專利名稱：乙酸激酶基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，涉及一種乙酸激酶基因。
背景技術(shù)：
乙酸代謝是葡萄糖代謝的一部分，1分子葡萄糖分解為2分子丙酮酸，1分子丙酮酸轉(zhuǎn)變?yōu)?分子乙酰輔酶A，乙酰輔酶A需要由磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶PTA和乙酸激酶AK的先后催化來進(jìn)行乙酰輔酶A在磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶PTA催化下生成乙酰磷酸，再在ATP參與下由乙酸激酶AK催化乙酰磷酸轉(zhuǎn)化為乙酸，而生成的乙酸排出體外，導(dǎo)致培養(yǎng)基中乙酸的積累，降低培養(yǎng)基的pH值，從而抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)。研究表明pH的變化可以改變微生物的發(fā)酵類型，從而影響H2產(chǎn)量。
產(chǎn)氫菌B49是哈爾濱工業(yè)大學(xué)林明博士從生物制氫反應(yīng)器的乙醇型發(fā)酵活性污泥中分離出的一株高產(chǎn)氫乙醇型發(fā)酵菌株，生理生化和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果證實(shí)為一新種或者新屬。該菌株已在中國(guó)微生物菌種保藏中心保藏，保藏編號(hào)為CGMCC1153。產(chǎn)氫菌B49的最大比產(chǎn)氫速率為25.0mmolH2/g·drycell·h，單位體積產(chǎn)氫速率為1813.8mL/L-culture，產(chǎn)氫能力居于國(guó)際前列。其菌株特征為單胞生長(zhǎng)的規(guī)則桿菌；周生鞭毛；G+；無莢膜；無芽孢；專性厭氧；乳白色圓形菌落；代時(shí)為7.2h；在28～43℃，pH＝3.3～8.5條件下生長(zhǎng)。B49酵解葡萄糖的主要發(fā)酵產(chǎn)物為乙醇、乙酸、H2、CO2和乳酸，參見任南琪提出的新型有機(jī)廢水發(fā)酵類型-乙醇型發(fā)酵的代謝途徑推測(cè)B49酵解葡萄糖的代謝途徑(見圖1)。由此可見，乙酸激酶基因的克隆對(duì)研究其代謝工程提高產(chǎn)氫量是重要的。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于乙酸激酶基因的克隆對(duì)研究產(chǎn)氫菌B49代謝工程提高產(chǎn)氫量有很重要的作用，本發(fā)明旨在從Ethanologenbacterium hit B49基因組中分離乙酸激酶基因。本發(fā)明所述的Ethanologenbacterium hit B49乙酸激酶基因Back是以高效產(chǎn)氫菌Ethanologenbacterium hit B49總DNA為模板，通過PCR擴(kuò)增獲得的。本發(fā)明的Ethanologenbacterium hit B49乙酸激酶基因Back序列全長(zhǎng)2034bp，其中A、C、G、T分別為489(24.04％)、625(30.73％)、520(25.57％)、400(19.67％)。在253bp處有起始密碼子ATG，在1450bp處有終止密碼子TAA，在198bp有一個(gè)推測(cè)的啟動(dòng)子序列CGGCATTGCAATGCTTTCATCGAATGCTTTATTTATTATGCAGGGGGAT。該序列無內(nèi)含子，具有1200bp完整的開放讀碼框，編碼399個(gè)氨基酸。編碼產(chǎn)物分子量為43.22kD，等電點(diǎn)pI為5.93。通過GenBank基因序列比對(duì)分析，表明本發(fā)明的乙酸激酶基因Back是一個(gè)新的乙酸激酶基因，與已注冊(cè)的乙酸激酶同源性為49～58％，其中與Thermotoga maritima MSB8的乙酸激酶基因同源性最高(58％)，證明是一個(gè)新的細(xì)菌乙酸激酶基因。該基因具有表達(dá)功能，分離的Back基因與原核表達(dá)載體pet-22b連接，構(gòu)建成pet-22b-Back重組表達(dá)載體，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后表達(dá)出該基因蛋白(45～50kD)，證實(shí)是一個(gè)具有表達(dá)功能的基因。本發(fā)明從Ethanologenbacterium hit B49基因組中分離乙酸激酶基因，擴(kuò)大乙酸激酶基因資源，從而為Ethanologenbacterium hit B49的代謝工程研究和構(gòu)建基因工程菌提供了科學(xué)依據(jù)。


圖1為產(chǎn)氫菌B49的代謝途徑，圖2為pMD18-T載體結(jié)構(gòu)圖譜，圖3為pMD18-T載體的酶切位點(diǎn)結(jié)構(gòu)圖，圖4為TaKaRa LA PCRTMin vitro cloning Kit試劑盒的PCR擴(kuò)增原理圖，圖5為特異性引物設(shè)計(jì)位置圖，圖6為pet-22b載體結(jié)構(gòu)圖譜，圖7為pet-22b載體的酶切位點(diǎn)結(jié)構(gòu)圖。
具體實(shí)施例方式
具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式中所述的Ethanologenbacterium hit B49乙酸激酶基因Back是以高效產(chǎn)氫菌Ethanologenbacterium hit B49總DNA為模板，通過PCR擴(kuò)增獲得的。其具體方法如下1、乙酸激酶基因的克隆(1)PCR引物的設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank中收錄的細(xì)菌乙酸激酶蛋白質(zhì)序列(具體菌種見表1)，用Blockmaker(http//blocks.fhere.org/blocks/blockmkr/make-blocks.html)進(jìn)行序列比對(duì)分析，然后將比對(duì)結(jié)果輸入CODEHOP(http//blocks.fhere.org/blocks/codehop.html)在線引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物，選用了一對(duì)PCR擴(kuò)增簡(jiǎn)并引物，具體序列見表2表1設(shè)計(jì)乙酸激酶基因簡(jiǎn)并引物所用乙酸激酶蛋白質(zhì)的菌種

表2.CODEHOP軟件設(shè)計(jì)的擴(kuò)增乙酸激酶的簡(jiǎn)并引物

注N(A，C，T或G)、R(A或G)、H(非G)、B(非A)、D(非C)。
(2)Ethanologenbacterium hit B49基因組總DNA的提取取Ethanologenbacterium hit B49菌液約50mL，用上海華舜生物工程有限公司生產(chǎn)的華舜小量細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒提取，提取步驟參見小量細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒操作手冊(cè)。
(3)乙酸激酶基因部分片段的PCR擴(kuò)增以Ethanologenbacterium hit B49總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系1xBuffer，0.6mM dNTP，引物ACKJ1-forward、ACKJ1-reverse各1.0μM，ExTaqDNA聚合酶2.5U，模板DNA 0.2～1μg，加ddH2O至50μL。反應(yīng)程序預(yù)變性95℃5min，94℃30s；62℃降到50℃，每次降1℃，40s；72℃2min，共12個(gè)循環(huán)，然后按94℃30s；50℃40s；72℃2min，共23個(gè)循環(huán)，最后在72℃延伸10min，4℃保存。
(4)PCR產(chǎn)物的克隆PCR產(chǎn)物用上海華舜生物工程有限公司生產(chǎn)的柱式華舜小量膠回收試劑盒回收，方法參照試劑盒小量膠回收操作手冊(cè)。pMD18-T是一種常用的克隆載體，大小為2692bp，具有Amp抗性基因；帶有一段大腸桿菌lacZ的調(diào)控序列和N-端146個(gè)氨基酸的編碼信息，此編碼區(qū)插入了多克隆位點(diǎn)，若無外源基因插入，載體會(huì)與大腸桿菌lacZ的C-端序列功能互補(bǔ)，即α互補(bǔ)，產(chǎn)生有完整活性的β-半乳糖苷酶；若有外源基因插入，則破壞了其讀碼框，產(chǎn)生無α互補(bǔ)能力的肽段，因此，在附加X-gal和IPTG的篩選培養(yǎng)基上白色菌落為帶有重組質(zhì)粒的細(xì)菌，藍(lán)色菌落為帶有重新環(huán)化載體的細(xì)菌。本實(shí)施方式的pMD18-T載體購(gòu)自大連寶生物工程公司，其pMD18-T質(zhì)粒圖譜及其酶切位點(diǎn)見圖2和3。回收產(chǎn)物與pMD18-T克隆載體連接，連接體系pMD18-T載體1μl(50ng)，PCR產(chǎn)物2μl(100～200ng)，Ligation Solution 5μl，加ddH2O至10μL，16℃過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.ColiDH5α感受態(tài)細(xì)胞。在含有氨芐青霉素、X-gal和IPTG的LB篩選平板上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，并提取白斑菌落質(zhì)粒進(jìn)行菌落PCR以鑒定陽性重組子。其中
a、采用CaCl2法制備E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞①E.coliDH5α在LB平板上劃線培養(yǎng)12～16h，挑取單菌落接入不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。
②取過夜活化的E.coliDH5α菌液1ml置于100ml新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600約為0.3。
③將菌液分裝于兩個(gè)預(yù)冷的50ml無菌離心管中，冰浴30min。
④4℃，4000rpm，離心10min，棄上清。
⑤加入10ml冰冷的0.1M CaCl2，重懸菌體，冰浴30min。
⑥4℃，4000rpm，離心10min，棄上清。
⑦加入2ml冰冷的0.1M CaCl2，重懸菌體。
b、熱激法轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞①取200μl感受態(tài)細(xì)胞，置于冰上，加入4μl連接產(chǎn)物，輕輕旋轉(zhuǎn)混勻內(nèi)容物。
②冰浴30min。
③42℃水浴中熱激90s，勿搖動(dòng)。
④冰浴2～3min。
⑤加入800μl無附加抗生素的LB培養(yǎng)基，混勻，37℃200～250rpm搖床振蕩預(yù)表達(dá)培養(yǎng)45～60min。
⑥室溫，4000rpm，離心5min，棄去900μl上清液，余液將菌體懸浮。
⑦將細(xì)菌涂布在附加50mg/LAmp、4μlIPTG和40μl X-gal的LB固體培養(yǎng)基上。
⑧平板于37℃正向放置至液體被吸收，然后倒置培養(yǎng)過夜。
c、陽性重組子的篩選及鑒定①藍(lán)白斑反應(yīng)篩選陽性重組子根據(jù)α-互補(bǔ)反應(yīng)的原理，在附加X-gal和IPTG的篩選培養(yǎng)基上產(chǎn)生的白色菌落為帶有重組質(zhì)粒的菌落，藍(lán)色菌落為帶有重新環(huán)化載體的菌落，因此白色菌落可初步鑒定為陽性重組子。
②陽性重組子的菌落PCR鑒定挑取白斑菌落，利用通用引物RV-M和M13-47進(jìn)行PCR，PCR條件95℃預(yù)變性10min；94℃30s，50℃30s，72℃90s，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存。進(jìn)行0.8％瓊脂糖凝膠電泳，若電泳顯示出與目的DNA大小的條帶，則證明質(zhì)粒重組正確，是陽性重組子。
(5)DNA序列測(cè)定與分析陽性重組子選用Invitrogen上海英俊生物技術(shù)有限公司自動(dòng)序列分析儀進(jìn)行序列測(cè)定，序列同源性比較在http//www.ncbi.nlm.gov網(wǎng)站上用BLAST程序進(jìn)行。
(6)克隆乙酸激酶基因部分片段兩側(cè)序列Cassette PCR的引物設(shè)計(jì)采用TaKaRaLAPCRTM in vitro cloning Kit試劑盒克隆乙酸激酶基因片段兩側(cè)序列。以已克隆的乙酸激酶基因片段序列為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)與試劑盒中Cassette primerC1、Cassette primer C2引物分別匹配的上游引物ACK-S11-lower、ACK-S12-lower和下游引物ACK-S21-upper、ACK-S22-upper，具體序列見表3。
表3擴(kuò)增乙酸激酶基因部分片段兩側(cè)序列的Cassette PCR引物

其中，Cassette PCR的原理和引物設(shè)計(jì)要求如下a、Cassette PCR原理具體原理見圖4。因?yàn)樵谠O(shè)計(jì)上，Cassette的5′末端沒有磷酸基，所以Target DNA的3′末端和Cassette的5′末端的連接部位形成缺口。在第一次PCR反應(yīng)的第一個(gè)循環(huán)時(shí)，從Primer C1開始的延伸反應(yīng)在連接部位終止，限制了Primer C1和Primer C1同一引物之間的擴(kuò)增，從而控制了非特異性PCR擴(kuò)增。只有從Primer S11或Primer S21開始延伸合成的DNA鏈，才能成為Primer C1的模板，進(jìn)行DNA的特異性擴(kuò)增反應(yīng)。再用內(nèi)側(cè)Primer(Primer C2，Primer S12或S22)進(jìn)一步進(jìn)行第二次PCR反應(yīng)，可以高效特異性地?cái)U(kuò)增目的DNA。
當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的氨基酸序列已知時(shí)，可以根據(jù)已知信息設(shè)計(jì)Mixed primer，擴(kuò)增編碼蛋白質(zhì)的cDNA。
本試劑盒原理的具體步聚如下1)用EcoR I限制酶將Ethanologenbacterium hit B49基因組DNA完全分解。
2)與具有EcoR I限制酶酶切位點(diǎn)的Cassette接頭進(jìn)行連接反應(yīng)。
3)用Cassette Primer(Primer C1)和根據(jù)已知區(qū)域的DNA序列設(shè)計(jì)的Primer(Primer S11或Primer S21)，進(jìn)行第1次PCR(1st PCR)反應(yīng)。
4)取3)的PCR反應(yīng)液的一部分作模板，使用內(nèi)側(cè)Primer(Primer C2和Primer S12或Primer S22)進(jìn)行第2次PCR(2nd PCR)反應(yīng)，特異性地?cái)U(kuò)增目的DNA片段。
b、Specific Primer(S11或S21，S12或S22)的設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)1)根據(jù)已知區(qū)域設(shè)計(jì)Primer(見圖5)。設(shè)計(jì)方向?yàn)樾枰獢U(kuò)增的未知區(qū)域的方向。S2的位置應(yīng)設(shè)計(jì)在S1的內(nèi)側(cè)，兩個(gè)引物間的距離沒有嚴(yán)格的規(guī)定。
設(shè)計(jì)引物時(shí)還需要注意以下幾點(diǎn)①引物長(zhǎng)度為20～35mer(擴(kuò)增長(zhǎng)鏈DNA時(shí)最好為30～35mer)。
②GC含量在50％左右，避免局部GC或AT集中。特別是引物的3′端不要AT集中。
③引物自身不要形成發(fā)夾等明顯的二級(jí)結(jié)構(gòu)。
④兩個(gè)Specific Primer(S11或S21、S12或S22)要與Cassette Primer(C1、C2)組合使用，所以設(shè)計(jì)時(shí)還要考慮不要與配對(duì)的引物形成引物二聚體，特別是3′端的3、4個(gè)堿基不要與配對(duì)的引物序列互補(bǔ)。
2)根據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸序列進(jìn)行設(shè)計(jì)引物時(shí)應(yīng)注意以下幾點(diǎn)①首先將氨基酸序列轉(zhuǎn)換成編碼氨基酸的堿基序列。應(yīng)盡量選擇簡(jiǎn)并少的區(qū)域設(shè)計(jì)引物，但與簡(jiǎn)并少而較短的引物相比，還不如使用簡(jiǎn)并多而較長(zhǎng)的引物比較合適。
②如果想減少引物簡(jiǎn)并，可考慮Codon usage進(jìn)行設(shè)計(jì)。
③3′末端不要簡(jiǎn)并。
④如果使用Mixed primer進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，需要將退火溫度降低，而其結(jié)果往往會(huì)引起非特異性的擴(kuò)增。如果有關(guān)DNA序列信息較多時(shí)，可進(jìn)一步在內(nèi)側(cè)再設(shè)計(jì)一個(gè)引物，用以鑒定目的DNA片段。
(7)克隆乙酸激酶基因部分片段兩側(cè)序列的Cassette PCR擴(kuò)增根據(jù)已克隆的乙酸激酶基因片段序列，分析該序列的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)情況，找出該序列沒有的限制性內(nèi)切酶，而TaKaRa LAPCRTMin vitro cloning Kit試劑盒中有該酶接頭的限制性內(nèi)切酶，最后選定用EcoR I酶切基因組DNA，酶切后的基因組DNA和用EcoR I adaptor接頭于16℃連接30h。Cassette PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如下A、DNA的限制酶酶切反應(yīng)反應(yīng)體系見表4。
表4

*代表使DNA完全分解的必要酶量，根據(jù)制備的DNA純度而定，一般10U分解1μgDNA。
B、連接反應(yīng)①按下列組份配制連接反應(yīng)液(表5)。
表5

②16℃反應(yīng)30分鐘。
③反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行乙醇沉淀回收DNA。
④溶解于5μl的滅菌蒸餾水中。
C、PCR擴(kuò)增①將B-④DNA溶液1μl加入到33.5μl滅菌蒸餾水中，94℃加熱10分鐘。
②按下列組份配制第一次(1st)PCR反應(yīng)液(表6)。
表6

③按以下條件進(jìn)行1stPCR反應(yīng)。
94℃30sec，55℃2min，72℃1min，共30個(gè)循環(huán)。
④用滅菌水將B-③的PCR反應(yīng)液按適當(dāng)倍數(shù)稀釋(1～10,000倍稀釋)，再取1μl進(jìn)行(第二次)2nd PCR反應(yīng)，2nd PCR反應(yīng)液組份如表7。
表7

⑤按以下條件進(jìn)行2nd PCR反應(yīng)。
94℃30sec，55℃2min，72℃1min，共循環(huán)30次。
⑥反應(yīng)結(jié)束后，取PCR反應(yīng)液(5～10μl)進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，可以得到擴(kuò)增到的PCR片段。
(8)乙酸激酶全長(zhǎng)基因的PCR擴(kuò)增、克隆和測(cè)序根據(jù)已拼接的序列設(shè)計(jì)全長(zhǎng)驗(yàn)證引物ACK-upper和ACK-lower，以Ethanologenbacterium hit B49基因組總DNA為模板擴(kuò)增全長(zhǎng)乙酸激酶基因。PCR反應(yīng)體系為94℃5min，94℃30s，58℃30s，72℃1min20s，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min，所用引物見表8。
表8乙酸激酶基因全長(zhǎng)驗(yàn)證引物

(9)Ethanologenbacterium hit B49乙酸激酶基因的原核表達(dá)將乙酸激酶基因Back與原核表達(dá)載體pet-22b重組，構(gòu)建成重組表達(dá)質(zhì)粒pet-22b-Back，熱激法轉(zhuǎn)化到原核表達(dá)宿主菌E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，1.0mMIPTG誘導(dǎo)3.5h后，經(jīng)12％的SDS-PAGE凝膠電泳、考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)基因的表達(dá)情況。pet-22b載體購(gòu)于Novagen公司，其質(zhì)粒圖譜及酶切位點(diǎn)見圖6和7。
根據(jù)pet-22b表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)序列，在乙酸激酶基因的253bp(起始密碼子ATG)處引入Nde I酶切位點(diǎn)，在1450bp(終止密碼子TAA)處引入Xho I酶切位點(diǎn)，具體引物見表9。PCR反應(yīng)條件95℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min30s，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。膠回收PCR產(chǎn)物，經(jīng)Nde I和Xho I酶切，在膠回收，與同樣用Nde I和XhoI酶切且膠回收的pet-22b原核表達(dá)載體于16℃連接3h。將該連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.ColiDH5α感受態(tài)細(xì)胞。在含有氨芐青霉素、X-gal和IPTG的LB篩選平板上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，并提取白斑菌落質(zhì)粒進(jìn)行菌落PCR以鑒定陽性重組子。提取陽性克隆質(zhì)粒，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)plys感受態(tài)細(xì)胞。在含有氨芐青霉素、X-gal和IPTG的LB篩選平板上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，并提取白斑菌落質(zhì)粒進(jìn)行菌落PCR以鑒定陽性重組子。
表9乙酸激酶基因表達(dá)用引物

(10)Ethanologenbacterium hit B49乙酸激酶活力測(cè)定A、乙酸激酶活力測(cè)定反應(yīng)液145mM Tris-HCl、200mM乙酸鉀、10mM ATP、0.7M中性NH2OH-HCl，333μL。
測(cè)定把細(xì)胞粗提液加入上述反應(yīng)液中起始反應(yīng)，25℃20min，然后加入終濃度5％的三氯乙酸終止反應(yīng)。往反應(yīng)物中加入2.5％FeCl2(溶于2N HCl)至1mL于25℃顯色15分鐘，13000×g離心5分鐘去除不溶物質(zhì)，在A540nm處吸光度。
B、蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用上海申能生物工程有限公司BCA蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒。
C、酶活單位的定義(U)每毫克(milligram)蛋白每分鐘消耗的ATP產(chǎn)物的微摩爾數(shù)。乙酸激酶活力為70U。
本發(fā)明所述的Ethanologenbacterium hit B49乙酸激酶基因Back是乙酸激酶，序列的Blast同源性比對(duì)結(jié)果顯示該基因與GenBank中已注冊(cè)的序列存在差異，是一個(gè)新的基因。
乙酸激酶Back基因序列特征該基因全長(zhǎng)2034bp，其中A、C、G、T分別為489(24.04％)、625(30.73％)、520(25.57％)、400(19.67％)。在253bp處有起始密碼子ATG，在1450bp處有終止密碼子TAA，在198bp有一個(gè)推測(cè)的啟動(dòng)子序列CGGCATTGCAATGCTTTCATCGAATGCTTTATTTTATTATGCAGGGGGAT。該序列無內(nèi)含子，具有1200bp完整的開放讀碼框，編碼399個(gè)氨基酸。編碼產(chǎn)物分子量為43.22kD，等電點(diǎn)pI為5.93。
序列表一、乙酸激酶Back基因及其編碼產(chǎn)物序列<110>哈爾濱工業(yè)大學(xué)<120>乙酸激酶基因<160>1<210>1<211>2034<212>DNA<213>乙酸激酶Back基因及其編碼產(chǎn)物序列<400>11GCTCACACCGTTCCTTCCCGCCGTTTGCCGCGCGCCTGACCGCCCGCCGCAAACAACCAT61 GCCCTGATGCGATTCTGATGCAGACGCAGCCGGCCCGCAGCCTGGCTCCTGTGCGTCAAA121 ACCGTCATAAAGCAAACAGGATCCCGCATACTACTTGCAACTGCTTTCCCTACCTTATAT181 AATAGTACATGTTGTATCGGCATTCATATGCTTTCATCGAATGCTTTATTTTATTATGCA241 GGGGGATCACATATGAAAATCTTGGTCATCAACGCGGGAAGTTCTTCGCTGAAATACCAAM K I L V I N A G S S S L K Y Q301 CTGATCAACGTGGAGAACAAGGACGTGCTGGCAAAAGGCAACTGCGAGCGCATCGGCATCL I N V E N K D V L A K G N C E R I G I361 GACGGGCGGTTCAAGCACAAAACAGGCGACGGCCGCGGGTTTGAGCGCGAAGTGGCGCTCD G R F K H K T G D G R G F E R E V A L421 CCCGACCACCGCGCGGCGTTCCGTCTGGTTATCGAAGCCCTTACCACCGGTGAATTTGCCP D H R A A F R L V I E A L T T G E F A481 GTAATCGGCAGCACCAGTGAGATCGACGCGGTGGGCCACCGCATCGTGCACGGCGGCGATV I G S T S E I D A V G H R I V H G G D541 AAGTTCACACACTCCGTGCTGGTGACCGACGAGGTGCTCAAAGAATTTCAGGGAGTCATCK F T H S V L V T D E V L K E F Q G V I601 AATTTCGCCCCCCTGCACAACCCTCCGGCACTCAGCGGCATTGAGGCCTGCCGGGAGACAN F A P L H N P P A L S G I E A C R E T661 CTGGGCAAAGCTGTGCCCAACGTCATGGTGTTCGACACCGCATTCCACCAGACCATGCCGL G K A V P N V M V F D T A F H Q T M P721 CCCCAGGCCTACATCTTCGGCGTGCCGTATAAATATTATGAGCAGTACCGCGTTCGCCGCP Q A Y I F G V P Y K Y Y E Q Y R V R R781 TACGGCGCGCATGGCACCTCCCACCGCTATGTCAGCCTGCGTTGCGCGGAGCTGCTGGGTY G A H G T S H R Y V S L R C A E L L G841 AAAAAGCCGGAAGAAACCAAGATCGTCACCTGCCATCTGGGCAACGGTTCCTCCATCTCC
K K P E E T K I V T C H L G N G S S I S901 GCGGTGGACGCCGGCAAATGTGTGGACACCAGCATGGGCTTTACACCTTTAGGCGGCATCA V D A G K C V D T S M G F T P L G G I961 ATCATGGGCACCCGCAGCGGCGACCTCGACCCCTCGGTGGTCACGCTTATCATGGAAAAAI M G T R S G D L D P S V V T L I M E K1021 GAAGGAATCAGCCCGCGCGATATGGAAAACCTGCTGAACAAGGAATCCGGCTTCATCGGCE G I S P R D M E N L L N K E S G F I G1081 ATCTCCGGTATCTCCAGCGACGACCGCGACCTGGAGGAAGCCACCGCCAAGGGCATTGAGI S G I S S D D R D L E E A T A K G I E1141 CGCTCGAAGATTGCGCAGGACGCCCAGCGCTATCAGATCAAAAAACTCGTCGGCGCTTATR S K I A Q D A Q R Y Q I K K L V G A Y1201 TCGGCGGCCATGGGCGGCCTGGACGCGCTGGCGTTCACCGGCGGCATCGGCGAAAATTCCS A A M G G L D A L A F T G G I G E N S1261 TCGCTGCTGCGCGCAGCCGTCTGCGAAAACATGGAATACCTCGGCATCACCTTCGACCCCS L L R A A V C E N M E Y L G I T F D P1321 GCGAAAAACGAAGAAACCATCCGCGGCAAAGAGGGCGACCTTTCCCTGCCCGGCGGCGAAA K N E E T I R G K E G D L S L P G G E1381 GTGCGCGTTTATGTTATCCCCACCAACGAGGAATATATGATCGCGCTCGACACCAAGACAV R V Y V I P T N E E Y M I A L D T K T1441 CTCGTCGGCTAAAAGCTTCTAATAAAACGAATATATAAAAAGCGACGTTCCAAGATCTAGL V G *1501 AACGTCGCTTTTTAACATTCCGCCGCCGCGGAATGCGTTTTCCATACAGATGCGCGGCAA1561 TGGCGGCACTGCTTGCTTTATGACGTGTGATGCGACTCCACAATCTCGCGTTCGCGAAAC1621 AACAGCGAAATGCACCAGATGCCCGCGATGGCCACGAGCGTGAAGATGATACGGCTGACA1681 GCGGAACCGGCTCCACCGAATGCCCAGTCGACCACATCAAAATTAAAAATGCCGACGCTG1741 CCCCAGTTAAGCGCGCCAATAATCACCAGCAGCAAAGCGATCCTGTCCAGCATGAAATCA1801 ACTCCCTTTTGCTTGCAGCCGCGCGGTTTCCTTTACGGTAACCGCAACGGTCCGTCAAAG1861 GTTCAAAAAACAGATGAAGCATTCAGCTACCATCCGCTTTCGCAGATAGTATGGACAAAA1921 ACGGGCGGATTATGCATCCGCCCGTTCCATCGCCTTTTATGTATTGCCGGTTATTCCTCG1981 GCGCCGCTTCTCTGCTCTTTGAGCAAATCGCGGATCTCCTGCAAGACCACCAGA
權(quán)利要求
1.乙酸激酶基因，其特征在于所述乙酸激酶的基因序列為GCTCACACCGTTCCTTCCCGCCGTTTGCCGCGCGCCTGACCGCCCGCCGCAAACAACCATGCCCTGATGCGATTCTGATGCAGACGCAGCCGGCCCGCAGCCTGGCTCCTGTGCGTCAAAACCGTCATAAAGCAAACAGGATCCCGCATACTACTTGCAACTGCTTTCCCTACCTTATATAATAGTACATGTTGTATCGGCATTCATATGCTTTCATCGAATGCTTTATTTTATTATGCAGGGGGATCACATATGAAAATCTTGGTCATCAACGCGGGAAGTTCTTCGCTGAAATACCAACTGATCAACGTGGAGAACAAGGACGTGCTGGCAAAAGGCAACTGCGAGCGCATCGGCATCGACGGGCGGTTCAAGCACAAAACAGGCGACGGCCGCGGGTTTGAGCGCGAAGTGGCGCTCCCCGACCACCGCGCGGCGTTCCGTCTGGTTATCGAAGCCCTTACCACCGGTGAATTTGCCGTAATCGGCAGCACCAGTGAGATCGACGCGGTGGGCCACCGCATCGTGCACGGCGGCGATAAGTTCACACACTCCGTGCTGGTGACCGACGAGGTGCTCAAAGAATTTCAGGGAGTCATCAATTTCGCCCCCCTGCACAACCCTCCGGCACTCAGCGGCATTGAGGCCTGCCGGGAGACACTGGGCAAAGCTGTGCCCAACGTCATGGTGTTCGACACCGCATTCCACCAGACCATGCCGCCCCAGGCCTACATCTTCGGCGTGCCGTATAAATATTATGAGCAGTACCGCGTTCGCCGCTACGGCGCGCATGGCACCTCCCACCGCTATGTCAGCCTGCGTTGCGCGGAGCTGCTGGGTAAAAAGCCGGAAGAAACCAAGATCGTCACCTGCCATCTGGGCAACGGTTCCTCCATCTCCGCGGTGGACGCCGGCAAATGTGTGGACACCAGCATGGGCTTTACACCTTTAGGCGGCATCATCATGGGCACCCGCAGCGGCGACCTCGACCCCTCGGTGGTCACGCTTATCATGGAAAAAGAAGGAATCAGCCCGCGCGATATGGAAAACCTGCTGAACAAGGAATCCGGCTTCATCGGCATCTCCGGTATCTCCAGCGACGACCGCGACCTGGAGGAAGCCACCGCCAAGGGCATTGAGCGCTCGAAGATTGCGCAGGACGCCCAGCGCTATCAGATCAAAAAACTCGTCGGCGCTTATTCGGCGGCCATGGGCGGCCTGGACGCGCTGGCGTTCACCGGCGGCATCGGCGAAAATTCCTCGCTGCTGCGCGCAGCCGTCTGCGAAAACATGGAATACCTCGGCATCACCTTCGACCCCGCGAAAAACGAAGAAACCATCCGCGGCAAAGAGGGCGACCTTTCCCTGCCCGGCGGCGAAGTGCGCGTTTATGTTATCCCCACCAACGAGGAATATATGATCGCGCTCGACACCAAGACACTCGTCGGCTAAAAGCTTCTATAAAACGAATATATAAAAAGCGACGTTCCAAGATCTAGAACGTCGCTTTTTAACATTCCGCCGCCGCGGAATGCGTTTTCCATACAGATGCGCGGCAATGGCGGCACTGCTTGCTTTATGACGTGTGATGCGACTCCACAATCTCGCGTTCGCGAAACAACAGCGAAATGCACCAGATGCCCGCGATGGCCACGAGCGTGAAGATGATACGGCTGACAGCGGAACCGGCTCCACCGAATGCCCAGTCGACCACATCAAAATTAAAAATGCCGACGCTGCCCCAGTTAAGCGCGCCAATAATCACCAGCAGCAAAGCGATCCTGTCCAGCATGAAATCAACTCCCTTTTGCTTGCAGCCGCGCGGTTTCCTTTACGGTAACCGCAACGGTCCGTCAAAGGTTCAAAAAACAGATGAAGCATTCAGCTACCATCCGCTTTCGCAGATAGTATGGACAAAAACGGGCGGATTATGCATCCGCCCGTTCCATCGCCTTTTATGTATTGCCGGTTATTCCTCGGCGCCGCTTCTCTGCTCTTTGAGCAAATCGCGGATCTCCTGCAAGACCACCAGA。
全文摘要
乙酸激酶基因，屬于生物工程領(lǐng)域。鑒于乙酸激酶基因的克隆對(duì)研究產(chǎn)氫菌B49代謝工程提高產(chǎn)氫量有很重要的作用，本發(fā)明旨在從Ethanologenbacterium hit B49基因組中分離乙酸激酶基因。本發(fā)明所述乙酸激酶基因Back是以Ethanologenbacterium hit B49總DNA為模板，通過PCR擴(kuò)增獲得的，是一個(gè)具有表達(dá)功能的基因。該基因全長(zhǎng)2034bp，無內(nèi)含子，具有1200bp完整的開放讀碼框，編碼399個(gè)氨基酸。本發(fā)明擴(kuò)大了乙酸激酶基因資源，從而為Ethanologenbacterium hit B49的代謝工程研究和構(gòu)建基因工程菌提供了科學(xué)依據(jù)。
文檔編號(hào)C12N15/55GK1800400SQ20051012736
公開日2006年7月12日 申請(qǐng)日期2005年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月20日
發(fā)明者林海龍, 任南琪, 鄭國(guó)香 申請(qǐng)人:哈爾濱工業(yè)大學(xué)