專利名稱：乳房鏈球菌的camp因子的制作方法
技術領域：
本發(fā)明主要涉及細菌抗原。更特別地，本發(fā)明是關于乳房鏈球菌(S.uberis)CAMP因子的重組生產和CAMP因子在疫苗組合物中的應用。
乳房鏈球菌是奶牛乳腺炎的重要病因，并與約20％的所有乳腺炎臨床病例有關(Bramley，A.J.和Dodd，F.H.(1984)乳品研究雜志(J.Dairy Res.)51481-512；Bramley，A.J.(1987)動物健康營養(yǎng)(Animal HealthNutrition)4212-16；Watts，J.L.(1988)乳品科學雜志(J.Dairy Sci.)711616-1624)。因為在治療乳房鏈球菌乳腺炎中抗菌劑治療基本無效，控制方法的發(fā)展必須以對參與攻擊和保護乳腺的毒力因子和保護性抗原的了解為基礎(Collins等(1988)乳品研究雜志5525-32；Leigh等(1990)獸醫(yī)科學研究(Res.Vet.Sci.)4985-87；Marshall等(1986)乳品研究雜志53507-514)。
已知一些乳房鏈球菌株可產生透明質酸囊(Hill，A.W.(1988)獸醫(yī)科學研究45400-404)，透明質酸酶(Schaufuss等(1989)Zentralbl.Bakteriol.Ser.A27146-53)，類R蛋白(Groschup，M.H.和Timoney，J.F.(1993)獸醫(yī)科學研究54124-126)，和共溶血素，即CAMP因子，也被稱為UBERIS因子(Skalka，B.和Smola，J.(1981)Zentralbl.Bakteriol.Ser.A 249190-194)。但是對他們的致病作用知之甚少。
CAMP因子的作用首先由Christie等在1944年所描述(Christie等(1944)澳大利亞實驗生物醫(yī)學科學雜志(Aus.J.Exp.Biol.Med.Sci.)22197-200)。這些作者發(fā)現B組鏈球菌(GBS)如無乳鏈球菌，當生長在金黃色葡萄球菌β-毒素(鞘磷脂酶)擴散帶旁時，產生完全溶血的明顯帶，這種現象稱為CAMP反應并且該反應中的化合物被稱為CAMP因子，它是一種分子量為23,500Da的胞外蛋白(Bernheimer等(1979)感染免疫(Infect.Immun.)23838-844)。隨后從如無乳鏈球菌中純化了CAMP因子，被鑒定為25,000Da蛋白質，等電點(PI)為8.9(Jurgens等(1985)色譜學雜志(J.Chrom.)348363-370)。無乳鏈球菌CAMP因子的氨基酸序列由Ruhlmann等測定(Ruhlmann等(1988)FEBS Lett 235262-266)。
CAMP反應的機制已有描述。見如，Bernheimer等(1979)感染免疫23838-844；Sterzik等在Alouf等編著的《細菌蛋白質毒素》一書中的“來自無乳鏈球菌的CAMP因子與人工膜的相互作用”，倫敦學術出版公司，1984；195-196；Sterzik等(1985)Zentralbl.Bakteriol.Mikrrobiol.HYG.Abt.1 Suppl.15101-108；Fehrenbach等在Fehrenbach等編著的《細菌蛋白質毒素》一書中的“CAMP-因子在毒力上的作用”，StuttgartGustavFischer Verlag，1988；351-357；Fehrenbach等在Alouf等編著的《細菌蛋白質毒素》一書中的“兩親性細菌多聚肽與人工膜的相互作用”，倫敦學術出版公司，1984；317-324。
CAMP因子對各種靶細胞包括綿羊和牛紅細胞及其中膜磷脂和鞘磷脂已由磷脂酶和鞘磷脂酶水解的人工膜有裂解活性。
CAMP因子在致病性中的作用還不清楚。部分純化的來自無乳鏈球菌的CAMP因子靜脈內注射兔子顯示出致死性(Skalka，B.和Smola，J.(1981)Zentralbl.Bakteriol.Ser.A 249190-194)。而且，小鼠腹腔內注射純化的CAMP因子顯著地提高了亞致死劑量的B組鏈球菌的致病性(Fehrenbach等“CAMP-因子(蛋白B)在毒力上的作用，”收在Fehrenbach等編著的《細菌蛋白質毒素》一書中，StuttgartGustav Fischerverlag，1988；351-357)。另外，與金黃色葡萄球菌的蛋白A一樣，GBS CAMP因子可以結合在免疫球蛋白的Fc段并因此被稱為蛋白B(Jürgens等(1987)實驗醫(yī)學雜志(J.Exp.Med.)165720-732)。
除了GBS和乳房鏈球菌，其他細菌，包括單核細胞增生李斯特菌和斯氏李斯特菌(Rocourt，J.和Grimont，P.A.D.(1983)Int.J.Syst.Bacteriol.33866-869)、氣單胞菌屬菌種(Figura，N.和Guglielmetti，P.(1987)臨床微生物學雜志(J.Clin.Microbiol)251341-1342)、馬紅球菌(Fraser，G.自然(Nature)189246)和某些弧菌屬菌種(Kohler，W.(1988)Zentralbl.Bakteriol.Mikrrobiol.HYG.Ser.A 27035-40)都產生與CAMP效應相似的反應。
GBS和胸膜肺炎氣單胞菌(A.pleuropneumoniae)的CAMP因子基因已在大腸桿菌中克隆和表達(Frey等(1989)感染免疫572050-2056；Schneewind等(1988)感染免疫562174-2179)。
但是直到現在，乳房鏈球菌的CAMP因子基因還未被克隆。更進一步，CAMP因子的保護力在以前還未被研究過。
本發(fā)明以乳房鏈球菌CAMP因子基因及CAMP因子能保護脊椎動物主體免于感染的發(fā)現為基礎。CAMP因子、其活性免疫原性的片段、其活性類似物或包括相同組份的嵌合蛋白可以單獨或與其他抗原組合用于可提供使脊椎動物主體免于細菌感染的保護的新的亞單位疫苗。
因此，在一實施方案中，本發(fā)明涉及一個含有免疫原性的乳房鏈球菌CAMP因子編碼序列的分離的核酸分子。在另外的實施方案中，本發(fā)明涉及包含該核酸分子的重組載體、這些載體轉染的宿主細胞和重組產生乳房鏈球菌CAMP因子的方法。
在另一實施方案中，本發(fā)明還涉及含有藥學適用載體和一種免疫原性的CAMP因子的疫苗組合物。在特別優(yōu)選的實施方案中，CAMP因子是一種鏈球菌CAMP因子。
在其他的實施方案中，本發(fā)明還涉及治療和預防主體中細菌感染的方法，包括鏈球菌感染和乳腺炎，包括將治療有效量的上述疫苗組合物施用于該主體。
在另外的實施方案中，本發(fā)明涉及生產疫苗組合物的方法，包括(a)提供至少一種免疫原性的CAMP因子；和(b)將免疫原性的CAMP因子與藥學適用載體組合。
根據文中闡述，本發(fā)明的這些和其他實施方案將容易地由本領域普通技術人員實現。


圖1描繪了重組質粒pJLD21及其亞克隆(命名為pJLD21-1和pJLD21-2)的限制酶切圖譜。線代表乳房鏈球菌的插入DNA，盒子代表載體pTZ18R的多克隆位點。重組質粒pJLD21及其衍生亞克隆的CAMP活性在右側顯示(+，CAMP反應陽性；-，CAMP反應陰性)。小水平箭頭代表測序實驗的起始位點和方向。DNA印跡實驗用的探針片段由大箭頭表示。底部的陰影盒子代表乳房鏈球菌(cfu)CAMP因子基因的開放讀碼框架。
圖2顯示了應用乳房鏈球菌和重組大腸桿菌克隆的CAMP反應的結果。如材料和方法下的實驗部分所述，在2#基礎血平板上進行CAMP反應。豎直條S，金黃色葡萄球菌。水平條1，乳房鏈球菌；2，大腸桿菌pJF1754(pTZ18R)(陰性對照)3，大腸桿菌pJF1754(pJLD21)(CAMP-陽性重組體)4，大腸桿菌pJF1754(pJLD21-2)(CAMP-陽性亞克隆)。
圖3A和3B代表乳房鏈球菌和無乳鏈球菌CAMP因子各自的SDS-PAGE和免疫印跡實驗。圖3A顯示了考馬氏亮藍染色的12％聚丙稀酰胺-SDS膠。泳道1，部分純化的乳房鏈球菌CAMP因子；泳道2，大腸桿菌pJF1754(pJLD21)的上清液(CAMP陽性)；泳道3，大腸桿菌pJF1754(pTZ18R)的上清液(陰性對照)；泳道4，無乳鏈球菌的上清液；泳道MW，預染的分子量標準。圖左的數據顯示了分子量標記的位置(以千計)。圖3B顯示圖3A的膠的免疫印跡。樣品轉移到硝基纖維素膜上與鼠的抗純化的乳房鏈球菌CAMP因子抗血清反應。
圖4A-4C(SEQ ID NO＿)顯示乳房鏈球菌CAMP因子基因的核苷酸序列及其啟動子區(qū)域。+1代表轉錄的起始位點，啟動子的-10和-35區(qū)域用下劃線表示。推定的S-D序列顯示為SD。推定的乳房鏈球菌CAMP因子的氨基酸序列用三字母密碼顯示在核苷酸序列的下方。信號肽和成熟肽被特別指明。
圖5顯示乳房鏈球菌CAMP因子基因啟動子區(qū)域的引物延伸分析。如實施例中所述進行引物延伸反應。使用的細胞RNA來自乳房鏈球菌(泳道1)、大腸桿菌pJF1754(pJLD21)(泳道2)和大腸桿菌pJF1754(pTZ18R)(泳道3)。雙脫氧測序序列梯利用相同的引物產生并在每條泳道上顯示為T、G、C、A。
圖6(SEQ ID NO＿)顯示乳房鏈球菌CAMP因子(上線，稱為“SUCAMP”)和無乳鏈球菌因子(下線，稱為“SAGCAMP”)之間的比較。氨基酸以單字母密碼標出。相同的氨基酸以雙點標出()。對比的序列顯示66.4％的一致性。序列中引入空區(qū)(用破折號標出)使排列對比最佳化。
圖7顯示不同乳房鏈球菌株的DNA印跡分析。所用探針的來源如圖1所示；來自每株乳房鏈球菌的染色體DNA用HindIII酶切。泳道1、2、3和4是分別來自ATCC株9927、13386、13387和19436的DNA樣品；泳道5、6、7和8是來自土壤分離株的DNA樣品。右邊的箭頭表明了雜交的限制性酶切片段的位置和長度。每株的CAMP反應表型用“+”(CAMP反應陽性)和“-”(CAMP反應陰性)在底部被標出。
圖8描繪了pGH-CAMP的結構。每個質粒來源克隆的CAMP反應顯示在圖右側；+代表陽性反應，-代表陰性反應?？蘸凶哟韕TZ18R，斜線盒子代表pGH433。
本發(fā)明的實施將采用(除非另有聲明)分子生物學、微生物學、病毒學、重組DNA技術和免疫學中的常規(guī)技術，這些技術都在本領域技術人員的技術范圍之內。這些技術可用文字完全解釋。見如，Sambrook，Fritsch&Maniatis，分子克隆實驗指南，第二版(1989)；DNA克隆，I和II卷(D.N.Glover編著1985)；寡核苷酸合成(M.J.Gait編著1984)；核酸雜交(B.D.Hames&S.J.Higgins編著1984)；動物細胞培養(yǎng)(R.K.Freshney編著1986)；固定化細胞和酶(IRL出版社，1986)；Perbal，B.，分子克隆實踐指南(1984)；系列叢書《酶學方法》(S.Coloweik和N.Kaplan編著，學術出版社)；和實驗免疫學手冊，I-IV卷(D.M.Weir和C.C.Blackwell編著，1986，Blackwell科學出版社)。A.定義在本發(fā)明的描述中將采用下列術語，并打算如下文所述定義下列術語。
必須聲明的是，除非文中明確聲明，如本說明書及附加的權利要求中所用的，單數形式的“一個””、“一種””和“這種”包括多數所述事物。因此，如“一種CAMP因子”的提法包括兩種或多種CAMP因子的混合物，依此類推。
詞條“CAMP因子”或編碼它的核苷酸序列，分別指的是衍生自各種細菌物種中所發(fā)現的CAMP因子基因的蛋白質或核苷酸序列，包括但并不限于乳房鏈球菌、B組鏈球菌(GBS)如無乳鏈球菌(Jurgens等(1985)色譜學雜志348363-370；和Ruhlmann等(1988)FEBS Lett 235262-266)、單核細胞增生李斯特菌和斯氏李斯特菌(Rocourt，J.和Grimont，P.A.D.(1983)Int.J.Syst.Bacteriol.33866-869)、氣單胞菌屬菌種(Figura，N.和Guglielmetti，P.(1987)臨床微生物學雜志251341-1342)、馬紅球菌(Fraser，G.自然189246)和某些弧菌屬菌種(Kohler，W.(1988)Zentralbl.Bakteriol.Mikrrobiol.HYG.Ser.A 27035-40)。
一個來自乳房鏈球菌代表性的CAMP因子基因存在于質粒pJLD21中，并如在圖4A-4C所示(SEQ ID NO＿)。
衍生的蛋白質或核苷酸序列不必從上文所述的基因中自然得到，還可通過各種方式產生，包括如根據本文所提供的資料化學合成、分離(如，從產生CAMP因子的生物中得到)或通過重組方法產生。而且，該詞條是指具有與該基因編碼的連續(xù)氨基酸序列基本同源的氨基酸序列且顯示免疫學活性的蛋白。因此，該詞條包括全長的以及免疫原性的截短的部分序列，及該蛋白質的活性類似物和前體形式，如那些包括信號肽序列的形式，這將在下文詳細描述。
本詞條也包括中性形式或堿或酸加成鹽形式的蛋白質，這取決于制備方式。這些酸加成鹽可包括游離氨基基團，也可形成帶有游離羧基的堿鹽。藥學適用的堿鹽和酸加成鹽下文將進一步討論。另外，蛋白質可通過結合其他生物學材料而被修飾，如脂類(那些與蛋白質自然結合的或不破壞免疫學活性的其他脂類)和糖類，或通過側鏈基團修飾，如氨基的乙?；⒘u基側鏈的磷酸化、巰基的氧化、氨基酸殘基的糖基化，以及對所編碼的原始序列的其他修飾。
因此本詞條包括序列的缺失、插入和取代，只要該多肽仍具有產生前文所規(guī)定的免疫學活性的功能。在此方面，特別優(yōu)選的取代將是本質上保守的，例如，那些發(fā)生在一個氨基酸家族內的取代。例如，氨基酸主要分成四個家族(1)酸性的--天冬氨酸、谷氨酸；(2)堿性的--賴氨酸、精氨酸、組氨酸(3)非極性的--丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)不帶電荷的極性氨基酸--甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有時被分類為芳香族氨基酸。例如可預測單獨地用異亮氨酸或纈氨酸取代亮氨酸(反之亦然)；用谷氨酸取代天冬氨酸(反之亦然)；用絲氨酸取代蘇氨酸(反之亦然)；或用結構相關的氨基酸進行相似的保守性的取代，對其生物學活性無重大影響。因而具有與所述分子基本相同的氨基酸序列，但有基本不影響蛋白質免疫原性的微小氨基酸取代的蛋白質都包括在所述多肽的定義范圍之內。
詞條“鏈球菌CAMP因子”指來自產生所述因子的鏈球菌菌株(包括乳房鏈球菌和GBS如無乳鏈球菌)的如上文所定義的CAMP因子。“乳房鏈球菌CAMP因子”是來自乳房鏈球菌的如上文所定義的CAMP因子。
“乳腺炎”意味著哺乳動物乳腺的發(fā)炎，包括奶牛、母羊、山羊、母豬、母馬等，其由產生CAMP因子的各種細菌所引起，在下文中將完整描述。感染表現為乳腺中吞噬細胞的浸潤。一般來說，發(fā)現有四個臨床類型的乳腺炎(1)極急性，乳腺腫脹、發(fā)熱、疼痛、和異常分泌并伴隨著發(fā)熱和系統(tǒng)性失調的其他癥狀，如明顯的抑郁，脈搏快而微弱，眼睛內陷，虛弱和完全厭食；(2)急性，乳腺的變化和上述相似，但發(fā)熱、厭食和抑郁為輕度到中度；(3)亞急性，未顯示系統(tǒng)性的變化，乳腺的改變及異常分泌較不明顯；和(4)亞臨床性，只有通過針對乳腺炎的常規(guī)檢查才檢查到炎癥反應。
檢測乳腺炎的常規(guī)檢查包括但不僅局限于加利福尼亞乳腺炎檢查，威斯康星乳腺炎檢查，Nagase乳腺炎檢查，電子細胞計數和用來檢測奶中持續(xù)的高白細胞數的體細胞計數。一般，奶中體細胞計數約為300,000--500,000個細胞/ml，表明有感染。因此，當例如奶中體細胞計數保持低于約500,000個細胞/ml時，疫苗被認為治療和/或預防乳腺炎有效。關于乳腺炎的論述和其診斷，見，如Merck獸醫(yī)手冊《獸類疾病的診斷、治療及預防和控制手冊》，Merck公司，Rahway，New Jersey，1991。
一個“分離的”核酸分子是指與分子天然存在的完整生物分離和不連續(xù)的核酸分子；或不含全部或部分的天然與之相連的序列的核酸分子；或天然存在的但有與其相連的異源序列(如下所述)的序列。
詞條“表位”指抗原或半抗原上的位點，針對該位點有特異的B細胞和T細胞應答。該詞條也可以與“抗原決定簇”或“抗原決定簇位點”互換使用。識別同一個表位的抗體可以通過顯示一個抗體封阻另一個抗體靶抗原結合位點的能力的簡單免疫實驗來鑒定。
針對一組合物或疫苗的“免疫應答”指在宿主中產生針對目的組合物或疫苗的細胞和/或抗體介導的免疫應答。通常情況下，一個“免疫應答”包括但不局限于一個或多個以下的效應產生特異性地針對包括在目的組合物和疫苗中的一個或多個抗原的抗體、B細胞、輔助T細胞、抑制T細胞、和/或細胞毒T細胞、和/或γδT細胞。優(yōu)選宿主顯示針對CAMP因子的保護性免疫應答，如，宿主將被保護免于隨后的病原體的感染，并且該保護可通過減少或缺乏感染宿主一般所表現的癥狀或者較快的恢復時間加以證實。
詞條“免疫原性”蛋白質或多肽指誘導出如上文所述的免疫應答的氨基酸序列。本文中所用的“免疫原性”蛋白質或多肽包括所述CAMP因子的全長序列，其中包括其前體和成熟的形式及類似物或其免疫原性片段?！懊庖咴云巍笔侵负幸粋€或多個表位并因此能誘導出如上所述的免疫應答的CAMP因子的片段。該片段可以通過如下方法進行鑒別，如，在固相支持物上同時合成大量的多肽，這些多肽與蛋白質分子的部分相一致，并且當這些多肽仍附著在固相支持物上時多肽與抗體發(fā)生反應。這些技術為本領域已知并描述于，如，美國專利號4,708,871；Geysen等(1984)美國國家科學院院報(Proc.Natl.Acad，Sci，USA)813998-4002；Geysen等(1986)分子免疫學23709-715。
針對本發(fā)明目的免疫原性片段，通常約有至少兩個氨基酸長度，更優(yōu)選約五個氨基酸長度，最優(yōu)選至少約10-15個氨基酸長度。片段的長度無嚴格的上限，它可以含有幾乎蛋白質序列的全長，或者甚至含有兩個或多個CAMP因子或所述因子的表位的融合蛋白。
“重組”多肽指由重組DNA技術產生的多肽；即，由編碼所需多肽的外源DNA結構轉化的細胞產生的多肽?！昂铣傻摹倍嚯氖悄切┩ㄟ^化學合成制備的多肽。
“載體”是一個復制子，例如一個質粒、噬菌體、或粘粒，另外的DNA片段可以連接到該載體上以便使連接片段進行復制。
特定蛋白的DNA“編碼序列”或“編碼它的核苷酸序列”，指一個當置于合適的調控元件的調控下時，在體內或體外轉錄和翻譯成一個多肽的DNA序列。編碼序列的界限由5’(氨基)末端的起始密碼子和3’(羧基)末端翻譯終止密碼子所決定。一個編碼序列可以包括，但并不局限于，原核序列、來自真核mRNA的cDNA、真核DNA基因組DNA序列(如，哺乳動物DNA)、和甚至是合成的DNA序列。轉錄終止序列通常位于編碼序列的3’端。
DNA“調控元件”統(tǒng)指啟動子、核糖體結合位點、聚腺苷酸信號、轉錄終止序列、上游調節(jié)區(qū)、增強子、和其他類似物，在宿主細胞中這些元件共同保證一個編碼序列轉錄和翻譯。只要所需基因能夠被轉錄和翻譯，并非所有這些調控元件需要總存在于一個重組載體中。
“可操作地連接”指元件的排列，其中所述成分的排列可使其執(zhí)行它們的常規(guī)功能。因此，可操作地連接在編碼序列的調控元件能夠影響編碼序列的表達。調控元件不必緊連編碼序列，只要他們可執(zhí)行指導其表達的功能即可。所以，例如，在啟動子和編碼序列之間可以插入不翻譯的但可轉錄的序列，啟動子仍被認為是與編碼序列“可操作地連接的”。
相似地，一個編碼序列被“可操作地連接在”另一個編碼序列上(即，在嵌合蛋白的情況下)，即RNA聚合酶將這兩個編碼序列轉錄成mRNA，接著翻譯成由這兩個編碼序列編碼的多肽。編碼序列不必緊連于另一個編碼序列，只要使轉錄序列最終被加工而產生所需蛋白質即可。
一個調控元件，例如一個啟動子，在細胞內對編碼序列“指導轉錄”，即RNA聚合酶結合在啟動子上并將編碼序列轉錄成mRNA，緊接著mRNA翻譯成編碼序列編碼的多肽。
“宿主細胞”是被外源核酸分子轉化的細胞，或是能被其轉化的細胞。
當外源DNA被引入細胞膜內時，該細胞就已被外源DNA“轉化”。外源DNA可能或可能不被整合(共價連接的)進組成細胞基因組的染色體DNA中。在原核細胞和酵母中，例如，外源的DNA可能維持附加體形式，如質粒。而對于真核細胞，一個穩(wěn)定的轉化細胞是外源DNA已整合進染色體因而可以通過染色體復制將外源DNA遺傳給子代細胞的細胞，真核細胞可建立由含有外源DNA的大量的子代細胞所組成的細胞系或克隆的能力證明了這種穩(wěn)定性。
“同源性”指在兩個多核苷酸或兩個多肽部分之間一致性的百分率。一部分和另一部分序列之間的對應性可以用本領域已知的技術來測定。例如，通過兩個多肽分子序列信息的排列比較并利用易于得到的計算機程序(如ALIGN，Dayhoff，M.O.(1978)《蛋白質序列和結構圖集》5補3，國立生物醫(yī)學研究基金會，華盛頓特區(qū))來測定其同源性。
另外，可通過多聚核苷酸在一定的條件下同源區(qū)域間形成穩(wěn)定雙螺旋而雜交，然后用單鏈特異性的核酸酶進行消化，確定消化后片段的大小來確定同源性。當如上述方法測定在分子的限定長度上核苷酸或氨基酸分子中至少約80％，優(yōu)選至少約90％，最優(yōu)選至少約95％相匹配時，兩個DNA或兩個多肽序列是彼此“基本同源的”。在本文中，基本同源也指與特異的DNA或多肽序列顯示同一性的序列。基本同源的DNA序列的可通過如特定系統(tǒng)所規(guī)定的嚴緊性條件下的DNA雜交實驗來確定。確定適當的雜交條件在本領域技術人員的技術范圍內。見，如，Sambrook等，同上；DNA克隆I&II卷，同上；核酸雜交，同上。
詞條“功能相當的”指當與由所述CAMP因子的成熟序列或其免疫原性部分的一致性CAMP因子所誘導的應答相比較時，可誘導一個基本相當的或增強的如上文所規(guī)定的免疫應答的CAMP因子氨基酸序列。
DNA結構的“異源”區(qū)域是位于天然并未與其相連的另一DNA分子之中或與其相連的一種可鑒別的片段。因此，當該異源區(qū)域編碼一個細菌基因時，這個基因的側翼通常為在來源細菌基因組中該細菌基因側翼所沒有的DNA。異源編碼序列的另一個例子是一個編碼序列本身天然并不存在的結構(如，具有與親本基因不同的密碼子的合成序列)。等位基因突變或自然發(fā)生的突變事件并不構成本文所用的DNA異源區(qū)段。
本文所用的詞條“治療”指(i)防止感染或再感染(預防)，或(ii)減少或消除有關疾病的癥狀(治療)。
“脊椎動物主體”指脊索動物亞門的任何一個成員，包括但不局限于哺乳動物如牛、綿羊、豬、山羊、馬和人；家養(yǎng)的動物如狗和貓；和鳥類，包括家養(yǎng)的、野生的和獵狩的鳥類如公雞和母雞包括雛雞、火雞和其他的鶉雞類鳥；和魚。該詞條沒有聲明特別的年齡。因此，成年的和新生的動物，以及胎兒都包括在內。B.一般方法本發(fā)明的中心內容是發(fā)現了CAMP因子在脊椎動物主體中能誘導保護性的免疫應答。乳房鏈球菌CAMP因子的基因已被分離和鑒定，并且因此編碼的CAMP因子已被測序。乳房鏈球菌CAMP因子基因的蛋白質產物已顯示能保護家畜免于隨后的乳房鏈球菌的攻擊。
特別是，乳房鏈球菌CAMP因子全部的DNA序列顯示在圖4A-4C中(SEQ ID NO＿)。發(fā)現CAMP因子基因的主要轉錄本在堿基“A”處開始(在圖4中描繪在+1位置)。在如在圖4中所示的轉錄起始位點的上游發(fā)現-10和-35區(qū)域，大腸桿菌啟動子的特征區(qū)(Harley，C.B.和Reynolds，R.P(1987)核酸研究152343-2361)。一個開放讀碼框架開始于位于157-159位的ATG密碼子并且終止于位于925-927位的終止密碼子TAA。起始密碼子ATG之前有一段大腸桿菌中為核糖體結合位點的嘌呤-富含區(qū)域(Stormo等(1982)核酸研究102971-2996)。
如圖4A-4C中所示，乳房鏈球菌CAMP因子基因編碼一個約256個氨基酸的(圖4A-4C中的氨基酸殘基1--256，含端值)、含有一個約28個氨基酸長度N-末端信號肽序列的前蛋白。前體分子計算的分子量為28，363Da。因此成熟的乳房鏈球菌CAMP因子包括29-256(含端值)的氨基酸殘基，如圖4A-4C中所示。如下文進一步的討論，CAMP因子基因編碼信號序列的部分可包括在編碼CAMP因子的構建物中，以在表達過程中指導CAMP因子的分泌。另外，CAMP因子的信號序列和編碼信號序列的核酸序列可用于異源蛋白質和核酸分子，以指導它們的分泌。
如圖6所示(SEQ ID NO＿)，無乳鏈球菌CAMP因子的226個氨基酸序列和乳房鏈球菌推定的256個氨基酸序列的排列對比表明66.4％的氨基酸殘基是一致的。另外，針對純化的乳房鏈球菌CAMP因子產生的抗體與無乳鏈球菌的蛋白B有交叉反應。如實施例中所示，當在大腸桿菌中重組表達產生時，乳房鏈球菌CAMP因子是被分泌的。
精確的定位和CAMP因子基因序列的體外突變研究可估計CAMP蛋白不同結構域的功能。同樣，本發(fā)明的資料允許通過基因取代和其他分子技術得到穩(wěn)定的CAMP因子合成缺陷突變體。乳房鏈球菌的親本株和突變株在動物中的毒力的比較提供了關于該CAMP因子在表達CAMP因子細菌的致病性中的作用的重要信息。
CAMP因子、其免疫原性片段或包含相同組份的嵌合蛋白可包含在亞單位疫苗組合物中，該蛋白質及其抗體可以用作檢測脊椎動物主體中的感染的診斷試劑。相似地，編碼蛋白質的基因可被克隆并用于設計探針來檢測和分離其他細菌株中的同源基因。
本發(fā)明的疫苗組合物可用于治療或預防多種細菌在脊椎動物主體中的感染。例如，包括乳房鏈球菌和/或B組鏈球菌(GBS)(如無乳鏈球菌)來源的CAMP因子的疫苗組合物，可用于治療脊椎動物中由這些細菌引起的鏈球菌感染。特別是，乳房鏈球菌和無乳鏈球菌是牛、馬、羊和山羊乳腺炎的共同細菌病原體。另外，B組鏈球菌，如無乳鏈球菌，已知可引起脊椎動物中大量的其他感染，包括敗血癥、腦膜炎、菌血癥、膿皰病、關節(jié)炎、尿道感染、膿腫、自發(fā)流產等。因此，含有鏈球菌CAMP因子的疫苗組合物將可用于治療和/或預防廣泛的鏈球菌感染。
相似地，來自單核細胞增生李斯特菌和斯氏李斯特菌、氣單胞菌屬菌株、馬紅球菌、和弧菌屬菌株的CAMP因子將可用于治療由這些菌株引起的細菌感染。例如，CAMP因子可用于預防或治療大范圍的動物和鳥類包括人類中的李斯特菌病。在反芻動物和禽類如鵝、小雞、火雞、鴨子、金絲雀和鸚鵡中的感染表現為腦炎和腦膜腦炎；在單胃動物、新生反芻動物和家禽中表現為敗血癥；和在多種動物中表現為自發(fā)流產和潛伏感染。氣單胞菌屬引起魚類的感染，包括鮭科、水族館中的魚、金魚、淡水和海水魚；同樣也感染籠養(yǎng)的鳥和兩棲動物及爬行動物。馬紅球菌引起馬的呼吸道感染、淋巴管炎、腹膜炎、腸炎、膿腫和自發(fā)流產?；【鷮僖鹪S多培養(yǎng)的、水族館中的和野生海洋及港灣野生魚類的弧菌病；鯨目動物的創(chuàng)口的感染；和引起小雞中禽類弧菌性肝炎和禽類感染性肝炎。
因此CAMP因子疫苗可在大量的物種中用于治療和/或預防大量的細菌感染。
多種菌株來源的CAMP因子可單獨或組合地用于本發(fā)明的的疫苗組合物中。例如，本發(fā)明的疫苗組合物中有時優(yōu)選具有一種或多種CAMP因子的不止一個的表位，使得可對目標主體提供廣譜的抗感染保護。在其最簡單的形式中，可通過應用編碼其中一種CAMP因子的完整序列的多肽，或組合編碼兩種或多種CAMP因子或CAMP因子的表位的序列的多肽來實現。因此疫苗組合物可包含，例如一種或多種CAMP因子的各種組合，或多個CAMP因子或甚至來自CAMP因子的多種表位的組合。
而且，本發(fā)明的疫苗組合物可包括其他細菌、真菌、病毒或原蟲的抗原。這些抗原可以單獨提供或由含有融合到這些抗原上的一種或多種CAMP因子的融合蛋白來提供。
CAMP因子的產生上述的CAMP因子和其活性片段、類似物和從中衍生的嵌合蛋白，可以通過多種方法產生。特別是，CAMP因子可以從表達該因子的細菌中直接分離。這一般首先通過制備缺乏細胞組分和一些胞外蛋白的粗提物來完成。接著所需蛋白可進一步純化如，通過柱層析、HPLC、免疫吸附技術或其他本領域已熟知的常規(guī)方法。
更特別的是，分離CAMP因子的技術已在下列文獻中描述，如，Skalka，B.和Smola，J.(1981)Zbl.Bakt.Hyg.，I.Abt.Orig.A249190-194；Skalka等(1980)Zbl.Vet.Med.B27559-566；Skalka等(1979)Zbl.Vet.Med.B26679-687；Bernheimei等(1979)感染免疫23838-844；Jurgens等(1985)色譜學雜志348363-370；Jurgens等(1987)實驗醫(yī)學雜志165720-732。
另外，如本文所述，該蛋白質可以由重組產生。如上文所解釋，這些重組體可采用下述形式，部分蛋白質序列的形式、全長序列形式、包括信號序列的前體形式，沒有信號序列的成熟形式、或甚至融合蛋白形式(如，融合了重組體宿主的合適先導序列，或鏈球菌或另一病原體的另一個亞單位抗原序列)。
本發(fā)明的CAMP因子基因可以根據蛋白質產物顯示CAMP活性的能力來分離，利用如下文所示的CAMP分析實驗。因此，可以構建基因文庫并且所得克隆用于轉化適當的宿主細胞。菌落可被匯總并篩選有CAMP活性的克隆。菌落同樣可用所需抗原的多克隆血清或單克隆抗體進行篩選。
此外，一旦氨基酸序列被決定，可制備含有已確定氨基酸序列部分的密碼子的寡核苷酸探針，并用于從DNA文庫中篩選編碼目的蛋白質的基因。制備寡核苷酸探針和DNA文庫的基本策略及利用核酸雜交的篩選，都已被本領域的普通技術人員所熟知。見，如，DNA克隆卷I，同上。核酸雜交，同上；寡核苷酸合成，同上；Sambrook等，同上。一旦在篩選文庫中檢測到雜交陽性的克隆，它可以用限制酶切分析和DNA測序來證實該特定文庫片段含有所需CAMP因子基因或其同源基因。
另外，編碼所需蛋白質的DNA序列可通過合成而不是克隆來制備?？筛鶕貏e的氨基酸序列用適當的密碼子設計DNA序列。一般，如果該序列將用來表達，人們將選擇所用宿主慣用的密碼子。通過通常方法制備的重疊寡核苷酸組合成完整的序列，并組合成一個完整的編碼序列。見，如，Edge(1981)自然292756；Nambair等(1984)科學2231299；Jay等(1984)生物化學雜志2596311。
一旦所需蛋白質的編碼序列已制備好或已被分離到，它們可被克隆進任何合適的載體或復制子。大量的克隆載體為本領域的技術人員所熟知，適當的克隆載體的選擇只是一個選擇問題。用來克隆的重組DNA載體和它們可轉化的宿主細胞的實施例包括細菌噬菌體λ(大腸桿菌)、pBR322(大腸桿菌)、pACYC177(大腸桿菌)、pKT230(革蘭氏陰性細菌)、pGV1106(革蘭氏陰性細菌)、pLAFR1(革蘭氏陰性細菌)、pME290(非大腸桿菌的革蘭氏陰性細菌)、pHV14(大腸桿菌和枯草芽孢桿菌)、pBD9(芽孢桿菌)、pIJ61(鏈霉菌)、pUC6(鏈霉菌)、YIp5(酵母菌)、YCp19(酵母菌)、和牛乳頭瘤病毒(哺乳動物細胞)。見，分子克隆I和II卷，同上；Sambrook等，同上；B.Perbal，同上。
該基因可置于啟動子、核糖體結合位點(對細菌表達)和按需要可選擇的操作子(這里統(tǒng)稱為“調控元件”)的控制之下，使得在含有該表達結構的載體轉化的宿主細胞中編碼所需蛋白質的DNA序列被轉錄成RNA。編碼序列可以含或不含有信號肽或先導序列。如果包含信號序列，它們可以是親本的、同源的序列或異源的序列。例如，乳房鏈球菌CAMP因子的信號序列(如圖4A所示)，可被用于多種CAMP因子的分泌，同樣一些其它的信號序列也可以如此，這在本領域是熟知的。通過宿主的翻譯后加工過程可以除去先導序列。見，如，美國專利號4,431,739；4,425,437；4,338,397。
還可能需要允許調節(jié)與宿主細胞的生長有關的蛋白序列表達的其他調節(jié)序列。調節(jié)序列已為本領域技術人員所熟知，實例包括響應于一個物理或化學的刺激(包括調節(jié)化合物的存在)引起基因表達的開啟和關閉的那些調節(jié)序列。其他類型的調節(jié)元件也可引入載體中，例如，增強子序列。
調控序列和其他調節(jié)序列可以被連接到編碼序列上，然后插入載體中，如上文所述的克隆載體?；蛘撸幋a序列可以直接被克隆進一個已含有調控序列和合適的限制酶切位點的表達載體中。
在某些情況下，編碼序列可能必須被修飾以使得該序列可以合適的取向與控制序列相連；即，維持正確的讀碼框。有時也需要產生CAMP因子的突變體或類似物?？梢酝ㄟ^蛋白質編碼序列部分的缺失來制備突變體或類似物，也可以通過一個序列的插入，和/或通過序列中一個或多個核苷酸的取代。修飾核苷酸序列的技術，例如定點突變，被描述在，如，Sambrook等，同上；DNA克隆，卷I&II，同上；核酸雜交，同上。
該表達載體接著被用于轉化一個適當的宿主細胞。本領域已知許多哺乳動物細胞系，包括可從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)獲得的無限增殖細胞系，例如，但不局限于，中國倉鼠卵巢細胞(CHO)、HeLa細胞、幼倉鼠腎(BHK)細胞、猴腎細胞(COS)、人肝癌細胞(如，Hep G2)、Madin-Dary牛腎(“MDBK”)細胞、以及其他一些細胞。相似地，細菌宿主如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、和鏈球菌菌種可用于本表達結構中。在本發(fā)明中有用的酵母宿主特別包括啤酒糖酵母、白色假絲酵母、麥芽糖假絲酵母、多形漢遜氏酵母、胞壁克魯維氏酵母、乳克魯維氏酵母、季也蒙畢赤酵母、巴斯德畢赤酵母、粟酒裂殖糖酵母和Yarrowialipolytic。用于桿狀病毒表達載體的昆蟲細胞特別包括埃及伊蚊、苜蓿銀紋夜蛾、家蠶、黑尾果蠅、草地夜蛾、和粉紋夜蛾。
根據表達系統(tǒng)和所選擇的宿主，本發(fā)明的蛋白質通過如上文所述的表達載體轉化的宿主細胞在一定條件下培養(yǎng)使所需的蛋白質得到表達來獲得。接著從宿主細胞中分離并純化該蛋白質。如果表達系統(tǒng)能夠分泌蛋白質到培養(yǎng)介質中，蛋白質可直接從培養(yǎng)基中純化。如果蛋白質不分泌，就在細胞裂解液中分離蛋白質。合適培養(yǎng)條件和回收方法的選擇在本領域技術人員的技術范圍內。
本發(fā)明的蛋白質也可以通過化學合成而產生，例如固相肽合成，利用已知的氨基酸序列或目的基因的DNA序列得來的氨基酸序列。這些方法是本領域的技術人員已知的。如果抗原的一個小片段能夠激發(fā)目標主體的免疫應答，則多肽的化學合成可能是優(yōu)選的。
CAMP因子、片段、類似物和含有它們的嵌合物，可以利用幾種標準實驗的任一種來檢測CAMP活性。例如，CAMP因子已知對多種靶細胞(包括牛和羊紅細胞)顯示裂解活性。因此，一個檢測CAMP因子活性的簡便方法即為利用羊或牛紅細胞的標準溶血反應來進行。見，如，Christie等，(1944)澳大利亞實驗生物醫(yī)學科學雜志22197-200；Brown等，(1974)感染免疫9377-383；Darling，C.L.(1975)臨床微生物學雜志1171；Wilkinsin，H.W.(1977)臨床微生物學雜志642；Bernheimer等(1979)感染免疫23838-844；Skalka，B和Smola，J.(1981)Zbl.Bakt.Hyg.，I.Abt Orig A249190-194；Huser等，(1983)普通微生物學雜志(J.Gen.Microbiol.)1291295。
活性還可以通過監(jiān)測對CAMP因子分解敏感的物質組成的脂質體中截留的標記分子的釋放來檢測。例如，CAMP因子活性可利用含[14C]標記的葡萄糖的脂質體進行監(jiān)測，脂質體由如鞘磷脂、膽固醇和磷酸二(十六烷基)酯制成，并檢測由于CAMP因子的分解脂質體中截留的[14C]標記的葡萄糖的釋放。見，Bernheimer等(1979)感染免疫23838-844。相似地，可檢測CAMP因子存在下脂質體中ATP的釋放，如Sterzik等(1984)所述，“無乳鏈球菌的CAMP因子與人工膜的相互作用”，載于Alouf等編著的《細菌蛋白質毒素》中，倫敦學術出版公司，1984195-196；和Sterzik等(1985)Zentralbl.Bakteriol.Mikrobiol.Hyg.Abt 1 Suppl.15101-108。也見于，Fehrenbach等(1984)“兩親性的細菌多肽與人工膜的相互作用”，載于Alouf等編著的《細菌蛋白質毒素》中，倫敦學術出版公司，1984317-324。
本發(fā)明的CAMP因子或其片段可用于產生抗體，包括多克隆抗體和單克隆抗體。如果需要多克隆抗體，用本發(fā)明的抗原或其片段或突變的抗原免疫選擇的哺乳動物(如，小鼠、兔子、山羊、馬等)。收集免疫動物的血清并根據已知的程序進行處理。見，如，Jurgens等(1985)色譜學雜志348363-370。如果利用含有多克隆抗體的血清，可以通過免疫親和層析按已知程序純化多克隆抗體。
CAMP因子和其片段的單克隆抗體也可以由本領域技術人員容易地制得。利用雜交瘤技術制備單克隆抗體的一般方法是己知的。永生化產生抗體的細胞系可通過細胞融合得到，也可通過其他技術如用癌基因DNA直接轉化B淋巴細胞，或用EB病毒轉染。見，如，M.Schreier等，雜交瘤技術(1980)；Hammerling等，單克隆抗體和T細胞雜交瘤(1981)；Kennett等，單克隆抗體(1980)；也見于美國專利號4,341,761；4,399,121；4,427,783；4,444,887；4,452,570；4,466,917；4,472,500；4,491,632；和4,493,890。產生的一系列針對所述CAMP因子或其片段的單克隆抗體，可以根據多種特性來篩選；例如，根據同型的(Ig)、表位、親和性等。單克隆抗體在利用免疫親和層析技術純化其所直接對應的單個抗原方面是有用的。多克隆抗體和單克隆抗體也可應用于被動免疫或可與亞單位疫苗制品結合來增強免疫應答。
疫苗制品和給藥本發(fā)明的CAMP因子可配制在疫苗組合物中，單獨或與其他抗原組合，用于按如下文所示免疫主體。制備該制品的方法如以下文獻中所述，如，Remington’s藥學，Mack出版公司，Easton，Pennsylvania，18版，1990。典型地，本發(fā)明的疫苗可制備成可注射制品，或溶液形式或懸液形式。也可制備適于在注射前溶于或懸于液體介質中的固體形式。該制品也可被乳化或活性成分被包裹入脂質載體中?；钚悦庖咴猿煞忠话闩c相容性藥物載體混合，例如水、鹽水、右旋糖、甘油、乙醇、或其類似的物質和其組合。另外，如果需要，載體可含少量的輔助物質如潤濕劑或乳化劑以及pH緩沖試劑。
增強疫苗效力的佐劑也應被加入制劑中。佐劑可包括例如胞壁酰二肽、阿維丁(avridine)、氫氧化鋁、二甲基二(十八烷基)溴化銨(DDA)、油、水包油乳液、皂苷、細胞因子、和本領域已知的其他物質。
為增強其免疫原性，CAMP因子可以與一個載體相連。合適的載體包括大的代謝緩慢的大分子如蛋白質，包括血清白蛋白、槭形血藍蛋白、免疫球蛋白分子、甲狀腺球蛋白、卵清蛋白、和本領域的技術人員已熟知的其他的蛋白質；多糖，如瓊脂糖凝膠、瓊脂糖、纖維素、纖維素珠和其他類似物；聚合的氨基酸如聚谷氨酸、聚賴氨酸、和其他類似物；氨基酸共聚物；和失活的病毒顆粒。
CAMP因子可以其天然的形式使用或其功能基團成分被修飾，例如賴氨酸殘基的琥珀酰化或與半胱氨酸-硫代內酯的反應。巰基基團也可包含在載體(或抗原)中，如通過氨基功能團與2-亞氨基硫雜環(huán)戊烷或3-(4-二硫吡啶)丙酸的N-羥基琥珀酰亞胺脂反應。適當的載體也可被修飾而含有間隔臂(如六亞甲基二胺或其他的相似大小的雙功能分子)以與多肽連接。
本發(fā)明CAMP因子的其他合適的載體包括逆轉錄病毒的VP6多肽，或其功能性片段，如美國專利號5,071,651所揭示。也可以使用病毒蛋白與免疫原的融合產物，其制備方法揭示于美國專利號4,722,840。還有其他合適的載體包括細胞，如淋巴細胞，由于以這種形式的提呈模仿了在主體中提呈的自然模式，因此產生了免疫狀態(tài)?；蛘撸景l(fā)明的蛋白質可與紅細胞偶聯，優(yōu)選與主體自己的紅細胞偶聯。肽與蛋白質或細胞偶聯的方法是本領域技術人員所熟知的。
另外，CAMP因子(或其復合物)可以中性或鹽形式配制成疫苗組合物。藥學適用的鹽包括酸加成鹽(由活性多肽的游離氨基形成)，它們由無機酸如鹽酸或磷酸，或有機酸如乙酸、草酸、酒石酸、苯乙醇酸等形成。由游離羧基形成的鹽可來自無機堿如氫氧化鈉、鉀、銨、鈣、或亞鐵，和有機堿如異丙基胺、三甲基胺、2-乙氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等。
注射用的疫苗制劑將含有“治療有效量”的活性成分，即，一個能夠在給予該組合物的主體中誘導免疫應答的量。例如在治療和預防乳腺炎中，“治療有效量”將優(yōu)選控制感染的量，如通過檢測如組合物維持或降低奶中體細胞數低于約500,00個細胞/ml的能力來確定。精確的量可由本領域技術人員利用常規(guī)實驗容易地確定。CAMP因子在組合物中典型的含量為從1％到95％(w/w)的范圍，或如果適當甚至更高或更低。根據本疫苗組合物，當給予每個動物1-3ml劑量時，注射溶液中含有20到500μg/ml的活性成分應足以激發(fā)免疫應答。
為免疫主體，該疫苗一般以腸胃外方法給藥，常通過肌肉內注射。但其他的給藥方如皮下、腹膜內和靜脈內注射也是可接受的。給藥量依賴于被治療的動物、動物的免疫系統(tǒng)合成抗體的能力、以及所需保護的程度。本領域普通技術人員可通過常規(guī)實驗建立的劑量效應曲線容易地確定有效劑量。給予至少一個劑量的疫苗來免疫主體，優(yōu)選兩個劑量。但是，動物可以接受維持對感染的免疫狀態(tài)所需的多個劑量。
適合于其他給藥方式的疫苗制劑包括栓劑和在某些情況下的氣霧劑、鼻腔內的、口服的制劑、和持續(xù)釋放的制劑。對于栓劑，載體成分將包括傳統(tǒng)的粘合劑和載體，例如，聚亞烷基二醇或甘油三酯。這些栓劑可由含有約0.5％-10％(w/w)的活性成分(優(yōu)選約1％-2％)的混合物形成?？诜d體包括那些正常使用的賦形劑，例如，藥物級的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精纖維素納、碳酸鎂等。這些口服疫苗組合物可以采用下列形式；溶液形式、懸液形式、片劑形式、丸劑形式、膠囊形式、持續(xù)釋放制劑形式、或粉劑形式，并含有從約10％到約95％的活性成分，優(yōu)選從約25％到約70％。
鼻腔內制劑將通常包含既不刺激鼻粘膜也不顯著干擾纖毛功能的載體。稀釋劑如水、鹽水或其他已知物質可用于本發(fā)明。鼻腔內制劑還可含有防腐劑如，但不局限于，氯代丁醇和氯潔爾滅。可加入表面活性劑來增強鼻粘膜對本發(fā)明蛋白質的吸收。
可控制的或持續(xù)釋放的制劑可通過將蛋白質摻入下列載體或介質中而制成，載體或介質如脂質體、不可吸收不可滲透的聚合物如乙烯乙酸乙烯酯共聚物和Hytrel共聚物，或可膨脹的聚合物如水凝膠，或可再吸收的聚合物如膠原蛋白和某些聚酸或聚酯如用于形成可再吸收縫合的那些。CAMP因子也可利用植入的微小泵導入體內，這在本領域是熟知的。
本發(fā)明的CAMP因子也可通過表達它的病毒載體來給藥。用于本發(fā)明的載體病毒包括但并不局限于痘苗病毒和其他痘病毒、腺病毒、和肝炎病毒。例如，表達該新蛋白的痘苗病毒重組體可由如下方式構建。編碼蛋白質的DNA首先插入一個適當的載體中，使該DNA緊連于痘苗病毒的啟動子且側翼為痘苗病毒DNA序列如編碼胸苷激酶(TK)的序列。該載體然后用于轉染同時感染了痘苗病毒的細胞。同源重組作用將痘苗病毒的啟動子連著編碼本發(fā)明蛋白質的基因插入到病毒基因組中。產生的TK-重組體可在5-溴脫氧尿嘧啶的存在下培養(yǎng)細胞來選擇并從其中選擇抗性病毒噬斑。
另一給藥途徑涉及基因治療或核酸免疫。因此，編碼本發(fā)明CAMP因子的核苷酸序列(和伴隨的調節(jié)元件)可以被直接給予主體以在體內從中翻譯蛋白質?；蛘撸蜣D移可由離體轉染主體的細胞或組織并重新將已轉化的材料導入宿主體內來完成。DNA可直接導入宿主器官中，例如通過注射(見國際
發(fā)明者M·江, A·A·潑特爾, P·R·馬克拉切蘭 申請人:薩斯喀徹溫大學