放；這僅在中性和堿性pH值下觀(guān)察到。

實(shí)例4：使用高碘酸鹽從孢子的核酸釋放

枯草桿菌是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，可從生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)改變到非常頑強(qiáng)的非分裂孢子，允許生物體在極端的環(huán)境條件下生存。通常，孢子非常耐熱(能夠在100℃下存活幾個(gè)小時(shí))、干燥、UV輻射和氧化劑。孢子形成基本上是由營(yíng)養(yǎng)素的缺乏引起的。細(xì)菌以不對(duì)稱(chēng)的方式分裂導(dǎo)致單個(gè)內(nèi)生孢子的形成，該內(nèi)生孢子包含由一個(gè)非常頑強(qiáng)的外壁包圍的細(xì)菌的基因組DNA。在這種狀態(tài)下，細(xì)菌可以處于休眠、但有生活力的狀態(tài)下持續(xù)延長(zhǎng)的時(shí)間，甚至上百年。在有利的環(huán)境條件下，內(nèi)生孢子可以重新被激活并恢復(fù)到生長(zhǎng)的(營(yíng)養(yǎng)的)狀態(tài)。

細(xì)菌孢子被認(rèn)為是在最難破開(kāi)的細(xì)胞類(lèi)型之中。破壞營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的一般抗菌劑，例如家庭消毒劑(如乙醇、洗滌劑、季銨化合物)不殺死內(nèi)生孢子。孢子外殼對(duì)溶菌酶不敏感。在這個(gè)實(shí)例中，證明了(間)高碘酸鈉對(duì)于從枯草桿菌孢子中釋放核酸的效力。

孢子的制備

枯草桿菌的單個(gè)菌落在軌道平臺(tái)搖床上以200rpm于37℃下在2mL盧里亞(Luria)液體培養(yǎng)基(LB)中生長(zhǎng)過(guò)夜。通過(guò)以11000rpm離心3分鐘收獲細(xì)菌(1mL)；丟棄上清液。細(xì)菌通過(guò)在1mL冷的無(wú)菌H₂O中離心洗滌兩次以除去殘留的LB。

為了將營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)換為孢子，將細(xì)菌懸浮于200μL H₂O中并添加到100mL的含有0.1mM氯化錳的哥倫比亞液體培養(yǎng)基中[J.A.·莫雷洛(J.A.Morello)和P.D.·艾爾納(P.D.Ellner)，1969，用于血液培養(yǎng)的新培養(yǎng)基(New medium for blood cultures)，應(yīng)用微生物學(xué)(Appl.Microbiol.)17：68-07]。

將混合物在軌道平臺(tái)上以160rpm在37℃下振蕩72小時(shí)以產(chǎn)生大約每毫升10⁸個(gè)孢子。孢子通過(guò)離心收獲并懸浮于15％乙醇的水中。

在使用之前，每個(gè)孢子樣品用冰冷的水洗滌三次。

為了消除任何剩余的營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌，將沉淀物懸浮在1mL冷水中。添加溶菌酶溶液(在Tris(10mM)、EDTA(1mM)中的400μL的5mg/mL儲(chǔ)備溶液)，并且將所得混合物在37℃下孵育1小時(shí)。孢子通過(guò)離心收集，并且丟棄上清液。

將孢子沉淀懸浮于1mL的0.1％SDS中并且在室溫下孵育5分鐘。孢子沉淀通過(guò)以9000rpm離心4分鐘收集；丟棄上清液。

為了除去制備中的任何殘留的無(wú)細(xì)胞DNA，將孢子懸浮于含有10μg胰DNA酶的1mL的1X DNA酶緩沖液(10mM Tris-HCl、4mM MgCl₂、1mM CaCl₂)，并在37℃下孵育30分鐘。

將孢子懸浮液在9,000rpm離心4分鐘并且棄去上清液。將沉淀用水洗滌一次。將高度純化的孢子沉淀再懸浮于1.2mL H₂O中。這種制備(800μL)的大多數(shù)被用于在下面的實(shí)驗(yàn)方法的步驟2中；其他三個(gè)100μL的等分試樣用酸提取HPLC方法(步驟5-8，以下)直接進(jìn)行處理以估計(jì)孢子的總DNA含量；孢子懸浮液的剩余100μL的等分試樣用溶菌酶和SDS進(jìn)行第二次處理(步驟9和10，以上)以確認(rèn)從孢子釋放的DNA不是由于轉(zhuǎn)化成營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)的細(xì)胞。然后進(jìn)行酸提取/HPLC分析。

DNA提取

用和不用(間)高碘酸鈉來(lái)制備試劑BA、BB、BC和BD(表10)。

懸浮的枯草桿菌孢子(來(lái)自以上步驟)的等分試樣(100μL)與等體積的具有或不具有(間)高碘酸鈉的BA、BB、BC或BD混合。將該混合物在70℃下加熱20分鐘，然后在14,000rpm下離心4分鐘。保留上清液并丟棄不溶性物質(zhì)的沉淀。

將鹽酸添加到上清液級(jí)分至0.2N的終濃度，然后將級(jí)分在60℃下加熱60分鐘。每個(gè)樣品(150μL)的一小部分用100μL的ADA緩沖液(pH 8.0)中和。該樣品通過(guò)HPLC進(jìn)行分析以確定對(duì)于腺嘌呤的AUC。

表10.使用的試劑組成

表11.在不同試劑中的高碘酸鹽對(duì)從在70℃下處理20分鐘的孢子的DNA釋放的有效性，如使用酸提取HPLC方法測(cè)量的*

*在分析使用在此所描述的酸提取HPLC方法釋放的DNA之前，用和不用15mM(間)高碘酸鈉(終濃度)在指示的pH和加熱(70℃，20分鐘)下用試劑(表10)處理枯草桿菌孢子。顯示了一式三份分析的結(jié)果。

**對(duì)于腺嘌呤的AUC(曲線(xiàn)下面積)是通過(guò)所指示的處理從孢子釋放到上清液中并通過(guò)HPLC測(cè)量的DNA的量。

***從孢子釋放的DNA的百分比是從在每個(gè)處理?xiàng)l件下釋放到上清液中的腺嘌呤的平均AUC，除以從未處理的孢子中酸提取的腺嘌呤的平均量計(jì)算出的。

結(jié)論

驚奇地，于BAP和BDP試劑中存在低濃度的(間)高碘酸鈉連同適度的加熱處理(70℃，20分鐘)能分別從孢子(最頑強(qiáng)的生物體)釋放多達(dá)10％和8.3％的DNA。較高的溫度和較長(zhǎng)的處理時(shí)間預(yù)計(jì)將釋放更多的DNA。在沒(méi)有釋(間)高碘酸鈉的情況下，不能檢測(cè)到DNA的釋放。

實(shí)例5：使用高碘酸鹽從真菌的核酸釋放

酵母是單細(xì)胞真核微生物，歸類(lèi)于真菌界。酵母的一個(gè)物種釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)已被廣泛使用了數(shù)千年并用于眾多應(yīng)用中。在發(fā)酵過(guò)程中，釀酒酵母能將簡(jiǎn)單碳水化合物代謝為CO₂(二氧化碳)和酒精(乙醇)。CO₂被用作烘焙中的發(fā)酵劑并且乙醇被用作酒精飲料的主要成分。最近，生物技術(shù)行業(yè)利用酵母將糖轉(zhuǎn)化為乙醇，用作生物燃料。一些酵母菌株已經(jīng)被用于生物降解的領(lǐng)域。釀酒酵母是研究最徹底的真核微生物之一，并且它仍然是遺傳和細(xì)胞生物學(xué)研究中的重要有機(jī)體。

盡管細(xì)菌通常具有由肽聚糖組成的細(xì)胞壁，真菌具有包含葡糖胺聚合物、幾丁質(zhì)的細(xì)胞壁。大多數(shù)真正的真菌具有細(xì)胞壁，該細(xì)胞壁由三層組成：幾丁質(zhì)、其他多糖(酵母聚糖)和甘露糖蛋白。(http://en.wikipedia.org/wiki/Cell_wall-cite_note-11)在這個(gè)實(shí)例中，釀酒酵母為發(fā)明者擔(dān)任來(lái)自真菌界的模式微生物，以測(cè)試NPI((間)高碘酸鈉)對(duì)于核酸(DNA和RNA兩者)的釋放的功效。

實(shí)驗(yàn)方法

用和不用(間)高碘酸鈉來(lái)制備試劑BA、BB、BC和BD(參見(jiàn)表10)。

釀酒酵母(弗萊希曼(Fleischmann’s)的面包酵母)的培養(yǎng)物通過(guò)在37℃下用具有50mM的葡萄糖胰蛋白酶大豆液體培養(yǎng)基生長(zhǎng)過(guò)夜來(lái)制備。細(xì)胞從6mL培養(yǎng)物通過(guò)在8,000rpm離心3分鐘來(lái)收集。細(xì)胞沉淀用冷PBS通過(guò)離心洗滌一次，懸浮于冷的PBS中，分配到10只管中，離心并將得到的沉淀用冷水再次洗滌。

將每份洗滌的沉淀再懸浮于200μL水中，并與等體積的具有或不具有NPI(最終15mM)的BA、BB、BC和BD試劑混合。將該懸浮液在70℃下加熱20分鐘，并且然后冷卻至室溫。將懸浮液在14,000rpm離心4分鐘；將澄清的上清液轉(zhuǎn)移至新的管并且丟棄沉淀。

將每種上清液的10μL的一個(gè)部分在0.8％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，并且用溴化乙錠染色以可視化DNA和RNA。

向上清液級(jí)分的剩余部分添加HCl至0.2N的終濃度。將樣品在60℃下加熱60分鐘。然后將150μL的每個(gè)樣品用100μL的ADA緩沖液(pH 8.0)中和。

中和的樣品(40μL)通過(guò)HPLC進(jìn)行分析并且確定腺嘌呤的AUC。

結(jié)果與討論

通過(guò)具有或不具有高碘酸鹽的不同組合物處理從釀酒酵母釋放的DNA

下表12所示的結(jié)果證明了本發(fā)明的幾個(gè)特征。

釀酒酵母，一種頑強(qiáng)的單細(xì)胞微生物，出乎意料地對(duì)通過(guò)(間)高碘酸鈉的DNA釋放敏感。相比在水(BC)中相同的熱處理，單獨(dú)在水中接近中性pH的(間)高碘酸鈉(BCP)在70℃下處理20分鐘后釋放了4倍以上的DNA(表12)。

添加高濃度的SDS(1-2％終濃度)和/或LiCl(125mM)和/或較高pH和/或螯合劑CDTA(2.5-25mM)增加了更多釋放的DNA的量(表12)。有趣的是，在相同的條件下在沒(méi)有(間)高碘酸鈉的情況下釋放的DNA的量并不受新型試劑的這些次級(jí)組份的影響(表12)。

如從文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)所預(yù)期的，相比DNA，酵母含有大量的RNA，其可以通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳看出(圖4)。清楚的強(qiáng)烈的核糖體RNA(rRNA)帶可以在使用試劑BA和BD沒(méi)有(間)高碘酸鈉處理的樣本中可以看出；當(dāng)添加(間)高碘酸鈉時(shí)更多的RNA似乎被釋放(BAP、BDP)，但RNA被部分降解。在這些實(shí)驗(yàn)中沒(méi)有嘗試通過(guò)處理?xiàng)l件穩(wěn)定從釀酒酵母釋放的RNA。

采用硼酸鹽緩沖的BB以及BBP釋放大量的RNA，但在兩種情況下RNA明顯被降低(圖4)。在所有情況下，相比RNA的量，在凝膠上只看到少量的高分子量DNA(圖4)。

表12.使用酸提取/HPLC方法來(lái)測(cè)量腺嘌呤的AUC時(shí)含有高碘酸鹽的試劑對(duì)DNA從釀酒酵母中釋放的影響*

*在表10中提供了組合物的詳細(xì)信息。

結(jié)論

這項(xiàng)研究表明，相對(duì)于不具有高碘酸鹽的相同試劑，DNA和RNA兩者從釀酒酵母(具有堅(jiān)固細(xì)胞壁的原始真核微生物)的釋放可以通過(guò)用含有高碘酸鈉的試劑處理來(lái)大大增強(qiáng)。在一些含有高碘酸鹽的試劑中，提取了高分子量的DNA和RNA，如使用瓊脂糖凝膠電泳查看從釀酒酵母釋放的DNA和RNA所示。

實(shí)例6：在各種試劑正高碘酸鹽和加熱處理對(duì)核酸從枯草桿菌和恥垢分枝桿菌中釋放的影響

在這個(gè)實(shí)例中，溫度(室溫、50℃、70℃、80℃和100℃)和在幾個(gè)組合物中的(間)高碘酸鈉(15mM終濃度)(表10)的影響，使用兩種不同的靶標(biāo)微生物(枯草桿菌和恥垢分枝桿菌)來(lái)進(jìn)行評(píng)估。核酸從這些微生物的釋放，使用酸提取HPLC方法、實(shí)時(shí)PCR和瓊脂糖凝膠電泳來(lái)進(jìn)行評(píng)估。

枯草桿菌是通常在土壤和植被中發(fā)現(xiàn)的一種頑強(qiáng)的細(xì)菌；它被廣泛用于研究實(shí)驗(yàn)室研究。細(xì)胞是革蘭氏陽(yáng)性的桿狀，并具有由肽聚糖(胞壁質(zhì))、糖和氨基酸的聚合物構(gòu)成的剛性細(xì)胞壁。在不利的環(huán)境條件下，它可以形成堅(jiān)韌的、保護(hù)性孢子，其能夠存活于極端條件。

分枝桿菌是可由染色技術(shù)鑒定為抗酸的桿狀細(xì)菌。在土壤中發(fā)現(xiàn)的一些物種被認(rèn)為是良性的。其他種類(lèi)對(duì)于人類(lèi)和其他哺乳動(dòng)物是嚴(yán)重的病原體和肺結(jié)核(TB)的致病物，肺結(jié)核是在世界的許多地方的毀滅性的疾病。世界衛(wèi)生組織(WHO)估計(jì)，2010年TB感染的發(fā)病率在一些非洲國(guó)家高達(dá)1000/10萬(wàn)人口。TB和HIV的雙重感染是特別致命的組合。越來(lái)越多的關(guān)注的原因是TB的廣泛耐藥(XDR)菌株，這些菌株構(gòu)成了重要的人類(lèi)健康問(wèn)題。

分枝桿菌物種共享特有的堅(jiān)韌細(xì)胞壁，該細(xì)胞壁包含稱(chēng)為霉菌酸的蠟狀材料，該材料使得微生物非常疏水。細(xì)胞壁由霉菌酸層、肽聚糖層和多糖(阿拉伯半乳聚糖)構(gòu)成?？顾崛旧男再|(zhì)是由于霉菌酸層。盡管革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌通常對(duì)溶菌酶是敏感的，并不知攻擊分枝桿菌的細(xì)胞壁的這樣的酶。從這個(gè)物種有效地釋放DNA的所有目前的方法都需要某種形式的機(jī)械破壞。

目前描述的方法，完全避免了復(fù)雜的機(jī)械破碎的步驟，對(duì)其從這些種類(lèi)的微生物釋放DNA的能力進(jìn)行了評(píng)估。

實(shí)驗(yàn)方法

將枯草桿菌在胰蛋白酶大豆液體培養(yǎng)基中于37℃下生長(zhǎng)過(guò)夜。過(guò)夜培養(yǎng)物的等分試樣(100μL)用于接種40mL的胰蛋白酶大豆液體培養(yǎng)基，并在37℃的搖動(dòng)平臺(tái)生長(zhǎng)直到對(duì)數(shù)期。恥垢分枝桿菌在胰蛋白酶大豆瓊脂上于37℃下生長(zhǎng)3天并且通過(guò)刮擦收獲至冷的H₂O中。

枯草桿菌和恥垢分枝桿菌各自通過(guò)在2,700g離心15分鐘來(lái)收集；丟棄上清液。細(xì)菌沉淀用冷的H₂O通過(guò)在2,700g離心15分鐘洗滌2次并且丟棄上清液。將洗滌的細(xì)菌沉淀重懸浮于15mL冷的H₂O中。

每個(gè)細(xì)菌懸浮液的3個(gè)等分試樣(每個(gè)300μL)直接用酸提取HPLC方法進(jìn)行處理以確定在這些細(xì)胞中的總核酸含量。

將各細(xì)菌懸浮液的剩余部分分成1.5mL樣品等分試樣，然后與等體積的BA、BB、BC或BD試劑(表10)之一，其中具有和不具有(間)高碘酸鈉(在試劑中為30mM，最終為15mM)，混合。

每個(gè)3mL等分試樣均等地(600μL)分到5只微型離心管，并且在室溫、50℃、70℃、80℃或100℃孵育20分鐘。將管在14,000rpm下離心5分鐘。將澄清的上清液轉(zhuǎn)移到新的管并且丟棄沉淀。將每個(gè)上清液的等分試樣(190μL)除去用于通過(guò)酸提取HPLC方法如下一式三份直接進(jìn)行分析(表13和表14)：

將鹽酸添加到上清液級(jí)分至0.2N的終濃度，將級(jí)分在60℃下加熱60分鐘。將每個(gè)級(jí)分的等分試樣(150μL)用100μL的ADA緩沖液(pH 8.0)中和。所得的樣品通過(guò)HPLC進(jìn)行分析并且確定腺嘌呤的AUC。

將來(lái)自每個(gè)剩余的上清液級(jí)分的350μL樣品除去，并且在50℃下與蛋白酶K(160μg)一起孵育1小時(shí)。

將10μL各處理的上清液級(jí)分在1.0％瓊脂糖凝膠上在100V下電泳40分鐘，用1Kb⁺DNA梯度作為標(biāo)記；將凝膠用溴化乙錠(1μg/μL)染色10分鐘，并且將DNA和RNA在UV透照下可視化/拍照(圖5和6)。

將氯化鈉(0.1M終濃度)添加到具有BC和BCP化學(xué)品的管。將兩體積的95％冷乙醇添加到所有的管，然后在-20℃下孵育30分鐘以沉淀核酸。將管在13,000rpm下離心，并且將沉淀小心地用冷的70％乙醇沖洗一次。

將沉淀風(fēng)干并溶解于90μL減小的TE(10mM Tris、0.1mM EDTA，pH 8.0)中。將各個(gè)溶解的沉淀的2μL部分與‘通用的’細(xì)菌16S核糖體DNA引物(BacrRNA173-F5’ATTACCGCGGCTGCTGG3’和BacrRNA173-R5’CCTACGGGAGGCAGCAG3’)一起添加到25μL的PCR反應(yīng)，以通過(guò)定量實(shí)時(shí)PCR(qPCR)來(lái)估計(jì)對(duì)于每個(gè)測(cè)試條件的從枯草桿菌和恥垢分枝桿菌釋放的DNA的量(表15和16)。每個(gè)PCR反應(yīng)包括2.5μL的1mg/mL牛血清白蛋白(BSA)、2.5μL的10x PCR緩沖液、1.25μL的50mM MgCl₂、0.5μL的10mMdNTPs、0.5μL的10pMol正向引物、0.5μL的10pMol反向引物、0.5μL的0.5μM Syto9、0.2μL的5U/μL Taq聚合酶、12.3μL的水。來(lái)自枯草桿菌和恥垢分枝桿菌的高度純化的DNA充當(dāng)PCR分析的參考。陰性對(duì)照包括在其中沒(méi)有添加模板DNA的反應(yīng)。Ct值是指在擴(kuò)增曲線(xiàn)穿過(guò)檢測(cè)的閾值的點(diǎn)的部分循環(huán)數(shù)。轉(zhuǎn)子基因(Rotorgene)儀器軟件設(shè)定閾值線(xiàn)，并且計(jì)算各樣品的Ct值。Ct值與樣品中的DNA的量成反比；一個(gè)Ct值的減小對(duì)應(yīng)于檢測(cè)出的DNA的量加倍。

結(jié)果與討論

結(jié)果顯示于表13、14、15和16中，和圖5和6中。

表13.在不同試劑中的高碘酸鹽對(duì)從在增加的溫度下處理20分鐘的枯草桿菌的DNA釋放的影響，如使用酸提取HPLC方法測(cè)量的

*從營(yíng)養(yǎng)的枯草桿菌釋放的DNA的百分比是從在每個(gè)處理?xiàng)l件下釋放到上清液中的腺嘌呤的平均AUC，除以從未處理的細(xì)菌中酸提取的腺嘌呤的平均量計(jì)算出的。

**超過(guò)100％的值表明參考樣品(從未經(jīng)處理的細(xì)菌沉淀中經(jīng)酸提取的腺嘌呤的平均量)稍微低估了存在的DNA的總量。

表14.在不同試劑中的高碘酸鹽對(duì)從在增加的溫度下處理20分鐘的恥垢分枝桿菌的DNA釋放的影響，如使用酸提取HPLC方法測(cè)量的

*從營(yíng)養(yǎng)的恥垢分枝桿菌釋放的DNA的百分比是從在每個(gè)處理?xiàng)l件下釋放到上清液中的腺嘌呤的平均AUC，除以從未處理的細(xì)菌中酸提取的腺嘌呤的平均量計(jì)算出的。

關(guān)于圖5，其顯示通過(guò)高碘酸鹽和80℃(A)或70℃(B)的加熱步驟DNA和RNA從枯草桿菌釋放到上清液中，高分子量(>23kb)DNA帶的強(qiáng)度在所有情況下因?yàn)楦叩馑猁}的存在顯著地增加了，除了一種情況，BBP在80℃下(小圖A)。后者可能是由于導(dǎo)致DNA在其從細(xì)胞釋放后在一些點(diǎn)丟失了的誤差，因?yàn)樵?0℃下處理的相同樣品表現(xiàn)出強(qiáng)烈的DNA帶(小圖B)。在所有條件下處理后存在完整的或基本完整的核糖體RNA，除了BB和BBP。

參見(jiàn)圖6，其顯示通過(guò)高碘酸鹽和70℃的加熱步驟DNA和RNA從恥垢分枝桿菌釋放到上清液中，高分子量(>23kb)DNA帶的強(qiáng)度在所有情況下因?yàn)楦叩馑猁}的存在顯著地增加了。相比枯草桿菌，釋放的RNA的量較少并且它更廣泛地被降解。

表15.使用qPCR定量通過(guò)高碘酸鹽和增加的溫度從枯草桿菌釋放到上清液中的DNA

表16.使用實(shí)時(shí)PCR定量通過(guò)高碘酸鹽和增加的溫度從恥垢分枝桿菌釋放到上清液中的DNA

在表15和16中給出的結(jié)果顯示高碘酸鹽降低了Ct值(即，提取更多的DNA)，從用BA、BB、和BD試劑處理的，但不是BC試劑(水)處理的，并在50℃、70℃和80℃下孵育20分鐘的營(yíng)養(yǎng)的枯草桿菌和恥垢分枝桿菌兩者。重要的是，用高碘酸鹽和加熱處理釋放的DNA的質(zhì)量是適合于隨后通過(guò)實(shí)時(shí)PCR分析進(jìn)行的擴(kuò)增和鑒定。使用在100℃加熱重復(fù)該研究并證明了成功的DNA提?。蝗欢?，qPCR結(jié)果被DNA在100℃下變性且不可被熒光染料定量的事實(shí)復(fù)雜化。

一些樣品在高碘酸鹽處理后沒(méi)能顯示更低的Ct值，很可能是由于可變的或較差效率的乙醇沉淀步驟。在這些實(shí)驗(yàn)中，在qPCR可以進(jìn)行之前需要該步驟來(lái)除去抑制劑。當(dāng)用乙醇沉淀之前相同的樣品通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析時(shí)(圖5和6)，在每種情況下可以看到從用高碘酸鹽處理的樣品釋放的DNA的量明顯增加。

結(jié)論

三種不同的方法(酸提取HPLC、瓊脂糖凝膠電泳和qPCR)已經(jīng)被用于證明由本發(fā)明的化學(xué)方法從微生物釋放核酸的有效性，該微生物包括已知抵抗標(biāo)準(zhǔn)的核酸提取方法的那些。本發(fā)明的方法是特別有價(jià)值的，因?yàn)樗灰髽悠返臋C(jī)械破碎或沸騰。高碘酸鹽以溫度依賴(lài)的方式明顯增加從枯草桿菌和恥垢分枝桿菌中釋放的DNA和RNA的量。

實(shí)例7：在各種試劑正高碘酸鹽和加熱處理對(duì)核酸從摻入恥垢分枝桿菌的唾液樣品中釋放的影響

在這個(gè)實(shí)例中，溫度(70℃)和添加至幾個(gè)組合物(表10)正(偏)高碘酸鈉(15mM終濃度)的影響，用被摻入人唾液中的‘活的’恥垢分枝桿菌的已知量來(lái)進(jìn)行評(píng)估，以模擬復(fù)雜的生物標(biāo)本的條件。從在復(fù)雜的樣品中的這個(gè)微生物的核酸釋放，使用酸提取HPLC方法和采用恥垢分枝桿菌特異性引物的實(shí)時(shí)PCR來(lái)進(jìn)行評(píng)估。

前面的實(shí)例處理了純的培養(yǎng)物并洗滌了細(xì)菌和真菌的沉淀。然而，大多數(shù)的生物標(biāo)本或樣品的組合物是高度復(fù)雜的，并且包含大量的樣品特有的、潛在的干擾物質(zhì)以及宿主細(xì)胞和微生物物種。例如，除了大量的水，唾液(和痰)包含許多其他物質(zhì)，例如，電解質(zhì)、粘液、許多酶、抗菌化合物和細(xì)胞(人類(lèi)和微生物起源的)。特別地，唾液包含大量的粘蛋白，該蛋白是具有多糖側(cè)鏈的蛋白質(zhì)。鑒于高碘酸鹽主要攻擊和打開(kāi)糖環(huán)，本發(fā)明人關(guān)注到高碘酸鹽(尤其是在發(fā)現(xiàn)可有效地從洗滌的微生物沉淀中釋放DNA的較低濃度下)，可能通過(guò)與存在于唾液中過(guò)剩的多糖反應(yīng)而被消耗，而不是可用來(lái)攻擊樣品中感興趣的細(xì)菌/真菌的細(xì)胞壁。這個(gè)實(shí)例被設(shè)計(jì)來(lái)證明高碘酸鹽在從復(fù)雜的生物樣品中的微生物中釋放核酸的有效性。還有，在人DNA和口腔細(xì)菌DNA的存在下，對(duì)摻入的生物體(恥垢分枝桿菌)的特異性檢測(cè)進(jìn)行了評(píng)估。

實(shí)驗(yàn)方法和材料

-通過(guò)交替向15只管子中吐痰來(lái)收集六個(gè)1mL唾液樣品。緊接其后，如下向每只管添加三種不同的緩沖液(1mL)中的一種：2只管包含BA試劑，2只管包含BB試劑，并且其余2只管包含BD試劑(表10)。

-大約10⁹個(gè)恥垢分枝桿菌的懸浮液通過(guò)離心在1mL冷的PBS(pH 7.4)中洗滌兩次，然后懸浮于0.5mL PBS中。

-將100μL的各個(gè)細(xì)菌懸浮液添加到一組含有BA、BB或BD試劑的管；將100μL的PBS添加到第二組管。樣品通過(guò)渦旋簡(jiǎn)單混合。使另一個(gè)100μL的細(xì)菌懸浮液(一式兩份)經(jīng)受酸提取HPLC方法以準(zhǔn)確地定量在具有三種緩沖液中的一種的每個(gè)唾液等分試樣中摻入的恥垢分枝桿菌DNA的量。使用已知濃度的腺嘌呤標(biāo)準(zhǔn)和已知67.5％GC含量的恥垢分枝桿菌DNA來(lái)將腺嘌呤的量轉(zhuǎn)換成DNA的量，已確定100μL的細(xì)菌懸浮液含有2366ng的恥垢分枝桿菌DNA。沒(méi)有預(yù)期100％的DNA產(chǎn)率，因?yàn)樘崛〔襟E隨后是純化步驟，例如，乙醇沉淀(下文描述)，其不是100％有效的。

-將10μL的蛋白酶K(89μg/mL終濃度)添加到每個(gè)管并將這些管在50℃下孵育過(guò)夜。

-從每個(gè)管將一個(gè)200μL等分試樣轉(zhuǎn)移到新的管，并與10μL的300mM(間)高碘酸鈉混合。

-來(lái)自每個(gè)管的第二個(gè)200μL的等分試樣轉(zhuǎn)移至新管。

-所有等分試樣在70℃下孵育20分鐘，然后在室溫下冷卻3分鐘。

-將Tris-HCl(1M，pH 7.1)添加至每個(gè)等分試樣至100mM的終濃度，并且在室溫下孵育15分鐘。

-將醋酸鉀(3M，pH 5.5)添加至每個(gè)等分試樣至150mM的終濃度，并且在冰上孵育10分鐘。

-將等分試樣在14,000rpm離心3.5分鐘。將上清液取出并轉(zhuǎn)移到新管；丟棄沉淀。

-將兩體積的室溫95％乙醇添加至每個(gè)等分試樣，并在室溫下孵育15分鐘。

-將等分試樣在14,000rpm離心3.5分鐘。

-小心地從每個(gè)等分試樣除去乙醇并且將DNA沉淀溶解于50μL的TE(pH7.5)。將一部分再溶解的沉淀稀釋5倍，并且將5μL稀釋的等分試樣作為模板添加至含有恥垢分枝桿菌基因特異的DNA引物的25μL的qPCR反應(yīng)[HP-正向：TGCCATCATCAGCGAAGTAG；HP-反向：GCGGCTACAGATTACGAAGC]。預(yù)期的產(chǎn)物是編碼恥垢分枝桿菌菌株MC2155的‘假定蛋白MSMEI_2098’的基因的250bp的區(qū)域。這個(gè)引物被用來(lái)通過(guò)定量PCR(qPCR)評(píng)估在將這個(gè)微生物摻入唾液樣品后從這個(gè)微生物釋放的DNA的量。具體的條件在表17中列出。qPCR反應(yīng)也包括2.5μL的1mg/mL牛血清白蛋白(BSA)、2.5μL的10x PCR緩沖液、1.0μL的50mM MgCl₂、0.5μL的10mM dNTPs以及0.5μL的10pMol正向引物、0.5μL的10pMol如上所述的反向引物、0.5μL的0.5μM Syto 9、0.2μL的5U/μL Taq聚合酶、11.85μL的水。來(lái)自恥垢分枝桿菌的高度純化的DNA充當(dāng)PCR分析的參考。陰性對(duì)照包括在其中沒(méi)有添加模板DNA的反應(yīng)。Ct值是指在擴(kuò)增曲線(xiàn)穿過(guò)軟件產(chǎn)生的檢測(cè)閾值的點(diǎn)的部分循環(huán)數(shù)。轉(zhuǎn)子基因(Rotorgene)軟件設(shè)定閾值線(xiàn)，并且計(jì)算各個(gè)樣品的Ct值。Ct值與樣品中的DNA的量成反比；一個(gè)Ct值的減小對(duì)應(yīng)于檢測(cè)出的DNA的量加倍。

結(jié)果與討論

結(jié)果總結(jié)在如下表17中：

表17.使用qPCR定量通過(guò)高碘酸鹽和增加的溫度從摻入恥垢分枝桿菌的人唾液釋放的DNA

表17的結(jié)果顯示高碘酸鹽顯著地增加從細(xì)胞中釋放的恥垢分枝桿菌DNA，該細(xì)胞最初被“摻入”唾液中并且隨后用含有高碘酸鹽的BB和BD試劑在70℃下處理20分鐘。較低的Ct值是恥垢分枝桿菌DNA更大的量的反映。使用含有高碘酸鹽的BA試劑觀(guān)察到提取效率相似但不那么顯著的增加。在最驚人的情況下，相比BD加高碘酸鹽，在包含單獨(dú)的BD試劑的樣品中DNA的估計(jì)量增加了約100倍，每個(gè)反應(yīng)從150pg增加至16,230pg。對(duì)于含有BB的樣品，添加高碘酸鹽也增加了DNA 100倍，每個(gè)反應(yīng)從70pg增加至6,430pg。對(duì)于含有BA的樣品，添加高碘酸鹽也增加了檢測(cè)的DNA，每個(gè)反應(yīng)從不可檢測(cè)增加至1,090pg。這些實(shí)驗(yàn)證明，從恥垢分枝桿菌釋放的DNA的量適合于通過(guò)qPCR分析進(jìn)行的PCR擴(kuò)增和微生物特異的鑒定，該恥垢分枝桿菌與含有高碘酸鹽和其他試劑的唾液混合并且隨后被加熱，該P(yáng)CR分析使用恥垢分枝桿菌特異的引物。

結(jié)論

這個(gè)實(shí)例證明了本發(fā)明的從恥垢分枝桿菌釋放核酸的化學(xué)組合物和方法的有效性，即使該恥垢分枝桿菌被摻入復(fù)雜的生物樣品。盡管在唾液中發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)連接的多糖和其他潛在的干擾物質(zhì)的存在，很小濃度的高碘酸鹽在從這個(gè)非常頑強(qiáng)的微生物中釋放很大比例的核酸非常有效。這證明了通過(guò)高碘酸鹽實(shí)現(xiàn)的DNA從恥垢分枝桿菌釋放和檢測(cè)的100倍的增加，可能增加涂片陰性、MT-陽(yáng)性樣品的檢測(cè)的敏感性，允許的有效治療方案早期開(kāi)始從而減少M(fèi)DR TB病例的傳染性的周期。

實(shí)例8：如通過(guò)實(shí)時(shí)PCR確定的，比較通過(guò)高碘酸鹽和MagNA純的純化方法從肉毒梭菌和難辨梭菌孢子釋放的DNA量

梭菌屬(Clostridium)是由大約100中革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌物種組成的屬，屬于厚壁菌門(mén)(Firmicutes)，其在脅迫下產(chǎn)生頑強(qiáng)的孢子。這些桿狀細(xì)胞在自然界中普遍存在，并且在土壤中尤其普遍。梭狀芽胞桿菌是能動(dòng)的專(zhuān)性厭氧菌，是引起人類(lèi)疾病的重要病原體。有五個(gè)引起人類(lèi)疾病的主要物種，即，肉毒梭菌、難辨梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、破傷風(fēng)梭菌和索氏梭菌。

由肉毒梭菌產(chǎn)生的孢子是橢圓形的近頂端內(nèi)生孢子，通常發(fā)現(xiàn)于土壤中，并且很難殺死。在海平面，肉毒梭菌孢子可以于沸水溫度存活，因此許多食品罐頭都是用加壓煮沸，該加壓煮沸達(dá)到甚至更高的溫度，足以殺滅孢子。肉毒梭菌在食品和傷口中產(chǎn)生肉毒毒素，其導(dǎo)致肉毒中毒。來(lái)自這種細(xì)菌的孢子可在蜂蜜中發(fā)現(xiàn)，并且在十二個(gè)月和更小的孩子中導(dǎo)致嬰兒型肉毒中毒。“肉毒桿菌毒素”是一種神經(jīng)毒素，在美容上用于麻痹面部肌肉減少老化的跡象，以及用于許多治療應(yīng)用中。

大約每20位住院患者中有1位將感染醫(yī)院獲得性感染(HAI)。雖然大多數(shù)類(lèi)型的HAI正在下降，由難辨梭菌(一種腸道共生菌)導(dǎo)致的暴發(fā)是困擾住院患者和長(zhǎng)期的醫(yī)療設(shè)施的一個(gè)日益嚴(yán)重的問(wèn)題，在這些住院患者和長(zhǎng)期的醫(yī)療設(shè)施中抗生素治療是常見(jiàn)的。難辨梭菌感染(CDI)通過(guò)糞-口途徑傳播，并且被認(rèn)為是從胃腸失調(diào)(即，正常腸道微生物或菌群的破壞)造成的?？股刂委煔⑺涝谖改c道中大多數(shù)細(xì)菌，這些細(xì)菌通常保持難辨梭菌在控制之下。在這種改變的環(huán)境中，難辨梭菌復(fù)制并產(chǎn)生攻擊腸道襯里的毒素，引起從腹瀉到威脅生命的炎癥和結(jié)腸內(nèi)表的出血的癥狀。根據(jù)疾病控制與預(yù)防中心(CDC)，難辨梭菌與美國(guó)每年14000人的死亡有關(guān)。

在醫(yī)療環(huán)境中，難辨梭菌通過(guò)糞-口途徑人對(duì)人傳播，并且當(dāng)人類(lèi)意外從共同的‘接觸’表面(如床欄、門(mén)把手、坐便器、水槽)吸入孢子時(shí)發(fā)生疫情。難辨梭菌孢子抵抗熱和最常規(guī)的表面清洗方法，包括基于酒精的手清潔劑，并且可以在環(huán)境中存活數(shù)月至數(shù)年。針對(duì)經(jīng)常發(fā)生的難辨梭菌感染的有效治療不能普遍獲得。矛盾的是，今天，對(duì)于難辨梭菌感染的主要治療是給予更多的抗生素，約20％的患者在一個(gè)月內(nèi)具有復(fù)發(fā)，而且他們中的許多都反復(fù)發(fā)作。

許多市場(chǎng)和行業(yè)都在尋找有效的方法來(lái)消滅有害孢子(和細(xì)菌)，包括食品安全(食品/肉類(lèi)加工廠(chǎng))、醫(yī)療保健、土壤和水樣采集(環(huán)境測(cè)試)、生物安全或生物防御、動(dòng)物飼料檢驗(yàn)、農(nóng)業(yè)/植物科學(xué)/工業(yè)等。對(duì)細(xì)菌和/或孢子的致病菌株的檢測(cè)和特性感興趣的臨床實(shí)踐和流行病學(xué)研究，需要具有優(yōu)良的敏感性和特異性以及重測(cè)信度的更快的替代方法。如今，“黃金標(biāo)準(zhǔn)”測(cè)試仍然涉及大便培養(yǎng)，這是一個(gè)敏感的檢測(cè)，但具有很長(zhǎng)的周轉(zhuǎn)時(shí)間，是資源密集型的，并且需要具有組織培養(yǎng)設(shè)施的有經(jīng)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室。相反，PCR試驗(yàn)測(cè)試廉價(jià)，具有快速的周轉(zhuǎn)時(shí)間、優(yōu)良的敏感性、特異性和預(yù)測(cè)值，只要從存在于所收集的生物樣品中感興趣的細(xì)菌/孢子提取出足夠量的DNA。

本發(fā)明人已驚奇地發(fā)現(xiàn)，常見(jiàn)的實(shí)驗(yàn)室化學(xué)品高碘酸鹽在弱堿性pH和升高的溫度下使用，可以用來(lái)從在活躍和休眠兩種狀態(tài)中的微生物中快速和有效地釋放核酸。在這個(gè)實(shí)例中，從肉毒梭菌和難辨梭菌的培養(yǎng)物中制備孢子，并且對(duì)兩種不同的DNA分離方法的功效進(jìn)行了比較：1)本發(fā)明的高碘酸鹽方法和2)可商購(gòu)的MagNA^TM純的純化方法。通過(guò)這些方法提取的DNA使用CLIA/CLEP批準(zhǔn)的實(shí)時(shí)PCR(rtPCR)試驗(yàn)來(lái)進(jìn)行定量，該rtPCR對(duì)于每個(gè)生物體是特異的。

實(shí)驗(yàn)方法

[肉毒梭菌和難辨梭菌孢子制備，DNA提取和rtPCR試驗(yàn)是與沃茲沃斯中心生物防御實(shí)驗(yàn)室(Wadsworth Center Biodefense Laboratory)(紐約州衛(wèi)生部門(mén)，奧爾巴尼，紐約州，美國(guó))合作進(jìn)行的。]

肉毒梭菌和難辨梭菌孢子制備

肉毒梭菌B型和難辨梭菌的冷凍儲(chǔ)備培養(yǎng)物在具有5％綿羊血的胰蛋白酶大豆瓊脂上培養(yǎng)，并在35℃下厭氧孵育24至48小時(shí)。初始孵育后，將這些培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到多個(gè)(最少10個(gè))腦心浸液瓊脂板(Brain Heart Infusion Agar plates)，并在35℃下厭氧孵育長(zhǎng)達(dá)2周。每3至4天進(jìn)行孔雀綠孢子染色以監(jiān)測(cè)體外細(xì)菌的孢子形成。當(dāng)孔雀綠染色顯示生物體的形成孢子幾乎完成時(shí)，將孢子收獲至5.0mL的PBS(pH 7.4)中，并在室溫下保存直到使用。

孢子濃度的確定

將肉毒梭菌和難辨梭菌的每個(gè)孢子儲(chǔ)備懸浮液在PBS中稀釋至10^-2。將這些最終稀釋液中的每一個(gè)的等分試樣(10μL)裝入2室的血細(xì)胞計(jì)數(shù)器載玻片的每個(gè)清潔的孔中。在40x放大無(wú)油下觀(guān)察血細(xì)胞計(jì)數(shù)器室來(lái)進(jìn)行孢子計(jì)數(shù)。在血細(xì)胞計(jì)數(shù)器的光場(chǎng)網(wǎng)格上孢子可視化為圓形或橢圓形的黑細(xì)胞。肉毒梭菌，檢測(cè)的極限(LOD)＝30個(gè)孢子/反應(yīng)；難辨梭菌，LOD＝20個(gè)孢子/反應(yīng)。

使用高碘酸鹽方法從孢子提取DNA

1.向肉毒梭菌和難辨梭菌的350μL孢子儲(chǔ)備懸浮液(上文)添加350μL BD2緩沖液(2％SDS、12.5mM CDTA、250mM LiCl、50mM甘氨酸，pH 10.5)。

2.渦旋混合。

3.取出100μL用于培養(yǎng)。

4.添加50μL的300mM(間)高碘酸鈉或NPI儲(chǔ)備(終濃度30mM)，渦旋混合。

5.在70℃水浴中孵育20分鐘。

6.在室溫下冷卻樣品2分鐘。

7.取出100μL用于培養(yǎng)。

8.添加20μL的1M Tris pH 7緩沖液(終濃度50mM)。

9.在室溫下孵育10分鐘。

10.添加20μL的3M醋酸鉀(pH 5.5)(終濃度150mM)。

11.在冰上孵育10分鐘。

12.以13000rpm離心5分鐘。

13.將上清轉(zhuǎn)移到干凈的標(biāo)記的管。丟棄沉淀。

14.加入800μL室溫的95％乙醇。

15.反轉(zhuǎn)20次混合。

16.在室溫下孵育樣品15分鐘以沉淀DNA。

17.以15,000rpm離心2分鐘以沉淀DNA。

18.輕輕取出并丟棄上清液，小心不要打亂沉淀。

19.將沉淀溶于100μL TE。

20.短暫渦旋以充分重懸DNA。

21.運(yùn)行CLIA/CLEP批準(zhǔn)的對(duì)每個(gè)生物體特異的rtPCR試驗(yàn)。

使用羅氏公司(Roche)的MagNA^TM純的DNA分離試劑盒從孢子中提取DNA

1.準(zhǔn)備10個(gè)在每個(gè)希望的濃度200μL的肉毒梭菌的和難辨梭菌孢子懸浮液的等分試樣(總共30只管)。

2.通過(guò)合并38μL蛋白酶K與262μL細(xì)菌裂解緩沖液對(duì)每個(gè)樣品制備裂解緩沖液，該262μL細(xì)菌裂解緩沖液是來(lái)自MagNA純的LC DNA分離試劑盒III(細(xì)菌、真菌)(目錄號(hào)03264785001，羅氏公司(Roche))。

3.將300μL的裂解緩沖液添加到每個(gè)200μL孢子懸浮液。

4.渦旋。

5.在65℃下孵育20分鐘。

6.在95℃下孵育10分鐘。

7.允許樣品在室溫下冷卻。

8.當(dāng)冷卻時(shí)，短暫離心以去除氣溶膠。

9.轉(zhuǎn)移500μL每個(gè)樣品到羅氏MagNA純的緊湊型樣品管。

10.將樣品管放置在羅氏MagNA純的緊湊型儀器上。

11.遵循篩選說(shuō)明使用DNA血液外部裂解試驗(yàn)方案：樣品體積：500μL；流出體積：100μL。

用于肉毒梭菌B型和難辨梭菌的實(shí)時(shí)PCR

所有rtPCR試驗(yàn)在ABI7500儀器上進(jìn)行。使用CLIA/CLEP批準(zhǔn)的對(duì)每個(gè)生物體特異的rtPCR試驗(yàn)法(弗羅布萊夫斯基(Wroblewski)等人，2009)單份地分析從每個(gè)提取分離的DNA。

結(jié)果與討論

雖然生物樣品或細(xì)菌/孢子的培養(yǎng)物的機(jī)械珠粒打漿可以相當(dāng)有效地破開(kāi)微生物，但是它的確會(huì)產(chǎn)生氣溶膠，該氣溶膠增加了傳播傳染劑的機(jī)會(huì)并且把實(shí)驗(yàn)室人員的健康處于危險(xiǎn)之中。因此，非常需要開(kāi)發(fā)非機(jī)械的化學(xué)方法從頑強(qiáng)的微生物及其孢子中釋放總核酸。這個(gè)實(shí)例證明本發(fā)明的“高碘酸鹽”方法是快速的、廉價(jià)的、簡(jiǎn)單的化學(xué)處理，在肉毒梭菌孢子(圖7)和難辨梭菌孢子兩者中分離DNA方面，比可商購(gòu)的來(lái)自羅氏公司(Roche)的DNA分離試劑盒(“合作者”的方法)和非常昂貴的自動(dòng)化系統(tǒng)顯著地更加有效(DNA增加8倍)。MagNA^TM純的試劑盒(“合作者(Collaborator)”，圖7和8)利用裂解緩沖液加磁性玻璃顆粒，而本發(fā)明的高碘酸鹽方法(“高碘酸鹽”，圖1A和1B)不需要磁珠或具有磁處理能力的復(fù)雜的自動(dòng)化系統(tǒng)甚至從頑強(qiáng)的孢子中分離DNA。

CLIA/CLEP批準(zhǔn)的rtPCR試驗(yàn)表明，相比“合作者”的方法，使用“高碘酸鹽”方法增加了檢測(cè)來(lái)自肉毒梭菌和難辨梭菌芽孢的DNA的敏感性(Δ3C_t值)，即，高碘酸鹽處理的樣品導(dǎo)致在rtPCR中在每個(gè)LOD始終較低的Ct值。使用高碘酸鹽方法對(duì)微生物DNA的提取的改善應(yīng)當(dāng)解釋為用其他CLIA/CLEP批準(zhǔn)的從rtPCR試驗(yàn)評(píng)估生物樣品中的檢測(cè)敏感性增強(qiáng)。

實(shí)例9：如通過(guò)對(duì)結(jié)核分枝桿菌特異的實(shí)時(shí)PCR確定的，比較通過(guò)高碘酸鹽方法與傳統(tǒng)的珠粒打漿從結(jié)核病陽(yáng)性的臨床痰樣品釋放的DNA的量。

這個(gè)實(shí)例提供了通過(guò)兩種方法純化的TB陽(yáng)性痰樣品(由FIND惠贈(zèng)，參見(jiàn)下文)的臨床評(píng)價(jià)的并排比較。具體地，對(duì)1)“治療標(biāo)準(zhǔn)”和2)“高碘酸鹽方法”兩種不同的DNA提取方法的影響在CLIA/CLEP批準(zhǔn)的rtPCR試驗(yàn)的敏感性上進(jìn)行了比較，該rtPCR試驗(yàn)靶向RD4結(jié)核分枝桿菌復(fù)合體(MTBC)差異區(qū)域(RD)(哈爾斯(Halse)等人，2011)。

與“高碘酸鹽方法”相反，“治療標(biāo)準(zhǔn)”方法包括珠粒打漿、機(jī)械方法以破開(kāi)痰樣品中的細(xì)菌。雖然機(jī)械珠粒打漿可以有效地破開(kāi)生物體，但是它在實(shí)驗(yàn)室的確產(chǎn)生危險(xiǎn)的氣溶膠。因此，非常希望開(kāi)發(fā)一種有效的、非機(jī)械的、化學(xué)的方法以安全地從結(jié)核分枝桿菌釋放DNA，而不會(huì)對(duì)診斷測(cè)試的臨床敏感性產(chǎn)生負(fù)面影響。

實(shí)驗(yàn)方法

結(jié)核分枝桿菌陽(yáng)性痰樣品的生活力的確認(rèn)

樣品

對(duì)于本實(shí)例，來(lái)自TB陽(yáng)性患者的未加工的痰樣品由創(chuàng)新診斷基金會(huì)(Foundation for Innovative Diagnostics，F(xiàn)IND)結(jié)核病標(biāo)本庫(kù)惠贈(zèng)。一式兩份的0.5mL的等分試樣從30位患者樣品提供并且冷凍儲(chǔ)存。利用培養(yǎng)和涂片分析，F(xiàn)IND將這30個(gè)樣品分類(lèi)為‘涂片+、培養(yǎng)+(高)’，‘涂片+、培養(yǎng)+(中)’或‘涂片-、培養(yǎng)+(低)’TB陽(yáng)性。

將等分試樣冷凍運(yùn)到沃茲沃斯中心分枝桿菌學(xué)實(shí)驗(yàn)室(Wadsworth Center Mycobacteriology Laboratory)(紐約州衛(wèi)生部門(mén)，奧爾巴尼，紐約州，美國(guó))以進(jìn)行進(jìn)一步的分析，該實(shí)驗(yàn)室是CLIA/CLEP批準(zhǔn)的臨床實(shí)驗(yàn)室。

在抵達(dá)沃茲沃斯之后，將來(lái)自30個(gè)捐贈(zèng)者的等分試樣在冰上解凍，并且在這些10個(gè)‘高’，10個(gè)‘中’和10個(gè)‘低’的TB等分試樣中的分枝桿菌的生存能力用培養(yǎng)和涂片鏡檢來(lái)確認(rèn)。

使用高碘酸鹽方法從TB陽(yáng)性痰中提取DNA

1.將0.5mL BD2緩沖液(2％SDS、12.5mM CDTA、250mM LiCl、50mM甘氨酸，pH 10.5)添加到每個(gè)0.5mL痰等分試樣；渦旋混合。

2.添加蛋白酶K(400μg)，并在50℃水浴中孵育2小時(shí)。

3.轉(zhuǎn)移0.4mL至新的管并添加NPI(終濃度30mM)，渦旋混合。

4.在70℃水浴中孵育20分鐘。

5.在室溫下冷卻樣品2分鐘。

6.添加1M Tris緩沖液(pH 7)至50mM的終濃度。

7.在室溫下孵育10分鐘。

8.添加3M醋酸鉀(pH 5.5)至150mM的終濃度。

9.在冰上孵育10分鐘。

10.以13000rpm離心5分鐘。

11.將上清轉(zhuǎn)移到干凈的標(biāo)記的管。丟棄沉淀。

12.添加2體積的室溫的95％乙醇。

13.反轉(zhuǎn)20次混合。

14.在室溫下孵育樣品10分鐘以沉淀DNA。

15.以15,000rpm離心2分鐘以沉淀DNA。

16.輕輕取出并丟棄上清液，小心不要打亂沉淀。

17.將沉淀溶于200μL TE。

18.短暫渦旋以充分重懸DNA。

使用“治療標(biāo)準(zhǔn)”從TB陽(yáng)性痰中提取DNA

1.將0.5mL 3.5％NaOH添加到每個(gè)0.5mL痰等分試樣；渦旋混合。

2.在室溫下孵育15分鐘。

3.添加無(wú)菌磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)使體積至10mL。

4.以5,000rpm離心20分鐘以沉淀細(xì)菌。丟棄上層清液。

5.在0.5mL無(wú)菌PBS中重懸沉淀。

6.預(yù)留300μL重懸的細(xì)菌用于培養(yǎng)。

7.向剩余200μL重懸的細(xì)菌中，加入200mg的105-150微米的玻璃珠粒。

8.珠粒打漿2個(gè)周期，每個(gè)周期1分鐘，隨后使用微型珠粒打漿機(jī)(BioSpec產(chǎn)品)在冰上進(jìn)行1分鐘。

對(duì)結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR和抗生素抗性焦磷酸測(cè)序

使用CLIA/CLEP批準(zhǔn)的rtPCR試驗(yàn)，來(lái)自每個(gè)純化的痰樣品的5μL‘純的’DNA和5μL稀釋的(1:10)DNA的重復(fù)反應(yīng)在ABI7500實(shí)時(shí)PCR儀上擴(kuò)增，該rtPCR試驗(yàn)靶向RD4結(jié)核分枝桿菌復(fù)合體(MTBC)差異區(qū)域(RD)(哈爾斯(Halse)等人，2011)。小于37的閾值循環(huán)(C_t)值報(bào)道為陽(yáng)性，并且值大于37的樣品被重測(cè)；如果結(jié)果是相同的，結(jié)果被報(bào)告為陽(yáng)性，并且如果它們不同，它們被報(bào)告為不確定的。

結(jié)果與討論

相比于傳統(tǒng)的珠粒打漿方法(“治療標(biāo)準(zhǔn)”)，本發(fā)明的化學(xué)“高碘酸鹽法”明確導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌特異性檢測(cè)的增加的敏感性，特別是對(duì)于通過(guò)培養(yǎng)和涂片鏡檢歸類(lèi)為‘低’和‘中’TB陽(yáng)性的痰樣品。在這個(gè)實(shí)例中，直到使用“治療標(biāo)準(zhǔn)”方法提取的DNA被稀釋10倍才可以檢測(cè)到在‘中’和‘高’TB陽(yáng)性痰樣品中的結(jié)核分枝桿菌(表18)；然而利用“高碘酸鹽方法”分離DNA后87％‘低’TB負(fù)荷的痰樣品被檢測(cè)為陽(yáng)性(表18)。

表18.使用2種不同的方法提取DNA后被檢測(cè)為T(mén)B陽(yáng)性的痰樣品的百分比

*2個(gè)數(shù)據(jù)從低TB樣品中排除-任何提取方法或培養(yǎng)后未檢測(cè)

圖9表明相比“治療標(biāo)準(zhǔn)”或SOC，使用“高碘酸鹽方法”提取的所有TB陽(yáng)性痰樣品中結(jié)核分枝桿菌的檢測(cè)極限的顯著的改善。例如，‘低’TB陽(yáng)性痰的C_t值的范圍對(duì)于“高碘酸鹽方法”為31.4-45.0，相比之下對(duì)于SOC為38.5-45.0；‘中’TB陽(yáng)性痰的C_t值的范圍對(duì)于“高碘酸鹽方法”為20.9-32.3，相比之下對(duì)于SOC為26.8-45.0；‘高’TB陽(yáng)性痰的C^t值的范圍對(duì)于“高碘酸鹽方法”為19.8-28.3，相比之下對(duì)于SOC為27-2-39.3；圖10顯示通過(guò)DNA提取方法安排的圖9的數(shù)據(jù)。當(dāng)使用本發(fā)明的高碘酸鹽方法來(lái)提取DNA時(shí)，對(duì)于所有TB負(fù)荷水平C_t值始終較低。這個(gè)由改善的DNA提取提供的較低的檢測(cè)極限，幫助確保對(duì)來(lái)自患者痰樣品的結(jié)核分枝桿菌的精確診斷。

實(shí)例10：基于高碘酸鹽方法比凱杰公司(Qiagen)純化釋放顯著更多的結(jié)核分枝桿菌DNA

自1980年以來(lái)結(jié)核病在發(fā)達(dá)以及發(fā)展中國(guó)家的復(fù)蘇與HIV傳染病、耐藥菌株的出現(xiàn)、和從疾病流行率很高地區(qū)的移民增加相關(guān)(科比特(Corbett)等人，2003)。結(jié)核病是發(fā)病率的最常見(jiàn)的原因之一和在欠發(fā)達(dá)國(guó)家生活的HIV陽(yáng)性成年人總死亡的最常見(jiàn)的原因，但它是可以預(yù)防和治療的疾病。由于從人到人傳播的高風(fēng)險(xiǎn)，結(jié)核分枝桿菌的快速檢測(cè)對(duì)疾病管理至關(guān)重要。美國(guó)疾病控制與預(yù)防中心(CDC)建議收到的臨床樣品同時(shí)通過(guò)培養(yǎng)、抗酸桿菌(AFB)染色、核酸擴(kuò)增(NAA)試驗(yàn)方案進(jìn)行分析(結(jié)核病在成人和兒童中的診斷標(biāo)準(zhǔn)與分類(lèi)(Diagnostic Standards and Classifications of Tuberculosis in Adults and Children)；美國(guó)胸科學(xué)會(huì)(American Thoracic Society)和CDC，2000)。雖然培養(yǎng)仍然是最后確定的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”，它可能需要長(zhǎng)達(dá)2至8周。AFB染色是快速的，但具有低敏感性和低特異性，因?yàn)樗粎^(qū)分來(lái)自結(jié)核分枝桿菌復(fù)合體(MTBC)的成員與非結(jié)核分枝桿菌(NTM)。因此，快速鑒定，對(duì)結(jié)核病的傳播至關(guān)重要，越來(lái)越多地依賴(lài)于核酸提取和分子診斷測(cè)試。

MTBC成員在毒力屬性、耐藥模式和宿主偏好方面不同。這些物種的快速區(qū)分以確定動(dòng)物傳染的或人類(lèi)起源的結(jié)核疾病或指導(dǎo)治療可以有益于公眾健康和病人管理。哈爾斯(Halse)等人(2010；2011)開(kāi)發(fā)了實(shí)時(shí)PCR試驗(yàn)用于區(qū)分密切相關(guān)的生物體，結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、牛BCG分枝桿菌、非洲分枝桿菌、田鼠分枝桿菌、和卡內(nèi)蒂分枝桿菌。MTBC成員的基因組之間的差別區(qū)域(RD)的存在或不存在允許設(shè)計(jì)一種廉價(jià)從、快速、單管、五叢的實(shí)時(shí)PCR(rtPCR)試驗(yàn)以區(qū)分臨床樣品中的這些物種。

在這樣的rtPCR的上游；然而，至關(guān)重要的是臨床標(biāo)本以這樣的方式處理以便盡可能地回收最大量的DNA。在歷史上，定量研究已經(jīng)顯示必須有5000至10000個(gè)桿菌/毫升標(biāo)本以允許在染色涂片中的細(xì)菌檢測(cè)(霍比(Hobby)等人，1973)。相反，需要10至100個(gè)生物體用于陽(yáng)性培養(yǎng)(耶格爾(Yeager)等人，1967)。在含有少至10個(gè)桿菌的整體標(biāo)本中的分枝桿菌的分子檢測(cè)對(duì)診斷測(cè)定表現(xiàn)出真正的挑戰(zhàn)，尤其是當(dāng)測(cè)試輸入量為總標(biāo)本的一小部分時(shí)。與培養(yǎng)和染色涂片相反，分子方法檢測(cè)來(lái)自接受治療的患者標(biāo)本中的活的和死亡或?yàn)l臨死亡的桿菌的DNA，允許治療前和治療過(guò)程中對(duì)MTBC生物體的鑒定。

明顯存在對(duì)開(kāi)發(fā)優(yōu)越的提取方法的需求，該提取方法有助于從患者標(biāo)本中的堅(jiān)韌的微生物中快速恢復(fù)全部或大部分DNA。從復(fù)雜樣品(像痰)的DNA提取的改善，直接轉(zhuǎn)化為對(duì)結(jié)核病和其他疾病的基于診斷性(Dx)/DNA測(cè)定的增加的敏感性，并且最終用適當(dāng)?shù)乃幬镏委焷?lái)更快地治療患者。這一需求被在多個(gè)國(guó)家中的多重耐藥結(jié)核病(MDR-TB)和廣泛耐藥結(jié)核病(XDR-TB)的出現(xiàn)以及近期在南非的迅速致命的HIV相關(guān)的結(jié)核病的流行進(jìn)一步加劇(甘地(Ghandi)等人，2006；拉維格里昂(Raviglione)，2006)。由于差的控制措施，一些國(guó)家現(xiàn)在正面臨的TB控制的可能最壞的情形之一：HIV感染和高度耐藥TB的致命組合(拉維格里昂(Raviglione)，2006)。

實(shí)驗(yàn)方法

摻入結(jié)核分枝桿菌的生物樣品的制備

為了模擬結(jié)核病陽(yáng)性痰，將減毒結(jié)核分枝桿菌(aMTB)以5×10⁶菌落形成單位/毫升(cfu/mL)摻入健康人的唾液樣品。

使用高碘酸鹽方法從結(jié)核分枝桿菌陽(yáng)性唾液中提取DNA[“DNA Genotek最優(yōu)方法”或“選項(xiàng)1”]

1.將等體積的摻入aMTB的唾液與BD2緩沖液(2％SDS、12.5mM CDTA、250mM LiCl、50mM甘氨酸，pH 10.5)混合。

2.在室溫下孵育15分鐘。

3.以5,000rpm離心20分鐘。丟棄上層清液。

4.將沉淀重懸浮于50％BD2緩沖液中。

5.添加NPI至30mM的終濃度，渦旋混合。

6.在70℃水浴中孵育20分鐘。

7.在室溫下冷卻樣品2分鐘。

8.添加1M Tris緩沖液(pH 7)至50mM的終濃度。

9.在室溫下孵育10分鐘。

10.添加3M醋酸鉀(pH 5.5)至150mM的終濃度。

11.在冰上孵育10分鐘。

12.以13000rpm離心5分鐘。

13.將上清轉(zhuǎn)移到干凈的標(biāo)記的管。丟棄沉淀。

14.加入800μL室溫的95％乙醇。

15.反轉(zhuǎn)20次混合。

16.在室溫下孵育樣品15分鐘以沉淀DNA。

17.以15,000rpm離心2分鐘以沉淀DNA。

18.輕輕取出并丟棄上清液，小心不要打亂沉淀。

19.將沉淀溶于100μL TE。

20.短暫渦旋以充分重懸DNA。

使用高碘酸鹽方法從結(jié)核分枝桿菌陽(yáng)性唾液中提取DNA隨后是凱杰公司(Qiagen)純化[“選項(xiàng)2”]

1.將等體積的摻入aMTB的唾液與BD2緩沖液(2％SDS、12.5mM CDTA、250mM LiCl、50mM甘氨酸，pH 10.5)混合。

2.在室溫下孵育15分鐘。

3.以5,000rpm離心20分鐘。丟棄上層清液。

4.將沉淀重懸浮于50％BD2緩沖液中。

5.添加NPI至30mM的終濃度，渦旋混合。

6.在70℃水浴中孵育20分鐘。

7.在室溫下冷卻樣品2分鐘。

8.添加1M Tris緩沖液(pH 7)至50mM的終濃度。

9.在室溫下孵育10分鐘。

10.添加等體積的凱杰(Qiagen)AL緩沖液。

11.對(duì)于凱杰公司(Qiagen)QIAamp DNA微型試劑盒(目錄號(hào)51304)遵循凱杰QIAMP程序。

使用BD2緩沖液和凱杰(Qiagen)純化從結(jié)核分枝桿菌陽(yáng)性唾液中提取DNA[“選項(xiàng)3”]

1.將等體積的摻入aMTB的唾液與BD2緩沖液(2％SDS、12.5mM CDTA、250mM LiCl、50mM甘氨酸，pH 10.5)混合。

2.在室溫下孵育15分鐘。

3.以5,000rpm離心20分鐘。丟棄上層清液。

4.將沉淀重懸浮于50％BD2緩沖液中。

5.添加等體積的凱杰(Qiagen)AL緩沖液。

6.對(duì)于凱杰公司(Qiagen)QIAamp DNA微型試劑盒(目錄號(hào)51304)遵循凱杰QIAMP程序。

用標(biāo)準(zhǔn)的氫氧化鈉/NALC方法和凱杰(Qiagen)純化從結(jié)核分枝桿菌陽(yáng)性唾液中提取DNA[“標(biāo)準(zhǔn)的凱杰方法”或“選項(xiàng)4”]

1.新鮮制備和高壓滅菌4％氫氧化鈉(NaOH)溶液。

2.新鮮制備和高壓滅菌2.9％檸檬酸鈉溶液。

3.在使用前，混合等體積的NaOH和檸檬酸鈉溶液。

4.添加N-乙酰基-L-半胱氨酸(NALC)粉末以達(dá)到0.5％的終濃度。充分混合并在同一天使用。

5.混合等體積的摻入aMTB的唾液和NaOH/NALC/檸檬酸溶液。

6.在室溫下孵育15分鐘。

7.添加無(wú)菌PBS以使總體積為50mL。

8.以5,000rpm離心20分鐘。丟棄上清液。

9.將沉淀重懸于PBS中。

10.添加等體積的凱杰(Qiagen)AL緩沖液。

11.對(duì)于凱杰公司(Qiagen)QIAamp DNA微型試劑盒(目錄號(hào)51304)遵循凱杰QIAMP程序。

rtPCR條件

在這個(gè)實(shí)例中，使從摻入aMTB的唾液樣品中分離的DNA(選項(xiàng)1-4，上文)經(jīng)受特異于分枝桿菌的rtPCR試驗(yàn)，RD4Taqman實(shí)時(shí)PCR測(cè)定。RD4的引物如下：RD4-正向5’-CCA CGA CTA TGA CTA GGA CAG CAA-3’和RD4-反向5’-AAG AAC TAT CAA TCG GGC AAG ATC-3’(哈爾斯(Halse)等人(2011))。

圖11闡明了通過(guò)分子檢測(cè)基于計(jì)算出的基因組當(dāng)量(GE)回收的aMTB DNA的百分比(回收GE/輸入GE*100)。

結(jié)果與結(jié)論

最近開(kāi)發(fā)的分子測(cè)定提供在培養(yǎng)材料的結(jié)果可用之前幫助疑似結(jié)核病患者的初期管理的可靠結(jié)果，并提供在從臨床標(biāo)本收集的短短1-2天內(nèi)預(yù)測(cè)結(jié)核分枝桿菌陽(yáng)性標(biāo)本的抗生素耐藥性的能力。然而，結(jié)核病診斷和一般基于PCR的系統(tǒng)需要DNA的有效分離和純化程序，其被痰的物理特點(diǎn)和缺乏同質(zhì)性以及被分枝桿菌細(xì)胞壁的高脂質(zhì)含量進(jìn)一步復(fù)雜化。因此，所有對(duì)分枝桿菌的DNA提取可用的技術(shù)需要操縱步驟，該步驟導(dǎo)致起始材料不可預(yù)測(cè)的損失，其可導(dǎo)致假陰性診斷。

本實(shí)例比較了針對(duì)生物標(biāo)本的多種DNA分離和處理方法。具體地，結(jié)核病陽(yáng)性痰通過(guò)在健康捐贈(zèng)者的唾液樣品中摻入aMTB來(lái)模擬。標(biāo)本的常規(guī)NaOH/NALC凈化，接著用可商購(gòu)的凱杰QIAamp DNA微型試劑盒進(jìn)行DNA提取(選項(xiàng)4)，導(dǎo)致在僅2.2％的aMTB DNA的回收率。相比之下，本發(fā)明的高碘酸鹽方法(選項(xiàng)1)導(dǎo)致71.3％aMTB DNA的顯著回收率；比選項(xiàng)4回收率增加了70％。選項(xiàng)3證明標(biāo)本與BD2緩沖液的初始孵育不是選項(xiàng)1的顯著結(jié)果的原因，因?yàn)锽D2緩沖液接著凱杰提取回收了aMTB原摻入量的1.6％。當(dāng)高碘酸鹽處理的標(biāo)本用凱杰的試劑盒進(jìn)行提取(選項(xiàng)2)時(shí)，只有26.4％的aMTB DNA被回收；相比傳統(tǒng)的NaOH/NACL/凱杰試劑盒(選項(xiàng)4)，相當(dāng)于DNA回收率增加24％。

高碘酸鹽方法有效地從結(jié)核分枝桿菌摻入標(biāo)本中分離出大多數(shù)的DNA，并因此可用于顯著增加診斷/分子測(cè)定已知的好處，即，高水平的特異性和敏感性，短的周轉(zhuǎn)時(shí)間和成本效益。這些改善使醫(yī)療保健系統(tǒng)節(jié)省多達(dá)8周的時(shí)間來(lái)通過(guò)培養(yǎng)區(qū)分MTBC的物種，提供信息以實(shí)現(xiàn)適當(dāng)?shù)?、快速的藥物治療，具有最小的副作用，以及早期洞察TB傳播。

實(shí)例11：通過(guò)高碘酸鹽的蛋白選擇性降解

高碘酸鹽通常用于溶液中打開(kāi)連二醇之間的糖環(huán)，允許RNA的3’-末端的選擇性標(biāo)記。出人意料的是，本發(fā)明人已經(jīng)確定高碘酸鹽在“殺死”或中和特定的酶(如胰核糖核酸酶A(RNA酶A))的活性方面也是非常有效的，并且高碘酸鹽也降解某些其他的蛋白質(zhì)。

在這個(gè)實(shí)例中，RNA酶A，切割單鏈RNA的胰核糖核酸酶，被證明是高碘酸鹽的靶標(biāo)。RNA酶的酶活性通過(guò)監(jiān)測(cè)其降解RNA底物(從HeLa細(xì)胞純化的RNA)的能力進(jìn)行評(píng)估。如果RNA酶的酶活性被高碘酸鹽負(fù)面地影響，則HeLa細(xì)胞核糖體RNA基本上不會(huì)被降解，如通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳所評(píng)估。

實(shí)驗(yàn)方法和材料

用高碘酸鹽處理純的胰核糖核酸酶A

1.將純的胰核糖核酸酶A(西格瑪公司(Sigma))(0.1-0.2μg/μL)添加到有或沒(méi)有15mM高碘酸鹽的緩沖液(1％SDS、25mM Li-CDTA、125mM LiCl、25mM甘氨酸，pH 10.5)。

2.將混合物在70℃下加熱15分鐘。

3.將10μL混合物裝載到10％SDS-PAGE凝膠上，并在160伏特運(yùn)行60分鐘。

4.SDS-PAGE凝膠用熱的考馬斯藍(lán)染色30分鐘，然后在室溫下脫色2小時(shí)，并在可見(jiàn)光下拍照(圖12)。

用高碘酸鹽處理恥垢分枝桿菌裂解物

1.從平板生長(zhǎng)的恥垢分枝桿菌的懸浮液制備洗滌的沉淀。

2.根據(jù)制造商的說(shuō)明在一個(gè)微型珠粒打漿機(jī)-16(Mini-BeadBeater-16)(BioSpec公司)進(jìn)行珠粒打漿。簡(jiǎn)而言之，將洗滌的細(xì)菌沉淀物懸浮于1000μL的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)，并轉(zhuǎn)移到含有約100μL的100μm的玻璃珠粒(Polyscience公司)的螺旋蓋聚丙烯離心管中。

3.將管固定到儀器，并以?xún)蓚€(gè)1分鐘的周期(3,450振動(dòng)/分鐘)進(jìn)行劇烈攪拌。在周期之間將樣品在冰上冷卻1分鐘。

4.將懸浮液轉(zhuǎn)移到1.5mL微型離心管中，并且通過(guò)在微型離心機(jī)中在14,000rpm下離心5分鐘除去完整的細(xì)胞和殘骸。

5.將上清液取出并且均等地分到兩個(gè)1.5mL微型離心管中。將一個(gè)級(jí)分用等體積的PBS稀釋(對(duì)照，參見(jiàn)圖13)。將第二級(jí)分與等體積的緩沖液(1％SDS、25mM Li-CDTA、125mM LiCl、25mM甘氨酸，pH 10.5)混合，分成3份，加入高碘酸鹽至0、7.5mM或15mM的終濃度。

6.將管在70℃下加熱15分鐘。對(duì)照樣品不加熱。

7.將7.5μL或15μL混合物裝載到10％SDS-PAGE凝膠上，并在160伏特運(yùn)行60分鐘。

8.SDS-PAGE凝膠用熱的考馬斯藍(lán)染色30分鐘，然后在室溫下脫色2小時(shí)，并拍照(圖13)。

用胰核糖核酸酶A和高碘酸鹽處理純化的HeLa核酸

1.在50mM甘氨酸(pH 10.5)中制備10μg/mL的純的胰核糖核酸酶A(西格瑪公司)(RNA酶A)溶液。

2.將該溶液在兩只管中平分，并且一個(gè)等分試樣用15mM高碘酸鹽處理。

3.兩只管在70℃下加熱15分鐘。

4.處理過(guò)的RNA酶A管在50mM ADA緩沖液(pH 6.5)中稀釋200-1000倍。

5.將稀釋的RNA酶A與HeLa核酸(DNA和RNA)一起在50℃下孵育20分鐘。

6.添加SDS至0.5％‘停止’該反應(yīng)。

7.用1.0％瓊脂糖凝膠電泳分析處理的HeLa RNA的完整性(圖14)。

結(jié)果與結(jié)論

圖12顯示了令人驚奇的結(jié)果：全長(zhǎng)純化的RNA酶蛋白質(zhì)的質(zhì)量在與高碘酸鹽短暫孵育之后降低了；在凝膠中未觀(guān)察到降解產(chǎn)物(更小的蛋白質(zhì)片段)。而且，仔細(xì)檢查圖13顯示在與高碘酸鹽孵育之后在恥垢分枝桿菌的無(wú)細(xì)胞的裂解液中某些(未知)蛋白質(zhì)條帶的選擇性丟失。在增加的濃度的高碘酸鹽(7.5mM和15mM)的存在下，一些蛋白質(zhì)條帶選擇性地降解或從凝膠完全消失，表明高碘酸鹽具有多個(gè)蛋白質(zhì)靶標(biāo)。

如在圖14中所示的數(shù)據(jù)所證明，如果RNA酶A與RNA接觸前與高碘酸鹽預(yù)孵育一小段時(shí)間，核糖體RNA不再被RNA酶A降解。需要添加較大量的RNA酶A(50ng)來(lái)檢測(cè)少量的未能被高碘酸鹽滅活的殘留活性的RNA酶。因此，除了其對(duì)總細(xì)胞蛋白的影響，高碘酸鹽可以靶向并抑制特定降解酶的酶促作用。

實(shí)例12：高碘酸鹽處理消除炭疽桿菌、肉毒桿菌和難辨梭菌孢子的生存能力

炭疽熱是一種急性的、通常致命的、由棒狀革蘭氏陽(yáng)性好氧性細(xì)菌炭疽桿菌引起的疾病，該炭疽桿菌通常以?xún)?nèi)生孢子形式安置在土壤中。像肉毒梭菌和難辨梭菌，炭疽桿菌能形成休眠的內(nèi)生孢子，其很難根除，在惡劣條件下生存幾十年甚至幾百年。當(dāng)孢子被吸入、攝入、或接觸到宿主的皮膚損傷時(shí)，他們可能成為再活化的并迅速繁殖。炭疽孢子的頑強(qiáng)性以及它們?cè)隗w外易于生產(chǎn)，使得它們非常適合于用作(以粉末和氣溶膠形式)生物武器。

盡管前面的實(shí)例證明了高碘酸鹽方法相比標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)于從孢子釋放核酸的有效性，重要的是也理解使用高碘酸鹽處理后任何活孢子是否殘留。

實(shí)驗(yàn)方法

炭疽桿菌、肉毒梭菌、和難辨梭菌孢子的制備

肉毒梭菌B型和難辨梭菌的冷凍儲(chǔ)備培養(yǎng)物在具有5％綿羊血的胰蛋白酶大豆瓊脂上培養(yǎng)，并在35℃下厭氧孵育24至48小時(shí)。初始孵育后，將這些培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到多個(gè)(最少10個(gè))腦心浸液瓊脂板(Brain Heart Infusion Agar plates)，并在35℃下厭氧孵育長(zhǎng)達(dá)2周。

炭疽桿菌斯特恩(Sterne)菌株的冷凍儲(chǔ)備培養(yǎng)物在具有5％綿羊血的胰蛋白酶大豆瓊脂上培養(yǎng)，并在35℃、5％CO₂下孵育24小時(shí)。初始孵育后，將這些培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到多個(gè)(最少10個(gè))桿菌孢子形成瓊脂板(Bacillus Sporulation Agar plates)，并在35℃、CO₂下厭氧孵育長(zhǎng)達(dá)2周。

每3至4天進(jìn)行孔雀綠孢子染色以監(jiān)測(cè)體外細(xì)菌的孢子形成。當(dāng)制備的孔雀綠染色顯示生物體的形成孢子幾乎完成時(shí)，將孢子收獲至5.0mL的PBS(pH 7.4)中，并在室溫下保存直到使用。

孢子濃度的確定

將肉毒梭菌和難辨梭菌的每個(gè)孢子儲(chǔ)備懸浮液在PBS中稀釋至10^-2。將炭疽桿菌斯特恩(Sterne)菌株在PBS中稀釋至10^-3。將這些最終稀釋液中的每一個(gè)的等分試樣(10μL)裝入2室的血細(xì)胞計(jì)數(shù)器載玻片的每個(gè)清潔的孔中。在40x放大無(wú)油下觀(guān)察血細(xì)胞計(jì)數(shù)器室來(lái)進(jìn)行孢子計(jì)數(shù)。在血細(xì)胞計(jì)數(shù)器的光場(chǎng)網(wǎng)格上孢子可視化為圓形或橢圓形的黑細(xì)胞。炭疽桿菌，檢測(cè)極限(LOD)＝53個(gè)孢子/反應(yīng)；肉毒梭菌，LOD＝30個(gè)孢子/反應(yīng)；難辨梭菌，LOD＝20個(gè)孢子/反應(yīng)。

使用標(biāo)準(zhǔn)和高碘酸鹽方法處理孢子

1.為每種生物體以要求的濃度制備700μL的孢子儲(chǔ)備懸浮液。

2.將每個(gè)樣品分成2x 350μL體積。

3. 350μL用于WC BDL標(biāo)準(zhǔn)方法(“合作者”)：

a.取出50μL等分試樣以通過(guò)涂抹于具有5％綿羊血胰蛋白酶大豆瓊脂上確認(rèn)孢子是有生活力的(參見(jiàn)下文)。

4. 350μL用于高碘酸鹽方法：

a.將350μL BD2緩沖液(2％SDS、12.5mM CDTA、250mM LiCl、50mM甘氨酸，pH 10.5添加至炭疽桿菌、肉毒梭菌、難辨梭菌的350μL孢子儲(chǔ)備懸浮液。

b.渦旋混合。

c.取出100μL用于培養(yǎng)(“高碘酸鹽前”)。

d.添加50μL的300mM(間)高碘酸鈉或NPI儲(chǔ)備(終濃度30mM)，渦旋混合。

e.在70℃水浴中孵育20分鐘。

f.在室溫下冷卻樣品2分鐘。

g.取出100μL用于培養(yǎng)(“高碘酸鹽后”)。

培養(yǎng)孢子以確定生存能力

炭疽桿菌：將等分試樣直接涂抹于具有5％綿羊血的胰蛋白酶大豆瓊脂上，并在35℃、5％CO₂下孵育24小時(shí)。

肉毒梭菌和難辨梭菌：將等分試樣直接涂抹于具有5％綿羊血的胰蛋白酶大豆瓊脂上，并在35℃下厭氧孵育24至48小時(shí)。

結(jié)果與討論

這個(gè)實(shí)例證明本發(fā)明的“高碘酸鹽”方法是在降低來(lái)自炭疽桿菌(圖15)、肉毒梭菌(圖16)、和難辨梭菌(圖17)的頑強(qiáng)的孢子的生存能力方面非常有效。高碘酸鹽處理(高碘酸鹽后)顯著地降低了炭疽桿菌孢子的生存能力，但使用一次處理并沒(méi)有根除存在的所有孢子。相比之下，高碘酸鹽處理后通過(guò)培養(yǎng)沒(méi)有肉毒梭菌和難辨梭菌是有生活力的。有趣的是，單獨(dú)的BD2緩沖液(高碘酸鹽前)對(duì)肉毒梭菌和難辨梭菌(但不是炭疽桿菌)孢子生存能力具有顯著的影響，表明這些微生物比炭疽桿菌更容易溶解。

實(shí)例13：使用本發(fā)明來(lái)檢測(cè)在唾液和口腔清洗標(biāo)本中的分枝桿菌

根據(jù)世界衛(wèi)生組織，在2012年，130萬(wàn)人死于TB，860萬(wàn)人患上了結(jié)核病，并且估計(jì)在全世界有53萬(wàn)<15歲的兒童患上這種傳染病。TB是通過(guò)細(xì)小的呼吸飛沫從被感染的人傳播的空中疾病。患有TB的病人是最有可能傳播給與他們有密切和長(zhǎng)時(shí)間接觸的人，如家庭成員、朋友和同事。

小兒TB的診斷受獲得兒童痰標(biāo)本的困難和他們的往往需要侵入性操作(如胃抽吸或支氣管鏡檢)的疾病的少菌性質(zhì)所阻礙。如果TB可以從唾液或口腔樣品進(jìn)行診斷，收集可以很容易在野外或診所進(jìn)行。然而，使用傳統(tǒng)的DNA提取方法，在TB感染的個(gè)體的唾液中豐富的MTB被認(rèn)為太低的唾液而不被認(rèn)為是用于活性肺TB的診斷的可靠樣本類(lèi)型。

如今，診斷實(shí)驗(yàn)室主要依靠痰標(biāo)本來(lái)進(jìn)行肺TB的診斷。然而，許多患者(包括嬰兒和兒童)都不能咳出痰液，使用于TB診斷性研究的替代的非侵入性樣品很有價(jià)值。幾個(gè)研究已經(jīng)評(píng)估了使用口腔清洗標(biāo)本(戴維斯·JL(Davis Jl)等人，2009)和唾液樣本(亞森·G(Yassen G)等人，2012)用于活性TB的檢測(cè)。在不能產(chǎn)生痰的患者中，相比誘導(dǎo)痰，唾液樣品和/或口腔清洗標(biāo)本可能更容易和更安全地獲得，誘導(dǎo)痰對(duì)于低氧性患者可能是不舒服的和危險(xiǎn)的并且對(duì)于工作人員可能是費(fèi)時(shí)和有害的。對(duì)于口腔清洗標(biāo)本的收集，受試者被指示大力咳嗽5次，然后用10mL的無(wú)菌鹽水漱口60秒。相比咳出痰，使用口腔清洗標(biāo)本和唾液樣本產(chǎn)生較少的感染性氣溶膠。

眾所周知，PCR診斷疾病的敏感性可以通過(guò)優(yōu)化DNA提取技術(shù)來(lái)改善。實(shí)例9(上文)表明，本發(fā)明的高碘酸鹽方法比使用珠粒打漿的治療標(biāo)準(zhǔn)方法從MTB釋放顯著更多的DNA。此外，實(shí)例10表明，基于高碘酸鹽方法比凱杰DNA提取方法釋放顯著更多的MTB DNA在唾液中。因此，可以預(yù)料，通過(guò)利用本發(fā)明來(lái)提取MTB DNA獲得的增加的檢測(cè)敏感性將第一次使廣泛采用唾液和/或口腔清洗標(biāo)本在有癥狀的個(gè)體(特別是兒童)中作為肺TB的初步診斷標(biāo)本成為可能。盡管在活躍感染個(gè)體的唾液中MTB的數(shù)量很低，預(yù)期通過(guò)基于高碘酸鹽方法獲得的檢測(cè)敏感性的提高將使得使用這種容易收集的樣品類(lèi)型的MTB的更可靠的分子檢測(cè)成為可能。唾液和/或口腔清洗標(biāo)本可以很容易地從有癥狀的個(gè)體中收集以快速篩選TB并在較早階段開(kāi)始治療，這反過(guò)來(lái)將減少與這種感染性疾病相關(guān)的傳播和發(fā)病率。

同樣地，可以預(yù)期本發(fā)明的組合物也可以與支氣管肺泡灌洗樣品、尿液、糞便和胃抽出物一起用來(lái)從MTB提取DNA，導(dǎo)致在分子診斷測(cè)試中TB檢測(cè)的敏感性增加和鑒定的TB病例數(shù)增加。

實(shí)例14：使用高碘酸鹽從廣泛的微生物中釋放核酸

在這個(gè)實(shí)例中，用高碘酸鹽處理了一組不同的微生物，包括革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌(蘇云金芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、恥垢分枝桿菌)、革蘭氏陰性細(xì)菌(卡他莫拉菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、蜃樓弗朗西斯氏菌)和酵母(白色念珠菌)。使用2種不同的方法評(píng)估了核酸從這些微生物的釋放，即在酸提取HPLC方法和實(shí)時(shí)PCR(qPCR)。

實(shí)驗(yàn)方法

使細(xì)菌和酵母在如下推薦的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中和推薦的溫度下生長(zhǎng)：YEPD液體培養(yǎng)基(白色念珠菌)、具有0.1％半胱氨酸的胰蛋白酶大豆液體培養(yǎng)基(蜃樓弗朗西斯氏菌)、腦心浸液液體培養(yǎng)基(小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、卡他莫拉菌)或胰蛋白酶大豆液體培養(yǎng)基(蘇云金芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、恥垢分枝桿菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌)。小腸結(jié)腸炎耶爾森菌和白色念珠菌在30℃下生長(zhǎng)，而其他微生物在35℃下生長(zhǎng)。

過(guò)夜后，生長(zhǎng)的細(xì)胞通過(guò)在7,500g離心8分鐘來(lái)收集；丟棄上清液。細(xì)菌沉淀用冷的磷酸鹽緩沖鹽水通過(guò)在7,500g離心6分鐘洗滌一次，并且丟棄上清液。洗滌的細(xì)菌沉淀重懸浮于1.5mL冷水中。

將180μL的細(xì)胞懸浮液與200μL的BD2緩沖液(2％SDS、12.5mM CDTA、250mM LiCl、50mM甘氨酸，pH 10.5)混合，并且將20μL的300mM高碘酸鹽或無(wú)RNA酶/DNA酶的水(對(duì)照)加入到未接收高碘酸鹽的樣品。將樣品在35℃，70℃或80℃下孵育20分鐘。將樣品在14,000rpm離心5分鐘。將上清液轉(zhuǎn)移到新的管并且丟棄沉淀。

將所有樣品均通過(guò)添加16μL TK緩沖液(500mM Tris、1.5M醋酸鉀，pH 5.5)純化，首先在室溫下孵育5分鐘，然后在冰上孵育15分鐘，接著在14,000rpm離心5分鐘。每個(gè)樣品的一半體積用2X體積的冷的95％乙醇在-20℃下沉淀1小時(shí)；另一半通過(guò)添加鹽酸至0.2N的終濃度來(lái)進(jìn)行酸水解，并在60℃下孵育60分鐘。向所有酸水解的樣品中添加NaOH至過(guò)量0.1N，接著在100℃下孵育10分鐘。為了中和樣品用于反相HPLC，將300μL的500mM ADA pH 6.5添加到樣品，并且樣品持續(xù)3分鐘在14,000rpm下離心5分鐘。上清液通過(guò)HPLC分析，而且丟棄任何不溶的物質(zhì)。

將乙醇中的樣品在14,000rpm下離心3分鐘，除去上清液，并將沉淀溶解在50μL冷的無(wú)RNA酶/DNA酶水中。適用1μL純化的物質(zhì)在重復(fù)的25μL PCR反應(yīng)中作為模板。參見(jiàn)實(shí)例6使用通用細(xì)菌引物的實(shí)時(shí)PCR的條件。

通用的真菌引物是F:5’-gcatcgatgaagaacgcagc-3’和R:5’-tcctccgcttattgatatgc-3’。每個(gè)25μL PCR反應(yīng)含有2.0mM MgCl₂、0.2mM dNTPs、1.0μM Syto 9、4.0pmole通用真菌引物F、4.0pmole通用真菌引物R、2.0μg牛血清白蛋白(BSA)、1U FastStart Taq DNA聚合酶(羅氏公司(Roche))和1×FastStart PCR預(yù)混液。通用真菌引物的循環(huán)條件如下：95℃持續(xù)2分鐘x 1，(95℃持續(xù)20秒，56.5℃持續(xù)30秒，72℃持續(xù)25秒)x 38。

結(jié)果與討論

顯然，在高碘酸鹽的存在下比沒(méi)有它從廣泛的微生物中釋放顯著更多的DNA，如通過(guò)實(shí)時(shí)PCR(表19-21)和酸提取HPLC方法(表22-30)所示。高碘酸鹽的這種效果似乎是溫度依賴(lài)的，最佳核酸釋放發(fā)生在70-80℃。高碘酸鹽從革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性細(xì)菌、以及真菌中釋放核酸。有趣的是，高碘酸鹽從金黃色葡萄球菌釋放較少量的核酸，如通過(guò)HPLC方法(但不是實(shí)時(shí)PCR)檢測(cè)的。

表19：使用通用細(xì)菌引物的實(shí)時(shí)PCR的C_t值。

表20：使用通用細(xì)菌引物或通用真菌引物的實(shí)時(shí)PCR的C_t值。

表21：使用通用細(xì)菌引物的實(shí)時(shí)PCR的C_t值。

表22：如通過(guò)酸提取HPLC方法確定的從蜃樓弗朗西斯氏菌中釋放的DNA(％)

表23：如通過(guò)酸提取HPLC方法確定的從金黃色葡萄球菌中釋放的DNA(％)

表24：如通過(guò)酸提取HPLC方法確定的從恥垢分枝桿菌中釋放的DNA(％)

表25：如通過(guò)酸提取HPLC方法確定的從蘇云金芽孢桿菌中釋放的DNA(％)

表26：如通過(guò)酸提取HPLC方法確定的從小腸結(jié)腸炎耶爾森菌中釋放的DNA(％)

表27：如通過(guò)酸提取HPLC方法確定的從白色念珠菌中釋放的DNA(％)

表28：如通過(guò)酸提取HPLC方法確定的從卡他莫拉菌中釋放的DNA(％)

表29：如通過(guò)酸提取HPLC方法確定的從肺炎克雷佰菌中釋放的DNA(％)

表30：如通過(guò)酸提取HPLC方法確定的從銅綠假單胞菌中釋放的DNA(％)

實(shí)例15：使用高碘酸鹽用于從存在于不同生物樣品類(lèi)型中的結(jié)核分枝桿菌釋放DNA

可能在各種天然的環(huán)境中找到微生物，宿主生物體和生物樣品。這個(gè)實(shí)例顯示，DNA提取的本發(fā)明的化學(xué)“高碘酸鹽方法”是適合于檢測(cè)頑強(qiáng)的生物體，例如，來(lái)自不同復(fù)雜程度的生物樣品的結(jié)核分枝桿菌。具體地，結(jié)核分枝桿菌DNA是從人類(lèi)尿液和糞便樣品中回收。

實(shí)驗(yàn)方法

摻入結(jié)核分枝桿菌的生物樣品的制備

為了模擬結(jié)核陽(yáng)性樣品，將來(lái)自健康供體的1mL的尿液或糞便(從收集到2mL糞便勻漿緩沖液中的約400mg糞便的制備(美國(guó)系列號(hào)61/949,692))樣品摻入減毒結(jié)核分枝桿菌(aMTB)至大約3×10⁶cfu/mL的終濃度。

使用“高碘酸鹽方法”從結(jié)核分枝桿菌陽(yáng)性尿液和糞便中提取DNA

1.將200μL的摻入aMTB的尿液或糞便和等體積的BD2緩沖液混合

2.添加40μL NPI(終濃度30mM)，渦旋混合，并在70℃下孵育20分鐘

3.在室溫下冷卻樣品2分鐘。

4.添加1M Tris緩沖液(pH 7)至50mM的終濃度

5.在室溫下孵育10分鐘

6.添加3M醋酸鉀(pH 5.5)至150mM的終濃度

7.在冰上孵育10分鐘

8.在15,000x g下離心5分鐘

9.將上清轉(zhuǎn)移到新的管，并丟棄沉淀

10.添加800μL室溫95％乙醇并反轉(zhuǎn)20次混合

11.在室溫下孵育樣品15分鐘以沉淀DNA

12.在15,000x g下離心2分鐘以沉淀DNA

13.小心取出并丟棄上清液，小心不要打亂沉淀

14.添加100μL TE以再水化沉淀。

實(shí)時(shí)PCR

將從摻有aMTB的尿或糞便中分離的DNA用于在實(shí)例9和10中所描述的RD4Taqman實(shí)時(shí)PCR試驗(yàn)。在試驗(yàn)之前對(duì)糞便的DNA稀釋1:100，并且在每種情況下使用5μL。

結(jié)果與結(jié)論

在這個(gè)實(shí)例中，在100％測(cè)試的情況下使用“高碘酸鹽方法”提取的DNA被檢測(cè)為T(mén)B陽(yáng)性(表31)，表明本發(fā)明在釋放從低復(fù)雜性(主要是水性的、均質(zhì)的、pH值中性溶液)到更高復(fù)雜性(半固體、不均勻的、pH值可變的復(fù)合材料)范圍的樣品釋放功能性DNA是有效的。

表31：使用“高碘酸鹽方法”提取DNA后，檢測(cè)出TB陽(yáng)性的尿液和糞便樣品的百分比。

實(shí)例16：使用高碘酸鹽用于傳染病樣品的生物安全性。

持續(xù)上升的全世界TB感染需要涉及檢測(cè)、治療和預(yù)防的健康的醫(yī)學(xué)響應(yīng)。這種框架取決于積極參與具有高度傳染性樣品的處理的實(shí)驗(yàn)室以及相關(guān)的科研人員的大型網(wǎng)絡(luò)。鑒于TB很容易傳播，需要復(fù)雜的、高級(jí)別生物安全柜(BSC)來(lái)處理。而且，這些工人處于感染的潛在較高風(fēng)險(xiǎn)中。具有迅速使這些樣本“生物安全”(即，不再有生活力)并且因此搬遷至更加基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)室用于下游分析的能力的組合物是在這一領(lǐng)域中明顯的優(yōu)勢(shì)。

在這個(gè)實(shí)例中，在用和不用高碘酸鹽的處理試驗(yàn)方案之后獲得的細(xì)菌沉淀從生物安全性的視角來(lái)進(jìn)行評(píng)估，以確保材料可以安全地從BSL-3(生物安全3級(jí))搬遷至BSL-2實(shí)驗(yàn)室的生物套房用于分析。

實(shí)驗(yàn)方法

摻入結(jié)核分枝桿菌的生物樣品的制備

為了模擬結(jié)核病陽(yáng)性痰，將具有如下大概儲(chǔ)備濃度的減毒結(jié)核分枝桿菌(aMTB)摻入來(lái)自健康捐贈(zèng)者的唾液樣品。

1. 7.5x 10⁹cfu/mL(高負(fù)載)

2. 7.5x 10⁷cfu/mL(中負(fù)載)

根據(jù)以下組來(lái)制備摻入的唾液樣品，并且使用高負(fù)載儲(chǔ)備濃度或中負(fù)載儲(chǔ)備濃度來(lái)制備每個(gè)組：

A.1.0mL唾液+1.0mL BD2緩沖液+100μL aMTB儲(chǔ)備液：無(wú)NPI處理

B.2.0mL唾液+100μL aMTB儲(chǔ)備液：無(wú)NPI處理

C.2.0mL唾液+100μL aMTB儲(chǔ)備液：NPI處理

D.1.0mL唾液+1.0mL BD2緩沖液+100μL aMTB儲(chǔ)備液：NPI處理

在各組中aMTB的終濃度為約3.75×10⁸cfu/mL(高負(fù)載樣品)或約3.75×10⁶cfu/mL(中負(fù)載樣品)。每只管短暫地渦旋混合，并且將樣品處理如下：

用于組A和組B樣品的試驗(yàn)方案

1.將每個(gè)樣品等分至3只新的1.5mL離心管，每管500μL

2.將管在3500x g下離心20分鐘

3.取出并丟棄懸浮液

4.將沉淀重懸浮于50μL的無(wú)菌PBS中

5.仔細(xì)地將PBS沉淀混合物應(yīng)用到Lowenstein-Jansen培養(yǎng)基管(LJ斜面)的頂邊，并輕輕左右搖擺來(lái)分配樣品。

6.在35℃下孵育42天并對(duì)生長(zhǎng)進(jìn)行評(píng)分

用于組C和組D樣品的試驗(yàn)方案

1.將每個(gè)樣品等分至3只新的1.5mL離心管，每管500μL

2.將管在3500x g下離心20分鐘

3.取出并丟棄懸浮液

4.將沉淀重懸浮于500μL的50％BD2緩沖液中

5.添加50μL NPI(終濃度30mM)，渦旋混合，并在70℃下孵育20分鐘

6.在室溫下冷卻樣品2分鐘。

7.添加1M Tris緩沖液(pH 7)至50mM的終濃度

8.將管在3500x g下離心20分鐘

9.取出并丟棄懸浮液

10.在500μL的無(wú)菌PBS中洗滌沉淀

11.將管在3500x g下離心20分鐘

12.取出并丟棄懸浮液

13.將沉淀重懸浮于50μL的無(wú)菌PBS中

14.仔細(xì)地將PBS沉淀混合物應(yīng)用到Lowenstein-Jansen培養(yǎng)基管(LJ傾斜)的頂邊，并輕輕左右搖擺來(lái)分配樣品。

15.在35℃下孵育42天并對(duì)生長(zhǎng)進(jìn)行評(píng)分

結(jié)果與結(jié)論

表32：在NPI存在或不存在下在LJ斜面上的aMTB生長(zhǎng)的總結(jié)

*缺乏初始裂解緩沖液(BD2)以消除背景菌群造成這些污染微生物的快速生長(zhǎng)

表32說(shuō)明了在NPI存在下TB生存能力的阻止。在不存在NPI的A和B組中，8-10天后TB菌落開(kāi)始出現(xiàn)(A組)，并污染的背景菌群在一天內(nèi)淹沒(méi)了LJ培養(yǎng)基(B組)。相反，在添加了NPI的C和D組中，甚至在孵育42天后(其是用于確定TB陰性狀態(tài)的目前的培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn))，沒(méi)有觀(guān)察到任何微生物的生長(zhǎng)。這表明TB生存能力的阻止需要NPI。即使用于去除背景菌群的初始裂解緩沖液不存在(BD2；C組)，這種效果也可見(jiàn)，表明單獨(dú)的NPI足以阻止TB生存能力。這對(duì)本領(lǐng)域的當(dāng)前狀態(tài)是明顯的改善，因?yàn)樗试S個(gè)別操作的TB陽(yáng)性樣品迅速和有效地提供樣品生物安全性。從而降低對(duì)個(gè)體的風(fēng)險(xiǎn)，并且這些NPI處理的樣品可以從限制性BSL3環(huán)境遷至BSL2實(shí)驗(yàn)室用于進(jìn)一步分析，包括DNA提取和實(shí)時(shí)PCR(參見(jiàn)實(shí)例9)。

實(shí)例17：在NaOH-NALC痰樣品中直接測(cè)試ML的活性

NaOH/NALC被廣泛用于液化痰。這個(gè)實(shí)例證明高碘酸鹽仍然有效，即，從用NaOH/NALC處理的痰樣品中的MTB釋放核酸。

實(shí)驗(yàn)方法

摻入結(jié)核分枝桿菌的痰樣品的制備

為了模擬結(jié)核病陽(yáng)性痰，將痰樣品(購(gòu)買(mǎi)自組織溶液有限公司(Tissue Solutions Ltd.)，格拉斯哥，蘇格蘭)摻入約9x106CFU/mL減毒結(jié)核分枝桿菌H37Ra(aMTB)，并且分成兩個(gè)部分。一個(gè)部分用等體積的NaOH/NALC在室溫下處理15分鐘，而第二部分與等體積BD2緩沖液(50mM甘氨酸、250mM LiCl、12.5mM Li-CDTA、2％SDS，pH 10.5)混合。將BD緩沖器處理的痰在5,000rpm下離心20分鐘，并且將沉淀再懸浮于1mL PBS中，向該P(yáng)BS中添加1mL BD2緩沖液。

使用最佳的高碘酸鹽方法從在NaOH/NALC或BD緩沖液中的aMTB陽(yáng)性痰提取DNA

1.將三個(gè)200μL等分試樣的NaOH/NALC處理的痰或BD2緩沖液處理的痰(上文)用NPI處理至30mM的終濃度，渦旋混合。

2.在70℃水浴中孵育20分鐘。

3.將等分試樣在室溫下冷卻2分鐘。

4.添加1M Tris緩沖液(pH 7)至50mM的終濃度。

5.添加3M醋酸鉀(pH 5.5)至150mM的終濃度。

6.在冰上孵育10分鐘。

7.以13,200rpm離心5分鐘。

8.將上清轉(zhuǎn)移到干凈的管。丟棄沉淀。

9.添加400μL室溫的95％乙醇。反轉(zhuǎn)20次混合。

10.在室溫下孵育樣品15分鐘以沉淀DNA。

11.以15,000rpm離心2分鐘以沉淀DNA。

12.輕輕取出并丟棄上清液，小心不要打亂沉淀。

13.將沉淀溶于200μL TE。短暫渦旋以充分重懸DNA。

使用縮短的高碘酸鹽方法從在NaOH/NALC中的aMTB陽(yáng)性痰提取DNA

1.將三個(gè)200μL等分試樣的NaOH/NALC處理的痰(上文)用NPI處理至30mM的終濃度，渦旋混合。

2.在70℃水浴中孵育20分鐘。

3.將等分試樣在室溫下冷卻2分鐘。

4.添加1M Tris緩沖液(pH 7)至50mM的終濃度。

5.在室溫下孵育10分鐘。

6.添加2體積的室溫的95％乙醇。反轉(zhuǎn)20次混合。

7.在室溫下孵育樣品15分鐘以沉淀DNA。

8.以15,000rpm離心2分鐘以沉淀DNA。

9.輕輕取出并丟棄上清液，小心不要打亂沉淀。

10.將沉淀溶于200μL TE。短暫渦旋以充分重懸DNA。

rtPCR條件

在這個(gè)實(shí)例中，使從摻有aMTB的痰樣品(上文)中分離的DNA經(jīng)受特異于分枝桿菌的rtPCR試驗(yàn)，RD4Taqman實(shí)時(shí)PCR測(cè)定(參見(jiàn)實(shí)例10)。

結(jié)果與結(jié)論

如上文概述的，用于NaOH/NALC處理的痰的提取試驗(yàn)方案可以通過(guò)去除從BD2緩沖液處理的樣品沉淀SDS需要的醋酸鉀和離心步驟來(lái)縮短。本實(shí)例使用對(duì)結(jié)核分枝桿菌特異的實(shí)時(shí)PCR試驗(yàn)來(lái)證明高碘酸鹽能夠在用NaOH/NALC處理后從痰中的aMTB釋放核酸(表33)。相比本發(fā)明的方法，BD2緩沖液處理接著用高碘酸鹽提取DNA，當(dāng)在使用高碘酸鹽進(jìn)行DNA提取之間用NaOH/NALC處理痰時(shí)Ct值僅高出2個(gè)循環(huán)。

表33：對(duì)從摻有aMTB的痰中釋放的DNA的定量

實(shí)例18：高碘酸鹽方法與治療標(biāo)準(zhǔn)相比用于結(jié)核分枝桿菌的分子檢測(cè)

CDC建議臨床標(biāo)本同時(shí)通過(guò)培養(yǎng)、抗酸桿菌(AFB)染色、和核酸擴(kuò)增試驗(yàn)方案來(lái)進(jìn)行分析(匿名，2009)。培養(yǎng)是TB陽(yáng)性的最終確定的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”，但它是緩慢的并可能需要長(zhǎng)達(dá)8周。AFB染色是快速的，但具有低敏感性和低特異性，因?yàn)樗粎^(qū)分來(lái)自結(jié)核分枝桿菌復(fù)合體(MTBC)的成員與非結(jié)核分枝桿菌(NTM)。因此，對(duì)控制疾病的傳播至關(guān)重要的快速鑒定依賴(lài)于核酸擴(kuò)增試驗(yàn)方案，例如實(shí)時(shí)PCR(qPCR)和測(cè)序。

在結(jié)核分枝桿菌感染的患者中抗生素耐藥性的評(píng)估是對(duì)患者管理和控制疾病的傳播至關(guān)重要的。結(jié)核分枝桿菌的藥物敏感試驗(yàn)(DST)的標(biāo)準(zhǔn)方法可能需要幾周到幾個(gè)月來(lái)提供結(jié)果。由于多重耐藥結(jié)核病(MDR-TB)和廣泛耐藥結(jié)核病(XDR-TB)的出現(xiàn)，已經(jīng)發(fā)展出快速的分子辦法。rpoB基因內(nèi)突變與利福平(RIF)耐藥性相關(guān)，而katG基因和inhA基因的突變與異煙肼耐藥性相關(guān)。哈爾斯(Halse)等人(2010)開(kāi)發(fā)了兩步分子方法，該方法直接用對(duì)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合體(MTBC)陽(yáng)性的臨床標(biāo)本通過(guò)實(shí)時(shí)PCR利用抗生素抗性基因焦磷酸測(cè)序分析。

在這個(gè)實(shí)例中，對(duì)通過(guò)兩種不同的方法處理的TB陽(yáng)性痰樣品(由創(chuàng)新診斷基金會(huì)(FIND)結(jié)核標(biāo)本庫(kù)惠贈(zèng))的臨床評(píng)估進(jìn)行了并排比較。具體地，1)“治療標(biāo)準(zhǔn)”方法，包括氫氧化鈉處理，接著是珠粒打漿，和2)本發(fā)明在CLIA/CLEP批準(zhǔn)的qPCR試驗(yàn)(靶向RD4MTBC差異區(qū)域(RD))(哈爾斯(Halse)等人，2011)和抗生素抗性基因焦磷酸測(cè)序試驗(yàn)(哈爾斯(Halse)等人，2010)的敏感性方面進(jìn)行了比較。在本發(fā)明的方法中，在DNA的分離和試驗(yàn)檢測(cè)之前，TB陽(yáng)性痰樣品用BD2緩沖液和高碘酸鹽進(jìn)行處理以促進(jìn)標(biāo)本中的細(xì)胞的化學(xué)細(xì)胞溶解。

與本發(fā)明相反，“治療標(biāo)準(zhǔn)”方法包括珠粒打漿、機(jī)械方法以破開(kāi)痰樣品中的細(xì)菌。雖然機(jī)械珠粒打漿可以有效地破開(kāi)生物體，但是它在實(shí)驗(yàn)室的確產(chǎn)生危險(xiǎn)的氣溶膠。因此，非常希望開(kāi)發(fā)一種有效的、非機(jī)械的、化學(xué)的方法以安全地從結(jié)核分枝桿菌釋放DNA，而不會(huì)對(duì)診斷測(cè)試的臨床敏感性產(chǎn)生負(fù)面影響。

實(shí)驗(yàn)方法

結(jié)核分枝桿菌陽(yáng)性痰樣品

對(duì)于本實(shí)例，來(lái)自確認(rèn)的TB陽(yáng)性患者的未加工的痰樣品由創(chuàng)新診斷基金會(huì)(FIND)結(jié)核病標(biāo)本庫(kù)惠贈(zèng)。使用涂片和培養(yǎng)分析，F(xiàn)IND將這些樣品歸類(lèi)為‘低’、‘中’和‘高’TB陽(yáng)性標(biāo)本。一式兩份的0.5mL的等分試樣從30位患者樣品提供并且冷凍儲(chǔ)存。將等分試樣冷凍運(yùn)到沃茲沃斯中心分枝桿菌學(xué)實(shí)驗(yàn)室(Wadsworth Center Mycobacteriology Laboratory)(紐約州衛(wèi)生部門(mén)，奧爾巴尼，紐約州，美國(guó))以進(jìn)行進(jìn)一步的分析，該實(shí)驗(yàn)室是CLIA/CLEP批準(zhǔn)的臨床實(shí)驗(yàn)室。

將來(lái)自30為供體的一式兩份的等分試樣在冰上解凍；在DNA的分離之前，一組等分試樣使用“治療標(biāo)準(zhǔn)”方法(合作者)來(lái)處理并且第二組用BD2緩沖液和高碘酸鹽來(lái)處理。

使用“治療標(biāo)準(zhǔn)”方法處理TB陽(yáng)性痰

1.將0.5mL 3.5％NaOH添加到每個(gè)0.5mL痰等分試樣(n＝6)；渦旋混合。

2.在室溫下孵育15分鐘。

3.用無(wú)菌磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)升至10mL。

4.以5,000rpm離心20分鐘以沉淀細(xì)菌。丟棄上層清液。

5.在0.5mL無(wú)菌PBS中重懸沉淀。

6.預(yù)留300μL的重懸浮的細(xì)菌用于培養(yǎng)以確認(rèn)結(jié)核分枝桿菌的生存能力。

7.通過(guò)將200mg的105-150微米的玻璃珠添加至剩余的200μL的再懸浮細(xì)菌來(lái)裂解細(xì)菌。

8.珠粒打漿2個(gè)周期，每個(gè)周期1分鐘，隨后使用微型珠粒打漿機(jī)(BioSpec產(chǎn)品)在冰上進(jìn)行1分鐘。

使用碘酸試驗(yàn)方法處理TB-陽(yáng)性痰

1.將0.5mL BD2緩沖液(2％SDS、12.5mM CDTA、250mM LiCl、50mM甘氨酸，pH 10.5)添加到每個(gè)0.5mL痰等分試樣(n＝6)；渦旋混合。

2.添加蛋白酶K(400μg)，并在50℃水浴中孵育2小時(shí)。

3.添加NPI至30mM的終濃度，渦旋混合。

4.在70℃水浴中孵育20分鐘。

5.在室溫下冷卻樣品2分鐘。

6.添加1M Tris緩沖液(pH 7)至50mM的終濃度。

7.在室溫下孵育10分鐘。

8.添加3M醋酸鉀(pH 5.5)至150mM的終濃度。

9.在冰上孵育10分鐘。

10.以13,000rpm離心5分鐘。

11.將上清轉(zhuǎn)移到干凈的標(biāo)記的管。丟棄沉淀。

12.添加2體積的室溫的95％乙醇；反轉(zhuǎn)20次以混合。

13.在室溫下孵育樣品15分鐘以沉淀DNA。

14.以15,000rpm離心2分鐘以沉淀DNA。

15.輕輕取出并丟棄上清液，小心不要打亂沉淀。

16.將沉淀溶于200μL TE。

17.短暫地渦旋以充分重懸DNA并且在室溫下靜置至少30分鐘。

對(duì)結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR和抗生素抗性焦磷酸測(cè)序

使用CLIA/CLEP批準(zhǔn)的qPCR試驗(yàn)，來(lái)自每個(gè)純化的痰樣品(上文)的5μL‘純的’DNA和5μL稀釋的(1:10)DNA的重復(fù)反應(yīng)在ABI7500實(shí)時(shí)PCR儀上擴(kuò)增，該qPCR試驗(yàn)靶向RD4MTBC差異區(qū)域(RD)(哈爾斯(Halse)等人，2011)。小于37的閾值循環(huán)(C_t)值報(bào)道為陽(yáng)性，并且值大于37的樣品被重測(cè)；如果結(jié)果是相同的，結(jié)果被報(bào)告為陽(yáng)性，并且如果它們不同，它們被報(bào)告為不確定的。

對(duì)于利福平耐藥性用先前公布的焦磷酸測(cè)序法(rpoB)(哈爾斯(Halse)等人，2010)和對(duì)于異煙肼耐藥性用另外的靶標(biāo)(inhA和katG)來(lái)進(jìn)行抗生素耐藥性分析。從兩種方法獲得的DNA被用于單獨(dú)的PCR反應(yīng)以擴(kuò)增rpoB、inhA和katG基因的特異性區(qū)域。在這些區(qū)域中的突變表明對(duì)利福平和/或異煙肼抗生素的可能的耐藥性。

結(jié)果與討論

現(xiàn)在，治療標(biāo)準(zhǔn)方法涉及用氫氧化鈉(或NaOH/NALC)液化痰，接著是使用機(jī)械珠粒打漿從細(xì)菌分離DNA。本發(fā)明的方法與那樣一種簡(jiǎn)單的化學(xué)處理不同，包括高碘酸鹽，有效地裂解細(xì)菌。重要的是，如果本發(fā)明的組合物和方法在引起對(duì)結(jié)核分枝桿菌特異的DNA和抗生素抗性標(biāo)記的后續(xù)檢測(cè)方面不是更加有效，本發(fā)明的組合物和方法似乎也與治療標(biāo)準(zhǔn)方法一樣有效。

表34：在結(jié)核分枝桿菌中對(duì)三種抗生素抗性標(biāo)記的焦磷酸測(cè)序結(jié)果。

相比傳統(tǒng)的方法(“合作者”，表34)，本發(fā)明的化學(xué)方法(“高碘酸鹽法”，表34)通過(guò)qPCR在由培養(yǎng)和涂片鏡檢歸類(lèi)為‘低’和‘中’TB陽(yáng)性的痰樣品中導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌特異性檢測(cè)的臨床敏感性增加。在這個(gè)實(shí)例中，直到使用“治療標(biāo)準(zhǔn)”方法提取的DNA被稀釋10倍才通過(guò)qPCR檢測(cè)到在‘中’和‘高’TB陽(yáng)性痰樣品中的結(jié)核分枝桿菌(表34)。對(duì)于所有TB負(fù)載的水平，表1闡明了相比治療標(biāo)準(zhǔn)方法(合作者)，使用本發(fā)明的方法(高碘酸鹽法)處理的所有TB陽(yáng)性痰樣品中結(jié)核分枝桿菌的顯著改善的檢測(cè)極限(通過(guò)qPCR的較低的C_t值)。這個(gè)較低的檢測(cè)極限，幫助確保對(duì)來(lái)自患者痰樣品的結(jié)核分枝桿菌的精確診斷。

類(lèi)似地，本發(fā)明的組合物和方法是與工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試兼容來(lái)預(yù)測(cè)在結(jié)核分枝桿菌陽(yáng)性標(biāo)本中的抗生素抗性。對(duì)于測(cè)試的6個(gè)臨床的TB陽(yáng)性痰標(biāo)本，用治療標(biāo)準(zhǔn)方法和高碘酸鹽方法獲得的焦磷酸測(cè)序法結(jié)果是100％一致的。重要的是，從這6個(gè)患者痰樣品中，本發(fā)明的高碘酸鹽方法，但不是治療標(biāo)準(zhǔn)方法，檢測(cè)到2名患者(FIND 01 012072和FIND 01 01 2137)具有抗生素抗性標(biāo)記(inhA和ropB基因)(表34)。甚至黃金標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)測(cè)試在體外52天后沒(méi)能顯示這2個(gè)患者的樣品中的分枝桿菌的生長(zhǎng)。

在測(cè)試時(shí)分枝桿菌DNA的回收率增加帶來(lái)的影響最好使用焦磷酸測(cè)序數(shù)據(jù)高亮顯示。用高碘酸鹽處理的樣品具有足夠數(shù)量可用的DNA以在測(cè)試的第0天對(duì)抗生素抗性標(biāo)記進(jìn)行測(cè)試。相比之下，治療標(biāo)準(zhǔn)方法在焦磷酸測(cè)序前需要平均14天用于MGIT培養(yǎng)來(lái)變成陽(yáng)性，該方法可以在第0天被PCR測(cè)試為陰性樣品上重復(fù)。患者的抗生素特征曲線(xiàn)對(duì)病例管理至關(guān)重要，并且使用適當(dāng)?shù)目股刂委煹妮^早期干預(yù)將減少傳播率和增加恢復(fù)的幾率。因此，本發(fā)明對(duì)通過(guò)實(shí)時(shí)PCR的MTBC的快速的當(dāng)天的鑒定有價(jià)值，并且足夠靈敏以檢測(cè)用于結(jié)核分枝桿菌的抗生素抗性標(biāo)記，無(wú)需等待通過(guò)培養(yǎng)來(lái)檢測(cè)分枝桿菌。

實(shí)例19：從痰拭子樣品中檢測(cè)MTB

對(duì)于結(jié)核病的最優(yōu)控制，早期診斷是至關(guān)重要的。若干研究人員已經(jīng)開(kāi)發(fā)出實(shí)時(shí)PCR試驗(yàn)，該實(shí)時(shí)PCR試驗(yàn)提供對(duì)患者樣品中結(jié)核分枝桿菌復(fù)合體(MTBC)的各種靶序列和藥物抗性基因的快速檢測(cè)。這些試驗(yàn)檢測(cè)臨床樣品中的MTBC的能力取決于所選的靶序列和DNA提取程序的效率。前面的實(shí)例已經(jīng)證明，本發(fā)明大幅改善了從微生物(如MTB)的核酸提取，增加了在人類(lèi)痰中結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)的敏感性。

代替處理全部痰標(biāo)本，通過(guò)直接從處于未加工的或未處理的狀態(tài)(即，用氫氧化鈉和/或NALC凈化之前)的每個(gè)標(biāo)本的一小部分提取核酸可以獲得進(jìn)一步的效率。這個(gè)實(shí)例證明可商購(gòu)的拭子可以用來(lái)成功地捕獲和轉(zhuǎn)移未處理的痰的小等分試樣(每個(gè)拭子大約100-200微升)。結(jié)合用本發(fā)明所獲得的提取效率，處理全部樣品的一小部分可以極大地改善標(biāo)本在實(shí)驗(yàn)室中的處理，以及診斷的時(shí)間。

材料與方法

將一個(gè)3mL冷凍的、未處理的痰樣品(組織溶液有限公司(Tissue Solutions Ltd.))解凍，并被摻入9x10⁷CFU/mL減毒的MTB H37Ra(aMTB)。一次一個(gè)地將8個(gè)FLOQ(科潘診斷公司(Copan Diagnostics Inc.)；目錄號(hào)502CS01)和8個(gè)Hydra Flock(清教徒醫(yī)療產(chǎn)品有限公司(Puritan Medical Products Co.,LLC)；目錄號(hào)25-3406-H)拭子浸入摻有aMTB的痰中，盤(pán)繞10秒，然后轉(zhuǎn)移到含有500μL的BD2緩沖液(50mM甘氨酸、250mM LiCl、12.5mM Li-CDTA、2％SDS，pH 10.5)的管中。在室溫下放置2小時(shí)后，將拭子取出，將管在3,500rpm下離心20分鐘，并將沉淀再懸浮于100μL PBS中。將每個(gè)拭子兩個(gè)重懸樣品涂抹到M7H10瓊脂平板上，并且在35℃下孵育21天以確認(rèn)aMTB的生存能力；將每個(gè)拭子6個(gè)再懸浮樣品在用和不用高碘酸鹽提取核酸之前與100μL BD2緩沖液混合(參見(jiàn)下文)。

使用高碘酸鹽方法從aMTB陽(yáng)性痰中提取DNA

1.將五個(gè)200μL的等分試樣(拭子1-5；上文)用NPI處理至30mM的終濃度，渦旋混合；一個(gè)200μL的等分試樣(拭子6)不用NPI處理。

2.在70℃水浴中孵育20分鐘。

3.將等分試樣在室溫下冷卻2分鐘。

4.添加1M Tris緩沖液(pH 7)至50mM的終濃度。

5.添加3M醋酸鉀(pH 5.5)至150mM的終濃度。

6.在冰上孵育10分鐘。

7.以13,200rpm離心5分鐘。

8.將上清轉(zhuǎn)移到干凈的管。丟棄沉淀。

9.添加400μL室溫的95％乙醇。反轉(zhuǎn)20次混合。

10.在室溫下孵育樣品15分鐘以沉淀DNA。

11.以15,000rpm離心2分鐘以沉淀DNA。

12.輕輕取出并丟棄上清液，小心不要打亂沉淀。

13.將沉淀溶于200μL TE。短暫渦旋以充分重懸DNA。

rtPCR條件

在這個(gè)實(shí)例中，使從摻有aMTB的痰樣品(上文)中分離的DNA經(jīng)受特異于分枝桿菌的rtPCR試驗(yàn)，RD4Taqman實(shí)時(shí)PCR測(cè)定(參見(jiàn)實(shí)例10)。

結(jié)果與結(jié)論

用拭子收集的摻有aMTB的痰在培養(yǎng)基中是有生活力的。在培養(yǎng)基中21天后，從科潘(Copan)拭子分離出的aMTB產(chǎn)生了一菌苔的細(xì)菌，而從清教徒(Puritan)拭子回收的aMTB產(chǎn)生了大約200個(gè)菌落/平板。

使用MTB特異的rtPCR很容易地檢測(cè)從單個(gè)科潘或清教徒拭子收集的aMTB DNA的量(拭子6；參見(jiàn)表35)。當(dāng)高碘酸鹽包含在DNA提取試驗(yàn)方案中時(shí)(拭子1-5；表35)，C_t值下降超過(guò)3個(gè)周期，對(duì)于科潘拭子從27.75下降到24.02，對(duì)于清教徒拭子從27.62下降到23.69，相當(dāng)于在每個(gè)拭子回收的aMTB特異DNA的量超過(guò)10倍的增加。此外，使用純的對(duì)比稀釋的DNA(1:10)的rtPCR證明了預(yù)期的3個(gè)循環(huán)的差異，表明提取的DNA包含很少或幾乎沒(méi)有PCR抑制劑。

因此，將拭子浸入未處理的痰標(biāo)本可以提供足夠的樣本(100-200μL)來(lái)迅速診斷在中至高陽(yáng)性標(biāo)本終的結(jié)核分枝桿菌的存在。重要的是，在DNA提取試驗(yàn)方案中包含高碘酸鹽增加了這項(xiàng)檢測(cè)的敏感性至少10倍，其對(duì)于低至中陽(yáng)性標(biāo)本具有重要的影響。

表35：使用拭子和高碘酸鹽從痰中分離的DNA的實(shí)時(shí)PCR分析。

其他參考文獻(xiàn)

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如此描述了本發(fā)明，但顯而易見(jiàn)的是它可以以許多方式變化。這些變化不被視為違背本發(fā)明的精神和范圍，并且所有這樣的修改，如將對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的，旨在被包括在以下權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。