專利名稱：核苷－5’－磷酸酯的制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及核苷-5’-磷酸酯的制造方法。本發(fā)明還涉及在核苷-5’-磷酸酯的制造中有用的新型酸性磷酸酶、編碼這種酸性磷酸酶的基因、含有這種基因的重組DNA和攜帶這種重組DNA的微生物。核苷-5’-磷酸酯作為調(diào)味品、醫(yī)藥及其原料非常有用。
背景技術(shù)：
核苷經(jīng)生物化學(xué)磷酸化來制造核苷-5’-磷酸酯的方法中，就所使用的磷酸供體而言，已知有使用對硝基苯磷酸的方法(特公昭39-29858號)、使用無機(jī)磷酸的方法(特公昭42-1186號)、使用聚磷酸的方法(特開昭53-56390號)、使用乙酰磷酸的方法(特開昭56-82098)、使用腺苷三磷酸(ATP)的方法(特開昭63-230094號)。然而，這些方法使用的底物非常昂貴，并可生成反應(yīng)副產(chǎn)物，因而都不能滿足廉價而高效地生產(chǎn)核苷-5’-磷酸酯的要求。
于是，本發(fā)明者們開發(fā)了使用特定的微生物菌體，在酸性條件下作用于核苷和選自聚磷酸(鹽)、磷酸苯酯(鹽)和氨甲酰磷酸(鹽)的磷酸供體，在不伴有2’-、3’-核苷酸異構(gòu)體副產(chǎn)物生成的情況下，高效生成核苷-5’-磷酸酯的方法(特開平7-231793號)。
但是，在此方法中也有以下各種缺點(diǎn)，在所使用的微生物菌體中存在微量的核苷分解活性，因而在反應(yīng)中部分底物被分解；而且，隨著反應(yīng)的繼續(xù)，生成和積累的核苷-5’-磷酸酯也會被分解，從而在反應(yīng)液中生成副產(chǎn)物，不能獲得足夠的回收率。另外，由于單個菌體的磷酸轉(zhuǎn)移活性較低，當(dāng)加入高濃度底物時反應(yīng)無法進(jìn)行。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種廉價而高效的核苷-5’-磷酸酯的制造方法。本發(fā)明的另一目的是提供在核苷-5’-磷酸酯的制造方法中有用的酶、編碼這種酶的基因、含有這種基因的重組DNA和攜帶這種重組DNA的微生物。
本發(fā)明者們?yōu)殚_發(fā)一種比傳統(tǒng)方法更有效的核苷-5’-磷酸酯的制造方法進(jìn)行了多方面的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，將從微生物的無細(xì)胞抽提液中純化的酸性磷酸酶在pH3.0～5.5的條件下作用于核苷和選自聚磷酸(鹽)、磷酸苯酯(鹽)和氨甲酰磷酸(鹽)的磷酸供體，能夠高產(chǎn)、有效地生產(chǎn)核苷-5’-磷酸酯。而且，本發(fā)明非常成功地從多種細(xì)菌中獲得了編碼酸性磷酸酶的野生型基因及從摩根氏菌屬和埃希氏菌屬的細(xì)菌中獲得了編碼磷酸酯水解活性降低了的突變型酸性磷酸酶的基因，并發(fā)現(xiàn)用基因工程技術(shù)大量表達(dá)該基因能使核苷-5’-磷酸酯的生產(chǎn)飛躍性地提高，至此完成本發(fā)明。
即，本發(fā)明提供一種核苷-5’-磷酸酯的制造方法，其特征在于使酸性磷酸酶，優(yōu)選是核苷酸酶活性降低了的酸性磷酸酶，在pH3.0～5.5的條件下作用于核苷和選自聚磷酸(鹽)、磷酸苯酯(鹽)和氨甲酰磷酸(鹽)的磷酸供體，來生成核苷-5’-磷酸酯，并收集生成物。
另外，本發(fā)明還提供磷酸酯水解活性降低了的突變型酸性磷酸酶、編碼這種酶的基因、含有這種基因的重組DNA以及攜帶這種重組DNA的微生物。
本發(fā)明還提供來源于埃希氏菌屬、腸桿菌屬、克雷伯氏菌屬和沙雷氏菌屬的新型酸性磷酸酶、編碼這些酶的基因、含有這些基因的重組DNA和攜帶這些重組DNA的微生物。
下面詳細(xì)說明本發(fā)明。
<1>酸性磷酸酶的獲取本發(fā)明所使用的酸性磷酸酶能以聚磷酸(鹽)、磷酸苯酯(鹽)或氨甲酰磷酸(鹽)為磷酸供體在pH3.0～5.5的條件下，催化磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移至核苷生成核苷-5’-磷酸酯的反應(yīng)，沒有特別的限制。這種酸性磷酸酶優(yōu)選來源于微生物，特別優(yōu)選的實(shí)施例為來源于有這種酶活性的、屬于摩根氏菌屬、埃希氏菌屬、普羅威登斯菌屬、腸桿菌屬、克雷伯氏菌屬和沙雷氏菌屬的細(xì)菌的酶?？膳e出以下菌株作為這類細(xì)菌的代表例。
摩氏摩根氏菌(Morganella morganii)NCIMB 10466摩氏摩根氏菌(Morganella morganii)IFO 3168摩氏摩根氏菌(Morganella morganii)IFO 3848蟑螂埃希氏菌(Escherichiia blattae)JCM 1650蟑螂埃希氏菌(Escherichiia blattae)ATCC 33429蟑螂埃希氏菌(Escherichiia blattae)ATCC 33430
蘇氏普羅威登氏菌(Providencia stuartii)ATCC 29851蘇氏普羅威登氏菌(Providencia stuartii)ATCC 33672產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)IFO 12010產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)IFO 13534植生克雷伯氏菌(Klebsiella planticola)IFO 14939植生克雷伯氏菌(Klebsiella planticola)IAM 1133無花果沙雷氏菌(Serratia ficaria)IAM 13540粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)IAM 12143然而，酸性磷酸酶(EC3.1.3.2)本來是在酸性條件下催化磷酸酯水解的酶，具有降解在磷酸轉(zhuǎn)移反應(yīng)中生成的核苷-5’-磷酸酯的核苷酸酶活性(在下文中稱為“磷酸酯水解活性”)。在本發(fā)明的核苷-5’-磷酸酯制造方法中，也可以使用這種酸性磷酸酶。但為了高收率地獲得核苷-5’-磷酸酯，最好使用與上述細(xì)菌產(chǎn)生的野生型酸性磷酸酶相比，磷酸酯水解活性降低了的突變型酸性磷酸酶(在下文中也簡稱為“突變型酸性磷酸酶”)。
如后述及，突變型酸性磷酸酶可用使編碼酸性磷酸酶的基因直接突變而表達(dá)突變型基因的方法來獲得；亦可，用紫外線照射或N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍等人工突變常用的誘變劑處理產(chǎn)生酸性磷酸酶的微生物。培養(yǎng)能產(chǎn)生磷酸酯水解活性降低了的突變型酸性磷酸酶的微生物，來獲得突變型酸性磷酸酶。
從上面介紹的微生物獲得具有酸性磷酸酶活性的蛋白質(zhì)可按下列步驟進(jìn)行，將具有這種活性的菌株培養(yǎng)在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中，收集增殖的菌體，破碎菌體制備無細(xì)胞抽提液，并進(jìn)行必要的純化。
培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)基沒有特殊的限制，可以使用含有普通的碳源、氮源、無機(jī)離子，必要時用含有有機(jī)營養(yǎng)源的普通培養(yǎng)基。碳源可用葡萄糖、蔗糖等糖類、甘油等醇類、有機(jī)酸及其它。氮源可用氨氣、氨水、銨鹽及其它。無機(jī)離子包括鎂離子、磷酸離子、鉀離子、鐵離子、錳離子及其它，可按需要而使用。有機(jī)營養(yǎng)源可使用維生素、氨基酸等，或含有它們的酵母抽提物、蛋白胨、肉抽提物、玉米漿、酪素分解物、大豆水解物等。
培養(yǎng)條件也沒有特殊的限制。例如，可在需氧條件下，將pH和溫度適當(dāng)控制在pH5～8和溫度25～40℃的范圍內(nèi)，培養(yǎng)12～48小時左右。
增殖的菌體可用離心等方法從培養(yǎng)液中收集。用常規(guī)方法由回收的菌體制備無細(xì)胞抽提液。即，用超聲波處理、Dyno-mill、氟氏壓碎器等方法破碎菌體，離心除去菌體殘?jiān)?，從而獲得無細(xì)胞抽提液。
從無細(xì)胞抽提液中純化酸性磷酸酶可采用硫酸銨分級、離子交換層析、疏水層析、親和層析、凝膠過濾層析、等電點(diǎn)沉淀等純化酶的常用技術(shù)適當(dāng)加以組合運(yùn)用。純化并不一定必須是完全純化，除去參與底物核苷降解的酶等夾雜物即可。
<2>酸性磷酸酶基因的獲取含有編碼具有酸性磷酸酶活性的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因的DNA片斷，可以從具有該酶活性的微生物等的細(xì)胞中克隆?？寺》椒ㄓ幸悦富钚詾橹笜?biāo)篩選染色體基因表達(dá)文庫的方法；制備針對該蛋白質(zhì)的抗體來篩選染色體基因表達(dá)文庫的方法；分析純化蛋白質(zhì)的N末端等的氨基酸序列，據(jù)此制備出探針來篩選基因文庫的方法等。
具體地說，編碼上面介紹的摩氏摩根氏菌、蟑螂埃希氏菌、蘇氏普羅威登氏菌、產(chǎn)氣腸桿菌、植生克雷伯氏菌、無花果沙雷氏菌或粘質(zhì)沙雷氏菌的酸性磷酸酶的基因，可通過制備各種微生物的染色體基因表達(dá)文庫，以磷酸酶活性為指標(biāo)篩選這些文庫來克隆。
即，首先由上述細(xì)菌制備染色體DNA，用適當(dāng)?shù)南拗泼覆糠窒缓笈c在大腸桿菌中能自主復(fù)制的載體連接，用獲得的重組DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌，從而制備成染色體基因表達(dá)文庫。在切斷染色體DNA時，通過調(diào)節(jié)切斷反應(yīng)時間來調(diào)整切斷的程度，并可使用眾多種類的限制酶。而且，基因克隆中使用的載體可以是任何能在大腸桿菌中自主復(fù)制的載體。例如，可以使用pUC19、pUC118、pHSG298、pBR322、pBluescriptII等。
制備載體與含有編碼酸性磷酸酶的基因的DNA片斷連接而成的重組DNA，其過程為，使用與切斷染色體DNA所用的限制酶相同的限制酶，或使用產(chǎn)生的切斷面與染色體的切斷面互補(bǔ)的限制酶，預(yù)先切斷載體，并用T4 DNA連接酶等連接酶進(jìn)行與DNA片斷的連接。所制備的重組DNA的受體菌可為任何適宜于載體復(fù)制的菌株，例如可以使用大腸桿菌HB101、JM109、DH5等菌株。
使這樣獲得的轉(zhuǎn)化子在瓊脂培養(yǎng)基上生長繁殖形成菌落，然后，在培養(yǎng)基表面上倒入含有對硝基苯磷酸的反應(yīng)液進(jìn)行反應(yīng)，表達(dá)磷酸酶活性的菌株會釋放出對硝基苯并顯黃色。在酸性條件下進(jìn)行上述反應(yīng)，以呈色為指標(biāo)篩選轉(zhuǎn)化子，能夠篩選到攜帶含編碼目的酸性磷酸酶的基因的DNA片斷的轉(zhuǎn)化子。
接著，從被選擇的轉(zhuǎn)化子中回收重組DNA，分析載體中連接的含有編碼酸性磷酸酶的基因的DNA片斷的結(jié)構(gòu)。編碼酸性磷酸酶的基因的堿基序列，在基因來源于摩氏摩根氏菌NCIMB 10466、蟑螂埃希氏菌JCM 1650、蘇氏普羅威登氏菌ATCC 29851、產(chǎn)氣腸桿菌IFO12010、植生克雷伯氏菌IFO 14939和無花果沙雷氏菌IAM 13540時，分別顯示在序列表序列編號2、9、17、19、21和23中。
由上述基因的編碼推導(dǎo)的酸性磷酸酶的氨基酸序列顯示在序列表序列編號4、11、18、20、22和24中。由上述基因編碼的酸性磷酸酶可以在本發(fā)明中優(yōu)選使用。而且，任何含有與上述基因編碼的酸性磷酸酶的氨基酸序列實(shí)質(zhì)上相同的氨基酸序列的酸性磷酸酶，都可以在本發(fā)明中優(yōu)選使用?！皩?shí)質(zhì)上相同”的意思是指酸性磷酸酶的氨基酸序列盡管有一個或兩個以上的氨基酸殘基的置換、缺失、插入或轉(zhuǎn)移，但核苷-5’-磷酸酯的生成活性(下文表述為“磷酸轉(zhuǎn)移活性”)并不喪失。
<3>編碼突變型酸性磷酸酶的基因的獲取按上述方法獲得的野生型酸性磷酸酶由于含有磷酸酯水解活性，在制造核苷-5’-磷酸酯時，隨著反應(yīng)時間的延續(xù)，伴隨著生成物的降解，因此是導(dǎo)致產(chǎn)率降低的重要原因。在這種情況下，應(yīng)人工引起編碼酸性磷酸酶的基因的突變以使其磷酸酯水解活性降低。
在DNA的目的位點(diǎn)上引起目的突變的位點(diǎn)特異性突變方法有，使用PCR的方法(Higuchi，R.，61頁，《PCR技術(shù)》(PCR technology)，Erlich，H.A.E編輯，Stockton press(1989)；Carter，P.，《酶學(xué)方法》(Meth.in Enzymol.)，154卷，382頁(1987))和使用噬菌體的方法(Kramer，W.和Frits，H.J.，《酶學(xué)方法》(Meth.in Enzymol.)，154卷，350頁(1987)；Kunkel，T.A.等，《酶學(xué)方法》(Meth.in Enzymol.)，154卷，367頁(1987))等。
磷酸酯水解活性降低了的酸性磷酸酶的實(shí)例包括含有與序列表序列編號4、11、18、20、22或24中所示氨基酸序列實(shí)質(zhì)上相同的氨基酸序列，且含有使野生型酸性磷酸酶的磷酸酯水解活性降低的突變的突變型酸性磷酸酶。具體地說，當(dāng)酶來源于摩氏摩根氏菌NCIMB10466時，所舉的例子為，在序列表序列編號4所示的氨基酸序列中第72位的甘氨酸殘基和/或第151位的異亮氨酸殘基被其它氨基酸殘基置換。在后述的實(shí)施例中所示的例子是第72位的甘氨酸殘基被天冬氨酸殘基置換、第151位的異亮氨酸殘基被蘇氨酸殘基置換而獲得的突變型酸性磷酸酶基因。當(dāng)酶來源于蟑螂埃希氏菌JCM 1650時，所舉的例子為，在序列表序列編號11所示的氨基酸序列中第74位的甘氨酸殘基和/或第153位的異亮氨酸殘基被其它氨基酸殘基置換。在后述的實(shí)施例中所示的例子是第74位的甘氨酸殘基被天冬氨酸殘基置換、第153位的異亮氨酸殘基被蘇氨酸殘基置換而獲得的突變型酸性磷酸酶基因。
因此，為了編碼這些突變型酸性磷酸酶，使用上述的位點(diǎn)特異性突變方法，在野生型基因的特定部位中進(jìn)行堿基置換即可。而且，磷酸酯水解活性降低的突變最好是沒有伴隨著與野生型酸性磷酸酶相比核苷-5’-磷酸酯生成活性實(shí)質(zhì)上降低的突變，即使在核苷-5’-磷酸酯生成活性降低的情況下，只要磷酸酯水解活性降低的程度較大，其結(jié)果是磷酸酯水解活性/核苷-5’-磷酸酯生成活性的比值低于野生型酸性磷酸酶的突變即可。就磷酸酯水解活性降低的程度而言，活性降低到野生型酶的約40％以下的即可。
在后述的實(shí)施例中，蟑螂埃希氏菌JCM 1650的酸性磷酸酶的氨基酸序列與摩氏摩根氏菌NCIMB 10466的酸性磷酸酶有很高的同源性，序列編號4所示氨基酸序列中的第72位的甘氨酸殘基和第151位的異亮氨酸殘基分別相當(dāng)于序列編號11所示氨基酸序列中的第74位的甘氨酸殘基和第153位的異亮氨酸殘基。而且，除蟑螂埃希氏菌JCM1650以外，來源于蘇氏普羅威登氏菌ATCC 29851、產(chǎn)氣腸桿菌IFO12010、植生克雷伯氏菌IFO 14939和無花果沙雷氏菌IAM 13540等微生物的酸性磷酸酶的氨基酸序列，與摩氏摩根氏菌NCIMB 10466的酸性磷酸酶的同源性也很高，并都分別含有與序列編號4所示氨基酸序列中的第72位的甘氨酸殘基和第151位的異亮氨酸殘基相當(dāng)?shù)陌被釟埢?，可以用同樣的方法獲得突變型酸性磷酸酶基因。與序列編號4所示氨基酸序列中的第72位的甘氨酸殘基和第151位的異亮氨酸殘基相當(dāng)?shù)陌被釟埢?，在來源于蘇氏普羅威登氏菌ATCC 29851、產(chǎn)氣腸桿菌IFO 12010和植生克雷伯氏菌IFO 14939的酸性磷酸酶中，為序列表序列編號18、20或22中所示氨基酸序列中的第92位的甘氨酸殘基和第171位的異亮氨酸殘基，在來源于無花果沙雷氏菌IAM13540的酸性磷酸酶中，為序列表序列編號24中所示的氨基酸序列中的第88位的甘氨酸殘基和第167位的異亮氨酸殘基。
<4>將酸性磷酸酶基因?qū)胨拗鲗⒂蒙鲜龇椒ǐ@得的含有編碼有酸性磷酸酶活性的蛋白質(zhì)的基因的DNA片斷，在適當(dāng)?shù)妮d體中再次重組后導(dǎo)入宿主細(xì)胞，能夠獲得高水平表達(dá)酸性磷酸酶活性的重組細(xì)菌。在這個過程中，如用編碼野生型酸性磷酸酶的基因，則表達(dá)野生型酸性磷酸酶；如用編碼突變型酸性磷酸酶的基因，則表達(dá)突變型酸性磷酸酶。
宿主包括上文列舉的HB101、JM109、DH5等大腸桿菌菌株，除此之外，能使構(gòu)建的重組DNA的復(fù)制起點(diǎn)和酸性磷酸酶基因具有功能的、重組DNA可以復(fù)制且酸性磷酸酶基因可以表達(dá)的細(xì)菌，都可用作宿主。一個最優(yōu)選的宿主是大腸桿菌JM109。
用于整合編碼酸性磷酸酶的基因的載體只需能在宿主中復(fù)制而沒有特殊的限制。在以大腸桿菌作為宿主的情況下，可以舉出能夠在此細(xì)菌中自主復(fù)制的質(zhì)粒作為例子，例如，可以使用ColE1系質(zhì)粒、p15A系質(zhì)粒、R因子系質(zhì)粒、噬菌體系質(zhì)粒等。具體的實(shí)例為，pBR322(《基因》(Gene)，2卷，95頁(1977))、pUC19(《基因》(Gene)，33卷，103頁(1985))、pUC119(《酶學(xué)方法》(Methods in Enzymology)，153卷，3頁(1987))、pACYC184(《細(xì)菌學(xué)雜志》(J.Bacteriol)，134卷，1141頁(1978))、pSC101(《美國科學(xué)院院報》(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)，70卷，3240頁(1973))等。
在含有編碼酸性磷酸酶的基因的DNA片斷含有在宿主中有功能的啟動子的情況下，將DNA片斷原封不動與載體連接即可。在上述DNA片斷不含啟動子的情況下，在上述基因的上游連接lac、trp、PL等在宿主微生物內(nèi)起作用的其它啟動子亦可。即使在上述DNA片斷含有啟動子的情況下，為了有效地表達(dá)編碼酸性磷酸酶的基因，也可與其它啟動子置換。
將含有編碼酸性磷酸酶的基因的DNA片斷與載體連接而成的重組DNA導(dǎo)入宿主的方法沒有特殊的限制，使用常規(guī)方法就可以進(jìn)行。在使用大腸桿菌作為宿主時，可以使用氯化鈣法(《分子生物學(xué)雜志》(J.Mol.Biol.)，53卷，159頁(1970))、Hanahan法(《分子生物學(xué)雜志》(J.Mol.Biol.)，166卷，557頁(1983))、SEM法(《基因》(Gene)，96卷，23頁(1990))、Chung等的方法(《美國科學(xué)院院報》(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)，86卷，2172頁(1989))、電穿孔法(《核酸研究》(Nucleic AcidsRes.)，16卷，6127頁(1988))等方法。
而且，可以按上述方法將酸性磷酸酶基因插入到能自主復(fù)制的載體DNA中并導(dǎo)入宿主，以染色體外DNA的形式保持在宿主中，也可以用轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)座子(《生物技術(shù)》(Biotechnol.)，第1卷，417頁(1983))、Mu噬菌體(特開平2-109985)或同源重組(《分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)》(Experiments in Molecular Genetics)，Cold Spring Harbor Lab.(1972))的方法將酸性磷酸酶基因整合到宿主微生物的染色體中。
<5>在重組微生物中表達(dá)酸性磷酸酶基因?qū)瓷鲜龇椒ǖ玫降?、?dǎo)入了含有編碼酸性磷酸酶的基因的重組DNA的轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)于含有碳源、氮源、無機(jī)離子、及如果必要時含有機(jī)營養(yǎng)源的適當(dāng)培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)化子能夠在菌體中高水平地表達(dá)酸性磷酸酶活性。適宜于使用的碳源包括葡萄糖等碳水化合物、甘油等醇類、有機(jī)酸及其它；使用的氮源包括氨氣、氨水、銨鹽及其它；必要時適宜于使用的無機(jī)離子包括鎂離子、磷酸離子、鉀離子、鐵離子、錳離子及其它離子；適宜于使用的有機(jī)營養(yǎng)源包括維生素、氨基酸等，以及含有它們的酵母抽提物、蛋白胨、肉抽提物、玉米漿、酪素分解物、大豆水解物等。而且，在培養(yǎng)基中加入IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)等啟動子依賴的表達(dá)誘導(dǎo)劑時，酸性磷酸酶的表達(dá)量會上升。
培養(yǎng)條件也沒有特殊的限制，例如，在需氧條件下，將pH和溫度適當(dāng)控制在pH5～8和25～40℃的范圍內(nèi)，培養(yǎng)12～48小時左右即可。
接著，從培養(yǎng)物中回收菌體，破碎菌體獲得無細(xì)胞抽提液，從中能夠純化酸性磷酸酶。純化可采用<1>中所述常用的酶純化技術(shù)加以適當(dāng)組合。純化并不一定必須是完全純化，除去參與底物核苷降解的酶等夾雜物即可。
<6>核苷-5’-磷酸酯的制造將上述<1>中獲得的酸性磷酸酶或上述<5>中所示的用基因工程技術(shù)大量表達(dá)基因所獲得的野生型酸性磷酸酶或突變型酸性磷酸酶，與核苷和選自聚磷酸(鹽)、磷酸苯酯(鹽)和氨甲酰磷酸(鹽)的磷酸供體進(jìn)行接觸反應(yīng)，可在反應(yīng)液中生成核苷-5’-磷酸酯。這時，為了得到高的生產(chǎn)性，將反應(yīng)液的pH調(diào)節(jié)在3.0～5.5的弱酸性范圍內(nèi)非常重要。
而且，在用基因工程技術(shù)大量表達(dá)編碼酸性磷酸酶的基因時，特別是大量表達(dá)編碼磷酸酯水解活性降低了的突變型酸性磷酸酶的基因時，使用含有轉(zhuǎn)化子的菌體的培養(yǎng)物、從該培養(yǎng)物分離回收的菌體、以及對該菌體進(jìn)行固定化處理、丙酮處理、冷凍干燥處理等所得到的菌體處理物，來代替純化的酸性磷酸酶，都能夠廉價而有效地生成核苷-5’-磷酸酯。
所用核苷包括，次黃嘌呤核苷、鳥嘌呤核苷、腺嘌呤核苷、黃嘌呤核苷、嘌呤核苷、6-甲氧嘌呤核苷、2，6-二氨基嘌呤核苷、6-氟嘌呤核苷、6-硫代嘌呤核苷、2-氨基-6-硫代嘌呤核苷和巰基鳥嘌呤核苷等嘌呤類核苷；尿嘧啶核苷、胞嘧啶核苷、5-氨基尿嘧啶核苷、5-羥基尿嘧啶核苷、5-溴尿嘧啶核苷和6-氮尿嘧啶核苷等嘧啶類核苷。在反應(yīng)中這些天然型核苷和非天然型核苷的5’位置被特異性地磷酸化，生成各自對應(yīng)的核苷-5’-磷酸酯。
反應(yīng)液中加入的核苷的濃度最好為1～20g/dl。在使用難溶于水的核苷時，加入硼酸或二甲基亞砜等表面活性劑會使反應(yīng)收率升高。
可以使用的磷酸供體包括焦磷酸、三聚磷酸、三偏磷酸、四偏磷酸、六偏磷酸或它們的混合物、或它們的鈉鹽、鉀鹽或這些鹽的混合物等聚磷酸(鹽)；磷酸苯酯二鈉、磷酸苯酯二鉀、O，O-縮水二磷酸苯酯或它們的混合物等磷酸苯酯(鹽)；氨甲酰磷酸二鈉、氨甲酰磷酸二鉀、氨甲酰磷酸二銨、氨甲酰磷酸二鋰或它們的混合物等氨甲酰磷酸(鹽)。磷酸供體的使用濃度由用作磷酸受體的核苷的濃度來決定。通常最好為核苷的1～5倍量。
反應(yīng)通常在20～60℃(優(yōu)選為30～40℃)的溫度、pH3.5～6.5(優(yōu)選為pH4.0～5.0)的弱酸性條件下提供優(yōu)選的結(jié)果。在反應(yīng)中可任選采用靜置或攪拌的方法。反應(yīng)時間根據(jù)所用的酶的活性、底物濃度等條件的不同可為1～100小時。
從反應(yīng)后的混合物中收集分離所生成的核苷-5’-磷酸酯，可以采用使用合成吸附樹脂的方法和使用沉淀劑的方法以及其它常規(guī)的收集分離方法。
附圖的簡單說明

圖1顯示在使用來源于摩氏摩根氏菌的酶的反應(yīng)中，反應(yīng)pH與5’-次黃嘌呤核苷酸生成量之間的關(guān)系。
圖2顯示在使用來源于蟑螂埃希氏菌的酶的反應(yīng)中，反應(yīng)pH與5’-次黃嘌呤核苷酸生成量之間的關(guān)系。
圖3顯示含有編碼酸性磷酸酶的基因的摩氏摩根氏菌染色體DNA片斷的限制酶圖譜。
圖4顯示在使用來源于摩氏摩根氏菌的酸性磷酸酶基因的攜帶菌株的反應(yīng)中5’-次黃嘌呤核苷酸的生成量。
圖5顯示在使用來源于摩氏摩根氏菌的野生型酸性磷酸酶基因的攜帶菌株和突變型酸性磷酸酶基因的攜帶菌株的反應(yīng)中5’-次黃嘌呤核苷酸的生成量。
圖6顯示含有編碼酸性磷酸酶的基因的蟑螂埃希氏菌染色體DNA片斷的限制酶圖譜。
圖7顯示在使用來源于蟑螂埃希氏菌的酸性磷酸酶基因的攜帶菌株的反應(yīng)中5’-次黃嘌呤核苷酸的生成量。
圖8顯示在使用來源于蟑螂埃希氏菌的野生型酸性磷酸酶基因的攜帶菌株和突變型酸性磷酸酶基因的攜帶菌株的反應(yīng)中5’-次黃嘌呤核苷酸的生成量。
圖9顯示含有編碼酸性磷酸酶的基因的產(chǎn)氣腸桿菌染色體DNA片斷的限制酶圖譜。
圖10顯示含有編碼酸性磷酸酶的基因的植生克雷伯氏菌染色體DNA片斷的限制酶圖譜。
圖11顯示含有編碼酸性磷酸酶的基因的無花果沙雷氏菌染色體DNA片斷的限制酶圖譜。
圖12用氨基酸的單字母表示法顯示由摩氏摩根氏菌、蟑螂埃希氏菌、蘇氏普羅威登氏菌、產(chǎn)氣腸桿菌、植生克雷伯氏菌、和無花果沙雷氏菌的酸性磷酸酶基因的堿基序列推導(dǎo)的蛋白質(zhì)的氨基酸序列。這些氨基酸序列分別在序列表序列編號4、11、18、20、22和24中用三字母表示法顯示。在圖中，用在序列下加*號顯示所有氨基酸序列中共同的氨基酸殘基。
優(yōu)選實(shí)施例的說明下面用實(shí)施例來具體地說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不限定于這些實(shí)施例。
磷酸轉(zhuǎn)移活性的測定以次黃嘌呤核苷為底物在下列條件下進(jìn)行。含有次黃嘌呤核苷40umol/ml、焦磷酸鈉100umol/ml、乙酸鈉緩沖液(pH5.0)100umol/ml和酶的反應(yīng)液(1ml)在pH5.0、30℃的條件下反應(yīng)10分鐘。加入2N的鹽酸200ul使反應(yīng)停止，然后離心除去沉淀，對反應(yīng)中生成的5’-次黃嘌呤核苷酸進(jìn)行定量。將在此標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下1分鐘內(nèi)生成1umol的5’-次黃嘌呤核苷酸的酶量定為1單位。
磷酸酯水解活性的測定是以5’-次黃嘌呤核苷酸為底物在下列條件下進(jìn)行。在含有5’-次黃嘌呤核苷酸10umol/ml、MES/NaOH緩沖液(pH6.0)100umol/ml和含酶的反應(yīng)液(1ml)在30℃的條件下反應(yīng)10分鐘，加入2N的鹽酸200ul使反應(yīng)停止，然后離心除去沉淀，對水解反應(yīng)中生成的次黃嘌呤核苷進(jìn)行定量。將在此標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下1分鐘內(nèi)生成1umol的次黃嘌呤核苷的酶量定為1單位。
次黃嘌呤核苷和5’-次黃嘌呤核苷酸用高效液相色譜(HPLC)在下述條件下進(jìn)行分析。
柱Cosmosil 5C 18-AR(4.6×150mm)(nacalai tesque公司出品)流動相5mM磷酸鉀緩沖液(pH2.8)/甲醇＝95/5流速 1.0ml/min溫度 室溫檢出 UV245nm在用次黃嘌呤核苷以外的核苷為原料的核苷-5’-磷酸酯的生成反應(yīng)中，原料核苷和生成的核苷-5’-磷酸酯也用與上述同樣的HPLC進(jìn)行分析。
實(shí)施例1來源于摩氏摩根氏菌的酸性磷酸酶的純化和性質(zhì)將50ml含有蛋白胨1g/dl、酵母抽提物0.5g/dl和氯化鈉1g/dl的營養(yǎng)培養(yǎng)基(pH7.0)加入500ml的坂口瓶中，在120℃加熱滅菌20分鐘。在瓶中接種一白金耳摩氏摩根氏菌NCIMB 10466的斜面培養(yǎng)物，在30℃振蕩培養(yǎng)16小時。離心培養(yǎng)液回收約3,000g的菌體。后者懸浮于1L的100mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)，在4℃進(jìn)行超聲波處理20分鐘破碎菌體。離心除去不溶性組分，制備無細(xì)胞抽提液。
在此無細(xì)胞抽提液中加入硫酸銨至30％飽和。離心除去生成的沉淀，然后在上清液中繼續(xù)加入硫酸銨至60％飽和。離心收集生成的沉淀，將其溶解在100mM的磷酸鉀緩沖液中。
這種粗酶液用5L的100mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)透析四次，然后上樣至用20mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)平衡的DEAE-Toyopearl650M柱(4.1×22cm)中，用800ml的20mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)洗脫，磷酸轉(zhuǎn)移活性存在于通過的組分中，回收該組分。
在此活性組分中加入硫酸銨至35％飽和，并用35％硫酸銨飽和的20mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)平衡的Butyl-Toyopearl柱(3.1×26cm)吸附。用35％飽和至20％飽和的磷酸鉀緩沖液(pH7.0)的線性梯度進(jìn)行洗脫。
收集活性組分，用1L的50mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)透析，然后用50mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)平衡的羥基磷灰石柱(5×6.5cm)吸附。用50mM至300mM的磷酸鉀緩沖液(pH7.0)的線性梯度進(jìn)行洗脫。
收集活性組分，并超濾濃縮。將此酶液注入HiLoad TM 16/60Superdex200柱(Pharmacia公司出品)，用含有100mM氯化鈉的50mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)以1.0ml/分的流速進(jìn)行洗脫。
按照上述操作，最終從無細(xì)胞抽提液中得到純化約550倍的顯示磷酸轉(zhuǎn)移活性的酶，回收率約為10％。此純化過程中的比活性和回收率如表1所示。此酶樣品在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中是均一的。
表1

純化后的酶具有以下性質(zhì)。
(1)作用將磷酸從聚磷酸等磷酸供體轉(zhuǎn)移至核苷，生成核苷-5’-磷酸酯。也顯示逆向的磷酸酯水解作用。
(2)底物特異性在磷酸轉(zhuǎn)移反應(yīng)中，可以用作磷酸供體的有焦磷酸、三聚磷酸、三偏磷酸、四偏磷酸、六偏磷酸、磷酸苯酯二鈉、磷酸苯酯二鉀、O，O-縮水二磷酸苯酯、氨甲酰磷酸二鈉、氨甲酰磷酸二鉀、氨甲酰磷酸二銨和氨甲酰磷酸二鋰等?？梢杂米髁姿崾荏w的有嘌呤核苷、次黃嘌呤核苷、鳥嘌呤核苷、腺嘌呤核苷、黃嘌呤核苷、尿嘧啶核苷、和胞嘧啶核苷等。另一方面，可在磷酸酯水解反應(yīng)中接受作用的有焦磷酸、三聚磷酸、三偏磷酸、四偏磷酸、六偏磷酸等無機(jī)磷酸；磷酸苯酯二鈉、磷酸苯酯二鉀、O，O-縮水二磷酸苯酯、氨甲酰磷酸二鈉、氨甲酰磷酸二鉀、氨甲酰磷酸二銨、氨甲酰磷酸二鋰等磷酸酯；以及5’-嘌呤核苷酸、5’-次黃嘌呤核苷酸、5’-鳥嘌呤核苷酸、5’-腺嘌呤核苷酸、5’-黃嘌呤核苷酸、5’-尿嘧啶核苷酸、5’-胞嘧啶核苷酸等5’-核苷酸。
(3)最適pH5.2(磷酸轉(zhuǎn)移反應(yīng))、6.5(磷酸酯水解反應(yīng))(4)pH穩(wěn)定性pH3.0～12.0(30℃、處理60分鐘)(5)最適溫度35℃左右(6)溫度穩(wěn)定性30℃以內(nèi)穩(wěn)定(pH7.0、處理30分鐘)(7)金屬離子和抑制劑的影響本酶的活性在加入金屬離子時，不會出現(xiàn)活化現(xiàn)象，Ag2+、Pb2-、Hg2+和Cu2+會抑制本酶的活性，而且碘乙酸也會抑制本酶的活性。
(8)分子量用高效液相色譜(TSKgel G-3000SW，Toyo Soda公司出品)計算出的分子量約為190,000。
(9)亞單位分子量用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測算出的亞單位分子量約為25,000。
本酶不僅有將磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移至核苷的磷酸轉(zhuǎn)移活性，還顯示逆向的磷酸酯水解活性，而且本酶顯示的磷酸酯水解活性比磷酸轉(zhuǎn)移活性高20倍以上。其它性質(zhì)也與摩根氏菌屬的細(xì)菌產(chǎn)生的已知酸性磷酸酶一致(《微生物學(xué)》(Microbiology)，140卷，1341-1350頁(1994))，因此，本酶顯然是一種酸性磷酸酶。
將焦磷酸鈉10g/dl和次黃嘌呤核苷2g/dl溶解在pH分別為5.5、5.0、4.5、4.0、3.5的乙酸鈉緩沖液中，然后加入上述酶樣品至50單位/dl。分別維持各自的pH，在30℃反應(yīng)6小時，測定隨時間延續(xù)生成的5’-次黃嘌呤核苷酸的量。而且，生成的次黃嘌呤核苷酸僅為5’-次黃嘌呤核苷酸，完全沒有發(fā)現(xiàn)2’-次黃嘌呤核苷酸和3’-次黃嘌呤核苷酸副產(chǎn)物的生成。結(jié)果如圖1所示。5’-次黃嘌呤核苷酸的生成速率在pH5.0時達(dá)到最大，5’-次黃嘌呤核苷酸的最大積累量隨pH的降低而升高。5’-次黃嘌呤核苷酸的生產(chǎn)在pH4.0的反應(yīng)條件下最有效率，3小時的反應(yīng)能生成積累2.60g/dl的5’-次黃嘌呤核苷酸。
實(shí)施例2使用來源于摩氏摩根氏菌的酸性磷酸酶樣品對各種核苷進(jìn)行的磷酸化反應(yīng)將焦磷酸鈉10g/dl和作為磷酸受體的次黃嘌呤核苷、鳥嘌呤核苷、尿嘧啶核苷或胞嘧啶核苷2g/dl溶解在乙酸鈉緩沖液(pH4.0)中，在其中加入實(shí)施例1的酶樣品至50單位/dl，將pH維持在pH4.0，在30℃反應(yīng)3小時。反應(yīng)中生成的核苷-5’-酯的量如表2所示。
而且，生成的核苷酸僅為核苷-5’-酯，完全沒有發(fā)現(xiàn)核苷-2’-酯和核苷-3’-酯副產(chǎn)物的生成。
表

實(shí)施例3使用來源于摩氏摩根氏菌的酸性磷酸酶樣品以各種磷酸化合物為磷酸供體生產(chǎn)5’-次黃嘌呤核苷酸將次黃嘌呤核苷2g/dl和作為磷酸供體的三聚磷酸鈉、聚磷酸鈉(商品名Polygon P，千代田化學(xué)(株)制品)、磷酸苯酯二鈉或氨甲酰磷酸二鈉10g/dl溶解在乙酸鈉緩沖液(pH4.0)中，在其中加入實(shí)施例1中制備的酶樣品至50單位/dl，將pH維持在pH4.0，在30℃反應(yīng)3小時。反應(yīng)中生成的5’-次黃嘌呤核苷酸的量如表3所示。
不管使用哪種磷酸供體都能有效地生成和積累5’-次黃嘌呤核苷酸，但在以聚磷酸鈉作磷酸供體時，5’-次黃嘌呤核苷酸的積累量最高。
表3

實(shí)施例4來源于蟑螂埃希氏菌的酸性磷酸酶的純化和性質(zhì)將50ml含有蛋白胨1g/dl、酵母抽提物0.5g/dl和氯化鈉1g/dl的營養(yǎng)培養(yǎng)基(pH7.0)加入500ml的坂口瓶中，在120℃加熱滅菌20分鐘。在瓶中接種一白金耳蟑螂埃希氏菌JCM 1650的斜面培養(yǎng)物，在30℃振蕩培養(yǎng)16小時。離心培養(yǎng)液回收菌體，將此菌體約3,300g懸浮于1L的100mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)，在4℃進(jìn)行超聲波處理20分鐘破碎菌體。離心除去不溶性組分，制備無細(xì)胞抽提液。
在此無細(xì)胞抽提液中加入硫酸銨至30％飽和。離心除去生成的沉淀，然后在上清液中繼續(xù)加入硫酸銨至60％飽和。離心收集生成的沉淀，并溶解在100mM的磷酸鉀緩沖液中。
這種粗酶液用5L的100mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)透析四次，然后上樣至用20mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)平衡的DEAE-Toyopearl650M柱(6.2×35cm)中，并用20mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)洗脫，磷酸轉(zhuǎn)移活性存在于通過的組分中，回收該組分。
在此活性組分中加入硫酸銨至35％飽和，并用含有35％飽和硫酸銨的20mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)平衡的Butyl-Toyopearl柱(5.0×22.5cm)吸附。用35％飽和至20％飽和的磷酸鉀緩沖液(pH7.0)的線性梯度進(jìn)行洗脫。
收集活性組分，用1L的100mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)透析，然后用100mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)平衡的羥基磷灰石柱(3.0×7.0cm)吸附。用50mM至100mM的磷酸鉀緩沖液(pH7.0)的線性梯度進(jìn)行洗脫，收集活性組分。
將此酶液用1L的10mM磷酸鉀緩沖液(pH6.0)透析，然后用10mM磷酸鉀緩沖液(pH6.0)平衡的CM-Toyopearl柱(2.0×14.0cm)吸附。用含有0mM至300mM的氯化鉀的磷酸鉀緩沖液(pH6.0)的線性梯度進(jìn)行洗脫，收集活性組分。
按照上述操作，最終從無細(xì)胞抽提液中得到了純化約600倍的顯示磷酸轉(zhuǎn)移活性的酶，回收率約為16％。此純化過程中的比活性和回收率如表4所示。此酶樣品在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中是均一的。
表4

純化后的酶具有以下性質(zhì)。
(1)作用將磷酸從聚磷酸等磷酸供體轉(zhuǎn)移至核苷，生成核苷-5’-磷酸酯。也顯示逆向的磷酸酯水解作用。
(2)底物特異性在磷酸轉(zhuǎn)移反應(yīng)中，可以用作磷酸供體的有焦磷酸、三聚磷酸、三偏磷酸、四偏磷酸、六偏磷酸、磷酸苯酯二鈉、磷酸苯酯二鉀、O，O-縮水二磷酸苯酯、氨甲酰磷酸二鈉、氨甲酰磷酸二鉀、氨甲酰磷酸二銨和氨甲酰磷酸二鋰等?？勺鳛榱姿崾荏w的有嘌呤核苷、次黃嘌呤核苷、鳥嘌呤核苷、腺嘌呤核苷、黃嘌呤核苷、尿嘧啶核苷、和胞嘧啶核苷等。另一方面，可在磷酸酯水解反應(yīng)中接受作用的有焦磷酸、三聚磷酸、三偏磷酸、四偏磷酸、六偏磷酸等無機(jī)磷酸；磷酸苯酯二鈉、磷酸苯酯二鉀、O，O-縮水二磷酸苯酯、氨甲酰磷酸二鈉、氨甲酰磷酸二鉀、氨甲酰磷酸二銨、氨甲酰磷酸二鋰等磷酸酯；以及5’-嘌呤核苷酸、5’-次黃嘌呤核苷酸、5’-鳥嘌呤核苷酸、5’-腺嘌呤核苷酸、5’-黃嘌呤核苷酸、5’-尿嘧啶核苷酸、5’-胞嘧啶核苷酸等5’-核苷酸。
(3)最適pH5.2(磷酸轉(zhuǎn)移反應(yīng))、6.5(磷酸酯水解反應(yīng))(4)pH穩(wěn)定性pH3.5～12.0(30℃、處理60分鐘)(5)最適溫度35℃左右(6)溫度穩(wěn)定性至40℃穩(wěn)定(pH7.0、處理30分鐘)(7)金屬離子和抑制劑的影響本酶的活性在加入金屬離子時，不會出現(xiàn)活化現(xiàn)象，F(xiàn)e2+、Ag2+、Pb2+、Hg2+和Cu2+會抑制本酶的活性，而且碘乙酸也會抑制本酶的活性。
(8)分子量用高效液相色譜(TSKgel G-3000SW，Toyo Soda公司出品)計算出的分子量約為188,000。
(9)亞單位分子量用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳計算出的亞單位分子量約為24,500。
本酶與從摩氏摩根氏菌NCIMB 10466的無細(xì)胞抽提液中純化的酶一樣，不僅有將磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移至核苷的磷酸轉(zhuǎn)移活性，還顯示逆向的磷酸酯水解活性，而且本酶顯示的磷酸酯水解活性比磷酸轉(zhuǎn)移活性高30倍以上。因此，本酶顯然是一種酸性磷酸酶。
將焦磷酸鈉15g/dl和次黃嘌呤核苷3g/dl溶解在pH分別為5.5、5.0、4.5、4.0、3.5的乙酸鈉緩沖液中，在它們中加入上述酶樣品至50單位/dl。分別維持各自的pH，在30℃反應(yīng)6小時，測定隨時間延續(xù)生成的5’-次黃嘌呤核苷酸的量。生成的次黃嘌呤核苷酸僅為5’-次黃嘌呤核苷酸，完全沒有發(fā)現(xiàn)2’-次黃嘌呤核苷酸和3’-次黃嘌呤核苷酸副產(chǎn)物的生成。結(jié)果如圖2所示。5’-次黃嘌呤核苷酸的生成速率在pH5.0時達(dá)到最大，5’-次黃嘌呤核苷酸的最大積累量隨pH的降低而升高。5’-次黃嘌呤核苷酸的生產(chǎn)在pH4.0的反應(yīng)條件下最有效率，在30℃、pH4.0的條件下反應(yīng)3小時能生成積累1.56 g/dl的5’-次黃嘌呤核苷酸。
實(shí)施例5使用來源于蟑螂埃希氏菌的酸性磷酸酶樣品對各種核苷進(jìn)行的磷酸化反應(yīng)將焦磷酸鈉15g/dl與次黃嘌呤核苷、鳥嘌呤核苷、尿嘧啶核苷或胞嘧啶核苷3g/dl溶解在乙酸鈉緩沖液(pH4.0)中，在其中加入實(shí)施例4的酶樣品至50單位/dl，將pH維持在pH4.0，在35℃反應(yīng)3小時。所生成的核苷-5’-酯的量如表5所示。
生成的核苷酸僅為核苷-5’-酯，完全沒有發(fā)現(xiàn)核苷-2’-酯和核苷-3’-酯的生成。
表5

實(shí)施例6使用來源于蟑螂埃希氏菌的酸性磷酸酶樣品以各種磷酸化合物為磷酸供體生產(chǎn)5’-次黃嘌呤核苷酸將次黃嘌呤核苷2g/dl和作為磷酸供體的三聚磷酸鈉、聚磷酸鈉(商品名Polygon P，千代田化學(xué)(株)出品)、磷酸苯酯二鈉或氨甲酰磷酸二鈉10g/dl溶解在乙酸鈉緩沖液(pH4.0)中，在其中加入實(shí)施例4中制備的酶樣品至50單位/dl，將pH維持在pH4.0，在35℃反應(yīng)3小時。生成的5’-次黃嘌呤核苷酸的量如表6所示。
不管使用哪種磷酸供體都能有效地生成和積累5’-次黃嘌呤核苷酸，在以聚磷酸鈉作磷酸供體時，5’-次黃嘌呤核苷酸的積累量最高。
表6

實(shí)施例7從摩氏摩根氏菌的染色體中分離編碼酸性磷酸酶的基因(1)N末端氨基酸序列的測定按照實(shí)施例1記載的方法從摩氏摩根氏菌NCIMB 10466的無細(xì)胞抽提液中純化的酸性磷酸酶，用DITC膜(Milligen/Biosearch公司生產(chǎn))吸附，使用Prosequencer 6625(Milligen/Biosearch公司生產(chǎn))確定N末端的氨基酸序列。測得序列表序列編號1中所示的20個殘基的N末端氨基酸序列。
(2)分離含有編碼酸性磷酸酶的基因的DNA片斷按照Murray和Thomson的方法(《核酸研究》(Nucl.Acid Res.)，4321卷，8頁(1980))從摩氏摩根氏菌NCIMB 10466的培養(yǎng)菌體中制備染色體DNA。用限制酶Sau3AI部分消化此染色體DNA，然后用蔗糖密度梯度離心法分離3～6kbp的DNA片斷。將質(zhì)粒載體pUC118(寶酒造社生產(chǎn))用限制酶BamHI切斷，與部分消化的染色體DNA片斷連接。DNA連接使用DNA連接試劑盒(寶酒造社生產(chǎn))，并按其指定的方法進(jìn)行。接著，將得到的DNA混合物按常規(guī)方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109(寶酒造社生產(chǎn))。將轉(zhuǎn)化子涂布在含有100μg/ml氨芐青霉素的L瓊脂培養(yǎng)基上繁殖，制備成基因文庫。
在轉(zhuǎn)化子繁殖的瓊脂培養(yǎng)基表面倒入含有4mM對硝基苯磷酸和100mM MES/NaOH緩沖液(pH6.5)的反應(yīng)液，在30℃保溫15分鐘。表達(dá)磷酸酶活性的細(xì)菌能釋放出對硝基苯呈黃色，以此為指標(biāo)選擇轉(zhuǎn)化子。對含有約20,000株轉(zhuǎn)化子的基因表達(dá)文庫進(jìn)行篩選，結(jié)果獲得了30株表達(dá)磷酸酶活性的轉(zhuǎn)化子。
對表達(dá)磷酸酶活性的30株轉(zhuǎn)化子進(jìn)行單菌落分離，并接種于2.5ml含有100μg/ml氨芐青霉素的L培養(yǎng)基中，在37℃培養(yǎng)16小時。從培養(yǎng)液中收集菌體，并向其中加入含有次黃嘌呤核苷2g/dl和焦磷酸鈉10g/dl的100mM乙酸鈉緩沖液(pH5.0)50μl，在30℃反應(yīng)16小時。用HPLC分析法檢測5’-次黃嘌呤核苷酸的生成，選擇帶有磷酸轉(zhuǎn)移活性的菌株。結(jié)果獲得了5株能顯示磷酸轉(zhuǎn)移活性、預(yù)計攜帶有含編碼目的酸性磷酸酶的基因的DNA片斷的轉(zhuǎn)化子。
實(shí)施例8來源于摩氏摩根氏菌NCIMB10466的酸性磷酸酶基因的堿基序列的測定從一株實(shí)施例7中獲得的預(yù)計攜帶有含來源于摩氏摩根氏菌NCIMB 10466的酸性磷酸酶基因的DNA片斷的轉(zhuǎn)化子中，用堿溶菌法(《分子克隆》(Molecular Cloning)，第二版(J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis，Cold Spring Harbour Laboratory Press，25頁(1989))制備質(zhì)粒，對插入的DNA片斷進(jìn)行分析。并將此質(zhì)粒命名為pMPI501。所測定的插入DNA片斷的限制酶圖譜如圖3所示。
進(jìn)一步用亞克隆的方法限定酸性磷酸酶基因的區(qū)域，結(jié)果提示，本酸性磷酸酶基因包含在用限制酶HindIII和限制酶EcoRI切割產(chǎn)生的1.2kbp大小的片斷中。因此，為測定堿基序列，將此1.2kbp的片斷結(jié)合到用HindIII和EcoRI切割的pUC118中構(gòu)建質(zhì)粒DNA。將此質(zhì)粒DNA命名為pMPI505并用常規(guī)方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109(寶酒造(社)生產(chǎn))，然后涂布于含有100μg/ml氨芐青霉素的L瓊脂培養(yǎng)基中獲得轉(zhuǎn)化子。
用堿溶菌法從攜帶pMPI505的大腸桿菌JM109(寶酒造生產(chǎn))轉(zhuǎn)化子中制備質(zhì)粒，進(jìn)行堿基序列的測定。堿基序列的測定使用TaqDyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit(Applied Biochemical公司生產(chǎn))按照Sanger等的方法(《分子生物學(xué)雜志》(J.Mol.Biol.)，143卷，161頁(1980))進(jìn)行。所測定的開放閱讀框的堿基序列參見序列表序列編號2。而且，由此堿基序列推導(dǎo)的蛋白質(zhì)的氨基酸序列參見序列表序列編號3。在此氨基酸序列中存在與純化的酶的N末端氨基酸序列完全一致的序列。純化的酶的N末端從序列編號3中顯示的序列的第21位丙氨酸殘基開始，因此序列編號3中所示的氨基酸序列是前體蛋白質(zhì)的序列，可以認(rèn)為由第1位的甲硫氨酸殘基至第20位的丙氨酸殘基組成的肽在翻譯后被除去。由此推導(dǎo)出的成熟蛋白質(zhì)的氨基酸序列參見序列編號4。由氨基酸序列計算出預(yù)計的成熟蛋白質(zhì)的分子量為24.9千道爾頓，這和純化的酶的SDS-PAGE的結(jié)果一致。由上述結(jié)果以及攜帶含有本片斷的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子均顯示磷酸轉(zhuǎn)移活性，可以確定本開放閱讀框是編碼目的酸性磷酸酶的區(qū)域。
分別用堿基序列和氨基酸序列與已知序列進(jìn)行同源性比較，使用的數(shù)據(jù)庫是EMBL和SWISS-PORT。比較的結(jié)果為，序列表序列編號2中所示的堿基序列與已知的來源于摩氏摩根氏菌的酸性磷酸酶基因(Thaller，M.C.等，《微生物學(xué)》(Microbiology)，140卷，1341頁(1994))，除了第54位的G是A、第72位的G是A、第276位的T是G、第378位的T是C、第420位的G是T、第525位的C是G、第529位的C是T、第531位的G是A之外，序列一致，而且證明，序列表序列編號4中所示的氨基酸序列與來源于摩氏摩根氏菌的酸性磷酸酶是相同的。即，編碼由序列表序列編號4所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的基因，是摩氏摩根氏菌NCIMB 10466的酸性磷酸酶基因。
并且，前體蛋白質(zhì)由249個氨基酸組成，由此序列預(yù)計的蛋白質(zhì)的分子量為27.0千道爾頓。
攜帶pMPI505的大腸桿菌JM109菌株被命名為AJ13143，并于平成8年2月23日(1996年2月23日)交與工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(郵政編碼305，日本茨城縣筑波市東一丁目1番3號)依據(jù)布達(dá)佩斯條約進(jìn)行了國際保藏，給予的保藏編號是FERM BP-5422。
實(shí)施例9通過表達(dá)來源于摩氏摩根氏菌NCIMB 10466的酸性磷酸酶基因來增加其活性將實(shí)施例8中構(gòu)建的大腸桿菌JM109/pMPI505接種于50ml含有氨芐青霉素100μg/ml和IPTG 1mM的L培養(yǎng)基中，在37℃培養(yǎng)16小時。從該培養(yǎng)液中離心收集菌體，用生理鹽水洗滌一次。用5ml的100mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)懸浮菌體，在4℃進(jìn)行超聲波處理20分鐘破碎菌體。離心處理液除去不溶性組分，制備無細(xì)胞抽提液。
測定所獲得的無細(xì)胞抽提液的磷酸轉(zhuǎn)移活性，用質(zhì)粒pUC118按同樣方法轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM109及摩氏摩根氏菌野生株制備的無細(xì)胞抽提液的活性作為對照，結(jié)果如表7所示。在大腸桿菌JM109/pUC118中沒有檢測到磷酸轉(zhuǎn)移活性，在摩氏摩根氏菌野生株中磷酸轉(zhuǎn)移活性也很低。另一方面，大腸桿菌JM109/pMPI505顯示的磷酸轉(zhuǎn)移比活性比摩氏摩根氏菌野生株高150倍，這一結(jié)果顯示，導(dǎo)入的DNA片斷在大腸桿菌中能夠高水平地表達(dá)酸性磷酸酶。
表7

實(shí)施例10使用攜帶有來源于摩氏摩根氏菌NCIMB 10466的酸性磷酸酶基因的菌株由次黃嘌呤核苷生產(chǎn)5’-次黃嘌呤核苷酸將焦磷酸鈉12g/dl和次黃嘌呤核苷6g/dl溶解在100mM的乙酸鈉緩沖液(pH4.0)中，在其中按干燥菌體重量100mg/dl加入上述大腸桿菌JM109/pMPI505的菌體。將pH維持在4.0，在30℃反應(yīng)6小時，測定隨時間延續(xù)生成的5’-次黃嘌呤核苷酸的量。生成的次黃嘌呤核苷酸僅為5’-次黃嘌呤核苷酸，完全沒有發(fā)現(xiàn)2’-次黃嘌呤核苷酸和3’-次黃嘌呤核苷酸副產(chǎn)物的生成。結(jié)果參見圖4。酸性磷酸酶基因攜帶菌株能表達(dá)顯著量的酸性磷酸酶，使用這種菌株由焦磷酸和次黃嘌呤核苷生產(chǎn)5’-次黃嘌呤核苷酸的反應(yīng)非常有效，能在短時間內(nèi)生產(chǎn)和積累5’-次黃嘌呤核苷酸。但是，隨著反應(yīng)時間的延續(xù)，生成積累的5’-次黃嘌呤核苷酸會因降解而減少。
實(shí)施例11磷酸酯水解活性低下型酸性磷酸酶基因的制備如實(shí)施例9和10所示，攜帶酸性磷酸酶基因的菌株能夠表達(dá)顯著量的酸性磷酸酶，使用這種菌株由焦磷酸和次黃嘌呤核苷生產(chǎn)5’-次黃嘌呤核苷酸的反應(yīng)非常有效，能在短時間內(nèi)生產(chǎn)和積累5’-次黃嘌呤核苷酸。但是，也證明生成的5’-次黃嘌呤核苷酸由于酸性磷酸酶自身有磷酸酯水解活性而受到降解，5’-次黃嘌呤核苷酸的積累量不會超過一定的程度。因此，對實(shí)施例7中克隆的、來源于摩氏摩根氏菌NCIMB10466的酸性磷酸酶基因，用PCR法按照位點(diǎn)特異的突變方法使之突變，進(jìn)行酶的改造。
使用DNA合成儀(Applied Biosystem公司生產(chǎn)，394型)按照磷亞酰胺法分別合成含有序列表序列編號5、6和7中所示序列的寡核苷酸MUT500、MUT510和MUT520。
使用實(shí)施例8中制備的質(zhì)粒pMPI505 1ng作為模板、M13引物-RV(寶酒造社生產(chǎn))和MUT510寡核苷酸各2.5μmol作為引物、以及Taq DNA聚合酶(寶酒造社生產(chǎn))2.5單位，在100μl含有dATP、dCTP、dGTP、dTTP各200μM、氯化鉀50mM和氯化鎂1.5mM的100mM Tris-鹽酸緩沖液(pH8.3)中加入上述物質(zhì)，使用94℃，30秒、55℃，2分鐘、72℃，3分鐘的循環(huán)參數(shù)，進(jìn)行25個循環(huán)的PCR反應(yīng)。PCR使用PJ2000型熱循環(huán)儀(寶酒造社生產(chǎn))進(jìn)行。另外，使用質(zhì)粒DNA pMPI505 1ng作為模板、M13引物-M4(寶酒造社生產(chǎn))和MUT500寡核苷酸各2.5μmol作為引物，按同樣的條件進(jìn)行PCR反應(yīng)。每次的反應(yīng)液用Microspin柱S-400(Pharmacia公司生產(chǎn))凝膠過濾進(jìn)行純化，以除去引物。
在95μl含有dATP、dCTP、dGTP、dTTP各200μM、氯化鉀50mM和氯化鎂1.5mM的100mM Tris-鹽酸緩沖液(pH8.3)中分別加入每種PCR反應(yīng)液1ul，在94℃加熱10分鐘，然后冷卻60分鐘至37℃，然后在37℃保溫15分鐘使異源雙鏈形成。加入Taq DNA聚合酶2.5單位在72℃反應(yīng)3分鐘，使異源雙鏈完成。接著，在此反應(yīng)液中加入M13引物-RV和M13引物-M4各2.5μmol，使用94℃，30秒、55℃，2分鐘、72℃，3分鐘的循環(huán)參數(shù)，進(jìn)行10個循環(huán)的PCR反應(yīng)。
第二輪PCR反應(yīng)的產(chǎn)物用HindIII和EcoRI切割，然后用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀。將此DNA片斷連接到用HindIII和EcoRI切割的pUC118中，所得到的質(zhì)粒DNA按常規(guī)方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109(寶酒造生產(chǎn))。并將其涂布在含有100μg/ml的氨芐青霉素的L瓊脂培養(yǎng)基上，獲取轉(zhuǎn)化子。用堿溶菌法從轉(zhuǎn)化子中制備質(zhì)粒，進(jìn)行堿基序列的測定以證實(shí)目的堿基已被置換。堿基序列的測定使用Taq DyeDeoxyTerminator Cycle Sequencing Kit(Applied Biochemical生產(chǎn))按照Sanger等的方法(《分子生物學(xué)雜志》(J.Mol.Biol.)，143卷，161頁(1980))進(jìn)行。由此制備了編碼成熟蛋白質(zhì)第72位的甘氨酸殘基(GGT)被天冬氨酸殘基(G*AT)置換的突變型酸性磷酸酶的突變型基因。含有這種突變型基因的質(zhì)粒命名為pMPI510。
使用pMPI505作為模板、MUT500和MUT520寡核苷酸作為引物，按照同樣的操作，制備了編碼成熟蛋白質(zhì)第151位的異亮氨酸殘基(ATC)被蘇氨酸殘基(A*CC)置換的突變型酸性磷酸酶的突變型基因。含有這種突變型基因的質(zhì)粒命名為pMPI520。繼而使用pMPI510作為模板，MUT500和MUT520寡核苷酸作為引物，按照同樣的操作制備了編碼成熟蛋白質(zhì)的第72位的甘氨酸殘基(GGT)被天冬氨酸殘基(G*AT)置換、第151位的異亮氨酸殘基(ATC)被蘇氨酸殘基(A*CC)置換的突變型酸性磷酸酶的突變型基因。含有這種突變型基因的質(zhì)粒命名為pMPI530。
將導(dǎo)入了上述含有各種突變型酸性磷酸酶基因的質(zhì)粒的大腸桿菌JM109/pMPI510、大腸桿菌JM109/pMPI520、大腸桿菌JM109/pMPI530和導(dǎo)入了含有野生型酸性磷酸酶基因的質(zhì)粒的大腸桿菌JM109/pMPI505接種于50ml含有氨芐青霉素100μg/ml和IPTG1mM的L培養(yǎng)基中，在37℃培養(yǎng)16小時。從培養(yǎng)液中離心收集菌體，用生理鹽水洗滌一次。菌體用5ml的100mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)懸浮，在4℃超聲波處理20分鐘破碎菌體。離心處理液除去不溶性組分，制備無細(xì)胞抽提液。在pH4.0的條件下測定所得到的無細(xì)胞抽提液的磷酸酯水解活性和磷酸轉(zhuǎn)移活性，并與野生型菌株的活性進(jìn)行比較。
野生型和突變型酸性磷酸酶的磷酸酯水解活性和磷酸轉(zhuǎn)移活性的測定結(jié)果列于表8。突變型酸性磷酸酶與野生型酸性磷酸酶相比，磷酸酯水解活性和磷酸轉(zhuǎn)移活性都降低，磷酸酯水解活性降低的程度更大，結(jié)果，突變型酸性磷酸酶的磷酸酯水解活性/磷酸轉(zhuǎn)移活性的比值低于野生型酸性磷酸酶的比值。
表8

實(shí)施例12使用攜帶有磷酸酯水解活性低下型酸性磷酸酶基因的菌株由次黃嘌呤核苷生產(chǎn)5’-次黃嘌呤核苷酸將導(dǎo)入了含有突變型酸性磷酸酶基因的質(zhì)粒的大腸桿菌JM109/pMPI510、大腸桿菌JM109/pMPI520、大腸桿菌JM109/pMPI530和導(dǎo)入了含有野生型酸性磷酸酶基因的質(zhì)粒的大腸桿菌JM109/pMPI505分別接種于50ml含有氨芐青霉素100μg/ml和IPTG 1mM的L培養(yǎng)基中，在37℃培養(yǎng)16小時。
將焦磷酸鈉12g/dl和次黃嘌呤核苷6g/dl溶解在100mM的乙酸鈉緩沖液(pH4.0)中，在其中按干燥菌體重量100mg/dl加入上述培養(yǎng)獲得的大腸桿菌各菌株的菌體。將pH維持在4.0，在30℃反應(yīng)22小時，測定隨時間延續(xù)生成的5’-次黃嘌呤核苷酸的量。結(jié)果如圖5所示。
在圖5中，縱軸代表5’-次黃嘌呤核苷酸的濃度(mg/dl)，橫軸代表反應(yīng)時間(h)，而實(shí)心圓形代表大腸桿菌(Eseheriehiacoli)JM109/pMPI505，實(shí)心三角形代表大腸桿菌(Escherichiacoli)JM109/pMPI510，空心圓形代表大腸桿菌(Escherichiacoli)JM109/pMPI520，空心四角形代表大腸桿菌(Escherichia coli)JM109/pMPI530，以此表示使用各菌時反應(yīng)的進(jìn)程。
在使用攜帶磷酸酯水解活性低下型酸性磷酸酶基因的菌株由次黃嘌呤核苷生產(chǎn)5’-次黃嘌呤核苷酸的反應(yīng)中，所生成的5’-次黃嘌呤核苷酸的分解速率降低，其結(jié)果，5’-次黃嘌呤核苷酸的收率和積累量升高。第72位的甘氨酸和第151位的異亮氨酸分別被天冬氨酸和蘇氨酸置換的突變型酸性磷酸酶基因的攜帶菌株大腸桿菌JM109/pMPI530的5’-次黃嘌呤核苷酸的積累量最高。
實(shí)施例13使用攜帶有磷酸酯水解活性低下型酸性磷酸酶基因的菌株生產(chǎn)各種核苷-5’-磷酸酯將導(dǎo)入了含有突變型酸性磷酸酶基因的質(zhì)粒的大腸桿菌JM109/pMPI530接種于50ml含有氨芐青霉素100μg/ml和IPTG 1mM的L培養(yǎng)基中，在37℃培養(yǎng)16小時。
將焦磷酸鈉12g/dl及用作磷酸受體的次黃嘌呤核苷、鳥嘌呤核苷、尿嘧啶核苷或胞嘧啶核苷6g/dl溶解在100mM的乙酸鈉緩沖液(pH4.5)中，在其中按干燥菌體重量100mg/dl加入上述菌體。將pH維持在4.0，30℃反應(yīng)22小時，生成的核苷-5’-磷酸酯的量列于表9。生成的核苷酸僅為核苷-5’-磷酸酯，完全沒有發(fā)現(xiàn)核苷-2’-磷酸酯和核苷-3’-磷酸酯。
表9

實(shí)施例14使用攜帶磷酸酯水解活性低下型酸性磷酸酶基因的菌株以各種磷酸化合物為磷酸供體生產(chǎn)5’-次黃嘌呤核苷酸將導(dǎo)入了含有突變型酸性磷酸酶基因的質(zhì)粒的大腸桿菌JM109/pMPI530接種于50ml含有氨芐青霉素100μg/ml和IPTG 1mM的L培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)16小時。
將次黃嘌呤核苷6g/dl和作為磷酸供體的三聚磷酸鈉、聚磷酸鈉(商品名Polygon P，千代田化學(xué)(株)出品)、磷酸苯酯二鈉或氨甲酰磷酸二鈉10g/dl溶解在乙酸鈉緩沖液(pH4.5)中，在其中按干燥菌體重量100mg/dl加入上述菌體。將pH維持在4.0，在30℃反應(yīng)22小時。生成的核苷-5’-磷酸酯的量列于表10。不管使用哪種磷酸供體都能有效地生成和積累5’-次黃嘌呤核苷酸，在以聚磷酸作磷酸供體時，5’-次黃嘌呤核苷酸的積累量最高。
表10

實(shí)施例15從蟑螂埃希氏菌的染色體中分離編碼酸性磷酸酶的基因(1)N末端氨基酸序列的測定從蟑螂埃希氏菌JCM 1650的無細(xì)胞抽提液中純化的酸性磷酸酶，用DITC膜(Milligen/Biosearch公司生產(chǎn))吸附，使用Prosequencer6625(Milligen/Biosearch公司生產(chǎn))確定N末端的氨基酸序列。序列表序列編號8中所示的15個殘基的N末端氨基酸序列得到了測定。
(2)編碼酸性磷酸酶的基因片斷的分離按照Murray和Thomson的方法(《核酸研究》(Nucl.Acid Res.)，4321卷，8頁(1980))從蟑螂埃希氏菌JCM 1650的培養(yǎng)菌體中制備染色體DNA。用限制酶Sau3AI部分消化此染色體DNA，然后用蔗糖密度梯度離心法分離3～6kbp的DNA片斷。將質(zhì)粒載體pUC118(寶酒造社生產(chǎn))用限制酶BamHI切斷，與部分消化的染色體DNA片斷連接。DNA連接使用DNA連接試劑盒(寶酒造社生產(chǎn))，并按其指定的方法進(jìn)行。接著，將得到的DNA混合物按常規(guī)方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109(寶酒造社生產(chǎn))。將轉(zhuǎn)化子涂布在含有100μg/ml氨芐青霉素的L瓊脂培養(yǎng)基上繁殖，制備成基因文庫。
在轉(zhuǎn)化子繁殖的瓊脂培養(yǎng)基表面倒入含有4mM對硝基苯磷酸和100mM MES/NaOH緩沖液(pH6.5)的反應(yīng)液，在30℃保溫15分鐘。表達(dá)磷酸酶活性的細(xì)菌能釋放出對硝基苯并顯黃色，以此為指標(biāo)選擇轉(zhuǎn)化子。對含有約8,000株轉(zhuǎn)化子的染色體基因表達(dá)文庫進(jìn)行篩選，結(jié)果獲得了14株表達(dá)磷酸酶活性的轉(zhuǎn)化子。
對表達(dá)磷酸酶活性的14株轉(zhuǎn)化子進(jìn)行單菌落分離，并接種于2.5ml含有100μg/ml氨芐青霉素的L培養(yǎng)基中，在37℃培養(yǎng)16小時。從培養(yǎng)液中收集菌體，并向其中加入50μl含有次黃嘌呤核苷2g/dl和焦磷酸鈉10g/dl的100mM乙酸鈉緩沖液(pH5.0)，在30℃反應(yīng)16小時。用HPLC分析法檢測5’-次黃嘌呤核苷酸的生成，選擇帶有磷酸轉(zhuǎn)移活性的菌株。結(jié)果獲得了3株能顯示磷酸轉(zhuǎn)移活性、預(yù)計攜帶有目的酸性磷酸酶基因片斷的轉(zhuǎn)化子。
實(shí)施例16來源于蟑螂埃希氏菌JCM 1650的酸性磷酸酶基因的堿基序列的測定從實(shí)施例15中獲得的預(yù)計攜帶有含來源于蟑螂埃希氏菌JCM1650的酸性磷酸酶基因的DNA片斷的一株轉(zhuǎn)化子中，用堿溶菌法制備質(zhì)粒，對插入的DNA片斷進(jìn)行分析。將此質(zhì)粒命名為pEPI301。所測得的插入DNA片斷的限制酶圖譜如圖6所示。
進(jìn)一步用亞克隆的方法限定酸性磷酸酶基因的區(qū)域，結(jié)果提示，本酸性磷酸酶基因包含在用限制酶ClaI和BamHI切割產(chǎn)生的2.4kbp大小的片斷中。因此，為測定堿基序列，將此片斷結(jié)合到用ClaI和BamHI切割的pBluescript KS(+)(Stratagene公司生產(chǎn))中構(gòu)建質(zhì)粒。將此質(zhì)粒DNA命名為pEPI305，用常規(guī)方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109(寶酒造生產(chǎn))，然后涂布于含有100μg/ml的氨芐青霉素的L瓊脂培養(yǎng)基中獲得轉(zhuǎn)化子。
用堿溶菌法從攜帶pEPI305的大腸桿菌JM109(寶酒造生產(chǎn))轉(zhuǎn)化子中制備質(zhì)粒，進(jìn)行堿基序列的測定。所測定的開放閱讀框的堿基序列參見序列表序列編號9。由此堿基序列推導(dǎo)的蛋白質(zhì)的氨基酸序列參見序列表序列編號10。在此氨基酸序列中存在與純化的酶的N末端氨基酸序列完全一致的序列。純化的酶的N末端從序列編號10的序列的第19位的亮氨酸殘基開始，因此序列編號10中所示的氨基酸序列是前體蛋白質(zhì)的序列，可以認(rèn)為由第1位的甲硫氨酸殘基至第18位的丙氨酸殘基組成的肽在翻譯后被除去。由此推導(dǎo)出的成熟蛋白質(zhì)的氨基酸序列參見序列編號11。由此計算出預(yù)計的成熟蛋白質(zhì)的分子量為25.1千道爾頓，這和純化的酶的SDS-PAGE的結(jié)果一致。由上述結(jié)果以及攜帶含有本片斷的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子能顯示磷酸轉(zhuǎn)移活性，可以確定本開放閱讀框是編碼目的酸性磷酸酶的區(qū)域。
即，編碼由序列表序列編號11中所表示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的基因是蟑螂埃希氏菌JCM 1650的酸性磷酸酶基因。
分別用堿基序列和氨基酸序列與下列已知序列進(jìn)行同源性比較，使用的數(shù)據(jù)庫是EMBL和SWISS-PORT。結(jié)果證明序列表序列編號8所示的蛋白質(zhì)和編碼它的DNA均為新型。該基因編碼的前體蛋白質(zhì)由249個氨基酸組成，由此序列預(yù)計的蛋白質(zhì)的分子量為27.0千道爾頓。
將該蛋白質(zhì)的氨基酸序列分別與下列已知序列進(jìn)行同源性比較。結(jié)果為，該蛋白質(zhì)顯示與蘇氏普羅威登氏菌(Providencia stuartii)的酸性磷酸酶有77.4％的同源性，與實(shí)施例8的摩氏摩根氏菌(Morganellamorganii)的酸性磷酸酶有77.1％的同源性，與鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)的酸性磷酸酶有44.3％的同源性。
并且，攜帶pEPI305的大腸桿菌JM109菌株被命名為AJ 13144，并于平成8年2月23日(1996年2月23日)交與工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(郵政編碼305，日本茨城縣筑波市東一丁目1番3號)依據(jù)布達(dá)佩斯條約進(jìn)行了國際保藏，給予的保藏編號是FERM BP-5423。
實(shí)施例17通過表達(dá)來源于蟑螂埃希氏菌JCM 1650的酸性磷酸酶基因來增加其活性將實(shí)施例16中制成的大腸桿菌JM109/pEPI305接種于50ml含有氨芐青霉素100ug/ml和IPTG 1mM的L培養(yǎng)基中，在37℃培養(yǎng)16小時。離心培養(yǎng)液收集菌體，用生理鹽水洗滌一次。用5ml的100mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)懸浮菌體，在4℃進(jìn)行超聲波處理20分鐘破碎菌體。離心處理液除去不溶性組分，制備無細(xì)胞抽提液。
測定所獲得的無細(xì)胞抽提液的磷酸轉(zhuǎn)移活性，用pBluescript KS(+)按同樣方法轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM109及蟑螂埃希氏菌野生株制備無細(xì)胞抽提液的活性作為對照，結(jié)果如表11所示。在大腸桿菌JM109/pBluescript KS(+)中沒有檢測到磷酸轉(zhuǎn)移活性，在蟑螂埃希氏菌野生株中磷酸轉(zhuǎn)移活性也很低。另一方面，大腸桿菌JM109/pEPI305顯示的磷酸轉(zhuǎn)移比活性比蟑螂埃希氏菌野生株高120倍，這一結(jié)果顯示，導(dǎo)入的DNA片斷在大腸桿菌中能夠高水平地表達(dá)酸性磷酸酶。
表11

實(shí)施例18使用攜帶有來源于蟑螂埃希氏菌JCM 1650的酸性磷酸酶基因的菌株由次黃嘌呤核苷生產(chǎn)5’-次黃嘌呤核苷酸將焦磷酸鈉12g/dl和次黃嘌呤核苷6g/dl溶解在100mM的乙酸鈉緩沖液(pH4.0)中，在其中按干燥菌體重量200mg/dl加入上述大腸桿菌JM109/pEPI305的菌體。將pH維持在4.0，在35℃反應(yīng)10小時，測定隨時間延續(xù)生成的5’-次黃嘌呤核苷酸的量。生成的次黃嘌呤核苷酸僅為5’-次黃嘌呤核苷酸，完全沒有發(fā)現(xiàn)2’-次黃嘌呤核苷酸和3’-次黃嘌呤核苷酸的生成。結(jié)果如圖7所示。使用此菌株由焦磷酸和次黃嘌呤核苷生產(chǎn)5’-次黃嘌呤核苷酸的反應(yīng)非常有效，能在短時間內(nèi)生產(chǎn)和積累5’-次黃嘌呤核苷酸。
實(shí)施例19磷酸酯水解活性低下型酸性磷酸酶基因的制備正如實(shí)施例17和18中所示，攜帶來源于蟑螂埃希氏菌JCM 1650酸性磷酸酶基因的菌株能夠表達(dá)顯著量的酸性磷酸酶，使用這種菌株由焦磷酸和次黃嘌呤核苷生產(chǎn)5’-次黃嘌呤核苷酸的反應(yīng)非常有效，能在短時間內(nèi)生產(chǎn)和積累5’-次黃嘌呤核苷酸。但是，也證明生成的5’-次黃嘌呤核苷酸由于酸性磷酸酶自身有磷酸酯水解活性而受到降解，5’-次黃嘌呤核苷酸的積累量不會超過某種程度。因此，在實(shí)施例15中克隆的來源于蟑螂埃希氏菌的酸性磷酸酶基因中用PCR方法按照位點(diǎn)特異的突變方法導(dǎo)入突變，進(jìn)行酶的改造。
使用DNA合成儀(Applied Biosystem公司生產(chǎn)，394型)按照磷亞酰胺法分別合成序列表序列編號12、13和14中所示的寡核苷酸MUT300、MUT310和MUT320。
使用實(shí)施例16中制備的質(zhì)粒pEPI305 1ng作為模板、M13引物-RV(寶酒造社生產(chǎn))和MUT310寡核苷酸各2.5umol作為引物、以及Taq DNA聚合酶(寶酒造社生產(chǎn))2.5單位，在100μl含有dATP、dCTP、dGTP、dTTP各200μM、氯化鉀50mM和氯化鎂1.5mM的100mM Tris-鹽酸緩沖液(pH8.3)中加入上述物質(zhì)，使用94℃，30秒、55℃，2分鐘、72℃，3分鐘的循環(huán)參數(shù)，進(jìn)行25個循環(huán)的PCR反應(yīng)。PCR使用PJ2000型熱循環(huán)儀(寶酒造社生產(chǎn))進(jìn)行。另外，使用質(zhì)粒pEPI3051ng作為模板、M13引物-M3(寶酒造社生產(chǎn))和MUT300寡核苷酸各2.5umol作為引物，按同樣的條件進(jìn)行PCR反應(yīng)。各反應(yīng)液用Microspin柱S-400(Pharmacia公司生產(chǎn))凝膠過濾進(jìn)行純化，以除去引物。
在95μl含有dATP、dCTP、dGTP、dTTP各200μM、氯化鉀50mM和氯化鎂1.5mM的100mM Tris-鹽酸緩沖液(pH8.3)中分別加入每種PCR反應(yīng)液1μl，在94℃加熱10分鐘，然后冷卻60分鐘至37℃，然后在37℃保溫15分鐘使異源雙鏈形成。加入Taq DNA聚合酶2.5單位在72℃反應(yīng)3分鐘，使異源雙鏈完成。接著，在此反應(yīng)液中加入M13引物-RV和M13引物-M3各2.5μmol，使用94℃，30秒、55℃，2分鐘、72℃，3分鐘的循環(huán)參數(shù)，進(jìn)行10個循環(huán)的PCR反應(yīng)。
第二輪PCR反應(yīng)的產(chǎn)物用ClaI和BamHI切割，然后用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀。將此DNA片斷連接到用ClaI和BamHI切割的pBluescript KS(+)中，所得到的質(zhì)粒DNA按常規(guī)方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109(寶酒造生產(chǎn))。并將其涂布在含有100μg/ml的氨芐青霉素的L瓊脂培養(yǎng)基上，獲取轉(zhuǎn)化子。
用堿溶菌法從轉(zhuǎn)化子中制備質(zhì)粒，進(jìn)行堿基序列的測定。證實(shí)目的堿基已被置換。由此制備了編碼成熟蛋白質(zhì)第74位的甘氨酸殘基(GGG)被天冬氨酸殘基(G*A*T)置換的突變型酸性磷酸酶的突變型基因。含有這種突變型基因的質(zhì)粒命名為pEPI310。
使用pEPI305作為模板、MUT300和MUT320寡核苷酸作為引物，按照同樣的操作，制備了編碼成熟蛋白質(zhì)第153位的異亮氨酸殘基(ATC)被蘇氨酸殘基(A*CC)置換的突變型酸性磷酸酶的突變型基因。含有這種突變型基因的質(zhì)粒命名為pEPI320。并且，使用pEPI310作為模板，MUT300和MUT320作為引物按照同樣的操作制備了編碼成熟蛋白質(zhì)的第74位的甘氨酸殘基(GGG)被天冬氨酸殘基(G*A*T)置換、第153位的異亮氨酸殘基(ATC)被蘇氨酸殘基(A*CC)置換的突變型酸性磷酸酶的基因。含有這種突變型基因的質(zhì)粒命名為pEPI330。
將導(dǎo)入了上述含有各酸性磷酸酶基因的質(zhì)粒的大腸桿菌JM109/pEPI310、大腸桿菌JM109/pEPI320、大腸桿菌JM109/pEPI330和導(dǎo)入了含有野生型酸性磷酸酶基因的質(zhì)粒的大腸桿菌JM109/pEPI305接種于50ml含有氨芐青霉素100μg/ml和IPTG 1mM的L培養(yǎng)基中，在37℃培養(yǎng)16小時。離心培養(yǎng)液收集菌體，用生理鹽水洗滌一次。菌體用5ml的100mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)懸浮，在4℃超聲波處理20分鐘破碎菌體。離心處理液除去不溶性組分，制備無細(xì)胞抽提液。在pH4.0的條件下測定所得到的無細(xì)胞抽提液的磷酸酯水解活性和磷酸轉(zhuǎn)移活性，并與野生型菌株的活性進(jìn)行比較。
野生型和突變型酸性磷酸酶的磷酸酯水解活性和磷酸轉(zhuǎn)移活性的測定結(jié)果如表12所示。突變型酸性磷酸酶與野生型酸性磷酸酶相比，磷酸酯水解活性和磷酸轉(zhuǎn)移活性都較低，且磷酸酯水解活性降低的程度大一些，結(jié)果，突變型酸性磷酸酶的磷酸酯水解活性/磷酸轉(zhuǎn)移活性的比值低于野生型酸性磷酸酶的比值。
表12

實(shí)施例20使用攜帶有磷酸酯水解活性低下型酸性磷酸酶基因的菌株由次黃嘌呤核苷生產(chǎn)5’-次黃嘌呤核苷酸將導(dǎo)入了含有突變型酸性磷酸酶基因的質(zhì)粒的大腸桿菌JM109/pEPI310、大腸桿菌JM109/pEPI320、大腸桿菌JM109/pEPI330和導(dǎo)入了含有野生型酸性磷酸酶基因的質(zhì)粒的大腸桿菌JM109/pEPI305接種于50ml含有氨芐青霉素100μg/ml和IPTG 1mM的L培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)16小時。
將焦磷酸鈉12g/dl和次黃嘌呤核苷6g/dl溶解在乙酸鈉緩沖液(pH4.0)中，在其中按干燥菌體重量200mg/dl加入上述培養(yǎng)獲得的大腸桿菌各菌株的菌體。將pH維持在4.0，在35℃反應(yīng)32小時，測定隨時間延續(xù)生成的5’-次黃嘌呤核苷酸的量。結(jié)果如圖8所示。
在圖8中，縱軸代表5’-次黃嘌呤核苷酸的濃度(mg/dl)，橫軸代表反應(yīng)時間(h)，而實(shí)心圓形代表大腸桿菌(Escherichiacoli)JM109/pEPI305，實(shí)心三角形代表大腸桿菌(Escherichiacoli)JM109/pEPI310，空心圓形代表大腸桿菌(Escherichiacoli)JM109/pEPI320，空心四角形代表大腸桿菌(Escherichiacoli)JM109/pEPI330，以此來顯示使用各菌時的反應(yīng)進(jìn)程。
在使用攜帶磷酸酯水解活性低下型酸性磷酸酶基因的菌株由次黃嘌呤核苷生產(chǎn)5’-次黃嘌呤核苷酸的反應(yīng)中，所生成的5’-次黃嘌呤核苷酸的分解速率降低，其結(jié)果是，5’-次黃嘌呤核苷酸的收率和積累量升高。第74位的甘氨酸和第153位的異亮氨酸分別被天冬氨酸和蘇氨酸置換的突變型酸性磷酸酶基因的攜帶菌株-大腸桿菌JM109/pEPI330的5’-次黃嘌呤核苷酸的積累量最高。
實(shí)施例21使用攜帶有磷酸酯水解活性低下型酸性磷酸酶基因的菌株生產(chǎn)各種核苷-5’-磷酸酯將導(dǎo)入了含有突變型酸性磷酸酶基因的質(zhì)粒的大腸桿菌JM109/pEPI330接種于50ml含有氨芐青霉素100ug/ml和IPTG 1mM的L培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)16小時。
將焦磷酸鈉12g/dl及用作磷酸受體的次黃嘌呤核苷、鳥嘌呤核苷、尿嘧啶核苷或胞嘧啶核苷6g/dl溶解在100mM的乙酸鈉緩沖液(pH4.5)中，在其中按干燥菌體重量200mg/dl加入上述菌體。將pH維持在4.0，在35℃反應(yīng)32小時。生成的核苷-5’-磷酸酯的量列于表13。生成的核苷酸僅為核苷-5’-磷酸酯，完全沒有發(fā)現(xiàn)核苷-2’-磷酸酯和核苷-3’-磷酸酯的生成。
表13

實(shí)施例22使用攜帶磷酸酯水解活性低下型酸性磷酸酶基因的菌株以各種磷酸化合物為磷酸供體生產(chǎn)5’-次黃嘌呤核苷酸將導(dǎo)入了含有突變型酸性磷酸酶基因的質(zhì)粒的大腸桿菌JM109/pEPI330接種于50ml含有氨芐青霉素100ug/ml和IPTG 1mM的L培養(yǎng)基中，在37℃培養(yǎng)16小時。
將次黃嘌呤核苷6g/dl和作為磷酸供體的三聚磷酸鈉、聚磷酸鈉(商品名Polygon P，千代田化學(xué)(株)出品)、磷酸苯酯二鈉或氨甲酰磷酸二鈉12g/dl溶解在100mM的乙酸鈉緩沖液(pH4.0)中，在其中按干燥菌體重量200mg/dl加入上述菌體。將pH維持在4.0，在35℃反應(yīng)32小時。生成的核苷-5’-磷酸酯的量如表14所示。不管使用哪種磷酸供體都能有效地生成和積累5’-次黃嘌呤核苷酸，在以聚磷酸作磷酸供體時，5’-次黃嘌呤核苷酸的積累量最高。
表14

實(shí)施例23從蘇氏普羅威登氏菌的染色體中分離編碼酸性磷酸酶的基因并測定其堿基序列以已知的蘇氏普羅威登氏菌的酸性磷酸酶基因的堿基序列(EMBL登記號X64820)為基礎(chǔ)，合成含有序列表序列編號15和16中所示的序列的、設(shè)計用于PCR擴(kuò)增該酸性磷酸酶基因的寡核苷酸引物PRP1和PRP2。
按照Murry和Thomson的方法(《核酸研究》(Nucl.Acid Res.)，4321卷，8頁(1980))從蘇氏普羅威登氏菌ATCC 29851的培養(yǎng)菌體中制備染色體DNA。使用這種染色體DNA 0.1ng作為模板、PRP1和PRP2寡核苷酸各2.5umol作為引物、以及Taq DNA聚合酶(寶酒造社生產(chǎn))2.5單位，在100μl含有dATP、dCTP、dGTP、dTTP各200μM、氯化鉀50mM和氯化鎂1.5mM的100mM Tris-鹽酸緩沖液(pH8.3)中加入上述物質(zhì)，使用94℃，30秒、55℃，2分鐘、72℃，3分鐘的循環(huán)參數(shù)，進(jìn)行30個循環(huán)的PCR反應(yīng)。對反應(yīng)液進(jìn)行瓊脂糖電泳，并用玻璃粉(寶酒造社生產(chǎn))回收約為1kbp的擴(kuò)增DNA片斷。用BamHI切割該DNA片斷，然后將其結(jié)合到用BamHI切割的pUC118中，此質(zhì)粒被命名為pPRP100。
測定導(dǎo)入了pPRP100的大腸桿菌JM109/pPRP100的磷酸酯水解活性和磷酸轉(zhuǎn)移活性。結(jié)果為，該菌不僅顯示磷酸酯水解活性，還顯示向核苷轉(zhuǎn)移磷酸的磷酸轉(zhuǎn)移活性。
用堿溶菌法從大腸桿菌JM109/pPRP100中制備質(zhì)粒，進(jìn)行堿基序列的測定。所測定的開放閱讀框的堿基序列和由此堿基序列推導(dǎo)出的蛋白質(zhì)的氨基酸序列參見序列表序列編號17和序列編號18。這個開放閱讀框的堿基序列和已知的蘇氏普羅威登氏菌的酸性磷酸酶基因的堿基序列完全一致。
實(shí)施例24從產(chǎn)氣腸桿菌、植生克雷伯氏菌、和無花果沙雷氏菌的染色體中分離編碼酸性磷酸酶的基因并測定其堿基序列按照Murry和Thompson的方法(《核酸研究》(Nucl.Acid Res.)，4321卷，8頁(1980))從產(chǎn)氣腸桿菌IFO 12010、植生克雷伯氏菌IFO14939和無花果沙雷氏菌IAM 13540的培養(yǎng)菌體中制備各菌的染色體DNA。接著，使用與實(shí)施例7(2)同樣的方法，分別制成含有約20,000株大腸桿菌JM109轉(zhuǎn)化子的染色體基因表達(dá)文庫。篩選表達(dá)文庫的結(jié)果，可獲得顯示磷酸轉(zhuǎn)移活性的轉(zhuǎn)化子?？梢哉J(rèn)為這些轉(zhuǎn)化子攜帶有來源于各自菌株的酸性磷酸酶基因。
從一株被認(rèn)為攜帶有來源于產(chǎn)氣腸桿菌IFO 12010的酸性磷酸酶基因的大腸桿菌JM109轉(zhuǎn)化子中用堿溶菌法制備質(zhì)粒，對插入的DNA片斷進(jìn)行分析。將此質(zhì)粒命名為pENP100。所確定的來源于產(chǎn)氣腸桿菌IFO 12010的插入DNA片斷的限制酶圖譜如圖9所示。
用亞克隆的方法限定酸性磷酸酶基因的區(qū)域，結(jié)果提示，該酸性磷酸酶包含在用限制酶SalI和限制酶KpnI切割產(chǎn)生的1.6kbp的片斷中。因此，為測定堿基序列，將此SalI-KpnI片斷結(jié)合到用SalI和KpnI切割的pUC118中構(gòu)建質(zhì)粒DNA。將此質(zhì)粒命名為pENP110。
用同樣的方法，從一株被認(rèn)為攜帶有來源于植生克雷伯氏菌IFO14939的酸性磷酸酶基因片斷的大腸桿菌JM109轉(zhuǎn)化子中用堿溶菌法制備質(zhì)粒，對插入的DNA片斷進(jìn)行分析。將此質(zhì)粒命名為pKLP100。所確定的來源于植生克雷伯氏菌IFO 14939的插入DNA片斷的限制酶圖譜如圖10所示。
用亞克隆的方法限定酸性磷酸酶基因的區(qū)域，結(jié)果提示，本酸性磷酸酶基因包含在用限制酶KpnI和限制酶EcoRI切割產(chǎn)生的2.2kbp的片斷中。因此，為測定堿基序列，將此KpnI-EcoRI片斷結(jié)合到用KpnI和EcoRI切割的pUC118中構(gòu)建質(zhì)粒DNA。將此質(zhì)粒命名為pKLP110。
同樣，從一株被認(rèn)為攜帶有來源于無花果沙雷氏菌IAM 13540的酸性磷酸酶基因片斷的大腸桿菌JM109轉(zhuǎn)化子中用堿溶菌法制備質(zhì)粒，對插入的DNA片斷進(jìn)行分析。將此質(zhì)粒命名為pSEP100。所確定的來源于無花果沙雷氏菌IAM 13540的插入DNA片斷的限制酶圖譜如圖11所示。
用亞克隆的方法限定酸性磷酸酶基因的區(qū)域，結(jié)果提示，本酸性磷酸酶基因包含在用限制酶HindIII切割產(chǎn)生的1.4kbp的片斷中。因此，為測定堿基序列，將此HindIII片斷結(jié)合到用HindIII切割的pUC118中構(gòu)建質(zhì)粒DNA。將此質(zhì)粒命名為pSEP110。
從分別導(dǎo)入了pENP110、pKLP110和pSEP110的大腸桿菌JM109/pENP110、大腸桿菌JM109/pKLP110和大腸桿菌JM109/pSEP110轉(zhuǎn)化子中，用堿溶菌法分別制備質(zhì)粒，按照實(shí)施例8的方法，測定插入片斷的堿基序列。所確定的來源于產(chǎn)氣腸桿菌IFO12010、植生克雷伯氏菌IFO 14939和無花果沙雷氏菌IAM 13540的插入片斷的開放閱讀框的堿基序列分別參見序列表序列編號19、21、23，由它們推導(dǎo)出的氨基酸序列分別參見序列表序列編號20、22、24。由于攜帶含有各DNA片斷的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子顯示磷酸轉(zhuǎn)移活性，因此可以確定這些開放閱讀框?yàn)槟康乃嵝粤姿崦富颉?br> 將堿基序列、氨基酸序列分別與下列已知序列進(jìn)行同源性比較。使用的數(shù)據(jù)庫是EMBL和SWISS-PORT。結(jié)果表明序列表序列編號19、21和23所示的基因都是新基因。而且，分別可以推導(dǎo)出，來源于產(chǎn)氣腸桿菌IFO 12010的基因編碼的蛋白質(zhì)由248個氨基酸組成，來源于植生克雷伯氏菌IFO 14939的基因編碼的蛋白質(zhì)由248個氨基酸組成，來源于無花果沙雷氏菌IAM 13540的基因編碼的蛋白質(zhì)由244個氨基酸組成。這些蛋白質(zhì)與摩氏摩根氏菌和蟑螂埃希氏菌的酸性磷酸酶的情況相同，可能是前體蛋白質(zhì)。
另外，由這些堿基序列預(yù)計的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，與實(shí)施例8中推導(dǎo)出的摩氏摩根氏菌NCIMB 10466、實(shí)施例16中推導(dǎo)出的蟑螂埃希氏菌JCM 1650以及已知的蘇氏普羅威登氏菌(EMBL登記號X64820)的酸性磷酸酶的前體蛋白質(zhì)的氨基酸序列一起，用氨基酸的單字母表示法列于圖12。在圖中序列下加*號者表示在所有氨基酸序列中共同的氨基酸殘基。
如圖12所示，來源于6種菌株的酸性磷酸酶的氨基酸序列的同源性非常高，在所有氨基酸序列中有130個氨基酸殘基是共同的。由此，預(yù)計這些酸性磷酸酶具有非常類似的功能。
實(shí)施例25通過表達(dá)來源于蘇氏普羅威登氏菌、產(chǎn)氣腸桿菌、植生克雷伯氏菌、和無花果沙雷氏菌的酸性磷酸酶基因來增加其活性將實(shí)施例23中構(gòu)建的大腸桿菌JM109/pPRP100、實(shí)施例24中構(gòu)建的大腸桿菌JM109/pENP110、大腸桿菌JM109/pKLP110和大腸桿菌JM109/pSEP110分別接種于50ml含有氨芐青霉素100μg/ml和IPTG 1mM的L培養(yǎng)基中，在37℃培養(yǎng)16小時。從離心培養(yǎng)液收集菌體，用生理鹽水洗滌一次。用5ml的100mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)懸浮菌體，在4℃進(jìn)行超聲波處理20分鐘破碎菌體。離心處理液除去不溶性組分，制備無細(xì)胞抽提液。
測定所獲得的無細(xì)胞抽提液的磷酸轉(zhuǎn)移活性，用蘇氏普羅威登氏菌ATCC 29851、產(chǎn)氣腸桿菌IFO 12010、植生克雷伯氏菌IFO 14939、無花果沙雷氏菌IAM 13540以及用pUC118按同樣方法轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM109制備無細(xì)胞抽提液，以它們的活性作為對照，結(jié)果列于表15。所有野生株的磷酸轉(zhuǎn)移活性都很低。而在大腸桿菌JM109/pUC118中沒有檢測到磷酸轉(zhuǎn)移活性。另一方面，導(dǎo)入了酸性磷酸酶基因的大腸桿菌JM109轉(zhuǎn)化子顯示的磷酸轉(zhuǎn)移活性全都比野生株高，這一結(jié)果顯示，導(dǎo)入的DNA片斷在大腸桿菌中能夠高水平地表達(dá)酸性磷酸酶。
表15

產(chǎn)業(yè)上的應(yīng)用范圍根據(jù)本發(fā)明，使酸性磷酸酶在pH3.0～5.5的條件下作用于核苷和選自聚磷酸(鹽)、磷酸苯酯(鹽)和氨甲酰磷酸(鹽)的磷酸供體，能夠廉價而有效地制造核苷-5’-磷酸酯。特別是使用本發(fā)明所提供的含有使磷酸酯水解活性降低的突變的酸性磷酸酶，能夠更有效地制造核苷-5’-磷酸酯。
序列表(1)一般信息(i)申請人味之素株式會社(ii)發(fā)明名稱核苷-5’-磷酸酯的制造方法(iii)序列數(shù)24(iv)通訊地址(A)聯(lián)系人(B)街道(C)城市(D)州(E)國家(F)郵政編碼(v)計算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型(B)計算機(jī)(C)操作系統(tǒng)(D)軟件(vi)現(xiàn)申請數(shù)據(jù)(A)申請編號(B)申請日(C)分類(vii)代理人/事務(wù)所信息(A)姓名(B)登錄編號(C)整理編號(ix)通訊信息(A)電話號碼(B)傳真號碼(2)序列編號1的序列信息(i)序列性質(zhì)(A)序列長度20個氨基酸(B)序列類型氨基酸
(D)拓?fù)錁?gòu)型線型(ii)序列種類蛋白質(zhì)(v)片斷類型N末端片斷(vi)來源(A)生物名摩氏摩根氏(Morganella morganii)(B)菌株名NCIMB 10466(xi)序列表述SEQ ID NO1Ala Ile Pro Ala Gly Asn Asp Ala Thr Thr Lys Pro Asp Leu Tyr Tyr1 5 10 15Leu Lys Asn Glu20(2)序列編號2的序列信息(i)序列性質(zhì)(A)序列長度750個堿基(B)序列類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線型(ii)序列種類基因組DNA(vi)來源(A)生物名摩氏摩根氏菌(Morganella morganii)(B)菌株名NCIMB 10466(ix)序列特征(A)特征表示符號CDS(B)存在位置1..747(ix)序列特征(A)特征表示符號sig_peptide(B)存在位置1..60(ix)序列特征(A)特征表示符號mat_peptide(B)存在位置61..747(xi)序列表述SEQ ID NO2ATG AAG AAG AAT ATT ATC GCC GGT TGT CTG TTC TCA CTG TTT TCC CTT 48Met Lys Lys Asn Ile Ile Ala Gly Cys Leu Phe Ser Leu Phe Ser Leu-20 -15 -10 -5TCC GCG CTG GCC GCG ATC CCG GCG GGC AAC GAT GCC ACC ACC AAG CCG 96Ser Ala Leu Ala Ala Ile Pro Ala Gly Asn Asp Ala Thr Thr Lys Pro1 5 10GAT TTA TAT TAT CTG AAA AAT GAA CAG GCT ATC GAC AGC CTG AAA CTG 144Asp Leu Tyr Tyr Leu Lys Asn Glu Gln Ala Ile Asp Ser Leu Lys Leu15 20 25TTA CCG CCA CCG CCG GAA GTC GGC AGT ATT CAG TTT TTA AAT GAT CAG 192Leu Pro Pro Pro Pro Glu Val Gly Ser Ile Gln Phe Leu Asn Asp Gln30 35 40GCA ATG TAT GAG AAA GGC CGT ATG CTG CGC AAT ACC GAG CGC GGA AAA 240Ala Met Tyr Glu Lys Gly Arg Met Leu Arg Asn Thr Glu Arg Gly Lys45 50 55 60CAG GCA CAG GCA GAT GCT GAC CTG GCC GCA GGG GGT GTG GCA ACC GCA 288Gln Ala Gln Ala Asp Ala Asp Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Ala65 70 75TTT TCA GGG GCA TTC GGC TAT CCG ATA ACC GAA AAA GAC TCT CCG GAG 336Phe Ser Gly Ala Phe Gly Tyr Pro Ile Thr Glu Lys Asp Ser Pro Glu80 85 90CTG TAT AAA CTG CTG ACC AAT ATG ATT GAG GAT GCC GGT GAT CTT GCC 384Leu Tyr Lys Leu Leu Thr Asn Met Ile Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala95 100 105ACC CGC TCC GCC AAA GAA CAT TAC ATG CGC ATC CGG CCG TTT GCG TTT 432Thr Arg Ser Ala Lys Glu His Tyr Met Arg Ile Arg Pro Phe Ala Phe110 115 120TAC GGC ACA GAA ACC TGT AAT ACC AAA GAT CAG AAA AAA CTC TCC ACC 480Tyr Gly Thr Glu Thr Cys Asn Thr Lys Asp Gln Lys Lys Leu Ser Thr125 130 135 140AAC GGA TCT TAC CCG TCA GGT CAT ACG TCT ATC GGC TGG GCA ACC GCA 528Asn Gly Ser Tyr Pro Ser Gly His Thr Ser Ile Gly Trp Ala Thr Ala145 150 155CTG GTG CTG GCG GAA GTG AAC CCG GCA AAT CAG GAT GCG ATT CTG GAA 576Leu Val Leu Ala Glu Val Asn Pro Ala Asn Gln Asp Ala Ile Leu Glu160 165 170CGG GGT TAT CAG CTC GGA CAG AGC CGG GTG ATT TGC GGC TAT CAC TGG 624Arg Gly Tyr Gln Leu Gly Gln Ser Arg Val Ile Cys Gly Tyr His Trp175 180 185CAG AGT GAT GTG GAT GCC GCG CGG ATT GTC GGT TCA GCC GCT GTC GCG 672Gln Ser Asp Val Asp Ala Ala Arg Ile Val Gly Ser Ala Ala Val Ala190 195 200ACA TTA CAT TCC GAT CCG GCA TTT CAG GCG CAG TTA GCG AAA GCC AAA 720Thr Leu His Ser Asp Pro Ala Phe Gln Ala Gln Leu Ala Lys Ala Lys205 210 215 220CAG GAA TTT GCA CAA AAA TCA CAG AAA TAA 750Gln Glu Phe Ala Gln Lys Ser Gln Lys225 229(2)序列編號3的序列信息(i)序列性質(zhì)(A)序列長度249個氨基酸
(B)序列類型氨基酸(D)拓?fù)錁?gòu)型線型(ii)序列種類蛋白質(zhì)(vi)來源(A)生物名摩氏摩根氏菌(Morganella morganii)(B)菌株名NCIMB 10466(xi)序列表述SEQ ID NO3Met Lys Lys Asn Ile Ile Ala Gly Cys Leu Phe Ser Leu Phe Ser Leu-20 -15 -10 -5Ser Ala Leu Ala Ala Ile Pro Ala Gly Asn Asp Ala Thr Thr Lys Pro1 5 10Asp Leu Tyr Tyr Leu Lys Asn Glu Gln Ala Ile Asp Ser Leu Lys Leu15 20 25Leu Pro Pro Pro Pro Glu Val Gly Ser Ile Gln Phe Leu Asn Asp Gln30 35 40Ala Met Tyr Glu Lys Gly Arg Met Leu Arg Asn Thr Glu Arg Gly Lys45 50 55 60Gln Ala Gln Ala Asp Ala Asp Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Ala65 70 75Phe Ser Gly Ala Phe Gly Tyr Pro Ile Thr Glu Lys Asp Ser Pro Glu80 85 90Leu Tyr Lys Leu Leu Thr Asn Met Ile Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala95 100 105Thr Arg Ser Ala Lys Glu His Tyr Met Arg Ile Arg Pro Phe Ala Phe110 115 120Tyr Gly Thr Glu Thr Cys Asn Thr Lys Asp Gln Lys Lys Leu Ser Thr125 130 135 140Asn Gly Ser Tyr Pro Ser Gly His Thr Ser Ile Gly Trp Ala Thr Ala145 150 155Leu Val Leu Ala Glu Val Asn Pro Ala Asn Gln Asp Ala Ile Leu Glu160 165 170Arg Gly Tyr Gln Leu Gly Gln Ser Arg Val Ile Cys Gly Tyr His Trp175 180 185Gln Ser Asp Val Asp Ala Ala Arg Ile Val Gly Ser Ala Ala Val Ala190 195 200Thr Leu His Ser Asp Pro Ala Phe Gln Ala Gln Leu Ala Lys Ala Lys205 210 215 220Gln Glu Phe Ala Gln Lys Ser Gln Lys225 229(2)序列編號4的序列信息(i)序列性質(zhì)(A)序列長度229個氨基酸(B)序列類型氨基酸(D)拓?fù)錁?gòu)型線型(ii)序列種類蛋白質(zhì)(vi)來源(A)生物名摩氏摩根氏菌(Morganella morganii)(B)菌株名NCIMB 10466(xi)序列表述SEQ ID NO4Ala Ile Pro Ala Gly Asn Asp Ala Thr Thr Lys Pro Asp Leu Tyr Tyr1 5 10 15Leu Lys Asn Glu Gln Ala Ile Asp Ser Leu Lys Leu Leu Pro Pro Pro20 25 30Pro Glu Val Gly Ser Ile Gln Phe Leu Asn Asp Gln Ala Met Tyr Glu35 40 45Lys Gly Arg Met Leu Arg Asn Thr Glu Arg Gly Lys Gln Ala Gln Ala50 55 60Asp Ala Asp Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Ala Phe Ser Gly Ala65 70 75 80Phe Gly Tyr Pro Ile Thr Glu Lys Asp Ser Pro Glu Leu Tyr Lys Leu85 90 95Leu Thr Asn Met Ile Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala Thr Arg Ser Ala100 105 110Lys Glu His Tyr Met Arg Ile Arg Pro Phe Ala Phe Tyr Gly Thr Glu115 120 125Thr Cys Asn Thr Lys Asp Gln Lys Lys Leu Ser Thr Asn Gly Ser Tyr130 135 140Pro Ser Gly His Thr Ser Ile Gly Trp Ala Thr Ala Leu Val Leu Ala145 150 155 160Glu Val Asn Pro Ala Asn Gln Asp Ala Ile Leu Glu Arg Gly Tyr Gln165 170 175Leu Gly Gln Ser Arg Val Ile Cys Gly Tyr His Trp Gln Ser Asp Val180 185 190Asp Ala Ala Arg Ile Val Gly Ser Ala Ala Val Ala Thr Leu His Ser195 200 205Asp Pro Ala Phe Gln Ala Gln Leu Ala Lys Ala Lys Gln Glu Phe Ala210 215 220Gln Lys Ser Gln Lys225 229(2)序列編號5的序列信息(i)序列性質(zhì)(A)序列長度20個堿基(B)序列類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線型(ii)序列種類其它核酸合成DNA(iv)反義鏈(xi)序列表述SEQ ID NO5ATTACCATGA TTACGAATTC 20(2)序列編號6的序列信息(i)序列性質(zhì)(A)序列長度21個堿基(B)序列類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線型(ii)序列種類其它核酸合成DNA(iv)反義鏈(xi)序列表述SEQ ID NO6GCGGTTGCCA CATCCCCTGC G 21(2)序列編號7的序列信息(i)序列性質(zhì)(A)序列長度21個堿基(B)序列類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線型(ii)序列種類其它核酸合成DNA(iv)反義鏈(xi)序列表述SEQ ID NO7TTGCCCAGCC GGTAGACGTA T 21(2)序列編號8的序列信息(i)序列性質(zhì)(A)序列長度15個氨基酸(B)序列類型氨基酸(D)拓?fù)錁?gòu)型線型(ii)序列種類蛋白質(zhì)(v)片斷類型N末端片斷(vi)來源(A)生物名蟑螂埃希氏菌(Escherichia blattae)(B)菌株名JCM 1650(xi)序列表述SEQ ID NO8Leu Ala Leu Val Ala Thr Gly Asn Asp Thr Thr Thr Lys Pro Asp Leu1 5 10 15(2)序列編號9的序列信息(i)序列性質(zhì)(A)序列長度750個堿基(B)序列類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線型(ii)序列種類基因組DNA(vi)來源(A)生物名蟑螂埃希氏菌(Escherichia blattae)(B)菌株名JCM 1650(ix)序列特征(A)特征表示符號CDS(B)存在位置1..747(ix)序列特征(A)特征表示符號sig_peptide(B)存在位置1..54(ix)序列特征(A)特征表示符號mat_peptide(B)存在位置55..747(xi)序列表述SEQ ID NO9ATG AAA AAA CGT GTT CTG GCA GTT TGT TTT GCC GCA TTG TTC TCT TCT 48Met Lys Lys Arg Val Leu Ala Val Cys Phe Ala Ala Leu Phe Ser Ser-18 -15 -10 -5CAG GCC CTG GCG CTG GTC GCT ACC GGC AAC GAC ACT ACC ACG AAA CCG 96Gln Ala Leu Ala Leu Val Ala Thr Gly Asn Asp Thr Thr Thr Lys Pro1 5 10GAT CTC TAC TAC CTC AAG AAC AGT GAA GCC ATT AAC AGC CTG GCG CTG 144Asp Leu Tyr Tyr Leu Lys Asn Ser Glu Ala Ile Asn Ser Leu Ala Leu15 20 25 30TTG CCG CCA CCA CCG GCG GTG GGC TCC ATT GCG TTT CTC AAC GAT CAG 192Leu Pro Pro Pro Pro Ala Val Gly Ser Ile Ala Phe Leu Asn Asp Gln35 40 45GCC ATG TAT GAA CAG GGG CGC CTG CTG CGC AAC ACC GAA CGC GGT AAG 240Ala Met Tyr Glu Gln Gly Arg Leu Leu Arg Asn Thr Glu Arg Gly Lys50 55 60CTG GCG GCG GAA GAT GCA AAC CTG AGC AGT GGC GGG GTG GCG AAT GCT 288Leu Ala Ala Glu Asp Ala Asn Leu Ser Ser Gly Gly Val Ala Asn Ala65 70 75TTC TCC GGC GCG TTT GGT AGC CCG ATC ACC GAA AAA GAC GCC CCG GCG 336Phe Ser Gly Ala Phe Gly Ser Pro Ile Thr Glu Lys Asp Ala Pro Ala80 85 90CTG CAT AAA TTA CTG ACC AAT ATG ATT GAG GAC GCC GGG GAT CTG GCG 384Leu His Lys Leu Leu Thr Asn Met Ile Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala95 100 105 110ACC CGC AGC GCG AAA GAT CAC TAT ATG CGC ATT CGT CCG TTC GCG TTT 432Thr Arg Ser Ala Lys Asp His Tyr Met Arg Ile Arg Pro Phe Ala Phe115 120 125TAT GGG GTC TCT ACC TGT AAT ACC ACC GAG CAG GAC AAA CTG TCC AAA 480Tyr Gly Val Ser Thr Cys Asn Thr Thr Glu Gln Asp Lys Leu Ser Lys130 135 140AAT GGC TCT TAT CCG TCC GGG CAT ACC TCT ATC GGC TGG GCT ACT GCG 528Asn Gly Ser Tyr Pro Ser Gly His Thr Ser Ile Gly Trp Ala Thr Ala145 150 155CTG GTG CTG GCA GAG ATC AAC CCT CAG CGC CAG AAC GAG ATC CTG AAA 576Leu Val Leu Ala Glu Ile Asn Pro Gln Arg Gln Asn Glu Ile Leu Lys160 165 170CGC GGT TAT GAG CTG GGC CAG AGC CGG GTG ATT TGC GGC TAC CAC TGG 624Arg Gly Tyr Glu Leu Gly Gln Ser Arg Val Ile Cys Gly Tyr His Trp175 180 185 190CAG AGT GAT GTG GAT GCC GCG CGG GTA GTG GGA TCT GCC GTT GTG GCG 672Gln Ser Asp Val Asp Ala Ala Arg Val Val Gly Ser Ala Val Val Ala195 200 205ACC CTG CAT ACC AAC CCG GCG TTC CAG CAG CAG TTG CAG AAA GCG AAG 720Thr Leu His Thr Asn Pro Ala Phe Gln Gln Gln Leu Gln Lys Ala Lys210 215 220GCC GAA TTC GCC CAG CAT CAG AAG AAA TAA 750Ala Glu Phe Ala Gln His Gln Lys Lys225 230(2)序列編號10的序列信息(i)序列性質(zhì)(A)序列長度249個氨基酸(B)序列類型氨基酸(D)拓?fù)錁?gòu)型線型(ii)序列種類蛋白質(zhì)(vi)來源(A)生物名蟑螂埃希氏菌(Escherichia blattae)(B)菌株名JCM 1650(xi)序列表述SEQ ID NO10Met Lys Lys Arg Val Leu Ala Val Cys Phe Ala Ala Leu Phe Ser Ser-18 -15 -10 -5Gln Ala Leu Ala Leu Val Ala Thr Gly Asn Asp Thr Thr Thr Lys Pro1 5 10Asp Leu Tyr Tyr Leu Lys Asn Ser Glu Ala Ile Asn Ser Leu Ala Leu15 20 25 30Leu Pro Pro Pro Pro Ala Val Gly Ser Ile Ala Phe Leu Asn Asp Gln35 40 45Ala Met Tyr Glu Gln Gly Arg Leu Leu Arg Asn Thr Glu Arg Gly Lys50 55 60Leu Ala Ala Glu Asp Ala Asn Leu Ser Ser Gly Gly Val Ala Asn Ala65 70 75Phe Ser Gly Ala Phe Gly Ser Pro Ile Thr Glu Lys Asp Ala Pro Ala80 85 90Leu His Lys Leu Leu Thr Asn Met Ile Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala95 100 105 110Thr Arg Ser Ala Lys Asp His Tyr Met Arg Ile Arg Pro Phe Ala Phe115 120 125Tyr Gly Val Ser Thr Cys Asn Thr Thr Glu Gln Asp Lys Leu Ser Lys130 135 140Asn Gly Ser Tyr Pro Ser Gly His Thr Ser Ile Gly Trp Ala Thr Ala145 150 155Leu Val Leu Ala Glu Ile Asn Pro Gln Arg Gln Asn Glu Ile Leu Lys160 165 170Arg Gly Tyr Glu Leu Gly Gln Ser Arg Val Ile Cys Gly Tyr His Trp175 180 185 190Gln Ser Asp Val Asp Ala Ala Arg Val Val Gly Ser Ala Val Val Ala195 200 205Thr Leu His Thr Asn Pro Ala Phe Gln Gln Gln Leu Gln Lys Ala Lys210 215 220Ala Glu Phe Ala Gln His Gln Lys Lys225 230(2)序列編號11的序列信息(i)序列性質(zhì)(A)序列長度231個氨基酸(B)序列類型氨基酸(D)拓?fù)錁?gòu)型線型(ii)序列種類蛋白質(zhì)(vi)來源(A)生物名蟑螂埃希氏菌(Escherichia blattae)(B)菌株名JCM 1650(xi)序列表述SEQ ID NO11Leu Ala Leu Val Ala Thr Gly Asn Asp Thr Thr Thr Lys Pro Asp Leu1 5 10 15Tyr Tyr Leu Lys Asn Ser Glu Ala Ile Asn Ser Leu Ala Leu Leu Pro20 25 30Pro Pro Pro Ala Val Gly Ser Ile Ala Phe Leu Asn Asp Gln Ala Met35 40 45Tyr Glu Gln Gly Arg Leu Leu Arg Asn Thr Glu Arg Gly Lys Leu Ala50 55 60Ala Glu Asp Ala Asn Leu Ser Ser Gly Gly Val Ala Asn Ala Phe Ser65 70 75 80Gly Ala Phe Gly Ser Pro Ile Thr Glu Lys Asp Ala Pro Ala Leu His85 90 95Lys Leu Leu Thr Asn Met Ile Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala Thr Arg100 105 110Ser Ala Lys Asp His Tyr Met Arg Ile Arg Pro Phe Ala Phe Tyr Gly115 120 125Val Ser Thr Cys Asn Thr Thr Glu Gln Asp Lys Leu Ser Lys Asn Gly130 135 140Ser Tyr Pro Ser Gly His Thr Ser Ile Gly Trp Ala Thr Ala Leu Val145 150 155 160Leu Ala Glu Ile Asn Pro Gln Arg Gln Asn Glu Ile Leu Lys Arg Gly165 170 175Tyr Glu Leu Gly Gln Ser Arg Val Ile Cys Gly Tyr His Trp Gln Ser180 185 190Asp Val Asp Ala Ala Arg Val Val Gly Ser Ala Val Val Ala Thr Leu195 200 205His Thr Asn Pro Ala Phe Gln Gln Gln Leu Gln Lys Ala Lys Ala Glu210 215 220Phe Ala Gln His Gln Lys Lys225 230(2)序列編號12的序列信息(i)序列性質(zhì)(A)序列長度20個堿基(B)序列類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線型(ii)序列種類其它核酸合成DNA(iv)反義鏈(xi)序列表述SEQ ID NO12CCTCGAGGTC GACGGTATCG 20(2)序列編號13的序列信息(i)序列性質(zhì)(A)序列長度21個堿基(B)序列類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線型(ii)序列種類其它核酸合成DNA(iv)反義鏈(xi)序列表述SEQ ID NO13ATTCGCCACA TCGCCACTGC T21(2)序列編號14的序列信息(i)序列性質(zhì)(A)序列長度22個堿基(B)序列類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線型(ii)序列種類其它核酸合成DNA(iv)反義鏈(xi)序列表述SEQ ID NO14TAGCCCAGCC GGTAGAGGTA TG 22(2)序列編號15的序列信息(i)序列性質(zhì)(A)序列長度25個堿基(B)序列類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線型(ii)序列種類其它核酸合成DNA(iv)反義鏈(xi)序列表述SEQ ID NO15CTGGATCCTG TGGCTATCAT CACCT25(2)序列編號16的序列信息(i)序列性質(zhì)(A)序列長度25個堿基(B)序列類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線型(ii)序列種類其它核酸合成DNA(iv)反義鏈(xi)序列表述SEQ ID NO16CTGGATCCGA CGCGATTTTA CCATA25(2)序列編號17的序列信息(i)序列性質(zhì)(A)序列長度747個堿基(B)序列類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線型(ii)序列種類基因組DNA(vi)來源
(A)生物名蘇氏普羅威登氏菌(B)菌株名ATCC 29851(ix)序列特征(A)特征表示符號CDS(B)存在位置1..744(xi)序列表述SEQ ID NO17ATG AAA AAA CTA TTA GCA GTA TTC TGC GCA GGG GCT TTT GTT TCA ACC 48Met Lys Lys Leu Leu Ala Val Phe Cys Ala Gly Ala Phe Val Ser Thr1 5 10 15AGT GTA TTT GCG GCG ATC CCT CCC GGC AAT GAT GTG ACA ACT AAA CCC 96Ser Val Phe Ala Ala Ile Pro Pro Gly Asn Asp Val Thr Thr Lys Pro20 25 30GAT CTT TAT TAT TTA AAA AAC TCA CAG GCT ATT GAT AGT TTA GCG TTA 144Asp Leu Tyr Tyr Leu Lys Asn Ser Gln Ala Ile Asp Ser Leu Ala Leu35 40 45TTG CCG CCA CCA CCT GAA GTG GGC AGT ATC TTA TTT TTA AAC GAC CAA 192Leu Pro Pro Pro Pro Glu Val Gly Ser Ile Leu Phe Leu Asn Asp Gln50 55 60GCG ATG TAT GAA AAA GGC CGT TTA TTG CGA AAT ACT GAG CGT GGA GAA 240Ala Met Tyr Glu Lys Gly Arg Leu Leu Arg Asn Thr Glu Arg Gly Glu65 70 75 80CAA GCC GCT AAG GAT GCT GAT CTG GCT GCG GGC GGT GTT GCG AAC GCA 288Gln Ala Ala Lys Asp Ala Asp Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Asn Ala85 90 95TTT TCT GAA GCT TTT GGT TAT CCC ATT ACC GAA AAG GAT GCG CCT GAA 336Phe Ser Glu Ala Phe Gly Tyr Pro Ile Thr Glu Lys Asp Ala Pro Glu100 105 110ATT CAT AAA TTG CTG ACG AAT ATG ATT GAA GAT GCG GGG GAT TTA GCA 384Ile His Lys Leu Leu Thr Asn Met Ile Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala115 120 125ACT CGC TCA GCC AAA GAG AAA TAC ATG CGC ATT CGT CCA TTT GCG TTC 432Thr Arg Ser Ala Lys Glu Lys Tyr Met Arg Ile Arg Pro Phe Ala Phe130 135 140TAC GGT GTT GCT ACC TGT AAC ACG AAA GAT CAG GAC AAA TTA TCT AAG 480Tyr Gly Val Ala Thr Cys Asn Thr Lys Asp Gln Asp Lys Leu Ser Lys145 150 155 160AAT GGC TCT TAT CCT TCT GGA CAC ACC GCA ATT GGC TGG GCA TCT GCA 528Asn Gly Ser Tyr Pro Ser Gly His Thr Ala Ile Gly Trp Ala Ser Ala165 170 175CTC GTA TTG TCA GAA ATT AAC CCA GAA AAC CAA GAT AAA ATT TTA AAA 576Leu Val Leu Ser Glu Ile Asn Pro Glu Asn Gln Asp Lys Ile Leu Lys180 185 190CGT GGT TAT GAA CTT GGC CAA AGC CGA GTC ATC TGT GGT TAC CAT TGG 624Arg Gly Tyr Glu Leu Gly Gln Ser Arg Val Ile Cys Gly Tyr His Trp195 200 205CAA AGT GAT GTT GAT GCA GCT CGT ATC GTT GCA TCG GGT GCG GTA GCA 672Gln Ser Asp Val Asp Ala Ala Arg Ile Val Ala Ser Gly Ala Val Ala210 215 220ACT TTA CAC TCC AAC CCT GAA TTC CAA AAA CAG TTA CAA AAA GCC AAA 720Thr Leu His Ser Asn Pro Glu Phe Gln Lys Gln Leu Gln Lys Ala Lys225 230 235 240GAC GAA TTT GCT AAA CTG AAA AAA TAG 747Asp Glu Phe Ala Lys Leu Lys Lys245(2)序列編號18的序列信息(i)序列性質(zhì)(A)序列長度248個氨基酸(B)序列類型氨基酸(D)拓?fù)錁?gòu)型線型(ii)序列種類蛋白質(zhì)(vi)來源(A)生物名蘇氏普羅威登氏菌(B)菌株名ATCC 29851(xi)序列表述SEQ ID NO18Met Lys Lys Leu Leu Ala Val Phe Cys Ala Gly Ala Phe Val Ser Thr1 5 10 15Ser Val Phe Ala Ala Ile Pro Pro Gly Asn Asp Val Thr Thr Lys Pro20 25 30Asp Leu Tyr Tyr Leu Lys Asn Ser Gln Ala Ile Asp Ser Leu Ala Leu35 40 45Leu Pro Pro Pro Pro Glu Val Gly Ser Ile Leu Phe Leu Asn Asp Gln50 55 60Ala Met Tyr Glu Lys Gly Arg Leu Leu Arg Asn Thr Glu Arg Gly Glu65 70 75 80Gln Ala Ala Lys Asp Ala Asp Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Asn Ala85 90 95Phe Ser Glu Ala Phe Gly Tyr Pro Ile Thr Glu Lys Asp Ala Pro Glu100 105 110Ile His Lys Leu Leu Thr Asn Met Ile Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala115 120 125Thr Arg Ser Ala Lys Glu Lys Tyr Met Arg Ile Arg Pro Phe Ala Phe130 135 140Tyr Gly Val Ala Thr Cys Asn Thr Lys Asp Gln Asp Lys Leu Ser Lys145 150 155 160Asn Gly Ser Tyr Pro Ser Gly His Thr Ala Ile Gly Trp Ala Ser Ala165 170 175Leu Val Leu Ser Glu Ile Asn Pro Glu Asn Gln Asp Lys Ile Leu Lys180 185 190Arg Gly Tyr Glu Leu Gly Gln Ser Arg Val Ile Cys Gly Tyr His Trp195 200 205Gln Ser Asp Val Asp Ala Ala Arg Ile Val Ala Ser Gly Ala Val Ala210 215 220Thr Leu His Ser Asn Pro Glu Phe Gln Lys Gln Leu Gln Lys Ala Lys225 230 235 240Asp Glu Phe Ala Lys Leu Lys Lys245(2)序列編號19的序列信息(i)序列性質(zhì)(A)序列長度747個堿基(B)序列類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線型(ii)序列種類基因組DNA(vi)來源(A)生物名產(chǎn)氣腸桿菌(B)菌株名IFO 12010(ix)序列特征(A)特征表示符號CDS(B)存在位置1..744(xi)序列表述SEQ ID NO19ATG AAA AAG CGC GTT CTC GCC CTC TGC CTC GCC AGC CTG TTT TCC GTT 48Met Lys Lys Arg Val Leu Ala Leu Cys Leu Ala Ser Leu Phe Ser Val1 5 10 15AAC GCT TTC GCG CTG GTC CCT GCC GGC AAT GAT GCA ACC ACC AAA CCG 96Asn Ala Phe Ala Leu Val Pro Ala Gly Asn Asp Ala Thr Thr Lys Pro20 25 30GAT CTC TAT TAT CTG AAA AAT GCA CAG GCC ATC GAT AGT CTG GCG CTG 144Asp Leu Tyr Tyr Leu Lys Asn Ala Gln Ala Ile Asp Ser Leu Ala Leu35 40 45TTG CCG CCG CCG CCG GAA GTT GGC AGC ATC GCA TTT TTA AAC GAT CAG 192Leu Pro Pro Pro Pro Glu Val Gly Ser Ile Ala Phe Leu Asn Asp Gln50 55 60GCG ATG TAT GAG AAA GGA CGG CTG TTG CGC AAT ACC GAA CGT GGC AAG 240Ala Met Tyr Glu Lys Gly Arg Leu Leu Arg Asn Thr Glu Arg Gly Lys65 70 75 80CTG GCG GCT GAA GAT GCT AAC CTG AGC GCC GGC GGC GTC GCG AAT GCC 288Leu Ala Ala Glu Asp Ala Asn Leu Ser Ala Gly Gly Val Ala Asn Ala85 90 95TTC TCC AGC GCT TTT GGT TCG CCC ATC ACC GAA AAA GAC GCG CCG CAG 336Phe Ser Ser Ala Phe Gly Ser Pro Ile Thr Glu Lys Asp Ala Pro Gln100 105 110TTA CAT AAG CTG CTG ACA AAT ATG ATT GAG GAT GCC GGC GAT CTG GCC 384Leu His Lys Leu Leu Thr Asn Met Ile Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala115 120 125ACC CGC AGC GCG AAA GAG AAA TAT ATG CGC ATT CGC CCG TTT GCG TTC 432Thr Arg Ser Ala Lys Glu Lys Tyr Met Arg Ile Arg Pro Phe Ala Phe130 135 140TAC GGC GTT TCA ACC TGT AAC ACT ACC GAG CAG GAC AAG CTG TCG AAA 480Tyr Gly Val Ser Thr Cys Asn Thr Thr Glu Gln Asp Lys Leu Ser Lys145 150 155 160AAC GGA TCT TAC CCT TCC GGC CAT ACC TCT ATC GGT TGG GCA ACC GCG 528Asn Gly Ser Tyr Pro Ser Gly His Thr Ser Ile Gly Trp Ala Thr Ala165 170 175CTG GTA CTG GCG GAG ATC AAT CCG CAG CGG CAA AAC GAA ATT CTC AAA 576Leu Val Leu Ala Glu Ile Asn Pro Gln Arg Gln Asn Glu Ile Leu Lys180 185 190CGC GGC TAT GAA TTG GGC GAA AGC CGG GTT ATC TGC GGC TAT CAT TGG 624Arg Gly Tyr Glu Leu Gly Glu Ser Arg Val Ile Cys Gly Tyr His Trp195 200 205CAG AGC GAT GTC GAT GCG GCG CGG ATA GTC GGC TCG GCG GTG GTG GCG 672Gln Ser Asp Val Asp Ala Ala Arg Ile Val Gly Ser Ala Val Val Ala210 215 220ACC CTG CAT ACC AAC CCG GCC TTC CAA CAG CAG TTG CAG AAA GCA AAG 720Thr Leu His Thr Asn Pro Ala Phe Gln Gln Gln Leu Gln Lys Ala Lys225 230 235 240GAT GAA TTC GCC AAA ACG CAG AAG TAA 747Asp Glu Phe Ala Lys Thr Gln Lys245(2)序列編號20的序列信息(i)序列性質(zhì)(A)序列長度248個氨基酸(B)序列類型氨基酸(D)拓?fù)錁?gòu)型線型(ii)序列種類蛋白質(zhì)(vi)來源(A)生物名產(chǎn)氣腸桿菌(B)菌株名IFO 12010(xi)序列表述SEQ ID NO20Met Lys Lys Arg Val Leu Ala Leu Cys Leu Ala Ser Leu Phe Ser Val1 5 10 15Asn Ala Phe Ala Leu Val Pro Ala Gly Asn Asp Ala Thr Thr Lys Pro20 25 30Asp Leu Tyr Tyr Leu Lys Asn Ala Gln Ala Ile Asp Ser Leu Ala Leu35 40 45Leu Pro Pro Pro Pro Glu Val Gly Ser Ile Ala Phe Leu Asn Asp Gln50 55 60Ala Met Tyr Glu Lys Gly Arg Leu Leu Arg Asn Thr Glu Arg Gly Lys65 70 75 80Leu Ala Ala Glu Asp Ala Asn Leu Ser Ala Gly Gly Val Ala Asn Ala85 90 95Phe Ser Ser Ala Phe Gly Ser Pro Ile Thr Glu Lys Asp Ala Pro Gln100 105 110Leu His Lys Leu Leu Thr Asn Met Ile Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala115 120 125Thr Arg Ser Ala Lys Glu Lys Tyr Met Arg Ile Arg Pro Phe Ala Phe130 135 140Tyr Gly Val Ser Thr Cys Asn Thr Thr Glu Gln Asp Lys Leu Ser Lys145 150 155 160Asn Gly Ser Tyr Pro Ser Gly His Thr Ser Ile Gly Trp Ala Thr Ala165 170 175Leu Val Leu Ala Glu Ile Asn Pro Gln Arg Gln Asn Glu Ile Leu Lys180 185 190Arg Gly Tyr Glu Leu Gly Glu Ser Arg Val Ile Cys Gly Tyr His Trp195 200 205Gln Ser Asp Val Asp Ala Ala Arg Ile Val Gly Ser Ala Val Val Ala210 215 220Thr Leu His Thr Asn Pro Ala Phe Gln Gln Gln Leu Gln Lys Ala Lys225 230 235 240Asp Glu Phe Ala Lys Thr Gln Lys245(2)序列編號21的序列信息(i)序列性質(zhì)(A)序列長度747個堿基(B)序列類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線型(ii)序列種類基因組DNA(vi)來源(A)生物名植生克雷伯氏菌(B)菌株名IFO 14939(ix)序列特征(A)特征表示符號CDS(B)存在位置1..744(xi)序列表述SEQ ID NO21ATG AAA AAG CGT GTA CTC GCC CTT TGC CTT GCC AGC CTC TTT TCA GTTMet Lys Lys Arg Val Leu Ala Leu Cys Leu Ala Ser Leu Phe Ser Val1 5 10 15AGC GCC TTT GCG CTG GTT CCC GCC GGC AAT GAT GCC ACC ACC AAG CCCSer Ala Phe Ala Leu Val Pro Ala Gly Asn Asp Ala Thr Thr Lys Pro20 25 30GAT CTC TAC TAT CTG AAA AAT GCC CAG GCC ATT GAC AGC CTG GCG CTGAsp Leu Tyr Tyr Leu Lys Asn Ala Gln Ala Ile Asp Ser Leu Ala Leu35 40 45TTG CCA CCG CCG CCG GAA GTG GGC AGC ATT GCG TTT TTA AAC GAT CAGLeu Pro Pro Pro Pro Glu Val Gly Ser Ile Ala Phe Leu Asn Asp Gln50 55 60GCG ATG TAT GAG AAA GGC CGT CTG CTG CGC GCC ACC GCC CGC GGC AAG 240Ala Met Tyr Glu Lys Gly Arg Leu Leu Arg Ala Thr Ala Arg Gly Lys65 70 75 80TTG GCG GCA GAA GAT GCC AAC CTG AGC GCG GGT GGC GTG GCC AAC GCC 288Leu Ala Ala Glu Asp Ala Asn Leu Ser Ala Gly Gly Val Ala Asn Ala85 90 95TTC TCC GCA GCA TTC GGC TCC CCG ATC AGC GAA AAA GAC GCC CCG GCG 336Phe Ser Ala Ala Phe Gly Ser Pro Ile Ser Glu Lys Asp Ala Pro Ala100 105 110CTG CAC AAA CTG CTC ACC AAC ATG ATT GAA GAC GCG GGC GAT CTG GCG 384Leu His Lys Leu Leu Thr Asn Met Ile Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala115 120 125ACC CGA GGC GCG AAA GAG AAG TAT ATG CGT ATT CGT CCG TTT GCC TTC 432Thr Arg Gly Ala Lys Glu Lys Tyr Met Arg Ile Arg Pro Phe Ala Phe130 135 140TAC GGC GTG TCC ACC TGC AAT ACC ACC GAA CAG GAT AAG CTG TCG AAA 480Tyr Gly Val Ser Thr Cys Asn Thr Thr Glu Gln Asp Lys Leu Ser Lys145 150 155 160AAC GGC TCC TAC CCT TCC GGA CAC ACC TCT ATC GGC TGG GCG ACC GCC 528Asn Gly Ser Tyr Pro Ser Gly His Thr Ser Ile Gly Trp Ala Thr Ala165 170 175CTG GTG CTG GCC GAA ATC AAC CCG CAG CGC CAG AAT GAG ATT CTC AAG 576Leu Val Leu Ala Glu Ile Asn Pro Gln Arg Gln Asn Glu Ile Leu Lys180 185 190CGC GGC TAT GAG CTC GGT GAA AGT CGG GTG ATC TGC GGT TAC CAC TGG 624Arg Gly Tyr Glu Leu Gly Glu Ser Arg Val Ile Cys Gly Tyr His Trp195 200 205CAG AGC GAT GTT GAC GCC GCG CGG ATT GTC GGC TCG GCG GTG GTT GCA 672Gln Ser Asp Val Asp Ala Ala Arg Ile Val Gly Ser Ala Val Val Ala210 215 220ACC CTG CAT ACC AAT CCG GCC TTC CAG CAG CAG CTG CAA AAA GCC AAA 720Thr Leu His Thr Asn Pro Ala Phe Gln Gln Gln Leu Gln Lys Ala Lys225 230 235 240GAC GAG TTT GCG AAA CAG CAG AAA TAG 747Asp Glu Phe Ala Lys Gln Gln Lys245(2)序列編號22的序列信息(i)序列性質(zhì)(A)序列長度248個氨基酸(B)序列類型氨基酸(D)拓?fù)錁?gòu)型線型(ii)序列種類蛋白質(zhì)(vi)來源(A)生物名植生克雷伯氏菌(B)菌株名IFO 14939(xi)序列表述SEQ ID NO22Met Lys Lys Arg Val Leu Ala Leu Cys Leu Ala Ser Leu Phe Ser Val1 5 10 15Ser Ala Phe Ala Leu Val Pro Ala Gly Asn Asp Ala Thr Thr Lys Pro20 25 30Asp Leu Tyr Tyr Leu Lys Asn Ala Gln Ala Ile Asp Ser Leu Ala Leu35 40 45Leu Pro Pro Pro Pro Glu Val Gly Ser Ile Ala Phe Leu Asn Asp Gln50 55 60Ala Met Tyr Glu Lys Gly Arg Leu Leu Arg Ala Thr Ala Arg Gly Lys65 70 75 80Leu Ala Ala Glu Asp Ala Asn Leu Ser Ala Gly Gly Val Ala Asn Ala85 90 95Phe Ser Ala Ala Phe Gly Ser Pro Ile Ser Glu Lys Asp Ala Pro Ala100 105 110Leu His Lys Leu Leu Thr Asn Met Ile Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala115 120 125Thr Arg Gly Ala Lys Glu Lys Tyr Met Arg Ile Arg Pro Phe Ala Phe130 135 140Tyr Gly Val Ser Thr Cys Asn Thr Thr Glu Gln Asp Lys Leu Ser Lys145 150 155 160Asn Gly Ser Tyr Pro Ser Gly His Thr Ser Ile Gly Trp Ala Thr Ala165 170 175Leu Val Leu Ala Glu Ile Asn Pro Gln Arg Gln Asn Glu Ile Leu Lys180 185 190Arg Gly Tyr Glu Leu Gly Glu Ser Arg Val Ile Cys Gly Tyr His Trp195 200 205Gln Ser Asp Val Asp Ala Ala Arg Ile Val Gly Ser Ala Val Val Ala210 215 220Thr Leu His Thr Asn Pro Ala Phe Gln Gln Gln Leu Gln Lys Ala Lys225 230 235 240Asp Glu Phe Ala Lys Gln Gln Lys245(2)序列編號23的序列信息(i)序列性質(zhì)(A)序列長度735個堿基(B)序列類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線型(ii)序列種類基因組DNA(vi)來源(A)生物名無花果沙雷氏菌(B)菌株名IAM 13540(ix)序列特征
(A)特征表示符號CDS(B)存在位置1..732(xi)序列表述SEQ ID NO23ATG AAA AAA ATA TTA TTA GCC ACA TTA AGC TGC GCC GCG TTG ACG CAG 48Met Lys Lys Ile Leu Leu Ala Thr Leu Ser Cys Ala Ala Leu Thr Gln1 5 10 15TTT TCC TTT GCC GCC AAA GAT GTC ACT ACC CAC CCT GAG GTT TAT TTT 96Phe Ser Phe Ala Ala Lys Asp Val Thr Thr His Pro Glu Val Tyr Phe20 25 30CTG CAA GAA TCA CAG TCC ATC GAC AGC CTG GCA CTA TTG CCG CCG CCG 144Leu Gln Glu Ser Gln Ser Ile Asp Ser Leu Ala Leu Leu Pro Pro Pro35 40 45CCG GCG ATG GAC AGC ATT GAT TTC CTG AAT GAC AAA GCG CAA TAC GAC 192Pro Ala Met Asp Ser Ile Asp Phe Leu Asn Asp Lys Ala Gln Tyr Asp50 55 60GCC GGG AAA ATA GTG CGC AAT ACT CCG CGT GGC AAG CAG GCT TAT GAT 240Ala Gly Lys Ile Val Arg Asn Thr Pro Arg Gly Lys Gln Ala Tyr Asp65 70 75 80GAC GCC CAC GTT GCC GGG GAC GGC GTT GCC GCC GCA TTT TCC AAC GCC 288Asp Ala His Val Ala Gly Asp Gly Val Ala Ala Ala Phe Ser Asn Ala85 90 95TTC GGC CTA GAA ATA GCC CAA CGG AAA ACG CCG GAG CTG TTT AAG CTG 336Phe Gly Leu Glu Ile Ala Gln Arg Lys Thr Pro Glu Leu Phe Lys Leu100 105 110GTG ATG AAA ATG CGT GAA GAC GCC GGC GAT TTG GCG ACC CGC AGC GCC 384Val Met Lys Met Arg Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala Thr Arg Ser Ala115 120 125AAA AAT CAC TAT ATG CGC ATT CGC CCC TTT GCG TTT TAT AAC GAA GCG 432Lys Asn His Tyr Met Arg Ile Arg Pro Phe Ala Phe Tyr Asn Glu Ala130 135 140ACC TGC CGA CCG GAC GAA GAA AGC ACC CTG TCG AAG AAC GGT TCT TAC 480Thr Cys Arg Pro Asp Glu Glu Ser Thr Leu Ser Lys Asn Gly Ser Tyr145 150 155 160CCT TCC GGC CAT ACC ACC ATC GGC TGG GCG ACC GCG CTG GTG CTG GCT 528Pro Ser Gly His Thr Thr Ile Gly Trp Ala Thr Ala Leu Val Leu Ala165 170 175GAA ATC AAC CCC GCC AGG CAG GGT GAA ATC CTG CAG CGC GGC TAT GAT 576Glu Ile Asn Pro Ala Arg Gln Gly Glu Ile Leu Gln Arg Gly Tyr Asp180 185 190ATG GGC CAA AGC CGG GTT ATC TGC GGT TAT CAC TGG CAA AGC GAC GTG 624Met Gly Gln Ser Arg Val Ile Cys Gly Tyr His Trp Gln Ser Asp Val195 200 205ACT GCG GCG CGC ATG GCG GCG TCG GCC ATG GTG GCG CGT TTG CAT GCC 672Thr Ala Ala Arg Met Ala Ala Ser Ala Met Val Ala Arg Leu His Ala210 215 220GAA CCC ACC TTC GCC GCC CAG CTG CAA AAG GCC AAA GAC GAA TTC AAC 720Glu Pro Thr Phe Ala Ala Gln Leu Gln Lys Ala Lys Asp Glu Phe Asn225 230 235 240GGC CTG AAA AAG TAA 735Gly Leu Lys Lys(2)序列編號24的序列信息(i)序列性質(zhì)
(A)序列長度244個氨基酸(B)序列類型氨基酸(D)拓?fù)錁?gòu)型線型(ii)序列種類蛋白質(zhì)(vi)來源(A)生物名無花果沙雷氏菌(B)菌株名IAM 13540(xi)序列表述SEQ ID NO24Met Lys Lys Ile Leu Leu Ala Thr Leu Ser Cys Ala Ala Leu Thr Gln1 5 10 15Phe Ser Phe Ala Ala Lys Asp Val Thr Thr His Pro Glu Val Tyr Phe20 25 30Leu Gln Glu Ser Gln Ser Ile Asp Ser Leu Ala Leu Leu Pro Pro Pro35 40 45Pro Ala Met Asp Ser Ile Asp Phe Leu Asn Asp Lys Ala Gln Tyr Asp50 55 60Ala Gly Lys Ile Val Arg Asn Thr Pro Arg Gly Lys Gln Ala Tyr Asp65 70 75 80Asp Ala His Val Ala Gly Asp Gly Val Ala Ala Ala Phe Ser Asn Ala85 90 95Phe Gly Leu Glu Ile Ala Gln Arg Lys Thr Pro Glu Leu Phe Lys Leu100 105 110Val Met Lys Met Arg Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala Thr Arg Ser Ala115 120 125Lys Asn His Tyr Met Arg Ile Arg Pro Phe Ala Phe Tyr Asn Glu Ala130 135 140Thr Cys Arg Pro Asp Glu Glu Ser Thr Leu Ser Lys Asn Gly Ser Tyr145 150 155 160Pro Ser Gly His Thr Thr Ile Gly Trp Ala Thr Ala Leu Val Leu Ala165 170 175Glu Ile Asn Pro Ala Arg Gln Gly Glu Ile Leu Gln Arg Gly Tyr Asp180 185 190Met Gly Gln Ser Arg Val Ile Cys Gly Tyr His Trp Gln Ser Asp Val195 200 205Thr Ala Ala Arg Met Ala Ala Ser Ala Met Val Ala Arg Leu His Ala210 215 220Glu Pro Thr Phe Ala Ala Gln Leu Gln Lys Ala Lys Asp Glu Phe Asn225 230 235 240Gly Leu Lys Lys
權(quán)利要求
1.一種核苷-5’-磷酸酯的制造方法，其特征在于使酸性磷酸酶在pH3.0～5.5的條件下作用于核苷和選自聚磷酸(鹽)、磷酸苯酯(鹽)和氨甲酰磷酸(鹽)的磷酸供體，來生成核苷-5’-磷酸酯，并收集生成物。
2.權(quán)利要求1中記載的核苷-5’-磷酸酯的制造方法，其中酸性磷酸酶含有使磷酸酯水解活性降低的突變。
3.權(quán)利要求1中記載的核苷-5’-磷酸酯的制造方法，其中酸性磷酸酶含有序列表序列編號4、11、18、20、22或24中所示的氨基酸序列，或者與這些氨基酸序列的任一個實(shí)質(zhì)上相同的氨基酸序列。
4.權(quán)利要求2中記載的核苷-5’-磷酸酯的制造方法，其中酸性磷酸酶含有與序列表序列編號4、11、18、20、22或24中所示的氨基酸序列實(shí)質(zhì)上相同的氨基酸序列，并且含有序列表序列編號4、11、18、20、22或24中所示的氨基酸序列的酸性磷酸酶是含有使酸性磷酸酶的磷酸酯水解活性降低的突變的突變型酸性磷酸酶。
5.權(quán)利要求4中記載的核苷-5’-磷酸酯的制造方法，其中上述突變是相當(dāng)于序列表序列編號4中所示的氨基酸序列中第72位的甘氨酸殘基和/或第151位的異亮氨酸殘基被其它氨基酸殘基置換的氨基酸置換。
6.權(quán)利要求5中記載的核苷-5’-磷酸酯的制造方法，其中上述突變是序列表序列編號4中所示的氨基酸序列中第72位的甘氨酸殘基和/或第151位的異亮氨酸殘基被其它氨基酸殘基置換、序列表序列編號11中所示的氨基酸序列中第74位的甘氨酸殘基和/或第153位的異亮氨酸殘基被其它氨基酸殘基置換、序列表序列編號18、20或22中所示的氨基酸序列中第92位的甘氨酸殘基和/或第171位的異亮氨酸殘基被其它氨基酸殘基置換、序列表序列編號24中所示的氨基酸序列中第88位的甘氨酸殘基和/或第167位的異亮氨酸殘基被其它氨基酸殘基置換。
7.含有與序列表序列4、11、18、20、22或24中所示的氨基酸序列實(shí)質(zhì)上相同的氨基酸序列，且含有使含有序列表序列4、11、18、20、22或24中所示的氨基酸序列的酸性磷酸酶的磷酸酯水解活性降低的突變的突變型酸性磷酸酶。
8.權(quán)利要求7中記載的突變型酸性磷酸酶，其中上述突變是相當(dāng)于序列表序列編號4中所示的氨基酸序列中第72位的甘氨酸殘基和/或第151位的異亮氨酸殘基被其它氨基酸殘基置換的氨基酸置換。
9.權(quán)利要求8中記載的突變型酸性磷酸酶，其中上述突變是序列表序列編號4中所示的氨基酸序列中第72位的甘氨酸殘基和/或第151位的異亮氨酸殘基被其它氨基酸殘基置換、序列表序列編號11中所示的氨基酸序列中第74位的甘氨酸殘基和/或第153位的異亮氨酸殘基被其它氨基酸殘基置換、序列表序列編號18、20或22中所示的氨基酸序列中第92位的甘氨酸殘基和/或第171位的異亮氨酸殘基被其它氨基酸殘基置換、序列表序列編號24中所示的氨基酸序列中第88位的甘氨酸殘基和/或第167位的異亮氨酸殘基被其它氨基酸殘基置換。
10.含有序列表序列編號11、20、22和24中所示的任何一種氨基酸序列的酸性磷酸酶。
11.編碼權(quán)利要求7～10任何一項(xiàng)中記載的酸性磷酸酶的基因。
12.含有權(quán)利要求11中記載的基因的重組DNA。
13.攜帶權(quán)利要求12中記載的重組DNA的微生物。
全文摘要
一種有效、經(jīng)濟(jì)地生產(chǎn)核苷－5’－磷酸酯的方法,包括以酸性磷酸酶、特別是核苷酸酶活性降低了的酸性磷酸酶在pH3.0～5.5的條件下處理核苷和一種磷酸供體,磷酸供體選自聚磷酸(鹽)、磷酸苯酯(鹽)和氨甲酰磷酸(鹽),從而生成核苷－5’－磷酸酯并收集生成物。
文檔編號C12R1/01GK1191566SQ96195770
公開日1998年8月26日 申請日期1996年5月24日 優(yōu)先權(quán)日1995年5月25日
發(fā)明者三原康博, 宇多川隆, 山田秀明, 淺野泰久 申請人:味之素株式會社