專利名稱：改進(jìn)面團(tuán)性質(zhì)的方法和面團(tuán)改進(jìn)組合物以及改進(jìn)的食品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及提供具有改進(jìn)的流變性質(zhì)的面粉面團(tuán)和具有高品質(zhì)特性的谷粉類食品，本發(fā)明提供了一種含有氧化麥芽糖的氧化還原酶的組合物，當(dāng)它作為組分添加到面團(tuán)中時(shí)能賦予面團(tuán)和由此制造的食品上述改進(jìn)的性質(zhì)，本發(fā)明還提供了制備改進(jìn)的面團(tuán)和谷粉類食品的方法。
具體地說，本發(fā)明涉及一種提供改進(jìn)面粉面團(tuán)流變性質(zhì)的方法并涉及由這種面團(tuán)制的烘烤食品或干制品，這種食品具有好的質(zhì)地、食用品質(zhì)和形狀。
就這方面，面團(tuán)的“強(qiáng)”或“弱”是由面團(tuán)制造谷粉類成品包括烘烤食品的一個(gè)重要方面。面團(tuán)的“強(qiáng)”或“弱”主要取決于其蛋白質(zhì)含量，特別是面筋蛋白質(zhì)的含量和質(zhì)量是決定其“強(qiáng)”、“弱”的重要的因素。蛋白質(zhì)含量低的面粉一般稱為“弱”面粉。這樣，水和“弱”面粉混合形成的有內(nèi)聚性的可延伸的且彈性的團(tuán)塊受到壓力時(shí)，通常具有高度延伸性，但當(dāng)外力去除時(shí)，它不能恢復(fù)原狀。
蛋白質(zhì)含量高的面粉一般稱為“強(qiáng)”面粉。這種面粉和水混合所形成的團(tuán)塊比弱面粉形成的團(tuán)塊延伸性小，混合時(shí)施加的壓力會(huì)回復(fù)，而不會(huì)比“弱”面粉形成的面團(tuán)塊所呈現(xiàn)的斷裂程度大。由于面團(tuán)具有較好的流變性質(zhì)和處理性質(zhì)，和由于以“強(qiáng)”面粉面團(tuán)制成的烘烤食品或干制品具有較佳的形狀和質(zhì)地品質(zhì)，因此，大多數(shù)烘烤業(yè)通常優(yōu)選強(qiáng)面粉。
由強(qiáng)面粉制成的面團(tuán)一般較穩(wěn)定。面團(tuán)的穩(wěn)定性是面團(tuán)最重要的特性之一。根據(jù)美國谷類化學(xué)家協(xié)會(huì)(AACC)方法36-01A，術(shù)語“穩(wěn)定性”被定義為“獲得正向反應(yīng)時(shí)面團(tuán)經(jīng)過的時(shí)間范圍和圓形面團(tuán)在一段時(shí)間內(nèi)抵抗它自身重量而不至變平的性質(zhì)”。根據(jù)相同的方法，術(shù)語“反應(yīng)”被定義為“面團(tuán)對(duì)已知和特定刺激、物質(zhì)或一系列條件的反應(yīng)，通常在與對(duì)照組比較下通過烘烤測(cè)定之”。
在焙烤食品業(yè)和面粉廠，人們已知用面團(tuán)性能改進(jìn)劑來強(qiáng)化面團(tuán)。這一類面團(tuán)性能改進(jìn)劑通常是非特異性氧化劑，如碘酸鹽、過氧化物、抗壞血酸、K-溴酸鹽或偶氮二甲酰胺，添加它們的目的在于改進(jìn)面粉的烘烤性能以獲得具有改進(jìn)的延伸性因而具有所需強(qiáng)度和穩(wěn)定性的面團(tuán)。氧化劑這一作用背后的機(jī)制是面粉蛋白質(zhì)(特別是面筋)含有硫醇基，當(dāng)它們被氧化時(shí)，會(huì)形成雙硫鍵，使蛋白質(zhì)形成更穩(wěn)定的基質(zhì)因，而形成更好的面團(tuán)品質(zhì)，同時(shí)使烤食品的體積與面包心結(jié)構(gòu)得以提高。
除了上述由于抗壞血酸/抗壞血酸鹽的氧化能力而使其作為面團(tuán)性能改進(jìn)劑外，這些化合物也可以作為氧化還原酶的底物，即EP 0 682 116 A1公開的抗壞血酸氧化酶。在底物存在下，這種酶把抗壞血酸/抗壞血酸鹽轉(zhuǎn)化成脫氫抗壞血酸和H2O2。該現(xiàn)有技術(shù)并沒有提出在抗壞血酸/抗壞血酸鹽的存在下抗壞血酸氧化酶具有改良面團(tuán)的效果，但假設(shè)了有這種情況。
然而，一些當(dāng)前可供使用的幾種氧化劑受到消費(fèi)者的反對(duì)或者得不到管理機(jī)構(gòu)的允許，因此人們?cè)噲D找到這些常規(guī)面粉和面團(tuán)添加劑的替代品，現(xiàn)有技術(shù)已提出用葡糖氧化酶來達(dá)到這個(gè)目的。
這樣，US 2,783,150公開了在面粉中添加葡糖氧化酶以提高面團(tuán)的強(qiáng)度、質(zhì)地及改進(jìn)烘烤面包的外觀。
CA 2,012,723公開了包含纖維素水解酶如木聚糖酶和葡糖和葡糖氧化酶的面包改良組合物，加入后者的目的是為了減少纖維素水解酶的不利影響(減小面團(tuán)的強(qiáng)度和粘性)，該文獻(xiàn)公開了在面團(tuán)中需要添加葡萄糖是為了獲得足夠的葡糖氧化酶活性。
JP-92 084848提使用一種包含葡糖氧化酶和脂酶的面包改良組合物。
EP-B1-321 811公開了使用包含巰基氫氧化酶和葡糖氧化酶的酶組合物以改進(jìn)面團(tuán)的流變特性。在該現(xiàn)有技術(shù)文件中論及了單獨(dú)使用葡糖氧化酶還沒有成功。
在EP-B1-338 452中公開了改進(jìn)面團(tuán)穩(wěn)定性的酶組合物，其含有纖維素酶/半纖維素酶、葡糖氧化酶和視需要含巰基氧化酶的混合物。
然而，葡糖氧化酶用作面團(tuán)改進(jìn)添加劑是有局限性的，因?yàn)檫@種酶要求有足量的葡萄糖作為底物才能在面團(tuán)系統(tǒng)中保持其有效性，而通常谷類面粉中葡萄糖的含量很低。因此，面團(tuán)中不含葡萄糖或葡萄糖含量低可能是葡糖氧化酶成為有效的面團(tuán)改進(jìn)劑的限制因素。
與此相比，谷類面粉中麥芽糖的含量通常明顯地比葡萄糖高，因此，新鮮制備的面團(tuán)中通常麥芽糖含量比葡萄糖多，于是，在實(shí)驗(yàn)中，分析得自小麥面粉懸浮液的上清液中的糖含量以及分析由此面粉和其它成分(包括水，酵母，鹽的和蔗糖)制得的面團(tuán)(如在下面實(shí)施例2.3所述)的糖含量，分析值如下(百分比以面粉重量計(jì))面粉生面團(tuán)蔗糖 0.3 ＜0.01半乳糖0.001 0.01葡萄糖0.250.72麥芽糖2.6 1.4果糖 0.080.67乳糖 ＜0.01 ＜0.01此外，麥芽糖的含量在由酵母發(fā)酵的面團(tuán)中仍然處于一個(gè)比較高的水平上，或者甚至?xí)黾樱@是由于酵母主要利用葡萄糖，例如，在面團(tuán)醒發(fā)過程中，由于面粉中本來就存在或面團(tuán)中曾加入過淀粉降解酶(如β-淀粉酶)，而使面團(tuán)中產(chǎn)生更多的麥芽糖。
現(xiàn)有技術(shù)已確認(rèn)葡糖氧化酶對(duì)面包面團(tuán)的流變特性和對(duì)相應(yīng)的烘烤制品品質(zhì)有改進(jìn)作用，也了解使用這種酶有若干弊端。因此，可能需要在面團(tuán)中添加蔗糖或葡萄糖作為酶的底物以獲得足夠的效果，未添加其它酶而單獨(dú)使用葡糖氧化酶時(shí)，可能無法持續(xù)提供所需的面團(tuán)或面包的改進(jìn)作用。
然而，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)添加能夠氧化麥芽糖的氧化還原酶，包括己糖氧化酶作為唯一的面團(tuán)性能改進(jìn)劑，即在面團(tuán)中不用伴隨加入供添加酶所需的底物或其它酶，結(jié)果當(dāng)面團(tuán)被延伸時(shí)，增加了抗斷裂性，就是說，這種酶本身使面團(tuán)的強(qiáng)度增加，從而使面團(tuán)不易產(chǎn)生機(jī)械變形。一般認(rèn)為，面團(tuán)中添加己糖氧化酶有上述效果是因小麥面筋中含硫氨基酸中的硫醇基團(tuán)間形成交聯(lián)所致，這種現(xiàn)象是面團(tuán)中由酶產(chǎn)生的H2O2與硫醇基團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)時(shí)后者被氧化而發(fā)生的。
己糖氧化酶(D-己糖O2-氧化還原酶，EC 1.1.3.5)是一種酶，該酶在氧存在下可將D-葡萄糖和幾個(gè)其它還原糖包括麥芽糖、葡萄糖、乳糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和纖維素二糖氧化成對(duì)應(yīng)的內(nèi)酯，接著水解成各個(gè)醛糖二糖酸。因此，己糖氧化酶不同于葡糖氧化酶，后者只能轉(zhuǎn)化D-葡萄糖，而己糖氧化酶能用于更寬范圍的糖底物。被此酶催化的氧化反應(yīng)說明如下或己糖氧化酶(以后也稱為HOX)已從幾種紅藻類品種例如Iridophycusflaccidum(Bean和Hassid，1956，生物化學(xué)雜志，218425-436)和角叉菜Chondrus crispus(Ikawa，1982，酶學(xué)方法，89145-149)分離出來。另外，藻類品種Euthora cristata(Sullivan等，1973，生物化學(xué)和生物物理學(xué)報(bào)，30911-22)也被證實(shí)能產(chǎn)生HOX。
根據(jù)本發(fā)明，其它己糖氧化酶的潛在來源包括微生物菌種或者陸生植物品種。作為這樣一種植物來源的實(shí)例，Bean在生物化學(xué)雜志(1961)2361235-1240中，已公開了一種從柑橘類水果中提取的氧化還原酶，該酶能氧化寬范圍的糖，其中包括D-葡萄糖、D-半乳糖、纖維素二糖、乳糖、麥芽糖、D-2-脫氧葡萄糖、D-甘露糖、D-葡糖胺和D-木糖。另一個(gè)具有己糖氧化酶活性的酶的例子是Dowling等細(xì)菌學(xué)雜志(1956)72555-560公開的鼻疽桿菌的酶系。
已經(jīng)報(bào)道了從上述天然來源分離的己糖氧化酶在一些食品的生產(chǎn)中具有潛在的用途。這樣，從Iridophycus flaccidum分離出的己糖氧化酶已顯示了能夠在牛奶中轉(zhuǎn)化乳糖的同時(shí)產(chǎn)生相應(yīng)的醛糖二糖酸，并顯示在牛奶中作為酸化劑的潛在的意義，如代替酸化用微生物培養(yǎng)以達(dá)到同樣目的(Rand，1972，食品科學(xué)雜志，37698-701)。在這方面，己糖氧化酶被認(rèn)為是比葡糖氧化酶更有意義的酶，因?yàn)楹笳咧挥刑砑悠咸烟腔蛱砑訉⑷樘寝D(zhuǎn)化成葡萄糖和半乳糖的乳糖降解酶時(shí)才能在牛奶或不含葡萄糖或少含葡萄糖的其它食品中發(fā)揮酶的有效作用。
氧化還原酶的能力(包括己糖氧化酶產(chǎn)生過氧化氫的能力)已用來改進(jìn)食品(包括乳酪，黃油和果汁)的貯存穩(wěn)定性，如在JP-B-73/016612中公開的。也有人提出氧化還原酶作為抗氧化劑在食品中有潛在的用途。
然而，本發(fā)明已證明已糖氧化酶在面粉面團(tuán)制品(不僅包括面包制品也包括由面粉面團(tuán)制成的其它制品如面條和營養(yǎng)面條制品)制造中作為面團(tuán)性能改進(jìn)劑的廣泛用途。
因此，本發(fā)明第一個(gè)方面涉及改進(jìn)面粉面團(tuán)的流變性質(zhì)和由此面團(tuán)制成的成品品質(zhì)的方法，該方法包括向面團(tuán)成分、面團(tuán)添加劑或面團(tuán)中添加有效量的至少能夠使麥芽糖氧化的氧化還原酶，如己糖氧化酶。
再一個(gè)方面，本發(fā)明也提供了面團(tuán)焙烤食品改進(jìn)組合物，其包含至少能夠使麥芽糖氧化的氧化還原酶和至少一種其它面團(tuán)成分或面團(tuán)添加劑。
另一方面，本發(fā)明涉及制備焙烤食品的方法，該方法包括制備面粉面團(tuán)和焙烤面團(tuán)，所述制備面粉面團(tuán)中包括添加有效量的至少能夠使麥芽糖氧化的氧化還原酶；以及一種制備以面團(tuán)為基料的食品的方法，包括向面團(tuán)中加入有效量的麥芽糖氧化還原酶。
在一方面，本發(fā)明的方法是改進(jìn)面團(tuán)流變性質(zhì)的一種方法。該方法包括，如上所述，將有效量的麥芽糖氧化還原酶添加到面團(tuán)配方組分中或是混合所有面團(tuán)組分形成的面團(tuán)中。在本文上下文中，“有效量”是用來表示足以使面團(tuán)和/或成品具有如本文中定義的改進(jìn)的特性的量。
在按照本發(fā)明的方法的一個(gè)適用的實(shí)施方案中，氧化還原酶是己糖氧化酶。如本文詳盡地描述的，己糖氧化酶能從天然產(chǎn)生該酶的海洋藻類品種中分離出來。這樣的品種屬于杉海苔科(Gigartinales目)。能產(chǎn)生己糖氧化酶的屬于杉海苔科的藻類品種的例子是角叉菜Chondrus crispus和Iridophycus flaccidum。包括Euthora cristata品種在內(nèi)的Cryptomeniales目的藻類品種也是己糖氧化酶的潛在來源。當(dāng)用這樣的天然來源來提取己糖氧化酶時(shí)，典型的例子是用含水的抽提介質(zhì)從藻類原材料抽提。就原材料而言，可以使用從藻類所生長的海區(qū)收獲的新鮮狀態(tài)的藻類，或使用經(jīng)干燥(如在環(huán)境溫度下風(fēng)干或經(jīng)任何合適的工業(yè)干燥方法，如循環(huán)加熱干燥或冷凍干燥)的植物體。為了有助于隨后的抽提步驟，有利地是可將新鮮的或干燥的原材料弄碎如研磨法或摻合法。
作為水性抽提介質(zhì)，pH范圍為5-8的緩沖溶液，如0.1M磷酸鈉緩沖液、20mM的三乙醇胺緩沖液或者20mM的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩沖液是合適的。從藻類中提取己糖氧化酶的典型方法是將藻類原材料懸浮在緩沖液中，最好在攪拌下將這種懸浮液在0-20℃的范圍，如在5℃下保持1至5天。
然后用適當(dāng)?shù)姆蛛x方法(如過濾，篩分或離心)從水性介質(zhì)中分離懸浮的藻類材料，接著從濾液或上清液中回收己糖氧化酶。根據(jù)需要，將所分離的藻類材料進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)其它抽提步驟。
由于幾種海藻包含有色的色素如藻青素，因此可能需要對(duì)濾液或上清液進(jìn)行進(jìn)一步的純化以除去這些色素。作為一個(gè)例子，以色素可以溶解的有機(jī)溶劑處理濾液或上清液，并隨后從水性介質(zhì)中將含有已溶色素的溶劑加以分離，即可除去色素。另外，通過疏水相互作用色譜法也可將色素從濾液或上清液中除去。
任何可從水性介質(zhì)中分離蛋白質(zhì)的合適的常規(guī)方法都可用來從水性抽提介質(zhì)中收集己糖氧化酶。這些方法的實(shí)例(在隨后的內(nèi)容中詳盡地描述)包括用于蛋白質(zhì)分離的常規(guī)方法，如離子交換色譜法，視需要隨后可接濃縮步驟如超濾。也可通過添加如(NH)2SO4或聚乙二醇(PEG)物質(zhì)使蛋白質(zhì)沉淀，其后通過分離沉淀及視需要施以使蛋白質(zhì)溶解的條件，以收集這種酶。
對(duì)于己糖氧化酶的某些應(yīng)用來說，理想的是提供基本上純的酶，如基本上不含其它蛋白質(zhì)或非蛋白質(zhì)污染物的制劑，從上述抽提和分離步驟所得粗制的酶制劑還需經(jīng)進(jìn)一步純化步驟如色譜步驟、凝膠過濾或聚焦色譜法，這些將通過隨后的實(shí)施例加以描述。
在按照本發(fā)明的方法的優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過混合面粉和水、膨松劑(如酵母或常規(guī)的化學(xué)膨松劑)以及有效量的己糖氧化酶在面團(tuán)形成條件之下制備面團(tuán)。當(dāng)然，面團(tuán)混合物中還可添加其它成分，也屬本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
典型地，這樣的生面團(tuán)組分包括常規(guī)面團(tuán)組分，如鹽、甜味劑(如食糖、糖漿或人工甜味劑)、類脂物質(zhì)(包括起酥油、人造黃油、黃油或者動(dòng)物或植物油)以及一種或多種面團(tuán)添加劑(如乳化劑)、淀粉降解酶、纖維素或半纖維素降解酶、蛋白酶、脂酶、非特異性氧化劑(如以上提及的那些氧化劑)、調(diào)味劑、乳酸菌培養(yǎng)液、維生素、礦物質(zhì)、親水膠體如藻酸鹽、角叉菜膠、果膠、植物膠(包括如瓜耳膠樹膠和刺槐豆膠)和膳食纖維物質(zhì)。
用于制造面粉面團(tuán)制品的常規(guī)乳化劑的例子包括如單酸甘油酯、脂肪酸單和雙甘油酯的二乙酰基酒石酸酯和卵磷脂(如從大豆獲得)。在淀粉降解酶中，淀粉酶作為面團(tuán)性能改進(jìn)添加劑是特別適用的。α-淀粉酶使淀粉降解成為糊精，進(jìn)一步受β-淀粉酶降解形成麥芽糖。添加到面團(tuán)組合物中的其它適用的淀粉降解酶包括葡糖淀粉酶和支鏈淀粉酶。在本文的上下文中，其它有意義的酶是木聚糖酶和其它氧化還原酶，如葡糖氧化酶、吡喃糖氧化酶和巰基氧化酶。
一種優(yōu)選的面粉是小麥面粉，但是也涉及包含由其它谷類品種(如，大米、玉米，大麥，黑麥和高粱)得來的面粉的面團(tuán)。
通過混合面粉、水、按照本發(fā)明的氧化還原酶和其它可能的成分和添加劑來制備面團(tuán)。氧化還原酶可與任何面團(tuán)成分(包括水和面團(tuán)成分混合物)或與任何添加劑或添加劑混合物一起加入。面團(tuán)可用任何烘烤食品業(yè)或任何其它工廠中的普通的常規(guī)面團(tuán)制備方法來制備。
氧化還原酶能作為一種液態(tài)制品添加或者以一種干燥的粉劑組合物形式(其中包含作為唯一的活性組分的酶或與一種或多種其它面團(tuán)成分或添加劑的混合物)添加。添加的酶組分的量通常是在成品面團(tuán)中每公斤面粉1到10,000單位，優(yōu)選為5到5000單位如10到1000單位。在適用的實(shí)施方案中，每公斤面粉中的酶量在20至500單位的范圍。在本文上下文中1氧化還原酶單位相當(dāng)于特定條件下每分鐘轉(zhuǎn)化1μ摩爾葡萄糖的酶量。其活性以每克酶制劑中的氧化還原酶的單位數(shù)表示。
氧化還原酶對(duì)面團(tuán)流變性質(zhì)的改進(jìn)效果可以通過以下方法測(cè)定按照國際谷類化學(xué)協(xié)會(huì)(ICC)和美國谷類化學(xué)協(xié)會(huì)(AACC)的標(biāo)準(zhǔn)方法，包括面粉糊粘度圖示儀法(ICC 126)、調(diào)粉性測(cè)定儀法(farinograph)(AACC 54-21)和延伸儀法(extensigraph)(AACC 54-10)。延伸儀法測(cè)定例如面團(tuán)保持酵母產(chǎn)生的氣體的能力和經(jīng)受醒發(fā)的能力。實(shí)際上，延伸儀法測(cè)定面團(tuán)的相對(duì)強(qiáng)度。強(qiáng)面團(tuán)顯示出比弱面團(tuán)較高的和(在某些情況下)較長的延伸曲線。AACC法54-10以以下方式定義延伸儀″延伸儀記錄一塊試驗(yàn)面團(tuán)到破裂時(shí)的負(fù)載延伸曲線。負(fù)載-延伸曲線或延伸曲線(extensigrams)的特征是用來評(píng)估面粉的一般品質(zhì)以及它對(duì)改進(jìn)劑的反應(yīng)″。
在按照本發(fā)明的方法的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，面團(tuán)的抗延伸性，以抗延伸性(曲線高度，B)與延伸性(曲線長度，C)間的比率(即B/C)表示，按照AACC方法54-10測(cè)定結(jié)果顯示，相對(duì)于不含氧化酶的其它類似面團(tuán)，增加至少10％。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗延伸性增加至少20％，例如至少50％，特別是增加至少100％。
按照本發(fā)明的方法可以用于任何類型的面粉面團(tuán)以改進(jìn)其流變性質(zhì)和由此特殊型面團(tuán)制得的成品的品質(zhì)。因此，本發(fā)明的方法很適合于制備傳統(tǒng)上以酵母發(fā)酵的面包制品，包括小麥面粉制作的面包制品(如長面包和面包卷)。然而，一般認(rèn)為本發(fā)明方法也可改進(jìn)添加化學(xué)發(fā)酵劑引起膨松的面團(tuán)的性質(zhì)，包括甜烘烤食品，如糕餅制品，包括如磅餅和松餅或松軟烤餅。
在一個(gè)有意義的方面，本發(fā)明是用來改進(jìn)制作面條制品(包括“白面條”和“中國面條”)的面團(tuán)的流變性質(zhì)和改進(jìn)面條成品的質(zhì)地品質(zhì)。用于面條制造的一個(gè)典型的基本配方包括以下成分小麥面粉100份，鹽0.5份和水33份。面條的典型制法是通過在合適的混合裝置中混合各成分，隨后用合適的面條機(jī)搟平面團(tuán)而形成細(xì)面條，隨后風(fēng)干之。
成品面條的品質(zhì)按它們的顏色、烹調(diào)品質(zhì)和質(zhì)地來估價(jià)。面條應(yīng)盡快烹煮，在烹煮之后仍然結(jié)實(shí)，煮湯中最好未流失任何固體。所供應(yīng)的面條應(yīng)具有滑順和結(jié)實(shí)的表面而不應(yīng)顯示粘性，并給出結(jié)實(shí)的咬感和好的口感。而且，重要的是面條要有淺的顏色。
由于提供具有所需的質(zhì)地和食用品質(zhì)的面條的小麥面粉的適宜性可能會(huì)隨著年份和生長區(qū)域的不同而不同，因此，通常添加面條改進(jìn)劑至面團(tuán)中以彌補(bǔ)面粉欠適宜的質(zhì)量。典型地，這樣的改進(jìn)劑包括膳食纖維物質(zhì)、植物蛋白質(zhì)、乳化劑和親水膠體如藻酸鹽、角叉菜膠、果膠、植物膠(包括瓜耳膠樹膠和刺槐豆膠)和淀粉酶。
人們?cè)噲D用葡糖氧化酶作為面條改進(jìn)劑。但是，如上所述，小麥面粉中葡萄糖的含量可能太低致使這種酶不具效力。
因此本發(fā)明的一個(gè)重要方面是本發(fā)明的氧化還原酶是有效的面條改進(jìn)劑(視需要與現(xiàn)用的改進(jìn)面條品質(zhì)的其它成分復(fù)配使用)。因此，可以認(rèn)為按照上述方法制備的面條應(yīng)在顏色、烹煮和食用品質(zhì)方面的性質(zhì)(包括結(jié)實(shí)，有彈性和質(zhì)地不粘和均勻)得了到改進(jìn)。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明方法制備的面團(tuán)是制備營養(yǎng)面食制品的面團(tuán)。這樣的制品(包括例如意大利面條和通心面)通常是以面粉和雞蛋為主要成分的面團(tuán)制備的。在混合各成分之后，使面團(tuán)形成所需種類的面條制品和然后風(fēng)干之。一般認(rèn)為，而糊面團(tuán)添加劑對(duì)其延伸性和穩(wěn)定性有明顯的改進(jìn)效果從而制得具有改進(jìn)質(zhì)地和食用品質(zhì)的面食成品。
在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了面團(tuán)改進(jìn)組合物，該組合物包含本發(fā)明的氧化還原酶和至少一種其它面團(tuán)成分或面團(tuán)添加劑。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，氧化還原酶是己糖氧化酶。其它成分或添加劑可以是以上描述的任何成分或添加劑。這種組合物可以方便地為包含氧化還原酶的液態(tài)制劑。然而，該組合物方便的是呈干燥的組合物形式?？梢岳斫獾厥牵诮M合物中氧化還原酶活性的量取決于其它成分或添加劑的類型和量。然而，氧化還原酶活性的量在10至100,000單位的范圍內(nèi)較好，優(yōu)選的在100至50,000單位的范圍內(nèi)，如1,000至10,000單位(包括2,000至5,000單位)。
根據(jù)需要，組合物可以是一種完全的面團(tuán)添加劑的混合物，或包含這種面團(tuán)的所有干燥的成分和添加劑的用于制備特定成品的預(yù)混合物形式。在特定的實(shí)施方案中，組合物對(duì)于制備烘烤食品或生產(chǎn)面條制品或者營養(yǎng)面食制品是特別有用的。
如上面提到的，本發(fā)明提供了一種用于制備烘烤食品的方法，該方法包括添加氧化還原酶如己糖氧化酶至面團(tuán)中。尤其是，這種方法的結(jié)果是烘烤食品如以上提及的制品相對(duì)于以不包含氧化還原酶的面團(tuán)制備的其它類似烘烤食品，其比容有所增加。在本文上下文中，“比容”用來表示產(chǎn)品的體積和重量之間的比率。人們驚奇發(fā)現(xiàn)按照上述方法，比容能顯著地增加例如至少10％，優(yōu)選增加至少20％，其中也有增加30％的，較好為至少40％，更好為至少50％。
在上述方法的一個(gè)有利的實(shí)施方案中，至少還有一種酶添加到面團(tuán)中。這里合適的例子包括纖維素酶、半纖維素酶、木聚糖酶、淀粉降解酶、葡糖氧化酶、脂酶和蛋白酶。
現(xiàn)在通過以下的非限制性實(shí)施例的說明，對(duì)本發(fā)明加以敘述。實(shí)施例11.1.從Chondrus criscus獲得的己糖氧化酶的純化純化的己糖氧化酶制劑是利用以下抽提和純化過程獲得的。在這些過程和下面純化酶的鑒定中，采用下列方法測(cè)定己糖氧化酶的活性1.1.1己糖氧化酶的活性測(cè)定本測(cè)定基于由Sullivan和Ikawa描述的方法(生物化學(xué)和生物物理學(xué)報(bào)，1973，30911-22)，但是修改成為在微型滴定平板上進(jìn)行。測(cè)定混合物包含150μl的β-D-葡萄糖(0.1M在0.1M pH＝6.3磷酸鈉緩沖液中)，120μl 0.1M pH＝6.3磷酸鈉緩沖液，10μl鄰聯(lián)茴香胺-二鹽酸鹽(西格馬D-3252，在H2O中3.0毫克/毫升)，10μl過氧化物酶(POD)(西格馬-8125，在0.1ml在0.1M pH＝6.3磷酸鈉緩沖液中)和10μl酶(HOX)溶液。以添加緩沖液替代酶溶液作為對(duì)照溶液。
培養(yǎng)由葡萄糖的添加開始。在25℃下培養(yǎng)15分鐘之后，在ELISA分析儀上讀取405nm的吸光度。利用不同濃度的H2O2替代酶溶液來制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。
這一反應(yīng)可用以下方式描述被氧化的鄰聯(lián)茴香胺呈黃顏色，在405nm處有吸收。1.1.2抽提新鮮的Chondrus crispus植物體是沿法國的布列塔尼地區(qū)海岸上收獲的。新鮮材料在針狀磨(Alpine)中均質(zhì)化。向形成的100克均漿的植物體材料添加300毫升0.1M pH＝6.8磷酸鈉緩沖液。混合物隨后在超聲浴中進(jìn)行5分鐘的超聲處理，在5℃下持續(xù)旋轉(zhuǎn)下提取4天，隨后在47,000×g下將混合物離心20分鐘。
利用裝備有Omega(10kD截留值，F(xiàn)iltron)超濾膜的Amicon超濾設(shè)備，對(duì)300ml形成的清晰的粉紅上清液進(jìn)行超濾脫鹽。1.1.3陰離子交換步驟將1.1.2形成的存留物施加于以20mM三乙醇胺(pH＝7.3)平衡過的200m1Q-瓊脂糖FF之5×10cm凝膠柱。用平衡緩沖液洗凝膠柱和用450ml在平衡緩沖液中含0到1M NaCl4的梯度液洗脫己糖氧化酶。柱以6ml/分鐘速度洗脫，收集流出級(jí)分，每級(jí)分14ml。利用裝備有Omega(10kD截留值，F(xiàn)iltron)超濾膜的Amicon 8400超濾裝置，通過超濾作用將收集的9-17(總125ml)級(jí)分濃縮到7.5ml。1.1.4.凝膠過濾將上述7.5ml存留物施加于以50mM磷酸鈉緩沖液(pH6.4)平衡過的葡聚糖凝膠Superdex 200 2.6×60cm凝膠過濾柱，以1ml/分鐘的流速洗脫。收集流出級(jí)分，每級(jí)分4ml。合并具有己糖氧化酶活性的17-28級(jí)分(總體積50ml)。1.1.5疏水相互作用色譜法向從凝膠過濾步驟1.1.4產(chǎn)生的合并液中加入硫酸銨至最終濃度為2M，然后將這一混合物施加于在20mM磷酸鈉緩沖液(pH＝6.3)和2M硫酸銨中平衡過的具32ml苯基瓊脂糖的1.6×16cm凝膠柱上。用平衡緩沖液洗柱后，用在20mM磷酸鈉緩沖液中含2M到0M硫酸銨的140ml線性梯度液以2ml/分鐘流速洗脫己糖氧化酶，。收集流出級(jí)分，每級(jí)分4ml，合并具有己糖氧化酶活性的24-33級(jí)分。
以上提及的粉紅顏色伴隨著酶，但根據(jù)此純化步驟可將其與己糖氧化酶分離。1.1.6.Mono Q陰離子交換用上述超濾法使上述苯基瓊脂糖凝膠色譜步驟產(chǎn)生的合并液脫鹽。取2ml這種合并液施加于在20mM三乙醇胺(pH＝7.3)中平衡過的Mono Q溶靛素橙HR5/5柱上。其后用在平衡緩沖液中含0到0.65 M NaCl的45ml線性梯度液以1.5毫升/分鐘的流速洗脫。收集流出級(jí)分，每級(jí)分1.5ml，合并14-24級(jí)分。1.1.7 Mono P陰離子交換將從以上1.1.6步驟中得來的含己糖氧化酶的合并液施加于在20mM-雙三羥甲基氨基甲烷緩沖液(pH＝6.5)中平衡過的Mono P溶靛素橙HR5/5柱。用在平衡緩沖液中含0到0.65 M NaCl的45ml線性梯度液以1.5ml/分鐘的流速洗脫酶。收集流出級(jí)分，每級(jí)分0.75ml。在級(jí)分12中發(fā)現(xiàn)最高的己糖氧化酶活性。1.2.純化的己糖氧化酶的鑒定從上述步驟第1.1.6和1.1.7得到的含己糖氧化酶的合并液用于以下鑒定實(shí)驗(yàn)1.2.1.分子量測(cè)定使用瓊脂糖6KR 10/30柱的凝膠滲透色譜法于50mM磷酸鈉緩沖液(pH＝6.4)中以0.5ml/分鐘的流速測(cè)定純化的原態(tài)己糖氧化酶的大小。鐵蛋白(440kD)、過氧化氫酶(232kD)、醛縮酶(158kD)、牛血清白蛋白(67kD)和胰凝乳蛋白酶原(25kD)用作大小的標(biāo)準(zhǔn)。經(jīng)測(cè)定，純化己糖氧化酶的分子量為120±10kD。1.2.2.最適pH的測(cè)定用于測(cè)定最適pH的檢測(cè)混合物(終體積300μl)含有120μl不同pH值的0.1M磷酸鈉/檸檬酸鹽緩沖液的貯備溶液。將所有其它檢測(cè)混合物組分溶于水中。于25℃下在稀釋的貯備緩沖溶液中測(cè)定pH。
己糖氧化酶在pH 3到8內(nèi)顯示酶促活性，但在3.5至5.5的范圍內(nèi)最佳。1.2.3己糖氧化酶對(duì)葡萄糖和麥芽糖的K。
利用EZ-FIT曲線擬合微機(jī)程序(Perrella，F(xiàn).W.，1988，分析生物化學(xué)，174437-447)，將動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)擬合于公式V＝VmasS(Km+S)，其中Vmax是最大速度，S是底物濃度，Km為達(dá)到50％最大速率時(shí)之濃度(Michaelis常數(shù))。
以酶的活性分別作為葡萄糖和麥芽糖的函數(shù)得到典型的雙曲飽和曲線。葡萄糖Km計(jì)算值為2.7mM±0.7mM，麥芽糖的Km是43.7±5.6mM。實(shí)施例2從Chondrus criscus提取的己糖氧化酶的面團(tuán)改進(jìn)作用2.1.Chondrus criscus己糖氧化酶的純化在這一實(shí)驗(yàn)中，己糖氧化酶以下列方法制備從法國的布列塔尼海岸收集新鮮的Chondrus crispus材料。將材料冷凍干燥，隨后被碾碎。將40g這種碾碎的材料懸浮在1000 m120mM的三乙醇胺緩沖液(pH＝7.3)中，在5℃下輕輕攪拌大約64小時(shí)，以2000×g離心10分鐘。上清液通過GF/A和GF/C玻璃濾器過濾，隨后通過45μm孔徑濾器過濾以獲得800ml具有相當(dāng)于每克制劑為0.44單位的葡糖氧化酶活性的己糖氧化酶活性的濾液?；钚缘臏y(cè)定用以下方法進(jìn)行。
將上清液施加于具有陰離子交換Q瓊脂糖Big Beads(死體積120ml)的330ml床體積的色譜柱上。結(jié)合的蛋白質(zhì)用在20mM TEA緩沖液(pH＝7.3)中含0-0.5M NaCl的梯度液洗脫，隨后用在20mM TEA緩沖液中的1M NaCl洗脫，收集流出的級(jí)分，每級(jí)分9ml組分，用以下分析方法對(duì)己糖氧化酶活性進(jìn)行分析。
合并具有己糖氧化酶活性的60-83級(jí)分(大約250ml)，經(jīng)超濾法濃縮和脫鹽后大約為25ml。向剩余物添加100 ml0.05 mM TEA，對(duì)其重復(fù)前步驟兩次。形成的25ml的剩余物每克具有0.95葡糖氧化酶活性單位。2.2.葡萄糖氧化酶活性的測(cè)定定義1葡糖氧化酶(GOD)單位相當(dāng)于在特定條件下每分鐘轉(zhuǎn)化1μmole葡萄糖的酶量。此活性以每克酶制劑的單位數(shù)表示。
試劑(i)緩沖液20g Na2HPO4-2H2O溶解在900ml蒸餾水中，pH調(diào)整到6.5；(ii)染色試劑(貯備溶液)200mg 2，6-二氯-苯酚-靛酚(西格馬No.D-1878)在劇烈攪拌1小時(shí)下溶解在1000ml蒸餾水中；(iii)過氧化物酶(貯備溶液)Boehringer Mannheim No.127 361，10,000單位溶解在10ml蒸餾水中，并添加4.2g硫酸銨；(iv)底物在緩沖液中的10％w/v D-葡萄糖溶液，(v)標(biāo)準(zhǔn)酶；得自Amano的水化酶#1423。
分析原理和方法葡萄糖被轉(zhuǎn)化成葡萄糖酸和H2O2，之后H2O2被過氧化物酶轉(zhuǎn)化成H2O和O2。產(chǎn)生的氧氣將藍(lán)色染料2，6-二氯-苯酚-靛酚氧化，使其變?yōu)樽仙?。?jīng)氧化的顏色于590nm進(jìn)行分光光度測(cè)定，相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算酶活性值。2.3.己糖氧化酶制劑對(duì)小麥面粉面團(tuán)中的硫醇基團(tuán)之間交聯(lián)作用的影響通過測(cè)量在面團(tuán)中游離的硫醇基團(tuán)的含量來研究己糖氧化酶制劑對(duì)硫醇基團(tuán)之間的交聯(lián)作用的影響，其中面團(tuán)由1500克小麥面粉，400Brabender單位(BU)的水，90g酵母，20g蔗糖和20g鹽混合，并在每千克面粉中分別添加0，100，250，875，1250單位上述己糖氧化酶制劑。基本依據(jù)Ellman(1958)比色法以及谷類化學(xué)雜志(1983，70，22-26)中所述的比色法進(jìn)行測(cè)定。這一方法基于的原則是5.5′-聯(lián)硫基-雙(2-硝基苯甲酸)-(DTNB)與面團(tuán)中硫醇基團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)形成深色的2-硝基-5-巰基-苯甲酸陰離子，可在412nm處由分光光度法測(cè)定。
假設(shè)在面團(tuán)中的硫醇基團(tuán)的量的相對(duì)變化由面團(tuán)中硫醇基團(tuán)和DTNB之間的反應(yīng)引起的光密度(OD)的變化反映，獲得了如下結(jié)果己糖氧化酶GOD單位/千克面粉 OD41200.297100 0.285250 0.265875 0.1871250 0.138這樣，本實(shí)驗(yàn)顯示OD明顯減少，表明游離硫醇基團(tuán)含量的減少與添加的己糖氧化酶活性的量成比例。2.4.添加己糖氧化酶對(duì)面團(tuán)流變特性的改進(jìn)根據(jù)AACC方法54-10以延伸儀對(duì)對(duì)添加或不添加相當(dāng)于每公斤面粉100單位己糖氧化酶活性的己糖氧化酶制劑的面團(tuán)進(jìn)行測(cè)定。不添加酶的面團(tuán)作為對(duì)照組。
上述方法的原則是在面團(tuán)形成之后，在30℃下分別放置45，90，135，180分鐘后接受負(fù)載-延伸試驗(yàn)，使用能記錄負(fù)載-延伸曲線的延伸儀進(jìn)行試驗(yàn)，負(fù)載-延伸曲線指示當(dāng)被拉伸時(shí)面團(tuán)的抗物理變形性能。從這條曲線中能夠計(jì)算出抗延伸性B(曲線的高度)和延伸性C(曲線的全長)。B/C比(D)是面粉面團(tuán)的烘烤強(qiáng)度的指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果匯于下表2.1中。表2.1每千克面粉補(bǔ)充了100GOD單位己糖氧化酶(HOX)的面團(tuán)的延伸儀測(cè)定試樣時(shí)間(分) B CD＝B/C對(duì)照 45 2301801.3HOX 45 3201801.8對(duì)照 90 2901611.8HOX 90 4501483.0對(duì)照 135 2901671.7HOX 135 4901463.4對(duì)照 180 3001681.8HOX 180 5001543.2從表中明顯看出，添加己糖氧化酶(HOX)對(duì)面團(tuán)的抗延伸性有改進(jìn)，這由B值的增加指示出來。幾乎達(dá)兩倍的B/C比值明顯反映出面粉的烘烤強(qiáng)度由于添加己糖氧化酶而顯著提高。
在類似的實(shí)驗(yàn)中，每千克面粉加入100單位市售的葡糖氧化酶產(chǎn)品，以相同的方式測(cè)定上述參數(shù)，以未加酶的面團(tuán)為對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表2.2所示表2.2每千克面粉補(bǔ)充了100 GOD單位葡萄糖氧化酶(GOX)的面團(tuán)的延伸儀測(cè)定試樣時(shí)間(分) B CD＝B/C對(duì)照45 2401801.3GOX 45 2901701.7對(duì)照90 2601751.5GOX 90 3601562.3對(duì)照135 2701711.6GOX 135 4201413.0當(dāng)比較上述兩種實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)，補(bǔ)充己糖氧化酶或補(bǔ)充葡糖氧化酶的面團(tuán)與對(duì)照之間的差異顯示己糖氧化酶比葡糖氧化酶有更強(qiáng)的加強(qiáng)效果。進(jìn)而，相對(duì)葡萄糖氧化酶，添加己糖氧化酶的B/C比增加的更快，這一點(diǎn)清楚地表明，與葡糖氧化酶相比，己糖氧化酶賦予焙烤強(qiáng)度更有效(

圖1)。實(shí)施例3從Chondrus criscus提取的己糖氧化酶的面團(tuán)改進(jìn)效果為了進(jìn)行這一實(shí)驗(yàn)，從丹麥的Hirsholmene海岸收獲新鮮的Chondruscrispus海草植物體。用兩個(gè)不同的抽提方法分離己糖氧化酶，合并兩種方法得到的物料用于下面的面團(tuán)改進(jìn)實(shí)驗(yàn)。3.1 Chondrus criscus I己糖氧化酶的純化新鮮的植物體954g用蒸餾水沖洗，用毛巾擦干并存儲(chǔ)在液氮中。用韋林氏滲合器混合海藻，將1908 m10.1 M磷酸鈉緩沖液、1M NaCl(pH6.8)添加到混合海藻中。在5℃持續(xù)攪拌4天提取混合物，隨后在20,000×g下將混合物離心30分鐘。
將形成的1910ml上清液(351.1U/ml)在B_chi旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀R110中于40℃下濃縮到440ml。濃縮液經(jīng)硫酸銨鹽析至25％。攪拌混合物30分鐘，在47,000×g下離心20分鐘。將上清液(395ml)以10mM三乙醇胺緩沖液(pH＝7.3)20升透析過夜，最后的體積為610ml(367.1U/ml)。
將上述610ml分兩次施加于在20mM TEA緩沖液(pH＝7.3)中平衡過的130ml Q-瓊脂糖FF的2.6×25cm柱。以平衡緩沖液洗柱，用在平衡緩沖液中含0到0.8M NaCl的梯度液800 ml洗脫結(jié)合蛋白質(zhì)。洗脫液流速為每分鐘4ml洗，收集流出級(jí)分，每級(jí)分12ml。收集具有己糖氧化酶活性的級(jí)分，合并至終體積為545ml(241.4U/ml)。3.2.Chondrus crispus II的己糖氧化酶的純化用蒸餾水沖洗1250g新鮮的植物體，用毛巾擦干并存儲(chǔ)于液氮中。用韋林氏摻合器將海藻混合，隨后添加2500ml的0.1M磷酸鈉緩沖液、1MNaCl(pH＝6.8)。在5℃持續(xù)攪拌4天提取混合物，隨后在20,000×g下將混合物離心30分鐘。
形成的2200ml上清液(332.8U/ml)在B_chi旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀R110中于40℃下濃縮到445ml。濃縮液經(jīng)硫酸銨鹽析至25％。攪拌混合物30分鐘，在47,000×g離心20分鐘。棄去沉淀。將上清液(380ml)以10mM三乙醇胺緩沖液(pH＝7.3)20升透析過夜，最后的體積為850 ml(319.2U/ml)。
將上述850ml施加于20m MTEA緩沖液(pH＝7.3)中平衡過的130ml Q-瓊脂糖FF 2.6×25cm柱。以平衡緩沖液洗柱，用在平衡緩沖液中含0到0.8M NaCl的梯度液800ml洗脫結(jié)合蛋白質(zhì)。洗脫液流速為每分鐘4ml，收集流出級(jí)分，每級(jí)分12ml。收集具有己糖氧化酶活性的級(jí)分，合并終體積為288ml。
上述步驟得到的存留液施加于具有185ml金屬螯合瓊脂糖FF(載有Ni2+)和在50mM磷酸鈉、1M NaCl(pH＝7.4)中平衡過的2.6×31cm柱。用在平衡緩沖液中含0到35mM咪唑的740ml梯度液(pH＝4.7)洗脫結(jié)合蛋白質(zhì)。洗脫液流速為2ml/分鐘，收集流出的級(jí)分，每級(jí)分11ml。合并41-54級(jí)分(140ml，352.3 U/ml)。一些己糖氧化酶確實(shí)通過了柱。3.3.提取物的合并和濃縮過柱的和從純化II得來的140ml以及從純化I得來的545ml合并成終體積為1120ml(303.6 U/ml)。將1120ml循環(huán)蒸發(fā)至210ml的體積，隨后以10mM三乙醇胺緩沖液(pH＝7.3)20升透析過夜，最后的體積為207ml(1200.4U/ml)。3.3.1陰離子交換步驟從上述步驟形成的存留液施加于在20mM三乙醇胺緩沖液(pH＝7.3)中平衡過的130ml Q-瓊脂糖FF的2.6×25cm柱上。以平衡緩沖液洗柱，用在平衡緩沖液中含0到0.8M NaCl的梯度液800ml洗脫結(jié)合蛋白質(zhì)。洗脫液流速為每分鐘4ml，收集流出的級(jí)分，每級(jí)分12ml。收集并合并具有己糖氧化酶活性的(260m1764.1U/ml)30-50級(jí)分。3.3.2其它酶的活性對(duì)上述合并的溶液進(jìn)行以下酶的活性試驗(yàn)過氧化氫酶，蛋白酶，木聚糖酶，α-和β-淀粉酶和脂酶。在溶液中沒有發(fā)現(xiàn)這些酶的活性。3.4添加己糖氧化酶對(duì)面團(tuán)流變特性的改進(jìn)由小麥面粉、水和鹽制備面團(tuán)，每公斤面粉分別添加0、72、216、360單位上述己糖氧化酶制劑。以沒有添加酶的面團(tuán)為對(duì)照組。此外，制備兩種面團(tuán)，其中每千克面粉分別添加216和360單位Gluzyme(一種葡糖氧化酶，可從丹麥的Novo Nordisk A/S買到)。
按照上述AACC法54-10的修改方法對(duì)面團(tuán)進(jìn)行延伸儀測(cè)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果匯于下面表3.1中。表3.1補(bǔ)充己糖氧化酶(HOX)或葡萄糖氧化酶(單位/千克面粉)的面團(tuán)延伸儀測(cè)定結(jié)果試樣 時(shí)間B CD＝B/C(分)對(duì)照45 2501581.6HOX72 U/千克45 3301562.1HOX 216 U/千克 45 4601533.0HOX 360 U/千克 45 5801304.5Gluzyme 72 U/千克 45 3501592.2Gluzyme 216 U/千克 45 3401482.3Gluzyme 360 U/千克 45 4801573.1對(duì)照90 2901641.8HOX 72 U/千克 90 4701453.2HOX 216 U/千克 90 6501424.6HOX 360 U/千克 90 8701167.5Gluzyme 72 U/千克 90 4501473.1Gluzyme 216 U/千克 90 4801383.5Gluzyme 360 U/千克 90 5001523.2對(duì)照1353301562.1HOX 72 U/千克 1355401294.2HOX 216 U/千克 1357501256.0HOX 360 U/千克 1358801177.5Gluzyme 72 U/千克 1355101363.8Gluzyme 216 U/千克 1355501224.5Gluzyme 360 U/千克 1355601214.6從表中明顯看出明，添加己糖氧化酶(HOX)或葡萄糖氧化酶對(duì)面團(tuán)的抗延伸性有改進(jìn)，這由B值的增加指示出來。B/C比值的增加明顯表示面粉的烘烤的強(qiáng)度由于酶的添加而顯著提高。
己糖氧化酶比葡糖氧化酶有更強(qiáng)的加強(qiáng)作用也是明顯的。此外，相對(duì)葡萄糖氧化酶而言，添加己糖氧化酶的B/C比增加得更快，這一點(diǎn)清楚的表明，與葡糖氧化酶相比，己糖氧化酶賦予焙烤強(qiáng)度更有效。實(shí)施例4從Chondrus crispus提取的己糖氧化酶的面團(tuán)改進(jìn)作用4.1.Chondrus crispus己糖氧化酶的純化在法國的布列塔尼海岸收集新鮮的Chondrus crispus材料。2285g新鮮的植物體以蒸餾水沖洗，以毛巾擦干并被存儲(chǔ)在液氮中。用韋林氏摻合器將海藻混合，隨后加入0.1M的磷酸鈉緩沖液4570ml、1MNaCl(pH＝6.8)?；旌衔镌?℃，持續(xù)用電磁攪拌器攪拌4天進(jìn)行提取，隨后在20,000×g下離心30分鐘。
形成的4930ml上清液(624.4U/ml)在B_chi旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀R110中于40C下濃縮到1580ml。濃縮液經(jīng)聚乙二醇(PEG)分級(jí)沉淀得3％(w/v)。攪拌混合物30分鐘，在47,000×g離心30分鐘，棄去沉淀。將1470ml(2118.7U/ml)上清液經(jīng)PEG分級(jí)沉淀到24％。攪拌混合物30分鐘，并在47,000×g離心30分鐘，棄去上清液，將414.15g沉淀再懸浮在200ml 20mMTEA緩沖液(pH＝7.3)中，隨后在5℃下以20升10mM TEA緩沖液(pH＝7.3)透析過夜。
透析之后的體積為650ml(2968.6 U/ml)。將懸浮液在20,000×g下離心30分鐘。棄去沉淀，上清液以蒸餾水稀釋成為3200ml。
將上述3200ml(829.9U/ml)施加于在20mMTEA緩沖液(pH＝7.3)中平衡過的1100ml Q-瓊脂糖FF的10×14cm柱中。以平衡緩沖液洗柱，用在平衡緩沖液中含0到0.8M NaCl的梯度液15000ml洗脫結(jié)合蛋白質(zhì)。洗脫液流速為每分鐘50ml。一些己糖氧化酶確實(shí)通過了柱，收集之，體積為840ml。
用硅藻土處理840ml懸液，并濃縮至335ml(2693.3 U/ml)。
將上述335ml施加于3升Sephadex G25C 10×40cm脫鹽柱。柱用20mMTEA緩沖液(pH＝7.3)平衡，以100ml/分鐘的流速洗脫，收集970ml洗脫液。將洗脫液施加于在20mM TEA緩沖液(pH＝7.3)中平衡過的1100mlQ-瓊脂糖FF的10×14cm 柱上。以平衡緩沖液洗滌柱，用在平衡緩沖液中含0到0.8MNaCl的梯度液15000ml洗脫結(jié)合蛋白質(zhì)。洗脫液流速為50ml/分鐘。己糖氧化酶確實(shí)通過了柱，收集之，體積為1035ml。
向上述洗脫液(1035ml)加入硫酸銨使終濃度為2M。將混合物分兩次施加于在25mM磷酸鈉緩沖液(pH＝6.3)和2M(NH4)2SO4中平衡過的200ml苯基瓊脂糖凝膠HP的5×10cm柱。以平衡緩沖液洗柱，隨后用在25mM的磷酸鈉緩沖液中含2到0M的(NH4)2SO4梯度液5000ml以50ml/分的速度洗脫結(jié)合蛋白質(zhì)。分別在第一和第二次中收集洗脫液500和29ml。合并具有己糖氧化酶活性的第一次中的級(jí)分5和第二次中的級(jí)分27-42，共1050ml(563.9 U/ml)。
上述合并液用3升SephadexG25C凝膠過濾柱脫鹽。柱以20mM TEA緩沖液(pH 7.3)平衡并以100ml/分鐘的速度洗脫，收集1,000ml洗脫液。
將1,000ml洗脫液濃縮成202ml(2310.2 U/ml)，將這一制劑用于下面的流變性能檢驗(yàn)。4.2.添加己糖氧化酶對(duì)面團(tuán)流變特性的改進(jìn)由小麥面粉、水和鹽制備面團(tuán)，每公斤面粉分別添加0、288、504、720單位的氧化還原酶制劑。以不添加酶的面團(tuán)為對(duì)照。此外，兩種面團(tuán)分別添加288和504單位/千克面粉的Gluzyme(一種葡糖氧化酶，可從丹麥的Novo Nordisk A/S買到)。
按照上述AACC法54-10之修改方法對(duì)面團(tuán)進(jìn)行延伸儀測(cè)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果匯于下面表4.1中。表4.1補(bǔ)充己糖氧化酶(HOX)或葡萄糖氧化酶(單位/千克面粉)的面團(tuán)的延伸儀測(cè)定結(jié)果樣品 時(shí) 間BC D＝B/C(分)對(duì)照45210 171 1.2HOX 288 U/千克 45490 139 3.5HOX 504 U/千克 45640 122 5.2HOX 720 U/千克 45730 109 6.7Gluzyme 288 U/千克 45350 165 2.1Gluzyme 504 U/千克 45385 153 2.5Gluzyme 720 U/千克 45435 148 2.9對(duì)照90275 182 1.5HOX 288 U/千克 90710 130 5.5HOX 504 U/千克 90825 106 7.8HOX 72 0 U/千克 90905 107 8.5Gluzyme 288 U/千克 90465 153 3.0Gluzyme 504 U/千克 90515 135 3.8Gluzyme 720 U/千克 90540 140 3.9對(duì)照135 280 175 1.6HOX 288 U/千克 135 745 102 7.3HOX 504 U/千克 135 920 94 9.8HOX 720 U/千克 13580Gluzyme 288 U/千克 135 525 129 4.1Gluzyme 504 U/千克 135 595 129 4.6Gluzyme 720 U/千克 135 630 121 5.2從表中明顯地看出，添加己糖氧化酶(HOX)或葡萄糖氧化酶面團(tuán)的抗延伸性有改進(jìn)，這由B值的增加指示出來。這也從B/C值的增加反映出來。
己糖氧化酶比葡糖氧化酶有更強(qiáng)的加強(qiáng)效果，兩種酶的增強(qiáng)作用與所添加的酶量成比例，也是明顯的。此外，相對(duì)葡萄糖氧化酶，添加己糖氧化酶的B/C比增加得更快，這一點(diǎn)清楚的表明，與葡糖氧化酶相比，己糖氧化酶賦予焙烤強(qiáng)度更有效。實(shí)施例5從Chondrus criscus提取的己糖氧化酶對(duì)面包比容的改進(jìn)效果5.1 Chondrus crispus己糖氧化酶的純化從法國的布列塔尼海岸收集新鮮的Chondrus crispus材料。將2191g新鮮的植物體用蒸餾水沖洗，以毛巾擦燥并被存儲(chǔ)在液氮中。用韋林氏摻合器將海藻混合，隨后加入0.1M的磷酸鈉緩沖液4382ml，1MNaCl(pH＝6.8)。持續(xù)以電磁攪拌器攪拌下，于5℃提取混合物4天，隨后在20,000×g下離心20分鐘。
將形成的4600ml上清液(746.1U/ml)在B_chi旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀R110中在40℃下濃縮到850ml。濃縮液經(jīng)聚乙二醇分級(jí)沉淀得3％(w/v)。攪拌混合物30分鐘，在20,000×g離心30分鐘。棄去沉淀。將705ml(2489.8 U/ml)上清液經(jīng)PEG分級(jí)沉淀得25％。攪拌混合物30分鐘，并在20,000×g離心30分鐘。棄去上清液，將341g沉淀再懸浮在225m120mM TEA緩沖液(pH＝7.3)中，該懸浮液500ml在3升SebhadexG25C 10×40cm脫鹽柱上脫鹽。柱用20mM TEA緩沖液(pH＝7.3)平衡，以100ml/分鐘的流速洗脫，收集1605ml洗脫液。
向上述洗脫液(687.5 U/ml)中加入硫酸銨，使終濃度為2M。將混合物分兩次施加于在25mM磷酸鈉緩沖液(pH＝6.3)、2M(NH4)2SO4中平衡過的200ml苯基瓊脂糖凝膠HP5×10cm柱。以平衡緩沖液洗柱，隨后用在25mM磷酸鈉緩沖液中含2到0M(NH4)2SO4的梯度液5000ml以50ml/分的速度洗脫結(jié)合蛋白質(zhì)。收集流出的級(jí)分，每級(jí)分29ml。合并具有己糖氧化酶活性的第一次中的85-105級(jí)分和第二次中的36-69級(jí)分，共1485ml(194.7U/ml)。
上述合并液用Sephadex G25C凝膠過濾柱脫鹽。柱以20mM TEA緩沖液(pH 7.3)平衡，并以100ml/分鐘的速度洗脫，收集1,200ml洗脫液。
將1,200ml洗脫液濃縮成685ml(726.2 U/ml)，以此制劑用于下面的焙烤試驗(yàn)。5.2面團(tuán)中添加己糖氧化酶對(duì)面包比容的改進(jìn)以1500g面粉、90g酵母、24g鹽、24g食糖和400 BU水制備面團(tuán)，每千克面粉分別添加0或108單位上述經(jīng)純化的己糖氧化酶和108單位Gluzyme(葡糖氧化酶在丹麥Novo Nordisk買到)。面團(tuán)在Hobart混合器中混合2+9分鐘(26℃下)，將其分為兩部分，隨后在加熱箱中30℃靜置10分鐘，以Fortuna 3/17/7成型，在34℃和RH＝85％條件下醒發(fā)45分鐘。醒發(fā)后的面團(tuán)在Bago烤箱中用12sec.蒸汽在220℃下烘烤17分鐘。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果匯于下表5.1中表5.1補(bǔ)充了己糖氧化酶或葡糖氧化酶(單位/千克面粉)的面團(tuán)制得的面包比容的改進(jìn)總體積 總重量 比容對(duì)照 532510275.18己糖氧化酶108U/千克 665010366.41Gluzyme108U/千克6075 10305.89從上表可以明顯看出，添加己糖氧化酶或葡糖氧化酶對(duì)重量基本相同的面團(tuán)制的面包的總體積有增加作用。這反映在與沒有加酶的焙烤的面包相比，比容的增加。
表中也可明顯地看出，在相同用量下，己糖氧化酶比葡糖氧化酶對(duì)比容有更明顯的增加效果。實(shí)施例6提純的己糖氧化酶的鑒定以上純化的己糖氧化酶制劑鑒定己糖氧化酶。6.1.在非變性PAGE后對(duì)己糖氧化酶活性進(jìn)行染色按照制造廠商的指導(dǎo)(Novex，San Diego，USA)，用預(yù)制的8-16％的Tris-甘氨酸Novex凝膠以原態(tài)PAGE對(duì)己糖氧化酶活性進(jìn)行分析。電泳后，凝膠在包含50mM磷酸鈉緩沖液(pH＝6.0)、100mM葡萄糖、50mg/l吩嗪甲硫酸鹽(西格馬P9625)和250mg/l氮藍(lán)四唑(西格馬N6876)(如Witteveen，C.F.B.1993在博士論文中描述的″在黑曲霉中的葡糖酸鹽形成和多元醇代謝)的溶液中溫育，對(duì)凝膠進(jìn)行己糖氧化酶活性染色。在大約30分鐘后可看出呈彼此靠近的雙色帶的己糖氧化酶活性。當(dāng)己糖氧化酶原態(tài)PAGE銀染時(shí)，也看見相同的雙色帶。利用原態(tài)PAGE測(cè)定的純化己糖氧化酶的分子量為144KD。將凝膠的一半銀染，另一半為活性染色。所用的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)為牛血清白蛋白(67 KD)，乳酸脫氫酶(140 kD)，過氧化氫酶(232 kD)，鐵蛋白(440 kD)和甲狀腺球蛋白(669 kD)。6.2利用SDS-PAGE測(cè)定分子量分子量也可由以上描述的第一次施加于原態(tài)PAGE上的物質(zhì)測(cè)定，在活性染色，將己糖氧化酶色帶從凝膠中割離，然后按照制造廠商建議用Electro-Eluter(422型，Bio-Rad，CA，USA)進(jìn)行電洗脫。將經(jīng)電洗脫的蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE和銀染色。這種物質(zhì)在SDS-PAGE凝膠中約70 kDa處呈現(xiàn)“一條”雙色帶。因此經(jīng)電洗脫的己糖氧化酶是兩個(gè)亞單位的二聚體。6.3己糖氧化酶的pI的測(cè)定含己糖氧化酶活性的試樣按照制造商的推薦(Novex，San Diego，US)采用預(yù)制3-10IEF凝膠的等電點(diǎn)聚焦(IEF)法進(jìn)行分析。在電泳后，一半的凝膠被銀染，其另一半以氮藍(lán)四唑染色(如6.1描述的)。
經(jīng)染色的己糖氧化酶成為雙色帶。第一帶的pI是4.79，第二帶的pI是4.64。所用的標(biāo)準(zhǔn)為胰蛋白酶原(9.30)，小扁豆凝集素堿性帶(8.65)，小扁豆凝集素中間帶(8.45)，小扁豆凝集素酸性帶(8.15)，馬肌紅蛋白酸性帶(6.85)，人碳酸酐酶B(5.85)，β-乳球蛋白(5.20)，大豆胰蛋白酶抑制劑(3.50)和淀粉葡糖苷酶(3.50)。6.4測(cè)定己糖氧化酶對(duì)不同糖的Km根據(jù)1.2.3所述，對(duì)7種不同的糖測(cè)定己糖氧化酶的Km。結(jié)果匯于表6.1中。表6.1測(cè)定己糖氧化酶的Km對(duì)不同糖底物Km(mM)CV(mM)D-葡萄糖 2.7 0.7D-半乳糖 3.6 1纖維素二糖20.27.8麥芽糖43.75.6乳糖 90.320.6木糖 102 26阿糖 531 158(CV＝變異系數(shù))6.5己糖氧化酶肽序列的測(cè)定將6.2中的電洗脫混合物50μl懸浮在450μl 0.1％的三氟乙酸(TFA)中。
為去掉Tris、甘氨酸和SDS，將上述混合物在反相HPLC上進(jìn)行層析。形成的溶液分九次施加于在0.1％三氟乙酸中平衡過的4.6×30cm的Brownlee C2柱上。以平衡緩沖液洗柱，以0.7ml/分鐘的流速用0.1％的TFA中含10至80％乙腈的14ml梯度液洗脫結(jié)合肽；收集含有酶最大峰值的級(jí)分，冷凍干燥之。6.5.1內(nèi)切蛋白酶Lys-C消化將形成的凍干酶溶解在50μl 8M尿素、0.4 M NH4HCO3(pH＝8.4)中。通過添加5μl 45mM二硫蘇糖醇，并于50℃置于N2氣氛中15分鐘進(jìn)行蛋白質(zhì)的變性和還原。將溶液冷卻到室溫并加入5μl 100mM碘乙酰胺，在室溫?zé)o光有N2的條件下，將半胱氨酸衍生化15分鐘。其后，將溶液懸浮在135μl水中，于37℃在N2下，添加溶于5μl水中的5μg內(nèi)切蛋白酶Lys-C進(jìn)行消化24小時(shí)。于-20℃冷凍反應(yīng)混合物以終止反應(yīng)。6.5.2肽的反相HPLC分離在VYDAC C18 0.46×15cm柱(The Separation Group，CA，美國)上以溶劑A(水中0.1％的TFA)和溶劑B(在乙腈中的0.1％的TFA)經(jīng)反相HPLC分離形成的肽。6.5.3肽測(cè)序按照制造商的說明，在應(yīng)用生物系統(tǒng)476A測(cè)序儀(應(yīng)用生物系統(tǒng)，CA，美國)上利用脈沖-液態(tài)快速循環(huán)進(jìn)行測(cè)序。鑒定出具有以下氨基酸序列的肽D P G Y I V I D V N A G T P D K P D P。
權(quán)利要求
1.一種改進(jìn)面粉面團(tuán)的流變性質(zhì)和由該面團(tuán)制得的成品品質(zhì)的方法，該方法包括在面團(tuán)成分、面團(tuán)添加劑或面團(tuán)中加入有效量的至少能夠使麥芽糖氧化的氧化還原酶。
2.按照權(quán)利要求1的方法，其中氧化還原酶是己糖氧化酶。
3.按照權(quán)利要求2的方法，其中己糖氧化酶得自選自藻類品種、植物品種和微生物品種的來源。
4.按照權(quán)利要求3的方法，其中己糖氧化酶得自Chondrus crispus。
5.按照權(quán)利要求2的方法，其中己糖氧化酶的添加量范圍是每千克面粉1至10,000單位。6.按照權(quán)利要求5的方法，其中己糖氧化酶的添加量范圍是每千克面粉10至1000單位。
7.按照權(quán)利要求1或2的方法，其中以AACC法54-10測(cè)定的抗延伸性(曲線的高度，B)和延伸性(曲線的長度，C)之比(即B/C比)來表示的面團(tuán)的抗延伸展性，相對(duì)于不含氧化還原酶的其它類似面團(tuán)增加至少10％。
8.按照權(quán)利要求1的方法，其中成品是面包。
9.按照權(quán)利要求1的方法，其中成品是面條制品。
10.按照權(quán)利要求1的方法，其中成品是營養(yǎng)面食制品。
11.按照權(quán)利要求1的方法，其中至少將一種其它酶添加到面團(tuán)成分、面團(tuán)添加劑或面團(tuán)中。
12.按照權(quán)利要求11的方法，其中所說的其它酶選自纖維素酶、半纖維素酶、木聚糖酶、淀粉降解酶、葡糖氧化酶、脂酶和蛋白酶。
13.一種面團(tuán)改進(jìn)組合物，該組合物包含一種至少能夠氧化麥芽糖的氧化還原酶，和至少一種其它面團(tuán)成分或面團(tuán)添加劑。
14.按照權(quán)利要求13的組合物，其中氧化還原酶得自選自藻類品種、植物品種和微生物品種的來源。
15.按照權(quán)利要求14的組合物，其中氧化還原酶是己糖氧化酶。
16.按照權(quán)利要求15的組合物，其中己糖氧化酶得自Chondruscrispus。
17.按照權(quán)利要求13的組合物，其是一種用于制備焙烤制品或者制備面條制品或營養(yǎng)面食制品的預(yù)混合物。
18.按照權(quán)利要求13的組合物，其包含選自乳化劑和親水膠體的添加劑。
19.按照權(quán)利要求18的組合物，其中親水膠體選自藻酸鹽、角叉菜膠、果膠和植物膠。
20.一種制備焙烤食品的方法，該方法包括制備于其中添加了有效量的至少能夠使麥芽糖氧化的氧化還原酶的面團(tuán)并烘烤該面團(tuán)。
21.按照權(quán)利要求20的方法，其中焙烤食品的比容與以不含氧化還原酶的面團(tuán)制備的其它類似焙烤食品相比，有所增加。
22.按照權(quán)利要求21的方法，其中比容增加至少20％。
23.按照權(quán)利要求20的方法，其中將至少一種其它酶添加到面團(tuán)中。
24.按照權(quán)利要求20的方法，其中所說的其它酶選自纖維素酶、半纖維素酶、木聚糖酶、淀粉降解酶、葡糖氧化酶、脂酶和蛋白酶。
25.按照權(quán)利要求20的方法，其中氧化還原酶是己糖氧化酶。
26.一種制備以面粉面團(tuán)為基料的食品的方法，該方法包括向面團(tuán)中加入有效量的氧化麥芽糖的氧化還原酶。
27.按照權(quán)利要求26的方法，其中氧化還原酶是己糖氧化酶。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種改進(jìn)面團(tuán)的流變性質(zhì)和由這種面團(tuán)得到的成品的品質(zhì)的方法,該方法包括添加有效量的能氧化麥芽糖的氧化還原酶,特別是己糖氧化酶,例如從藻類品種(如Iridophyclus flaccidum,Chondrus crispus或Euthora cristata)分離出的己糖氧化酶;本發(fā)明也提供了包含所說的氧化還原酶的面團(tuán)改進(jìn)組合物。
文檔編號(hào)A23L1/16GK1190871SQ9619557
公開日1998年8月19日 申請(qǐng)日期1996年6月4日 優(yōu)先權(quán)日1995年6月7日
發(fā)明者J·B·西, C·H·潑爾森, P·B·霍斯特魯普 申請(qǐng)人:丹尼司可公司