專利名稱：利用異檸檬酸裂合酶活性被改變的微生物制備核黃素的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及核黃素的一種微生物制備方法，其中該微生物含活性被改變的異檸檬酸裂合酶。
維生素B2，亦稱核黃素，是人和動(dòng)物體的必需成分。維生素B2缺乏會(huì)導(dǎo)致口腔和咽部黏膜炎癥、口角裂口、皮膚皺褶處發(fā)癢和炎癥及類似的皮膚損傷、結(jié)膜炎、視敏度下降和角膜渾濁。嬰幼兒中可能發(fā)生生長(zhǎng)停滯和體重下降。因此維生素B2作為一種用于維生素缺乏和食品添加劑的維生素制劑具有特別的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。另外，它亦用做食品染色劑，例如蛋黃醬，冰激凌，餐末點(diǎn)心如牛奶凍中等等。
核黃素可以化學(xué)制備或微生物制備。在化學(xué)制備方法中，核黃素常作為一種純凈的終產(chǎn)物經(jīng)多步程序得到，其中需要使用相對(duì)昂貴的起始化合物，例如D-核糖。
應(yīng)用微生物制備核黃素提供了化學(xué)制備這種化合物的一種替代途徑?？稍偕脑牧希缰参镉皖?，可以用做微生物合成的起始化合物。
通過發(fā)酵真菌如棉阿舒囊霉(Ashbya gossypii)或阿舒假囊酵母(Eremothecium ashybii)制備核黃素已有公開報(bào)道(默克索引(The MerckIndex)，Windholz等編，Merck & Co.，1183頁(yè)，1983)；然而酵母，如念珠菌屬和酵母屬，和細(xì)菌，如梭狀芽胞桿菌亦適合制造核黃素。過量產(chǎn)生核黃素的菌株已被描述過，如在EP 405370中就談到可以通過轉(zhuǎn)化來自枯草芽孢桿菌的核黃素生物合成基因而得到它們。然而，這些原核基因不適合于用真核生物如釀酒酵母或棉阿舒囊霉制備核黃素的重組方法。
WO 93/03183描述的是從真核生物如釀酒酵母克隆核黃素生物合成特異性基因。這些基因可用來構(gòu)建重組真核微生物使其有效地生成核黃素。
然而常常是因?yàn)槠鹗蓟衔锖秃它S素生物合成酶的底物在微生物體內(nèi)數(shù)量有限，導(dǎo)致盡管核黃素生物合成活性增加，核黃素產(chǎn)量并不高。
因此本發(fā)明的目的即提供一種改良的制備核黃素的微生物方法，這種方法應(yīng)用那些無底物限制或僅有輕微底物限制的微生物，從而使核黃素以更高的速率生產(chǎn)出來。
依據(jù)本發(fā)明，通過改變所用微生物體內(nèi)的內(nèi)源性異檸檬酸裂合酶活性，已經(jīng)達(dá)到以上目的。這種活性改變可以與未改變活性的起始株比較得到測(cè)定。有很大范圍的選擇自由來得到ICL活性改變的微生物。
一種選擇是改變內(nèi)原性ICL基因，使其編碼的酶與起始酶相比ICL活性增加。增加酶活性可以通過，如改變催化中心而增加底物轉(zhuǎn)化，消除酶抑制劑影響，而達(dá)到目的。也可以增加酶本身的合成來增加酶活性，例如通過基因擴(kuò)增或通過消除抑制酶生物合成的因素。內(nèi)源性ICL活性增加優(yōu)選通過促使內(nèi)源性ICL基因突變而完成。這種性質(zhì)的突變可以是采用標(biāo)準(zhǔn)方法，如紫外線照射或致突變的化學(xué)物質(zhì)引起的隨機(jī)突變；也可以是采用基因工程方法，如缺失，插入，或取代引起的特異性突變。
ICL基因表達(dá)的增強(qiáng)可以通過增加ICL基因的拷貝數(shù)和/或增強(qiáng)對(duì)ICL基因表達(dá)起正性調(diào)節(jié)的調(diào)控因子。這樣，調(diào)控因子優(yōu)選可在轉(zhuǎn)錄水平通過使用強(qiáng)轉(zhuǎn)錄信號(hào)如啟動(dòng)子和增強(qiáng)子來增強(qiáng)。然而，也可例如通過提高mRNA的穩(wěn)定性來增強(qiáng)翻譯。為了增加基因拷貝數(shù)，ICL基因可以摻入一個(gè)基因組建物或載體中，此基因組建物或載體優(yōu)選含一個(gè)可作用于ICL基因的調(diào)控基因序列，特別用來增強(qiáng)基因表達(dá)。然后，用此含ICL基因的基因組建物轉(zhuǎn)化產(chǎn)生核黃素的微生物。
優(yōu)選從微生物中分離ICL基因，尤其是從真菌棉阿舒囊霉。然而其他生物，若其細(xì)胞內(nèi)含有乙醛酸循環(huán)的回補(bǔ)序列，因而含異檸檬酸裂合酶，植物也一樣，都適合從中分離ICL基因。分離ICL基因可以通過與ICL基因中的缺損突變體同源或異源互補(bǔ)，或異源探針，或用異源引物進(jìn)行PCR而完成。關(guān)于亞克隆，互補(bǔ)質(zhì)粒中插入子的大小可以通過適宜的限制酶酶切而減到最小。此推定基因經(jīng)測(cè)序和確認(rèn)后，通過融合PCR的方法，以精確的裝配方式被亞克隆。所得片段以插入子形式插入質(zhì)粒中。攜帶該片段的質(zhì)粒導(dǎo)入ICL基因缺陷突變體，然后檢測(cè)該突變體中ICL基因發(fā)揮功能的能力。最后，功能性組建物被用來轉(zhuǎn)化核黃素生產(chǎn)菌。
分離和測(cè)序后，可以得到異檸檬酸裂合酶基因。此基因含有編碼SEQ IDNO2給出的氨基酸序列或其等位變體的核苷酸序列。等位變體特別包括功能性衍生物，它們可由缺失、插入、取代SEQ ID NO1所示序列中的核苷酸而得到，不過仍然保留ICL活性。
一個(gè)具有SEQ ID NO1176-550核苷酸之核苷酸序列的啟動(dòng)子或一個(gè)具有基本同樣效應(yīng)的DNA序列被刻意放在異檸檬酸裂合酶基因上游。這樣，位于該基因上游的啟動(dòng)子能夠通過一個(gè)或多個(gè)核苷酸取代，或(一個(gè))多個(gè)插入和/或缺失與含指定核苷酸序列的啟動(dòng)子有所區(qū)別，但是此啟動(dòng)子的功能和效用不受損傷。而且，此啟動(dòng)子的效用可通過改變序列得到加強(qiáng)，或完全被更有效的啟動(dòng)子取代。
進(jìn)一步講，多個(gè)特別增加ICL基因活性的調(diào)節(jié)性基因序列或調(diào)控基因可被指定給ICL基因。因此，增強(qiáng)子可被指定給ICL基因，其通過增加RNA聚合酶和DNA的相互作用增強(qiáng)ICL基因的表達(dá)。
一個(gè)或多個(gè)DNA序列可被置于異檸檬酸裂合酶基因上游和/或下游，可伴有或不伴有上游啟動(dòng)子和/或調(diào)節(jié)基因，而使異檸檬酸裂合酶基因包含在一個(gè)基因結(jié)構(gòu)中。
通過克隆ICL基因，有可能得到含ICL基因且如上文提到適于轉(zhuǎn)化核黃素生產(chǎn)菌的質(zhì)粒或載體。那些通過轉(zhuǎn)化得到的細(xì)胞，優(yōu)選棉阿舒囊霉中，含有可復(fù)制基因，也就是說在染色體中有額外的相同拷貝。這些基因拷貝可通過同源重組整合在基因組任何想要的位點(diǎn)，和/或在質(zhì)?；蜉d體中。
產(chǎn)生ICL活性改變的生產(chǎn)微生物的另一選擇是制造那些耐受抑制ICL活性物質(zhì)的微生物，并把它們選擇出來。異檸檬酸裂合酶(ICL)抑制劑已為技術(shù)人員所知，并列舉在如《酶抑制劑手冊(cè)》(Handbook of EngymeInbibitors)第291頁(yè)，編者Hellmut Zollner，Verlag Chemie，Weinheim，1993.特別合適的抑制劑是磷酸烯醇丙酮酸(PEP)，6-磷酸-葡萄糖酸和馬來酸，尤其是衣康酸和草酸。
如果生產(chǎn)核黃素的微生物株在以上抑制劑存在的情況下培養(yǎng)，會(huì)令人吃驚地出現(xiàn)核黃素合成抑制。在培養(yǎng)板上，這可以通過形成不變黃色而仍保持白色的菌落得到顯示。所以應(yīng)用此系統(tǒng)，那些耐受異檸檬酸裂合酶抑制菌株可以迅速被辨認(rèn)出來。因?yàn)檫@些菌株在抑制劑存在的情況下也能生產(chǎn)核黃素，從而形成黃色的菌落。這種性質(zhì)的菌株可以通過自發(fā)突變形成，也可以通過常規(guī)方法如化學(xué)方法或紫外線照射誘導(dǎo)出的合適突變形成。如此就有可能得到向培養(yǎng)基分泌更多量核黃素的微生物株。具體得到的核黃素合成增加的抗性株是棉阿舒囊霉菌株，該菌株以保藏號(hào)10067保藏在DSM[德國(guó)微生物保藏中心]。
這種新穎方法優(yōu)選選用真菌作為微生物。合適的真菌例子列舉在《印度化學(xué)工程》(Indian Chem.Engr.)，B部，37卷，第1，2號(hào)(1995)第15頁(yè)表6中。
那些屬于皮契茄屬、假囊酵母屬和阿舒囊霉屬，尤其是棉阿舒囊霉的微生物是特別合適的。
然而，除真菌以外的微生物，例如細(xì)菌，尤其是在《印度化學(xué)工程》，B部，137卷，1，2號(hào)(1995)第16頁(yè)表6中列出的細(xì)菌，也可以使用。
實(shí)施例1棉阿舒囊霉基因組文庫(kù)的構(gòu)建用Wright和Philippsen方法(1991，基因(Gene)10999-105)分離染色體DNA用來構(gòu)建基因組DNA文庫(kù)。DNA先用Sau 3A不完全消化，再用蔗糖密度梯度分級(jí)分離。最長(zhǎng)的片段(圖4)與Bam HI切割的大腸桿菌/釀酒酵母菌穿梭質(zhì)粒YEp352(J.E.Hill等，1993，酵母(Yeast)2；163-167)連接。用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a。在含氨芐青霉素和X-Gal的平板上，3600個(gè)可辨認(rèn)的白色克隆被分離出來。它們被認(rèn)為是因?yàn)楹袛y帶插入片段的質(zhì)粒而呈白色的。當(dāng)隨機(jī)挑選其中30個(gè)克隆來研究時(shí)，發(fā)現(xiàn)它們的確都含有質(zhì)粒。這些質(zhì)粒含有7-8Kb的插入片段，并且這些插入片段并不相同。這些情況從限制性酶切圖譜上看一目了然。基于棉阿舒囊霉基因組有7X103Kb大小，因此每一個(gè)基因都存在于此基因文庫(kù)中的幾率是97％-99.99％。每100個(gè)克隆在瓊脂平板上大量劃線培養(yǎng)，所含質(zhì)粒隨后制備成庫(kù)。結(jié)果該基因文庫(kù)包含了36個(gè)質(zhì)粒庫(kù)。
實(shí)施例2基因文庫(kù)中攜帶ICL1片段的挑選基因文庫(kù)中的質(zhì)粒制品被用來轉(zhuǎn)化釀酒酵母ICL1dura3(fs)(E.Fernandez等，1992，歐洲生化期刊(Eur.J.Biochem.)，204983-990)。該突變株本身的ICL1基因遭到破壞，ura3基因在本身的閱讀框架上也存在突變。由于這樣的基因型，此株不能以乙醇作為碳源生長(zhǎng)從而表現(xiàn)尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷。第一步，被基因文庫(kù)轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞在葡萄糖為其唯一碳源的基本培養(yǎng)基上篩選。由于ura3基因存在于質(zhì)粒中，僅有那些吸收了質(zhì)粒的細(xì)胞能夠生長(zhǎng)。這是因?yàn)榛九囵B(yǎng)基內(nèi)不含任何尿嘧啶。這一步得到了1900個(gè)克隆。這些克隆通過復(fù)制鋪板轉(zhuǎn)移到含乙醇作為唯一碳源的基本培養(yǎng)基上。由于異檸檬酸裂合酶(一種回補(bǔ)酶)是在菌株靠乙醇生長(zhǎng)時(shí)無條件需要的，因此僅那些所含質(zhì)粒攜帶了ICL基因的克隆能夠生長(zhǎng)。這樣分離到能夠靠乙醇生長(zhǎng)的兩個(gè)克隆。
實(shí)施例3基因文庫(kù)分離片段行使功能的能力檢測(cè)為了檢測(cè)染色體ICL缺陷互補(bǔ)是否由質(zhì)粒編碼完成的，所選酵母克隆在含尿嘧啶的完全培養(yǎng)基上培養(yǎng)兩次。所得細(xì)胞在培養(yǎng)板上呈單菌落生長(zhǎng)。在隨機(jī)挑選的16和13個(gè)克隆中，分別有7和5個(gè)克隆不再能夠在含葡萄糖的基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，同是這些克隆也不再能在含乙醇的基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。因此質(zhì)粒消除就與ICL1d互補(bǔ)喪失聯(lián)系起來。
質(zhì)粒從兩克隆之一被重新分離。它含大約8Kb長(zhǎng)的插入子。酵母突變株的重新轉(zhuǎn)化導(dǎo)致發(fā)現(xiàn)的所有克隆都有互補(bǔ)現(xiàn)象?？梢岳肧phI把8Kb的片段縮短到具有全部功能的2.9Kb大小。
在依賴乙醇生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化體的粗提取物中，發(fā)現(xiàn)了0.3U/mg蛋白質(zhì)的特異性異檸檬酸裂合酶活性。另外，應(yīng)用抗阿舒囊霉ICL多克隆抗體，蛋白質(zhì)印跡法可顯示出清楚的信號(hào)。
應(yīng)用根據(jù)ICL胰蛋白酶分解肽推出的引物，PCR顯示了所期望大小片段的強(qiáng)信號(hào)。用雙向凝膠電泳分離蛋白質(zhì)。此蛋白質(zhì)用胰蛋白酶分解成多肽。用Edman降解法對(duì)這些多肽行末端測(cè)序。把這些肽的序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中的相比發(fā)現(xiàn)，它們與釀酒酵母異檸檬酸裂合酶有70％以上的一致性。根據(jù)這些序列設(shè)計(jì)的引物被用來進(jìn)行PCR。大約8Kb互補(bǔ)基因文庫(kù)片段的3.3Kb被測(cè)序(Sanger等，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)74(1977)5463-5467)。經(jīng)與數(shù)據(jù)庫(kù)比較，在已確定序列中發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)編碼區(qū)。一個(gè)含1680個(gè)堿基的閱讀框架(SEQ ID NO；1)與釀酒酵母ICL1基因有65％的一致性；ICL基因處于一個(gè)與釀酒酵母Ser-tRNA序列有84％一致性的序列上游375個(gè)堿基部位(SEQ ID No1)。
實(shí)施例4
亞克隆的ICL在大腸桿菌/酵母/阿舒囊霉穿梭質(zhì)粒中發(fā)揮功能的能力兩個(gè)經(jīng)限制性酶切得到的片段和一個(gè)分離的基因文庫(kù)片段的PCR產(chǎn)物(圖5)被克隆進(jìn)pAG100質(zhì)粒(圖6)。此質(zhì)粒由Steiner和Philippsen構(gòu)建(1994，Mol.Gen.Genet 242263-271)。這兩個(gè)片段是2.9Kb的SphI片段(pAG100icl.4)和2.2Kb的Bg1 I/Eco RV片段(pAG 100 icl.6).這兩個(gè)片段都含Ser-tRNA。因此，還進(jìn)行了推定基因和融合的Bam HI切割位點(diǎn)(pAG100 icl.8)的PCR擴(kuò)增。這三個(gè)DNA均被克隆進(jìn)pAG100質(zhì)粒的Bam HI位點(diǎn)。此質(zhì)粒再用來轉(zhuǎn)化酵母突變株釀酒酵母ICL1d ura3(fs)。這三個(gè)構(gòu)建物完全互補(bǔ)了ICL1d的缺陷。也就是說，它們攜帶功能基因。
實(shí)施例5攜帶ICL的質(zhì)粒對(duì)棉阿舒囊霉形成核黃素的影響以上所述質(zhì)粒對(duì)棉阿舒囊霉的轉(zhuǎn)化(方法Wright和Philippsen，1991，基因10999-105)導(dǎo)致了核黃素形成顯著增加。這些菌株在裝有兩個(gè)隔板的500ml搖瓶中培養(yǎng)。每瓶盛50ml含10g/L大豆油，10g/L酵母提取物和200μg/ml遺傳霉素的培養(yǎng)基。對(duì)照株棉阿舒囊霉pAG100胞內(nèi)質(zhì)粒無任何插入子，兩天后產(chǎn)生18.7±0.1mg/l核黃素。棉阿舒囊霉pAG100.4和棉阿舒囊霉pAG100.6株則分別產(chǎn)生31.2±6.1mg/l和31.0±2.0mg/l的核黃素(圖7)。由于其高度變異性，不可能去測(cè)量異檸檬酸裂合酶比活性的顯著變化。在補(bǔ)充了3g/l甘氨酸的培養(yǎng)基中，棉阿舒囊霉pAG100.8株三天內(nèi)產(chǎn)生了65±5.6mg/l核黃素。與此對(duì)照，通過直接對(duì)比，棉阿舒囊霉pAG100對(duì)照株僅形成了29.9±1.8mg/l核黃素(圖8)不可能去測(cè)量異檸檬酸裂合酶比活性和菌絲體干重的顯著性差異。
實(shí)施例6異檸檬酸裂合酶(ICL)的純化為鑒定對(duì)ICL有抑制效應(yīng)的物質(zhì)，棉阿舒囊霉ICL首先被純化出來。此真菌菌絲體在植物油上長(zhǎng)出后，分離純化該酶。純化的每一步驟都簡(jiǎn)要列于表1。從此表可看出，大約25g菌絲體經(jīng)弗氏壓碎器破壞細(xì)胞后得到的典型粗提取物有220單位的ICL活性。經(jīng)40,000g離心后，回收到約78％的酶活性，并在上清液中呈溶解狀態(tài)。隨后用硫酸銨沉淀法分級(jí)分離使此酶富集為原來的三倍。通過SephacrylS-300柱凝膠過濾后，ICL被結(jié)合在陽(yáng)離子交換劑Mono S-瓊脂糖凝膠上，然后被氯化鈉洗脫。所得制劑通過SDS聚丙稀酰銨凝膠電泳均質(zhì)后具有18.4U/mg的比活性。
實(shí)施例7ICL抑制劑的鑒定通過比色實(shí)驗(yàn)(Dixon，H.和Kornberg，H.L.(1959)，生化雜志(Biochem.J.)72，3乙醛酸循環(huán)關(guān)鍵酶的檢測(cè)法)，純化的酶可以用來測(cè)定其它物質(zhì)對(duì)其活性的影響。所測(cè)物質(zhì)對(duì)純化酶的影響總結(jié)和描繪在表2和

圖1中。所研究物質(zhì)包括那些真菌細(xì)胞中對(duì)酶可能有抑制效應(yīng)的代謝物。其中，6-磷酸-葡萄糖酸和磷酸烯醇丙酮酸表現(xiàn)出最明顯的抑制效應(yīng)。在10mM濃度時(shí)，抑制大于50％。然而，被認(rèn)為不參加真菌代謝的衣康酸和草酸基本上都表現(xiàn)出顯著的更大的抑制效應(yīng)。在濃度為1mM時(shí)，各自有78％和95％的抑制。
實(shí)施例8衣康酸選擇性突變株的鑒定所分離真菌孢子中遺傳物質(zhì)的突變可通過紫外線照射孢子而產(chǎn)生。當(dāng)照射劑量達(dá)到只有10-20％的孢子存活時(shí)，就能得到耐受衣康酸對(duì)核黃素形成抑制的突變株。當(dāng)用此法分離得到的突變株在大豆油中生長(zhǎng)時(shí)，它產(chǎn)生的核黃素比原株高25倍(圖2)。ICL比活性在核黃素形成期升高了15％(圖2)。利用抗體可證明蛋白質(zhì)數(shù)量增加。就對(duì)衣康酸抑制的反應(yīng)來說，來自突變株的ICL有與起始株一樣的反應(yīng)。
實(shí)施例9核黃素形成與ICL比活性的相關(guān)性觀察發(fā)現(xiàn)，當(dāng)葡萄糖作為底物存在時(shí)，真菌僅在葡萄糖消耗后才開始產(chǎn)生核黃素。這令人吃驚地表明ICL和核黃素形成之間有因果關(guān)系。簡(jiǎn)言之，當(dāng)其在油中生長(zhǎng)時(shí)先前被葡萄糖抑制的ICL在粗提取物中也變成可測(cè)量的了，并且其活性升高到如前所述的水平(圖3)。
序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人(A)名稱BASF Aktiengesellschaft(B)街道Carl-Bosch-Strasse 38(C)城市Ludwigshafen(E)國(guó)家聯(lián)邦德國(guó)(F)郵政編碼D-67056(G)電話號(hào)碼0621/6048526(H)傳真0621/6043123(I)電傳1762175170(A)名稱Forschungszentrum Juelich GmbH(B)街道Leo-Brandt-Strasse(C)城市Juelich(E)國(guó)家德國(guó)(F)郵政編碼D-52425(G)電話號(hào)碼02461/613004(ii)申請(qǐng)名稱利用異檸檬酸裂合酶活性被改變的微生物制備核黃素(iii)序列數(shù)2(iv)電腦可讀形式(A)媒體類型軟磁盤(B)電腦IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件Patentin Release #1.0，#1.25版本(EPO)(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特性(A)長(zhǎng)度2364堿基對(duì)
(B)類型核酸(C)鏈型 雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA到mRNA(iii)假擬結(jié)構(gòu)無(iii)反義無(ix)特性(A)名稱/關(guān)鍵詞5′UTR(B)位點(diǎn)1..550(ix)特性(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位點(diǎn)551..2233(ix)特性(A)名稱/關(guān)鍵詞3′UTR(B)位點(diǎn)2234..2364(xi)序列描述SEQ ID NO1CGAAAGCGCC AAATACCGGA AACGGCACAG GCGCAGCTCT AATAGCCGTT CCACGATAAC 60TTTGGAAGTT ATGGCACTAT GGCCGAGTGG TTAAGGCGAC AGACTTGAAA TCTGTTGGGC 120TCTGCCCGCG CTGGTTCAAA TCCTGCTGGT GTCGTTATTT TTGCCGTTTC TTTTTAGATG 180AAACTCAGGG GCCTTTAGTC CGCCCTTTTG CCCGCTGATT CATCGCCCGC CAGCAACACC 240GGTTGAGCCG ATCAGCGCAA GAACGCGCAA AGTCACGTAT GGCCCCTAAG AGTTGAGCTC 300TCCCCCTCGG CTCCTTCCGG GCGCGGAAAA GCCTGCGTCA CCCCATTAAG TCCGAAACCG 360CGTTCAAGTG TACTTGGTCC GGGCCAATGT GGTTGCCTCA TCCGAGTCAC CGATACGCAG 420GTGCGCCCGT CGAGTCACCA TTAGGAGTAG AGCATCTGAT TATATATAGG CCTAGTTACA 480GCGGTAACAT AGACTGATAG CTCCAGCTCC AGCACTAGCT TGTAGGACAT CTGCGCGACA 540CCCAGTGAAC ATG TCC CCT TCC GTC AGA GAC GCC CGC AAC GAC CTT GCC589Met Ser Pro Ser Val Arg Asp Ala Arg Asn Asp Leu Ala1 5 10AGC CTG CAA CAG CAG GCA GCC GCC GAA GCC GAG GAT ATT AGG AGA TGG 637Ser Leu Gln Gln Gln Ala Ala Ala Glu Ala Glu Asp Ile Arg Arg Trp15 20 25TGG AGC CAG CCA CGG TGG GCG GGC ACC AAG CGC GTG TAC ACG GCC GAG 685Trp Ser Gln Pro Arg Trp Ala Gly Thr Lys Arg Val Tyr Thr Ala Glu30 35 40 45GAC ATC GTC AAG CGC CGC GGC ACG TTC CCT GTC GTC GAA TAC CCA TCT 733Asp Ile Val Lys Arg Arg Gly Thr Phe Pro Val Val Glu Tyr Pro Ser50 55 60TCC GTA ATG GCG GAC AAG CTC GTG GAG ACA TTG GCG CGG CAC TCG CGC 781Ser Val Met Ala Asp Lys Leu Val Glu Thr Leu Ala Arg His Ser Arg65 70 75AAC GGC ACG GTT TCA CAG ACG TTC GGA GTG CTC GAC CCA GTG CAA ATG 829Asn Gly Thr Val Ser Gln Thr Phe Gly Val Leu Asp Pro Val Gln Met80 85 90ACG CAA ATG GTG AAG TAT CTG GAC ACG ATT TAC GTG TCT GGC TGG CAA 877Thr Gln Met Val Lys Tyr Leu Asp Thr Ile Tyr Val Ser Gly Trp Gln95 100 105TGC AGC GCC ACG GCT TCG ACC TCG AAC GAG CCT GGG CCC GAT CTC GCG 925Cys Ser Ala Thr Ala Ser Thr Ser Asn Glu Pro Gly Pro Asp Leu Ala110 115 120 125GAC TAT CCG ATG GAC ACC GTG CCA AAC AAG GTC GAG CAC CTG TTC ATG 973Asp Tyr Pro Met Asp Thr Val Pro Asn Lys Val Glu His Leu Phe Met
130 135 140GCG CAG CTG TTC CAC GAC CGG AAA CAG CGC GAG GCC CGC CTG TCG TGC 1021Ala Gln Leu Phe His Asp Arg Lys Gln Arg Glu Ala Arg Leu Ser Cys145 150 155ACT ACC CAG CGC GAG CTC GAC CAA TTG GGG CCT GAG ATT GAC TAC TTG 1069Thr Thr Gln Arg Glu Leu Asp Gln Leu Gly Pro Glu Ile Asp Tyr Leu160 165 170AGG CCG ATT GTC GCT GAC GCA GAC ACC GGC CAC GGC GGG CTA ACA GCC 1117Arg Pro Ile Val Ala Asp Ala Asp Thr Gly His Gly Gly Leu Thr Ala175 180 185GTC TTT AAA CTC ACG AAG ATG TTC ATC GAG CGC GGT GCA GCC GGT ATC 1165Val Phe Lys Leu Thr Lys Met Phe Ile Glu Arg Gly Ala Ala Gly Ile190 195 200 205CAC ATG GAG GAC CAG TCC TCC AGC AAC AAA AAG TGC GGG CAC ATG GCG 1213His Met Glu Asp Gln Ser Ser Ser ASn Lys Lys Cys Gly His Met Ala210 215 220GGC CGC TGC GTG ATC CCT GTT CAG GAG CAC ATT AGT CGT TTA GTG ACT 1261Gly Arg Cys Val Ile Pro Val Gln Glu His Ile Ser Arg Leu Val Thr225 230 235GTG CGC ATG TGT GCG GAC GTG ATG CAC TCG AAC CTG GTG CTT GTC GCG 1309Val Arg Met Cys Ala Asp Val Met His Ser Asn Leu Val Leu Val Ala240 245 250AGA ACA GAC TCG GAG GCC GCC ACC TTA CTT AGC TCG AAC ATT GAC GCG 1357Arg Thr Asp Ser Glu Ala Ala Thr Leu Leu Ser Ser Asn Ile Asp Ala255 260 265CGC GAT CAT TAC TAC ATT GTC GGG GCC TCG AAC CCT GAG GTA ACT GTA 1405Arg Asp His Tyr Tyr Ile Val Gly Ala Ser Asn Pro Glu Val Thr Val270 275 280 285CCG CTG ATC GAA GTT TTG GAC GCC GCG CAG CAG GCC GGC GCC TCA GGT 1453Pro Leu Ile Glu Val Leu Asp Ala Ala Gln Gln Ala Gly Ala Ser Gly290 295 300GAC AGA TTG GCT CAG CTA GAG GAG GAC TGG TGC AAG AAG GCC AAG TTG 1501Asp Arg Leu Ala Gln Leu Glu Glu Asp Trp Cys Lys Lys Ala Lys Leu305 310 315AGG CTC TTC CAC GAG GCA TTT GCC GAC CAG GTG AAT GCC AGC CCT TCG 1549Arg Leu Phe His Glu Ala Phe Ala Asp Gln Val Asn Ala Ser Pro Ser320 325 330ATC AAA GAC AAG GCG GGC GTT ATT GCC AAA TTT AAC TCA CAG ATC GGG 1597Ile Lys Asp Lys Ala Gly Val Ile Ala Lys Phe Asn Ser Gln Ile Gly335 340 345CCA CAG ACA GGC GCG TCG ATC AGA GAG ATG CGC AAA CTG GGC CGC GAG 1645Pro Gln Thr Gly Ala Ser Ile Arg Glu Met Arg Lys Leu Gly Arg Glu350 355 360 365CTG CTC GGG CAG GAC GTC TAC TTC GAC TGG GAC CTG CCT CGC GCT AGA 1693Leu Leu Gly Gln Asp Val Tyr Phe Asp Trp Asp Leu Pro Arg Ala Arg370 375 380GAG GGC TTG TAC CGC TAC AAG GGC GGC ACC CAG TGC GCG ATC ATG CGC 1741Glu Gly Leu Tyr Arg Tyr Lys Gly Gly Thr Gln Cys Ala Ile Met Arg385 390 395GCA CGC GCG TTC GCG CCG TAC GCC GAC CTG GTC TGG TTC GAA TCC AAC 1789Ala Arg Ala Phe Ala Pro Tyr Ala Asp Leu Val Trp Phe Glu Ser Asn400 405 410TTC CCT GAC TTC CAG CAG GCT AAG GAG TTT GCG CAG GGC GTG CGC GAG 1837Phe Pro Asp Phe Gln Gln Ala Lys Glu Phe Ala Gln Gly Val Arg Glu415 420 425AAG TTC CCC AAC AAG TGG ATG GCC TAC AAC TTG TCG CCC AGC TTC AAC 1885Lys Phe Pro Asn Lys Trp Met Ala Tyr Asn Leu Ser Pro Ser Phe Asn430 435 440 445TGG CCG AAG GCC ATG CCT CCC AAG GAG CAG GAG AAC TAC ATC CAA CGG 1933Trp Pro Lys Ala Met Pro Pro Lys Glu Gln Glu Asn Tyr Ile Gln Arg450 455 460CTG GGC GAG ATC GGA TAT GTG TGG CAG TTC ATC ACG CTA GCC GGC CTG 1981Leu Gly Glu Ile Gly Tyr Val Trp Gln Phe Ile Thr Leu Ala Gly Leu465 470 475CAT ACC AAT GCC TTG GCC ATC GAC AAC TTC TCG CGC GAA TTC AGC AGG 2029His Thr Asn Ala Leu Ala Ile Asp Asn Phe Ser Arg Glu Phe Ser Arg480 485 490TTC GGA ATG CGT GCG TAT GCA CAA GGC ATC CAG CAG AGG GAG ATG GAC 2077Phe Gly Met Arg Ala Tyr Ala Gln Gly Ile Gln Gln Arg Glu Met Asp495 500 505GAG GGC GTC GAT GTC CTA AAA CAC CAG AAG TGG GCC GGC GCA GAG TAT 2125Glu Gly Val Asp Val Leu Lys His Gln Lys Trp Ala Gly Ala Glu Tyr510 515 520 525GTT GAC AGC ATT CTC AAG CTT GCC CAG GGC GGT GTG TCT TCG ACA GCC 2173Val Asp Ser Ile Leu Lys Leu Ala Gln Gly Gly Val Ser Ser Thr Ala530 535 540TCG ATG GGT AAG GGT GTA ACC GAA GAG CAG TTC GGC TCC TCA AAC GGT 2221Ser Met Gly Lys Gly Val Thr Glu Glu Gln Phe Gly Ser Ser Asn Gly545 550 555GCC AAA CTA TGATATCATC TCTGAGTCAT TTCTCTCGAC AAGATCCTCG 2270Ala Lys Leu
560GCCAGACTTC TGGAATATAT ATAACATCGG GTACCCCGAC ATCCCTGCCT TCCGCAACGT2330GCGAAGCAGC TGATACGTAT ACTTTAAACG CACA2364(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度560個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Ser Pro Ser Val Arg Asp Ala Arg Asn Asp Leu Ala Ser Leu Gln1 5 10 15Gln Gln Ala Ala Ala Glu Ala Glu Asp Ile Arg Arg Trp Trp Ser Gln20 25 30Pro Arg Trp Ala Gly Thr Lys Arg Val Tyr Thr Ala Glu Asp Ile Val35 40 45Lys Arg Arg Gly Thr Phe Pro Val Val Glu Tyr Pro Ser Ser Val Met50 55 60Ala Asp Lys Leu Val Glu Thr Leu Ala Arg His Ser Arg Asn Gly Thr65 70 75 80Val Ser Gln Thr Phe Gly Val Leu Asp Pro Val Gln Met Thr Gln Met85 90 95Val Lys Tyr Leu Asp Thr Ile Tyr Val Ser Gly Trp Gln Cys Ser Ala100 105 110Thr Ala Ser Thr Ser Asn Glu Pro Gly Pro Asp Leu Ala Asp Tyr Pro115 120 125Met Asp Thr Val Pro Asn Lys Val Glu His Leu Phe Met Ala Gln Leu130 135 140Phe His Asp Arg Lys Gln Arg Glu Ala Arg Leu Ser Cys Thr Thr Gln145 150 155 160Arg Glu Leu Asp Gln Leu Gly Pro Glu Ile Asp Tyr Leu Arg Pro Ile165 170 175Val Ala Asp Ala Asp Thr Gly His Gly Gly Leu Thr Ala Val Phe Lys180 185 190Leu Thr Lys Met Phe Ile Glu Arg Gly Ala Ala Gly Ile His Met Glu195 200 205Asp Gln Ser Ser Ser Asn Lys Lys Cys Gly His Met Ala Gly Arg Cys210 215 220Val Ile Pro Val Gln Glu His Ile Ser Arg Leu Val Thr Val Arg Met225230 235 240Cys Ala Asp Val Met His Ser Asn Leu Val Leu Val Ala Arg Thr Asp245 250 255Ser Glu Ala Ala Thr Leu Leu Ser Ser Asn Ile Asp Ala Arg Asp His260 265 270Tyr Tyr Ile Val Gly Ala Ser Asn Pro Glu Val Thr Val Pro Leu Ile275 280 285Glu Val Leu Asp Ala Ala Gln Gln Ala Gly Ala Ser Gly Asp Arg Leu290 295 300Ala Gln Leu Glu Glu Asp Trp Cys Lys Lys Ala Lys Leu Arg Leu Phe305 310 315 320His Glu Ala Phe Ala Asp Gln Val Asn Ala Ser Pro Ser Ile Lys Asp325 330 335Lys Ala Gly Val Ile Ala Lys Phe Asn Ser Gln Ile Gly Pro Gln Thr340 345 350Gly Ala Ser Ile Arg Glu Met Arg Lys Leu Gly Arg Glu Leu Leu Gly355 360 365Gln Asp Val Tyr Phe Asp Trp Asp Leu Pro Arg Ala Arg Glu Gly Leu370 375 380Tyr Arg Tyr Lys Gly Gly Thr Gln Cys Ala Ile Met Arg Ala Arg Ala385 390 395 400Phe Ala Pro Tyr Ala Asp Leu Val Trp Phe Glu Ser Asn Phe Pro Asp405 410 415Phe Gln Gln Ala Lys Glu Phe Ala Gln Gly Val Arg Glu Lys Phe Pro420 425 430Asn Lys Trp Met Ala Tyr Asn Leu Ser Pro Ser Phe Asn Trp Pro Lys435 440 445Ala Met Pro Pro Lys Glu Gln Glu Asn Tyr Ile Gln Arg Leu Gly Glu450 455 460Ile Gly Tyr Val Trp Gln Phe Ile Thr Leu Ala Gly Leu His Thr Asn465 470 475 480Ala Leu Ala Ile Asp Asn Phe Ser Arg Glu Phe Ser Arg Phe Gly Met485 490 495Arg Ala Tyr Ala Gln Gly Ile Gln Gln Arg Glu Met Asp Glu Gly Val500 505 510Asp Val Leu Lys His Gln Lys Trp Ala Gly Ala Glu Tyr Val Asp Ser515 520 525Ile Leu Lys Leu Ala Gln Gly Gly Val Ser Ser Thr Ala Ser Met Gly530 535 540Lys Gly Val Thr Glu Glu Gln Phe Gly Ser Ser Asn Gly Ala Lys Leu545 550 555 560
表1
表權(quán)利要求
1.核黃素的一種微生物制備方法，其中先把生產(chǎn)核黃素的微生物在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后分離產(chǎn)生的核黃素，它包括應(yīng)用內(nèi)源性異檸檬酸裂合酶被改變的微生物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中由于內(nèi)源性ICL基因的突變，該微生物顯示出一種有較高ICL活性的酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中由于ICL基因拷貝數(shù)的增加，該微生物有更高的ICL基因表達(dá)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中ICL基因已與增強(qiáng)ICL基因表達(dá)的調(diào)節(jié)性DNA序列功能性連接。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中使用耐受ICL抑制性物質(zhì)的微生物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中微生物耐受衣康酸和草酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求1到6任一項(xiàng)的方法，其中真菌被用作微生物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中來自阿舒囊霉屬的真菌被用作微生物。
9.一種ICL基因，其編碼SEQ ID NO2中所示的氨基酸序列。
10.一種包含根據(jù)權(quán)利要求9的ICL基因的基因組建物。
11.根據(jù)權(quán)利10的基因組建物，其中ICL基因已與一個(gè)或多個(gè)增強(qiáng)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)信號(hào)功能性連接。
全文摘要
本發(fā)明公開了核黃素的一種微生物制備方法,其中先把生產(chǎn)核黃素的微生物在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng),然后分離產(chǎn)生的核黃素,它包括應(yīng)用內(nèi)源性異檸檬酸裂合酶(ICL)活性被改變的微生物。
文檔編號(hào)C12N1/15GK1193356SQ96195479
公開日1998年9月16日 申請(qǐng)日期1996年7月10日 優(yōu)先權(quán)日1995年7月13日
發(fā)明者B·卡斯?fàn)? H·薩姆, K－P·斯塔曼, G·施密德, T·博德克爾, H·瑟爾伯格 申請(qǐng)人:巴斯福股份公司, 尤里西研究中心有限公司