專利名稱：一種昆蟲抗冷凍蛋白基因序列及其表達純化方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種昆蟲抗冷凍蛋白基因的序列，本發(fā)明還涉及該昆蟲抗冷凍蛋白基因的克隆以及蛋白表達純化方法。
背景技術：
抗冷凍蛋白(antifreeze proteins，AFPs)是一類具有降低生物體液冰點和抑制冰晶生長的生物活性蛋白，在低溫生物的生存中起著重要的作用?？估鋬龅鞍卓勺鳛榈鞍踪|制劑在醫(yī)藥上應用于生物體、離體元件、組織、細胞系的低溫或超低溫保存以及靶組織的冷凍手術；在農(nóng)業(yè)上可提高植物、動物的耐凍能力；在冷凍食品上應用可維持冷凍食品的結構和減少營養(yǎng)的損失；另外抗冷凍蛋白還可以制作冰漿以及作為一種新的抑制冰形成制劑。由此可見，抗冷凍蛋白的應用潛力巨大。
目前，已從魚類、昆蟲、植物、真菌、細菌中分離得到了許多種類的抗冷凍蛋白，其中昆蟲抗冷凍蛋白的活性最高，比所有已知北極魚的抗冷凍蛋白活性高出10-30倍，甚至100倍。
現(xiàn)在常用的大腸桿菌表達系統(tǒng)，如pGEX載體，表達的蛋白會在N端或C端多余幾個氨基酸序列，或者帶有His或GST的標簽，因此表達出的蛋白與天然蛋白存在差異，活性可能受到影響；如要切除標簽蛋白GST，還必須使用昂貴的內切酶，必然增加成本?；蛘咭园w的形式表達，雖然不帶有多余的氨基酸殘基，但是包涵體的處理步驟繁瑣，最終得到的復性蛋白活性往往較低。

發(fā)明內容
(一)要解決的技術問題本發(fā)明的目的是公開一種昆蟲抗冷凍蛋白基因的序列，本發(fā)明的另一目的是提供一種高效、簡便、廉價的昆蟲抗冷凍蛋白基因的克隆以及蛋白表達純化的方法。
(二)技術方案本發(fā)明公開了一種昆蟲抗冷凍蛋白基因，其序列為SEQ ID NO1。
本發(fā)明提供了一種昆蟲抗冷凍蛋白基因的克隆、蛋白表達及純化方法，它包括以下步驟a.提取并純化昆蟲的mRNA；b.設計特異性引物對P1，上游序列為AFP15’-TGCAGGAATCGGCACGAGGAA-3’，下游序列為AFP25’-GACTTTCATGGCTTAATTAGC-3’，用RT-PCR法克隆抗冷凍蛋白基因；c.抗冷凍蛋白基因與T載體連接形成重組質粒pGAFP4，測序；d.設計特異性引物對P2，上游序列為AFP1′5’-GGT GGT TGC TCTTCC ACC ATG GAT GGC TCG TGT ACA-3’，下游序列為AFP2′5’-GGT GGT CTG CAG TCA TTA ATT AGC ACT GAA-3’，用PCR方法將抗冷凍蛋白基因從重組質粒pGAFP4中擴增出來，擴增產(chǎn)物與表達元件PTYB11連接構建了表達載體PTYB11-afp；e.表達載體PTYB11-afp轉化大腸桿菌細胞；f.誘導表達；g.親和純化抗冷凍蛋白。
本發(fā)明所述的基因克隆、蛋白表達及純化方法，mRNA是從一種生活在瑞典的鱗翅目昆蟲的幼蟲體內提取并純化的。
本發(fā)明所述的基因克隆、蛋白表達及純化方法，RT-RCP的反應體系為ddH2O 23.0μL5×Buffer 10.0μLdNTPs(10mM)1.0μLAFP1(10μM)5.0μLAFP2(10μM)5.0μLMgSO4(25mM) 2.0μL
AMV反轉錄酶(5U·μL-1) 1.0μLTflDNA酶(5U·μL-1)1.0μLmRNA2.0μL；RT-RCP反應參數(shù)為反轉錄48℃ 45min；預變性94℃ 2min；循環(huán)參數(shù)94℃ 40s，55℃ 30s，72℃ 1min，35個循環(huán)；最后72℃延伸6min。
本發(fā)明所述的基因克隆、蛋白表達及純化方法，抗冷凍蛋白基因與T-Vector連接后獲得重組質粒pGAFP4。
本發(fā)明所述的基因克隆、蛋白表達及純化方法，PCR反應體系為ddH2O 40.0μL10×Buffer(含Mg2+) 5.0μLdNTPs(10mM) 1.0μLAFP1′(10μM) 1.25μLAFP2′(10μM) 1.25μLTaq DNA聚合酶(5U·μL-1) 0.5μLpGAFP4 1.0μL；PCR反應參數(shù)預變性94℃ 5min；循環(huán)參數(shù)為94℃ 40s，55℃ 30s，72℃ 1min，35個循環(huán)；最后72℃延伸6min。
本發(fā)明所述的基因克隆、蛋白表達及純化方法，將從重組質粒pGAFP4中擴增出來的抗冷凍蛋白基因(afp)與原核生物表達元件PTYB11連接，構建出表達載體PTYB11-afp。
本發(fā)明所述的基因克隆、蛋白表達及純化方法，用表達質粒PTYB11-afp轉化DH5α感受態(tài)細胞后，挑取陽性克隆搖菌，以試劑盒小量提取重組表達質粒PTYB11-afp。
本發(fā)明所述的基因克隆、蛋白表達及純化方法，把提取的表達質粒PTYB11-afp轉化表達菌株BL21，加入IPTG誘導抗冷凍蛋白的表達。加入溶菌酶和無蛋白酶的DNase處理，離心取上清。
本發(fā)明所述的基因克隆、蛋白表達及純化方法，IPTG誘導條件是37℃3h；溶菌酶工作濃度為20μg·mL-1，無蛋白酶的DNase工作濃度為10μg·mL-1，條件是30℃ 2h。
本發(fā)明所述的基因克隆、蛋白表達及純化方法，在誘導表達后，用Chitin介質純化蛋白并柱上切割，洗脫獲得純化的抗冷凍蛋白。
本發(fā)明中所用的mRNA提取純化試劑盒和RT-PCR試劑盒均為QIAGEN公司產(chǎn)品。
本發(fā)明所用的表達質粒載體PTYB11購買自NEB(New England Biolabs)公司，該質粒帶有強的T7啟動子，目的蛋白基因克隆在標簽intein的3’端，且表達出的目的蛋白N端不帶有載體的氨基酸殘基。
本發(fā)明所用的純化介質Chitin在結合緩沖液中能特異性結合標簽intein，從而純化蛋白，并且在裂解緩沖液中，標簽與抗冷凍蛋白斷開，洗脫下純的抗冷凍蛋白。所用的結合緩沖液成分為HEPES 20mM，NaCl 500mM，TritonX-100 0.1％，PMSF 20μM；所用的裂解緩沖液成分為HEPES 20mM，NaCl500mM，DTT 50mM。
本發(fā)明所述的表達系統(tǒng)得到的融合蛋白不需要內切酶即可切除標簽蛋白，不含多余的氨基酸序列，因為表達質粒PTYB11的目的蛋白(AFP)與PTYB11上的蛋白自剪接元件(稱為“內含肽”，intein)及幾丁質結合蛋白形成了融合蛋白，通過幾丁質柱親和純化融合蛋白，誘導內含肽的肽鍵裂解活性，在幾丁質介質上將目標蛋白釋放出來，而內含肽與幾丁質結合蛋白仍結合在幾丁質介質上，達到單柱分離純化蛋白的目的。pTYB11載體只有在SapI位點被用來分別克隆目的基因的3’和5’端，此克隆策略使得目的基因和intein標簽(即剪切標簽)正好相鄰，純化的目的蛋白不含多余的氨基酸殘基。
用本發(fā)明所述的表達系統(tǒng)得到的融合蛋白更接近天然蛋白活性，這是因為純化的目的蛋白不含多余的氨基酸殘基，保證了表達出來的目的蛋白能夠正確折疊成天然的構像，從而保持了其天然的活性。
本發(fā)明所用的質粒轉化方法參照《分子克隆實驗指南》第2版，第55頁，金冬雁，黎孟楓等譯。
本發(fā)明中提取mRNA是按購自QIAGEN公司的Oligotex Direct mRNA純化試劑盒中的操作步驟進行。
(三)有益效果應用本發(fā)明所述的方法成功地克隆到了昆蟲的抗冷凍蛋白基因。誘導表達的抗冷凍蛋白占菌體總蛋白的30％，通過介質純化后得到的抗冷凍蛋白純度達95％以上，說明本發(fā)明提供的方法是高效的。
另外，用本發(fā)明所述的表達系統(tǒng)得到的融合蛋白不需要內切酶即可切除標簽蛋白，不含多余的氨基酸序列，更接近天然蛋白活性。


圖1RT-PCR法擴增的電泳圖；圖中M、100bp DNA Mark；M′、1kbDNAMark；1-4均為RT-PCR產(chǎn)物。
圖2誘導表達的蛋白電泳圖；圖中1、蛋白標準；2、誘導前菌體總蛋白；3-8、誘導2h、4h、6h、8h、10h、12h菌體總蛋白；箭頭所指為誘導表達的融合蛋白。
圖3純化后的蛋白電泳圖；圖中1、蛋白標準；2、上樣流出液；3-7、洗脫液；細頭所指為融合蛋白，粗箭頭所指為昆蟲抗冷凍蛋白。
具體實施例方式
下面結合具體的實施例來進一步闡述本發(fā)明。應理解，以下實施例僅用于說明本發(fā)明，而不用來限制本發(fā)明的范圍。
實施例11.取1只3齡昆蟲幼蟲，去掉頭部后，放在一液氮預冷的研缽中，加入液氮，迅速研磨至粉狀并轉進一液氮預冷的無RNase的1.5mL離心管中，根據(jù)mRNA的提取和純化試劑盒中的說明獲得純mRNA。
2.以AFP1(5’-TGCAGGAATCGGCACGAGGAA-3’)和AFP2(5’-GACTTTCATGG CTTAATTAGC-3’)為引物，以mRNA為模板進行抗冷凍蛋白基因的RT-PCR擴增。
RT-PCR的反應體系為ddH2O 23.0μL，5×Buffer 10.0μL，dNTPs(10mM)1.0μL，AFP1(10μM)5.0μL，AFP2(10μM)5.0μL，MgSO4(25mM)2.0μL，AMV反轉錄酶(5U/μL)1.0μL，TflDNA酶(5U/μL)1.0μL，mRNA 2.0μL，總體積50.0μL。
反應參數(shù)為反轉錄48℃ 45min；預變性94℃ 2min；循環(huán)參數(shù)94℃40s，55℃ 30s，72℃ 1min，35個循環(huán)；最后72℃延伸6min。
擴增產(chǎn)物以1％膠電泳并回收。
3.回收的抗冷凍蛋白基因直接與pGEMR T-Vector相連，得到重組質粒pGAFP4并由上?；蚬緶y序獲得抗冷凍蛋白基因核苷酸全序列。
4.以AFP1′5′-GGT GGT TGC TCT TCC ACC ATG GAT GGC TCGTGT ACA-3和AFP2′5′-GGT GGT CTG CAG TCA TTA ATT AGC ACTGAA-3′為引物，以重組質粒pGAFP4為模板用PCR法重新擴增出抗冷凍蛋白基因。
PCR反應體系為ddH2O 40.0μL，10×PCR Buffer(含Mg2+)5.0μL，dNTPs(10mM)1.0μL，AFP1′(10μM)1.25μL，AFP2′(10μM)1.25μL，Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.5μL，質粒pGAFP41.0μL，總體積50μL。
反應參數(shù)為預變性94℃ 5min；循環(huán)參數(shù)為94℃ 40s，55℃ 30s，72℃1min，35個循環(huán)；72℃延伸6min。
5.該基因片段直接連接到新的表達載體PTYB11中，形成抗冷凍蛋白的表達載體PTYB11-afp。
6.取10μL質粒PTYB11-afp加入150μL DH5α感受態(tài)細胞中，冰浴30min，42℃水浴90s，冰浴2min，加800μL LB，于37℃搖床上搖45min，轉速為220rpm，鋪板，抗生素為100μg·mL-1氨芐。
7.挑取陽性克隆，用試劑盒小量提取重組表達質粒PTYB11-afp。
8.將表達質粒PTYB11-afp轉化表達菌株BL21，然后加入ITPG誘導抗冷凍蛋白的表達，誘導條件是37℃ 3h。再加入溶菌酶和無蛋白酶的DNase處理，離心取上清。溶菌酶工作濃度為20μg·mL-1，無蛋白酶的DNase工作濃度為10μg·mL-1，條件是30℃ 2h。
9.用Chitin介質純化融合蛋白并柱上切割，洗脫獲得純化的抗冷凍蛋白。所用的結合緩沖液成分為HEPES 20mM，NaCl 500mM，Triton X-100 0.1％，PMSF 20μM；所用的裂解緩沖液成分為HEPES 20mM，NaCl 500mM，DTT50mM。
序列表<110>華南農(nóng)業(yè)大學<120>SEQ ID NO1<130>一種昆蟲抗冷凍蛋白基因序列及其表達純化方法<160>1<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>411<212>DNA<213>Budworm<400>1tgcaggaatc ggcacgagga aagacatatt tttttttagt ttcaaaagtt gtgtacattt 60ttctcaagta tcatgaagtg tttaatgctg atcatggctc tagccattat caacactgta120
tcttctgatg gctcgtgtac aaacacgaac tctcagctca gcgcaaactc caagtgcgaa180aaatcgacgt tgaccaactg ctacgtcgat aaaagcgagg tttacggcac tacctgtaca240ggaagccgat tcgacggagt cactataacg acttcaacat ctaccggttc acgtatttca300ggccctggat gcaagatttc cacttgcatt atcaccgggg gtgtacctgc tccatcagct360gcttgcaaga tttctggatg tactttcagt gctaattaag ccatgaaagt c 41權利要求
1.一種昆蟲抗冷凍蛋白基因，其序列為SEQ ID NO1。
2.一種昆蟲抗冷凍蛋白基因的克隆、蛋白表達及純化方法，其特征在于包括以下步驟a.提取并純化昆蟲的mRNA；b.設計特異性引物對P1，上游序列為AFP15’-TGCAGGAATCGGCACGAGGAA-3’，下游序列為AFP25’-GACTTTCATGGCTTAATTAGC-3’，用RT-PCR法克隆抗冷凍蛋白基因；c.抗冷凍蛋白基因與T載體連接形成重組質粒pGAFP4，測序；d.設計特異性引物對P2，上游序列為AFP1′5’-GGT GGT TGC TCTTCC ACC ATG GAT GGC TCG TGT ACA-3’，下游序列為AFP2′5’-GGT GGT CTG CAG TCA TTAATT AGC ACT GAA-3’，用PCR方法將抗冷凍蛋白基因從重組質粒pGAFP4中擴增出來，擴增產(chǎn)物與表達元件PTYB11連接構建了表達載體PTYB11-afp；e.表達載體PTYB11-afp轉化大腸桿菌細胞；f.誘導表達；g.親和純化抗冷凍蛋白。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于mRNA是從一種生活在瑞典的鱗翅目昆蟲的幼蟲體內提取并純化的。
4.如權利要求2所述的方法，其特征在于用構建的表達質粒PTYB11-afp轉化DH5α感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆進行搖菌，試劑盒小量提取表達質粒PTYB11-afp。
5.如權利要求2所述的方法，其特征在于用提取的表達質粒PTYB11-afp轉化表達菌株BL21，然后加入IPTG誘導抗冷凍蛋白的表達。
6.如權利要求2所述的方法，其特征在于誘導表達后，用Chitin介質純化蛋白并柱上切割，洗脫獲得純化的抗冷凍蛋白。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種昆蟲抗冷凍蛋白基因，其序列為SEQ ID NO1。本發(fā)明還提供了該昆蟲抗冷凍蛋白基因的克隆、蛋白表達及純化方法，主要包括以下步驟利用特異性引物擴增該昆蟲抗冷凍蛋白基因，與原核生物表達元件PTYB11連接構建表達載體PTYB11－afp，轉化表達菌株BL21，加入誘導劑誘導，以及純化抗冷凍蛋白。運用本發(fā)明所述的方法成功地克隆到了昆蟲抗冷凍蛋白基因。誘導表達的抗冷凍蛋白占菌體總蛋白的30％，通過介質純化后得到的抗冷凍蛋白純度達95％以上，說明本發(fā)明提供的方法是高效的。而且，用本發(fā)明所述的表達系統(tǒng)得到的融合蛋白不需要內切酶即可切除標簽蛋白，不含多余的氨基酸序列，更接近天然蛋白活性。
文檔編號C12N15/09GK1800393SQ20051012641
公開日2006年7月12日 申請日期2005年12月8日 優(yōu)先權日2005年12月8日
發(fā)明者郭麗瓊, 林俊芳, 陳小萍 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學