在過去的數(shù)十年，代謝工程實踐者已經(jīng)致力于探索生物解決方案以生產(chǎn)化學品，因此，提供更傳統(tǒng)化學方法的替代。通常而言，生物解決方案允許利用可再生原料(例如糖)并且與基于現(xiàn)有石油化學的方法競爭。一種用于生產(chǎn)化學品的多步驟生物解決方案一般包含微生物作為將原料轉(zhuǎn)化成靶分子的催化劑。用于產(chǎn)生特定靶分子的全套酶反應可以劃分成屬于中心碳途徑的那些酶反應和屬于產(chǎn)物特異性途徑的那些酶反應。屬于中心碳途徑和產(chǎn)物特異性途徑的反應是關聯(lián)的，因為必須在有助于該方法的競爭力總體權衡下考慮每種酶反應的氧化還原約束條件(一般是NAD(P)H)和能量學約束條件(一般是ATP)。歷史上，將糖上生長的異養(yǎng)生物的中心碳途徑描述為Embden-Meyerhoff-Parnas途徑(EMPP；即“糖酵解”)、磷酸戊糖途徑(PPP)、Entner-Doudoroff途徑(EDP)和磷酸轉(zhuǎn)酮酶途徑(PKP)(見Gottschalk(1986),Bacterial Metabolism,第2版Springer-Verlag,New York)。每個中心途徑或中心途徑組合相對于特定靶分子提供優(yōu)點和缺點。為了提供有競爭力的生物加工，已經(jīng)描述了具有涉及EMPP，PPP和EDP的修飾的重組微生物(M.Emmerling等人,Metab.Eng.1:117(1999)；L.O.Ingram等人,Appl.Environ.Microbiol.53:2420(1987)；C.T.Trinh等人,Appl.Environ.Microbiol.74:3634(2008))。最近，已經(jīng)描述了具有涉及PKP的修飾的重組微生物(見Sonderegger等人,Appl.Environ.Microbiol.70(2004),2892-2897，美國專利7,253,001，Chinen等人,J.Biosci.Bioeng.103(2007),262-269，美國專利7,785,858；Fleige等人，Appl.Microbiol.Cell Physiol.91(2011),769-776)。

EMPP(糖酵解)將1mol葡萄糖轉(zhuǎn)化成2mol丙酮酸(PYR)。當需要乙酰-CoA時，1mol PYR可以轉(zhuǎn)化成1mol乙酰-CoA(AcCoA)，同時生成1mol CO₂和1mol NADH。在方程1中給出對反應的總結。

葡萄糖+2ADP+2H₃PO₄+2CoA+4NAD⁺→

2乙酰-CoA+2CO₂+2ATP+2H₂O+4NADH+4H⁺(方程1)

PPP提供將1mol葡萄糖轉(zhuǎn)化成1mol CO₂和2mol NADPH的手段，同時產(chǎn)生0.67mol果糖-6-磷酸(F6P)和0.33mol甘油醛-3-磷酸(GAP)。如此形成的F6P和GAP必須由其他反應途徑代謝，例如由EMPP代謝。EDP將1mol葡萄糖轉(zhuǎn)化成1mol GAP和1mol PYR，同時產(chǎn)生1mol NADPH。與PPP相同，如此形成的GAP必須由其他反應途徑代謝。PKP提供將1mol葡萄糖轉(zhuǎn)化成1mol GAP和1.5mol乙酰磷酸(AcP)的手段。當需要乙酰-CoA時，1當量AcP外加1當量輔酶A(CoA)可以由磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶的作用轉(zhuǎn)化成1當量乙酰-CoA和1當量無機磷酸(Pi)。

本領域已經(jīng)描述了用于遺傳修飾微生物的多種方案，從而能夠?qū)⒍喾N原料如液化玉米粉、甘油或合成氣(氫和一氧化碳的混合物)或化合物如甲烷轉(zhuǎn)化成所需化合物如液態(tài)燃料或丁醇(參見，例如，WO 2012/053905和Peralta-Yahya等人,Nature 488(2012),320-328)。例如，Conrado和Gonzalez(Science 343(2014),621-623)討論了轉(zhuǎn)化甲烷成液態(tài)燃料的可能選項并且在這種情況下提到，甲烷營養(yǎng)菌可以通過直接利用甲醛的核酮糖單磷酸(RuMP)循環(huán)或從充分氧化的甲醛通過Calvin-Benson-Bassham-(CBB)CO₂-固定循環(huán)，將甲醛轉(zhuǎn)化成丙酮酸。但是，據(jù)稱這類方法的效率低并且據(jù)稱這些方法涉及高的代謝能量損耗。

考慮到對利用可再生資源生產(chǎn)所有種類化合物的方法的需求日益增加，需要提供允許高效生產(chǎn)中心代謝物如乙酰-CoA或其前體的手段和方法，因而建立開發(fā)其他方法將這些代謝物轉(zhuǎn)化成有用化合物的平臺。

因此，需要提供這樣的方法，所述方法包括通過最佳容忍酶反應的氧化還原約束條件和能量學約束條件而將原料最大限度轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物的中心碳途徑和產(chǎn)物特異性途徑，因而允許能量學高效地產(chǎn)生乙酰-CoA前體，所述乙酰-CoA是許多生物的、尤其可以用于從可再生資源產(chǎn)生多種工業(yè)重要化合物的的微生物的分解代謝的大部分中心代謝物之一。申請人已經(jīng)通過提供如權利要求書中定義的實施方案滿足這種需求。

需要提供這樣的方法，所述方法因而允許能量學高效地產(chǎn)生乙酰-CoA前體，所述乙酰-CoA是許多生物的、尤其可以用于從可再生資源產(chǎn)生多種工業(yè)重要化合物的的微生物的分解代謝的大部分中心代謝物之一。本發(fā)明通過提供如權利要求書中定義的實施方案解決這種需求。

因此，本發(fā)明涉及通過利用磷酸轉(zhuǎn)酮酶或磺基乙醛乙酰轉(zhuǎn)移酶從甲醛產(chǎn)生乙酰磷酸的方法。

發(fā)明人令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，劃歸為磷酸轉(zhuǎn)酮酶的酶能夠根據(jù)以下反應方案從甲醛和磷酸催化形成乙酰磷酸：

2CH₂O+磷酸→乙酰磷酸+H₂O。

這種反應強烈地放能，在生理條件下比ATP水解發(fā)散更多能量。

不同類型的磷酸轉(zhuǎn)酮酶是已知的并且它們均可以用于本發(fā)明的方法中。通常，就其天然催化的反應而言基于底物偏好性，磷酸轉(zhuǎn)酮酶劃分成兩個類型：木酮糖-5-磷酸(X5P)磷酸轉(zhuǎn)酮酶，其歸屬于EC 4.1.2.9并且天然利用X5P和果糖-6-磷酸(F6P)作為底物，但偏好X5P，以及X5P/果糖-6-磷酸(F6P)磷酸轉(zhuǎn)酮酶，其歸屬于EC 4.1.2.22并且可以可比較的活性同時利用X5P和F6P作為底物(Suzuki等人,J.Biol.Chem.44(2010),34279-34287)。在下文，術語“磷酸轉(zhuǎn)酮酶”總是指這兩個類型。

因此，X5P磷酸轉(zhuǎn)酮酶是歸屬于EC 4.1.2.9并且能夠催化以下反應的酶：

D-木酮糖-5-磷酸+磷酸→D-甘油醛-3-磷酸+乙酰磷酸+H₂O

另一歸屬于EC 4.1.2.22類型的磷酸轉(zhuǎn)酮酶一般稱作果糖-6-磷酸磷酸轉(zhuǎn)酮酶并且天然地能夠催化以下反應：

D-果糖6-磷酸+磷酸→乙酰磷酸+D-赤蘚糖4-磷酸+H₂O

還存在其中磷酸轉(zhuǎn)酮酶劃歸至兩個類型的磷酸轉(zhuǎn)酮酶的情況，例如，在磷酸轉(zhuǎn)酮酶來自Nitrolancetus hollandicus Lb的情況下，或其中鑒定的磷酸轉(zhuǎn)酮酶尚未劃歸至兩個類型的任一類型，而通常單純地劃歸為磷酸轉(zhuǎn)酮酶。在本文中使用時，術語“磷酸轉(zhuǎn)酮酶”還指全部這些磷酸轉(zhuǎn)酮酶。

因此，在本發(fā)明方法的一個實施方案中，通過利用劃歸為EC 4.1.2.9的磷酸轉(zhuǎn)酮酶的磷酸轉(zhuǎn)酮酶，實現(xiàn)甲醛和磷酸根據(jù)上文所示反應方案經(jīng)酶促轉(zhuǎn)化成乙酰磷酸。已經(jīng)在多種生物、尤其微生物如細菌和真菌中鑒定了這種酶。在一個優(yōu)選的實施方案中，磷酸轉(zhuǎn)酮酶(EC 4.1.2.9)源自原核生物、優(yōu)選地細菌。例如，已經(jīng)描述該酶出現(xiàn)在以下細菌中：乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)(Uniprot登錄號Q88S87；Q88U67)、戊糖乳桿菌(Lactobacillus pentosus)(Uniprot登錄號Q937F6)、路氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)、動物雙歧桿菌(Bifidobacterium animalis)(Uniprot登錄號A0PAD9)、動物雙歧桿菌乳酸亞種(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)(Uniprot登錄號Q9AEM9)、溶纖維丁酸弧菌(Butyrovibrio fibrisolvens)、腸道絲狀桿菌(Fibrobacter intestinalis)、琥珀酸絲狀桿菌(Fibrobacter succinogene)、腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、酒類酒球菌(Oenococcus oeni)、Starkeya novella、硫桿菌屬物種(Thiobacillus sp.)、雙孢高溫雙孢菌(Thermobispora bispora)(菌株ATCC 19993/DSM 43833/CBS 139.67/JCM 10125/NBRC 14880/R51；Uniprot登錄號D6YAD9)、Thermobaculum terrenum(菌株ATCCBAA-798/YNP1；Uniprot登錄號D1CI63)和Nitrolancetus hollandicus Lb(Uniprot登錄號I4EJ52)。

在另一個優(yōu)選的實施方案中，磷酸轉(zhuǎn)酮酶(EC 4.1.2.9)源自真核生物、優(yōu)選地真菌，例如酵母，如釀酒酵母(S.cerevisiae)。已經(jīng)描述了該酶出現(xiàn)在以下真菌中：構巢裸胞殼(Emericella nidulans)(Uniprot登錄號：Q5B3G7)、金龜子綠僵菌(Metarhizium anisopliae)(Uniprot登錄號：C1K2N2)、博伊丁假絲酵母(Candida boidinii)、彎假絲酵母(Candida curvata)、無名假絲酵母(Candida famata)、土生假絲酵母(Candida humicola)、近平滑假絲酵母(Candida parapsilosis)、近平滑假絲酵母(Candida parapsilosis)NCYC926、熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)、Cyberlindnera jadinii、Cyberlindnera saturnus、Debaromyces robertsiae、尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)、馬克斯克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus)、Kluyveromyces phaseolosporus、斯達氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi)、Ogataea angusta、嗜單寧管囊酵母(Pachysolen tannophilus)、Priceomyces medius、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、Rhodospiridium toruloides、粘紅酵母(Rhodotorula glutinis)、禾本紅酵母(Rhodotorula graminisyi)、產(chǎn)黃青霉(Penicillium chrysogenum)、皮狀絲孢酵母(Trichosporon cutaneum)和解脂耶羅維亞酵母(Yarrowia lipolytica)。

可以用本領域技術人員已知的方法評估磷酸轉(zhuǎn)酮酶(EC 4.1.2.9)的酶活性。這類方法例如在Meile等人(J.Bacteriol.183(2001),2929-2936)中和Suzuki等人(Acta Cryst.F66(2010),941–943)中描述。

在結構和功能上充分地定義了磷酸轉(zhuǎn)酮酶(EC 4.1.2.9)。例如，Petrareanu等人(Acta Crystallographica F66(2010),805-807)描述了來自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的木酮糖-5-磷酸磷酸轉(zhuǎn)酮酶的X射線結晶學分析。

在本發(fā)明方法的另一個實施方案中，通過利用劃歸為EC 4.1.2.22中果糖-6-磷酸磷酸轉(zhuǎn)酮酶的磷酸轉(zhuǎn)酮酶，實現(xiàn)甲醛和磷酸根據(jù)上文所示反應方案經(jīng)酶促轉(zhuǎn)化成乙酰磷酸。這種酶已經(jīng)在多種生物、尤其微生物如細菌和真菌中鑒定。在一個優(yōu)選的實施方案中，果糖-6-磷酸磷酸轉(zhuǎn)酮酶(EC 4.1.2.22)源自原核生物、優(yōu)選地細菌。已經(jīng)描述了該酶出現(xiàn)在以下細菌中：青春雙歧桿菌(Bifidobacterium adolescentis)、動物雙歧桿菌乳酸亞種(Uniprot登錄號：Q9AEM9)、長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)、假長雙歧桿菌(Bifidobacterium pseudolongum)、尤其假長雙歧桿菌球形亞種(Bifidobacterium pseudolongum subsp.globosum)、兩歧雙歧桿菌(Bifidobacterium bifidum)、短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)、齒雙歧桿菌(Bifidobacterium dentium)、Bifidobacterium mongoliense、Bifidobacterium bombi、鉤蟲貪銅菌(Cupriavidus necator)、陰道加德納菌(GardnereHa vaginalis)、木葡糖醋桿菌(Gluconacetobacter xylinus)、類植物乳桿菌(Lactobacillus paraplantarum)、腸膜明串珠菌和Nitrolancetus hollandicus Lb(Uniprot登錄號I4EJ52)。

在另一個優(yōu)選實施方案中，果糖-6-磷酸磷酸轉(zhuǎn)酮酶(EC 4.1.2.22)源自真核生物、優(yōu)選地真菌，例如酵母，如巴斯德酵母(S.pastorianus)。已經(jīng)描述了該酶出現(xiàn)在以下酵母中：假絲酵母屬物種(Candida sp.)、假絲酵母屬物種107(Candida sp.107)、熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)、粘紅酵母(Rhodotorula glutinis)、禾本紅酵母(Rhodotorula graminisyi)和巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)。

在結構和功能上充分地定義了該酶。例如，Suzuki等人(Acta Crystallographica F66(2010),941-943；J.Biol.Chem.285(2010)描述了來自短雙歧桿菌的磷酸轉(zhuǎn)酮酶的過量表達、結晶和X射線分析。編碼來自乳酸雙歧桿菌的木酮糖-5-磷酸/果糖-6-磷酸磷酸轉(zhuǎn)酮酶的基因例如在Meile等人(J.Bacteriol.183(2001),2929-2936)中描述。

可以用本領域技術人員已知的方法評估果糖-6-磷酸磷酸轉(zhuǎn)酮酶(EC 4.1.2.22)的酶活性。這類方法例如在Meile等人(J.Bacteriol.183(2001),2929-2936)中和Suzuki等人(Acta Cryst.F66(2010),941–943)中描述。

尚未歸屬為EC 4.2.1.9或EC 4.2.1.22并且可以用于本發(fā)明方法中的其他磷酸轉(zhuǎn)酮酶例如是來自Thermosynechococcus elongatus(菌株BP-1；Uniprot登錄號：Q8DJN6)的磷酸轉(zhuǎn)酮酶、來自凝固芽孢桿菌(Bacillus coagulans)36D1(Uniprot登錄號：G2TIL0)的磷酸轉(zhuǎn)酮酶、來自乳酸乳球菌乳酸亞種(菌株KF147；Uniprot登錄號：A9QST6)的磷酸轉(zhuǎn)酮酶、來自假長雙歧桿菌球形亞種(Uniprot登錄號：Q6R2Q6)的磷酸轉(zhuǎn)酮酶和來自丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)(菌株ATCC824；Uniprot登錄號：Q97JE3；Servisky等人(J.Ind.Microbiol.Biotechnol.39(2012),1859-1867)；SEQ ID NO:2)的磷酸轉(zhuǎn)酮酶。

在所附實施例中，顯示假長雙歧桿菌球形亞種(Uniprot登錄號：Q6R2Q6；SEQ ID NO:1)、丙酮丁醇梭菌(菌株ATCC824；Uniprot登錄號：Q97JE3；SEQ ID NO:2)和乳酸乳球菌乳酸亞種(菌株KF147；Uniprot登錄號：A9QST6；SEQ ID NO:3)的磷酸轉(zhuǎn)酮酶能夠轉(zhuǎn)化甲醛和磷酸成乙酰磷酸和H₂O。

在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明方法中使用的磷酸轉(zhuǎn)酮酶具有如SEQ ID NO:1至3任一者中所示的氨基酸序列或顯示SEQ ID NO:1至3任一者同源至少x％并具有磷酸轉(zhuǎn)酮酶活性的氨基酸序列，其中x是30和100之間的整數(shù)，優(yōu)選地是35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99，其中這種酶能夠如上文中所述那樣將甲醛和磷酸轉(zhuǎn)化成乙酰磷酸。優(yōu)選地，通過將各自序列與上述SEQ ID NOs任一個的氨基酸序列比較，確定同一性的程度。當比較的序列不具有相同的長度時，同一性程度優(yōu)選地指較短序列中與較長序列內(nèi)氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分數(shù)或指較長序列中與較短序列內(nèi)氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分數(shù)。可以根據(jù)本領域熟知的方法，優(yōu)選地使用合適的計算機算法(如CLUSTAL)確定序列同一性程度。

當使用Clustal分析方法來確定特定序列是否與參考序列例如80％同一時，對于氨基酸序列的比較，可以使用默認設置或者設置優(yōu)選如下：矩陣：blosum 30；開放空位罰分：10.0；延伸空位罰分：0.05；延遲發(fā)散(Delay divergent)：40；空位分隔距離：8。對于核苷酸序列比較，延伸空位罰分優(yōu)選地設置至5.0。

優(yōu)選地，在序列的整個長度范圍內(nèi)計算同一性的程度。

已經(jīng)描述了磷酸轉(zhuǎn)酮酶序列的多重比對結果顯示出幾個高度保守的區(qū)域并且使用這些區(qū)域中的兩個區(qū)域作為磷酸轉(zhuǎn)酮酶的特征標識樣式(http://prosite.expasy.org/PDOC60002)。第一特征標識樣式是E-G-G-E-L-G-Y并且第二特征標識樣式是G-x(3)-[DN]-x-P-x(2)-[LIVFT]-x(3)-[LIVM]-x-G-D-G-E。仍不知第一特征標識樣式的功能，而第二特征標識樣式對應于焦磷酸硫胺素結合位點。因此，在優(yōu)選的實施方案中，如上文定義的磷酸轉(zhuǎn)酮酶具有這樣的氨基酸序列，所述氨基酸序列含有上文提到的兩個特征標識樣式至少之一、優(yōu)選地含有至少第二特征標識樣式并且甚至更優(yōu)選地含有兩種特征標識樣式。

序列比對顯示，來自不同起源的磷酸轉(zhuǎn)酮酶之間的總體序列同一性可以低到約26％。例如，Meile等人(J.Biol.Chem.183(2001),2929-2936)報道，乳雙歧桿菌(Bifidobacterium lactis)的D-木酮糖5-磷酸/D-果糖6-磷酸磷酸轉(zhuǎn)酮酶基因(xfp)揭示與其他生物的基因組中序列的26％至55％同一性。

可以例如通過如所附實施例中所述的測定法評定選擇的磷酸轉(zhuǎn)酮酶是否能夠催化甲醛和磷酸轉(zhuǎn)化成乙酰磷酸和H₂O。

如聯(lián)系本發(fā)明方法所用的術語“磷酸/磷酸鹽”指這樣的化合物，所述化合物對轉(zhuǎn)化甲醛和磷酸成乙酰磷酸和H₂O的方法中使用的酶而言可接受作為磷酸/磷酸鹽來源。一個可能性是提供磷酸形式(即H₃PO₄)的磷酸/磷酸鹽。然而，還可構思其他形形式，尤其磷酸(H₃PO₄)的鹽，其中一個，兩個或三個氫原子由其他離子(如鈉離子)替換。磷酸轉(zhuǎn)酮酶是二磷酸硫胺素依賴性酶，即它們需要二磷酸硫胺素(也稱作ThDP或TPP)作為輔因子。因此，在本發(fā)明的方法中有利的是在反應期間提供TPP。另外，一些磷酸轉(zhuǎn)酮酶需要離子，如Mg²⁺或Ca²⁺作為輔因子。在這種情況下，本發(fā)明的方法還包括在如上文所述的轉(zhuǎn)化期間存在這類離子。

還可以通過利用磺基乙醛乙酰轉(zhuǎn)移酶(EC 2.3.3.15)，實現(xiàn)甲醛和磷酸根據(jù)上文所示反應方案經(jīng)酶促轉(zhuǎn)化成乙酰磷酸?；腔胰┮阴＾D(zhuǎn)移酶(EC 2.3.3.15)是可以催化以下反應的酶：

2-磺基乙醛+磷酸→乙酰磷酸+亞硫酸鹽

這種酶已經(jīng)在多種生物、尤其細菌中鑒定。在一個優(yōu)選的實施方案中，磺基乙醛乙酰轉(zhuǎn)移酶(EC 2.3.3.15)源自原核生物、優(yōu)選地細菌。已經(jīng)描述了該酶出現(xiàn)在以下細菌中：解芳烴卡斯特羅尼氏菌(Castellaniella defragrans)(Uniprot登錄號：Q84H44；先前稱為解芳烴產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes defragrans)(Ruff等人,Biochem.J.369(2003),275-285))、木糖氧化產(chǎn)堿菌木糖氧化亞種(Alcaligenes xylosoxydans xylosoxydans)(Uniprot登錄號：Q84H41)、Desulfonispora thiosulfatigenes(Uniprot登錄號：Q93PS3)、草木樨根瘤菌(Rhizobium meliloti)(菌株1021)(Uniprot登錄號：Q92UW6)、Ruegeria pomeroyi(Uniprot登錄號：Q5LMK2)、鉤蟲貪銅菌(Uniprot登錄號：Q0K022)、Roseovarius nubinhibens(Uniprot登錄號：A3SR25)、不動桿菌屬物種(Acinetobacter sp.)和銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。

原則上，任何磺基乙醛乙酰轉(zhuǎn)移酶(EC 2.3.3.15)均可以用于本發(fā)明方法中來轉(zhuǎn)化甲醛和磷酸成乙酰磷酸。

如同磷酸轉(zhuǎn)酮酶，磺基乙醛乙酰轉(zhuǎn)移酶是焦磷酸硫胺素(TPP)依賴性酶并且因此特征在于它們含有TPP結合結構域。在已知的磺基乙醛乙酰轉(zhuǎn)移酶當中，TPP結合結構域是高度保守的(參見，例如，Ruff等人,Biochem.J.369(2003),275-285)?？傊?，已知的磺基乙醛乙酰轉(zhuǎn)移酶在N末端附近顯示高程度的序列保守性，包括TPP結合結構域(參見Ruff等人,見上述引文)?？梢栽诿副旧鞱末端中和在解芳烴卡斯特羅尼氏菌(C.defragrans)酶接近氨基酸400的區(qū)域中觀察到序列趨異性。Ruff等人(見上述引文)描述了磺基乙醛乙酰轉(zhuǎn)移酶形成3個亞組(參見所述出版物的圖4)。據(jù)稱亞組2和亞組3顯示符合PROSITE共有序列的TPP結合結構域

(L/I/V/M/F)(G/S/A)X₅PX₄(L/I/V/M/F/Y/W)X(L/I/V/M/F)XGD(G/S/A)(G/S/A/C))，而亞組1略微地悖離共有序列：

(L/I/V/M/F)(G/S/A)X₅PX₄(L/I/V/M/F/Y/W)X(L/I/V/M/F/Y)XGD(G/S/A)(G/S/A/C)。

除這些區(qū)域之外，不同磺基乙醛乙酰轉(zhuǎn)移酶之間的序列同一性能相當?shù)?低至約44％)。

在一個優(yōu)選的實施方案中，在本發(fā)明方法中使用的磺基乙醛乙酰轉(zhuǎn)移酶是顯示如SEQ ID NO:4中所述氨基酸序列的解芳烴卡斯特羅尼氏菌磺基乙醛乙酰轉(zhuǎn)移酶或顯示如SEQ ID NO:5中所述氨基酸序列的木糖氧化產(chǎn)堿桿菌磺基乙醛乙酰轉(zhuǎn)移酶或顯示如SEQ ID NO:6中所述氨基酸序列的Desulfonispora thiosulfatigenes磺基乙醛乙酰轉(zhuǎn)移酶或顯示如SEQ ID NO:7中所述氨基酸序列的草木樨根瘤菌(菌株1021)磺基乙醛乙酰轉(zhuǎn)移酶或顯示如SEQ ID NO:8中所述的氨基酸序列或顯示相關氨基酸序列的Roseovarius nubinhibens磺基乙醛乙酰轉(zhuǎn)移酶。

因此，在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明方法中使用的磺基乙醛乙酰轉(zhuǎn)移酶具有如SEQ ID NO:4至8任一者中所示的氨基酸序列或顯示與SEQ ID NO:4至8任一者同源至少x％并具有磺基乙醛乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的氨基酸序列，其中x是30和100之間的整數(shù)，優(yōu)選地是35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99，其中這種酶能夠如上文中所述那樣將甲醛和磷酸轉(zhuǎn)化成乙酰磷酸。優(yōu)選地，如上文所述確定同一性程度。

可以用本領域技術人員已知的方法評估磺基乙醛乙酰轉(zhuǎn)移酶(EC 2.3.3.15)的酶活性。這類方法例如在Ruff等人(Biochem.J.369(2003),275-285)中描述。

根據(jù)本發(fā)明方法產(chǎn)生的乙酰磷酸可以進一步轉(zhuǎn)化成所需的分子如大多數(shù)生物內(nèi)作為中心代謝物的乙酸或乙酰-輔酶A(也稱作乙酰-CoA)。

在體外自發(fā)地發(fā)生乙酰磷酸水解成乙酸，因為乙酰磷酸相當不穩(wěn)定。

乙酰磷酸也可以例如通過利用乙酸激酶(EC 2.7.2.1)、丙酸激酶(EC 2.7.2.15)、丁酸激酶(EC 2.7.2.7)或(二磷酸)乙酸激酶(EC 2.7.2.12)，在體外或在體內(nèi)經(jīng)酶促轉(zhuǎn)化成乙酸。

乙酸激酶是催化以下反應的酶：

由于這種反應是可逆的，酶可以用來轉(zhuǎn)化乙酰磷酸成乙酸?？梢酝ㄟ^從反應連續(xù)移走ATP，例如通過其他酶促轉(zhuǎn)化或通過本領域技術人員已知的手段和方法從反應移走ATP，將反應推向乙酸方向。這種酶存在于龐大種類的生物中，尤其原核生物、真核生物和古細菌中。它是糖酵解中的重要酶并且酶水平在過量葡萄糖存在時通常增加。原則上，任何乙酸激酶(EC 2.7.2.1)均可以在本發(fā)明的方法中用來轉(zhuǎn)化乙酰磷酸成乙酸。

另外，也已經(jīng)描述了丙酸激酶(EC 2.7.2.15)能夠根據(jù)以下反應方案轉(zhuǎn)化乙酰磷酸成乙酸：

這種酶存在于腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，如大腸桿菌或腸道沙門氏菌腸道亞種鼠傷寒血清型變種(Salmonella enteric subsp.enterica serovar.thyphimurium)中。

也可以通過利用丁酸激酶(EC 2.7.2.7)實現(xiàn)乙酰磷酸轉(zhuǎn)化成乙酸。丁酸激酶是催化以下反應的酶：

但是，已經(jīng)顯示對于一些丁酸激酶，例如來自丁酸芽胞梭菌(Clostridium butyricum)和來自丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)的那些，它們還可以催化以下反應：

因此，也能夠催化ATP+乙酸可逆轉(zhuǎn)化成ADP+乙酰磷酸的任何丁酸激酶可以在本發(fā)明方法中用于轉(zhuǎn)化乙酰磷酸成乙酸。

另外，也可以通過利用(二磷酸)乙酸激酶(EC 2.7.2.12)實現(xiàn)乙酰磷酸轉(zhuǎn)化成乙酸。(二磷酸)乙酸激酶(EC 2.7.2.12)是催化以下反應的酶：

已經(jīng)描述了這種酶出現(xiàn)在溶組織內(nèi)阿米巴(Entamoeba histolytica)中。

也可以通過利用?；姿崦?EC 3.6.1.7)實現(xiàn)乙酰磷酸經(jīng)酶促水解成乙酸和H₃PO₄。?；姿崦?AcP；EC 3.6.1.7)是在真核生物和(嗜溫和極端嗜熱)原核生物中廣泛表達的胞質(zhì)酶(分子量約為10kDa)。AcP可以在脊椎動物物種的許多組織中存在，在骨骼肌中和心臟中作為肌肉型AcP(MT-AcP)和在紅細胞、腦和睪丸中作為(器官)共有型AcP(CT-AcP)存在(Zuccotti等人,Acta Cryst.61(2005),144-146)。酰基磷酸酶催化以下反應：

乙酰磷酸+H₂O→乙酸+H₃PO₄

已經(jīng)在龐大種類的生物中描述這種酶。優(yōu)選地，本發(fā)明方法中使用的?；姿崦秆苌栽u(Gallus gallus)、豚鼠(Cavia porcellus)(Liguri等人,Biochem.J.217(1984),499-505)、智人(Homo sapiens)、豬(Sus scrofa)、普通牛(Bos taurus)、歐洲野兔(Oryctolagus cuniculus)、馬(Equus cacallus)或Pyrococcus hirokoshii(Miyazoo等人,Acta Crystallographica D60(2004),1135-1136)。

這些酶的結構特征和功能特征已經(jīng)過充分地研究并且例如在以下中描述：Liguri等人(Biochem.J.217(1984),499-505)、Miyazoo等人(Acta Crystallographica D60(2004),1135-1136)和Taddei等人(FEBS Letters 362(1995),175-179)。

可以例如通過利用磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(EC 2.3.1.8)酶促實現(xiàn)乙酰磷酸轉(zhuǎn)化成乙酰-CoA(體外或體內(nèi))。這種酶天然地催化以下反應：

這種酶存在于多種生物中，即原核生物、真核生物和古細菌中。原則上，任何已知的磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(EC 2.3.1.8)均可以用于這種轉(zhuǎn)化。

根據(jù)本發(fā)明方法轉(zhuǎn)化成乙酰磷酸的甲醛可以通過外部方式提供給反應或可以通過另一個化學反應或酶促反應提供。

已經(jīng)長久已知甲醛的化學產(chǎn)生并且通常，工業(yè)上通過甲醇的催化性氧化產(chǎn)生甲醛。在這種情況下的最常見催化劑是銀金屬或鐵氧化物和鉬氧化物或釩氧化物的混合物。在常用的Formox工藝中，甲醇和氧在大約250℃至400℃在與鉬和/或釩組合的氧化鐵存在下反應以根據(jù)以下化學方程產(chǎn)生甲醛：

2CH₃OH+O₂→2CH₂O+2H₂O

銀基催化劑通常在較高溫度(約650℃)運行。該催化劑上的兩個化學反應同時產(chǎn)生甲醛：上文所示反應和脫氫反應：

CH₃OH→H₂CO+H₂

也可以通過氧化甲烷產(chǎn)生甲醛。另外，已經(jīng)描述，可以通過一氧化碳和氫在中性Fe2S2簇上氣相中反應而產(chǎn)生甲醛(和甲醇)(參見Yin等人,Phys.Chem.Chem.Phys.15(2013),4699-4706)。

在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的方法還包括步驟：提供待通過甲醇酶促轉(zhuǎn)化的甲醛。催化甲醇轉(zhuǎn)化成甲醛的酶是已知的并且包括，例如甲醇脫氫酶(EC 1.1.1.244)。甲醇脫氫酶(EC 1.1.1.244)催化以下反應：

這種酶已經(jīng)在甲基營養(yǎng)芽孢桿菌屬物種甲醇芽胞桿菌(Bacillus methanolicus)中鑒定(Arfman等人,Arch.Microbiol.152(1989),280-288)。還可以催化甲醇轉(zhuǎn)化成甲醛的酶是劃歸為EC 1.1.2.7(甲醇脫氫酶(細胞色素c))的酶。這些酶是含有PQQ的II型醇脫氫酶，即NAD(P)非依賴性甲醇脫氫酶。這類酶例如已知來自幾種

變形菌門(Proteobacteria)細菌如扭脫甲基桿菌(Methylobacterium extorquens)、食甲基嗜甲基菌(Methylophilus methylotrophus)或脫氮生絲微菌(Hyphomicrobium denitrificans)。另外，醇氧化酶(EC 1.1.3.13)也可以用于轉(zhuǎn)化甲醇成甲醛。醇氧化酶(EC 1.1.3.13)是催化以下反應的酶：

伯醇+O₂→醛+H₂O₂

已經(jīng)在龐大種類的生物中例如，在使用甲醇作為唯一碳源和能量源的甲基營養(yǎng)酵母如畢赤酵母(Pichia)、假絲酵母(Candida)和漢遜酵母(Hansenula)(Hartner和Glieder,Microbial Cell Factories 5(2006),39)和在一些真菌例如曲霉屬(Aspergillus)(Kumar和Goswami,Appl.Microbiol.Biotechnol.72(2006),906-911)中鑒定到這些酶。Arnaud等人(FEBS 296(1992)，259-262)描述，航海假單胞菌(Pseudomonas nautica)菌株617的純化終末氧化酶將CO還原成甲醛。

可以轉(zhuǎn)化成甲醛的甲醇本身可以從甲烷通過酶促反應提供。特別地，例如甲烷單加氧酶(MMO)催化甲烷轉(zhuǎn)化成甲醇。已經(jīng)描述這種酶的兩種類型，即EC 1.14.13.25甲烷單加氧酶(可溶性)和EC 1.14.18.3甲烷單加氧酶(顆粒狀)。催化的反應是：

CH₄+NADH+H⁺+O₂→CH₃OH+NAD+H₂O(其中NADH作為輔因子)

CH₄+NADPH+H⁺+O₂→CH₃OH+NADP+H₂O(其中NADPH作為輔因子)

已經(jīng)鑒定到相應酶，例如，在甲醇營養(yǎng)細菌如莢膜甲基球菌(Methylococcus capsulatus)(Pilkington和Dalton,Methods Enzymology 188(1990),181-190)和發(fā)孢甲基彎曲菌(Methylosinus trichosporium)(Fox等人,J.Biol.Chem.266(1991),540-550)中鑒定到。這些酶已經(jīng)通過體外研究表征，包括晶體結構分析(Sazinsky等人,Biochemistry 43(2004),16263-16276)。

本發(fā)明的方法可以在體外或在體內(nèi)實施。體外反應理解為其中不使用細胞的反應，即無細胞反應。因此，體外優(yōu)選地意指在無細胞系統(tǒng)中。在一個實施方案中，術語“在體外”意指在分離的酶(或酶系統(tǒng)，任選地包含可能要求的輔因子)存在下。在一個實施方案中，該方法中所用的酶以純化形式使用。

為在體外實施該方法，將反應的底物和酶在允許酶有活性并允許酶促轉(zhuǎn)化發(fā)生的條件下(緩沖液、溫度、輔底物、輔因子等)溫育。允許該反應推進足以產(chǎn)生相應產(chǎn)物的時間?？梢酝ㄟ^本領域已知的方法，如可能與質(zhì)譜法檢測連接的液相色譜(HPLC)，測量相應產(chǎn)物的產(chǎn)生。

酶可以處于允許酶促反應發(fā)生的任何合適形式。它們可以是純化或部分純化的或處于細胞粗提物或部分純化的提取物形式。酶還可能固定在合適的載體上。

根據(jù)本發(fā)明使用來自不同起源的磷酸轉(zhuǎn)酮酶，實施例顯示了體外反應。

在另一個實施方案中，如上文所述，本發(fā)明的方法在生物、優(yōu)選微生物存在的情況下以培養(yǎng)方式實施，所述生物至少產(chǎn)生磷酸轉(zhuǎn)酮酶或磺基乙醛乙酰轉(zhuǎn)移酶和任選地為提供甲醛而必需的酶或為進一步轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的乙酰磷酸成其他化合物(如乙酸或乙酰-CoA)而必需的酶。利用微生物實施本發(fā)明方法的方法稱作“體內(nèi)”方法。甲醛可以外部提供或可以通過所用的本身表達磷酸轉(zhuǎn)酮酶或磺基乙醛乙酰轉(zhuǎn)移酶的微生物產(chǎn)生。這種微生物表達如上文所述的為酶促產(chǎn)生甲醛而必需的至少一種酶。還可能共培養(yǎng)能夠產(chǎn)生甲醛的微生物和表達磷酸轉(zhuǎn)酮酶和/或磺基乙醛乙酰轉(zhuǎn)移酶的微生物，從而轉(zhuǎn)化由第一微生物產(chǎn)生的甲醛。

因此，在本發(fā)明的這類實施方案中，使用如上文所述的至少產(chǎn)生磷酸轉(zhuǎn)酮酶或磺基乙醛乙酰轉(zhuǎn)移酶的微生物。可以使用天然產(chǎn)生磷酸轉(zhuǎn)酮酶或磺基乙醛乙酰轉(zhuǎn)移酶的微生物或已經(jīng)過基因修飾，從而表達(或過量表達)磷酸轉(zhuǎn)酮酶和/或磺基乙醛乙酰轉(zhuǎn)移酶的微生物。因此，微生物可以是天然表達磷酸轉(zhuǎn)酮酶和/或磺基乙醛乙酰轉(zhuǎn)移酶的微生物，即在其基因組中天然具有編碼磷酸轉(zhuǎn)酮酶或磺基乙醛乙酰轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列并表達它/它們的微生物。表達可以按組成型方式或按誘導或受調(diào)節(jié)的方式發(fā)生。內(nèi)在地即天然地具磷酸轉(zhuǎn)酮酶活性或磺基乙醛乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的微生物是本領域已知的，并且它們的任一種可以用于本發(fā)明的上下文中。

在另一個實施方案中，該微生物可以是已經(jīng)通過引入含有核苷酸序列的核酸分子進行基因修飾的微生物，所述核苷酸序列編碼磷酸轉(zhuǎn)酮酶或磺基乙醛乙酰轉(zhuǎn)移酶。該核酸分子可以穩(wěn)定地整合到該微生物的基因組中或可以按染色體外方式例如在質(zhì)粒上存在。

這種基因修飾的微生物可以例如是這樣的微生物，所述微生物天然地不具有磷酸轉(zhuǎn)酮酶活性或磺基乙醛乙酰轉(zhuǎn)移酶活性并且已經(jīng)過基因修飾以表達磷酸轉(zhuǎn)酮酶或磺基乙醛乙酰轉(zhuǎn)移酶，或這樣的微生物，所述微生物天然地具有磷酸轉(zhuǎn)酮酶活性或磺基乙醛乙酰轉(zhuǎn)移酶活性并且已經(jīng)過基因修飾，例如通過用編碼磷酸轉(zhuǎn)酮酶或磺基乙醛乙酰轉(zhuǎn)移酶的核酸(例如載體)轉(zhuǎn)化以增加所述微生物中磷酸轉(zhuǎn)酮酶活性或磺基乙醛乙酰轉(zhuǎn)移酶活性和/或通過在編碼酶的內(nèi)源核苷酸序列前方插入啟動子，以增加所述微生物中相應的活性。

然而，本發(fā)明優(yōu)選地排除如自然界中所存在那樣的天然存在的微生物，所述微生物按照自然界中存在的水平表達如上文所述的酶。相反，本發(fā)明的和在本發(fā)明方法中使用的微生物優(yōu)選地是非天然存在的微生物，無論它是否已經(jīng)過基因修飾以表達(包括過量表達)正常情況下不存在于其基因組中的本發(fā)明外源酶或無論它是否已經(jīng)過工程化以過量表達外源酶。

因此，聯(lián)系本發(fā)明使用的酶和(微)生物優(yōu)選地是非天然存在的酶或(微生物)，即它們是與天然存在的酶或微生物顯著不同并且在自然界中不存在的酶或(微)生物。就這些酶而言，它們優(yōu)選地是天然存在酶的變體，所述變體本身不存在于自然界中。這類變體例如包括顯示改善的特性，如更高酶活性、更高底物專一性、更高溫度抗性等的突變體，尤其通過分子生物學方法制備的突變體。就(微)生物而言，它們優(yōu)選地是因基因修飾而不同于天然存在生物的如上文所述的基因修飾生物?；蛐揎椛锸遣惶烊淮嬖诘?，即，不能在自然界中發(fā)現(xiàn)并且因引入外來核酸分子而與天然存在生物實質(zhì)上不同的生物。

通過過量表達如上文所述的外源酶或內(nèi)源酶，酶濃度實質(zhì)上高于自然界中存在的濃度，這隨后可以出乎意料地迫使利用相應非天然酶的本發(fā)明反應進行。優(yōu)選地，過量表達的酶的濃度是至少5％、10％、20％、30％或40％的總宿主細胞蛋白。

將“非天然”底物理解為這樣的分子，所述分子不受自然界中相應的酶作用，即使它可以實際上與內(nèi)源酶一起共存于微生物中。這種“非天然”底物不被自然界中的微生物轉(zhuǎn)化，因為其他底物是優(yōu)選的(例如“天然底物”)。因此，本發(fā)明構思了用上文描述的酶在自然界中不存在的環(huán)境下利用非天然底物。

因此，在本發(fā)明的上下文中該微生物也可能是天然不具有磷酸轉(zhuǎn)酮酶活性或磺基乙醛乙酰轉(zhuǎn)移酶活性，但經(jīng)基因修飾從而包含允許磷酸轉(zhuǎn)酮酶或磺基乙醛乙酰轉(zhuǎn)移酶表達的核苷酸序列的微生物。類似地，該微生物也可以是天然具有磷酸轉(zhuǎn)酮酶活性或磺基乙醛乙酰轉(zhuǎn)移酶活性，但是經(jīng)基因修飾從而增強磷酸轉(zhuǎn)酮酶活性或磺基乙醛乙酰轉(zhuǎn)移酶活性(例如例如通過引入編碼磷酸轉(zhuǎn)酮酶或磺基乙醛乙酰轉(zhuǎn)移酶的外源核苷酸序列或通過引入用于編碼所述酶的內(nèi)源性基因的啟動子以增加內(nèi)源產(chǎn)量至過量表達(非天然)水平)的微生物。

如果使用天然表達酸轉(zhuǎn)酮酶或磺基乙醛乙酰轉(zhuǎn)移酶的微生物，可以如此修飾這種微生物，從而在微生物中過量表達相應的活性?？梢岳缤ㄟ^以下方式實現(xiàn)這一點：在相應基因的啟動子區(qū)中實施突變或引入高表達性啟動子，從而導致確保更高基因表達的啟動子。備選地，還可能是基因如此突變，從而導致顯示更高活性的酶。

通過使用表達磷酸轉(zhuǎn)酮酶或磺基乙醛乙酰轉(zhuǎn)移酶的微生物，可能在不需要分離或純化酶的情況下，在培養(yǎng)基中直接實施本發(fā)明的方法。

在一個實施方案中，本發(fā)明方法中使用的生物是已經(jīng)過基因修飾以含有編碼磷酸轉(zhuǎn)酮酶或磺基乙醛乙酰轉(zhuǎn)移酶的外來核酸分子的微生物。在這種語境下，術語“外來”或“外源”意指核酸分子不天然地存在于所述微生物中。這意味著它不出現(xiàn)在微生物中的相同結構內(nèi)或在相同位置處。在一個優(yōu)選的實施方案中，外來核酸分子是包含啟動子和編碼相應酶的編碼序列的重組分子，其中驅(qū)動編碼序列表達的啟動子相對于編碼序列是異源的。在這種語境下，“異源”意指該啟動子不是天然驅(qū)動所述編碼序列表達的啟動子，而是天然驅(qū)動不同編碼序列表達的啟動子，即，它衍生自另一個基因，或是合成的啟動子或嵌合啟動子。優(yōu)選地，啟動子是相對于微生物為異源的啟動子，即在相應的微生物中不天然存在的啟動子。甚至更優(yōu)選地，啟動子是誘導型啟動子。在不同類型的生物中、尤其在微生物中驅(qū)動表達的啟動子是本領域技術人員熟知的。

在又一個實施方案中，核酸分子相對于微生物是外來的，因為編碼的酶相對于微生物不是內(nèi)源的，即當微生物未經(jīng)基因修飾時不由微生物天然表述。換句話說，編碼的酶相對于微生物是異源的。外來核酸分子可以在微生物中以染色體外形式存在，例如作為質(zhì)粒，或穩(wěn)定整合在染色體中。優(yōu)選穩(wěn)定整合。因此，基因修飾可以例如在于整合編碼酶的相應基因至染色體中，或在于從含有酶編碼序列上游的啟動子的質(zhì)粒表達所述酶，所述啟動子和編碼序列優(yōu)選地源自不同生物；或本領域技術人員已知的任何其他方法。

在本發(fā)明的上下文中，術語“微生物”指細菌，以及指真菌，如酵母，并且也指藻類和古細菌。在一個優(yōu)選的實施方案中，微生物是細菌。原則上可以使用任何細菌。在本發(fā)明方法中待使用的優(yōu)選細菌是芽孢桿菌屬(Bacillus)、梭菌屬(Clostridium)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、發(fā)酵單胞菌屬(Zymomonas)或埃希氏菌屬(Escherichia)的細菌。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，細菌屬于埃希氏菌屬并且甚至更優(yōu)選地屬于大腸桿菌物種。在另一個優(yōu)選實施方案中，細菌屬于惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)物種，或?qū)儆谶\動發(fā)酵單胞菌(Zymomonas mobilis)物種，或?qū)儆诠劝彼岚魻顥U菌(Corynebacterium glutamicum)物種或?qū)儆诳莶菅挎邨U菌(Bacillus subtilis)物種。

還可能使用極端嗜熱細菌如嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus)或來自梭菌科(Clostridiae)的厭氧細菌。

在另一個優(yōu)選實施方案中，微生物是真菌，更優(yōu)選地是酵母屬、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyce)、曲霉屬(Aspergillus)、木霉屬(Trichoderma)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)或畢赤酵母屬(Pichia)的真菌，并且甚至更優(yōu)選地是以下物種：釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、黑曲霉(Aspergillus niger)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、馬克斯克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus)、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)、Pichia torula或Pichia utilis。

在另一個實施方案中，本發(fā)明的方法利用至少表達磷酸轉(zhuǎn)酮酶和/或磺基乙醛乙酰轉(zhuǎn)移酶的光合微生物。優(yōu)選地，微生物是光合細菌或微藻。在又一個實施方案中，微生物是藻，更優(yōu)選地屬于硅藻類(diatomeae)的藻。

還可構思在本發(fā)明方法中使用微生物的組合，其中不同微生物表達如上文所述的不同酶。

在一個特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明方法中使用的微生物是甲醇營養(yǎng)或甲基營養(yǎng)細菌或甲醇營養(yǎng)或甲基營養(yǎng)酵母。這類微生物優(yōu)選地在本發(fā)明方法中使用，因為它們天然地具有代謝甲醇和/或甲烷以通過上文所述的酶促反應產(chǎn)生甲醛的能力。甲醇營養(yǎng)細菌及它們的可能用途例如在Jiang等人(Biochemical Engineering J.49(2010),277-288)、Schrader等人(Trends in Biotechnology 27(2008),107-115)、Chistoserdova等人(Anu.Rev.Microbiol.63(2009)、477-499)和Kalyuzhnaya等人(Nature Commun.4(2013)中描述。這些細菌的多樣性例如在Chistoserdova等人(參見上述引文)和Jiang等人(參見上述引文)中描述。Schrader等人(參見上述引文)和Kalyuzhnaya等人(參見上述引文)描述了這類微生物作為甲烷轉(zhuǎn)化用催化劑的用途。最后，Schrader等人(參見上述引文)還描述了允許操縱甲基營養(yǎng)細菌(如扭脫甲基桿菌)的代謝以形成所需產(chǎn)物的遺傳工具。甲烷營養(yǎng)菌或甲基營養(yǎng)細菌的例子包括但不限于嗜甲基菌科(Methylophilaceae)細菌和以下屬的細菌：甲基細菌屬(Methylobacter)、甲基桿菌屬(Methylobacterium)(例如，扭脫甲基桿菌(Methylobacterium extorquens)、嗜有機甲基桿菌(Methylobacterium organophilum)和羅得西亞甲基桿菌(Methylobacterium rhodesianum)、甲基芽孢桿菌屬(Methylobacillus)(例如，鞭毛甲基芽孢桿菌(Methylobacillus flagellatus)和產(chǎn)糖甲基芽孢桿菌(Methylobacillus glycogenes))、甲基單胞菌屬(Methylomonas)(例如，甲烷甲基單胞菌(Methylomonas methanica))、甲基球形菌屬(Methylosoma)、甲基微菌屬(Methylomicrobium)(例如，嗜鹽甲基微菌(Methylomicrobium alcaliphilum))、甲基熱菌屬(Methylothermus)、甲基鹽菌屬(Methylohalobius)、甲基八疊球菌(Methylosarcina)、甲基球形菌屬(Methylosphaera)、甲基孢囊菌屬(Methylocystis)、甲基彎曲菌屬(Methylosinus)(例如，發(fā)孢甲基彎曲菌(Methylosinus trichosporium)、甲基帽菌屬(Methylocapsa)、甲基細胞菌屬(Methylocella)、甲基球菌屬(Methylococcus)(例如，莢膜甲基球菌(Methylococcus capsulatus))、甲基暖菌屬(Methylocaldum)、嗜甲基菌屬(Methylophilus)(例如，食甲基嗜甲基菌(Methylophilus methylotrophus))、嗜酸嗜甲基菌屬(Methylacidiphilum)、生絲微菌屬(Hyphomicrobium)(例如，Hyphomicrobium methylovorum或查氏生絲微菌屬(Hyphomicrobium zavarzinii))、芽孢桿菌屬(Bacillus)(例如，甲醇芽胞桿菌(Bacillus methanolicus))、假單胞菌屬(Pseudomonas)、副球菌屬(Paracoccus)(例如，脫氮副球菌(Paracoccus denitrificans))、玫瑰桿菌屬(Silicibacter)(例如，Silicibacter pomeroyi)或Granulibacter(例如，Granulibacter bethesdensis)。

在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明方法中使用的微生物是表達甲醇脫氫酶(MDH)和尤其催化甲醇氧化成甲醛的含有吡咯并喹啉-醌(PQQ)的酶(醌蛋白)的微生物(Anthony,Adv.Microbila Physiol.27(1986),113-120；Duine和Frank,Methanol dehydrogenase:A quinoprotein；引自：Microbial Growth on C₁Compounds；編者Dalton,H.,Heyden&Son Ltd.,London(1981),31-41；Duine等人,Eur.J.Biochem.108(1980),187-192)。

在一個特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明方法中使用的微生物是酸單胞菌屬微生物，優(yōu)選地甲醇酸單胞菌物種(以前名稱為：甲醇醋酸桿菌)生物。甲醇酸單胞菌是能夠依賴甲醇作為唯一碳源生長的獨特乙酸細菌。這種細菌特別地可用于本發(fā)明的方法中，因為它高效地攝取甲醇。甲醇由這種細菌轉(zhuǎn)化成甲醛，原因是表達甲醇脫氫酶(由MxaF基因編碼；參見，例如，Suzuki等人,J.Gen.Appl.Microbiol.55(2009),101-110)。這種生物的基因組DNA序列草圖已經(jīng)由Higashiura等人(FEMS Microbiol.Lett.351(2014),9-13)報告。甲醇酸單胞菌的甲醇脫氫酶是醌蛋白并且已經(jīng)詳細描述了其特性(Frébortova等人,Biochim.Biophys.Acta 1363(1998),24-34)。

其他例子是屬于疣微菌門(Verrucomicrobia)的細菌或伯克氏菌目(Burkholderiales)、尤其叢毛單胞菌科(Comamonadaceae)或紅環(huán)菌科(Rhodocyclaceae)、例如Methylibium屬(例如Methylibium petroleiphilum)和伯克霍爾德菌屬(Burkholderia)(例如，瘤狀伯克霍爾德菌(Burkholderia phymatum))的細菌。其他例子是絲狀細菌，例如泉發(fā)菌屬(Crenothrix)(例如多孢泉發(fā)菌(Crenothrix polyspora))、細枝發(fā)菌屬(Clonothrix)(例如褐色細枝發(fā)菌(Clonothrix fusca))或貝氏硫菌屬(例如白色貝氏硫菌(Beggiatoa alba))的絲狀細菌。

甲醇營養(yǎng)或甲基營養(yǎng)酵母例如包括畢赤酵母屬(Pichia)酵母、優(yōu)選地巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris))、假絲酵母屬酵母(例如博伊丁假絲酵母)、Ogataea屬酵母、Kuraishia、Komagatealla屬酵母(參見，例如，Yurimoto等人,Intern.J.Microbiol.2011(2011)，ID101298)，擲孢酵母屬(Sporobolomyces)酵母(例如玫瑰擲孢酵母(Sporobolomyces roseus)Y株)或紅酵母屬酵母(Rhodotorula)(例如粘紅酵母(Rhodotorula glutinis)株CY)、漢遜酵母屬(Hansenula)酵母(例如多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha))。

下文還將進一步詳細描述為了表達目的酶對微生物的基因修飾。

本發(fā)明方法中所用的磷酸轉(zhuǎn)酮酶和/或磺基乙醛乙酰轉(zhuǎn)移酶可以是天然存在的磷酸轉(zhuǎn)酮酶或磺基乙醛乙酰轉(zhuǎn)移酶或它可以是從天然存在的磷酸轉(zhuǎn)酮酶/磺基乙醛乙酰轉(zhuǎn)移酶衍生的磷酸轉(zhuǎn)酮酶/磺基乙醛乙酰轉(zhuǎn)移酶，例如通過引入突變或例如，改變或改善酶活性、穩(wěn)定性等的其他改變。

用于修飾和/或改善蛋白質(zhì)的所需酶活性的方法是本領域技術人員熟知的并且包括例如隨機誘變或位點定向誘變并隨后選擇具有所需特性的酶，或所謂“定向進化”方案。

例如，對于原核細胞中的基因修飾，可以將編碼磷酸轉(zhuǎn)酮酶或磺基乙醛乙酰轉(zhuǎn)移酶的核酸分子引入質(zhì)粒中，所述質(zhì)粒允許通過DNA序列重組誘變或序列修飾。標準方法(見Sambrook和Russell(2001),Molecular Cloning:A Laboratory Manual,CSH Press,Cold Spring Harbor,NY,USA)允許進行堿基交換或添加天然或合成序列?？梢酝ㄟ^使用與片段互補的銜接頭和接頭連接DNA片段。另外，可以使用提供合適限制性位點或除去多余DNA或限制性位點的工程化措施。在其中可能插入，缺失或置換的那些情況下，可以使用體外誘變、“引物修復”、限制作用或連接。通常而言，實施序列分析、限制分析和其他生物化學和分子生物學方法作為分析方法。隨后用如上文所述的測定法，對所產(chǎn)生的磷酸轉(zhuǎn)酮酶/磺基乙醛乙酰轉(zhuǎn)移酶變體測試所需的活性，例如，酶活性，并且特別地是測試它們增加的酶活性。

如上文所述，本發(fā)明方法中所用或本發(fā)明組合物中所含的微生物可以是已經(jīng)通過導入編碼磷酸轉(zhuǎn)酮酶和/或磺基乙醛乙酰轉(zhuǎn)移酶的核酸分子進行基因修飾的微生物。因此，在一個優(yōu)選的實施方案中，微生物是已經(jīng)過基因修飾以具有增加的磷酸轉(zhuǎn)酮酶活性和/或增加的磺基乙醛乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的重組微生物。這可以例如通過用編碼核酸磷酸轉(zhuǎn)酮酶和/或磺基乙醛乙酰轉(zhuǎn)移酶的核酸轉(zhuǎn)化該微生物來實現(xiàn)。下文將進一步詳細描述對微生物的基因修飾。優(yōu)選地，引入微生物中的核酸分子是相對于該微生物是異源的核酸分子，即，它天然地不存在于所述微生物中。

在本發(fā)明的上下文中，“增加的活性”意指基因修飾的微生物中酶的、尤其是磷酸轉(zhuǎn)酮酶或磺基乙醛乙酰轉(zhuǎn)移酶的表達和/或活性比相應未修飾的微生物中高至少10％、優(yōu)選地至少20％、更優(yōu)選地至少30％或50％、甚至更優(yōu)選地至少70％或80％并且特別優(yōu)選高至少90％或100％。在甚至更優(yōu)選的實施方案中，表達和/或活性的增加可以是至少150％、至少200％或至少500％。在特別優(yōu)選的實施方案中，表達比相應未修飾的微生物中高至少10倍、更優(yōu)選地至少100倍和甚至更優(yōu)選至少1000倍。

術語“增加的”表達/活性也涵蓋如下情況，其中相應未修飾的微生物不表達相應的酶，例如磷酸轉(zhuǎn)酮酶或磺基乙醛乙酰轉(zhuǎn)移酶，從而未修飾的微生物中的相應表達/活性是零。優(yōu)選地，過量表達的酶的濃度是至少5％、10％、20％、30％或40％的總宿主細胞蛋白。

用于測量細胞中給定蛋白質(zhì)的表達水平的方法是本領域技術人員熟知的。在一個實施方案中，通過測量相應蛋白質(zhì)的量進行表達水平的測量。相應方法是本領域技術人員熟知的并且包括蛋白質(zhì)印跡法、ELISA等。在另一個實施方案中，通過測量相應RNA的量進行表達水平的測量。相應方法是本領域技術人員熟知的并且包括例如RNA印跡。

用于測量磷酸轉(zhuǎn)酮酶或磺基乙醛乙酰轉(zhuǎn)移酶的酶活性的方法是本領域已知的并且已經(jīng)在上文描述。

在本發(fā)明的上下文中，術語“重組”意指微生物經(jīng)基因修飾，從而與野生型或未修飾的微生物相比，含有編碼如上文定義的酶的核酸分子。編碼如上文定義的酶的核酸分子可以單獨使用或作為載體的部分使用。

所述核酸分子還可以包含與包含于該核酸分子中的多核苷酸有效連接的表達控制序列。如本說明書自始至終使用，術語“有效連接的”或“有效連接”指在一個或多個表達控制序列和多核苷酸中待表達的編碼區(qū)之間以如此方式連接，從而在與表達控制序列相容的條件下實現(xiàn)表達。

表達包括異源DNA序列的轉(zhuǎn)錄，優(yōu)選地，轉(zhuǎn)錄成可翻譯的mRNA。確保在真菌中以及在細菌中表達的調(diào)節(jié)元件是本領域技術人員熟知的。它們涵蓋啟動子、增強子、終止信號、靶向信號等。在下文與相關載體的解釋相聯(lián)系時進一步給出實例。

相對于核酸分子的來源和/或相對于待表達的基因，用于與核酸分子連接的啟動子可以是同源或異源的。合適的啟動子是例如自身導致組成型表達的啟動子。然而，也可以使用僅在由外部影響所決定的時間點激活的啟動子。在本上下文中，可以使用人工啟動子和/或化學誘導型啟動子。

所述載體還可以包含與包含于該載體中的所述多核苷酸有效連接的表達控制序列。這些表達控制序列可以適用于確保可翻譯的RNA在細菌或真菌中的轉(zhuǎn)錄和合成。

此外，可以通過分子生物學中常規(guī)的方法將不同突變插入多核苷酸(見例如Sambrook和Russell(2001),Molecular Cloning:A Laboratory Manual,CSH Press,Cold Spring Harbor,NY,USA)，導致合成可能具有改變的生物學特性的多肽?？蓸嬎荚谖恢锰帉朦c突變，其中在所述位置處的氨基酸序列的修飾例如影響多肽的生物活性或多肽的調(diào)節(jié)。

另外，可以制備擁有修飾的底物或產(chǎn)物特異性的突變體。優(yōu)選地，這類突變體顯示增加的活性。備選地，可以制備在不喪失底物結合活性的情況下消除其催化活性的突變體。

另外，將突變引入編碼如上文定義的酶的多核苷酸中允許減少或增加所述多核苷酸編碼的酶的基因表達速率和/或活性。

為了遺傳地修飾細菌或真菌，可以將將編碼如上文定義的酶的多核苷酸或這些分子的部分引入質(zhì)粒中，這允許通過DNA序列重組誘變或序列修飾。標準方法(見Sambrook和Russell(2001),Molecular Cloning:A Laboratory Manual,CSH Press,Cold Spring Harbor,NY,USA)允許進行堿基交換或添加天然或合成序列?？梢酝ㄟ^使用針對片段的銜接頭和接頭相互連接DNA片段。另外，可以使用提供合適限制性位點或除去多余DNA或限制性位點的工程化措施。在可能插入，缺失或置換的那些情況下，可以使用體外誘變、“引物修復”、限制作用或連接。通常而言，實施序列分析、限制分析和其他生物化學和分子生物學方法作為分析方法。

因而，根據(jù)本發(fā)明，可以通過遺傳地修飾真菌或細菌來產(chǎn)生重組微生物，包括將上述多核苷酸、核酸分子或載體導入真菌或細菌中。

表達編碼相應酶、尤其編碼磷酸轉(zhuǎn)酮酶或磺基乙醛乙酰轉(zhuǎn)移酶的多核苷酸，以導致具有上文描述的任一種活性例如磷酸轉(zhuǎn)酮酶活性或磺基乙醛乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的多肽產(chǎn)生。不同表達系統(tǒng)的綜述例如含于Methods in Enzymology 153(1987),385-516中，引自Bitter等人(Methods in Enzymology153(1987)，516-544)并含于Sawers等人,(Applied Microbiology and Biotechnology 46(1996),1-9)、Billman-Jacobe(Current Opinion in Biotechnology 7(1996),500-4)、Hockney(Trends in Biotechnology 12(1994),456-463)、Griffiths等人,(Methods in Molecular Biology 75(1997),427-440)中。酵母表達系統(tǒng)的綜述例如由Hensing等人(Antonie van Leuwenhoek 67(1995),261-279),Bussineau等人(Developments in Biological Standardization 83(1994),13-19)、Gellissen等人(Antonie van Leuwenhoek 62(1992),79-93)、Fleer(Current Opinion in Biotechnology 3(1992),486-496)、Vedvick(Current Opinion in Biotechnology 2(1991),742-745)和Buckholz(Bio/Technology 9(1991),1067-1072)給出。

已經(jīng)在文獻中廣泛描述了表達載體。原則上，它們不僅含有選擇標記基因和確保在選擇的宿主中復制的復制起點，還含有細菌啟動子或病毒啟動子，和在大多數(shù)情況下轉(zhuǎn)錄終止信號。在啟動子和終止信號之間通常存在至少一個使得插入編碼性DNA序列成為可能的限制性位點或多接頭。如果天然控制相應基因的轉(zhuǎn)錄的DNA序列在選擇的宿主生物中有活性，則該天然控制相應基因的轉(zhuǎn)錄的DNA序列可以用作啟動子序列。然而，這種序列也可以交換為其他啟動子序列。可以使用確?；蚪M成型表達的啟動子和允許人為控制基因表達的誘導型啟動子。文獻中詳述了擁有這些特性的細菌啟動子和病毒啟動子序列。文獻中充分描述了用于微生物(例如大腸桿菌、釀酒酵母)中表達的調(diào)節(jié)序列。允許特別高地表達下游序列的啟動子例如是T7啟動子(Studier等人,Methods in Enzymology 185(1990),60-89)、lacUV5、trp、trp-lacUV5(DeBoer等人,引自Rodriguez和Chamberlin(編著),Promoters,Structure and Function；Praeger,New York,(1982),462-481；DeBoer等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1983),21-25)、lp1、rac(Boros等人,Gene 42(1986),97-100)。誘導型啟動子優(yōu)選地用于多肽的合成。這些啟動子經(jīng)常導致比組成型啟動子更高的多肽產(chǎn)量。為了獲得最佳多肽量，經(jīng)常使用兩階段方法。首先，將宿主細胞在最佳條件下培養(yǎng)直至相對高的細胞密度。在第二步驟中，根據(jù)使用的啟動子的類型，誘導轉(zhuǎn)錄。在這個方面，tac啟動子是特別合適的，所述tac啟動子可以由乳糖或IPTG(＝異丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷)誘導(deBoer等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80(1983),21-25)。文獻中也描述了轉(zhuǎn)錄的終止信號。

可以通過例如Sambrook和Russell(2001),Molecular Cloning:A Laboratory Manual,CSH Press,Cold Spring Harbor,NY,USA；Methods in Yeast Genetics,A Laboratory Course Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1990中描述的標準方法，用如上所述的多核苷酸或載體實施宿主細胞的轉(zhuǎn)化。將宿主細胞在滿足(尤其在pH值、溫度、鹽濃度、通氣、抗生素、維生素、微量元素等方面滿足)所用具體宿主細胞要求的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

當本發(fā)明方法通過使用提供相應酶活性的生物/微生物在體內(nèi)實施時，在允許酶促反應出現(xiàn)的合適培養(yǎng)條件下培育生物、優(yōu)選地微生物。特定培養(yǎng)條件取決于所用的特定生物/微生物，但是為本領域技術人員熟知。通常以如此方式選擇培養(yǎng)條件，從而它們允許編碼用于相應反應的酶的基因的表達。多種方法是本領域技術人員已知的，以便在某些培養(yǎng)階段改進并精細調(diào)節(jié)某些基因的表達，如通過化學誘導物或通過溫度變動誘導基因表達。

在另一個實施方案中，本發(fā)明的方法包括步驟：以(細胞)培養(yǎng)物形式、優(yōu)選地液態(tài)細胞培養(yǎng)物形式提供攜帶相應酶活性的生物，優(yōu)選地微生物，后續(xù)步驟是在發(fā)酵器(經(jīng)常也稱作生物反應器)中于允許相應酶表達的合適條件下培育所述生物，優(yōu)選地微生物，并且還包括步驟：實現(xiàn)如本文上述的本發(fā)明方法的酶促轉(zhuǎn)化。合適的發(fā)酵器或生物反應器裝置和發(fā)酵條件是本領域技術人員已知的。生物反應器或發(fā)酵器指支持生物活性環(huán)境的本領域已知的任何制造或工程化的裝置或系統(tǒng)。因此，生物反應器或發(fā)酵器可以是實施化學/生物化學過程如本發(fā)明方法的容器，所述化學/生物化學過程涉及生物、優(yōu)選地微生物和/或生物化學活性物質(zhì)，即，從此類生物衍生的上述酶或攜帶上述酶的生物。在生物反應器或發(fā)酵器中，這種過程可以是需氧的或厭氧的。這些生物反應器常見是圓柱狀，并且可以具有從數(shù)升至若干立方米的一系列規(guī)格，并經(jīng)常由不銹鋼制成。在這個方面，不受理論約束，發(fā)酵器或生物反應器可以按照這樣的方式設計，從而它適合以例如分批培養(yǎng)、補料分批培養(yǎng)、灌流培養(yǎng)或化學培養(yǎng)方式來培養(yǎng)生物，優(yōu)選地微生物，全部培養(yǎng)方法通常均是本領域已知的。

培養(yǎng)基可以是適于培養(yǎng)相應生物或微生物的任何培養(yǎng)基。

本發(fā)明還涉及一種組合物，所述組合物含有

(a)甲醛和磷酸轉(zhuǎn)酮酶；或

(b)甲醛和磺基乙醛乙酰轉(zhuǎn)移酶；或

(c)甲醛和磷酸轉(zhuǎn)酮酶和磺基乙醛乙酰轉(zhuǎn)移酶；或

(d)甲醛和表達磷酸轉(zhuǎn)酮酶的微生物；或

(e)甲醛和表達磺基乙醛乙酰轉(zhuǎn)移酶的微生物；或

(f)甲醛和表達磷酸轉(zhuǎn)酮酶和磺基乙醛乙酰轉(zhuǎn)移酶的微生物。

磷酸轉(zhuǎn)酮酶/磺基乙醛乙酰轉(zhuǎn)移酶可以是如上文聯(lián)系本發(fā)明方法定義的磷酸轉(zhuǎn)酮酶/磺基乙醛乙酰轉(zhuǎn)移酶。組合物中所含微生物可以是表達磷酸轉(zhuǎn)酮酶和/或磺基乙醛乙酰轉(zhuǎn)移酶的任何合適的微生物，尤其如上文聯(lián)系本發(fā)明方法所述的微生物。

本發(fā)明另外涉及磷酸轉(zhuǎn)酮酶或磺基乙醛乙酰轉(zhuǎn)移酶的用途或表達磷酸轉(zhuǎn)酮酶和/或磺基乙醛乙酰轉(zhuǎn)移酶的微生物的用途，用于從甲醛產(chǎn)生乙酰磷酸。就磷酸轉(zhuǎn)酮酶/磺基乙醛乙酰轉(zhuǎn)移酶和微生物而言，它們?nèi)缟衔囊呀?jīng)與本發(fā)明方法相聯(lián)系時所述那樣適用。

圖1顯示使用來自乳酸乳球菌(L.lactis)的磷酸轉(zhuǎn)酮酶從甲醛產(chǎn)生乙酰磷酸的酶促反應的質(zhì)譜圖(A)和無酶情況下對照反應的質(zhì)譜圖(B)。

圖2顯示在磷酸存在下由磷酸轉(zhuǎn)酮酶轉(zhuǎn)化甲醛形成的乙酸的峰強度。

在本說明書中，引用了包括專利申請的眾多文件。這些文獻的公開內(nèi)容，盡管不認為與本發(fā)明可專利性相關，通過引用的方式完整結合在此。更具體地，參考的全部文獻通過引用的方式以相同的程度結合，如同專門且個別地指出通過引用的方式結合每份單獨的文獻。

現(xiàn)在將參以下實施例描述本發(fā)明，所述實施例僅是示意性的并且不得解釋為限制本發(fā)明的范圍。

實施例

實施例1:磷酸轉(zhuǎn)酮酶的克隆、表達和純化

重組酶的基因合成、克隆和表達

通過寡核苷酸串聯(lián)法產(chǎn)生了從原核生物基因組推斷的磷酸轉(zhuǎn)酮酶序列，以符合大腸桿菌的密碼子選擇(基因由商業(yè)合成)。將一段6組氨酸密碼子插入甲硫氨酸起始密碼子后，以提供用于純化的親和標簽。將由此合成的基因克隆于含有修飾的多克隆位點(MCS)的改良pUC18表達載體(New England Biolabs)中。將目的基因克隆在PacI和NotI限制性位點處。

使用標準熱休克法，用這些載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)MG1655大腸桿菌細胞。將轉(zhuǎn)化的細胞在30℃在LB-氨芐青霉素培養(yǎng)基中培育24小時，160轉(zhuǎn)/分鐘振搖。

通過在4℃，10,000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘收集細胞并且在-80℃貯存細胞沉淀物。

蛋白質(zhì)純化和濃縮

來自200ml培養(yǎng)的細胞的沉淀物在冰上融化并且重懸于3ml含有300mM NaCl、5mM MgCl₂、1mM DTT和10mM咪唑的50mM Tris-HCl pH7.5中。添加10μl lysonase(Merck)。將細胞在室溫孵育10分鐘并且隨后返回冰上20分鐘。通過超聲波處理2x 30秒完成細胞裂解。隨后通過在4℃，10,000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘使細菌提取物澄清。將澄清的細菌裂解物加載于允許吸附加6-His標簽的蛋白質(zhì)的PROTINO-1000Ni-TED柱(Macherey-Nagel)上。將柱洗滌并且將目的酶用4ml含有300mM NaCl、5mM MgCl₂、1mM DTT、250mM咪唑的50mM Tris-HCl pH 7.5洗脫。將洗脫物隨后在Amicon Ultra-4 10kDa濾器單元(Millipore)上濃縮和脫鹽，并且將酶重懸于50mM Tris-HCl pH 7.5中。在長期儲存之前，向酶制品補充10％甘油。通過在NanoDrop 1000分光光度計(Thermo Scientific)上直接紫外280nm測量，對蛋白質(zhì)濃度定量。如此純化的蛋白質(zhì)純度在70％至90％變動。

實施例2：從甲醛經(jīng)酶催化產(chǎn)生乙酰磷酸的研究

乙酰磷酸對水解是特別不穩(wěn)定的，釋放乙酸。因此，使用質(zhì)譜(MS)和HPLC分析監(jiān)測從甲醛經(jīng)酶催化產(chǎn)生乙酸。

質(zhì)譜(MS)分析

在以下條件下實施酶促反應：

50mM磷酸鈉pH 7.5

1mM焦磷酸硫胺素(TPP)

10mM MgCl₂

50mM甲醛(Sigma)

將pH調(diào)節(jié)至7.5

磷酸轉(zhuǎn)酮酶(PKT)濃度是10mg/ml。

在不添加酶或不添加甲醛的情況下進行對照測定法。酶促反應在37℃以0.2ml總體積運行40小時伴以振搖。一般地，取出200μl等分試樣的反應，離心并將上清液轉(zhuǎn)移至一個清潔小瓶。使用以流速2ml/小時運行的注射泵，通過樣品的直接上樣，在離子阱質(zhì)譜儀(Ion Trapp Mass Spectrometer，Esquire3000，Bruker)上以負離子模式獲得MS譜。評價乙酸的存在。MS分析顯示來自酶促樣品但是不來自對照的在m/z 59.4處對應于乙酸的[M-H]^-離子(圖1A和B、圖2)。

基于HPLC的分析

在以下條件下實施酶促反應：

50mM磷酸鈉pH 7.5

5mM焦磷酸硫胺素(TPP)

5mM MgCl₂

1.9mM L-半胱氨酸鹽酸鹽

23mM氟化鈉

50mM甲醛(Sigma)

將pH調(diào)節(jié)至7.5

磷酸轉(zhuǎn)酮酶(PKT)按濃度5mg/ml添加。

平行運行由(a)甲醛和磷酸在無酶情況下、(b)甲醛和酶在無磷酸情況下組成的對照反應。

酶促反應在37℃以0.3ml總體積運行48小時伴以振搖，并通過在80℃溫育5分鐘終止。隨后將分析管離心并且將100μl澄清的上清液轉(zhuǎn)移至一個清潔小瓶中。使用商業(yè)乙酸鈉(Sigma-Aldrich)作為參考。使用配備折射探測器和柱加熱模塊的1260Inifinity LC系統(tǒng)(Agilent)，進行HPLC分析。在配備PL Hi-Plex H保護柱(50x 7.7mm)的Hi-Plex H柱(300x 7.7mm，8μm粒度，柱溫度65℃)上分離10μl樣品。由硫酸溶液(5.5mM)組成的流動相以流速0.6ml/分鐘運行。在這些條件下乙酸的保留時間是18.4分鐘。

表1中顯示HPLC分析的結果。

表1：隨反應混合物中存在磷酸而變化的從甲醛形成乙酸。

這些數(shù)據(jù)顯示，在磷酸和磷酸轉(zhuǎn)酮酶存在下通過形成乙酰磷酸而推進，發(fā)生從甲醛產(chǎn)生乙酸。

實施例3：磺基乙醛乙酰轉(zhuǎn)移酶催化從甲醛產(chǎn)生乙酰磷酸的研究

乙酰磷酸對水解是特別不穩(wěn)定的，釋放乙酸。因此，使用HPLC分析監(jiān)測從甲醛經(jīng)酶催化產(chǎn)生乙酸。

基于HPLC的分析

在以下條件下實施酶促反應：

50mM磷酸鈉pH7.5

5mM焦磷酸硫胺素(TPP)

5mM MgCl₂

1.9mM L-半胱氨酸鹽酸鹽

23mM氟化鈉

50mM甲醛(Sigma-Aldrich)

1-10mg/ml酶

這項研究中使用以下酶：

來自木糖氧化產(chǎn)堿桿菌木糖氧化亞種(Alcaligenes xylosoxydans xylosoxydans)(Uniprot登錄號：Q84H41)的磺基乙醛乙酰轉(zhuǎn)移酶

來自Roseovarius nubinhibens ISM(Uniprot登錄號：A3SR25)的磺基乙醛乙酰轉(zhuǎn)移酶

來自解芳烴卡斯特羅尼氏菌(Uniprot登錄號：Q84H44)的磺基乙醛乙酰轉(zhuǎn)移酶

來自Desulfonispora thiosulfatigenes(Uniprot登錄號：Q93PS3)的磺基乙醛乙酰轉(zhuǎn)移酶

平行運行由(a)甲醛和磷酸在無酶情況下、(b)甲醛和酶在無磷酸情況下組成的對照反應。

酶促反應在37℃以0.3ml總體積進行48小時伴以振搖，并通過在80℃溫育5分鐘終止。隨后將分析管離心并且將100μl澄清的上清液轉(zhuǎn)移至一個清潔小瓶中。使用商業(yè)乙酸鈉(Sigma-Aldrich)作為參考。使用配備折射探測器和柱加熱模塊的1260Inifinity LC系統(tǒng)(Agilent)，進行HPLC分析。在配備PL Hi-Plex H保護柱(50x 7.7mm)的Hi-Plex H柱(300x 7.7mm，8μm粒度，柱溫度65℃)上分離10μl樣品。由硫酸溶液(5.5mM)組成的流動相以流速0.6ml/分鐘運行。在這些條件下乙酸的保留時間是18.4分鐘。