對于用于核酸擴(kuò)增的方法和試劑的需求日益增加。生成特定核酸的多個(gè)拷貝通常是必要的或有用的，以便核酸可用于給定的應(yīng)用。例如，為了分析感興趣的核酸的核苷酸序列，在分析該序列之前經(jīng)常復(fù)制核酸以增加它的拷貝數(shù)。在另一個(gè)實(shí)例中，為了確定樣品中特定核酸的存在或不存在，可在一定條件下處理樣品以使得如果特定核酸存在于該樣品中則它可被擴(kuò)增。在另一個(gè)實(shí)例中，用作探針的核酸可進(jìn)行重復(fù)拷貝以生成大量含有與原始核酸模板相同的序列的核酸，從而生成核酸的許多拷貝，該拷貝可用作探針。

已知多種用于核酸擴(kuò)增的方法。例如，聚合酶鏈反應(yīng)(“PCR”)(參見，例如，美國專利號(hào)4,683,202)是一種用于核酸擴(kuò)增的普遍方法。為了成功地進(jìn)行PCR反應(yīng)，該反應(yīng)必須在重復(fù)多個(gè)循環(huán)的多個(gè)不同溫度下進(jìn)行。這需要用于重復(fù)地改變PCR反應(yīng)的溫度的硬件或其他機(jī)構(gòu)。用于核酸擴(kuò)增的另一種方法被稱為環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(“LAMP”)(參見，例如，美國專利號(hào)6,410,278)。LAMP反應(yīng)可在等溫下進(jìn)行，但通常包括四種不同引物的使用，這些引物識(shí)別靶核酸上總計(jì)六種不同的序列。

為促進(jìn)生成擴(kuò)增的核酸以用于使用擴(kuò)增的核酸的多個(gè)和增加數(shù)量的應(yīng)用，需要用于核酸擴(kuò)增的新的方法和試劑。

援引并入

本說明書中提到的所有出版物、專利和專利申請均通過引用而以相同程度并入本文，猶如特別地且單獨(dú)地指出每個(gè)單獨(dú)的出版物、專利或?qū)＠暾埻ㄟ^引用而并入。然而，在本公開的內(nèi)容與本文通過引用并入的文獻(xiàn)的內(nèi)容之間沖突的情況下，以本公開的內(nèi)容為準(zhǔn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本文提供了涉及核酸擴(kuò)增和多聯(lián)體生成的方法和組合物。

在一些實(shí)施方式中，本文提供了用于生成包含雙鏈核酸模板的兩個(gè)或更多個(gè)拷貝的多聯(lián)體的方法，該方法包括：(A)在使得合成與雙鏈核酸模板的第一鏈退火的第一引物的第一拷貝的延伸產(chǎn)物的條件下，用第一引物的第一拷貝和聚合酶處理包含雙鏈核酸模板的一級(jí)雙鏈核酸，其中第一引物包含5’末端核苷酸、3’末端核苷酸以及兩個(gè)區(qū)域：(i)尾區(qū)，其包含：(a)引物的5’末端核苷酸，(b)最內(nèi)核苷酸，其中該最內(nèi)核苷酸在5’末端核苷酸的下游，(c)5’末端核苷酸與最內(nèi)核苷酸之間的中間部分，該中間部分包含一個(gè)或多個(gè)核苷酸，以及(ii)模板結(jié)合區(qū)，其包括：(a)引物的3’末端核苷酸，(b)最內(nèi)核苷酸，其中該最內(nèi)核苷酸在3’末端核苷酸的上游，(c)3’末端核苷酸與最內(nèi)核苷酸之間的中間部分，該中間部分包含一個(gè)或多個(gè)核苷酸，并且第一引物的第一拷貝的模板結(jié)合區(qū)與雙鏈核酸模板的第一鏈退火，(B)在使得合成與步驟(A)的第一引物的第一拷貝的延伸產(chǎn)物退火的第二引物的延伸產(chǎn)物的條件下，用第二引物和聚合酶處理步驟(A)的第一引物的第一拷貝的延伸產(chǎn)物，其中第二引物包含5’末端核苷酸、3’末端核苷酸以及兩個(gè)區(qū)域：(i)尾區(qū)，其包含：(a)引物的5’末端核苷酸，(b)最內(nèi)核苷酸，其中該最內(nèi)核苷酸在5’末端核苷酸的下游，(c)5’末端核苷酸與最內(nèi)核苷酸之間的中間部分，該中間部分包含一個(gè)或多個(gè)核苷酸，以及(ii)模板結(jié)合區(qū)，其包含：(a)引物的3’末端核苷酸，(b)最內(nèi)核苷酸，其中該最內(nèi)核苷酸在3’末端核苷酸的上游，(c)3’末端核苷酸與最內(nèi)核苷酸之間的中間部分，該中間部分包含一個(gè)或多個(gè)核苷酸，第二引物的尾區(qū)包含與第一引物的尾區(qū)的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列，如果將所述序列對齊使得第二引物的5’末端核苷酸與第一引物的尾區(qū)的最內(nèi)核苷酸對齊并且第一引物的5’末端核苷酸與第二引物的尾區(qū)的最內(nèi)核苷酸對齊，第二引物的模板結(jié)合區(qū)與步驟(A)的第一引物的第一拷貝的延伸產(chǎn)物退火，并且第二引物的延伸產(chǎn)物含有5’末端核苷酸、3’末端核苷酸以及包含3’末端核苷酸的3’末端區(qū)，其中該3’末端區(qū)含有與在5’至3’方向讀取的第二引物的尾區(qū)的核苷酸序列相同的核苷酸序列，且3’末端區(qū)的最后的核苷酸是第二引物的延伸產(chǎn)物的3’末端核苷酸，(C)在使得合成與步驟(B)的第二引物的延伸產(chǎn)物退火的第一引物的第二拷貝的延伸產(chǎn)物的條件下，用第一引物的第二拷貝和聚合酶處理步驟(B)的第二引物的延伸產(chǎn)物，以產(chǎn)生包含步驟(B)的第二引物的延伸產(chǎn)物和第一引物的第二拷貝的延伸產(chǎn)物的二級(jí)核酸的第一拷貝，其中第一引物的第二拷貝的延伸產(chǎn)物含有5’末端核苷酸、3’末端核苷酸以及包含3’末端核苷酸的3’末端區(qū)，其中該3’末端區(qū)含有與在5’至3’方向讀取的第一引物的尾區(qū)的核苷酸序列相同的核苷酸序列，并且該3’末端區(qū)的最后的核苷酸是第二引物的延伸產(chǎn)物的3’末端核苷酸，(D)將至少步驟(C)重復(fù)另外一次或多次以生成步驟(C)的二級(jí)核酸的至少第二拷貝，(E)在使得二級(jí)核酸的第一拷貝的第一引物的第二拷貝的延伸產(chǎn)物的3’末端區(qū)與二級(jí)核酸的第二拷貝的第二引物的延伸產(chǎn)物的3’末端區(qū)退火的條件下，處理步驟(C)的二級(jí)核酸的第一拷貝以及步驟(D)的二級(jí)核酸的第二拷貝，以產(chǎn)生包含二級(jí)核酸的第一拷貝的第一引物的第二拷貝的延伸產(chǎn)物以及二級(jí)核酸的第二拷貝的第二引物的延伸產(chǎn)物的交換結(jié)構(gòu)，(F)在使得合成二級(jí)核酸的第一拷貝的第一引物的第二拷貝的延伸產(chǎn)物的延伸產(chǎn)物以及合成二級(jí)核酸的第二拷貝的第二引物的延伸產(chǎn)物的延伸產(chǎn)物的條件下，用聚合酶處理步驟(E)的交換結(jié)構(gòu)，以產(chǎn)生包含步驟(A)的雙鏈核酸模板的兩個(gè)拷貝的多聯(lián)體，其中該多聯(lián)體包含二級(jí)核酸的第一拷貝的第一引物的第二拷貝的延伸產(chǎn)物的延伸產(chǎn)物以及二級(jí)核酸的第二拷貝的第二引物的延伸產(chǎn)物的延伸產(chǎn)物。

在一些實(shí)施方式中，本文提供了用于生成包含多核苷酸模板或其類似序列的兩個(gè)或更多個(gè)拷貝的多聯(lián)體的方法，該方法包括：(A)在使得合成與多核苷酸模板退火的第一引物的第一拷貝的延伸產(chǎn)物的條件下，用第一引物的第一拷貝和聚合酶處理包含多核苷酸模板的一級(jí)核酸，其中第一引物包含5’末端核苷酸、3’末端核苷酸以及兩個(gè)區(qū)域：(i)尾區(qū)，其包含：(a)引物的5’末端核苷酸，(b)最內(nèi)核苷酸，其中該最內(nèi)核苷酸在5’末端核苷酸的下游，(c)5’末端核苷酸與最內(nèi)核苷酸之間的中間部分，該中間部分包含一個(gè)或多個(gè)核苷酸，以及(ii)模板結(jié)合區(qū)，其包括：(a)引物的3’末端核苷酸，(b)最內(nèi)核苷酸，其中該最內(nèi)核苷酸在3’末端核苷酸的上游，(c)3’末端核苷酸與最內(nèi)核苷酸之間的中間部分，該中間部分包含一個(gè)或多個(gè)核苷酸，并且第一引物的第一拷貝的模板結(jié)合區(qū)與多核苷酸模板退火，(B)在使得合成與步驟(A)的第一引物的第一拷貝的延伸產(chǎn)物退火的第二引物的延伸產(chǎn)物的條件下，用第二引物和聚合酶處理步驟(A)的第一引物的第一拷貝的延伸產(chǎn)物，其中第二引物包含5’末端核苷酸、3’末端核苷酸以及兩個(gè)區(qū)域：(i)尾區(qū)，其包含：(a)引物的5’末端核苷酸，(b)最內(nèi)核苷酸，其中該最內(nèi)核苷酸在5’末端核苷酸的下游，(c)5’末端核苷酸與最內(nèi)核苷酸之間的中間部分，該中間部分包含一個(gè)或多個(gè)核苷酸，(ii)模板結(jié)合區(qū)，其包含：(a)引物的3’末端核苷酸，(b)最內(nèi)核苷酸，其中該最內(nèi)核苷酸在3’末端核苷酸的上游，(c)3’末端核苷酸與最內(nèi)核苷酸之間的中間部分，該中間部分包含一個(gè)或多個(gè)核苷酸，第二引物的尾區(qū)包含與第一引物的尾區(qū)的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列，如果將所述序列對齊使得第二引物的5’末端核苷酸與第一引物的尾區(qū)的最內(nèi)核苷酸對齊以及第一引物的5’末端核苷酸與第二引物的尾區(qū)的最內(nèi)核苷酸對齊，第二引物的模板結(jié)合區(qū)與步驟(A)的第一引物的第一拷貝的延伸產(chǎn)物退火，并且第二引物的延伸產(chǎn)物含有5’末端核苷酸、3’末端核苷酸以及包含3’末端核苷酸的3’末端區(qū)，其中該3’末端區(qū)含有與在5’至3’方向讀取的第二引物的尾區(qū)的核苷酸序列相同的核苷酸序列，且3’末端區(qū)的最后的核苷酸是第二引物的延伸產(chǎn)物的3’末端核苷酸，(C)在使得合成與步驟(B)的第二引物的延伸產(chǎn)物退火的第一引物的第二拷貝的延伸產(chǎn)物的條件下，用第一引物的第二拷貝和聚合酶處理步驟(B)的第二引物的延伸產(chǎn)物，以產(chǎn)生包含步驟(B)的第二引物的延伸產(chǎn)物和第一引物的第二拷貝的延伸產(chǎn)物的二級(jí)核酸的第一拷貝，其中第一引物的第二拷貝的延伸產(chǎn)物含有5’末端核苷酸、3’末端核苷酸以及包含3’末端核苷酸的3’末端區(qū)，其中該3’末端區(qū)含有與在5’至3’方向讀取的第一引物的尾區(qū)的核苷酸序列相同的核苷酸序列，并且該3’末端區(qū)的最后的核苷酸是第二引物的延伸產(chǎn)物的3’末端核苷酸，(D)將至少步驟(C)重復(fù)另外一次或多次以生成包含步驟(B)的第二引物的延伸產(chǎn)物和步驟(C)的第一引物的第二拷貝的延伸產(chǎn)物的二級(jí)核酸的至少第二拷貝，(E)在使得二級(jí)核酸的第一拷貝的第一引物的第二拷貝的延伸產(chǎn)物的3’末端區(qū)與二級(jí)核酸的第二拷貝的第二引物的延伸產(chǎn)物的3’末端區(qū)退火的條件下，處理步驟(C)的二級(jí)核酸的第一拷貝以及步驟(D)的二級(jí)核酸的第二拷貝，以產(chǎn)生包含二級(jí)核酸的第一拷貝的第一引物的第二拷貝的延伸產(chǎn)物以及二級(jí)核酸的第二拷貝的第二引物的延伸產(chǎn)物的交換結(jié)構(gòu)，(F)在使得合成二級(jí)核酸的第一拷貝的第一引物的第二拷貝的延伸產(chǎn)物的延伸產(chǎn)物以及合成二級(jí)核酸的第二拷貝的第二引物的延伸產(chǎn)物的延伸產(chǎn)物的條件下，用聚合酶處理步驟(E)的交換結(jié)構(gòu)，以產(chǎn)生包含步驟(A)的多核苷酸模板的兩個(gè)拷貝的多聯(lián)體，其中該多聯(lián)體包含二級(jí)核酸的第一拷貝的第一引物的第二拷貝的延伸產(chǎn)物的延伸產(chǎn)物以及二級(jí)核酸的第二拷貝的第二引物的延伸產(chǎn)物的延伸產(chǎn)物。在一些實(shí)施方式中，步驟(A)的核酸聚合酶是DNA聚合酶。在一些實(shí)施方式中，步驟(A)的核酸聚合酶是逆轉(zhuǎn)錄酶。

在一些實(shí)施方式中，本文提供了用于生成包含雙鏈核酸模板的兩個(gè)或更多個(gè)拷貝的多聯(lián)體的方法，該方法包括：(A)制備反應(yīng)混合物，其包含：(i)包含雙鏈核酸模板的一級(jí)核酸，(ii)分離的核酸聚合酶，(iii)第一引物，其包含5’末端核苷酸、3’末端核苷酸以及兩個(gè)區(qū)域：(a)尾區(qū)，其包含：(1)引物的5’末端核苷酸，(2)最內(nèi)核苷酸，其中該最內(nèi)核苷酸在5’末端核苷酸的下游，(3)5’末端核苷酸與最內(nèi)核苷酸之間的中間部分，該中間部分包含一個(gè)或多個(gè)核苷酸，以及(b)模板結(jié)合區(qū)，其包括：(1)引物的3’末端核苷酸，(2)最內(nèi)核苷酸，其中該最內(nèi)核苷酸在3’末端核苷酸的上游，(3)3’末端核苷酸與最內(nèi)核苷酸之間的中間部分，該中間部分包含一個(gè)或多個(gè)核苷酸，其中模板結(jié)合區(qū)與核酸模板的第一鏈互補(bǔ)，(iv)第二引物，其包含5’末端核苷酸、3’末端核苷酸以及兩個(gè)區(qū)域：(a)尾區(qū)，其包含：(1)引物的5’末端核苷酸，(2)最內(nèi)核苷酸，其中該最內(nèi)核苷酸在5’末端核苷酸的下游，(3)5’末端核苷酸與最內(nèi)核苷酸之間的中間部分，該中間部分包含一個(gè)或多個(gè)核苷酸，以及(b)模板結(jié)合區(qū)，其包含：(1)引物的3’末端核苷酸，(2)最內(nèi)核苷酸，其中該最內(nèi)核苷酸在3’末端核苷酸的上游，(3)3’末端核苷酸與最內(nèi)核苷酸之間的中間部分，該中間部分包含一個(gè)或多個(gè)核苷酸，并且其中模板結(jié)合區(qū)與核酸模板的第二鏈互補(bǔ)，并且其中如果將所述序列對齊使得第二引物的5’末端核苷酸與第一引物的尾區(qū)的最內(nèi)核苷酸對齊并且第一引物的5’末端核苷酸與第二引物的尾區(qū)的最內(nèi)核苷酸對齊，第二引物的尾區(qū)含有與第一引物的尾區(qū)的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列，以及(B)在沒有熱循環(huán)的情況下將反應(yīng)混合物溫育至少3分鐘。

在一些實(shí)施方式中，本文提供了用于生成包含多核苷酸模板的兩個(gè)或更多個(gè)拷貝的多聯(lián)體的方法，該方法包括：(A)制備反應(yīng)混合物，其包含：(i)包含多核苷酸模板的核酸，(ii)分離的核酸聚合酶，(iii)第一引物，其包含5’末端核苷酸、3’末端核苷酸以及兩個(gè)區(qū)域：(a)尾區(qū)，其包含：(1)引物的5’末端核苷酸，(2)最內(nèi)核苷酸，其中該最內(nèi)核苷酸在5’末端核苷酸的下游，(3)5’末端核苷酸與最內(nèi)核苷酸之間的中間部分，該中間部分包含一個(gè)或多個(gè)核苷酸，以及(b)模板結(jié)合區(qū)，其包括：(1)引物的3’末端核苷酸，(2)最內(nèi)核苷酸，其中該最內(nèi)核苷酸在3’末端核苷酸的上游，(3)3’末端核苷酸與最內(nèi)核苷酸之間的中間部分，該中間部分包含一個(gè)或多個(gè)核苷酸，并且其中模板結(jié)合區(qū)與多核苷酸模板互補(bǔ)，(iv)第二引物，其包含5’末端核苷酸、3’末端核苷酸以及兩個(gè)區(qū)域：(a)尾區(qū)，其包含：(1)引物的5’末端核苷酸，(2)最內(nèi)核苷酸，其中該最內(nèi)核苷酸在5’末端核苷酸的下游，(3)5’末端核苷酸與最內(nèi)核苷酸之間的中間部分，該中間部分包含一個(gè)或多個(gè)核苷酸，以及(b)模板結(jié)合區(qū)，其包含：(1)引物的3’末端核苷酸，(2)最內(nèi)核苷酸，其中該最內(nèi)核苷酸在3’末端核苷酸的上游，(3)3’末端核苷酸與最內(nèi)核苷酸之間的中間部分，該中間部分包含一個(gè)或多個(gè)核苷酸，并且其中模板結(jié)合區(qū)與互補(bǔ)于多核苷酸模板的核苷酸序列互補(bǔ)，并且其中如果將所述引物的序列對齊使得第二引物的5’末端核苷酸與第一引物的尾區(qū)的最內(nèi)核苷酸對齊并且第一引物的5’末端核苷酸與第二引物的尾區(qū)的最內(nèi)核苷酸對齊，第二引物的尾區(qū)含有與第一引物的尾區(qū)的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列，以及(B)在不高于80℃的溫度下將反應(yīng)混合物溫育至少3分鐘。

在一些實(shí)施方式中，本文提供了用于生成包含雙鏈核酸模板的兩個(gè)或更多個(gè)拷貝的多聯(lián)體的方法，該方法包括：將包含雙鏈核酸模板的雙鏈核酸分子的第一拷貝和第二拷貝與聚合酶一起溫育，以產(chǎn)生包含與交換結(jié)構(gòu)的第二鏈的延伸產(chǎn)物退火的交換結(jié)構(gòu)的第一鏈的延伸產(chǎn)物的多聯(lián)體，其中該多聯(lián)體包含雙鏈核酸模板的兩個(gè)拷貝，其中雙鏈核酸分子包含各自含有多個(gè)核苷酸的第一鏈和第二鏈，第一鏈包含5’末端核苷酸和3’末端核苷酸，并含有5’至3’方向的通用格式的區(qū)域：A1-B-A2，第二鏈包含5’末端核苷酸和3’末端核苷酸，并含有5’至3’方向的通用格式的區(qū)域：C1-D-C2，區(qū)域B包含雙鏈核酸模板的第一鏈的核苷酸序列，區(qū)域D包含雙鏈核酸模板的第二鏈的核苷酸序列，在雙鏈核酸分子中，區(qū)域A1與C2退火，B與D退火，且A2與C1退火，生成了包含雙鏈核酸分子的第一拷貝的第一鏈以及雙鏈核酸分子的第二拷貝的第二鏈的交換結(jié)構(gòu)，其中第一鏈的A2區(qū)域與第二鏈的C2區(qū)域退火，合成了交換結(jié)構(gòu)的第一鏈的延伸產(chǎn)物，并合成了交換結(jié)構(gòu)的第二鏈的延伸產(chǎn)物。

在實(shí)施方式中，本文提供了拷貝多核苷酸模板的方法，該方法包括：在包含第一引物的多個(gè)拷貝和第二引物的多個(gè)拷貝的反應(yīng)混合物中溫育多核苷酸模板，其中：第一引物包含第一區(qū)域和第二區(qū)域，其中第一引物的第二區(qū)域包含與多核苷酸模板的第一部分互補(bǔ)的核苷酸序列；第二引物包含第一區(qū)域和第二區(qū)域，其中第二引物的第二區(qū)域包含與配偶體核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列，其中該配偶體核苷酸序列與多核苷酸模板的第二部分互補(bǔ)；并且在多核苷酸模板與第一引物的多個(gè)拷貝和第二引物的多個(gè)拷貝一起溫育時(shí)，形成至少一條多聯(lián)體鏈，其中該多聯(lián)體鏈包含5’端和3’端，并且包含具有5’至3’方向的通用結(jié)構(gòu)C’-T-C’-T-X-C’的核苷酸序列，其中：C’表示第二引物的第一區(qū)域的核苷酸序列，T表示多核苷酸模板的核苷酸序列或其類似序列，且X表示任何數(shù)目和序列的核苷酸。

在一些實(shí)施方式中，在本文提供的包括形成包含具有5’至3’方向的通用結(jié)構(gòu)C’-T-C’-T-X-C’的核苷酸序列的多聯(lián)體鏈的方法中，該多聯(lián)體鏈?zhǔn)堑谝欢嗦?lián)體鏈，并且還形成了第二多聯(lián)體鏈，其中該第二多聯(lián)體鏈包含5’端和3’端，并且包含具有5’至3’方向的通用結(jié)構(gòu)C-X’-T’-C-T’-C的核苷酸序列，其中：C表示第一引物的第一區(qū)域的核苷酸序列，T’表示與多核苷酸模板互補(bǔ)的核苷酸序列，且X’表示與X的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。

在實(shí)施方式中，本文提供了測定生物樣品中的靶多核苷酸模板的方法，該方法包括：A)在包含第一引物的多個(gè)拷貝和第二引物的多個(gè)拷貝的反應(yīng)混合物中溫育生物樣品或其部分，其中：第一引物包含第一區(qū)域和第二區(qū)域，其中第一引物的第二區(qū)域包含與多核苷酸模板的第一部分互補(bǔ)的核苷酸序列；第二引物包含第一區(qū)域和第二區(qū)域，其中第二引物的第二區(qū)域包含與配偶體核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列，其中該配偶體核苷酸序列與多核苷酸模板的第二部分互補(bǔ)；并且在多核苷酸模板與第一引物的多個(gè)拷貝和第二引物的多個(gè)拷貝一起溫育時(shí)，形成至少一條多聯(lián)體鏈，其中該多聯(lián)體鏈包含5’端和3’端，并且包含具有5’至3’方向的通用結(jié)構(gòu)C’-T-C’-T-X-C’的核苷酸序列，其中：C’表示第二引物的第一區(qū)域的核苷酸序列，T表示多核苷酸模板的核苷酸序列或其類似序列，且X表示任何數(shù)目和序列的核苷酸；以及B)在A)溫育步驟開始后在一個(gè)或多個(gè)點(diǎn)測量A)的反應(yīng)混合物中擴(kuò)增的核酸的量。在實(shí)施方式中，測量反應(yīng)混合物中擴(kuò)增的核酸的量可包括確定反應(yīng)混合物中的熒光的水平。在實(shí)施方式中，該方法可進(jìn)一步包括確定反應(yīng)混合物中的核酸擴(kuò)增的轉(zhuǎn)變時(shí)間。

在實(shí)施方式中，在本文提供的包含多聯(lián)體鏈(其包含具有5’至3’方向的通用結(jié)構(gòu)C’-T-C’-T-X-C’的核苷酸序列)的方法、反應(yīng)混合物、容器(vessel)或試劑盒中，X可含有具有5’至3’方向的通用結(jié)構(gòu)[(C’-T)_N]的序列，其中C’表示第二引物的第一區(qū)域的核苷酸序列，T表示多核苷酸模板的核苷酸序列或其類似序列，且N為0至2000之間的任何整數(shù)。在實(shí)施方式中，N可以是0至10、0至100、0至1000、0至5000、0至10,000、1至10、1至100、1至1000、1至2000、1至5000或1至10,000之間的任何整數(shù)。

在實(shí)施方式中，在本文提供的包含多聯(lián)體鏈(其包含具有5’至3’方向的通用結(jié)構(gòu)C’-T-C’-T-X-C’的核苷酸序列)的方法、反應(yīng)混合物、容器或試劑盒中，X可含有不多于0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、100、500、1000、10,000、50,000、100,000或500,000個(gè)核苷酸。在實(shí)施方式中，在本文提供的包含多聯(lián)體鏈(其包含具有5’至3’方向的通用結(jié)構(gòu)C’-T-C’-T-X-C’的核苷酸序列)的方法、容器或試劑盒中，X可含有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、100、500、1000、10,000、50,000、100,000或500,000個(gè)核苷酸。在實(shí)施方式中，在本文提供的包含多聯(lián)體鏈(其包含具有5’至3’方向的通用結(jié)構(gòu)C’-T-C’-T-X-C’的核苷酸序列)的方法、容器或試劑盒中，X可含有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、100、500、1000、10,000、50,000、100,000個(gè)核苷酸，并且不多于2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、100、500、1000、10,000、50,000、100,000或500,000個(gè)核苷酸。

在實(shí)施方式中，在本文提供的包含多聯(lián)體鏈(其包含具有5’至3’方向的通用結(jié)構(gòu)C’-T-C’-T-X-C’的核苷酸序列)的方法、反應(yīng)混合物、容器或試劑盒中，在至少一個(gè)C’與T之間，存在并非C’或T序列的一部分的一個(gè)或多個(gè)額外的核苷酸。所述一個(gè)或多個(gè)額外的核苷酸可以是，例如，1至10、1至20、1至100或1至1000個(gè)核苷酸。

在實(shí)施方式中，在本文提供的包含多聯(lián)體鏈(其包含具有5’至3’方向的通用結(jié)構(gòu)C’-T-C’-T-X-C’的核苷酸序列)的方法、反應(yīng)混合物、容器或試劑盒中，至少一個(gè)C’或T序列可缺失一個(gè)或多個(gè)核苷酸。在2個(gè)或更多個(gè)核苷酸缺失的情況下，缺失的核苷酸可以是鄰近的，或者可以在分開的位置。所述一個(gè)或多個(gè)缺失的核苷酸可以是，例如，1至10、1至20、1至100或1至1000個(gè)核苷酸。

在實(shí)施方式中，在本文提供的包含多聯(lián)體鏈(其包含具有5’至3’方向的通用結(jié)構(gòu)C’-T-C’-T-X-C’的核苷酸序列)的方法、反應(yīng)混合物、容器或試劑盒中，至少一個(gè)C’或T序列可具有一個(gè)或多個(gè)點(diǎn)突變。在存在兩個(gè)或更多個(gè)點(diǎn)突變的情況下，點(diǎn)突變可以是鄰近的，或者可以在分開的位置。所述一個(gè)或多個(gè)點(diǎn)突變可以是，例如，1至10、1至20、1至100或1至1000個(gè)點(diǎn)突變。

在實(shí)施方式中，在本文提供的包含多聯(lián)體鏈(其包含具有5’至3’方向的通用結(jié)構(gòu)C’-T-C’-T-X-C’的核苷酸序列)的方法、反應(yīng)混合物、容器或試劑盒中，核苷酸序列具有以下特點(diǎn)中的兩個(gè)或全部三個(gè)：i)在至少一個(gè)C’與T之間，存在并非C’或T序列的一部分的一個(gè)或多個(gè)額外的核苷酸；ii)至少一個(gè)C’或T序列缺失一個(gè)或多個(gè)核苷酸；以及iii)至少一個(gè)C’或T序列含有一個(gè)或多個(gè)點(diǎn)突變。

在實(shí)施方式中，在本文提供的包含多聯(lián)體鏈(其包含具有5’至3’方向的通用結(jié)構(gòu)C’-T-C’-T-X-C’的核苷酸序列)的方法、反應(yīng)混合物、容器或試劑盒中，在多核苷酸模板是RNA分子的實(shí)施方式中，T可表示與多核苷酸模板的RNA序列類似的DNA序列的核苷酸序列。

在實(shí)施方式中，在本文提供的包含多聯(lián)體鏈(其包含具有5’至3’方向的通用結(jié)構(gòu)C’-T-C’-T-X-C’的核苷酸序列)的方法、反應(yīng)混合物、容器或試劑盒中，該多聯(lián)體鏈進(jìn)一步包含位于最5’的C’序列的5’的一個(gè)或多個(gè)核苷酸。所述一個(gè)或多個(gè)核苷酸可以是，例如，1至10、1至20、1至100或1至1000個(gè)核苷酸。

在實(shí)施方式中，在本文提供的包含多聯(lián)體鏈(其包含具有5’至3’方向的通用結(jié)構(gòu)C’-T-C’-T-X-C’的核苷酸序列)的方法、反應(yīng)混合物、容器或試劑盒中，該多聯(lián)體鏈進(jìn)一步包含位于最3’的C’序列的3’的一個(gè)或多個(gè)核苷酸。所述一個(gè)或多個(gè)核苷酸可以是，例如，1至10、1至20、1至100或1至1000個(gè)核苷酸。

在實(shí)施方式中，本文提供了生成包含雙鏈核酸模板的至少兩個(gè)拷貝的多聯(lián)體的方法，該方法包括：在反應(yīng)混合物中溫育至少第一模板分子和第二模板分子，其中：第一模板分子包含第一核酸鏈和第二核酸鏈，其中：第一模板分子的第一核酸鏈包含具有5’至3’方向的通用結(jié)構(gòu)H’-S-Y₁-H’的核苷酸序列，其中：H’表示第一同源序列的核苷酸序列，S表示雙鏈核酸模板的第一鏈的核苷酸序列，且Y₁表示任何數(shù)目和序列的核苷酸；并且第一模板分子的第二核酸鏈包含具有5’至3’方向的通用結(jié)構(gòu)H-Y₁’-S’-H的核苷酸序列，其中：H表示第二同源序列的核苷酸序列，其中第一同源序列與第二同源序列彼此互補(bǔ)，Y₁’表示與Y₁的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列，且S’表示雙鏈核酸模板的第二鏈的核苷酸序列，其中雙鏈核酸模板的第一鏈和第二鏈彼此互補(bǔ)；并且第二模板分子包含第一核酸鏈和第二核酸鏈，其中：第二模板分子的第一核酸鏈包含具有5’至3’方向的通用結(jié)構(gòu)H’-S-Y₂-H’的核苷酸序列，其中：H’表示第一同源序列的核苷酸序列，S表示雙鏈核酸模板的第一鏈的核苷酸序列，且Y₂表示任何數(shù)目和序列的核苷酸；且第一模板分子的第二核酸鏈包含具有5’至3’方向的通用結(jié)構(gòu)H-Y₂’-S’-H的核苷酸序列，其中：H表示第二同源序列的核苷酸序列，Y₂’表示與Y₂的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列，且S’表示雙鏈核酸模板的第二鏈的核酸序列；并且在反應(yīng)混合物中的第一模板分子與第二模板分子一起溫育時(shí)，形成包含雙鏈核酸模板的至少兩個(gè)拷貝的至少一個(gè)多聯(lián)體，其中多聯(lián)體包含第一多聯(lián)體鏈和第二多聯(lián)體鏈，其中第一多聯(lián)體鏈包含5’端和3’端，并包含具有5’至3’方向的通用結(jié)構(gòu)H’-S-Y₂-H’-S-Y₁-H’的核苷酸序列，其中H’、Y₁、S和Y₂中的每一個(gè)均表示如上所述的核苷酸序列；并且其中第二多聯(lián)體鏈包含5’端和3’端，并包含具有5’至3’方向的通用結(jié)構(gòu)H-Y₁’-S’-H-Y₂’-S’-H的序列，其中，H’、Y₁、S和Y₂中的每一個(gè)均表示如上所述的核苷酸序列。

在實(shí)施方式中，在本文提供的包含第一多聯(lián)體鏈(其包含具有5’至3’方向的通用結(jié)構(gòu)H’-S-Y₂-H’-S-Y₁-H’的核苷酸序列)的方法、反應(yīng)混合物、容器或試劑盒中，Y₁和Y₂中的至少一個(gè)或兩者可表示0個(gè)核苷酸。

在實(shí)施方式中，在本文提供的包含第一多聯(lián)體鏈(其包含具有5’至3’方向的通用結(jié)構(gòu)H’-S-Y₂-H’-S-Y₁-H’的核苷酸序列)的方法、反應(yīng)混合物、容器或試劑盒中，Y₁可含有具有5’至3’方向的通用結(jié)構(gòu)[(H’-S)_N1]的序列，其中H’和S表示如上所述的核苷酸序列，且N1是0至2000之間的任何整數(shù)。

在實(shí)施方式中，在本文提供的包含第一多聯(lián)體鏈(其包含具有5’至3’方向的通用結(jié)構(gòu)H’-S-Y₂-H’-S-Y₁-H’的核苷酸序列)的方法、反應(yīng)混合物、容器或試劑盒中，Y₂可含有具有5’至3’方向的通用結(jié)構(gòu)[(H’-S)_N2]的序列，其中H’和S表示如上所述的核苷酸序列，且N2是0至2000之間的任何整數(shù)。

在實(shí)施方式中，在本文提供的包含第一模板分子和第二模板分子的方法、反應(yīng)混合物、容器或試劑盒中，第一模板分子和第二模板分子兩者均為雙鏈DNA分子。

在實(shí)施方式中，在本文提供的包含第一模板分子的第一核酸鏈的方法、反應(yīng)混合物、容器或試劑盒中，其中第一核酸鏈包含具有5’至3’方向的通用結(jié)構(gòu)H’-S-Y₁-H’的核苷酸序列，其中H’表示第一同源序列的核苷酸序列，第一同源序列可含有不多于4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90或100個(gè)核苷酸。在實(shí)施方式中，第一同源序列可含有至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90或100個(gè)核苷酸。在實(shí)施方式中，第一同源序列可含有至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90或100個(gè)且不多于5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100或200個(gè)核苷酸。

在實(shí)施方式中，本文提供的反應(yīng)混合物、容器或試劑盒包含核酸聚合酶。在實(shí)施方式中，核酸聚合酶是具有鏈置換活性的DNA聚合酶。在實(shí)施方式中，核酸聚合酶是RNA聚合酶。在實(shí)施方式中，核酸聚合酶是逆轉(zhuǎn)錄酶。在實(shí)施方式中，反應(yīng)混合物、容器或試劑盒包含多于一種核酸聚合酶，諸如具有鏈置換活性的DNA聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶兩種酶。在實(shí)施方式中，本文提供的反應(yīng)混合物、容器或試劑盒包含核苷酸和緩沖液。

在實(shí)施方式中，在本文提供的包含多核苷酸模板的方法、反應(yīng)混合物、容器或試劑盒中，多核苷酸模板是單鏈分子。在實(shí)施方式中，在本文提供的包含多核苷酸模板的方法、反應(yīng)混合物、容器或試劑盒中，多核苷酸模板包含雙鏈核酸模板的一條鏈。在實(shí)施方式中，在本文提供的包含多核苷酸模板的方法、反應(yīng)混合物、容器或試劑盒中，多核苷酸模板是DNA或RNA分子。

在實(shí)施方式中，在本文提供的包含核酸模板的方法、反應(yīng)混合物、容器或試劑盒中，核酸模板是RNA或DNA分子。在實(shí)施方式中，核酸模板可以是單鏈或雙鏈分子。

在實(shí)施方式中，在本文提供的包括溫育反應(yīng)混合物的方法中，在溫育反應(yīng)混合物的過程中，反應(yīng)混合物的溫度不超過90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、37、35、30、25或20℃。在實(shí)施方式中，在本文提供的方法中，該方法的所有步驟均在不高于90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、37、35、30、25或20℃的溫度下進(jìn)行。在實(shí)施方式中，本文提供的反應(yīng)混合物、容器或試劑盒保持不高于90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、37、35、30、25、或20℃的溫度。在實(shí)施方式中，本文提供的方法在沒有熱循環(huán)的情況下進(jìn)行。

在實(shí)施方式中，在本文提供的包含含有第一部分的多核苷酸模板的方法、反應(yīng)混合物、容器或試劑盒中，第一部分含有不多于5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100或200個(gè)核苷酸。在實(shí)施方式中，在本文提供的包含含有第一部分的多核苷酸模板的方法、反應(yīng)混合物、容器或試劑盒中，第一部分含有至少5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100或200個(gè)核苷酸。在實(shí)施方式中，在本文提供的包含含有第一部分的多核苷酸模板的方法、反應(yīng)混合物、容器或試劑盒中，第一部分含有至少5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90或100個(gè)且不多于10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100或200個(gè)核苷酸。

在實(shí)施方式中，在本文提供的包含含有第一區(qū)域的引物的方法、反應(yīng)混合物、容器或試劑盒中，第一區(qū)域含有至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、或100個(gè)核苷酸。在實(shí)施方式中，在本文提供的包含含有第一區(qū)域的引物的方法、反應(yīng)混合物、容器或試劑盒中，第一區(qū)域含有不多于4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90或100個(gè)核苷酸。在實(shí)施方式中，在本文提供的包含含有第一區(qū)域的引物的方法、反應(yīng)混合物、容器或試劑盒中，第一區(qū)域含有至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80或90個(gè)且不多于5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90或100個(gè)核苷酸。在實(shí)施方式中，在本文提供的包含含有第一區(qū)域的第一引物和含有第一區(qū)域的第二引物的方法、反應(yīng)混合物、容器或試劑盒中，第一引物和第二引物兩者均可具有以上所述的任何特征。在實(shí)施方式中，在本文提供的包含含有第一區(qū)域的第一引物和含有第一區(qū)域的第二引物的方法、反應(yīng)混合物、容器或試劑盒中，第一引物的第一區(qū)域和第二引物的第一區(qū)域可含有相同數(shù)目的核苷酸。在實(shí)施方式中，在本文提供的包含含有第一區(qū)域的第一引物和含有第一區(qū)域的第二引物的方法、反應(yīng)混合物、容器或試劑盒中，第一引物的第一區(qū)域和第二引物的第一區(qū)域可含有不同數(shù)目的核苷酸。

在實(shí)施方式中，在本文提供的包含含有第二區(qū)域的引物的方法、反應(yīng)混合物、容器或試劑盒中，第二區(qū)域含有至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、或100個(gè)核苷酸。在實(shí)施方式中，在本文提供的包含含有第二區(qū)域的引物的方法、反應(yīng)混合物、容器或試劑盒中，第二區(qū)域含有不多于4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90或100個(gè)核苷酸。在實(shí)施方式中，在本文提供的包含含有第二區(qū)域的引物的方法、反應(yīng)混合物、容器或試劑盒中，第二區(qū)域含有至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80或90個(gè)且不多于5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90或100個(gè)核苷酸。在實(shí)施方式中，在本文提供的包含含有第二區(qū)域的第一引物和含有第二區(qū)域的第二引物的方法、反應(yīng)混合物、容器或試劑盒中，第一引物和第二引物兩者均可具有以上所述的任何特征。在實(shí)施方式中，在本文提供的包含含有第二區(qū)域的第一引物和含有第二區(qū)域的第二引物的方法、反應(yīng)混合物、容器或試劑盒中，第一引物的第二區(qū)域和第二引物的第二區(qū)域可含有相同數(shù)目的核苷酸。在實(shí)施方式中，在本文提供的包含含有第二區(qū)域的第一引物和含有第二區(qū)域的第二引物的方法、反應(yīng)混合物、容器或試劑盒中，第一引物的第二區(qū)域和第二引物的第二區(qū)域可含有不同數(shù)目的核苷酸。

在實(shí)施方式中，在本文提供的包含含有第二區(qū)域的第二引物和包含第二部分的多核苷酸模板的方法、反應(yīng)混合物、容器或試劑盒中，第二引物的第二區(qū)域的核苷酸序列與多核苷酸模板的第二部分的核苷酸序列相同。

在實(shí)施方式中，在本文提供的包含含有尾區(qū)的引物的方法、反應(yīng)混合物、容器或試劑盒中，尾區(qū)含有至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90或100個(gè)核苷酸。在實(shí)施方式中，在本文提供的包含含有尾區(qū)的引物的方法、反應(yīng)混合物、容器或試劑盒中，尾區(qū)含有不多于4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90或100個(gè)核苷酸。在實(shí)施方式中，在本文提供的包含含有尾區(qū)的引物的方法、反應(yīng)混合物、容器或試劑盒中，尾區(qū)含有至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80或90個(gè)且不多于5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90或100個(gè)核苷酸。在實(shí)施方式中，在本文提供的包含含有尾區(qū)的第一引物和含有尾區(qū)的第二引物的方法、反應(yīng)混合物、容器或試劑盒中，第一引物和第二引物兩者均可具有以上所述的任何特征。在實(shí)施方式中，在本文提供的包含含有尾區(qū)的第一引物和含有尾區(qū)的第二引物的方法、反應(yīng)混合物、容器或試劑盒中，第一引物的尾區(qū)和第二引物的尾區(qū)可含有相同數(shù)目的核苷酸。在實(shí)施方式中，在本文提供的包含含有尾區(qū)的第一引物和含有尾區(qū)的第二引物的方法、反應(yīng)混合物、容器或試劑盒中，第一引物的尾區(qū)和第二引物的尾區(qū)可含有不同數(shù)目的核苷酸。

在實(shí)施方式中，在本文提供的包含含有模板結(jié)合區(qū)的引物的方法、反應(yīng)混合物、容器或試劑盒中，該模板結(jié)合區(qū)含有至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90或100個(gè)核苷酸。在實(shí)施方式中，在本文提供的包含含有模板結(jié)合區(qū)的引物的方法、反應(yīng)混合物、容器或試劑盒中，模板結(jié)合區(qū)含有不多于4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90或100個(gè)核苷酸。在實(shí)施方式中，在本文提供的包含含有模板結(jié)合區(qū)的引物的方法、反應(yīng)混合物、容器或試劑盒中，模板結(jié)合區(qū)含有至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80或90個(gè)且不多于5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90或100個(gè)核苷酸。在實(shí)施方式中，在本文提供的包含含有模板結(jié)合區(qū)的第一引物和含有模板結(jié)合區(qū)的第二引物的方法、反應(yīng)混合物、容器或試劑盒中，第一引物和第二引物兩者均可具有以上所述的任何特征。在實(shí)施方式中，在本文提供的包含含有模板結(jié)合區(qū)的第一引物和含有模板結(jié)合區(qū)的第二引物的方法、反應(yīng)混合物、容器或試劑盒中，第一引物的模板結(jié)合區(qū)和第二引物的模板結(jié)合區(qū)可含有相同數(shù)目的核苷酸。在實(shí)施方式中，在本文提供的包含含有模板結(jié)合區(qū)的第一引物和含有模板結(jié)合區(qū)的第二引物的方法、反應(yīng)混合物、容器或試劑盒中，第一引物的模板結(jié)合區(qū)和第二引物的模板結(jié)合區(qū)可含有不同數(shù)目的核苷酸。

在實(shí)施方式中，在本文提供的包含多核苷酸模板的方法、反應(yīng)混合物、容器或試劑盒中，多核苷酸模板可含有至少8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、200、500、1000、2000或5000個(gè)核苷酸。在實(shí)施方式中，在本文提供的包含多核苷酸模板的方法、反應(yīng)混合物、容器或試劑盒中，多核苷酸模板可含有不多于8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、200、500、1000、2000、5000或10,000個(gè)核苷酸。在實(shí)施方式中，在本文提供的包含多核苷酸模板的方法、反應(yīng)混合物、容器或試劑盒中，多核苷酸模板可含有至少8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、200、500、1000、2000或5000個(gè)且不多于9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、200、500、1000、2000、5000或10,000個(gè)核苷酸。

在實(shí)施方式中，在本文提供的包含雙鏈核酸模板的方法、反應(yīng)混合物、容器或試劑盒中，雙鏈核酸模板的每一條鏈可含有至少8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、200、500、1000、2000或5000個(gè)核苷酸。在實(shí)施方式中，在本文提供的包含雙鏈核酸模板的方法、反應(yīng)混合物、容器或試劑盒中，雙鏈核酸模板的每一條鏈可含有不多于8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、200、500、1000、2000、5000或10,000個(gè)核苷酸。在實(shí)施方式中，在本文提供的包含雙鏈核酸模板的方法、反應(yīng)混合物、容器或試劑盒中，雙鏈核酸模板的每一條鏈可含有至少8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、200、500、1000、2000或5000個(gè)且不多于9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、200、500、1000、2000、5000或10,000個(gè)核苷酸。

在實(shí)施方式中，本文提供的反應(yīng)混合物、容器或試劑盒不含有重組酶。

在實(shí)施方式中，本文提供的方法、反應(yīng)混合物、容器或試劑盒可含有或包含引物的多個(gè)拷貝。所述多個(gè)拷貝可以是，例如，引物的至少5、10、15、20、50、100、500、1000、10,000、100,000或1,000,000個(gè)拷貝。

在實(shí)施方式中，本文提供的反應(yīng)混合物或容器可包含來自受試者的生物樣品的至少一部分。該生物樣品可以是，例如，唾液、血液、尿液、臉頰拭子或鼻拭子。該受試者可以是人。

在一些實(shí)施方式中，本文提供的方法的所有步驟均在不高于70、65、60、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15或10℃的溫度下進(jìn)行。在一些實(shí)施方式中，本文提供的方法的一些步驟在不高于70、65、60、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15或10℃的溫度下進(jìn)行。

在一些實(shí)施方式中，本文提供的方法的兩個(gè)或更多個(gè)步驟在相同的反應(yīng)混合物中同時(shí)進(jìn)行。在一些實(shí)施方式中，本文提供的方法的所有步驟均在相同的反應(yīng)混合物中同時(shí)進(jìn)行。

在一些實(shí)施方式中，在本文提供的方法中，在該方法開始后的5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、120或180分鐘內(nèi)核酸模板擴(kuò)增了至少10、100、1000、10,000、100,000或1,000,000倍。在一些實(shí)施方式中，在本文提供的方法中，在該方法開始后的5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、120或180分鐘內(nèi)反應(yīng)混合物中核酸模板的拷貝數(shù)增加了至少10、100、1000、10,000、100,000或1,000,000倍。

在實(shí)施方式中，本文提供的核酸模板可以是單鏈或雙鏈核酸模板。

在實(shí)施方式中，本文提供了一種容器，該容器包含在其中流體連通的：第一引物，其中該第一引物包含第一區(qū)域和第二區(qū)域，并且其中第一引物的第二區(qū)域包含與多核苷酸模板的第一部分互補(bǔ)的核苷酸序列；第二引物，其中該第二引物包含第一區(qū)域和第二區(qū)域，并且其中第二引物的第二區(qū)域包含與配偶體核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列，其中該配偶體核苷酸序列與多核苷酸模板的第二部分互補(bǔ)；以及至少一條多聯(lián)體鏈，其中該多聯(lián)體鏈包含5’端和3’端，并且包含具有5’至3’方向的通用結(jié)構(gòu)C’-T-C’-T-X-C’的核苷酸序列，其中：C’表示第二引物的第一區(qū)域的核苷酸序列，T表示多核苷酸模板的核苷酸序列或其類似序列，且X表示任何數(shù)目和序列的核苷酸。

在一些實(shí)施方式中，本文提供了一種容器，該容器包含在其中流體流通的：(A)分離的核酸聚合酶，(B)包含至少第一鏈的核酸模板，(C)第一引物，其包含5’末端核苷酸、3’末端核苷酸以及兩個(gè)區(qū)域：(i)尾區(qū)，其包含：(a)引物的5’末端核苷酸，(b)最內(nèi)核苷酸，其中該最內(nèi)核苷酸在5’末端核苷酸的下游，(c)5’末端核苷酸與最內(nèi)核苷酸之間的中間部分，該中間部分包含一個(gè)或多個(gè)核苷酸，以及(ii)模板結(jié)合區(qū)，其包括：(a)引物的3’末端核苷酸，(b)最內(nèi)核苷酸，其中該最內(nèi)核苷酸在3’末端核苷酸的上游，(c)3’末端核苷酸與最內(nèi)核苷酸之間的中間部分，該中間部分包含一個(gè)或多個(gè)核苷酸，其中模板結(jié)合區(qū)與核酸模板的第一鏈互補(bǔ)，以及(D)第二引物，其包含5’末端核苷酸、3’末端核苷酸以及兩個(gè)區(qū)域：(i)尾區(qū)，其包含：(a)引物的5’末端核苷酸，(b)最內(nèi)核苷酸，其中該最內(nèi)核苷酸在5’末端核苷酸的下游，(c)5’末端核苷酸與最內(nèi)核苷酸之間的中間部分，該中間部分包含一個(gè)或多個(gè)核苷酸，以及(ii)模板結(jié)合區(qū)，其包含：(a)引物的3’末端核苷酸，(b)最內(nèi)核苷酸，其中該最內(nèi)核苷酸在3’末端核苷酸的上游，(c)3’末端核苷酸與最內(nèi)核苷酸之間的中間部分，該中間部分包含一個(gè)或多個(gè)核苷酸，并且其中模板結(jié)合區(qū)與互補(bǔ)于核酸模板的第一鏈的核苷酸序列互補(bǔ)，并且其中如果將引物的序列對齊使得第二引物的5’末端核苷酸與第一引物的尾區(qū)的最內(nèi)核苷酸對齊并且第一引物的5’末端核苷酸與第二引物的尾區(qū)的最內(nèi)核苷酸對齊，第二引物的尾區(qū)含有與第一引物的尾區(qū)的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。

在實(shí)施方式中，本文提供了一種試劑盒，其包含兩個(gè)或更多個(gè)流體隔離的器皿(container)，該器皿共同包含：第一引物，其中第一引物包含第一區(qū)域和第二區(qū)域，并且其中第一引物的第二區(qū)域包含與多核苷酸模板的第一部分互補(bǔ)的核苷酸序列；第二引物，其中第二引物包含第一區(qū)域和第二區(qū)域，并且其中第二引物的第二區(qū)域包含與配偶體核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列，其中該配偶體核苷酸序列與核苷酸模板的第二部分互補(bǔ)；以及分離的具有鏈置換活性的DNA聚合酶；其中：第一引物的第一區(qū)域和第二引物的第一區(qū)域互補(bǔ)。

在一些實(shí)施方式中，本文提供了一種用于檢測包含至少第一鏈的感興趣的靶核酸的試劑盒，該試劑盒包含兩個(gè)或更多個(gè)流體隔離的器皿，該器皿共同包含：(A)分離的核酸聚合酶，(B)第一引物，其包含5’末端核苷酸、3’末端核苷酸以及兩個(gè)區(qū)域：(i)尾區(qū)，其包含：(a)引物的5’末端核苷酸，(b)最內(nèi)核苷酸，其中該最內(nèi)核苷酸在5’末端核苷酸的下游，(c)5’末端核苷酸與最內(nèi)核苷酸之間的中間部分，該中間部分包含一個(gè)或多個(gè)核苷酸，以及(ii)模板結(jié)合區(qū)，其包括：(a)引物的3’末端核苷酸，(b)最內(nèi)核苷酸，其中該最內(nèi)核苷酸在3’末端核苷酸的上游，(c)3’末端核苷酸與最內(nèi)核苷酸之間的中間部分，該中間部分包含一個(gè)或多個(gè)核苷酸，其中模板結(jié)合區(qū)與靶核酸的第一鏈互補(bǔ)，以及(C)第二引物，其包含5’末端核苷酸、3’末端核苷酸以及兩個(gè)區(qū)域：(i)尾區(qū)，其包含：(a)引物的5’末端核苷酸，(b)最內(nèi)核苷酸，其中該最內(nèi)核苷酸在5’末端核苷酸的下游，(c)5’末端核苷酸與最內(nèi)核苷酸之間的中間部分，該中間部分包含一個(gè)或多個(gè)核苷酸，以及(ii)模板結(jié)合區(qū)，其包含：(a)引物的3’末端核苷酸，(b)最內(nèi)核苷酸，其中該最內(nèi)核苷酸在3’末端核苷酸的上游，(c)3’末端核苷酸與最內(nèi)核苷酸之間的中間部分，該中間部分包含一個(gè)或多個(gè)核苷酸，并且其中模板結(jié)合區(qū)與互補(bǔ)于靶核酸的第一鏈的核苷酸序列互補(bǔ)，并且其中如果將引物的序列對齊使得第二引物的5’末端核苷酸與第一引物的尾區(qū)的最內(nèi)核苷酸對齊并且第一引物的5’末端核苷酸與第二引物的尾區(qū)的最內(nèi)核苷酸對齊，第二引物的尾區(qū)含有與第一引物的尾區(qū)的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。

在一些實(shí)施方式中，本文提供的試劑盒包含具有感興趣的靶核酸的核苷酸序列的核酸。

在一些實(shí)施方式中，本文提供的反應(yīng)混合物、容器或試劑盒包含核酸染料。

在一些實(shí)施方式中，在本文提供的包含分離的核酸聚合酶的容器或試劑盒中，分離的核酸聚合酶是DNA聚合酶。在一些實(shí)施方式中，在本文提供的包含分離的核酸聚合酶的容器或試劑盒中，分離的核酸聚合酶是逆轉(zhuǎn)錄酶。在一些實(shí)施方式中，在本文提供的包含分離的核酸聚合酶的容器或試劑盒中，該容器或試劑盒包含DNA聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶兩者。

在一些實(shí)施方式中，在本文提供的包含核酸聚合酶的方法、容器或試劑盒中，該核酸聚合酶具有鏈置換活性。

在一些實(shí)施方式中，本文提供的方法包括用核酸染料處理一個(gè)或多個(gè)反應(yīng)組分或該方法的步驟。

在一些實(shí)施方式中，在本文提供的包含核酸模板的方法、容器或試劑盒中，模板是DNA分子。在一些實(shí)施方式中，在本文提供的包含核酸模板的方法、容器或試劑盒中，模板是RNA分子。

在一些實(shí)施方式中，在本文提供的包含第一引物的方法、容器或試劑盒中，第一引物的尾區(qū)包含至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方式中，在本文提供的包含第一引物的方法、容器或試劑盒中，第一引物的尾區(qū)包含不多于4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50或60個(gè)核苷酸。

在一些實(shí)施方式中，在本文提供的包含第二引物的方法、容器或試劑盒中，第二引物的尾區(qū)包含至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方式中，在本文提供的包含第二引物的方法、容器或試劑盒中，第二引物的尾區(qū)包含不多于4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50或60個(gè)核苷酸。

在一些實(shí)施方式中，在本文提供的包含第一引物的方法、容器或試劑盒中，第一引物的模板結(jié)合區(qū)包含至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方式中，在本文提供的包含第一引物的方法、容器或試劑盒中，第一引物的模板結(jié)合區(qū)包含不多于4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50或60個(gè)核苷酸。

在一些實(shí)施方式中，在本文提供的包含第二引物的方法、容器或試劑盒中，第二引物的模板結(jié)合區(qū)包含至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方式中，在本文提供的包含第二引物的方法、容器或試劑盒中，第二引物的模板結(jié)合區(qū)包含不多于4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50或60個(gè)核苷酸。

在一些實(shí)施方式中，在本文提供的其中RNA分子是模板分子或一級(jí)核酸的方法和組合物中，模板的擴(kuò)增可以指對應(yīng)于RNA分子的DNA鏈的拷貝的生成。

在一些實(shí)施方式中，本文提供的方法包括測量來自包括本方法的測定的熒光信號(hào)。

在一些實(shí)施方式中，核酸連接酶可包含在本文提供的方法或組合物中。在一些實(shí)施方式中，相比于如果核酸連接酶不包含在反應(yīng)中，當(dāng)連接酶包含在反應(yīng)混合物中用于本文提供的方法時(shí)，采用本文提供的方法可更快速地?cái)U(kuò)增核酸模板。在實(shí)施方式中，本文提供的反應(yīng)混合物、容器或試劑盒可含有具有連接酶活性的酶。

在實(shí)施方式中，本文提供了測定樣品中的病原體的方法，該方法包括進(jìn)行如本文提供的方法以從病原體中擴(kuò)增核酸。在實(shí)施方式中，在本文提供的組合物或方法中使用的靶核酸可以是來自病原體的核酸。在實(shí)施方式中，在本文提供的方法中使用的第一和第二引物可各自含有與病原體的核酸中的序列互補(bǔ)的區(qū)域，或者與互補(bǔ)于病原體核酸中的序列的序列互補(bǔ)的區(qū)域。在實(shí)施方式中，病原體的核酸可以是DNA或RNA。病原體可包括但不限于病毒、細(xì)菌、真菌和原生生物。樣品可來自受試者，并可具有本文其他地方所述的任何樣品特征。

在實(shí)施方式中，本文提供的用于核酸擴(kuò)增的方法可用于人體或動(dòng)物體外部的診斷方法。例如，樣品可從人或動(dòng)物中獲得，并且可用本文提供的用于核酸擴(kuò)增的方法測定樣品中感興趣的靶核酸。

在實(shí)施方式中，本文提供的方法可包括：a)在反應(yīng)混合物中提供一種或多種用于進(jìn)行如本文所述的方法的試劑(例如，第一引物、第二引物、核酸模板、核酸聚合酶、核苷酸、緩沖液、水等中的一種或多種)，以及b)在基本等溫的溫度下溫育反應(yīng)混合物，其中在溫育期間反應(yīng)混合物的溫度偏離中心溫度不多于或少于20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1攝氏度。在實(shí)施方式中，中心溫度可以是，例如，30、35、40、45、50、55、60、65、70、75或80攝氏度。

在實(shí)施方式中，本文提供的方法可以在基本等溫的溫度下進(jìn)行。在實(shí)施方式中，基本等溫的溫度可以是30、35、40、45、50、55、60、65、70、75或80攝氏度加或減20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1攝氏度中的任何溫度。

在實(shí)施方式中，本文提供的方法可在一個(gè)或多個(gè)溫度下進(jìn)行，該溫度均不超過90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、或25攝氏度。

在實(shí)施方式中，本文提供的方法可在沒有熱循環(huán)的情況下進(jìn)行/反應(yīng)混合物可在沒有熱循環(huán)(即沒有升高和降低溫育溫度以分離鏈或使引物雜交的循環(huán)，如在例如基于PCR的方法中使用的)的條件下溫育。

在本文提供的包含含有第一區(qū)域的第一引物和含有第一區(qū)域的第二引物的組合物和方法中，其中第一引物的第一區(qū)域與第二引物的第一區(qū)域互補(bǔ)，在實(shí)施方式中，第一引物的第一區(qū)域和第二引物的第一區(qū)域含有核苷酸序列，使得雙鏈結(jié)構(gòu)不會(huì)形成限制酶識(shí)別序列，該雙鏈結(jié)構(gòu)根據(jù)沃森-克里克(Watson-Crick)堿基配對原則通過第一引物的第一區(qū)域與第二引物的第一區(qū)域退火而形成。

在本文提供的包含核酸聚合酶的組合物和方法中，在實(shí)施方式中，該核酸聚合酶具有3’至5’外切核酸酶活性。

在實(shí)施方式中，本文提供了用于擴(kuò)增靶核酸鏈的方法，該方法包括：在基本上等溫的條件下溫育包含靶核酸鏈、第一引物和第二引物的反應(yīng)混合物，其中：所述靶核酸鏈包含第一部分和第二部分；所述第一引物包含第一區(qū)域和第二區(qū)域，其中所述第一區(qū)域包含該引物的5’端，所述第二區(qū)域包含該引物的3’端，并且所述第二區(qū)域與該核酸鏈的第一部分互補(bǔ)；所述第二引物包含第一區(qū)域和第二區(qū)域，其中所述第一區(qū)域包含該引物的5’端，所述第二區(qū)域包含該引物的3’端，并且所述第二區(qū)域與同該核酸鏈的第二部分互補(bǔ)的序列互補(bǔ)；所述第一引物的第一區(qū)域與所述第二引物的第一區(qū)域互補(bǔ)；并擴(kuò)增靶核酸鏈。任選地，該靶核酸鏈可進(jìn)一步包含第三部分，其中所述第三部分位于該靶核酸鏈中第一部分與第二部分之間，并且其中所述第二引物的第一區(qū)域與所述靶核酸鏈的第三部分互補(bǔ)。

在實(shí)施方式中，在本文提供的任何方法中，多核苷酸模板、靶核酸鏈等可含有內(nèi)部基序，其中本文提供的用于擴(kuò)增靶核酸鏈的引物的尾區(qū)與該內(nèi)部基序互補(bǔ)。

在實(shí)施方式中，本文提供的方法可進(jìn)一步包括向本文提供的反應(yīng)混合物中添加肽-核酸(PNA)探針和與DNA-PNA雜合體結(jié)合的染料，其中該P(yáng)NA探針與用于在反應(yīng)混合物中擴(kuò)增的靶核酸或其互補(bǔ)序列互補(bǔ)。

在實(shí)施方式中，本文提供的反應(yīng)混合物可包含具有鏈置換活性的DNA聚合酶。

當(dāng)核酸在本文被描述為被“擴(kuò)增”等時(shí)，該核酸還可被描述為被“拷貝”等。

在實(shí)施方式中，在本文描述為具有第一區(qū)域和第二區(qū)域的引物中，所述第一區(qū)域可含有該引物的5’端，并且所述第二區(qū)域可含有該引物的3’端。

在實(shí)施方式中，在本文描述為具有尾區(qū)和模板結(jié)合區(qū)的引物中，所述第一區(qū)域可含有該引物的5’端，并且所述第二區(qū)域可含有該引物的3’端。

在實(shí)施方式中，本文提供了用于拷貝多核苷酸模板的方法，該方法包括：在沒有熱循環(huán)的條件下溫育包含多核苷酸模板、第一引物和第二引物的反應(yīng)混合物，其中：所述多核苷酸模板包含第一部分和第二部分；所述第一引物包含第一區(qū)域和第二區(qū)域，其中所述第一區(qū)域包含該引物的5’端，所述第二區(qū)域包含該引物的3’端，并且所述第二區(qū)域與該多核苷酸模板的第一部分互補(bǔ)；所述第二引物包含第一區(qū)域和第二區(qū)域，其中所述第一區(qū)域包含該引物的5’端，所述第二區(qū)域包含該引物的3’端，并且所述第二區(qū)域與同該多核苷酸模板的第二部分互補(bǔ)的序列互補(bǔ)；所述第一引物的第一區(qū)域與所述第二引物的第一區(qū)域互補(bǔ)；并生成該多核苷酸模板的多個(gè)拷貝。任選地，該多核苷酸模板可進(jìn)一步包含第三部分，其中所述第三部分位于該多核苷酸模板中第一部分與第二部分之間，并且其中所述第二引物的第一區(qū)域與所述多核苷酸模板的第三部分互補(bǔ)。

在實(shí)施方式中，本文提供了用于擴(kuò)增多核苷酸模板的方法，該方法包括在包含第一引物和第二引物的反應(yīng)混合物中溫育所述多核苷酸模板，其中：所述多核苷酸模板包含第一部分、第二部分和第三部分，其中所述第三部分位于該多核苷酸模板中第一部分與第二部分之間；所述第一引物包含第一區(qū)域和第二區(qū)域，其中所述第一引物的第二區(qū)域與所述多核苷酸模板的第一部分互補(bǔ)；并且所述第二引物包含第一區(qū)域和第二區(qū)域，其中所述第二引物的第二區(qū)域與同所述多核苷酸模板的第二部分互補(bǔ)的序列互補(bǔ)，所述第二引物的第一區(qū)域與所述第一引物的第一區(qū)域互補(bǔ)，并且所述第二引物的第一區(qū)域與所述多核苷酸模板的第三部分互補(bǔ)。

在實(shí)施方式中，本文提供了用于評(píng)估在多核苷酸模板中核苷酸序列的感興趣位置處的核苷酸的身份的方法，該方法包括：A)在至少第一反應(yīng)混合物和第二反應(yīng)混合物的每一個(gè)中提供所述多核苷酸模板的拷貝，其中：該多核苷酸模板包含第一部分、第二部分和第三部分，其中所述第三部分位于該多核苷酸模板中所述第一部分與所述第二部分之間，并且其中所述感興趣的位置在第三部分中；所述第一反應(yīng)混合物包含所述多核苷酸模板的拷貝、第一引物和第二引物，其中：所述第一引物包含第一區(qū)域和第二區(qū)域，其中所述第一區(qū)域包含該引物的5’端，所述第二區(qū)域包含該引物的3’端，并且所述第二區(qū)域與所述多核苷酸模板的第一部分互補(bǔ)；所述第二引物包含第一區(qū)域和第二區(qū)域，其中所述第一區(qū)域包含該引物的5’端，所述第二區(qū)域包含該引物的3’端，并且所述第二區(qū)域與同所述多核苷酸模板的第二部分互補(bǔ)的序列互補(bǔ)；所述第一引物的第一區(qū)域與所述第二引物的第一區(qū)域互補(bǔ)；并且所述第二引物的第一區(qū)域與所述多核苷酸模板的第三部分互補(bǔ)；所述第二反應(yīng)混合物包含所述多核苷酸模板的拷貝、第三引物和第四引物，其中：所述第三引物包含第一區(qū)域和第二區(qū)域，其中所述第一區(qū)域包含該引物的5’端，所述第二區(qū)域包含該引物的3’端，并且所述第二區(qū)域與所述多核苷酸模板的第一部分互補(bǔ)；所述第四引物包含第一區(qū)域和第二區(qū)域，其中所述第一區(qū)域包含該引物的5’端，所述第二區(qū)域包含該引物的3’端，并且所述第二區(qū)域與同所述多核苷酸模板的第二部分互補(bǔ)的序列互補(bǔ)；所述第三引物的第一區(qū)域與所述第四引物的第一區(qū)域互補(bǔ)；并且所述第四引物的第一區(qū)域與所述多核苷酸模板的第三部分互補(bǔ)；并且所述第二引物的第一區(qū)域的核苷酸序列與所述第四引物的第一區(qū)域的核苷酸序列相差一個(gè)核苷酸，其中如果為了序列的最大互補(bǔ)而用所述多核苷酸模板的第三部分的核苷酸序列定位所述第二引物或第四引物的第一區(qū)域的核苷酸序列，則在所述第二引物與第四引物中不同的核苷酸的位置對應(yīng)于所述多核苷酸模板中感興趣的核苷酸的位置；B)在沒有熱循環(huán)的條件下溫育所述第一反應(yīng)混合物和第二反應(yīng)混合物；以及C)比較所述第一反應(yīng)混合物中多核苷酸模板的擴(kuò)增速率或量與所述第二反應(yīng)混合物中多核苷酸模板的擴(kuò)增速率或量，其中所述多核苷酸模板的擴(kuò)增速率或量指示所述第二或第四引物的第一區(qū)域與所述多核苷酸模板的第三部分的核苷酸序列之間的互補(bǔ)程度。

任選地，在本文提供的涉及多核苷酸模板的實(shí)施方式中，該多核苷酸模板是DNA鏈。

任選地，在本文提供的涉及多核苷酸模板的實(shí)施方式中，該多核苷酸模板是RNA鏈。

任選地，在本文提供的涉及多核苷酸模板的實(shí)施方式中，該多核苷酸模板是雙鏈體核酸分子的一條鏈。在實(shí)施方式中，該雙鏈體核酸分子是雙鏈體DNA分子或雙鏈體RNA分子。

任選地，在本文提供的涉及反應(yīng)混合物、容器或試劑盒的實(shí)施方式中，該反應(yīng)混合物、容器或試劑盒包含具有鏈置換活性的DNA聚合酶。

任選地，在本文提供的涉及反應(yīng)混合物、容器或試劑盒的實(shí)施方式中，該反應(yīng)混合物、容器或試劑盒包含逆轉(zhuǎn)錄酶。

任選地，在本文提供的涉及反應(yīng)混合物、容器或試劑盒的實(shí)施方式中，該反應(yīng)混合物、容器或試劑盒包含核酸染料、核苷酸或緩沖液。

任選地，在本文提供的涉及含有第一部分、第二部分和第三部分的多核苷酸模板的實(shí)施方式中，該多核苷酸模板可具有3’至5’方向的元件的通用結(jié)構(gòu)1P-1S-3P-2S-2P，其中“1P”是所述第一部分，“1S”是第一間隔區(qū)(space)，“3P”是所述第三部分，“2S”是第二間隔區(qū)，并且“2P”是所述第二部分。所述“第一間隔區(qū)”和“第二間隔區(qū)”是所述多核苷酸模板的部分，它們含有不是所述第一部分、第二部分或第三部分的一部分的核苷酸。在實(shí)施方式中，所述第一部分可具有，例如，6至30個(gè)核苷酸或如本文其他地方所述的任何其他數(shù)目的核苷酸。在實(shí)施方式中，所述第一間隔區(qū)可具有，例如，2至30個(gè)核苷酸或如本文其他地方所述的任何其他數(shù)目的核苷酸。在實(shí)施方式中，所述第三部分可具有，例如，4至14個(gè)核苷酸或如本文其他地方所述的任何其他數(shù)目的核苷酸。在實(shí)施方式中，所述第一間隔區(qū)可具有，例如，2至30個(gè)核苷酸或如本文其他地方所述的任何其他數(shù)目的核苷酸。在實(shí)施方式中，所述第一部分可具有，例如，6至30個(gè)核苷酸或如本文其他地方所述的任何其他數(shù)目的核苷酸。

在實(shí)施方式中，在本文提供的涉及在反應(yīng)混合物中溫育多核苷酸模板的方法中，可以在該反應(yīng)混合物的溫育過程中生成包含所述多核苷酸模板的至少2、3、4、5或10個(gè)拷貝的多聯(lián)體鏈。

在實(shí)施方式中，本文提供了用于擴(kuò)增雙鏈核酸分子的方法，該方法包括在包含第一引物和第二引物的反應(yīng)混合物中溫育所述雙鏈核酸分子，其中：所述雙鏈核酸分子包含第一鏈和第二鏈，其中所述第一鏈包含第一部分和第三部分，并且所述第二鏈包含第二部分；所述第一引物包含第一區(qū)域和第二區(qū)域，其中所述第一引物的第二區(qū)域與所述第一鏈的第一部分互補(bǔ)；并且所述第二引物包含第一區(qū)域和第二區(qū)域，其中所述第二引物的第二區(qū)域與所述第二鏈的第二部分互補(bǔ)，所述第二引物的第一區(qū)域與所述第一鏈的第三部分互補(bǔ)，并且所述第二引物的第一區(qū)域與所述第一引物的第一區(qū)域互補(bǔ)。

在實(shí)施方式中，本文提供了一種反應(yīng)混合物，其包含：多核苷酸模板、第一引物和第二引物，其中：所述多核苷酸模板包含第一部分、第二部分和第三部分，其中所述第三部分位于該多核苷酸模板中第一部分與第二部分之間；所述第一引物包含第一區(qū)域和第二區(qū)域，其中所述第一區(qū)域包含該引物的5’端，所述第二區(qū)域包含該引物的3’端，并且所述第二區(qū)域與所述多核苷酸模板的第一部分互補(bǔ)；所述第二引物包含第一區(qū)域和第二區(qū)域，其中所述第一區(qū)域包含該引物的5’端，所述第二區(qū)域包含該引物的3’端，并且所述第二區(qū)域與同所述多核苷酸模板的第二部分互補(bǔ)的序列互補(bǔ)；所述第一引物的第一區(qū)域與所述第二引物的第一區(qū)域互補(bǔ)；并且所述第二引物的第一區(qū)域與所述多核苷酸模板的第三部分互補(bǔ)。

在實(shí)施方式中，本文提供了用于擴(kuò)增多核苷酸模板的試劑盒，該試劑盒包含：第一引物和第二引物，其中：所述第一引物包含第一區(qū)域和第二區(qū)域，其中所述第一區(qū)域包含該引物的5’端，所述第二區(qū)域包含該引物的3’端，并且所述第二區(qū)域與所述多核苷酸模板的第一部分互補(bǔ)；所述第二引物包含第一區(qū)域和第二區(qū)域，其中所述第一區(qū)域包含該引物的5’端，所述第二區(qū)域包含該引物的3’端，并且所述第二區(qū)域與同所述多核苷酸模板的第二部分互補(bǔ)的序列互補(bǔ)；所述第一引物的第一區(qū)域與所述第二引物的第一區(qū)域互補(bǔ)；并且所述第二引物的第一區(qū)域與所述多核苷酸模板的第三部分互補(bǔ)，其中所述第三部分位于該多核苷酸模板中第一部分與第二部分之間。

任選地，在本文提供的涉及試劑盒的實(shí)施方式中，該試劑盒的組分可以在至少兩個(gè)單獨(dú)的流體隔離的器皿之間分配。

在實(shí)施方式中，本文提供了包含兩個(gè)或更多個(gè)流體隔離的器皿的試劑盒，所述器皿共同包含：第一引物、第二引物、第三引物和第四引物，其中：所述第一引物包含第一區(qū)域和第二區(qū)域，其中所述第一區(qū)域包含該引物的5’端，所述第二區(qū)域包含該引物的3’端，并且所述第二區(qū)域與多核苷酸模板的第一部分互補(bǔ)；所述第二引物包含第一區(qū)域和第二區(qū)域，其中所述第一區(qū)域包含該引物的5’端，所述第二區(qū)域包含該引物的3’端，并且所述第二區(qū)域與同所述多核苷酸模板的第二部分互補(bǔ)的序列互補(bǔ)；所述第三引物包含第一區(qū)域和第二區(qū)域，其中所述第一區(qū)域包含該引物的5’端，所述第二區(qū)域包含該引物的3’端，并且所述第二區(qū)域與所述多核苷酸模板的第一部分互補(bǔ)；所述第四引物包含第一區(qū)域和第二區(qū)域，其中所述第一區(qū)域包含該引物的5’端，所述第二區(qū)域包含該引物的3’端，并且所述第二區(qū)域與同所述多核苷酸模板的第二部分互補(bǔ)的序列互補(bǔ)；所述第一引物的第一區(qū)域與所述第二引物的第一區(qū)域互補(bǔ)；所述第三引物的第一區(qū)域與所述第四引物的第一區(qū)域互補(bǔ)；并且所述第一引物的第一區(qū)域的核苷酸序列與所述第三引物的第一區(qū)域的核苷酸序列相差一個(gè)核苷酸。任選地，所述第二引物的第一區(qū)域和所述第四引物的第一區(qū)域均與所述多核苷酸模板的第三部分互補(bǔ)，其中所述第三部分位于該多核苷酸模板中第一部分與第二部分之間。任選地，所述第一引物、第二引物、第三引物和第四引物中的每一個(gè)的第二區(qū)域?yàn)?至30個(gè)核苷酸的長度。任選地，所述第一引物、第二引物、第三引物和第四引物中的每一個(gè)的第二區(qū)域?yàn)?至30個(gè)核苷酸的長度。

在本文提供的涉及試劑盒的實(shí)施方式中，該試劑盒可包含對照核酸鏈，該對照核酸鏈包含有待用該試劑盒的試劑檢測的多核苷酸模板的核苷酸序列。

在本文提供的方法和組合物中，任選地，可包括PNA探針和染料DiSc₂(5)。該P(yáng)NA探針可以與用于在相關(guān)反應(yīng)中擴(kuò)增的靶序列及其拷貝特異性地退火，從而形成DNA-PNA雙鏈體。本文提供的方法可包括檢測在染料DiSc₂(5)與DNA-PNA雙鏈體結(jié)合時(shí)該染料的顏色變化。在實(shí)施方式中，可以在反應(yīng)開始之后或反應(yīng)結(jié)束之后，向本文提供的反應(yīng)混合物中添加PNA探針和染料。在實(shí)施方式中，可以在反應(yīng)開始之后至少5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100分鐘，向本文提供的反應(yīng)混合物中添加PNA探針和染料。在實(shí)施方式中，可以在反應(yīng)開始之后不超過5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100分鐘，向本文提供的反應(yīng)混合物中添加PNA探針和染料。

除非上下文另外明確指出，本文中對生成多核苷酸模板或核酸模板的拷貝或擴(kuò)增多核苷酸模板或核酸模板的提及包括生成含有多核苷酸模板/核酸模板的序列的拷貝，以及生成含有多核苷酸模板/核酸模板的類似序列的拷貝。例如，如果多核苷酸模板是RNA，則生成模板的拷貝可包括生成這樣的拷貝，該拷貝是含有多核苷酸模板的RNA序列的DNA形式的DNA分子(即，在DNA序列中，含有“T”而非“U”)。

附圖說明

在附圖中，

圖1為本文提供的方法的總的示意圖；圖1A-1K示出了本方法的步驟和特征。圖1包含以下的核苷酸序列：103：AACGGTTGCTC(SEQ ID NO:1)；104：GAGCAACCGTT(SEQ ID NO:2)；105：ATGGGAGC(SEQ ID NO:3)；106：CCATAACG(SEQ ID NO:4)；111:ATGGGAGCAACCGTT(SEQ ID NO:5)；112：CCATAACGGTTGCTCCCAT(SEQ ID NO:6)；113：ATGGGAGCAACCGTTATGG(SEQ ID NO:7)；121：CCATAACGGTTGCTCCCATAACGGTTGCTCCCAT(SEQ ID NO:8)；122：ATGGGAGCAACCGTTATGGGAGCAACCGTTATGG(SEQ ID NO:9)。

圖2A示出了與本文提供的方法一起使用的某些引物的核苷酸序列。圖2A包含以下的核苷酸序列：P1引物，37個(gè)核苷酸：CGCCGGATGGCTCTTGGGAAACCAAACCGTACCAACC(SEQ ID NO:10)；P1引物，35個(gè)核苷酸：CCGGATGGCTCTTGGGAAACCAAACCGTACCAACC(SEQ ID NO:11)；P1引物，33個(gè)核苷酸：GGATGGCTCTTGGGAAACCAAACCGTACCAACC(SEQ ID NO:12)；P1引物，31個(gè)核苷酸：ATGGCTCTTGGGAAACCAAACCGTACCAACC(SEQ ID NO:13)；P1引物，30個(gè)核苷酸：TGGCTCTTGGGAAACCAAACCGTACCAACC(SEQ ID NO:14)；P1引物，29個(gè)核苷酸：GGCTCTTGGGAAACCAAACCGTACCAACC(SEQ ID NO:15)；P1引物，28個(gè)核苷酸：GCTCTTGGGAAACCAAACCGTACCAACC(SEQ ID NO:16)；P1引物，27個(gè)核苷酸：CTCTTGGGAAACCAAACCGTACCAACC(SEQ ID NO:17)；P1引物，26個(gè)核苷酸：TCTTGGGAAACCAAACCGTACCAACC(SEQ ID NO:18)；P1引物，25個(gè)核苷酸：CTTGGGAAACCAAACCGTACCAACC(SEQ ID NO:19)；P1引物，24個(gè)核苷酸：TTGGGAAACCAAACCGTACCAACC(SEQ ID NO:20)；P1引物，23個(gè)核苷酸：TGGGAAACCAAACCGTACCAACC(SEQ ID NO:21)；P2引物，36個(gè)核苷酸：GTTTCCCAAGAGCCATCCGGCGATGCGGAATGTACC(SEQ ID NO:22)；P2引物，34個(gè)核苷酸：GTTTCCCAAGAGCCATCCGGATGCGGAATGTACC(SEQ ID NO:23)；P2引物，32個(gè)核苷酸：GTTTCCCAAGAGCCATCCATGCGGAATGTACC(SEQ ID NO:24)；P2引物，30個(gè)核苷酸：GTTTCCCAAGAGCCATATGCGGAATGTACC(SEQ ID NO:25)；P2引物，29個(gè)核苷酸：GTTTCCCAAGAGCCAATGCGGAATGTACC(SEQ ID NO:26)；P2引物，28個(gè)核苷酸：GTTTCCCAAGAGCCATGCGGAATGTACC(SEQ ID NO:27)；P2引物，27個(gè)核苷酸：GTTTCCCAAGAGCATGCGGAATGTACC(SEQ ID NO:28)；P2引物，26個(gè)核苷酸：GTTTCCCAAGAGATGCGGAATGTACC(SEQ ID NO:29)；P2引物，25個(gè)核苷酸：GTTTCCCAAGAATGCGGAATGTACC(SEQ ID NO:30)；P2引物，24個(gè)核苷酸：GTTTCCCAAGATGCGGAATGTACC(SEQ ID NO:31)；P2引物，23個(gè)核苷酸：GTTTCCCAAATGCGGAATGTACC(SEQ ID NO:32)；以及P2引物，22個(gè)核苷酸：GTTTCCCAATGCGGAATGTACC(SEQ ID NO:33)。

圖2B為示出了根據(jù)本文提供的方法進(jìn)行的反應(yīng)的結(jié)果的圖。

圖3A和3B示出了與本文提供的方法一起使用的某些引物的核苷酸序列。圖3A包含以下的核苷酸序列：C5：ATGGCTCTTGGGAAACTGAAACCGTACCAACC(SEQ ID NO:34)；D5：GTTTCCCAAGAGCCATGGATGCGGAATGTACC(SEQ ID NO:35)；C6：GGCTCTTGGGAAACTGAAACCGTACCAACC(SEQ ID NO:36)；D6：GTTTCCCAAGAGCCGGATGCGGAATGTACC(SEQ ID NO:37)；C7：CTCTTGGGAAACTGAAACCGTACCAACC(SEQ ID NO:38)；D7：GTTTCCCAAGAGGGATGCGGAATGTACC(SEQ ID NO:39)；C8：TCTTGGGAAACTGAAACCGTACCAACC(SEQ ID NO:40)；D8：GTTTCCCAAGAGGATGCGGAATGTACC(SEQ ID NO:41)；C9：CTTGGGAAACTGAAACCGTACCAACC(SEQ ID NO:42)；D9：GTTTCCCAAGGGATGCGGAATGTACC(SEQ ID NO:43)；C10：TTGGGAAACTGAAACCGTACCAACC(SEQ ID NO:44)；D10：GTTTCCCAAGGATGCGGAATGTACC(SEQ ID NO:45)；C11：TGGGAAACTGAAACCGTACCAACC(SEQ ID NO:46)；D11：GTTTCCCAGGATGCGGAATGTACC(SEQ ID NO:47)；C12：GGGAAACTGAAACCGTACCAACC(SEQ ID NO:48)；以及D12：GTTTCCCGGATGCGGAATGTACC(SEQ ID NO:49)。圖3B包含以下的核苷酸序列：A1：ATGGCTCTTGGGAAACTGCCTGAAACCGTACCAACC(SEQ ID NO:50)；B1：GTTTCCCAAGAGCCATACAGGGATGCGGAATGTACC(SEQ ID NO:51)；A2：GGCTCTTGGGAAACTGCCTGAAACCGTACCAACC(SEQ ID NO:52)；B2：GTTTCCCAAGAGCCACAGGGATGCGGAATGTACC(SEQ ID NO:53)；A3：CTCTTGGGAAACTGCCTGAAACCGTACCAACC(SEQ ID NO:54)；B3：GTTTCCCAAGAGACAGGGATGCGGAATGTACC(SEQ ID NO:55)；A4：TCTTGGGAAACTGCCTGAAACCGTACCAACC(SEQ ID NO:56)；B4：GTTTCCCAAGAACAGGGATGCGGAATGTACC(SEQ ID NO:57)；A5：CTTGGGAAACTGCCTGAAACCGTACCAACC(SEQ ID NO:58)；B5：GTTTCCCAAGACAGGGATGCGGAATGTACC(SEQ ID NO:59)；A6：TTGGGAAACTGCCTGAAACCGTACCAACC(SEQ ID NO:60)；B6：GTTTCCCAAACAGGGATGCGGAATGTACC(SEQ ID NO:61)；A7：TGGGAAACTGCCTGAAACCGTACCAACC(SEQ ID NO:62)；B7：GTTTCCCAACAGGGATGCGGAATGTACC(SEQ ID NO:63)；A8：GGGAAACTGCCTGAAACCGTACCAACC(SEQ ID NO:64)；以及B8：GTTTCCCACAGGGATGCGGAATGTACC(SEQ ID NO:65)。

圖3C和3D為示出了根據(jù)本文提供的方法進(jìn)行的反應(yīng)的結(jié)果的圖。

圖4為示出了根據(jù)本文提供的方法進(jìn)行的反應(yīng)的結(jié)果的圖。

圖5為示出了根據(jù)本文提供的方法進(jìn)行的反應(yīng)的結(jié)果的圖。

圖6為示出了根據(jù)本文提供的方法進(jìn)行的反應(yīng)的結(jié)果的圖。

圖7為示出了根據(jù)本文提供的方法進(jìn)行的反應(yīng)中生成的產(chǎn)物的核苷酸序列的序列比對。圖7包含以下的核苷酸序列(按從比對中的頂部序列到比對中的底部序列的順序)：SEQ ID NO:66：TCTTGAGAGAACCCACTAACAGTAGAAGTACCATACATTTGTACAGAAGGGGAAGACCAAATTCTTGAGA；SEQ ID NO:67：TCTTGAGAGAACCCACTAACAGTAGAAGTACCATACATTTGTACAGAAGGGGAAGACCAAATTCTTGAGAGAACCCACTAACAGTAGAAGTACCATACATTT；SEQ ID NO:68：TCTTGAGAGAACCCACTAACAGTAGAAGTACCATACATTTGTACAGAAGGGGAAGACCAAATTCTTGAGAGAACCCACTAACAGTAGAAGTACCATACATTT；SEQ ID NO:69：TCTTGAGAGAACCCACTAACAGTAGAAGTACCATACATTTGTACAGAAGGGGAAGACCAAATTCTTGAGAGAACCCACTAACAGTAGAAGTACCATACATTT；SEQ ID NO:70：TCTTGAGAGAACCCACTAACAGTAGAAGTACCATACATTTGTACTGAAGGGGAAGACCAAATTCTTGAGAGAACCCACTAACAGTAGAAGTACCATACATTT；SEQ ID NO:71：TCTTGAGAGAACCCACTAACAGTAGAAGTACCATACATTTGTACAGAAGGGGAAGACCAAATTCTTGAGAGAACCCACTAACAGTAGAAGTACCATACATTT；SEQ ID NO:72：TCTTGAGAGAACCCACTAACAGTAGAAGTACCATACATTTGTACAGAAGGGGAAGACCAAATTCTTGAGAGAACCCACTAACAGTAGAAGTACCATACATTT；SEQ ID NO:73：TCTTGAGAGAACCCACTAACAGTAGAAGTACCATACATTTGTACAGAAGGGGAAGACCAAATTCTTGAGAGAACCCACTAACAGTAGAAGTACCATACATTT；SEQ ID NO:74：TCTTGAGAGAACCCACTAACAGTAGAAGTACCATACATTTGTACAGAAGGGGAAGACCAAATTCTTGAGAGAACCCACTAACAGTAGAAGTACCATACATTT；SEQ ID NO:75：TCTTGAGAGAACCCACTAACAGTAGAAGTACCATACATTTGTACAGAAGGGGAAGACCAATTCTTGAGAGAACCCACTAACAGTAGAAGTACCATACATTT；SEQ ID NO:76：GAACCCACTAACAGTAGAAGTACCATACATTTGTACAGAAGGGGAAGACCAAATGAACCCACTAACAGTAGAAGTACCATACATTT；SEQ ID NO:77：TCTTGAGAGAACCCACTAACTCTTGAGAGAACCCACTAAC；以及SEQ ID NO:78：GGAAGACCAAATTCTTGAGA。

圖8A-8C是本文提供的分子的實(shí)施方式的特征的一般示意圖。

圖9是本文提供的分子的實(shí)施方式的特征的一般示意圖。

圖10A-10C是本文提供的分子的實(shí)施方式的特征的一般示意圖。

圖11是描繪根據(jù)本文提供的方法進(jìn)行的反應(yīng)的結(jié)果的圖。

圖12是描繪根據(jù)本文提供的方法進(jìn)行的反應(yīng)的結(jié)果的圖。

需要注意的是，附圖和其中的元件不必要按形狀或比例繪制。例如，為便于呈現(xiàn)或使呈現(xiàn)清楚，附圖中元件的形狀或比例可進(jìn)行簡化或修改。應(yīng)進(jìn)一步理解，附圖和其中的元件僅用于示例性說明目的，不應(yīng)理解為以任何方式進(jìn)行限制。

具體實(shí)施方式

盡管本發(fā)明包括各種修改和替代形式，但其具體實(shí)施方式通過附圖中的示例示出并將在本文中詳細(xì)描述。然而，應(yīng)理解，并非意在將本發(fā)明限于所公開的特定形式，而是相反，本發(fā)明覆蓋如由權(quán)利要求所限定的本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的所有修改、等同項(xiàng)和替代方案。

在一些實(shí)施方式中，本文提供了涉及核酸擴(kuò)增和多聯(lián)體生成的方法和組合物。

在本文提供的方法中，核酸多聯(lián)體的生成還增加了該多聯(lián)體中的核酸模板/特定核酸的拷貝數(shù)。因此，本文中對用于生成多聯(lián)體的方法和組合物的提及還適用于核酸的擴(kuò)增。

如本文所用的，“多核苷酸”指的是含有兩個(gè)或更多個(gè)核苷酸的聚合鏈?！岸嗪塑账帷卑ㄒ铩⒐押塑账?、核酸鏈等。多核苷酸可含有標(biāo)準(zhǔn)或非標(biāo)準(zhǔn)核苷酸。通常，多核苷酸在鏈的一個(gè)末端(“5’末端”)含有5’磷酸并在鏈的另一末端(“3’末端”)含有3’羥基基團(tuán)。多核苷酸的最5’核苷酸在本文中可被稱為多核苷酸的“5’末端核苷酸”。多核苷酸的最3’核苷酸在本文中可被稱為多核苷酸的“3’末端核苷酸”。

在含有5’末端核苷酸和3’末端核苷酸的多核苷酸的上下文中如本文所用的術(shù)語“下游”指的是比多核苷酸中的參考位置更接近3’末端核苷酸的該多核苷酸中的位置。例如，在具有序列5’ATAAGC 3’的引物中，“G”在“T”和全部“A”的下游。

在含有5’末端核苷酸和3’末端核苷酸的多核苷酸的上下文中，如本文所用的術(shù)語“上游”指的是比多核苷酸中的參考位置更接近5’末端核苷酸的該多核苷酸中的位置。例如，在具有序列5’ATAAGC 3’的引物中，“T”在“G”、“C”以及最接近“G”的兩個(gè)“A”的上游。

如本文所用的，“核酸”包括DNA和RNA兩者，包括含有非標(biāo)準(zhǔn)核苷酸的DNA和RNA?！昂怂帷焙兄辽僖粋€(gè)多核苷酸(“核酸鏈”)。核酸可以是單鏈或雙鏈的。

如本文所用的，“多聯(lián)體”指的是在其內(nèi)含有特定核酸的兩個(gè)或更多個(gè)拷貝的核酸分子，其中這些拷貝串聯(lián)連接。在該多聯(lián)體內(nèi)，特定核酸的拷貝可彼此直接連接，或者它們可間接地連接(例如，在特定核酸的拷貝之間可具有核苷酸)。在一個(gè)實(shí)例中，該特定核酸可以是雙鏈核酸模板的核酸，以使得多聯(lián)體可含有該雙鏈核酸模板的兩個(gè)或更多個(gè)拷貝。在另一個(gè)實(shí)例中，該特定核酸可以是多核苷酸模板的核酸，以使得多聯(lián)體可含有該多核苷酸模板的兩個(gè)或更多個(gè)拷貝。

如本文所用的，“靶”核酸或分子指的是感興趣的核酸。靶核酸/分子可以是任何類型，包括單鏈或雙鏈DNA或RNA(例如，mRNA)。

如本文所用的，“互補(bǔ)”序列指的是這樣的兩個(gè)核苷酸序列，這兩個(gè)核苷酸序列在彼此反平行對齊時(shí)，含有按照標(biāo)準(zhǔn)堿基配對原則(例如，A-T、G-C或A-U)可彼此配對的多個(gè)單獨(dú)的核苷酸堿基，使得含有該序列的分子可彼此特異性地退火。對于被認(rèn)為“互補(bǔ)”的序列，不必要兩個(gè)序列中的每一個(gè)核苷酸堿基均能夠彼此配對。例如，如果當(dāng)兩個(gè)序列對于互補(bǔ)而最佳對齊時(shí)，該兩個(gè)序列中至少30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的核苷酸堿基可彼此配對，則該序列可被認(rèn)為是互補(bǔ)的。此外，當(dāng)兩個(gè)序列的總長度彼此明顯不同時(shí)，該序列仍可被認(rèn)為“互補(bǔ)”。例如，如果當(dāng)15個(gè)核苷酸的引物與含有數(shù)百個(gè)核苷酸的更長的多核苷酸的特定區(qū)域反向平行對齊時(shí)，該引物的多個(gè)單獨(dú)的核苷酸堿基可與更長的多核苷酸中的核苷酸堿基配對，則該15個(gè)核苷酸的引物可被認(rèn)為與該含有數(shù)百個(gè)核苷酸的更長的多核苷酸“互補(bǔ)”。此外，“互補(bǔ)”序列可含有一種或多種核苷酸類似物或核堿基類似物。如本文所用的，“完全互補(bǔ)的”或“完全互補(bǔ)”等是指彼此100％互補(bǔ)的兩個(gè)序列(即當(dāng)所述序列為了最大互補(bǔ)而配對時(shí)，所述序列的核苷酸之間沒有錯(cuò)配)。

如本文所用的，當(dāng)應(yīng)用于蛋白質(zhì)、核酸或其他生物分子時(shí)，術(shù)語“分離的”指的是已從其天然存在的環(huán)境的組分中純化或分離的分子(例如，從其天然產(chǎn)生的細(xì)胞中純化的蛋白質(zhì))。“分離的”分子可與其他分子相接觸(例如，作為反應(yīng)混合物的一部分)。如本文所用的，“分離的”分子還包括具有天然存在的氨基酸或核苷酸序列的重組產(chǎn)生的蛋白質(zhì)或核酸?！胺蛛x的”核酸包括在細(xì)胞中包含的編碼多肽的核酸分子，該細(xì)胞通常在例如該核酸分子在與天然細(xì)胞不同的染色體位置時(shí)表達(dá)多肽。在一些實(shí)施方式中，“分離的”多肽被純化為至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或100％的同質(zhì)性，如通過多肽的SDS-PAGE以及隨后的考馬斯藍(lán)、銀或其他蛋白質(zhì)染色方法所顯示的。

除非上下文中另外明確指出，如本文所用的，描述為含有模板或其他核酸的“序列”的核酸分子也可被認(rèn)為含有該模板或其他核酸本身(例如，被描述為含有模板的序列的分子也可以被描述為含有該模板)。

如本文所用的，當(dāng)?shù)谝欢嗪塑账岜幻枋鰹榕c第二多核苷酸“退火”等時(shí)，第一多核苷酸全部或其任何部分可與第二多核苷酸退火，反之亦然。

如本文所用的，提及在某一條件下或采用其他對象等“處理”給定對象指的是直接或間接地將給定對象暴露于所提及的條件或其他對象。因此，盡管“處理”步驟可包括不同的相關(guān)操作(例如，將酶加入到容器中，振動(dòng)容器等)，但并非每一個(gè)“處理”步驟都需要不同的相關(guān)操作。例如，包括一種或多種試劑的反應(yīng)可設(shè)置在容器中，并且一旦反應(yīng)已經(jīng)開始，則多個(gè)事件或步驟可以在容器中發(fā)生而不進(jìn)一步人為或機(jī)械干預(yù)容器中的內(nèi)容物。在容器中進(jìn)行的這些多個(gè)事件或步驟中的一個(gè)或多個(gè)可以被描述為“處理”容器中的對象，即使在反應(yīng)開始后不單獨(dú)地干預(yù)容器中的內(nèi)容物。

可參考圖1對本文提供的方法和組合物的實(shí)施方式進(jìn)行描述?？商峁┮患?jí)核酸101(圖1A)。一級(jí)核酸101可含有核酸模板102的序列。核酸模板102可以是含有第一鏈103和第二鏈104的雙鏈核酸。在圖1中，雙鏈核酸模板的第一鏈103具有5’至3’方向的示例性核苷酸序列AACGGTTGCTC(SEQ ID NO:1)。第一鏈103還包含5’末端核苷酸(最5’的A)和3’末端核苷酸(最3’的C)。第二鏈104具有5’至3’方向的示例性核苷酸序列GAGCAACCGTT(SEQ ID NO:2)。第二鏈104還包含5’末端核苷酸(最5’的G)和3’末端核苷酸(最3’的T)。

還可提供第一引物105和第二引物106(圖1B)。在圖1中，第一引物105具有5’至3’方向的示例性核苷酸序列ATGGGAGC(SEQ ID NO:3)。第一引物還包含5’末端核苷酸(最5’的A)和3’末端核苷酸(最3’的C)。第二引物106具有5’至3’方向的示例性核苷酸序列CCATAACG(SEQ ID NO:4)。第二引物還包含5’末端核苷酸(最5’的C)和3’末端核苷酸(最3’的G)。雖然圖1的核酸模板102是11個(gè)核苷酸的長度并具有示例性核苷酸序列，但這些是示例性的，并不被認(rèn)為是限制。

第一引物105可包含兩個(gè)區(qū)域：i)尾區(qū)以及ii)模板結(jié)合區(qū)(“模板”區(qū))。第一引物105的尾區(qū)可包含三個(gè)部分：a)引物的5’末端核苷酸，b)最內(nèi)核苷酸，其中該最內(nèi)核苷酸在5’末端核苷酸的下游，以及c)5’末端核苷酸與最內(nèi)核苷酸之間的中間部分，該中間部分包含一個(gè)或多個(gè)核苷酸。在圖1中，第一引物105的尾區(qū)具有5’至3’方向的示例性核苷酸序列：ATGG，在該序列中，引物的5’末端核苷酸為A，中間部分為中間的TG，且最內(nèi)核苷酸為最3’的G。第一引物105的模板結(jié)合區(qū)可包含三個(gè)部分：a)引物的3’末端核苷酸，b)最內(nèi)核苷酸，其中該最內(nèi)核苷酸在3’末端核苷酸的上游，以及c)3’末端核苷酸與最內(nèi)核苷酸之間的中間部分，該中間部分包含一個(gè)或多個(gè)核苷酸。在圖1中，第一引物105的模板結(jié)合區(qū)具有5’至3’方向的示例性核苷酸序列：GAGC，在該序列中，引物的3’末端核苷酸為C，中間部分為中間的AG，且最內(nèi)核苷酸為最5’的G。

第二引物106可包含兩個(gè)區(qū)域：i)尾區(qū)以及ii)模板結(jié)合區(qū)。第一引物106的尾區(qū)可包含三個(gè)部分：a)引物的5’末端核苷酸，b)最內(nèi)核苷酸，其中該最內(nèi)核苷酸在5’末端核苷酸的下游，以及c)5’末端核苷酸與最內(nèi)核苷酸之間的中間部分，該中間部分包含一個(gè)或多個(gè)核苷酸。在圖1中，第二引物106的尾區(qū)具有5’至3’方向的示例性核苷酸序列：CCAT，在該序列中，引物的5’末端核苷酸為最5’的C，中間部分為中間的CA，且最內(nèi)核苷酸為T。第二引物106的模板結(jié)合區(qū)可包含三個(gè)部分：a)引物的3’末端核苷酸，b)最內(nèi)核苷酸，其中該最內(nèi)核苷酸在3’末端核苷酸的上游，以及c)3’末端核苷酸與最內(nèi)核苷酸之間的中間部分，該中間部分包含一個(gè)或多個(gè)核苷酸。在圖1中，第二引物106的模板結(jié)合區(qū)具有5’至3’方向的示例性核苷酸序列：AACG，在該序列中，引物的3’末端核苷酸為G，中間部分為中間的AC，且最內(nèi)核苷酸為最5’的A。

在一些實(shí)施方式中，如果將引物的序列對齊使得第二引物的5’末端核苷酸與第一引物的尾區(qū)的最內(nèi)核苷酸對齊并且第一引物的5’末端核苷酸與第二引物的尾區(qū)的最內(nèi)核苷酸對齊，則第二引物的尾區(qū)可含有與第一引物的尾區(qū)的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。例如，在圖1中，第二引物106的尾區(qū)具有5’至3’方向的核苷酸序列CCAT，并且第一引物105的尾區(qū)具有5’至3’方向的核苷酸序列ATGG。當(dāng)?shù)诙锏?’末端核苷酸(C)與第一引物的尾區(qū)的最內(nèi)核苷酸(G)對齊并且第一引物的5’末端核苷酸(A)與第二引物的尾區(qū)的最內(nèi)核苷酸(T)對齊107時(shí)，這些序列是互補(bǔ)的(圖1B)。

應(yīng)注意，雖然第二引物的尾區(qū)可含有與第一引物的尾區(qū)的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列，但通常由第一引物與第二引物退火而形成的產(chǎn)物對于本文提供的方法或組合物不是期望的或有用的。因此，在一些實(shí)施方式中，可以采取步驟來最小化第一引物-第二引物退火產(chǎn)物的形成。這樣的步驟可包括，例如，在開始本文提供的方法之前不在引物可相互作用持續(xù)延長的時(shí)間段的條件下對第一引物和第二引物進(jìn)行預(yù)溫育。

可在使得第一引物的第一拷貝105a的模板結(jié)合區(qū)與核酸模板的第一鏈103退火(圖1C)并且形成第一引物的第一拷貝的延伸產(chǎn)物111(圖1D)的條件下，用第一引物的第一拷貝105a和聚合酶108處理一級(jí)核酸101。聚合酶108可催化第一引物的第一拷貝的延伸產(chǎn)物111的形成。該聚合酶可具有鏈置換活性。在合成第一引物的第一拷貝的延伸產(chǎn)物111的過程中，聚合酶可從核酸模板的第一鏈103置換核酸模板的第二鏈104。通常，由第一引物的第一拷貝105a的3’端生成延伸產(chǎn)物。在生成第一引物的第一拷貝的延伸產(chǎn)物111的過程中，第一引物的第一拷貝105a可與合成的延伸產(chǎn)物共價(jià)連接，使得第一引物的第一拷貝變?yōu)楸疚拿枋鰹椤暗谝灰锏牡谝豢截惖难由飚a(chǎn)物”的分子的一部分。第一引物的第一拷貝的延伸產(chǎn)物111與核酸模板的第一鏈103互補(bǔ)。在一些實(shí)施方式中，當(dāng)?shù)谝灰锏牡谝豢截?05a與核酸模板的第一鏈103退火時(shí)，模板結(jié)合區(qū)而非第一引物的第一拷貝105a的尾區(qū)與核酸模板的第一鏈退火。

在一些實(shí)施方式中，使得第一引物的第一拷貝105a的模板結(jié)合區(qū)與核酸模板的第一鏈103退火并形成第一引物的第一拷貝的延伸產(chǎn)物111的條件可包括足以支持基于聚合酶的核酸合成的任何條件。針對基于聚合酶的核酸合成的示例性條件是本領(lǐng)域已知的并提供于例如，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,M.R.Green and J.Sambrook,Cold Spring Harbor Laboratory Press(2012)中，該文獻(xiàn)通過引用全文并入本文。在實(shí)施方式中，第一引物或第二引物的模板結(jié)合區(qū)可支持由核酸聚合酶進(jìn)行的引物的模板依賴性延伸，這可從引物的3’端延伸引物。

可在使得第二引物106的模板結(jié)合區(qū)與第一引物的第一拷貝的延伸產(chǎn)物111退火(圖1E)并形成第二引物的延伸產(chǎn)物112(圖1F)的條件下，用第二引物106和聚合酶108處理第一引物的第一拷貝的延伸產(chǎn)物111。聚合酶108可催化第二引物106的延伸產(chǎn)物的形成。該聚合酶可具有鏈置換活性。聚合酶可以是與用于生成第一引物的第一拷貝的延伸產(chǎn)物111的聚合酶相同類型的聚合酶，或者它可以是不同類型的聚合酶。在合成第二引物的延伸產(chǎn)物112的過程中，聚合酶可從第一引物的第一拷貝的延伸產(chǎn)物111置換核酸模板的第一鏈103。通常，由第二引物106的3’端生成延伸產(chǎn)物。在生成第二引物的延伸產(chǎn)物112的過程中，第二引物106可與合成的延伸產(chǎn)物共價(jià)連接，使得第二引物變?yōu)楸疚拿枋鰹椤暗诙锏难由飚a(chǎn)物”的分子的一部分。第二引物的延伸產(chǎn)物112與第一引物的第一拷貝的延伸產(chǎn)物111互補(bǔ)。在一些實(shí)施方式中，當(dāng)?shù)诙?06與第一引物的第一拷貝的延伸產(chǎn)物111退火時(shí)，模板結(jié)合區(qū)而非第二引物106的尾區(qū)與第一引物的第一拷貝的延伸產(chǎn)物111退火。第二引物的延伸產(chǎn)物112含有5’末端核苷酸、3’末端核苷酸以及3’末端區(qū)。3’末端區(qū)的最后的核苷酸(T)是第二引物的延伸產(chǎn)物的3’末端核苷酸(T)，并且該3’末端區(qū)含有與在5’至3’方向讀取的第二引物的尾區(qū)的核苷酸序列(CCAT)相同的核苷酸序列。

在一些實(shí)施方式中，使得第二引物106的模板結(jié)合區(qū)與第一引物的第一拷貝的延伸產(chǎn)物111退火并形成第二引物的延伸產(chǎn)物112的條件可包括足以支持基于聚合酶的核酸合成的任何條件，包括本文其他地方討論的任何條件。該條件可與用于生成第一引物的第一拷貝的延伸產(chǎn)物111的條件相同，或者它們可以是不同的條件。

可在使得第一引物的第二拷貝105b的模板結(jié)合區(qū)與第二引物的延伸產(chǎn)物112退火(圖1G)并形成第一引物的第二拷貝的延伸產(chǎn)物113(圖1H)的條件下，用第一引物的第二拷貝105b和聚合酶108處理第二引物的延伸產(chǎn)物112。聚合酶108可催化第一引物的第二拷貝的延伸產(chǎn)物113的形成。該聚合酶可具有鏈置換活性。聚合酶可以是與用于生成第一引物的第一拷貝的延伸產(chǎn)物111或第二引物的延伸產(chǎn)物112的聚合酶相同類型的聚合酶，或者它可以是不同類型的聚合酶。在合成第一引物的第二拷貝的延伸產(chǎn)物113的過程中，聚合酶可從第二引物的延伸產(chǎn)物112置換第一引物的第一拷貝的延伸產(chǎn)物111。通常，由第一引物的第二拷貝105b的3’端生成延伸產(chǎn)物。在生成第一引物的第二拷貝的延伸產(chǎn)物113的過程中，第一引物的第二拷貝105b可與合成的延伸產(chǎn)物共價(jià)連接，使得第一引物的第二拷貝變?yōu)楸疚拿枋鰹椤暗谝灰锏牡诙截惖难由飚a(chǎn)物”的分子的一部分。第一引物的第二拷貝的延伸產(chǎn)物113與第二引物的延伸產(chǎn)物112互補(bǔ)。在一些實(shí)施方式中，當(dāng)?shù)谝灰锏牡诙截?05b與第二引物的延伸產(chǎn)物112退火時(shí)，第一引物的第二拷貝105b的模板結(jié)合區(qū)和尾區(qū)均與第二引物的延伸產(chǎn)物112退火。第一引物的第二拷貝的延伸產(chǎn)物113含有5’末端核苷酸、3’末端核苷酸以及3’末端區(qū)。3’末端區(qū)的最后的核苷酸(G)是第二引物的延伸產(chǎn)物的3’末端核苷酸(G)，并且該3’末端區(qū)含有與在5’至3’方向讀取的第一引物的尾區(qū)的核苷酸序列(ATGG)相同的核苷酸序列。

在一些實(shí)施方式中，使得第一引物的第二拷貝105b的模板結(jié)合區(qū)與第二引物的延伸產(chǎn)物112退火并形成第一引物的第二拷貝的延伸產(chǎn)物113的條件可包括足以支持基于聚合酶的核酸合成的任何條件，包括本文其他地方討論的任何條件。該條件可與用于生成第一引物的第一拷貝的延伸產(chǎn)物111或第二引物的延伸產(chǎn)物112的條件相同，或者它們可以是不同的條件。

第一引物的第二拷貝的延伸產(chǎn)物113的生成可導(dǎo)致生成包含第一引物的第二拷貝的延伸產(chǎn)物113和第二引物的延伸產(chǎn)物112的分子，該分子在本文中可被稱為“二級(jí)核酸”115。在二級(jí)核酸115內(nèi)，第一引物的第二拷貝的延伸產(chǎn)物113可與第二引物的延伸產(chǎn)物112退火。此外，二級(jí)核酸115含有核酸模板102的序列。該二級(jí)核酸115具有比單獨(dú)核酸模板102長的核苷酸長度，因?yàn)槌怂崮０?02的序列之外，它還可包含第一引物和第二引物的尾區(qū)的序列及其互補(bǔ)序列。具體而言，二級(jí)核酸115可具有第一端區(qū)域116和第二端區(qū)域117。第一端區(qū)域116可包含第二引物的延伸產(chǎn)物112的3’末端區(qū)及其互補(bǔ)序列。第二端區(qū)域117可包含第一引物的第二拷貝的延伸產(chǎn)物113的3’末端區(qū)及其互補(bǔ)序列。

可形成或提供二級(jí)核酸115的第一拷貝115a和第二拷貝115b(圖1I)。二級(jí)核酸115的第一拷貝115a和第二拷貝115b可采用通過其可生成具有二級(jí)核酸115的通用結(jié)構(gòu)的核酸的任何方法生成，包括本文其他地方討論的任何方法。例如，如上文所述的用于由一級(jí)核酸101生成二級(jí)核酸115的全部過程可重復(fù)兩次，以便生成該二級(jí)核酸的第一拷貝115a和第二拷貝115b。在另一個(gè)實(shí)例中，二級(jí)核酸的第一拷貝115a和第二拷貝115b可由第一引物的第一拷貝的延伸產(chǎn)物111的單一拷貝生成。在這一實(shí)例中，第二引物的延伸產(chǎn)物的兩個(gè)拷貝112a、112b可由第一引物的第一拷貝的延伸產(chǎn)物111的單一拷貝生成，這在從第一引物的第一拷貝的延伸產(chǎn)物111的單一拷貝置換第二引物的延伸產(chǎn)物的第一拷貝112a時(shí)，可能發(fā)生，從而允許由第一引物的第一拷貝的延伸產(chǎn)物111的單一拷貝生成第二引物的延伸產(chǎn)物的第二拷貝112b。然后，例如，第一引物的第二拷貝的延伸產(chǎn)物113a、113b可分別由第二引物的延伸產(chǎn)物的各個(gè)拷貝112a、112b生成。也可進(jìn)行用于生成二級(jí)核酸的第一拷貝115a和第二拷貝115b的另外的程序并將該程序與本文提供的方法一起使用。

可在使得二級(jí)核酸的第一拷貝的第一引物的第二拷貝的延伸產(chǎn)物113a的3’末端區(qū)與二級(jí)核酸的第二拷貝的第二引物的延伸產(chǎn)物112b的3’末端區(qū)退火的條件下，處理二級(jí)核酸的第一拷貝115a和第二拷貝115b，以產(chǎn)生包含這些鏈的交換結(jié)構(gòu)118(圖1J)(為簡單起見，未示出鏈113b和112a)?？稍谑沟眯纬蓛蓚€(gè)組分鏈112b、113a的延伸產(chǎn)物(該延伸產(chǎn)物在本文中可分別稱為“第一多聯(lián)體鏈”121和“第二多聯(lián)體鏈”122)的條件下，用聚合酶進(jìn)一步處理交換結(jié)構(gòu)118。第一多聯(lián)體鏈121和第二多聯(lián)體鏈122可退火在一起并可共同被稱為多聯(lián)體120(圖1K)。多聯(lián)體120可含有核酸模板102的兩個(gè)或更多個(gè)拷貝。在多聯(lián)體120內(nèi)，核酸模板102的兩個(gè)或更多個(gè)拷貝中的一些或全部可通過第一引物105和第二引物106的尾區(qū)的序列彼此分隔開，其中尾區(qū)的序列彼此退火。例如，在圖1K的多聯(lián)體120中，雙鏈核酸模板的第一鏈的第一拷貝通過5’-3’順序的序列CCAT與雙鏈核酸模板的第一鏈的第二拷貝分隔開。CCAT還是第二引物106的尾區(qū)的5’-3’順序的序列。類似地，在圖1K的多聯(lián)體120中，雙鏈核酸模板的第二鏈的第一拷貝通過5’-3’順序的序列ATGG與雙鏈核酸模板的第二鏈的第二拷貝分隔開。ATGG還是第一引物105的尾區(qū)的5’-3’順序的序列。在多聯(lián)體內(nèi)，第一多聯(lián)體鏈的CCAT與第二多聯(lián)體鏈的ATGG退火。

在一些實(shí)施方式中，使得形成交換結(jié)構(gòu)118或交換結(jié)構(gòu)的鏈的延伸產(chǎn)物的條件可包括足以支持基于聚合酶的核酸合成的任何條件，包括本文其他地方討論的任何條件。該條件可與如用于生成第一引物的第一拷貝的延伸產(chǎn)物111、第二引物的延伸產(chǎn)物112或第一引物的第二拷貝的延伸產(chǎn)物111的條件相同，或者它們可以是不同的條件。

在一些實(shí)施方式中，本文提供的多聯(lián)體可根據(jù)圖1I-1K中的總體概述的過程進(jìn)一步增加長度。例如，可處理如圖1K所示的多聯(lián)體分子120中的兩個(gè)，使得它們形成與圖1J中所示的結(jié)構(gòu)相似的交換結(jié)構(gòu)(除了具有更長的鏈)，隨后生成包含核酸模板102的四個(gè)拷貝的更大的多聯(lián)體分子。在另一實(shí)例中，二級(jí)核酸115和多聯(lián)體120可形成交換結(jié)構(gòu)，隨后生成含有核酸模板102的三個(gè)拷貝的更大的多聯(lián)體分子。在一些實(shí)施方式中，在本文提供的方法中，可同時(shí)生成多個(gè)不同長度的多個(gè)不同的多聯(lián)體。

在實(shí)施方式中，可參考圖8對本文提供的方法和組合物進(jìn)行描述。多核苷酸模板800(圖8A)可以是用于擴(kuò)增的靶標(biāo)。多核苷酸模板800是單一核酸鏈。該多核苷酸模板鏈可作為游離的單鏈分子存在，或者它可作為雙鏈分子的一部分存在，在該雙鏈分子中該多核苷酸模板鏈與其互補(bǔ)鏈退火。多核苷酸模板800可以是DNA或RNA。

多核苷酸模板800可含有至少第一部分801(也用“(i)”表示)和第二部分802(也用“(ii)”表示)。第一部分801和第二部分802可各自含有任何數(shù)目的核苷酸，諸如各自少于1000、500、400、300、200、100、90、80、70、60、50、40、30、20、15、10、9、8、7、6、5、4或3個(gè)核苷酸或各自至少1000、500、400、300、200、100、90、80、70、60、50、40、30、20、15、10、9、8、7、6、5、4或3個(gè)核苷酸。通常，第一部分801和第二部分802可以各自含有10至30個(gè)核苷酸，盡管第一部分801和第二部分802也可以是如本文其他地方所述的其他長度。第一部分801和第二部分802可含有相同或不同數(shù)目的核苷酸。在一些實(shí)施方式中，除第一部分801和第二部分802之外，多核苷酸模板800還可含有其他部分。在其他實(shí)施方式中，第一部分801和第二部分802可構(gòu)成多核苷酸模板800的全部。多核苷酸模板800可具有本文其他地方所述的核酸模板的長度。多核苷酸模板800可以是一級(jí)核酸的一部分。多核苷酸模板可存在于從受試者獲得的樣品中。

多核苷酸模板800可在含有第一引物810和第二引物820的反應(yīng)混合物中進(jìn)行溫育(圖8B)。通常，該反應(yīng)混合物含有每個(gè)引物的多個(gè)拷貝，例如，每個(gè)引物的至少4、5、6、10、15、20、50、100、1000、10,000、100,000或1百萬個(gè)拷貝或更多個(gè)拷貝。第一引物810可具有第一區(qū)域811(也用“(i)”表示)和第二區(qū)域812(也用“(ii)”表示)。第一引物的第一區(qū)域811可具有5’端，并且第一引物的第二區(qū)域812可具有3’端。第一引物的第一區(qū)域可具有與第一引物的第二區(qū)域的核苷酸序列不同的核苷酸序列。第二引物820可具有第一區(qū)域821(也用“(i)”表示)和第二區(qū)域822(也用“(ii)”表示)。第二引物的第一區(qū)域821可具有5’端，并且第二引物的第二區(qū)域822可具有3’端。第二引物的第一區(qū)域可具有與第二引物的第二區(qū)域的核苷酸序列不同的核苷酸序列。

第一引物的第二區(qū)域812可具有與多核苷酸模板的第一部分801的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。在圖8中，多核苷酸模板的第一部分801的核苷酸序列由字母A表示，并且第一引物的第二區(qū)域812的核苷酸序列由字母A’表示，其中A和A’彼此互補(bǔ)。第二引物的第二區(qū)域822可具有與配偶體核苷酸序列830互補(bǔ)的核苷酸序列，其中配偶體核苷酸序列830與多核苷酸模板的第二部分802的核苷酸序列互補(bǔ)。在圖8中，多核苷酸模板的第二部分802的核苷酸序列由字母B表示，配偶體核苷酸序列830的核苷酸序列由字母B’表示，并且第二引物的第二區(qū)域822的核苷酸序列由字母B表示，其中B和B’彼此互補(bǔ)。換言之，如圖8所示，多核苷酸模板的第二部分802的核苷酸序列(B)可與第二引物的第二區(qū)域822的核苷酸序列(B)相同。通過采用本文提供的組合物和方法，可生成配偶體核苷酸序列830，例如，作為來自第一引物的3’端的延伸產(chǎn)物的一部分。在實(shí)施方式中，第一引物的第一區(qū)域811可與第二引物的第一區(qū)域821互補(bǔ)。在圖8中，第一引物的第一區(qū)域的核苷酸序列由字母C表示，并且第二引物的第一區(qū)域的核苷酸序列由字母C’表示，其中C和C’彼此互補(bǔ)。

在實(shí)施方式中，圖8的第一引物和第二引物可分別具有本文其他地方所述的第一引物和第二引物的任何特征(例如，如圖1中的)。而且，在實(shí)施方式中，圖8的第一引物的第一區(qū)域可具有本文其他地方所述的第一引物的尾區(qū)的任何特征。在實(shí)施方式中，圖8的第一引物的第二區(qū)域可具有本文其他地方所述的第一引物的模板結(jié)合區(qū)的任何特征。在實(shí)施方式中，圖8的第二引物的第一區(qū)域可具有本文其他地方所述的第二引物的尾區(qū)的任何特征。在實(shí)施方式中，圖8的第二引物的第二區(qū)域可具有本文其他地方所述的第二引物的模板結(jié)合區(qū)的任何特征。

在實(shí)施方式中，含有多核苷酸模板800和第一引物810的至少兩個(gè)拷貝以及第二引物820的至少兩個(gè)拷貝的反應(yīng)混合物可含有一個(gè)或多個(gè)可支持如本文其他地方所述的基于聚合酶的核酸合成的其他組分(例如，聚合酶、核苷酸、緩沖液、水等)。相似地，含有多核苷酸模板800和第一引物810的至少兩個(gè)拷貝以及第二引物820的至少兩個(gè)拷貝的反應(yīng)混合物可在本文其他地方所述的用于支持核酸模板的擴(kuò)增或多聯(lián)體的生成的任何反應(yīng)條件下進(jìn)行溫育。

在實(shí)施方式中，在如本文所述在反應(yīng)混合物中溫育多核苷酸模板800和第一引物810的至少兩個(gè)拷貝以及第二引物820的至少兩個(gè)拷貝時(shí)，可形成一個(gè)或多個(gè)多聯(lián)體鏈(圖8C)。在實(shí)施方式中，形成的多聯(lián)體鏈840可具有5’和3’端，并可具有含有5’至3’方向的通用結(jié)構(gòu)C’-T-C’-T-X-C’的序列，其中C’是第二引物的第一區(qū)域的核苷酸序列，T是多核苷酸模板的序列或其類似序列，并且X是任何數(shù)目和序列的核苷酸。因此，如由多聯(lián)體鏈的通用結(jié)構(gòu)所示的，多聯(lián)體鏈可含有多核苷酸模板的序列或其類似序列的至少兩個(gè)拷貝，其中多核苷酸模板的序列的拷貝由至少第二引物的第一區(qū)域的序列分隔開。在實(shí)施方式中，T可以是多核苷酸模板的類似序列。如本文所用的，多核苷酸模板的“類似序列”指的是含有作為多核苷酸模板的相似序列，而非含有多核苷酸模板中的核苷酸的一個(gè)或多個(gè)相似的核苷酸的序列。因此，例如，如果多核苷酸模板含有RNA序列，則其類似序列可以是相同序列的DNA形式(即，RNA序列中的尿嘧啶在類似的DNA序列中是胸腺嘧啶)，或反之亦然。繼續(xù)該實(shí)例，如果多核苷酸模板含有5’UACCUG 3’的RNA序列，則類似的序列是5’TACCTG 3’的DNA序列。

在實(shí)施方式中，在含有5’至3’方向的通用結(jié)構(gòu)C’-T-C’-T-X-C’的序列中，X是零個(gè)核苷酸(即，X的任一側(cè)上的T和C序列直接連接)。在其他實(shí)施方式中，X是少于10,000、5000、4000、3000、2000、1000、500、400、300、200、100、90、80、70、60、50、40、30、20、15、10、9、8、7、6、5、4或3個(gè)核苷酸。X中的核苷酸(如果有)可具有任何序列。在實(shí)施方式中，X含有具有5’至3’方向的通用結(jié)構(gòu)[(C’-T)_N]的序列，其中C’是第二引物的第一區(qū)域的核苷酸序列，T是多核苷酸模板的序列或其類似序列，并且N是小于1000、500、200、100、50或10的任何整數(shù)，諸如1至500、1至200、1至100、1至50或1至10之間的整數(shù)。例如，如果當(dāng)X含有5’至3’方向的通用結(jié)構(gòu)[(C’-T)_N]的序列時(shí)“N”是3，則在結(jié)構(gòu)C’-T-C’-T-X-C’的X位置上存在3個(gè)連續(xù)重復(fù)的(C’-T)，使得相應(yīng)的結(jié)構(gòu)可以寫成：C’-T-C’-T–C’-T–C’-T–C’-T-C’，其中，帶下劃線的C’和T是式[(C’-T)₃]的C’-T的重復(fù)。因此，例如，根據(jù)本文提供的組合物和方法，可形成含有多核苷酸模板的數(shù)十或數(shù)百個(gè)拷貝的多聯(lián)體鏈。在實(shí)施方式中，如圖8所提供的多聯(lián)體鏈可具有本文其他地方所述的多聯(lián)體鏈的任何特征。而且，在一些實(shí)施方式中，在生成多聯(lián)體鏈的過程中，在具有通用結(jié)構(gòu)C’-T-C’-T-X-C’的序列中的C’或T的一個(gè)或多個(gè)位置處，可在C’與T之間插入少量的核苷酸(例如，15個(gè)或更少、10個(gè)或更少、5個(gè)或更少、或3個(gè)或更少)。而且，在一些實(shí)施方式中，在生成多聯(lián)體鏈的過程中，在具有通用結(jié)構(gòu)C’-T-C’-T-X-C’的序列中的C’或T的一個(gè)或多個(gè)位置處，少量的核苷酸(例如，15個(gè)或更少、10個(gè)或更少、5個(gè)或更少、或3個(gè)或更少)可從C’或T序列中缺失。因此，根據(jù)本文提供的方法生成的多聯(lián)體鏈可包括具有如本文提供的通用結(jié)構(gòu)的鏈，但該鏈可在多聯(lián)體鏈的不同序列組分之間的一個(gè)或多個(gè)接合點(diǎn)(即，模板序列與引物序列/T和C’之間的接合)處添加或去除少量核苷酸。而且，在實(shí)施方式中，如本文提供的多聯(lián)體鏈可在含有多聯(lián)體(該多聯(lián)體含有具有通用結(jié)構(gòu)C’-T-C’-T-X-C’的序列)的分子的5’或3’端含有附加的核苷酸(例如，多達(dá)3、5、10、20、50、100、500、1000個(gè)或更多個(gè)附加的核苷酸)。在實(shí)施方式中，通用結(jié)構(gòu)C’-T-C’-T-X-C’的C’可具有本文其他地方所述的第二引物的尾區(qū)的任何特征(例如，長度、序列)。在實(shí)施方式中，通用結(jié)構(gòu)C’-T-C’-T-X-C’的T可具有本文其他地方所述的多核苷酸模板鏈的任何特征(例如，長度、序列)。

在實(shí)施方式中，根據(jù)本文提供的方法生成的多聯(lián)體鏈840可以是單鏈分子的一部分。在其他實(shí)施方式中，根據(jù)本文提供的方法生成的多聯(lián)體鏈840可以是雙鏈多聯(lián)體的一部分，在該雙鏈多聯(lián)體中多聯(lián)體鏈840與互補(bǔ)于多聯(lián)體鏈850的鏈退火。雖然圖8C描繪了含有具有5’至3’方向的通用結(jié)構(gòu)C’-T-C’-T-X-C’(鏈840)或C-T’-C-T’-X’-C(鏈850)的序列的多聯(lián)體鏈(其中X是0個(gè)核苷酸)，但根據(jù)圖8的示意圖生成的多聯(lián)體鏈可具有上文或本文其他地方所述的多聯(lián)體鏈的任何特征。而且，關(guān)于圖8C，序列A和B是模板鏈的一部分，并且因此不在通用結(jié)構(gòu)C’-T-C’-T-X-C’或C-T’-C-T’-X’-C中單獨(dú)用符號(hào)表示。

為了進(jìn)一步說明在圖8的實(shí)施方式中元件的關(guān)系，圖8提供了區(qū)塊(blocks)860、862、864、866和868。區(qū)塊860(具有反斜線樣填充)指示總多核苷酸模板序列(即元件800)或其互補(bǔ)序列的相對位置。區(qū)塊862(具有垂直線填充)指示所述多核苷酸模板的第一部分的序列(即元件801的序列的相對位置)或其互補(bǔ)序列的相對位置。因此，區(qū)塊862還表示第一引物的第二區(qū)域(即元件812)的序列，它與元件801互補(bǔ)。區(qū)塊864(具有垂直和水平線填充)指示所述多核苷酸模板的第二部分的序列(即元件802的序列的相對位置)或其互補(bǔ)序列的相對位置。因此，區(qū)塊864還表示配偶體核苷酸序列(即元件830)的序列，它與元件802互補(bǔ)。區(qū)塊864還指示第二引物的第二區(qū)域822的序列的相對位置，該序列可以是與所述多核苷酸模板的第二部分(元件802)的序列相同的序列，或相似的序列。換言之，在實(shí)施方式中，822的核苷酸序列可以與802的核苷酸序列相同或相似。例如，如圖8A中所示，在實(shí)施方式中，在多核苷酸模板中具有不是該多核苷酸模板的第一部分或第二部分的一部分的核苷酸。例如，在一個(gè)實(shí)例中，所述多核苷酸模板的第一部分可含有15個(gè)核苷酸，所述多核苷酸模板的第二部分可含有15個(gè)核苷酸，并且所述多核苷酸模板的第一部分與第二部分之間為25個(gè)核苷酸。通常，所述多核苷酸模板的第一部分和所述多核苷酸模板的第二部分各自為10至30個(gè)核苷酸的長度，盡管也考慮其他數(shù)目。例如，所述多核苷酸模板的第一部分和第二部分中的每一個(gè)可以為至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50或100個(gè)核苷酸，不多于5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50或100個(gè)核苷酸，或至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50個(gè)核苷酸且不多于6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50或100個(gè)核苷酸(上限高于下限)。在實(shí)施方式中，在所述多核苷酸模板中第一部分與第二部分之間可以具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、100、200或500個(gè)核苷酸，不多于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、100、200或500個(gè)核苷酸，或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、100或200個(gè)核苷酸且不多于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、100、200或500個(gè)核苷酸(上限高于下限)。區(qū)塊866(具有波浪線填充)指示第一引物的第一區(qū)域的序列(即元件811/區(qū)域“C”的序列的相對位置)或其互補(bǔ)序列的相對位置。因此，區(qū)塊866還表示第二引物的第一區(qū)域(元件821/區(qū)域“C”)的序列，它與元件811互補(bǔ)。區(qū)塊868(具有菱形填充)指示多聯(lián)體鏈(即元件840)的序列或其互補(bǔ)序列的相對位置。因此，區(qū)塊868還表示與所述多聯(lián)體鏈互補(bǔ)的鏈(元件850)的序列。如圖8C中所示，在多聯(lián)體鏈或其互補(bǔ)體(868)中存在所述多核苷酸模板序列或其互補(bǔ)體(860)的兩個(gè)拷貝，這兩個(gè)拷貝被第一引物的第一區(qū)域的核苷酸序列或其互補(bǔ)體(866)分隔開。此外，在多聯(lián)體鏈或其互補(bǔ)體(868)中，第一引物的第一區(qū)域的核苷酸序列或其互補(bǔ)體(866)在兩端側(cè)接所述多核苷酸模板序列或其互補(bǔ)體(860)。而且，在多聯(lián)體鏈或其互補(bǔ)體(868)中，具有第一引物的第二區(qū)域的序列或其互補(bǔ)體(862)的兩個(gè)拷貝和第二引物的第二區(qū)域的序列或其互補(bǔ)體(864)的兩個(gè)拷貝，它們均作為所述多核苷酸模板序列或其互補(bǔ)體的兩個(gè)拷貝的一部分而以兩個(gè)拷貝存在。區(qū)塊860、862、864、866和868不應(yīng)被解釋為規(guī)定圖8的元件之間的任何所需的特定大小關(guān)系；相反，在本文提供的某些實(shí)施方式中，區(qū)塊860、862、864、866和868僅用于幫助說明圖8的元件相對于彼此的一般位置。

根據(jù)本文提供的方法和組合物生成的多聯(lián)體可以是任何長度的核苷酸。在一些實(shí)施方式中，本文生成的多聯(lián)體分子可以是至少30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、15,000、20,000或25,000個(gè)核苷酸的長度。在一些實(shí)施方式中，本文生成的多聯(lián)體分子可以是不多于30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、15,000、20,000或25,000個(gè)核苷酸的長度。在一些實(shí)施方式中，本文生成的多聯(lián)體分子可具有選自最小值為30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、15,000或20,000個(gè)核苷酸的長度且最大值為40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、15,000、20,000或25,000個(gè)核苷酸的長度的范圍的長度。在一些實(shí)施方式中，根據(jù)本文提供的方法或組合物生成的至少一些多聯(lián)體具有上文所述的特征。在一些實(shí)施方式中，根據(jù)本文提供的方法或組合物生成的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的多聯(lián)體具有上文所述的特征。

根據(jù)本文提供的方法和組合物生成的多聯(lián)體可含有核酸模板或特定核酸的任何數(shù)目的拷貝。在一些實(shí)施方式中，本文生成的多聯(lián)體分子可含有核酸模板或特定核酸的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或100個(gè)拷貝。在一些實(shí)施方式中，本文生成的多聯(lián)體分子可含有核酸模板或特定核酸的不多于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或100個(gè)拷貝。在一些實(shí)施方式中，本文生成的多聯(lián)體分子可具有核酸模板或特定核酸的選自最小值為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80或90個(gè)拷貝且最大值為3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或100個(gè)拷貝的范圍的多個(gè)拷貝。在一些實(shí)施方式中，根據(jù)本文提供的方法或組合物生成的至少一些多聯(lián)體具有上文所述的特征。在一些實(shí)施方式中，根據(jù)本文提供的方法或組合物生成的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的多聯(lián)體具有上文所述的特征。

本文提供的方法的過程可以采用多種不同方式進(jìn)行監(jiān)測。在實(shí)施方式中，可測定反應(yīng)的核酸擴(kuò)增產(chǎn)物(例如，產(chǎn)物的量或其生成速率)。在其他實(shí)施方式中，可測定反應(yīng)的聚合酶沿核酸模板的活性(例如，聚合酶沿模板鏈的移動(dòng))。因此，在一些實(shí)施方式中，由于由方法產(chǎn)生的產(chǎn)物的積累(可能在該方法的步驟期間或完成后)或由于在方法的步驟期間發(fā)生的可檢測事件，使得可觀察到本文提供的方法的事件。

可測定擴(kuò)增的核酸的存在，例如，通過檢測反應(yīng)產(chǎn)物(擴(kuò)增的核酸或反應(yīng)副產(chǎn)物)或通過檢測與反應(yīng)進(jìn)展相關(guān)的探針。

在一些實(shí)施方式中，可通過用染料將產(chǎn)物染色來鑒定反應(yīng)產(chǎn)物。在一些實(shí)施方式中，染料在與核酸結(jié)合時(shí)比未與核酸結(jié)合時(shí)可具有更大的熒光。在實(shí)施方式中，染料可插入雙鏈核酸或它可與核酸的外部區(qū)域結(jié)合?？膳c本文提供的方法和組合物一起使用的核酸染料包括，例如，花青染料、染料、Gold、Green I、Green II、溴化乙錠、二氫乙錠、BlueView^TM、染料、染料、染料、染料、染料、染料、染料、染料、染料、碘化丙啶、碘化己啶(hexidium iodide)、亞甲藍(lán)、DAPI、吖啶橙、奎納克林(quinacrine)、吖啶二聚體(acridine dimer)、9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶、雙苯酰亞胺染料、Hoechst染料、7-氨基放線菌素D、放線菌素D、羥芪巴脒、派洛寧Y(pyronin Y)、Diamond^TM染料、GelRed^TM、GelGreen^TM和LDS 751。

在一些實(shí)施方式中，可通過分析擴(kuò)增反應(yīng)的濁度來鑒定反應(yīng)產(chǎn)物。例如，在實(shí)施方式中，增加的濁度可能與反應(yīng)產(chǎn)物和反應(yīng)副產(chǎn)物(例如，與鎂復(fù)合的焦磷酸)的形成相關(guān)。

在一些實(shí)施方式中，可通過分離根據(jù)本文方法通過凝膠電泳進(jìn)行的反應(yīng)并隨后用核酸染料將凝膠染色來鑒定反應(yīng)產(chǎn)物。該染料可以是本文公開的或本領(lǐng)域以其他方式已知的任何核酸染料。

在一些實(shí)施方式中，本領(lǐng)域已知的用于檢測核酸或用于生成核酸的任何方法或組合物可與本文提供的方法和組合物一起使用。

在一些實(shí)施方式中，含有與核酸模板鏈(或具有相似或相同的序列的鏈)的一部分互補(bǔ)的核苷酸序列和含有熒光報(bào)道分子(熒光團(tuán))和猝滅劑中的一種或兩種的核酸探針包含在本文提供的反應(yīng)中。

在實(shí)例中，核酸探針可含有在其5’或3’末端的熒光報(bào)道分子，以及在另一末端的猝滅劑。該探針可進(jìn)一步具有含有按順序的至少第一、第二和第三區(qū)域的核苷酸序列，在該核苷酸序列中第一和第三區(qū)域彼此互補(bǔ)，并且第二區(qū)域的至少一部分與核酸模板鏈(探針“檢測序列”)的一部分互補(bǔ)。在一些實(shí)施方式中，第二區(qū)域的長度可大于第一或第三區(qū)域的長度。在一些實(shí)施方式中，第二區(qū)域的長度可為10至40個(gè)核苷酸，并且第一和第三區(qū)域的長度可為4至10個(gè)核苷酸。該探針可具有至少兩種不同的構(gòu)型：(A)其中探針不與其檢測序列退火且第一和第三區(qū)域彼此退火的構(gòu)型；該構(gòu)型可以是“莖-環(huán)”結(jié)構(gòu)，在該結(jié)構(gòu)中第一和第三區(qū)域形成莖而第二區(qū)域形成環(huán)，以及(B)其中探針與其檢測序列退火的構(gòu)型；在該構(gòu)型中，第二區(qū)域或其一部分與其檢測序列退火，并且第一和第三區(qū)域彼此不退火。在探針的構(gòu)型(A)中，熒光報(bào)道分子和猝滅劑(它們位于探針的相對末端/第一和第三區(qū)域的外端)可彼此緊密靠近(均在通過第一和第三區(qū)域退火形成的莖結(jié)構(gòu)的末端處)，以使得熒光報(bào)道分子被猝滅。在探針的構(gòu)型(B)中，熒光報(bào)道分子和猝滅劑可不彼此緊密靠近，以使得熒光報(bào)道分子不被猝滅。探針可用于監(jiān)測所選反應(yīng)產(chǎn)物的積累，例如，在探針可形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)或與其檢測序列退火的反應(yīng)條件下。在一些實(shí)施方式中，如果存在檢測序列，則探針可與檢測序列退火，并且探針可響應(yīng)于熒光團(tuán)的激發(fā)光譜的波長的光而發(fā)熒光。相反，如果不存在檢測序列，則探針可形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，并且探針不響應(yīng)于熒光團(tuán)的激發(fā)光譜的波長的光而發(fā)熒光。

在另一實(shí)例中，核酸探針可在其5’或3’末端含有熒光報(bào)道分子，并且它可與含有猝滅劑的核酸引物退火。含有猝滅劑的核酸引物可在引物的位置上含有猝滅劑，使得當(dāng)核酸探針與引物退火時(shí)，熒光報(bào)道分子被猝滅。探針可用于監(jiān)測所選反應(yīng)產(chǎn)物的積累，例如，在探針可與引物退火或與其檢測序列(在反應(yīng)產(chǎn)物中)退火的反應(yīng)條件下。在一些實(shí)施方式中，如果存在檢測序列，則探針可與檢測序列退火，并且探針可響應(yīng)于熒光團(tuán)的激發(fā)光譜的波長的光而發(fā)熒光(由此指示反應(yīng)產(chǎn)物的存在)。相反，如果不存在檢測序列，則探針可保持與引物配對，并且探針不響應(yīng)于熒光團(tuán)的激發(fā)光譜的波長的光而發(fā)熒光。

在含有熒光報(bào)道分子和猝滅劑對的探針中，可選擇熒光報(bào)道分子和猝滅劑，以使得猝滅劑可有效地猝滅報(bào)道分子。在一些實(shí)施方式中，熒光報(bào)道分子與猝滅劑配對，其中熒光報(bào)道分子的發(fā)射最大值類似于猝滅劑的吸收最大值?？捎米鳠晒鈭?bào)道分子的熒光團(tuán)包括，例如，CAL Fluor Gold、CAL Fluor Orange、Quasar 570、CAL Fluor Red 590、CAL Fluor Red 610、CAL Fluor Red 610、CAL Fluor Red 635、Quasar 670(Biosearch Technologies)、VIC、NED(Life Technologies)、Cy3、Cy5、Cy5.5(GE Healthcare Life Sciences)、Oyster 556、Oyster 645(Integrated DNA Technologies)、LC red 610、LC red 610、LC red 640、LC red 670、LC red 705(Roche Applies Science)、德克薩斯紅(Texas red)、FAM、TET、HEX、JOE、TMR和ROX?？墒褂玫拟鐒┌?，例如，DDQ-I、DDQ-II(Eurogentec)、Eclipse(Epoch Biosciences)、Iowa Black FQ、Iowa Black RQ(Integrated DNA Technologies)、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3(Biosearch Technologies)、QSY-7、QSY-21(分子探針)和Dabcyl。

在一些實(shí)施方式中，本文提供的組合物或方法使用的探針可以是肽核酸(PNA)探針。肽核酸是合成的DNA類似物，在其中，例如，磷酸二酯骨架被N-(2-氨乙基)甘氨酸的重復(fù)單元代替，并且嘌呤和嘧啶堿基經(jīng)由甲基羰基連接體附接至所述合成DNA類似物上。任選地，在本文提供的反應(yīng)中可以提供PNA探針，它進(jìn)一步含有能與PNA-DNA雙鏈體結(jié)合并且當(dāng)與PNA-DNA雙鏈體結(jié)合時(shí)改變顏色的染料。這樣的染料的一個(gè)實(shí)例是3,3’-二乙基噻二碳菁碘化物[DiSc₂(5)]。DiSc₂(5)在與PNA-DNA雙鏈體結(jié)合時(shí)從藍(lán)色變?yōu)樽仙⑶彝ㄟ^圖像分析，例如在分光光度計(jì)中，或通過人類肉眼，可以觀察到這一顏色變化。例如，在Wilhelmsson等人,Nucleic Acids Research,2002,Vol.30,No.2e3中描述了使用PNA探針和DiSc₂(5)檢測PNA-DNA雙鏈體，該文獻(xiàn)通過引用并入于此用于所有目的。在使用PNA探針的實(shí)施方式中，通常將PNA探針設(shè)計(jì)為與有待于在相關(guān)擴(kuò)增反應(yīng)中擴(kuò)增的序列互補(bǔ)。因此，如果序列成功擴(kuò)增，則PNA探針將與含有擴(kuò)增的序列的DNA鏈退火，并且可以檢測到此退火(例如，通過觀察DiSc₂(5)與PNA-DNA雙鏈體結(jié)合時(shí)的顏色變化)。因此，本文提供的實(shí)施方式使用PNA探針可以幫助準(zhǔn)確地確定序列得到成功擴(kuò)增的反應(yīng)，并且?guī)椭鷮⑦@些反應(yīng)與具有核酸的非特異性擴(kuò)增的反應(yīng)區(qū)分開。為了隨本文提供的實(shí)施方式使用PNA探針，任選地，PNA探針可以在反應(yīng)開始時(shí)包含在本文提供的反應(yīng)混合物中。在其他實(shí)例中，可以在反應(yīng)開始之后或反應(yīng)結(jié)束之后的某一時(shí)間，向反應(yīng)混合物中添加PNA探針?？梢栽谔砑覲NA探針的同時(shí)或在不同時(shí)間向反應(yīng)混合物中添加染料。例如，在實(shí)施方式中，可以在反應(yīng)開始時(shí)向反應(yīng)混合物中添加染料，而可以在反應(yīng)開始之后的某一時(shí)間點(diǎn)添加PNA。在實(shí)施方式中，本文提供的試劑盒可進(jìn)一步含有與有待通過該試劑盒的試劑擴(kuò)增的核苷酸序列互補(bǔ)的PNA探針和能與PNA-DNA雙鏈體結(jié)合的染料。

在一些實(shí)施方式中，根據(jù)本文提供的方法進(jìn)行的反應(yīng)可在含有光源和光學(xué)傳感器的裝置中進(jìn)行監(jiān)測。在一些情況下，可將反應(yīng)定位于來自光源的光路上，并且可測量由樣品吸收(例如，在混濁的反應(yīng)的情況下)、由樣品散射(例如，在混濁的反應(yīng)的情況下)或由樣品發(fā)射(例如，在含有熒光分子的反應(yīng)的情況下)的光。在一些實(shí)施方式中，本文提供的方法可在如在2013年2月18日提交的美國專利申請系列號(hào)13/769,779中公開的設(shè)備或其中的模塊中進(jìn)行或監(jiān)測，該專利申請通過引用全文并入本文。

通過使用本文提供的方法，感興趣的核酸模板的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物可在擴(kuò)增反應(yīng)開始后例如30秒、1分鐘、3分鐘、5分鐘、10分鐘、15分鐘、20分鐘、30分鐘、45分鐘、60分鐘、90分鐘、120分鐘、180分鐘或240分鐘內(nèi)進(jìn)行鑒定。在其他實(shí)例中，當(dāng)生成模板的少至10、50、100、500、1000、5000、10,000、50,000、100,000、500,000或1,000,000個(gè)拷貝時(shí)，通過使用本文提供的方法可鑒定對于感興趣的核酸模板為陽性的擴(kuò)增反應(yīng)。在其他實(shí)例中，通過使用本文提供的方法，可鑒定樣品中感興趣的核酸模板的存在，該樣品在該方法開始時(shí)含有感興趣的模板的少至1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、40、50、100、200、500、1000、5000或10,000個(gè)拷貝。

在實(shí)施方式中，本文提供的方法可用于測定樣品中的感興趣的靶核酸。在某些實(shí)施方式中，可通過包括測定反應(yīng)中核酸擴(kuò)增的轉(zhuǎn)變時(shí)間的方法來確定樣品中感興趣的靶核酸的存在或量。轉(zhuǎn)變時(shí)間/轉(zhuǎn)變點(diǎn)是擴(kuò)增反應(yīng)被確定為對核酸模板為陽性的時(shí)間或點(diǎn)。轉(zhuǎn)變時(shí)間/轉(zhuǎn)變點(diǎn)可以通過一個(gè)或多個(gè)指標(biāo)來鑒定，例如，反應(yīng)開始后在反應(yīng)中已經(jīng)生成所選量的核酸的時(shí)間，當(dāng)反應(yīng)的擴(kuò)增速率由基線期變?yōu)橹笖?shù)期時(shí)的時(shí)間，或者當(dāng)反應(yīng)的擴(kuò)增速率由指數(shù)期變?yōu)槠脚_(tái)期(plateau phase)時(shí)的時(shí)間等。在實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)變時(shí)間/轉(zhuǎn)變點(diǎn)可以基于反應(yīng)的熒光或吸光度的變化或基于反應(yīng)的熒光或吸光度達(dá)到所選值來鑒定。在某些實(shí)施方式中，樣品中感興趣的靶核酸的存在或量可通過包括比較反應(yīng)的核酸擴(kuò)增的轉(zhuǎn)變時(shí)間來

確定，該反應(yīng)相對于以下反應(yīng)中的一者或兩者具有未知量的感興趣的靶核酸：i)已知缺乏感興趣的靶核酸的反應(yīng)(即，陰性對照)；或ii)已知含有感興趣的靶核酸的反應(yīng)(即，陽性對照)。在實(shí)施方式中，可測量含有感興趣的靶核酸的反應(yīng)和不含有靶核酸的反應(yīng)兩者的所選的轉(zhuǎn)變時(shí)間。在實(shí)施方式中，樣品中感興趣的靶核酸的存在可基于這樣的方法來確定，該方法包括評(píng)價(jià)包含可含有或可不含有感興趣的靶核酸的樣品的反應(yīng)的轉(zhuǎn)變點(diǎn)與具有感興趣狀態(tài)(例如，已知其含有或不含有感興趣的靶核酸)的已知靶核酸的一個(gè)或多個(gè)反應(yīng)的轉(zhuǎn)變時(shí)間之間的時(shí)間差異。例如，如果根據(jù)本文提供的方法的反應(yīng)的轉(zhuǎn)變時(shí)間比已知不含有感興趣的靶核酸的相應(yīng)反應(yīng)早至少3、5、10、15、20、30、40、50、60、90、120或180分鐘，則樣品可被鑒定為含有感興趣的靶核酸。在另一實(shí)例中，如果根據(jù)本文提供的方法的反應(yīng)的轉(zhuǎn)變時(shí)間比已知不含有感興趣的靶核酸的相應(yīng)反應(yīng)晚不多于3、5、10、15、20、30、40、50、60、90、120或180分鐘，則樣品可被鑒定為含有感興趣的靶核酸。

本文提供的方法可進(jìn)行任意時(shí)間長度。通常，該方法將進(jìn)行足以監(jiān)測例如核酸復(fù)制速率、聚合酶活性的出現(xiàn)或擴(kuò)增產(chǎn)物的積累的時(shí)間長度。在一些實(shí)施方式中，本文提供的方法可進(jìn)行總計(jì)少于10秒、30秒、1分鐘、5分鐘、10分鐘、20分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時(shí)、2小時(shí)、3小時(shí)、4小時(shí)、6小時(shí)、8小時(shí)、12小時(shí)、16小時(shí)或24小時(shí)，到該時(shí)間時(shí)測量核酸復(fù)制速率、聚合酶活性的出現(xiàn)或擴(kuò)增產(chǎn)物的積累。

本文提供的方法可以以各種方式終止。在一個(gè)實(shí)施方式中，方法的步驟可在濃度降低時(shí)或該方法的一個(gè)或多個(gè)步驟中包含的一種或多種試劑(例如，dNTP)完全消耗時(shí)結(jié)束。在另一個(gè)實(shí)施方式中，方法的步驟可在該方法的一個(gè)或多個(gè)步驟中包含的一種或多種酶(例如，聚合酶)失活時(shí)結(jié)束。酶可通過各種方式失活。例如，由于影響酶結(jié)構(gòu)的隨機(jī)事件，導(dǎo)致酶可隨時(shí)間逐漸失去酶活性，或者酶可暴露于加速酶活性失活的條件(例如，高熱量、極端pH等)。

在一些實(shí)施方式中，一級(jí)核酸可以是單鏈或雙鏈的。單鏈一級(jí)核酸在本文也可被稱為“一級(jí)多核苷酸”。一級(jí)核酸可以是線形或環(huán)形的。一級(jí)核酸可以包含核酸模板。在一些實(shí)施方式中，整個(gè)一級(jí)核酸可以是核酸模板。在其他實(shí)施方式中，一級(jí)核酸可以含有不是核酸模板的一部分的一個(gè)或多個(gè)核苷酸(例如，一級(jí)核酸可具有比包含在一級(jí)核酸內(nèi)的核酸模板更長的長度)。在一些實(shí)施方式中，一級(jí)核酸可含有核酸模板的兩個(gè)或更多個(gè)拷貝。一級(jí)核酸可含有DNA、RNA或其混合物。雙鏈線形一級(jí)核酸可具有平端或粘端(“粘端”指的是具有突出鏈的末端，該突出鏈具有一個(gè)或多個(gè)未配對的核苷酸)。

一級(jí)核酸可以是任何長度的核苷酸。例如，一級(jí)核酸可以是至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、500、750、1000或1500個(gè)核苷酸的長度。在另一個(gè)實(shí)例中，一級(jí)核酸可以是2至100,000、5至100,000、10至100,000、15至100,000、20至100,000、25至100,000、30至100,000、50至100,000、70至100,000、100至100,000、200至100,000、2至10,000、5至10,000、10至10,000、15至10,000、20至10,000、25至10,000、30至10,000、50至10,000、70至10,000、100至10,000、200至10,000、2至5,000、5至5,000、10至5,000、15至5,000、20至5,000、25至5,000、30至5,000、50至5,000、70至5,000、100至5,000、200至5,000、2至3,000、5至3,000、10至3,000、15至3,000、20至3,000、25至3,000、30至3,000、50至3,000、70至3,000、100至3,000、200至3,000、2至1,000、5至1,000、10至1,000、15至1,000、20至1,000、25至1,000、30至1,000、50至1,000、70至1,000、100至1,000、200至1,000、2至500、5至500、10至500、15至500、20至500、25至500、30至500、50至500、70至500、100至500或200至500個(gè)核苷酸堿基的長度。

在一些實(shí)施方式中，核酸模板可以是單鏈或雙鏈的。核酸模板的單鏈在本文可被稱為“多核苷酸模板”。如本文提及的“多核苷酸模板”并不排除與其互補(bǔ)序列結(jié)合。換言之，“多核苷酸模板”可以是例如整個(gè)單鏈核酸模板，或者它可以是雙鏈核酸模板的一條鏈。核酸模板可以包含在一級(jí)核酸分子中。在一些實(shí)施方式中，核酸模板可構(gòu)成整個(gè)一級(jí)核酸分子。在其他實(shí)施方式中，核酸模板可包含在含有不是核酸模板的一部分的一個(gè)或多個(gè)核苷酸的一級(jí)核酸中(例如，核酸模板可具有比含有核酸模板的一級(jí)核酸更短的長度)。

核酸模板可以是任何長度的核苷酸。例如，核酸模板可以是至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、500、750、1000或1500個(gè)核苷酸的長度。在另一個(gè)實(shí)例中，核酸模板可以是2至100,000、5至100,000、10至100,000、15至100,000、20至100,000、25至100,000、30至100,000、50至100,000、70至100,000、100至100,000、200至100,000、2至10,000、5至10,000、10至10,000、15至10,000、20至10,000、25至10,000、30至10,000、50至10,000、70至10,000、100至10,000、200至10,000、2至5,000、5至5,000、10至5,000、15至5,000、20至5,000、25至5,000、30至5,000、50至5,000、70至5,000、100至5,000、200至5,000、2至3,000、5至3,000、10至3,000、15至3,000、20至3,000、25至3,000、30至3,000、50至3,000、70至3,000、100至3,000、200至3,000、2至1,000、5至1,000、10至1,000、15至1,000、20至1,000、25至1,000、30至1,000、50至1,000、70至1,000、100至1,000、200至1,000、2至500、5至500、10至500、15至500、20至500、25至500、30至500、50至500、70至500、100至500或200至500個(gè)核苷酸堿基的長度。

如本文所用的“引物”可以指這樣一種多核苷酸，該多核苷酸i)能夠與原始核酸鏈雜交，并且ii)充當(dāng)合成新的核酸鏈的起始點(diǎn)，其中新的核酸鏈?zhǔn)且锏难由飚a(chǎn)物并與原始鏈互補(bǔ)。引物可在其3’末端具有游離的–OH基團(tuán)，其可充當(dāng)延伸產(chǎn)物合成的起點(diǎn)。

引物可含有標(biāo)準(zhǔn)核苷酸[例如，標(biāo)準(zhǔn)DNA脫氧核糖核苷酸(脫氧腺苷單磷酸、脫氧鳥苷單磷酸、胸苷單磷酸、脫氧胞苷單磷酸)或標(biāo)準(zhǔn)RNA核糖核苷酸(腺苷單磷酸、鳥苷單磷酸、尿苷單磷酸、胞苷單磷酸)]、替代性核苷酸(例如，肌苷)、修飾的核苷酸、核苷酸類似物或其組合。例如，寡核苷酸引物可包括肽核酸、嗎啉代寡核苷酸(例如，磷二酰胺嗎啉代寡核苷酸)、鎖定核酸[參見，例如，Kaur,H,等人,Biochemistry 45(23),7347-55(2006)]、乙二醇核酸或蘇糖核酸。引物可具有骨架，包括，例如，磷酸二酯鍵、硫代磷酸酯鍵(用硫替代非橋接O)或肽鍵(作為肽核酸的一部分)。替代性核苷酸、修飾的核苷酸以及核苷酸類似物可在本文中通稱為“非標(biāo)準(zhǔn)核苷酸”。

引物中非標(biāo)準(zhǔn)核苷酸的存在可影響該引物的各種特性。在一些實(shí)施方式中，在引物中包含非標(biāo)準(zhǔn)核苷酸可增加或降低引物對其互補(bǔ)序列的熱力學(xué)穩(wěn)定性。例如，具有增加的熱力學(xué)穩(wěn)定性的引物可含有鎖定核酸。具有降低的熱力學(xué)穩(wěn)定性的引物可含有，例如，肌苷(由Auer等人,Nucl.Acids Res.24；5021-5025(1996)描述的)或帶負(fù)電荷的化學(xué)基團(tuán)，諸如羧酸。

本文提供的第一引物或第二引物可以是任何長度。第一引物和第二引物可含有相同數(shù)目的核苷酸或不同數(shù)目的核苷酸。在一些實(shí)施方式中，第一或第二引物可以為至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、500、750、1000或1500個(gè)核苷酸的長度。在一些實(shí)施方式中，第一或第二引物可以為不多于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、500、750、1000或1500個(gè)核苷酸的長度。在一些實(shí)施方式中，第一或第二引物可具有選自最小值為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、500、750或1000個(gè)核苷酸的長度并且最大值為3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、500、750、1000或1500個(gè)核苷酸的長度的范圍的長度。

本文提供的第一引物或第二引物的尾區(qū)可以是任何長度。通常，針對于同一模板的第一引物和第二引物的尾區(qū)含有相同數(shù)目的核苷酸。在一些實(shí)施方式中，第一或第二引物的尾區(qū)可以為至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、500、750、1000或1500個(gè)核苷酸的長度。在一些實(shí)施方式中，第一或第二引物的尾區(qū)可以為不多于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、500、750、1000或1500個(gè)核苷酸的長度。在一些實(shí)施方式中，第一或第二引物的尾區(qū)可具有選自最小值為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、500、750或1000個(gè)核苷酸的長度并且最大值為3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、500、750、1000或1500個(gè)核苷酸的長度的范圍的長度。

本文提供的第一引物或第二引物的模板結(jié)合區(qū)可以是任何長度。針對于同一模板的第一引物和第二引物的模板結(jié)合區(qū)可含有相同數(shù)目的核苷酸或不同數(shù)目的核苷酸。在一些實(shí)施方式中，第一或第二引物的模板結(jié)合區(qū)可以為至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、500、750、1000或1500個(gè)核苷酸的長度。在一些實(shí)施方式中，第一或第二引物的模板結(jié)合區(qū)可以為不多于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、500、750、1000或1500個(gè)核苷酸的長度。在一些實(shí)施方式中，第一或第二引物的模板結(jié)合區(qū)可具有選自最小值為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、500、750或1000個(gè)核苷酸的長度且最大值為3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、500、750、1000或1500個(gè)核苷酸的長度的范圍的長度。

在一些實(shí)施方式中，引物可以是任何長度，并含有在用于包括該引物的方法或其步驟的溫度下允許該引物與其互補(bǔ)序列足夠穩(wěn)定且特異性地退火的任何核苷酸序列。引物所需的確切長度可能依賴于多種因素，包括反應(yīng)的溫度、引物的化學(xué)組成以及包括引物的反應(yīng)。在一些實(shí)施方式中，引物的模板結(jié)合區(qū)可以是任何長度，并含有在用于包括該引物的方法或其步驟的溫度下允許該引物的模板結(jié)合區(qū)與其互補(bǔ)序列足夠穩(wěn)定且特異性地退火的任何核苷酸序列。引物的模板結(jié)合區(qū)所需的確切長度可能依賴于多種因素，包括反應(yīng)的溫度、引物的模板結(jié)合區(qū)的化學(xué)組成以及包括引物的反應(yīng)。與缺乏非標(biāo)準(zhǔn)核苷酸的相應(yīng)引物的長度相比，在引物中包含一個(gè)或多個(gè)非標(biāo)準(zhǔn)核苷酸可改變在本文提供的方法中使用的引物的所需長度。例如，如果采用本文提供的方法，期望有具有某一解鏈溫度(“Tm”)的引物，在一些實(shí)施方式中，相比于如果引物僅含有標(biāo)準(zhǔn)核苷酸，如果引物含有至少一些非標(biāo)準(zhǔn)核苷酸，具有所選Tm的引物可以具有更短的長度。通常，核苷酸序列的“解鏈溫度”指的是50％的具有核苷酸序列的核酸與其互補(bǔ)序列堿基配對(即在雙鏈分子中)，而50％的具有核苷酸序列的核酸是單鏈形式時(shí)的溫度。

在一些實(shí)施方式中，本文提供的第一引物或第二引物中的一個(gè)或兩者可被設(shè)計(jì)為在引物的尾區(qū)中含有與靶核酸序列內(nèi)的內(nèi)部基序(即核苷酸序列)互補(bǔ)的核苷酸序列。例如，再次參考圖1，第一引物105的尾區(qū)可含有與雙鏈核酸模板的第二鏈104中的內(nèi)部基序互補(bǔ)的核苷酸序列，第一引物的第一拷貝的延伸產(chǎn)物111或第一引物的第二拷貝的延伸產(chǎn)物113。類似地，仍然參考圖1，第二引物106的尾區(qū)可含有與雙鏈核酸模板的第一鏈103中的內(nèi)部基序互補(bǔ)的核苷酸序列或第二引物的延伸產(chǎn)物112。在至少一些情況下，如本文所述，在引物的尾區(qū)中具有與靶核酸序列內(nèi)的內(nèi)部基序互補(bǔ)的核苷酸序列可以提高反應(yīng)的速度或特異性。

不受理論束縛，根據(jù)圖9中概括的機(jī)理，可以認(rèn)為在引物的尾區(qū)中具有與靶核酸序列內(nèi)的內(nèi)部基序互補(bǔ)的核苷酸序列可以提高反應(yīng)的速度或特異性。為簡潔起見，圖9和這一機(jī)理僅就第一引物的第一拷貝來描述，但根據(jù)具體情況，同樣可應(yīng)用于第一引物的第二拷貝、第二引物等。另外，圖9和這一機(jī)理僅就第一引物的第一拷貝的延伸產(chǎn)物111來描述，該延伸產(chǎn)物與第二引物的延伸產(chǎn)物112退火，但其同樣可應(yīng)用于含有本文所述的引物的延伸產(chǎn)物的其他分子?，F(xiàn)在轉(zhuǎn)向圖9，第一引物的尾區(qū)的至少一部分可含有與在第一引物的第一拷貝的延伸產(chǎn)物111中的內(nèi)部基序902(反斜線樣填充)互補(bǔ)的核苷酸序列901(棋盤狀填充)，并且該第一引物可被整合到第一引物的第一拷貝的延伸產(chǎn)物(如本文其他地方所述)111中。第一引物的第一拷貝的延伸產(chǎn)物111可與第二引物的延伸產(chǎn)物112退火。在含有第一引物的第一拷貝的延伸產(chǎn)物111和第二引物的延伸產(chǎn)物112的雙鏈體核酸的“呼吸(breathing)”過程中，引物的尾區(qū)901可向存在于第一引物的第一拷貝的延伸產(chǎn)物中的內(nèi)部基序902移動(dòng)并可與之暫時(shí)退火。在與第一引物的第一拷貝的延伸產(chǎn)物中的內(nèi)部基序902暫時(shí)退火之后，引物的尾區(qū)901可退回到與第二引物的延伸產(chǎn)物112退火的原始位置，并且任選地，它可以在這些結(jié)構(gòu)之間反復(fù)地來回移動(dòng)(由圖9中的箭頭表示)。在尾區(qū)901的核苷酸序列與內(nèi)部基序902退火的時(shí)間過程中，第二引物的延伸產(chǎn)物112的3’末端處的一個(gè)或多個(gè)核苷酸可能未退火，并且可用于結(jié)合第一引物的新拷貝或另一雙鏈體核酸(例如，二級(jí)核酸)中的互補(bǔ)序列。在第二引物的延伸產(chǎn)物112的3’末端處的一個(gè)或多個(gè)核苷酸結(jié)合第一引物的新拷貝或另一雙鏈體核酸(例如，二級(jí)核酸)中的互補(bǔ)序列的事件中，這些事件中的任意一個(gè)均可以如本文其他地方所述提高反應(yīng)的速率，例如，通過生成第一引物的新延伸產(chǎn)物(在其生成過程中，它代替原始的第一引物延伸產(chǎn)物)。而且，即使在第一引物中不具有與內(nèi)部基序902互補(bǔ)的核苷酸序列901，在本文提供的方法中在雙鏈體核酸中的互補(bǔ)序列之間仍然可以存在“呼吸”。然而，當(dāng)在第一引物中具有與內(nèi)部基序902互補(bǔ)的核苷酸序列901時(shí)，雙鏈體核酸可以“呼吸”的時(shí)間長度可以增加，并且根據(jù)本文提供的方法這可能轉(zhuǎn)而提高反應(yīng)的速率。

在實(shí)施方式中，內(nèi)部基序可以含有至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、75或100個(gè)核苷酸。在實(shí)施方式中，內(nèi)部基序可以含有不多于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、75或100個(gè)核苷酸。在實(shí)施方式中，內(nèi)部基序可以含有至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50或75個(gè)且不多于3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、75或100個(gè)核苷酸(其中上限值高于下限值)。通常，在引物中與內(nèi)部基序互補(bǔ)的核苷酸序列含有與該內(nèi)部基序中相同數(shù)目的核苷酸。而且，在引物中與內(nèi)部基序互補(bǔ)的核苷酸序列可與該內(nèi)部基序完全互補(bǔ)，或者在引物與內(nèi)部基序中的核苷酸序列之間可以存在一個(gè)或多個(gè)錯(cuò)配的核苷酸。內(nèi)部基序的起點(diǎn)可與引物的3’末端核苷酸隔開任意距離，該3’末端核苷酸延伸以形成含有該內(nèi)部基序的引物延伸產(chǎn)物，但是該內(nèi)部基序的起點(diǎn)通?？膳c該引物的3’末端核苷酸隔開例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、75或100個(gè)核苷酸。在實(shí)施方式中，內(nèi)部基序的起點(diǎn)可與引物的3’末端核苷酸隔開不多于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、75或100個(gè)核苷酸，該3’末端核苷酸延伸以形成含有該內(nèi)部基序的引物延伸產(chǎn)物。在實(shí)施方式中，內(nèi)部基序的起點(diǎn)可與引物的3’末端核苷酸隔開至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50或75個(gè)且不多于3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、75或100個(gè)核苷酸(其中上限數(shù)目大于下限數(shù)目)，該3’末端核苷酸延伸以形成含有該內(nèi)部基序的引物延伸產(chǎn)物。

如本文所用的，在單一靶核酸鏈/多核苷酸模板的情況下，“內(nèi)部基序”是該靶核酸鏈的一部分，它與用于擴(kuò)增本文提供的靶核酸的引物對的一個(gè)引物的尾區(qū)互補(bǔ)，并且具有與該引物對的另一引物的尾區(qū)相同或相似的核苷酸序列。因此，例如，如果靶核酸中的內(nèi)部基序具有5’至3’方向的核苷酸序列GGGATGGA，則用來根據(jù)本文提供的方法擴(kuò)增靶核酸的引物對的一個(gè)引物的尾區(qū)/第一區(qū)域?qū)⒕哂?’至3’方向的核苷酸序列TCCATCCC(或類似序列)，并且該引物對的另一引物的尾區(qū)/第一區(qū)域?qū)⒕哂?’至3’方向的核苷酸序列GGGATGGA(或類似序列)。在雙鏈靶核酸的情況下，術(shù)語“內(nèi)部基序”是指兩條鏈的任意一條的相關(guān)區(qū)域，如以上對于單鏈所描述的。在本文描述的引物延伸產(chǎn)物的情況下，“內(nèi)部基序”是指與引物延伸產(chǎn)物的一部分互補(bǔ)的延伸產(chǎn)物的一部分，所述引物延伸產(chǎn)物的一部分對應(yīng)于延伸以形成特定引物延伸產(chǎn)物的引物的尾區(qū)。而且，如果提到與特定鏈中的“內(nèi)部基序”互補(bǔ)的不同鏈中的核苷酸序列，該互補(bǔ)序列可在本文中被稱為“內(nèi)部基序互補(bǔ)體”。值得注意的是，在存在兩條互補(bǔ)核酸鏈的情況下(例如，在含有兩個(gè)互補(bǔ)引物延伸產(chǎn)物的雙鏈分子中)，每條鏈將具有不同的“內(nèi)部基序”(所述不同鏈的“內(nèi)部基序”將彼此互補(bǔ))，因此在適當(dāng)?shù)那闆r下，本文提供的“內(nèi)部基序”的描述可根據(jù)相關(guān)鏈或引物來限定。例如，可以描述雙鏈核酸，其中該核酸的第一鏈以5’-3’順序具有部分C’-B-C-A-C’，并且該核酸的第二鏈以5’-3’順序具有部分C-A’-C’-B’-C，其中第一鏈的部分C’與第二鏈的部分C退火，第一鏈的部分A與第二鏈的部分A’退火，以此類推。如果第一鏈的部分C’對應(yīng)于本文提供的引物的尾區(qū)，并且部分C’與部分C互補(bǔ)，那么第一鏈的部分C可被稱為第一鏈的“內(nèi)部基序”，并且第二鏈的部分C’可被稱為相對于第一鏈的“內(nèi)部基序互補(bǔ)體”。同時(shí)，如果第二鏈的部分C也對應(yīng)于本文提供的引物的尾區(qū)，并且它與部分C’互補(bǔ)，那么第二鏈的部分C’可被稱為第二鏈的“內(nèi)部基序”，并且第一鏈的部分C可被稱為相對于第二鏈的“內(nèi)部基序互補(bǔ)體”。

在實(shí)施方式中，本文提供的方法和組合物可以結(jié)合圖10進(jìn)行描述。可按照與圖8大體相同的方式描述圖10的特征，除了圖10的模板還包括內(nèi)部基序之外。

多核苷酸模板1000(圖10A)可以是擴(kuò)增的靶標(biāo)。多核苷酸模板1000是單核酸鏈。多核苷酸模板鏈可作為游離的單鏈分子而存在，或者它可作為雙鏈分子的一部分而存在，其中該多核苷酸模板鏈與其互補(bǔ)鏈退火。多核苷酸模板1000可以是DNA或RNA。

多核苷酸模板1000可以含有至少第一部分1001(也用“(i)”和字母“A”表示)和第二部分1002(也用“(ii)”和字母“B”表示)。第一部分1001和第二部分1002可各自含有任意數(shù)目的核苷酸，例如對于圖8中的模板的第一部分和第二部分所描述的。第一部分1001和第二部分1002可含有相同或不同數(shù)目的核苷酸。此外，多核苷酸模板1000可含有第三部分1003(也用“(iii)”和字母“C”表示)，它還可被稱為“內(nèi)部基序”。內(nèi)部基序通常含有6至10個(gè)核苷酸，盡管任選地可含有其他數(shù)目的核苷酸，諸如至少4、5、6、7、8、9、10、11或12個(gè)核苷酸，不多于6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個(gè)核苷酸，或至少4、5、6、7、8、9、10、11或12個(gè)核苷酸且不多于6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個(gè)核苷酸(上限值大于下限值)。內(nèi)部基序1003通常與第一部分1001和第二部分1002在任一側(cè)隔開2至25個(gè)核苷酸，盡管可以隔開其他數(shù)目的核苷酸，諸如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45或50個(gè)核苷酸，不多于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50或60個(gè)核苷酸，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45或50個(gè)核苷酸至2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50或60個(gè)核苷酸(上限值大于下限值)。在實(shí)施方式中，第一部分1001與內(nèi)部基序1003之間相比于第二部分1002與內(nèi)部基序1003之間可具有相同數(shù)目的核苷酸(例如，第一部分與內(nèi)部基序之間可具有6個(gè)核苷酸，并且第二部分與內(nèi)部基序之間可具有6個(gè)核苷酸)。在其他實(shí)施方式中，第一部分1001與內(nèi)部基序1003之間可具有不同于第二部分1002與內(nèi)部基序1003之間的核苷酸數(shù)目(例如，第一部分與內(nèi)部基序之間可具有6個(gè)核苷酸，而第二部分與內(nèi)部基序之間可具有8個(gè)核苷酸)。在實(shí)施方式中，內(nèi)部基序與第一部分1001或第二部分1002之間沒有核苷酸(例如在實(shí)施方式中，內(nèi)部基序可以直接挨著第一部分1001或第二部分1002中的一個(gè)或兩者)。

多核苷酸模板1000可以在含有第一引物1010和第二引物1020的反應(yīng)混合物中溫育(圖10B)。通常，該反應(yīng)混合物含有每個(gè)引物的多個(gè)拷貝，例如，每個(gè)引物的至少4、5、6、10、15、20、50、100、1000、10,000、100,000個(gè)或1百萬個(gè)或更多拷貝。第一引物1010可以具有第一區(qū)域1011(也用“(i)”表示)和第二區(qū)域1012(也用“(ii)”表示)。第一引物的第一區(qū)域1011可具有5’端，而第一引物的第二區(qū)域1012可具有3’端。第一引物的第一區(qū)域可具有與第一引物的第二區(qū)域的核苷酸序列不同的核苷酸序列。第二引物1020可以具有第一區(qū)域1021(也用“(i)”表示)和第二區(qū)域1022(也用“(ii)”表示)。第二引物的第一區(qū)域1021可具有5’端，而第二引物的第二區(qū)域1022可具有3’端。第二引物的第一區(qū)域可具有與第二引物的第二區(qū)域的核苷酸序列不同的核苷酸序列。

第一引物的第二區(qū)域1012可具有與多核苷酸模板的第一部分1001的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。在圖10中，多核苷酸模板的第一部分1001的核苷酸序列由字母A表示，而第一引物的第二區(qū)域1012的核苷酸序列由字母A’表示，其中A與A’彼此互補(bǔ)。第二引物的第二區(qū)域1022可具有與配偶體核苷酸序列1030互補(bǔ)的核苷酸序列，其中配偶體核苷酸序列1030與多核苷酸模板的第二部分1002的核苷酸序列互補(bǔ)。在圖10中，多核苷酸模板的第二部分1002的核苷酸序列由字母B表示，配偶體核苷酸序列1030的核苷酸序列由字母B’表示，并且第二引物的第二區(qū)域1022的核苷酸序列由字母B表示，其中B與B’彼此互補(bǔ)。換言之，如圖10所示，多核苷酸模板的第二部分1002(B)的核苷酸序列可與第二引物的第二區(qū)域1022(B)的核苷酸序列相同。采用本文提供的組合物和方法，可以生成配偶體核苷酸序列1030，例如，作為從第一引物的3’端延伸的延伸產(chǎn)物的一部分。在實(shí)施方式中，第一引物的第一區(qū)域1011可與第二引物的第一區(qū)域1021互補(bǔ)。在圖10中，第一引物的第一區(qū)域的核苷酸序列由字母C表示，而第二引物的第一區(qū)域的核苷酸序列由字母C’表示，其中C與C’彼此互補(bǔ)。

此外，第二引物的第一區(qū)域1021可與多核苷酸模板中的內(nèi)部基序1003互補(bǔ)。在圖10中，多核苷酸模板的內(nèi)部基序1003的核苷酸序列由字母C表示，其中C與C’彼此互補(bǔ)。因此，如圖10所示，在實(shí)施方式中，第一引物的第一區(qū)域1011可具有與多核苷酸模板的內(nèi)部基序1003相同的核苷酸序列，而第二引物的第一區(qū)域1021具有與內(nèi)部基序1003互補(bǔ)的序列。此外，第二引物的第一區(qū)域1021與第一引物的第一區(qū)域1011和內(nèi)部基序都互補(bǔ)，而第一引物的第一區(qū)域1011與第二引物的第一區(qū)域1021和內(nèi)部基序互補(bǔ)體互補(bǔ)。

在實(shí)施方式中，圖10的第一引物和第二引物可分別具有在本文其他地方(例如，如圖1或8中)所述的第一引物和第二引物的任何特征。而且，在實(shí)施方式中，圖10的第一引物的第一區(qū)域可具有在本文其他地方所述的第一引物的尾區(qū)的任何特征。在實(shí)施方式中，圖10的第一引物的第二區(qū)域可具有在本文其他地方所述的第一引物的模板結(jié)合區(qū)的任何特征。在實(shí)施方式中，圖10的第二引物的第一區(qū)域可具有在本文其他地方所述的第二引物的尾區(qū)的任何特征。在實(shí)施方式中，圖10的第二引物的第二區(qū)域可具有在本文其他地方所述的第二引物的模板結(jié)合區(qū)的任何特征。

在實(shí)施方式中，含有多核苷酸模板1000和第一引物1010的至少兩個(gè)拷貝以及第二引物1020的至少兩個(gè)拷貝的反應(yīng)混合物可含有如本文其他地方所述可支持基于聚合酶的核酸合成的一個(gè)或多個(gè)其他組分(例如聚合酶、核苷酸、緩沖液、水等)。類似地，含有多核苷酸模板1000和第一引物1010的至少兩個(gè)拷貝以及第二引物1020的至少兩個(gè)拷貝的反應(yīng)混合物可在本文其他地方所述用于支持核酸模板的擴(kuò)增或多聯(lián)體的生成的任何反應(yīng)條件下溫育。

在實(shí)施方式中，在多核苷酸模板1000和第一引物1010的至少兩個(gè)拷貝以及第二引物1020的至少兩個(gè)拷貝在反應(yīng)混合物中如本文所述進(jìn)行溫育時(shí)，可形成一條或多條多聯(lián)體鏈(圖10C)。在實(shí)施方式中，形成的多聯(lián)體鏈1040可具有5’端和3’端，并且可具有含有5’至3’方向的通用結(jié)構(gòu)C’-T-C’-T-X-C’的序列，其中C’是第二引物的第一區(qū)域的核苷酸序列，T是多核苷酸模板的序列或其類似序列，并且X是任意數(shù)目和序列的核苷酸。如圖10C進(jìn)一步所示，在鏈1040的多核苷酸模板的序列內(nèi)，在5’至3’方向上，存在該模板的以下部分的序列：B(多核苷酸模板的第二部分)，C(內(nèi)部基序)，和A(多核苷酸模板的第一部分)。因此，如圖10C所示，在本文提供的實(shí)施方式中，內(nèi)部基序/內(nèi)部基序互補(bǔ)體的序列在多聯(lián)體鏈中的多個(gè)位置處存在。特別地，在鏈1040中，內(nèi)部基序互補(bǔ)體(C’)的序列出現(xiàn)在多聯(lián)體鏈中所述多核苷酸模板的序列的兩個(gè)拷貝之間和該鏈的末端處，并且內(nèi)部基序(C)的序列在多核苷酸模板的序列內(nèi)的同一條鏈中存在。因此，如多聯(lián)體鏈1040的通用結(jié)構(gòu)所示，多聯(lián)體鏈可含有多核苷酸模板的序列或其類似序列的至少兩個(gè)拷貝，其中多核苷酸模板的序列的拷貝由至少第二引物的第一區(qū)域的序列分隔開。在實(shí)施方式中，在以上提供的通用結(jié)構(gòu)C’-T-C’-T-X-C’中的T可以是多核苷酸模板的類似序列。

在實(shí)施方式中，根據(jù)本文提供的方法生成的多聯(lián)體鏈1040可以是單鏈分子的一部分。在其他實(shí)施方式中，根據(jù)本文提供的方法生成的多聯(lián)體鏈1040可以是雙鏈多聯(lián)體的一部分，其中多聯(lián)體鏈1040與互補(bǔ)于多聯(lián)體鏈的鏈1050退火。盡管圖10C描繪了含有具有5’至3’方向的通用結(jié)構(gòu)C’-T-C’-T-X-C’(鏈1040)或C-T’-C-T’-X’-C(鏈1050)的序列的多聯(lián)體鏈，其中X為0個(gè)核苷酸，但根據(jù)圖10的示意圖生成的多聯(lián)體鏈可具有以上或本文其他地方描述的多聯(lián)體鏈的任意特征。而且，如圖10C所示，序列A和B和C是模板鏈的一部分，因此在通用結(jié)構(gòu)C’-T-C’-T-X-C’或C-T’-C-T’-X’-C中沒有單獨(dú)以符號(hào)表示。

為了進(jìn)一步說明在圖10的實(shí)施方式中元件的關(guān)系，圖10提供了區(qū)塊1060、1062、1064、1066和1068。區(qū)塊1060(具有反斜線樣填充)指示總多核苷酸模板序列(即元件1000)或其互補(bǔ)序列的相對位置。區(qū)塊1062(具有垂直線填充)指示所述多核苷酸模板的第一部分的序列(即元件1001的序列的相對位置)或其互補(bǔ)序列的相對位置。因此，區(qū)塊1062還表示第一引物的第二區(qū)域(即元件1012)的序列，它與元件1001互補(bǔ)。區(qū)塊1064(具有垂直和水平線填充)指示所述多核苷酸模板的第二部分的序列(即元件1002的序列的相對位置)或其互補(bǔ)序列的相對位置。因此，區(qū)塊1064還表示配偶體核苷酸序列(即元件1030)的序列，它與元件1002互補(bǔ)。區(qū)塊1064還指示第二引物的第二區(qū)域1022的序列的相對位置，該序列可以是與所述多核苷酸模板的第二部分(元件1002)的序列相同的序列，或相似的序列。換言之，在實(shí)施方式中，1022的核苷酸序列可以與1002的核苷酸序列相同或相似。例如，如圖10A中所示，在實(shí)施方式中，在多核苷酸模板中具有不是該多核苷酸模板的第一部分、第二部分或第三部分(內(nèi)部基序)的一部分的核苷酸。區(qū)塊1066(具有波浪線填充)指示第一引物的第一區(qū)域的序列(即元件1011/區(qū)域“C”的序列的相對位置)或其互補(bǔ)序列的相對位置。因此，區(qū)塊1066還表示第二引物的第一區(qū)域(即元件1021/區(qū)域“C”)的序列，它與元件1011互補(bǔ)。此外，區(qū)塊1066還表示內(nèi)部基序的序列或其互補(bǔ)序列。值得注意的是，內(nèi)部基序的序列或其互補(bǔ)序列既在模板序列中又在第一和第二引物的尾區(qū)中。如本文其他地方所述，內(nèi)部基序可以直接鄰近所述多核苷酸模板的第一部分或第二部分中的一個(gè)或兩者，或者在內(nèi)部基序與第一部分或第二部分之間可以具有額外的核苷酸。區(qū)塊1068(具有菱形填充)指示多聯(lián)體鏈(即元件1040)的序列或其互補(bǔ)序列的相對位置。因此，區(qū)塊1068還表示與多聯(lián)體鏈互補(bǔ)的鏈(元件1050)的序列。如圖10C中所示，在多聯(lián)體鏈或其互補(bǔ)體(1068)中，存在所述多核苷酸模板序列或其互補(bǔ)體(1060)的兩個(gè)拷貝，這兩個(gè)拷貝被第一引物的第一區(qū)域的核苷酸序列或其互補(bǔ)體(1066)分隔開。這種將所述多核苷酸模板的拷貝分隔開的序列也是內(nèi)部基序或其互補(bǔ)體(1066)的序列。此外，在多聯(lián)體鏈或其互補(bǔ)體(1068)中，第一引物的第一區(qū)域的核苷酸序列或其互補(bǔ)體(1066)在兩端側(cè)接所述多核苷酸模板序列或其互補(bǔ)體(1060)。而且，在多聯(lián)體鏈或其互補(bǔ)體(1068)中，具有第一引物的第二區(qū)域的序列或其互補(bǔ)體(1062)的兩個(gè)拷貝和第二引物的第二區(qū)域的序列或其互補(bǔ)體(1064)的兩個(gè)拷貝，它們均作為所述多核苷酸模板序列或其互補(bǔ)體的兩個(gè)拷貝的一部分而以兩個(gè)拷貝存在。區(qū)塊1060、1062、1064、1066和1068不應(yīng)被解釋為規(guī)定圖10的元件之間的任何所需的特定大小關(guān)系；相反，在本文提供的某些實(shí)施方式中，區(qū)塊1060、1062、1064、1066和1068僅用于幫助說明圖10的元件相對于彼此的一般位置。

本文提供的引物可通過任何合適的方法進(jìn)行制備。例如，引物可化學(xué)合成。在另一實(shí)例中，天然存在的核酸可進(jìn)行分離、裂解(例如，采用限制酶)和/或修飾以生成或變?yōu)楸疚乃龅囊锏囊徊糠帧?/p>

在一些實(shí)施方式中，標(biāo)記物可附接至引物。標(biāo)記物包括，例如，結(jié)合配體(例如，地高辛或生物素)、酶、熒光分子/熒光團(tuán)、發(fā)光的分子、猝滅劑分子或放射性同位素。在其他實(shí)施方式中，可將寡核苷酸的堿基替代為熒光類似物，諸如2-氨基嘌呤(參見，例如，Proc.Acad.Sci.USA,91,6644—6648(1994)，該文獻(xiàn)通過引用全文并入本文)。

在一些實(shí)施方式中，使得i)第一引物的第一拷貝的模板結(jié)合區(qū)與核酸模板鏈退火，ii)第二引物的模板結(jié)合區(qū)與第一引物的第一拷貝的延伸產(chǎn)物退火，iii)第一引物的第二拷貝的模板結(jié)合區(qū)與第二引物的延伸產(chǎn)物退火，或iv)二級(jí)核酸的第一拷貝的第一引物的第二拷貝的延伸產(chǎn)物的3’末端區(qū)與二級(jí)核酸的第二拷貝的第二引物的延伸產(chǎn)物的3’末端區(qū)退火，以產(chǎn)生包含這些鏈的交換結(jié)構(gòu)的條件，可各自包括(即，i)、ii)、iii)或iv)中的任何一個(gè)可包括)在使得雙鏈核酸分子的鏈以一定程度“呼吸(breathe)”(即經(jīng)歷連接堿基對的氫鍵的局部斷裂的短暫時(shí)期)的溫度下溫育核酸，該程度足以促進(jìn)引物或不同的核酸鏈進(jìn)入雙鏈分子的鏈之間，并足以使引物或不同的核酸鏈與打開的雙鏈核酸分子的一條鏈退火。在一些實(shí)施方式中，方法或其步驟可在至少10、15、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、90或95℃的溫度下執(zhí)行或溫育。在一些實(shí)施方式中，方法或其步驟可在不高于10、15、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、90或95℃的溫度下執(zhí)行或溫育。在一些實(shí)施方式中，方法或其步驟可在10、15、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85或90℃至15、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、90或95℃之間的溫度下執(zhí)行或溫育。

在一些實(shí)施方式中，對于本文提供的方法或其步驟，在低于相關(guān)潛在配對的核苷酸鏈或其區(qū)域(例如，第一引物的模板結(jié)合區(qū)與核酸模板的第一鏈配對，第二引物的模板結(jié)合區(qū)與第一引物的第一拷貝的延伸產(chǎn)物配對，第一引物與第二引物的延伸產(chǎn)物配對，第二引物的延伸產(chǎn)物的3’末端區(qū)與其互補(bǔ)序列配對，第一引物的第一拷貝的延伸產(chǎn)物的3’末端區(qū)與其互補(bǔ)序列配對，等等)的解鏈溫度(Tm)的溫度下執(zhí)行步驟或方法。在一些實(shí)施方式中，對于本文提供的方法或其步驟，在高于相關(guān)潛在配對的核苷酸鏈或其區(qū)域(例如，第一引物的模板結(jié)合區(qū)與核酸模板的第一鏈配對，第二引物的模板結(jié)合區(qū)與第一引物的第一拷貝的延伸產(chǎn)物配對，第一引物與第二引物的延伸產(chǎn)物配對，第二引物的延伸產(chǎn)物的3’末端區(qū)與其互補(bǔ)序列配對，第一引物的第一拷貝的延伸產(chǎn)物的3’末端區(qū)與其互補(bǔ)序列配對，等等)的Tm的溫度下執(zhí)行步驟或方法。在一些實(shí)施方式中，對于本文提供的方法或其步驟，在處于相關(guān)潛在配對的核苷酸鏈或其區(qū)域(例如，第一引物的模板結(jié)合區(qū)與核酸模板的第一鏈配對，第二引物的模板結(jié)合區(qū)與第一引物的第一拷貝的延伸產(chǎn)物配對，第一引物與第二引物的延伸產(chǎn)物配對，第二引物的延伸產(chǎn)物的3’末端區(qū)與其互補(bǔ)序列配對，第一引物的第一拷貝的延伸產(chǎn)物的3’末端區(qū)與其互補(bǔ)序列配對，等等)的Tm或在其+/-1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20或25℃或+/-1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20或25℃以內(nèi)的溫度下執(zhí)行步驟或方法。

在一些實(shí)施方式中，核酸聚合酶包含在本文提供的方法或組合物中。聚合酶可生成引物的延伸產(chǎn)物。引物及其延伸產(chǎn)物可與模板核酸鏈互補(bǔ)。通常，核酸聚合酶將在引物的3’端處引發(fā)引物的延伸產(chǎn)物的合成。在一些實(shí)施方式中，DNA聚合酶包含在本文提供的方法或組合物中。如本文所用的，“DNA聚合酶”指的是對DNA模板具有主要的或?qū)Ｒ坏木酆厦富钚缘暮怂峋酆厦?。在一些?shí)施方式中，逆轉(zhuǎn)錄酶包含在本文提供的方法或組合物中。如本文所用的，“逆轉(zhuǎn)錄酶”指的是可從RNA模板合成DNA鏈的核酸聚合酶。在一些實(shí)施方式中，RNA聚合酶可包含在本文提供的方法或組合物中。如本文所用的，“RNA聚合酶”指的是可從DNA或RNA模板合成RNA鏈的核酸聚合酶。

在一些實(shí)施方式中，本文提供的聚合酶可具有鏈置換活性。具有鏈置換活性的聚合酶包括，例如，exo-Bca DNA聚合酶、phi29DNA聚合酶、大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段、Vent_R DNA聚合酶、Deep Vent_R DNA聚合酶、9°N_m DNA聚合酶、Bst 2.0DNA聚合酶以及Bst DNA聚合酶的大片段。也可以使用具有鏈置換活性的其他聚合酶。

聚合酶的修飾形式也可以與本文提供的方法和組合物一起使用，條件是修飾的聚合酶具有序列依賴性核酸合成活性。聚合酶的修飾形式(“修飾的聚合酶”)可以具有，例如，100個(gè)或更少的、70個(gè)或更少的、50個(gè)或更少的、40個(gè)或更少的、30個(gè)或更少的、20個(gè)或更少的、10個(gè)或更少的、5個(gè)或更少的、4個(gè)或更少的、3個(gè)或更少的、2個(gè)或更少的或1個(gè)與聚合酶的親代形式的序列不同的氨基酸。在一些實(shí)施方式中，修飾的聚合酶可含有比親代聚合酶多或少不多于1000、700、500、400、300、200、100、50、40、30、20、10或5個(gè)氨基酸。在一些實(shí)施方式中，修飾的聚合酶可含有親代聚合酶的片段。在一些實(shí)施方式中，修飾的聚合酶可包含具有來源于聚合酶的一部分和來源于非聚合酶蛋白質(zhì)的一部分的嵌合多肽。在一些實(shí)施方式中，修飾的聚合酶可具有，例如，與親代聚合酶相比提高的催化活性、提高的穩(wěn)定性或提高的熱穩(wěn)定性。

在一些實(shí)施方式中，本文提供的聚合酶是熱穩(wěn)定的。熱穩(wěn)定的聚合酶在高達(dá)25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90或95℃的溫度下可具有例如至少5、10、15、20、30、40、50、60、90、120或180分鐘的半衰期。在一些實(shí)施方式中，修飾的聚合酶可以是熱穩(wěn)定的。

在一些實(shí)施方式中，本文提供的方法和其步驟包括足以支持基于聚合酶的核酸合成的條件或在該條件下進(jìn)行。針對基于聚合酶的核酸合成的示例性條件是本領(lǐng)域已知的并提供于例如Green和Sambrook(同上)中。用于基于聚合酶的核酸合成反應(yīng)的非限制性組分可包括以下的一種或多種：聚合酶(例如，以每50微升反應(yīng)體積0.01至10個(gè)單位的酶，或者其中的任何范圍，包括例如，每50微升反應(yīng)體積0.01-1、0.1-10、0.1-5、0.5-10、0.5-5、0.5-2、1-10或1-5個(gè)單位的酶的濃度，其中1單位的酶在75℃下將使15nmol的dNTP在30分鐘內(nèi)摻入聚合產(chǎn)物中)；模板(以每個(gè)反應(yīng)至少例如1、10、100、1,000、10,000或100,000個(gè)拷貝的濃度)；引物(以例如0.01至10微摩爾，或者其中的任何范圍，包括例如0.01-1、0.1-10、0.1-5、0.5-5或0.5-2微摩爾的濃度)；dNTP(例如dATP、dTTP、dGTP和dCTP，以例如每個(gè)dATP、dTTP、dGTP和dCTP 50至500微摩爾，或者其中的任何范圍，包括例如每個(gè)dATP、dTTP、dGTP和dCTP 50-350、100-500、100-300、200-500或300-400微摩爾的濃度)；鹽(例如KCl或乙酸鉀，以例如1至200毫摩爾，或者其中的任何范圍，包括例如1-100、1-50、1-20、1-10、10-20、10-50或10-200毫摩爾的濃度)；緩沖液(例如Tris-HCl或Tris-乙酸鹽(Tris-acetate)，pH 7.8-8.5，以例如1至100毫摩爾，或者其中的任何范圍，包括例如1-50、1-20、1-10、1-5、10-100、20-100或50-100毫摩爾的濃度)；以及鎂離子(以例如0.1至10毫摩爾，或者其中的任何范圍，包括例如，0.1-5、0.1-1、0.5-10、0.5-5或0.5-2.5毫摩爾的濃度)。用于基于聚合酶的核酸合成反應(yīng)的另外的非限制性組分可提高反應(yīng)速度、提高反應(yīng)的保真度或提高反應(yīng)中的酶或DNA的穩(wěn)定性，并且可以包括以下的一種或多種：明膠(以例如0.0001％至0.1％w/v的濃度)、BSA(以例如0.01至1微克每微升的濃度)、蔗糖(以例如0.01摩爾至0.8摩爾的濃度)、海藻糖(以例如0.01摩爾至0.8摩爾的濃度)、DMSO(以例如0.01％至10％v/v的濃度)、甜菜堿(以例如0.1至10摩爾的濃度)、甲酰胺(以例如0.1％至10％v/v的濃度)、甘油(以例如0.1％至20％v/v的濃度)、聚乙二醇(以例如0.1％至20％v/v的濃度)、非離子型去污劑[例如NP-40(以例如0.01％至1％v/v的濃度)]、Tween-20(以例如0.01％至1％v/v的濃度)或Triton X-100(以例如0.01％至1％v/v的濃度)]、銨離子[例如硫酸銨(以例如1至100毫摩爾的濃度)]和EDTA(以例如0.001至0.1毫摩爾的濃度)。其他的試劑也可存在于本文提供的基于聚合酶的核酸合成反應(yīng)中。例如，可以使用足以合成RNA反應(yīng)產(chǎn)物或含有非標(biāo)準(zhǔn)核苷酸的反應(yīng)產(chǎn)物的試劑。足以支持基于聚合酶的核酸合成的條件可包括多個(gè)溫度和pH值。例如，基于聚合酶的核酸合成反應(yīng)的pH可為例如pH 6.0至pH 10.0，諸如pH 6.5、7、7.5、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.5、9或9.5?；诰酆厦傅暮怂岷铣煞磻?yīng)的溫度可以是恒定的或變化的。恒定的溫度可以在例如10℃至95℃之間，諸如20、25、30、35、37、40、42、45、50、55、60、65、70、75、80或85℃。變化的溫度可以是例如10℃至95℃之間的兩個(gè)或更多個(gè)不同的溫度，諸如選自20、25、30、35、37、40、42、45、50、55、60、65、70、75、80或85℃的兩個(gè)或更多個(gè)溫度。

本文提供的方法可在多個(gè)溫度下進(jìn)行。在一些實(shí)施方式中，方法的所有步驟在相同的溫度下進(jìn)行。因此，諸如在PCR中的溫度循環(huán)在本文公開的方法中是不必要的。在一些實(shí)施方式中，本文提供的方法可在兩個(gè)或更多個(gè)不同的溫度下進(jìn)行。在一些實(shí)施方式中，含有用于本文提供的方法的試劑的反應(yīng)混合物在兩個(gè)或更多個(gè)不同的溫度下進(jìn)行溫育。在一些實(shí)例中，可選擇不同的溫度來優(yōu)化速率、準(zhǔn)確度或本文提供的方法的不同步驟的其他特征。例如，可選擇溫度來提高聚合酶的酶活性。在一些實(shí)例中，可選擇不同的溫度來提高引物與模板的結(jié)合特異性或提高模板對引物的可及性(例如較高的溫度可促進(jìn)雙鏈體模板核酸的分離)。在一些實(shí)施方式中，本文提供的方法的所有步驟在不高于80、70、60、50、40、30、20或10℃的溫度下進(jìn)行。在一些實(shí)施方式中，本文提供的方法在20-60、30-70、40-80、20-40、30-50、40-60、50-70、60-80、30-40、35-45、40-50、45-55、50-60、55-65℃的溫度下進(jìn)行。在某些實(shí)施方式中，含有靶核酸的樣品可在本文提供的方法開始之前加熱至大于40、50、60、70、80、90或95℃的溫度。在某些實(shí)施方式中，本文提供的反應(yīng)混合物可在本文提供的方法開始之前或之后一次加熱至大于40、50、60、70、75、80、85、90或95℃的升高的溫度。將反應(yīng)混合物加熱至升高的溫度之后，反應(yīng)混合物可維持在如本文其他地方提供的較低的溫度下(例如，在40-70℃的溫度下)用于進(jìn)行該方法的其余部分。在實(shí)施方式中，如果在本文提供的方法開始之前將反應(yīng)混合物或樣品加熱至升高的溫度，則可在反應(yīng)混合物或樣品已經(jīng)加熱至升高的溫度并且反應(yīng)混合物或樣品已經(jīng)回到如本文提供的較低溫度之后，將核酸聚合酶添加至反應(yīng)混合物或樣品中。本文公開的方法可在有或沒有熱循環(huán)儀的情況下進(jìn)行。

作為一種考慮，可選擇用于本文提供的方法或其步驟的溫度以適合在該方法的步驟中使用的酶。在一些實(shí)施方式中，對于使用聚合酶的方法，選擇反應(yīng)的溫度，使得該溫度不會(huì)顯著損害聚合酶的活性(例如，可選擇反應(yīng)的溫度使得聚合酶具有至少24、12、6、4、3、2、1、0.75、0.5、0.25或0.1小時(shí)的半衰期)?；蛘撸稍趽p害方法中使用的酶的活性的溫度下執(zhí)行方法(例如，可選擇反應(yīng)的溫度使得反應(yīng)中的酶具有不多于24、12、6、4、3、2、1、0.75、0.5、0.25或0.1小時(shí)的半衰期)。在一些實(shí)施方式中，如果在損害一種或多種酶的活性的溫度或其他條件(例如pH)下執(zhí)行方法，則可在該方法開始后以一個(gè)或多個(gè)間隔向反應(yīng)中加入另外的酶以補(bǔ)充受損的酶的活性。

在一些實(shí)施方式中，本文提供的方法的一個(gè)或多個(gè)步驟在相同的反應(yīng)容器(例如，管、尖端、器皿等)中發(fā)生。在一些實(shí)施方式中，方法的所有步驟均在相同的反應(yīng)容器中發(fā)生。

用于本文提供的方法的試劑可在反應(yīng)開始時(shí)一起提供，或者它們可以按順序加入，其中在一個(gè)、兩個(gè)或更多個(gè)步驟之后向反應(yīng)中添加新的試劑。在一些情況下，可在反應(yīng)過程期間向反應(yīng)容器中添加新的試劑(例如，酶、引物)，以增加可作用于底物或代替已變得失活的試劑(例如酶)的功能的試劑的量。可在本文提供的方法的反應(yīng)開始后的一個(gè)或多個(gè)選定的時(shí)間間隔(例如，在反應(yīng)開始后1、3、5、7、10、15、20、30、45或60分鐘)向反應(yīng)中添加新的試劑。

在一些實(shí)施方式中，本文提供的方法的一個(gè)或多個(gè)步驟可同時(shí)發(fā)生。例如，在生成第一引物的第一拷貝的延伸產(chǎn)物的單一拷貝后，可由該第一引物的第一拷貝的延伸產(chǎn)物的單一拷貝按順序生成第二引物的延伸產(chǎn)物的多個(gè)拷貝。由于第二引物的延伸產(chǎn)物的拷貝由第一引物的第一拷貝的延伸產(chǎn)物的單一拷貝按順序生成，因此第二引物的延伸產(chǎn)物的單獨(dú)的拷貝可以例如，充當(dāng)用于形成第一引物的第二拷貝的延伸產(chǎn)物的模板，是二級(jí)核酸的組分，是交換結(jié)構(gòu)的組分，或者可以是用于形成第二引物/第一多聯(lián)體鏈的延伸產(chǎn)物的延伸產(chǎn)物的起始點(diǎn)。在另一實(shí)例中，二級(jí)核酸的兩個(gè)拷貝可在由核酸模板的第一鏈生成第一引物的第一拷貝的延伸產(chǎn)物的同時(shí)形成交換結(jié)構(gòu)。在另一實(shí)例中，在由核酸模板的第一鏈生成第一引物的第一拷貝的延伸產(chǎn)物的一個(gè)拷貝的同時(shí)，由第一引物的第一拷貝的延伸產(chǎn)物的不同拷貝生成第二引物的延伸產(chǎn)物。本文提供的其他步驟也可同時(shí)發(fā)生。此外，在本文提供的包括雙鏈核酸模板的方法和組合物中，核酸模板的任一條鏈可被認(rèn)為是“第一鏈”，并且本文提供的引物對的任一引物可被認(rèn)為是“第一引物”。因此，在一些實(shí)例中，雙鏈核酸的兩條鏈可以根據(jù)本文提供的方法同時(shí)用作核酸的“第一鏈”，且引物對的相對引物充當(dāng)不同的“第一鏈”的“第一引物”。而且，根據(jù)本文提供的方法生成的各種結(jié)構(gòu)可任選地進(jìn)入本文提供的方法的不同途徑。例如，在實(shí)施方式中，第一二級(jí)核酸可與第二二級(jí)核酸配對以形成如本文其他地方所述的交換結(jié)構(gòu)。在其他實(shí)施方式中，第一二級(jí)核酸可被第一引物侵入，并且第二引物的延伸產(chǎn)物可充當(dāng)用于生成第一引物的新的延伸產(chǎn)物的模板。為生成第一引物的新的延伸產(chǎn)物，置換作為二級(jí)核酸的一部分的第一引物的延伸產(chǎn)物。在另一實(shí)例中，在實(shí)施方式中，第一多聯(lián)體可與另一多聯(lián)體配對以形成交換結(jié)構(gòu)。在其他實(shí)施方式中，第一多聯(lián)體可被第一引物侵入，并且第一多聯(lián)體鏈可充當(dāng)用于生成新的第二多聯(lián)體鏈的模板。為生成新的第一多聯(lián)體鏈，置換作為多聯(lián)體的一部分的第一多聯(lián)體鏈。其他類似事件也可在本文提供的方法的過程中發(fā)生。

本文提供的反應(yīng)和組合物可含有第一引物、第二引物、一級(jí)核酸、二級(jí)核酸、第一引物的第一拷貝的延伸產(chǎn)物、第一引物的第二拷貝的延伸產(chǎn)物、第二引物的延伸產(chǎn)物、交換結(jié)構(gòu)、多聯(lián)體等的多個(gè)拷貝。因此，本文提供的方法可包括這樣的過程，其中本文提供的多個(gè)步驟同時(shí)發(fā)生，并且這樣的步驟可與相關(guān)分子的多個(gè)拷貝一起發(fā)生。

在一些實(shí)施方式中，在本文提供的方法或組合物中提供了兩組或更多組第一和第二引物，其中每一組均含有第一引物和第二引物，并且其中不同的引物組與不同的核酸模板互補(bǔ)。組中的第一和第二引物兩者的模板結(jié)合區(qū)可與同一雙鏈核酸模板的不同鏈互補(bǔ)。通常，給定組中的第一和第二引物的尾區(qū)具有不同于將在同一方法或組合物中使用的其他引物組的第一和第二引物的尾區(qū)的非互補(bǔ)序列，使得來自不同引物組的引物尾部不是互補(bǔ)的。這可能是理想的以便防止形成含有來源于不同核酸模板的鏈的雜合交換結(jié)構(gòu)?；蛘?，在兩個(gè)或更多個(gè)不同的引物組中的第一和第二引物的尾區(qū)可具有互補(bǔ)序列，以便形成雜合交換結(jié)構(gòu)和含有來源于不同核酸模板的鏈的多聯(lián)體。在本文提供的方法或組合物中包含兩個(gè)或更多個(gè)引物組可支持在同一反應(yīng)容器中同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)不同的核酸模板。這例如對于擴(kuò)增樣品中感興趣的多個(gè)模板或?qū)τ跍y定樣品中多個(gè)不同模板的存在可能是有用的。在一些實(shí)施方式中，在本文提供的方法中提供了1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、100、200、500組或更多組第一和第二引物，以便擴(kuò)增1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、100、200、500個(gè)或更多個(gè)不同的核酸模板或測定該核酸模板的存在。

在一些實(shí)施方式中，在本文提供的方法中，可快速擴(kuò)增核酸模板。例如，在一些實(shí)施方式中，在該方法開始后0.1、0.5、1、3、5、10、15、20、30、40、50、60、90、120或180分鐘內(nèi)核酸模板可擴(kuò)增至少500倍。在另一實(shí)例中，在一些實(shí)施方式中，在該方法開始后0.1、0.5、1、3、5、10、15、20、30、40、50、60、90、120或180分鐘內(nèi)核酸模板可擴(kuò)增至少10,000倍。在另一實(shí)例中，在一些實(shí)施方式中，在該方法開始后0.1分鐘、0.5分鐘、1分鐘、3分鐘、5分鐘、10分鐘、15分鐘、20分鐘、30分鐘、40分鐘、50分鐘、60分鐘、90分鐘、2小時(shí)、3小時(shí)、4小時(shí)、6小時(shí)、8小時(shí)、12小時(shí)、16小時(shí)或24小時(shí)內(nèi)，核酸模板相對于該方法開始時(shí)反應(yīng)混合物中存在的核酸模板的原始量可擴(kuò)增至少5、10、25、50、100、250、500、1,000、5,000、10,000、50,000、100,000、500,000或1,000,000倍。在一些實(shí)施方式中，當(dāng)方法開始時(shí)，用于該方法的第一步驟的所有試劑均在含有用于該方法的反應(yīng)混合物的容器中。在一些實(shí)施方式中，當(dāng)方法開始時(shí)，用于該方法的所有步驟的所有試劑均在含有用于該方法的反應(yīng)混合物的容器中。

在一些實(shí)施方式中，在本文提供的方法中，核酸模板可以以比線性速率更高的速率進(jìn)行擴(kuò)增。在一些實(shí)施方式中，在本文提供的方法中，核酸模板可以以指數(shù)方式進(jìn)行擴(kuò)增。在一些實(shí)施方式中，在本文提供的方法中，在該方法開始后每1、2、3、5、10、15、20、25、30、45、60、90、120、180或240分鐘，核酸模板的數(shù)目可至少加倍。在一些實(shí)施方式中，相對于該方法開始時(shí)反應(yīng)中存在的核酸模板的原始量，核酸模板可擴(kuò)增至少5、10、25、50、100、250、500、1,000、5,000、10,000、50,000、100,000、500,000、1,000,000或10,000,000倍。

根據(jù)本文提供的方法生成的多聯(lián)體中核酸模板的多個(gè)拷貝的存在可有助于根據(jù)本文提供的方法快速擴(kuò)增核酸模板。特別地，由于核酸模板的鏈的多個(gè)拷貝可存在于單一多聯(lián)體鏈中，因此將單一聚合酶負(fù)載至單一多聯(lián)體鏈上可導(dǎo)致隨著聚合酶沿著該多聯(lián)體鏈移動(dòng)而生成核酸模板的鏈的多個(gè)拷貝。在一些情況下，核酸聚合酶遇到并負(fù)載至核酸鏈上所需的時(shí)間可顯著影響擴(kuò)增反應(yīng)的總體速度。例如，如果聚合酶在復(fù)制反應(yīng)期間遇到的每個(gè)核酸鏈僅含有核酸模板的鏈的單一拷貝，則在生成該模板的鏈的每個(gè)拷貝后聚合酶可能需要遇到并負(fù)載至新的模板鏈上。相比之下，通過采用多聯(lián)體，在聚合酶遇到并負(fù)載至多聯(lián)體鏈上后，它可合成模板的鏈的多個(gè)拷貝而無需使多聯(lián)體鏈留下或遇到并負(fù)載至另一條鏈上。

在一些實(shí)施方式中，本文提供了用于由單鏈或雙鏈RNA模板生成雙鏈DNA多聯(lián)體的方法和組合物。除了逆轉(zhuǎn)錄酶(例如，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、Superscript II^TM逆轉(zhuǎn)錄酶、Superscript III^TM逆轉(zhuǎn)錄酶或ThermoScript^TM逆轉(zhuǎn)錄酶)也包含在本文提供的方法中外，可如本文所述執(zhí)行該方法。第一引物的第一拷貝可與RNA模板退火，并且逆轉(zhuǎn)錄酶可生成第一引物的第一拷貝的延伸產(chǎn)物，該延伸產(chǎn)物通過逆轉(zhuǎn)錄的過程形成為DNA鏈。用于RNA的逆轉(zhuǎn)錄的方法和條件是本領(lǐng)域已知的并公開在例如RNA：A Laboratory Manual,D.Rio等人,Cold Spring Harbor Laboratory Press(2011)中，該文獻(xiàn)通過引用全文并入本文。在通過逆轉(zhuǎn)錄酶(由RNA鏈)生成第一引物的第一拷貝的延伸產(chǎn)物(為DNA鏈)后，用于生成多聯(lián)體的其余步驟可與本文其他地方所述的相同。

在一些實(shí)施方式中，本文提供的方法和組合物可包括一個(gè)或多個(gè)“暴沸(bumping)引物”。暴沸引物可與本文提供的方法和組合物一起使用，以通過例如提高從核酸模板的第一鏈置換核酸模板的第二鏈的速率，提高從第一引物延伸產(chǎn)物置換核酸模板的第一鏈的速率或者提高從第二引物延伸產(chǎn)物置換第一引物延伸產(chǎn)物的速率來例如提高生成反應(yīng)產(chǎn)物的速率或特異性。如本文所用的“暴沸引物”指的是與在核酸模板的第一鏈或第二鏈上的序列互補(bǔ)的引物，該序列在與第一引物或第二引物的模板結(jié)合區(qū)結(jié)合的相同鏈上的序列的下游。因此，當(dāng)暴沸引物與同一核酸鏈(第一引物或第二引物與該核酸鏈退火)退火時(shí)，暴沸引物的3’末端朝向第一引物或第二引物的5’末端(即，第一引物或第二引物的5’末端核苷酸和尾區(qū))。當(dāng)與核酸聚合酶一起溫育并在支持生成引物延伸產(chǎn)物的條件下時(shí)，暴沸引物的延伸產(chǎn)物可通過該聚合酶由暴沸引物的3’末端形成。由于暴沸引物的3’末端朝向第一引物或第二引物的5’末端，因此隨著暴沸引物的延伸產(chǎn)物的長度增加，它可最終遇到作為延伸產(chǎn)物的第一引物或第二引物的5’末端。聚合酶可隨后從鏈以及第一引物或第二引物的任何延伸產(chǎn)物中置換第一引物或第二引物。因此，暴沸引物可加快本文提供的反應(yīng)。

在一些實(shí)施方式中，本文提供了含有一種或多種酶、引物或本文提供的其他試劑的容器。容器可包含能夠支持或含有液體或固體材料的任何結(jié)構(gòu)，并可包括管、器皿、尖端等。在一些實(shí)施方式中，容器壁可允許光穿過壁透射。容器可以是光學(xué)透明的。容器可含有，例如，分離的核酸聚合酶、分離的DNA聚合酶、分離的逆轉(zhuǎn)錄酶、第一引物、第二引物、核酸染料或核酸探針中的任意一種或多種，如本文其他地方所述?？商峁┤萜鞯娜魏蝺?nèi)容物的任何數(shù)目的拷貝(例如，第一拷貝、第二拷貝、第三拷貝等)。容器的內(nèi)容物可以是流體連通的。在一些實(shí)施方式中，容器可進(jìn)一步含有核酸模板。在一些實(shí)施方式中，容器可進(jìn)一步含有核苷酸、緩沖液、鹽、水或本文提供的用于核酸擴(kuò)增的其他試劑。在一些實(shí)施方式中，容器可含有兩個(gè)或更多個(gè)引物組，其中每個(gè)引物組包含第一引物和第二引物，并且不同的引物組與不同的核酸模板互補(bǔ)。

可將對于本文提供的方法有用的兩種或更多種試劑包裝并作為試劑盒提供。例如，試劑盒可包含以下的任意兩種或更多種：核酸模板、第一引物、第二引物、核酸聚合酶、DNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、緩沖液、核酸染料、核酸探針或dNTP，如本文其他地方所述。在試劑盒內(nèi)，兩種或更多種試劑可包裝于分開的容器或同一容器中。在一些實(shí)施方式中，試劑盒可進(jìn)一步含有核苷酸、緩沖液、鹽、水或本文提供的用于核酸擴(kuò)增的其他試劑。

在實(shí)施方式中，如本文提供的第一引物和第二引物可作為引物組一起提供。引物組可作為單獨(dú)的試劑盒或組合物提供，或者該引物組可與用于執(zhí)行本文提供的方法的一種或多種其他試劑一起提供于試劑盒中。

在一些實(shí)施方式中，核酸連接酶可包含在本文提供的方法或組合物中。連接酶催化核苷酸之間(通常在一個(gè)核苷酸的5’磷酸與另一個(gè)核苷酸的3’羥基基團(tuán)之間)磷酸二酯鍵的形成。相比于不包含連接酶的反應(yīng)，本文提供的反應(yīng)通過在反應(yīng)中包含連接酶可以以更高的速率擴(kuò)增靶核酸。連接酶可以例如增加存在于本文提供的反應(yīng)中的多聯(lián)體的大小或數(shù)目。

核酸連接酶包括大腸桿菌DNA連接酶、Taq DNA連接酶、T3DNA連接酶、T4DNA連接酶、T7DNA連接酶、Ampligase^TM、T4RNA連接酶1和T4RNA連接酶2。

為催化連接反應(yīng)，某些連接酶需要ATP(例如T4DNA連接酶)或NAD+(大腸桿菌DNA連接酶)。在一些實(shí)施方式中，連接酶可連接具有平端的核酸。在一些實(shí)施方式中，連接酶可連接具有粘端的核酸。在一些實(shí)施方式中，連接酶可連接具有平端和粘端兩者的核酸。

連接酶的修飾形式也可與本文提供的方法和組合物一起使用，條件是修飾的連接酶具有催化核苷酸之間磷酸二酯鍵的形成的能力。連接酶的修飾形式(“修飾的連接酶”)可以具有例如，100個(gè)或更少的、70個(gè)或更少的、50個(gè)或更少的、40個(gè)或更少的、30個(gè)或更少的、20個(gè)或更少的、10個(gè)或更少的、5個(gè)或更少的、4個(gè)或更少的、3個(gè)或更少的、2個(gè)或更少的、或1個(gè)與天然存在的親代連接酶形式的序列不同的氨基酸。在一些實(shí)施方式中，修飾的連接酶可含有比親代連接酶多或少不多于1000、700、500、400、300、200、100、50、40、30、20、10或5個(gè)的氨基酸。在一些實(shí)施方式中，修飾的連接酶可含有親代連接酶的片段。在一些實(shí)施方式中，修飾的連接酶可包含具有來源于連接酶的一部分和來源于非連接酶蛋白質(zhì)的一部分的嵌合多肽。在一些實(shí)施方式中，修飾的連接酶可具有，例如，與親代連接酶相比提高的催化活性、提高的穩(wěn)定性或提高的熱穩(wěn)定性。

在一些實(shí)施方式中，本文提供的連接酶是熱穩(wěn)定的。熱穩(wěn)定的連接酶在高達(dá)25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90或95℃的溫度下可具有例如至少5、10、15、20、30、40、50、60、90、120或180分鐘的半衰期。在一些實(shí)施方式中，修飾的連接酶可以是熱穩(wěn)定的。

在一些實(shí)施方式中，包含在本文提供的方法和組合物中的連接酶可以是在本文中被稱為“p50-Tth”的修飾的連接酶，其具有氨基酸序列：MGHHHHHHHHHHSSGHIEGRASMTLEEARKRVNELRDLIRYHNYRYYVLADPEISDAEYDRLLRELKELEERFPELKSPDSPTLQVGARPLEATFRPVRHPTRMYSLDNAFNLDELKAFEERIERALGRKGPFAYTVEHKVDGLSVNLYYEEGVLVYGATRGDGEVGEEVTQNLLTIPTIPRRLKGVPERLEVRGEVYMPIEAFLRLNEELEERGERIFKNPRNAAAGSLRQKDPRITAKRGLRATFYALGLGLEEVEREGVATQFALLHWLKEKGFPVEHGYARAVGAEGVEAVYQDWLKKRRALPFEADGVVVKLDELALWRELGYTARAPRFAIAYKFPAEEKETRLLDVVFQVGRTGRVTPVGILEPVFLEGSEVSRVTLHNESYIEELDIRIGDWVLVHKAGGVIPEVLRVLKERRTGEERPIRWPETCPECGHRLLKEGKVHRCPNPLCPAKRFEAIRHFASRKAMDIQGLGEKLIERLLEKGLVKDVADLYRLRKEDLVGLERMGEKSAQNLLRQIEESKKRGLERLLYALGLPGVGEVLARNLAARFGNMDRLLEASLEELLEVEEVGELTARAILETLKDPAFRDLVRRLKEAGVEMEAKEKGGEALKGLTFVITGELSRPREEVKALLRRLGAKVTDSVSRKTSYLVVGENPGSKLEKARALGVPTLTEEELYRLLEARTGKKAEELV(SEQ ID NO:79)。連接酶p50-Tth在至少60℃的溫度下具有熱穩(wěn)定的平端連接活性。連接酶p50-Tth是嵌合蛋白，其包括含His10的前導(dǎo)序列、來自人類NF-kappa-B蛋白登錄號(hào)NP_003989氨基酸40-366的p50序列(以斜體字表示)、柔性富甘氨酸序列以及來自嗜熱棲熱菌(Thermus Thermophilus)HB8，登錄YP_144363的Tth DNA連接酶序列(用下劃線表示)。在一些實(shí)施方式中，p50-Tth連接酶的修飾形式可與本文提供的方法和組合物一起使用(例如具有100個(gè)或更少的、70個(gè)或更少的、50個(gè)或更少的、40個(gè)或更少的、30個(gè)或更少的、20個(gè)或更少的、10個(gè)或更少的、5個(gè)或更少的、4個(gè)或更少的、3個(gè)或更少的、2個(gè)或更少的、或1個(gè)與p50-Tth連接酶不同的氨基酸)。在實(shí)施方式中，與本文提供的組合物或方法一起使用的連接酶可以是描述于2013年3月15日提交的美國臨時(shí)專利申請?zhí)?1/802,124或2014年3月15日提交的PCT申請?zhí)朠CT/US14/30003中的連接酶，這兩個(gè)專利申請均通過引用全文并入本文用于所有目的。

本文提供的用于擴(kuò)增核酸模板/生成含有該模板的至少兩個(gè)拷貝的多聯(lián)體的各種方法和組合物可實(shí)現(xiàn)先前已通過用于等溫的依賴熱循環(huán)儀的核酸擴(kuò)增的其他方法和組合物實(shí)現(xiàn)的許多功能。根據(jù)本文提供的方法用于擴(kuò)增的核酸模板在本文也可稱為“靶核酸”等。本文提供的方法和組合物可用于，例如感興趣的核酸的分離和克隆、基因表達(dá)分析、核酸的診斷鑒定、新型核酸的合成、核酸探針合成和標(biāo)記、受試者的法醫(yī)學(xué)鑒定、受試者的等位基因鑒定、遺傳篩查、核酸測序以及相關(guān)的應(yīng)用。靶核酸分子可以是任何類型，包括單鏈或雙鏈DNA或RNA(例如，mRNA)。靶核酸可以是任何類型或功能(例如，編碼蛋白質(zhì)的序列、調(diào)節(jié)序列、內(nèi)含子等)。靶核酸可以是整個(gè)基因或其一部分。

在一些實(shí)施方式中，本文提供的方法或組合物可用于檢測樣品中靶核酸的量(包括靶標(biāo)的存在或不存在)，測量在所選時(shí)間段內(nèi)由樣品形成的靶標(biāo)的擴(kuò)增產(chǎn)物的量，或確定由樣品生成模板的一定數(shù)目的拷貝所必需的時(shí)間量?？膳c本文提供的方法和組合物一起使用的樣品在本文其他地方進(jìn)行了描述，并且可包括，例如受試者的體液、分泌物或組織。在實(shí)施方式中，可在測定中使用樣品之前處理樣品以根據(jù)本文提供的方法擴(kuò)增樣品中的靶核酸。樣品的處理可包括如本文其他地方所述的任何處理步驟，并可包括例如聲處理或化學(xué)裂解步驟。

在一些實(shí)施方式中，可執(zhí)行本文提供的方法以在同一反應(yīng)容器中同時(shí)測定至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100種或更多種不同的靶核酸。通常，對于每種感興趣的靶核酸，提供了第一引物和第二引物，每一個(gè)均與核酸靶標(biāo)的鏈或其互補(bǔ)序列互補(bǔ)?？赏ㄟ^例如使用對不同靶核酸中的檢測序列具有序列特異性的核酸探針和不同的熒光團(tuán)，來監(jiān)測在同一容器中不同靶核酸的擴(kuò)增。

在一些實(shí)施方式中，本文提供的方法或組合物可用于檢測靶核酸中感興趣的特定核苷酸的存在或不存在(例如，在突變或SNP的情況下)。例如，可選擇與靶核酸中包括感興趣的核苷酸或與之相鄰的區(qū)域選擇性結(jié)合的第一或第二引物。該引物可設(shè)計(jì)為使得其選擇性地：i)當(dāng)該區(qū)域含有感興趣的核苷酸時(shí)與該區(qū)域結(jié)合，或ii)當(dāng)該區(qū)域含有感興趣的核苷酸時(shí)不與該區(qū)域結(jié)合。可用所選引物來執(zhí)行如本文所述的方法，并且擴(kuò)增反應(yīng)的結(jié)果可提供關(guān)于靶核酸中感興趣的核苷酸存在或不存在的信息。例如，如果第一引物的模板結(jié)合區(qū)被設(shè)計(jì)為具有與包含感興趣的特定核苷酸(例如突變)的靶核酸中的序列互補(bǔ)的核苷酸序列，則用所選引物從樣品中成功擴(kuò)增靶核酸可表明該樣品含有具有感興趣的特定核苷酸的靶核酸。在一些實(shí)施方式中，用于分析靶核酸中感興趣的核苷酸的引物可在該引物的3’末端含有關(guān)鍵核苷酸(即對應(yīng)于靶核酸中感興趣的核苷酸的同一位置的核苷酸)。在這樣的情況下，引物的3’末端核苷酸的退火可能依賴于靶核酸中感興趣的核苷酸的存在。如果引物的3’末端核苷酸不與靶核酸中的核苷酸退火(例如由于核苷酸之間的錯(cuò)配)，則該錯(cuò)配可顯著影響核酸聚合酶由引物合成延伸產(chǎn)物。因此，在一些實(shí)施方式中，具有對應(yīng)于感興趣的核苷酸的3’末端核苷酸的引物可用于確定靶核酸中特定核苷酸的存在或不存在。在這樣的實(shí)施方式中，在一些情況下可選擇在引物的3’末端的關(guān)鍵核苷酸與靶核酸中感興趣的核苷酸互補(bǔ)，并且在一些其他情況下可選擇在引物的3’末端的關(guān)鍵核苷酸與靶核酸中感興趣的核苷酸不互補(bǔ)。感興趣的核苷酸可代表例如靶核酸的野生型形式、突變體形式或多態(tài)性。

在其他實(shí)施方式中，可通過選擇引物，使得感興趣的核苷酸存在于不與第一或第二引物的模板結(jié)合區(qū)互補(bǔ)的區(qū)域中的靶核酸中，來檢測靶核酸中感興趣的特定核苷酸(例如突變或SNP)。例如，感興趣的核苷酸可以大約在靶核酸序列的中間。在實(shí)施方式中，感興趣的核苷酸可以在本文其他地方所述的“內(nèi)部基序”中。在實(shí)施方式中，當(dāng)感興趣的核苷酸在內(nèi)部基序中時(shí)，可以將引物對制備成在引物的尾區(qū)中含有與內(nèi)部基序或其互補(bǔ)體互補(bǔ)，并且可用于確定在靶序列中的內(nèi)部基序中存在或不存在感興趣的核苷酸的核苷酸序列。如本文其他地方所解釋的，引物的尾區(qū)中的核苷酸序列與該引物的延伸產(chǎn)物中的內(nèi)部基序暫時(shí)退火可提高本文提供的反應(yīng)的速率。在一些情況下，引物的尾區(qū)中的核苷酸序列對該引物的延伸產(chǎn)物中的內(nèi)部基序的親和力越大，反應(yīng)可越快發(fā)生。而且，通常，在引物的尾區(qū)中的核苷酸序列中可與該引物的延伸產(chǎn)物中的內(nèi)部基序中的核苷酸結(jié)合的核苷酸數(shù)目越大，該延伸產(chǎn)物的尾區(qū)中的核苷酸序列對于延伸產(chǎn)物中的內(nèi)部基序的親和力越大。因此，在實(shí)施方式中，采用本文提供的組合物和方法，可以通過使用引物來確定在靶序列中存在或不存在感興趣的核苷酸，所述引物在引物的尾區(qū)中具有能與靶序列中的內(nèi)部基序或其互補(bǔ)體結(jié)合的核苷酸序列，并且在尾區(qū)內(nèi)具有或不具有與內(nèi)部基序或其互補(bǔ)體中感興趣的特定核苷酸特異性結(jié)合的核苷酸。通常，當(dāng)引物的尾區(qū)中的核苷酸序列含有與該引物的延伸產(chǎn)物中的核苷酸(對應(yīng)于靶標(biāo)中感興趣的核苷酸)互補(bǔ)的核苷酸時(shí)，將比當(dāng)引物的尾區(qū)中的相關(guān)核苷酸不與該引物的延伸產(chǎn)物中的核苷酸(對應(yīng)于靶標(biāo)中感興趣的核苷酸)互補(bǔ)時(shí)更快地發(fā)生反應(yīng)。例如，野生型形式的靶核酸鏈的內(nèi)部基序可具有核苷酸序列：5’TATTGCAT 3’。然而，在群體中的許多個(gè)體中，該序列中的“G”可頻繁突變?yōu)椤癆”。為了確定特定靶核酸是否在序列中含有“G”或其他核苷酸，可以制備在其尾區(qū)中含有具有序列5’ATGCAATA 3’的核苷酸序列的引物。如果使用該引物(和合適的第二引物)根據(jù)本文提供的方法擴(kuò)增靶核酸，則當(dāng)“G”存在于內(nèi)部基序中時(shí)，相對于當(dāng)在該內(nèi)部基序中“G”的位置處存在不同的核苷酸時(shí)，擴(kuò)增反應(yīng)可具有特定的反應(yīng)速率。這是因?yàn)槿绻癎”存在于內(nèi)部基序中，則引物的尾區(qū)中的核苷酸序列將與內(nèi)部基序完全互補(bǔ)，但是如果在G的正常位置處存在非“G”的核苷酸，則將不會(huì)完全互補(bǔ)。通常，在這一實(shí)例中，如果“G”存在于內(nèi)部基序中，與不存在“G”相比，引物的尾區(qū)將與內(nèi)部基序更頻繁地退火，并且這可以轉(zhuǎn)而導(dǎo)致存在“G”時(shí)比不存在“G”時(shí)更快的反應(yīng)速率。采用本文提供的系統(tǒng)和方法，可以制備引物，以確定存在或不存在感興趣的核苷酸(例如，可以制備引物，使得當(dāng)存在突變形式的核苷酸時(shí)比存在野生型形式的核苷酸時(shí)更快地發(fā)生反應(yīng)，或反之亦然)。而且，在實(shí)施方式中，可以制備引物，以便確定在靶標(biāo)中的內(nèi)部基序中在感興趣的位置處的未知核苷酸的身份。例如，可以制備四個(gè)不同的引物對，每一個(gè)根據(jù)情況含有對應(yīng)于靶核酸中感興趣的核苷酸的A、T、G或C。在實(shí)施方式中，產(chǎn)生最快反應(yīng)結(jié)果的引物對可能指示哪個(gè)核苷酸存在于靶核酸中的內(nèi)部基序中感興趣的位置處。例如，靶核酸可具有通常具有5’至3’方向的序列GTAACGAG的內(nèi)部基序。然而，靶核酸的不同變體可在內(nèi)部基序的第5位置(即“C”的位置)處具有不同的核苷酸。繼續(xù)該實(shí)例，如果提供含有靶核酸的樣品，其中不知道在內(nèi)部基序的第5位置處是何種核苷酸，則可將該樣品分成至少4個(gè)部分，并且這四個(gè)部分可用于第一反應(yīng)混合物、第二反應(yīng)混合物、第三反應(yīng)混合物和第四反應(yīng)混合物。向第一反應(yīng)混合物中提供第一引物對，其中引物分別具有包含5’至3’方向的序列CTCGTTAC和GTAACGAG的尾區(qū)。如果“C”存在于內(nèi)部基序的第5位置處，則這些尾區(qū)將與該內(nèi)部基序或其互補(bǔ)體完全互補(bǔ)。因此，如果靶標(biāo)在這一反應(yīng)混合物中擴(kuò)增最快，則表明“C”存在于該靶標(biāo)中的內(nèi)部基序中感興趣的核苷酸的位置處。向第二反應(yīng)混合物中提供第二引物對，其中引物分別具有包含5’至3’方向的序列CTCATTAC和GTAATGAG的尾區(qū)。如果“T”存在于內(nèi)部基序的第5位置處，則這些尾區(qū)將與該內(nèi)部基序或其互補(bǔ)體完全互補(bǔ)。因此，如果靶標(biāo)在這一反應(yīng)混合物中擴(kuò)增最快，則表明“T”存在于該靶標(biāo)中的內(nèi)部基序中感興趣的核苷酸的位置處。向第三反應(yīng)混合物中提供第三引物對，其中引物分別具有包含5’至3’方向的序列CTCCTTAC和GTAAGGAG的尾區(qū)。如果“G”存在于內(nèi)部基序的第5位置處，則這些尾區(qū)將與該內(nèi)部基序或其互補(bǔ)體完全互補(bǔ)。因此，如果靶標(biāo)在這一反應(yīng)混合物中擴(kuò)增最快，則表明“G”存在于該靶標(biāo)中的內(nèi)部基序中感興趣的核苷酸的位置處。向第四反應(yīng)混合物中提供第四引物對，其中引物分別具有包含5’至3’方向的序列CTCTTTAC和GTAAAGAG的尾區(qū)。如果“A”存在于內(nèi)部基序的第5位置處，則這些尾區(qū)將與該內(nèi)部基序或其互補(bǔ)體完全互補(bǔ)。因此，如果靶標(biāo)在這一反應(yīng)混合物中擴(kuò)增最快，則表明“A”存在于該靶標(biāo)中的內(nèi)部基序中感興趣的核苷酸的位置處。在實(shí)施方式中，如果例如不希望篩選所有可能的核苷酸變體(例如，如果在感興趣的位置通常發(fā)現(xiàn)僅2個(gè)不同的核苷酸)，則以上概述的方法或組合物可以任選地僅用2或3種反應(yīng)混合物來準(zhǔn)備，這些反應(yīng)混合物具有對應(yīng)于在感興趣的位置處僅有2或3個(gè)核苷酸選項(xiàng)的引物對。

在實(shí)施方式中，根據(jù)本文提供的方法，含有靶核酸的樣品可被分成至少第一和第二部分，其中第一部分在具有第一引物對的第一反應(yīng)混合物中溫育，并且第二部分在具有第二引物對的第二反應(yīng)混合物中溫育。在實(shí)施方式中，第一引物對和第二引物對彼此僅在引物各自的尾區(qū)/第一區(qū)域中相差一個(gè)核苷酸(例如，第一對的第一引物的第一區(qū)域的序列與第二對的第一引物的第一區(qū)域的序列僅相差一個(gè)核苷酸)。在引物的尾區(qū)中不同的單一核苷酸可對應(yīng)于靶核酸中感興趣的核苷酸的位置。通過比較在第一反應(yīng)混合物中與在第二反應(yīng)混合物中靶核酸的擴(kuò)增速率或量，可以確定在靶核酸中的感興趣的核苷酸的身份。在實(shí)施方式中，以上概述的方法可采用樣品的第一、第二、第三和第四部分以及第一引物對、第二引物對、第三引物對和第四引物對進(jìn)行，其中如上所述，第一引物對、第二引物對、第三引物對和第四引物對彼此僅在引物各自的尾區(qū)/第一區(qū)域中相差一個(gè)核苷酸。

在實(shí)施方式中，可提供至少第一靶核酸和第二靶核酸，其中第一靶核酸和第二靶核酸如本文其他地方所述在內(nèi)部基序中感興趣的位置處相差一個(gè)核苷酸。在實(shí)施方式中，根據(jù)本文提供的方法，第一靶核酸可在含有本文所述的引物對的第一反應(yīng)混合物中溫育，并且第二靶核酸可在含有相同引物對的第二反應(yīng)混合物中溫育。通過比較在第一反應(yīng)混合物中的第一靶核酸與在第二反應(yīng)混合物中的第二靶核酸的擴(kuò)增速率或量，或與絕對值比較，根據(jù)本文其他地方所述的原理，可以確定在第一靶核酸和第二靶核酸的一個(gè)或兩者中感興趣的位置處的核苷酸的身份。

此外，在實(shí)施方式中，本文所述用于檢測感興趣的單一核苷酸的組合物和方法也可以用來檢測多個(gè)核苷酸突變或多態(tài)性。

本文提供的方法和組合物可用于從可含有核酸的任何樣品中擴(kuò)增核酸。樣品的實(shí)例可包括各種流體樣品。在一些情況下，樣品可以是來自受試者的體液樣品。樣品可包含一個(gè)或多個(gè)流體組分。在一些情況下，可提供固體或半固體樣品。樣品可包括從受試者采集的組織。樣品可包括受試者的體液、分泌物或組織。樣品可以是生物樣品。該生物樣品可以是體液、分泌物或組織樣品。生物樣品的實(shí)例可以包括但不限于，血液、血清、唾液、尿液、胃液和消化液、淚液、糞便、精液、陰道液、來源于腫瘤組織的間質(zhì)液、眼部液體、汗液、粘液、耳垢、油、腺體分泌物、呼氣、脊髓液、毛發(fā)、指甲、皮膚細(xì)胞、血漿、鼻拭子或鼻咽洗液、脊髓液、腦脊髓液、組織、咽喉拭子、活檢物、胎盤液、羊水、臍帶血、重點(diǎn)流體(emphatic fluid)、腔液、痰、膿、微生物群、胎糞、母乳或其他排泄物。樣品可以由人或動(dòng)物提供。樣品可以來自植物、微生物(例如病毒、細(xì)菌)或其他生物物質(zhì)。

在一些實(shí)施方式中，本文提供的方法和組合物可在服務(wù)點(diǎn)位置(例如受試者的家中或工作地點(diǎn)、食品雜貨店、藥店、診所或?qū)W校等)執(zhí)行或使用。本文提供的方法和組合物可允許快速擴(kuò)增來自受試者的樣品中的核酸，以便幫助診斷或治療受試者。例如，此處提供的方法和組合物可用于檢測來自受試者的樣品中來自病原體如病毒(例如流感病毒)或細(xì)菌(例如鏈球菌屬(streptococcus))的核酸的存在。

在實(shí)施方式中，本文提供的方法和組合物可用來檢測病原體或病原體的特征(例如病原體內(nèi)的基因或基因變異)?？刹捎帽疚奶峁┑姆椒ɑ蚪M合物檢測的病原體或其特征可包括，例如，鮑氏不動(dòng)桿菌(Acinetobacter baumannii)、blaROB抗性基因、blaTEM抗性基因、Bordetalla holmesii、洋蔥伯克霍爾德氏菌(Burkholderia cepacia)、白假絲酵母(Candida albicans)、艱難梭菌(Clostridium difficile)、索氏梭菌(Clostridium sordellii)、產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)、陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)、糞腸球菌(Enterococcus faecaelis)、屎腸球菌(Enterococcus faecium)、大腸桿菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、KPC抗性基因、侵肺軍團(tuán)菌(Legionella pneumophila)、mecA抗性基因、mecC抗性基因、卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、膿腫分枝桿菌(Mycobacterium abscessus)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、金黃色葡萄球菌(萬古霉素抗性)VRSA、無乳鏈球菌(Strep B)(Streptococcus agalactiae(Strep B))、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumonia)、肺炎鏈球菌(青霉素敏感性)、釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)、vanA抗性基因、vanB抗性基因、腺病毒B(Adenovirus B)、腺病毒C(Adenovirus C)、腺病毒E、博卡病毒1+3(Bocavirus 1+3)、博卡病毒2+4、副百日咳博德特氏菌(Bordetella parapertussis)、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、肺炎衣原體(Chlamydia pneumonia)、索氏梭菌、冠狀病毒229E(Coronavirus 229E)、冠狀病毒HKU1、冠狀病毒MERS、冠狀病毒NL63、冠狀病毒OC43、人偏肺病毒A(Human metapneumovirus A)、人偏肺病毒B、甲型流感-MP(Influenza A–MP)、乙型流感-MP(Influenza B–MP)、流感H1N1(2009)、流感H1N1(季節(jié)性)、流感H3N2、流感H5N1、流感H7N9(HA基因)、流感H7N9(NA基因)、麻疹病毒(measles virus)、腮腺炎病毒(mumps virus)、結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)、肺炎支原體(Mycoplasma pneumonia)、副流感1(Parainfluenza 1)、副流感2、副流感3、副流感4a、副流感4b、人呼吸道合胞病毒A(RSV A)(Respiratory syncytial virus A(RSV A))、人呼吸道合胞病毒B(RSV B)、鼻病毒A(Rhinovirus A)、鼻病毒B、鼻病毒C、風(fēng)疹病毒(rubella virus)、釀膿鏈球菌、白假絲酵母、砂眼衣原體(Chlamydia trachomatis)、人乳頭瘤病毒(human papilloma virus)、HPV 16、HPV 18、HSV-1/2、生殖道支原體(mycoplasma genitalium)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)、蒼白密螺旋體(梅毒)(Treponema pallidum(syphilis))、陰道毛滴蟲(Trichomonas vaginalis)、水痘-帶狀皰疹病毒(Varicella-zoster virus)、EB病毒(Epstein-Barr Virus)、甲型肝炎(Hepatitis A)、乙型肝炎(Hepatitis B)、丙型肝炎(Hepatitis C)、丁型肝炎(Hepatitis D)、HIV、HIV-1組M、HIV-1組O1、HIV-1組O3、HIV-2組A、HIV-2組B、人型支原體(Mycoplasma hominis)、奇異變形菌(Proteus mirabilis)、彭氏變形菌(Proteus penneri)、普通變形菌(Proteus vulgaris)、腐生葡萄球菌(S.saprophyticus)、解脲支原體(Ureaplasma urealyticum)、炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)、鼠疫耶爾森氏菌(Yersina pestis)、登革病毒(Dengue virus)、瘧原蟲(Plasmodium)、克氏錐蟲(錐蟲病)(Tryponosoma cruzi(chagas))、西尼羅病毒1(West Nile Virus 1)、西尼羅病毒2、諾如病毒譜系1(Norovirus lineage 1)、諾如病毒譜系2、埃博拉病毒(Ebola virus)。在實(shí)施方式中，可使用本文提供的方法針對來自受試者的單一樣品測定1、2、3、5、10、20、30、50個(gè)或更多個(gè)這樣的病原體或其特征。在實(shí)施方式中，在2014年9月5日提交的國際申請?zhí)朠CT/US2014/54424或2014年5月20日提交的美國臨時(shí)專利申請?zhí)?2/001,050中描述的任何基于核酸擴(kuò)增的測定或測定組，可使用本文所述的核酸擴(kuò)增方法進(jìn)行，這些申請通過引用以全文并入于此用于所有目的。類似地，在國際申請?zhí)朠CT/US2014/54424或美國臨時(shí)專利申請?zhí)?2/001,050中描述的任何病原體或其特征可采用本文提供的核酸擴(kuò)增方法進(jìn)行測定。

在實(shí)施方式中，流感組可以使用本文提供的用于從一個(gè)或多個(gè)流感菌株擴(kuò)增核酸的方法來進(jìn)行。例如，使用本文提供的方法可以從甲型流感、甲型流感H3N2、甲型流感H5N1、甲型流感H7N9-HA基因、甲型流感H7N9-NA基因或乙型流感中的一個(gè)或多個(gè)擴(kuò)增一個(gè)或多個(gè)核酸。可以使用本文提供的方法進(jìn)行的其他組包括，例如，呼吸組、性傳播疾病組、血源性病原體組或醫(yī)源性感染組。這些組中的任何一個(gè)可包括針對至少2、3、4、5、10、15或20個(gè)不同的病原體或基因的測定。

在實(shí)施方式中，本文提供的方法和組合物可用于甲型流感病毒檢測和亞型分型。甲型流感亞型由以下兩種病毒基因的類型確定：血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)。目前有18種已知的HA基因(H1-H18)和11種已知的NA基因(N1-N11)。這些基因在甲型流感病毒中的不同分子上編碼，因而甲型流感亞型可能攜帶不同HA和NA基因的任何組合。為了準(zhǔn)確地對甲型流感病毒進(jìn)行檢測和分型，可能需要測試可能含有或已知含有甲型流感病毒的樣品的至少兩種至高達(dá)全部18種已知的HA基因和至少兩種至高達(dá)全部11種已知的NA基因。在實(shí)施方式中，來自受試者的單一樣品可被分成兩個(gè)或更多個(gè)部分，并且這些部分可在本文提供的反應(yīng)條件下與具有對于所述18種已知HA基因和11種已知NA基因中的每一種為特異性的模板結(jié)合區(qū)的引物對(即29個(gè)不同的引物對)一起溫育。在實(shí)施方式中，來自受試者的單一樣品可被分成至少29個(gè)不同的部分，其中第一部分在本文提供的反應(yīng)條件下與具有對于H1為特異性的模板結(jié)合區(qū)的引物對一起溫育，其中第二部分在本文提供的反應(yīng)條件下與具有對于H2為特異性的模板結(jié)合區(qū)的引物對一起溫育，其中第三部分在本文提供的反應(yīng)條件下與具有對于H3為特異性的模板結(jié)合區(qū)的引物對一起溫育，其中第四部分在本文提供的反應(yīng)條件下與具有對于H4為特異性的模板結(jié)合區(qū)的引物對一起溫育，其中第五部分在本文提供的反應(yīng)條件下與具有對于H5為特異性的模板結(jié)合區(qū)的引物對一起溫育，其中第六部分在本文提供的反應(yīng)條件下與具有對于H6為特異性的模板結(jié)合區(qū)的引物對一起溫育，其中第七部分在本文提供的反應(yīng)條件下與具有對于H7為特異性的模板結(jié)合區(qū)的引物對一起溫育，其中第八部分在本文提供的反應(yīng)條件下與具有對于H8為特異性的模板結(jié)合區(qū)的引物對一起溫育，其中第九部分在本文提供的反應(yīng)條件下與具有對于H9為特異性的模板結(jié)合區(qū)的引物對一起溫育，其中第十部分在本文提供的反應(yīng)條件下與具有對于H10為特異性的模板結(jié)合區(qū)的引物對一起溫育，其中第十一部分在本文提供的反應(yīng)條件下與具有對于H11為特異性的模板結(jié)合區(qū)的引物對一起溫育，其中第十二部分在本文提供的反應(yīng)條件下與具有對于H12為特異性的模板結(jié)合區(qū)的引物對一起溫育，其中第十三部分在本文提供的反應(yīng)條件下與具有對于H13為特異性的模板結(jié)合區(qū)的引物對一起溫育，其中第十四部分在本文提供的反應(yīng)條件下與具有對于H14為特異性的模板結(jié)合區(qū)的引物對一起溫育，其中第十五部分在本文提供的反應(yīng)條件下與具有對于H15為特異性的模板結(jié)合區(qū)的引物對一起溫育，其中第十六部分在本文提供的反應(yīng)條件下與具有對于H16為特異性的模板結(jié)合區(qū)的引物對一起溫育，其中第十七部分在本文提供的反應(yīng)條件下與具有對于H17為特異性的模板結(jié)合區(qū)的引物對一起溫育，其中第十八部分在本文提供的反應(yīng)條件下與具有對于H18為特異性的模板結(jié)合區(qū)的引物對一起溫育，其中第十九部分在本文提供的反應(yīng)條件下與具有對于N1為特異性的模板結(jié)合區(qū)的引物對一起溫育，其中第二十部分在本文提供的反應(yīng)條件下與具有對于N2為特異性的模板結(jié)合區(qū)的引物對一起溫育，其中第二十一部分在本文提供的反應(yīng)條件下與具有對于N3為特異性的模板結(jié)合區(qū)的引物對一起溫育，其中第二十二部分在本文提供的反應(yīng)條件下與具有對于N4為特異性的模板結(jié)合區(qū)的引物對一起溫育，其中第二十三部分在本文提供的反應(yīng)條件下與具有對于N5為特異性的模板結(jié)合區(qū)的引物對一起溫育，其中第二十四部分在本文提供的反應(yīng)條件下與具有對于N6為特異性的模板結(jié)合區(qū)的引物對一起溫育，其中第二十五部分在本文提供的反應(yīng)條件下與具有對于N7為特異性的模板結(jié)合區(qū)的引物對一起溫育，其中第二十六部分在本文提供的反應(yīng)條件下與具有對于N8為特異性的模板結(jié)合區(qū)的引物對一起溫育，其中第二十七部分在本文提供的反應(yīng)條件下與具有對于N9為特異性的模板結(jié)合區(qū)的引物對一起溫育，其中第二十八部分在本文提供的反應(yīng)條件下與具有對于N10為特異性的模板結(jié)合區(qū)的引物對一起溫育，并且其中第二十九部分在本文提供的反應(yīng)條件下與具有對于N11為特異性的模板結(jié)合區(qū)的引物對一起溫育。在一些實(shí)施方式中，如本文其他地方所述，針對2、3、4、5個(gè)或更多個(gè)不同的HA或NA亞型的引物對可以與來自受試者的樣品的單一部分一起溫育(例如在常規(guī)容器中)，并且可以使用序列特異性探針(例如DNA探針或PNA探針)鑒定擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物。在實(shí)施方式中，可以進(jìn)行一組(panel)，其中單一樣品用于以針對至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25個(gè)或全部上述29個(gè)HA和NA亞型的引物對進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。在實(shí)施方式中，組(panel)可包括用來擴(kuò)增H1、H2、H3、H5、H7或N9中的一個(gè)或多個(gè)的反應(yīng)。在實(shí)施方式中，本文所述的用于檢測甲型流感或其亞型的組或方法可進(jìn)一步包括用來檢測例如甲型流感基質(zhì)蛋白基因(它存在于全部甲型流感亞型中，從而可用于鑒定樣品中的甲型流感)、人RNA酶P(以確保從人類受試者中充足地收集樣品；對于非人類受試者，可以使用其他合適的物種特異性對照基因)或摻加核酸對照的試劑或反應(yīng)，該摻加核酸對照可在樣品收集或處理步驟的過程中的一個(gè)或多個(gè)時(shí)間點(diǎn)添加，以便確保充分的樣品收集或處理。在實(shí)施方式中，可提供試劑盒來進(jìn)行以上提供的任何方法或任何組。

在實(shí)施方式中，與可能使用其他核酸擴(kuò)增方法(例如PCR或LAMP)采用一對引物進(jìn)行擴(kuò)增相比，通過使用本文提供的方法，可以使用一對引物來擴(kuò)增更多種類的靶核酸序列。例如，在實(shí)施方式中，本文提供的引物的模板結(jié)合區(qū)可與模板充分退火，以根據(jù)本文提供的方法擴(kuò)增該模板，即使當(dāng)引物的模板結(jié)合區(qū)與模板之間具有1、2、3、4、5個(gè)或更多個(gè)核苷酸錯(cuò)配時(shí)。在實(shí)施方式中，當(dāng)在本文提供的方法中使用的至少第一引物和任選的第二引物的模板結(jié)合區(qū)中至少6％、8％、10％、12％、14％、16％、18％、20％、22％或24％的核苷酸不與模板序列中的相應(yīng)核苷酸互補(bǔ)時(shí)，可進(jìn)行本文提供的方法。因此，本文提供的引物和方法的使用可有助于用同一對引物擴(kuò)增多個(gè)類似但不同的序列。例如，本文提供的引物和方法可用于檢測甲型流感的多個(gè)不同的菌株，其中所述菌株具有類似但不同的核苷酸序列。例如，可能有甲型流感的兩個(gè)不同的菌株，其中這兩個(gè)菌株均被確定為H1N1亞型，但所述菌株具有略微不同的H1或N1核苷酸序列。在實(shí)施方式中，使用本文提供的組合物和方法，第一菌株和第二菌株均可使用相同的引物對得到擴(kuò)增。

此外，可基于病原體的核酸中的高度保守區(qū)選擇用于從病原體中擴(kuò)增核酸的引物，以進(jìn)一步幫助根據(jù)本文提供的方法采用相同引物對檢測病原體的多個(gè)不同的菌株。這樣的高度保守區(qū)可通過例如在病原體的多個(gè)菌株之間的感興趣的基因的序列比對來鑒定。例如，Genbank ID號(hào)為AEK98400、ABG47862、AEO00689、ABF17954、AFG99237、AFG99027、ABO33069、ABE12623、AFG72790、AAA87553、AAZ38605、AFN19700、ABB04371、ABC39805的HA3序列來自H3N2甲型流感病毒的不同隔離群。這些HA3基因各自具有略微不同的核苷酸序列。盡管如此，通過細(xì)心選擇引物，可根據(jù)本文提供的方法采用同一組引物擴(kuò)增全部這些HA3基因。例如，根據(jù)本文提供的方法可選擇以5’-3’順序具有序列AACCTCACTACGTAAGTCTTGACGTAAACGGTTACCCACGTAGACTAGAGTAATAACTCGAAAAGGGT(SEQ ID NO:91)的HA3基因的一部分作為擴(kuò)增靶標(biāo)(該序列以DNA形式，而非RNA形式提供)。以5’至3’方向描述該序列，第一下劃線序列是模板的第二部分，第二下劃線序列是內(nèi)部基序，第三下劃線序列是模板的第一部分，如這些術(shù)語在例如圖10中使用一樣。在這個(gè)和其他這樣的實(shí)例中，可以選擇用于擴(kuò)增的總靶序列以及充當(dāng)模板的第一部分、模板的第二部分和內(nèi)部基序的特定序列，使得如本文所述的引物可用于根據(jù)本文提供的方法成功地?cái)U(kuò)增范圍廣泛的相關(guān)序列。在實(shí)施方式中，可提供如本文所述的第一引物，其中該引物的模板結(jié)合區(qū)與以上模板的第一部分互補(bǔ)，并且可以提供如本文所述的第二引物，其中該引物的模板結(jié)合區(qū)與同該模板的第二部分互補(bǔ)的配偶體序列互補(bǔ)。任選地，所述引物可進(jìn)一步具有與內(nèi)部基序或其互補(bǔ)序列互補(bǔ)的尾區(qū)。這樣的引物可在例如本文提供的組合物或方法中提供。

采用本文提供的方法，可以在樣品或反應(yīng)混合物中在低至例如小于1000、500、100、50、10、5、2或1個(gè)拷貝/微升的濃度下明確鑒定病原體或基因。在實(shí)施方式中，本文提供的方法可從一種類型的病原體或基因特異性地?cái)U(kuò)增核酸，并且不從相關(guān)的病原體或基因擴(kuò)增核酸。例如，本文提供的用于擴(kuò)增甲型流感基質(zhì)蛋白基因的試驗(yàn)可從甲型流感的多個(gè)不同菌株中擴(kuò)增該基因，但不從乙型流感中擴(kuò)增遺傳物質(zhì)。

在實(shí)施方式中，本文提供的方法可在一種或多種潛在干擾性物質(zhì)的存在下成功進(jìn)行。潛在干擾性物質(zhì)的實(shí)例包括BSA、葡萄糖、膽紅素、亞硝酸鹽、β-hCG、丙酮、低pH條件、高pH條件、醋氨酚、阿司匹林、黃體酮、炔雌醇、尿防腐劑、精液、人體潤滑劑、避孕凝膠劑、殺精劑、女性粉劑、痔瘡乳膏、咪康唑、人類基因組DNA、洗劑、通用轉(zhuǎn)運(yùn)培養(yǎng)基(病毒的)、艾米斯(amies)轉(zhuǎn)運(yùn)培養(yǎng)基(細(xì)菌的)、血液、粘蛋白、阿昔洛韋、冷皰治療、尿、糞便、血紅蛋白、甘油三酯、EDTA、肝素、膽固醇、γ-球蛋白、氨芐青霉素、煙堿、可替寧、噴鼻劑、滴鼻劑或它們的任意組合。在實(shí)施方式中，本文提供的方法可在潛在干擾性物質(zhì)的存在下進(jìn)行，該物質(zhì)的濃度可達(dá)至少與2014年5月20日提交的美國臨時(shí)專利申請?zhí)?2/001,050中提供的一樣大，該申請通過引用并入于此用于所有目的。在實(shí)施方式中，本文提供的方法可在潛在干擾性物質(zhì)的存在下進(jìn)行，該物質(zhì)的濃度可達(dá)比美國臨時(shí)專利申請?zhí)?2/001,050中提供的大至少10％、25％、50％或100％。

本文公開的測定和方法可在用于處理樣品的裝置或系統(tǒng)上執(zhí)行。本文公開的測定和方法可容易地并入用于處理樣品的裝置或用于處理樣品的系統(tǒng)中并在其中使用，該裝置或系統(tǒng)可以是自動(dòng)化的測定裝置或者可以是自動(dòng)化的測定系統(tǒng)。這樣的裝置以及這樣的系統(tǒng)可用于實(shí)施本文公開的方法。例如，裝置可用于接收樣品。裝置可用于制備或用于處理樣品。裝置可用于對樣品進(jìn)行測定。裝置可用于從樣品獲得數(shù)據(jù)。裝置可用于傳送從樣品中獲得的數(shù)據(jù)。裝置可用于處理或測定樣品之后處置樣品。

裝置可以是系統(tǒng)的一部分，該系統(tǒng)的組件可以是樣品處理裝置。裝置可以是樣品處理裝置。樣品處理裝置可配置為促進(jìn)樣品的采集、制備用于臨床檢驗(yàn)的樣品或執(zhí)行使用一種或多種試劑的方法，如本文所公開的。樣品處理裝置可配置為從樣品獲得數(shù)據(jù)。樣品處理裝置可配置為傳送從樣品中獲得的數(shù)據(jù)。樣品處理裝置可配置為分析來自樣品的數(shù)據(jù)。樣品處理裝置可配置為與另一裝置或?qū)嶒?yàn)室或附屬于實(shí)驗(yàn)室的個(gè)體通信，以分析從樣品中獲得的數(shù)據(jù)。

樣品處理裝置可配置為放置在受試者體內(nèi)或受試者上。樣品處理裝置可配置為直接或間接地接納來自受試者的樣品。樣品可以是，例如，血液樣品(例如，由手指針刺或由靜脈穿刺獲得的樣品或動(dòng)脈血樣品)、尿液樣品、活檢樣品、組織切片、糞便樣品或其他生物樣品；水樣品、土壤樣品、食物樣品、空氣樣品；或其他樣品。血液樣品可以包括，例如，全血、血漿或血清。樣品處理裝置可通過裝置的外殼接收來自受試者的樣品。樣品采集可發(fā)生在樣品采集地點(diǎn)或其他地方。可在樣品采集地點(diǎn)向裝置提供樣品。

在一些實(shí)施方式中，樣品處理裝置可配置為接收或容納筒匣。在一些實(shí)施方式中，樣品處理裝置可包含筒匣。該筒匣可從樣品處理裝置中移除。在一些實(shí)施方式中，可向樣品處理裝置的筒匣提供樣品?；蛘?，可向樣品處理裝置的另一部分提供樣品。筒匣和/或裝置可包含可配置為容納樣品的樣品采集單元。

筒匣可包含樣品，并可包含用于在處理或測試樣品中使用的試劑、用于在處理或測試樣品中使用的一次性用品或其他材料。筒匣可包含本文公開的用于執(zhí)行本文公開的方法的試劑。將筒匣放置在樣品處理裝置上或?qū)⑼蚕徊迦霕悠诽幚硌b置之后，筒匣的一個(gè)或多個(gè)組件可與樣品處理裝置的其他組件流體連通。例如，如果樣品在筒匣收集，則樣品可轉(zhuǎn)移至樣品處理裝置的其他部分。類似地，如果在筒匣上提供了一種或多種試劑，則該試劑可轉(zhuǎn)移至樣品處理裝置的其他部分，或者樣品處理裝置的其他組件可得到該試劑。在一些實(shí)施方式中，筒匣的試劑或組件可保持在筒匣上。在一些實(shí)施方式中，不包含需要裝管或需要維護(hù)(例如，人工或自動(dòng)維護(hù))的流體元件。

樣品或試劑可轉(zhuǎn)移至裝置，諸如樣品處理裝置。樣品或試劑可在裝置內(nèi)轉(zhuǎn)移。樣品或試劑的這種轉(zhuǎn)移可在不提供從筒匣到裝置的連續(xù)流體途徑的情況下完成。樣品或試劑的這種轉(zhuǎn)移可在不提供裝置內(nèi)的連續(xù)流體途徑的情況下完成。在實(shí)施方式中，樣品或試劑的這種轉(zhuǎn)移可以通過樣品處理系統(tǒng)(例如移液管)來完成；例如，樣品、試劑或其等分試樣可被吸入頂端開放的轉(zhuǎn)移組件，諸如移液管尖端，該轉(zhuǎn)移組件可以可操作地連接到樣品處理系統(tǒng)，該樣品處理系統(tǒng)將該尖端以及包含在該尖端內(nèi)的樣品、試劑或其等分試樣一起轉(zhuǎn)移至樣品處理裝置之上或之內(nèi)的位置。樣品、試劑或其等分試樣可放置在樣品處理裝置之上或之內(nèi)的位置。樣品和試劑或多種試劑可使用樣品處理系統(tǒng)以相似的方式進(jìn)行混合。筒匣的一個(gè)或多個(gè)組件可以以自動(dòng)化方式轉(zhuǎn)移至樣品處理裝置的其他部分，反之亦然。

裝置，諸如樣品處理裝置，可具有流體處理系統(tǒng)。流體處理系統(tǒng)可進(jìn)行或可幫助進(jìn)行運(yùn)輸、稀釋、提取、等分、混合以及對于流體如樣品的其他操作。在一些實(shí)施方式中，流體處理系統(tǒng)可包含在裝置外殼內(nèi)。流體處理系統(tǒng)可允許流體的采集、遞送、處理和/或運(yùn)輸，干燥試劑的溶解，液體和/或干燥試劑與液體的混合，以及非流體組分、樣品或材料的采集、遞送、處理和/或運(yùn)輸。該流體可以是樣品、試劑、稀釋液、洗液、染料或可被裝置使用的任何其他流體，并且可以包括但不限于均勻流體、不同的液體、乳液、懸浮液和其他流體。流體處理系統(tǒng)(包括但不限于移液管)還可用于在裝置周圍運(yùn)輸容器(其中含有或不含有流體)。流體處理系統(tǒng)可分配或抽吸流體。樣品可包含漂浮在流體內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)微粒或固體物質(zhì)。

在實(shí)施方式中，流體處理系統(tǒng)可包含移液管、移液管尖端、注射器、毛細(xì)管或其他組件。流體處理系統(tǒng)可具有含內(nèi)表面和外表面以及開放端的部分。流體處理系統(tǒng)可包括移液管(其可包含移液管主體和移液管的管嘴)并且可包括移液管尖端。移液管尖端可以從或不可以從移液管管嘴上拆除。在實(shí)施方式中，流體處理系統(tǒng)可使用與移液管尖端配對的移液管；移液管尖端可以是一次性的。尖端在與移液管配對時(shí)，可形成流體密封。移液管尖端可使用一次、兩次或更多次。在實(shí)施方式中，流體處理系統(tǒng)可使用具有或不具有移液管尖端的移液管或相似裝置來抽吸、分配、混合、運(yùn)輸或以其他方式處理流體。需要時(shí)，可從流體處理系統(tǒng)分配流體。在從例如移液管尖端的孔口中分配之前流體可包含在移液管尖端內(nèi)。在實(shí)施方式或情況中，在使用期間，可分配全部流體；在其他實(shí)施方式或情況中，在使用期間，可分配尖端內(nèi)流體的一部分。移液管可選擇性地抽吸流體。移液管可抽吸所選量的流體。移液管可以能夠致動(dòng)攪拌機(jī)構(gòu)以混合尖端或容器內(nèi)的流體。移液管可合并尖端或容器，從而產(chǎn)生連續(xù)的流動(dòng)回路以用于包括非液體形式的材料或試劑的混合。移液管尖端還可通過多個(gè)流體的同時(shí)或順序計(jì)量遞送來促進(jìn)混合，諸如在兩段式底物反應(yīng)中。

流體處理系統(tǒng)可包括一個(gè)或多個(gè)流體隔離的或液壓獨(dú)立的單元。例如，流體處理系統(tǒng)可包含一個(gè)、兩個(gè)或更多個(gè)移液管尖端。移液管尖端可被配置為接納并限制流體。尖端可以是彼此流體隔離或彼此液壓獨(dú)立的。包含在每個(gè)尖端內(nèi)的流體可以與其他尖端內(nèi)的流體以及與裝置內(nèi)的其他流體為流體隔離或液壓獨(dú)立的。流體隔離或液壓獨(dú)立的單元可以是相對于裝置的其他部分和/或彼此可移動(dòng)的。流體隔離或液壓獨(dú)立的單元可以是單獨(dú)可移動(dòng)的。流體處理系統(tǒng)可以包含一個(gè)或多個(gè)基部或支持體。基部或支持體可支持一個(gè)或多個(gè)移液管或移液管單元?；炕蛑С煮w可將流體處理系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)移液管彼此連接。

樣品處理裝置可配置為對從受試者獲得的樣品執(zhí)行處理步驟或操作。樣品處理可包括樣品制備，包括，例如，樣品稀釋、將樣品分為等分試樣、提取、與試劑接觸、過濾、分離、離心或其他的預(yù)備或處理操作或步驟。樣品處理裝置可配置為對樣品執(zhí)行一個(gè)或多個(gè)樣品制備操作或步驟。任選地，樣品可制備用于化學(xué)反應(yīng)和/或物理處理步驟。樣品制備操作或步驟可包括以下的一個(gè)或多個(gè)：離心、分離、過濾、稀釋、富集、純化、沉淀、溫育、移液、運(yùn)輸、色譜分析、細(xì)胞裂解、細(xì)胞計(jì)數(shù)、粉碎、研磨、活化、超聲處理、微柱處理、用磁珠處理、用納米顆粒處理或其他樣品制備操作或步驟。例如，樣品制備可包括將血液分離為血清和/或微粒部分或者將任何其他樣品分離為各個(gè)組分的一個(gè)或多個(gè)步驟。樣品制備可包括稀釋和/或濃縮樣品如血液樣品或其他生物樣品的一個(gè)或多個(gè)步驟。樣品制備可包括向樣品中加入抗凝劑或其他成分。樣品制備還可包括樣品的純化。在實(shí)施方式中，所有的樣品處理、制備或測定操作或步驟均由單一裝置執(zhí)行。在實(shí)施方式中，所有的樣品處理、制備或測定操作或步驟均在單一裝置的外殼內(nèi)執(zhí)行。在實(shí)施方式中，大多數(shù)的樣品處理、制備或測定操作或步驟由單一裝置執(zhí)行，并且可在單一裝置的外殼內(nèi)執(zhí)行。在實(shí)施方式中，許多的樣品處理、制備或測定操作或步驟由單一裝置執(zhí)行，并且可在單一裝置的外殼內(nèi)執(zhí)行。在實(shí)施方式中，樣品處理、制備或測定操作或步驟可由多于一個(gè)裝置執(zhí)行。

樣品處理裝置可配置為對樣品運(yùn)行一個(gè)或多個(gè)測定，并從該樣品獲得數(shù)據(jù)。樣品處理裝置可執(zhí)行本文提供的方法以及附加的測定。測定可包括一種或多種物理或化學(xué)處理，并可包括運(yùn)行一個(gè)或多個(gè)化學(xué)或物理反應(yīng)。樣品處理裝置可配置為對體液的小樣品執(zhí)行一個(gè)、兩個(gè)或更多個(gè)測定。可在具有一定體積的樣品上進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)化學(xué)反應(yīng)，如本文其他地方所述。例如，可在具有小于飛升(femtoliter)體積的丸劑中進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)化學(xué)反應(yīng)。在實(shí)例中，樣品采集單元被配置為接收相當(dāng)于單滴或更少的血液或間質(zhì)液體積的體液樣品。在實(shí)施方式中，樣品的體積可以是小體積，其中小體積可以是小于約1000μL、或小于約500μL、或小于約250μL、或小于約150μL、或小于約100μL、或小于約75μL、或小于約50μL、或小于約40μL、或小于約20μL、或小于約10μL、小于約5μL、小于約1μL、小于約0.5μL、小于約0.1μL的體積或其他的小體積。在實(shí)施方式中，對單一樣品執(zhí)行全部的樣品測定操作或步驟。在實(shí)施方式中，所有的樣品測定操作或步驟均由單一裝置執(zhí)行。在實(shí)施方式中，所有的樣品測定操作或步驟均在單一裝置的外殼內(nèi)執(zhí)行。在實(shí)施方式中，大多數(shù)的樣品測定操作或步驟由單一裝置執(zhí)行，并且可在單一裝置的外殼內(nèi)執(zhí)行。在實(shí)施方式中，許多的樣品測定操作或步驟由單一裝置執(zhí)行，并且可在單一裝置的外殼內(nèi)執(zhí)行。在實(shí)施方式中，樣品處理、制備或測定操作或步驟可由多于一個(gè)裝置執(zhí)行。

樣品處理裝置可配置為對樣品進(jìn)行多個(gè)測定。在一些實(shí)施方式中，樣品處理裝置可以配置為執(zhí)行本文提供的方法以及一個(gè)、兩個(gè)或更多個(gè)附加測定。在實(shí)施方式中，樣品處理裝置可配置為對單一樣品進(jìn)行多個(gè)測定。在實(shí)施方式中，樣品處理裝置可配置為對單一樣品進(jìn)行多個(gè)測定，其中該樣品是小樣品。例如，小樣品可以具有為小于約1000μL、或小于約500μL、或小于約250μL、或小于約150μL、或小于約100μL、或小于約75μL、或小于約50μL、或小于約40μL、或小于約20μL、或小于約10μL、小于約5μL、小于約1μL、小于約0.5μL、小于約0.1μL的小體積或其他小體積的樣品體積。樣品處理裝置可以能夠?qū)我粯悠愤M(jìn)行多重測定。多個(gè)測定可同時(shí)運(yùn)行；可按順序運(yùn)行；或者一些測定可同時(shí)運(yùn)行而其他測定按順序運(yùn)行。一個(gè)或多個(gè)對照測定和/或校準(zhǔn)物(例如，包括具有用于測定/測試的校準(zhǔn)物的對照的配置)也可并入裝置中；對照測定和對校準(zhǔn)物的測定可與對樣品進(jìn)行的測定同時(shí)進(jìn)行，或可在對樣品進(jìn)行的測定之前或之后進(jìn)行，或以其任何組合方式進(jìn)行。在實(shí)施方式中，所有的樣品測定操作或步驟均由單一裝置執(zhí)行。在實(shí)施方式中，全部多個(gè)樣品測定操作或步驟均在單一裝置的外殼內(nèi)執(zhí)行。在實(shí)施方式中，多個(gè)測定中的大多數(shù)的樣品測定操作或步驟由單一裝置執(zhí)行，并且可在單一裝置的外殼內(nèi)執(zhí)行。在實(shí)施方式中，多個(gè)測定中的許多的樣品測定操作或步驟由單一裝置執(zhí)行，并且可在單一裝置的外殼內(nèi)執(zhí)行。在實(shí)施方式中，樣品處理、制備或測定操作或步驟可由多于一個(gè)裝置執(zhí)行。

在實(shí)施方式中，全部多個(gè)測定可在短的時(shí)間段內(nèi)進(jìn)行。在實(shí)施方式中，這樣的短的時(shí)間段包括少于約三小時(shí)、或少于約兩小時(shí)、或少于約一小時(shí)、或少于約40分鐘、或少于約30分鐘、或少于約25分鐘、或少于約20分鐘、或少于約15分鐘、或少于約10分鐘、或少于約5分鐘、或少于約4分鐘、或少于約3分鐘、或少于約2分鐘、或少于約1分鐘或其他短的時(shí)間段。

樣品處理裝置可配置為檢測與樣品相關(guān)的一種或多種信號(hào)。樣品處理裝置可配置為鑒定樣品的一個(gè)或多個(gè)特性。例如，樣品處理裝置可配置為檢測樣品中一種分析物(例如靶核酸)或多種分析物或疾病狀況的存在或濃度(例如，在體液、分泌物、組織或其他樣品中或通過體液、分泌物、組織或其他樣品)。或者，樣品處理裝置可配置為檢測一種或多種可被分析以檢測樣品中一種或多種分析物(其可以指示疾病狀況)或疾病狀況的存在或濃度的信號(hào)。信號(hào)可在裝置上或另一位置進(jìn)行分析。運(yùn)行臨床檢驗(yàn)可以包括或可以不包括對收集的數(shù)據(jù)的任何分析或比較。

可在有或沒有樣品的情況下進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)或其他處理步驟?？捎裳b置制備或運(yùn)行的步驟、測試或測定的實(shí)例可包括但不限于，免疫測定、核酸測定(例如本文所提供的方法)、基于受體的測定、細(xì)胞計(jì)數(shù)測定、比色測定、酶測定、電泳測定、電化學(xué)測定、光譜測定、色譜測定、顯微測定、地形測定(topographic assay)、量熱測定、濁度測定、凝集測定、放射性同位素測定、粘度測定、凝聚測定、凝固時(shí)間測定、蛋白質(zhì)合成測定、組織學(xué)測定、培養(yǎng)測定、摩爾滲透壓濃度測定和/或其他類型的測定，離心、分離、過濾、稀釋、富集、純化、沉淀、粉碎、溫育、移液、運(yùn)輸、細(xì)胞裂解或其他樣品制備操作或步驟或其組合。可由裝置制備或運(yùn)行的步驟、測試或測定可包括成像，包括顯微鏡檢查、細(xì)胞計(jì)數(shù)以及制備或使用圖像的其他技術(shù)?？捎裳b置制備或運(yùn)行的步驟、測試或測定可進(jìn)一步包括對樣品的組織學(xué)、形態(tài)學(xué)、運(yùn)動(dòng)學(xué)、動(dòng)力學(xué)和/或狀態(tài)的評(píng)估，該評(píng)估可包括對細(xì)胞的這種評(píng)估。

裝置可以能夠在短的時(shí)間量內(nèi)進(jìn)行所有的機(jī)載步驟(例如，由單一裝置執(zhí)行的步驟或操作)。裝置可以能夠在短的時(shí)間量內(nèi)對單一樣品進(jìn)行所有的機(jī)載步驟。例如，從受試者樣品采集到傳輸數(shù)據(jù)和/或分析可能花費(fèi)約3小時(shí)或更少、2小時(shí)或更少、1小時(shí)或更少、50分鐘或更少、45分鐘或更少、40分鐘或更少、30分鐘或更少、20分鐘或更少、15分鐘或更少、10分鐘或更少、5分鐘或更少、4分鐘或更少、3分鐘或更少、2分鐘或更少、或1分鐘或更少的時(shí)間。從將樣品接納在裝置內(nèi)到傳輸數(shù)據(jù)和/或關(guān)于這樣的樣品的裝置分析的時(shí)間量可能依賴于對樣品執(zhí)行的步驟、測試或測定的類型或數(shù)目。從將樣品接納在裝置內(nèi)到傳輸數(shù)據(jù)和/或關(guān)于這樣的樣品的裝置分析的時(shí)間量可能花費(fèi)約3小時(shí)或更少、2小時(shí)或更少、1小時(shí)或更少、50分鐘或更少、45分鐘或更少、40分鐘或更少、30分鐘或更少、20分鐘或更少、15分鐘或更少、10分鐘或更少、5分鐘或更少、4分鐘或更少、3分鐘或更少、2分鐘或更少或1分鐘或更少的時(shí)間。

裝置可配置為準(zhǔn)備樣品以供處置或配置為在樣品的處理或測定后處置樣品，諸如生物樣品。

在實(shí)施方式中，樣品處理裝置可配置為傳送從樣品獲得的數(shù)據(jù)。在實(shí)施方式中，樣品處理裝置可配置為通過網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行通信。樣品處理裝置可包括可與網(wǎng)絡(luò)接合的通信模塊。樣品處理裝置可經(jīng)由有線連接或無線地連接至網(wǎng)絡(luò)。該網(wǎng)絡(luò)可以是局域網(wǎng)(LAN)或廣域網(wǎng)(WAN)諸如因特網(wǎng)。在一些實(shí)施方式中，該網(wǎng)絡(luò)可以是個(gè)人局域網(wǎng)。該網(wǎng)絡(luò)可包括云。樣品處理裝置可連接至網(wǎng)絡(luò)而無需中間裝置，或者可能需要中間裝置將樣品處理裝置連接至網(wǎng)絡(luò)。樣品處理裝置可以通過網(wǎng)絡(luò)與另一裝置通信，該另一裝置可以是任何類型的聯(lián)網(wǎng)裝置，包括但不限于個(gè)人計(jì)算機(jī)、服務(wù)器計(jì)算機(jī)或膝上型計(jì)算機(jī)；個(gè)人數(shù)字助理(PDA)，諸如Windows CE裝置；電話，諸如蜂窩電話、智能電話(例如，iPhone、Android、Blackberry等)或位置感知的便攜式電話(例如GPS)；漫游裝置，諸如聯(lián)網(wǎng)的漫游裝置；無線裝置，諸如無線電子郵件裝置或能夠與計(jì)算機(jī)網(wǎng)絡(luò)無線通信的其他裝置；或可以通過網(wǎng)絡(luò)而可能通信并處理電子交易的任何其他類型的網(wǎng)絡(luò)裝置。這樣的通信可包括向云計(jì)算基礎(chǔ)設(shè)施或可被其他裝置訪問的任何其他類型的數(shù)據(jù)存儲(chǔ)基礎(chǔ)設(shè)施提供數(shù)據(jù)。

樣品處理裝置可以向例如衛(wèi)生保健專業(yè)人員、健康護(hù)理專業(yè)場所諸如實(shí)驗(yàn)室或其附屬機(jī)構(gòu)提供關(guān)于樣品的數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)室、衛(wèi)生保健專業(yè)人員或受試者中的一個(gè)或多個(gè)可具有能夠接收或訪問由樣品處理裝置提供的數(shù)據(jù)的網(wǎng)絡(luò)裝置。樣品處理裝置可配置為向數(shù)據(jù)庫提供關(guān)于樣品的數(shù)據(jù)。樣品處理裝置可配置為向電子病歷系統(tǒng)、向?qū)嶒?yàn)室信息系統(tǒng)、向?qū)嶒?yàn)室自動(dòng)化系統(tǒng)或其他系統(tǒng)或軟件提供關(guān)于樣品的數(shù)據(jù)。樣品處理裝置可以以報(bào)告的形式提供數(shù)據(jù)。

實(shí)驗(yàn)室、裝置或其他實(shí)體或軟件可對關(guān)于樣品的數(shù)據(jù)進(jìn)行實(shí)時(shí)分析。軟件系統(tǒng)可進(jìn)行化學(xué)分析和/或病理分析，或者這些可分布在實(shí)驗(yàn)室、臨床以及專業(yè)或?qū)＜胰藛T的組合中。分析可包括樣品的定性和/或定量評(píng)估。數(shù)據(jù)分析可包括隨后的樣品的定性和/或定量評(píng)估。任選地，報(bào)告可基于原始數(shù)據(jù)、預(yù)處理的數(shù)據(jù)或分析的數(shù)據(jù)生成。可制作這樣的報(bào)告以便維持從樣品獲得的數(shù)據(jù)的機(jī)密性、關(guān)于從中獲得樣品的受試者的身份和其他信息、數(shù)據(jù)的分析以及其他機(jī)密信息。報(bào)告和/或數(shù)據(jù)可傳輸至衛(wèi)生保健專業(yè)人員。可向數(shù)據(jù)庫、電子病歷系統(tǒng)、向?qū)嶒?yàn)室信息系統(tǒng)、向?qū)嶒?yàn)室自動(dòng)化系統(tǒng)或其他系統(tǒng)或軟件提供由樣品處理裝置獲得的數(shù)據(jù)或?qū)@樣的數(shù)據(jù)的分析或報(bào)告。

可使用或可與本文公開的方法、組合物或其他試劑一起使用的試劑、測定、方法、試劑盒、裝置和系統(tǒng)的實(shí)例的描述和公開內(nèi)容可發(fā)現(xiàn)于，例如，美國專利8,088,593；美國專利8,380,541；2013年2月18日提交的美國專利申請序列號(hào)13/769,798；2013年2月18日提交的美國專利申請序列號(hào)13/769,779；2011年9月26日提交的美國專利申請序列號(hào)13/244,947；2012年9月25日提交的國際申請?zhí)朠CT/US2012/57155；2011年9月26日提交的美國申請序列號(hào)13/244,946；2011年9月26日提交的美國專利申請13/244,949；以及2011年9月26日提交的美國申請序列號(hào)61/673,245；2014年3月15日提交的國際申請?zhí)朠CT/US14/30034；和2014年3月15日提交的美國專利申請?zhí)?4/214,850，這些專利和專利申請的公開內(nèi)容均通過引用全文并入于此。

本申請要求2013年11月22日提交的美國臨時(shí)專利申請?zhí)?1/908,027；2014年5月20日提交的美國臨時(shí)專利申請?zhí)?2/001,050；2014年3月15日提交的美國非臨時(shí)專利申請?zhí)?4/214,850；以及2014年3月15日提交的國際專利申請?zhí)朠CT/US14/30034的權(quán)益和優(yōu)先權(quán)，其中每一個(gè)專利申請的公開內(nèi)容通過引用全文并入于此用于所有目的。2013年3月15日提交的美國臨時(shí)專利申請?zhí)?1/800,606的公開內(nèi)容也通過引用全文并入于此用于所有目的。

實(shí)施例

提供以下實(shí)施例僅僅是為了說明性目的，并非旨在以任何方式限制本發(fā)明。

實(shí)施例1-用可變尾區(qū)長度的引物擴(kuò)增模板核酸

使用如本文提供的方法擴(kuò)增靶核酸。準(zhǔn)備反應(yīng)以測定靶核酸T124A1的102核苷酸部分，其是A型流感病毒血凝素(HA3)基因(RNA分子)的464核苷酸部分。在SEQ ID NO:89中提供了T124A1的核苷酸序列。制備第一引物(“P1”)的12個(gè)變體和第二引物(“P2”)的12個(gè)變體。圖2A中提供了全部引物變體的序列。所有的引物均含有15個(gè)核苷酸長度的模板結(jié)合區(qū)。第一引物的所有變體的模板結(jié)合區(qū)的序列為：CAAACCGTACCAACC(SEQ ID NO:80)(在5’-3’方向)。第二引物的所有變體的模板結(jié)合區(qū)的序列為：ATGCGGAATGTACC(SEQ ID NO:81)(在5’-3’方向)。不同的引物變體含有范圍為8至22個(gè)核苷酸長度特別是8、9、10、11、12、13、14、15、16、18、20或22個(gè)核苷酸長度的尾區(qū)。第一引物的尾區(qū)具有堿基序列：CGCCGGATGGCTCTTGGGAAAC(SEQ ID NO:82)(在5’-3’方向)。堿基序列為22個(gè)核苷酸的長度；第一引物的較短尾區(qū)具有相同的序列，從尾區(qū)的5’端減去適當(dāng)數(shù)目的核苷酸(例如具有18個(gè)核苷酸長度的尾區(qū)的引物具有含有與堿基序列減去堿基序列的前4個(gè)核苷酸(CGCC)相同的序列的尾區(qū))。第二引物的尾區(qū)具有堿基序列：GTTTCCCAAGAGCCATCCGGCG(SEQ ID NO:83)(在5’-3’方向)。堿基序列為22個(gè)核苷酸的長度；第一引物的較短尾區(qū)具有相同的序列，從尾區(qū)的3’端減去適當(dāng)數(shù)目的核苷酸(例如具有18個(gè)核苷酸長度的尾區(qū)的引物具有含有與堿基序列減去堿基序列的最后4個(gè)核苷酸(GGCG)相同的序列的尾區(qū))。

制備150微升的反應(yīng)混合物，每一個(gè)含有：50mM乙酸鉀，20mM Tris-乙酸鹽(pH 7.9)，10mM乙酸鎂，1mM DTT，30μg牛血清白蛋白(BSA)，0.8M甜菜堿，各為1.4mM的dATP、dTTP、dGTP和dCTP，2uM59(Life Technologies)，0.8單位/μl Bst DNA聚合酶(New England BioLabs)，0.016單位/μl AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(New England Biolabs)，1單位/μl鼠核糖核酸酶抑制劑(New England Biolabs)，0.8μM的第一引物變體，0.8μM的第二引物變體以及每微升100,000個(gè)拷貝T124A1模板，并在59℃下在CFX 96Touch儀器(Bio-Rad)中溫育100分鐘。測定的轉(zhuǎn)變點(diǎn)使用采用CFX Manager軟件(Bio-Rad)的單一閾值方法來確定并示于圖2B中。X軸提供了反應(yīng)中使用的第一和第二引物的尾區(qū)的核苷酸長度，而Y軸提供了測定的轉(zhuǎn)變時(shí)間(以分鐘計(jì))。對于每一個(gè)尾區(qū)核苷酸長度，示出了兩個(gè)相鄰的條：左邊的條是含有模板的反應(yīng)的轉(zhuǎn)變時(shí)間，而右邊的條是沒有模板的反應(yīng)[“無模板對照”(“NTC”)]的轉(zhuǎn)變時(shí)間。對于超過90分鐘的轉(zhuǎn)變時(shí)間，不顯示條。如圖2B所示，在這些反應(yīng)條件下，具有8-15個(gè)核苷酸并且尤其是8-11個(gè)核苷酸的尾區(qū)的引物支持最快的轉(zhuǎn)變時(shí)間。無模板對照反應(yīng)最后顯示轉(zhuǎn)變時(shí)間；這是由于隨著時(shí)間的推移形成了背景非特異性產(chǎn)物。

實(shí)施例2-用可變尾區(qū)長度和可變模板結(jié)合區(qū)長度的引物擴(kuò)增模板核酸

使用如本文提供的方法擴(kuò)增靶核酸。準(zhǔn)備反應(yīng)以測定靶核酸T124A1，該靶核酸T124A1在上文實(shí)施例1中進(jìn)行了描述。制備兩個(gè)不同組的第一引物和第二引物對組。在第一組的引物對中，每一個(gè)引物均具有20個(gè)核苷酸長度的模板結(jié)合區(qū)(“20核苷酸模板結(jié)合區(qū)”組)。在第二組的引物對中，每一個(gè)引物均具有16個(gè)核苷酸長度的模板結(jié)合區(qū)(“16核苷酸模板結(jié)合區(qū)”組)。在各組中，制備具有8個(gè)不同尾區(qū)長度的第一和第二引物對組：7、8、9、10、11、12、14和16個(gè)核苷酸。圖3提供了針對16核苷酸模板結(jié)合區(qū)組(圖3A)和20核苷酸模板結(jié)合區(qū)組(圖3B)的不同的引物對組的核苷酸序列。在圖3A和3B中，“尾”序列指尾區(qū)，而“引物”區(qū)指引物的模板結(jié)合區(qū)。引物的序列以5’-3’方向顯示。

制備110微升的反應(yīng)混合物，每一個(gè)含有：50mM乙酸鉀，20mM Tris-乙酸鹽(pH 7.9)，10mM乙酸鎂，1mM DTT，30μg牛血清白蛋白(BSA)，0.8M甜菜堿，各為1.4mM的dATP、dTTP、dGTP和dCTP，2uM59(Life Technologies)，0.8單位/μl Bst DNA聚合酶(New England BioLabs)，0.016單位/μl AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(New England Biolabs)，1單位/μl鼠核糖核酸酶抑制劑(New England Biolabs)，0.8μM的第一引物變體，0.8μM的第二引物變體以及每微升100,000個(gè)拷貝T124A1模板，并在56℃下在CFX 96Touch儀器(Bio-Rad)中溫育100分鐘。測定的轉(zhuǎn)變點(diǎn)示于圖3C(20核苷酸模板結(jié)合區(qū)組)和3D(16核苷酸模板結(jié)合區(qū)組)中。在圖3C和3D中，X軸提供了反應(yīng)中使用的第一和第二引物的尾區(qū)的核苷酸長度，而Y軸提供了測定的轉(zhuǎn)變時(shí)間(以分鐘計(jì))。對于每一個(gè)尾區(qū)核苷酸長度，示出了兩個(gè)相鄰的條：左邊的條是含有模板的反應(yīng)的轉(zhuǎn)變時(shí)間，而右邊的條是沒有模板的反應(yīng)的轉(zhuǎn)變時(shí)間。如圖3所示，在這些反應(yīng)條件下，含有具有相對較短尾區(qū)的引物的反應(yīng)顯示了更快的轉(zhuǎn)變時(shí)間以及含模板的反應(yīng)與沒有模板的反應(yīng)的轉(zhuǎn)變時(shí)間之間的更大的分離。例如，對于16bp和20bp引物，含有具有7、8或9個(gè)核苷酸的尾區(qū)長度的引物的反應(yīng)顯示了比含有具有12、14或16個(gè)核苷酸的尾區(qū)長度的引物的反應(yīng)更快的轉(zhuǎn)變時(shí)間。

實(shí)施例3-在可變的溫度下擴(kuò)增模板核酸

使用如本文提供的方法擴(kuò)增靶核酸。準(zhǔn)備反應(yīng)以測定在上文實(shí)施例1中描述的靶核酸T124A1。第一引物“RLX0892”(序列：5’TTGGGAAACCAAACCGTACCAACC 3’)(SEQ ID NO:20)和第二引物“RLX0893”(序列：5’GTTTCCCAAATGCGGAATGTACC 3’)(SEQ ID NO:32)用于擴(kuò)增T124A1。這兩種引物均具有9核苷酸尾區(qū)，RLX0892具有15核苷酸模板結(jié)合區(qū)而RLX0893具有14核苷酸模板結(jié)合區(qū)。RLX0892的尾區(qū)為：5’TTGGGAAAC 3’(SEQ ID NO:84)而RLX0893的尾區(qū)為：5’GTTTCCCAA 3’(SEQ ID NO:85)。

制備80微升的反應(yīng)混合物，每一個(gè)含有：50mM乙酸鉀，20mM Tris-乙酸鹽(pH 7.9)，10mM乙酸鎂，1mM DTT，20μg牛血清白蛋白(BSA)，0.8M甜菜堿，各為1.4mM的dATP、dTTP、dGTP和dCTP，2uM59(Life Technologies)，0.8單位/μl Bst DNA聚合酶(New England BioLabs)，0.016單位/μl AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(New England Biolabs)，1單位/μl鼠核糖核酸酶抑制劑(New England Biolabs)，0.8μM的第一引物RLX0892，0.8μM的第二引物RLX0893以及每微升10,000、1,000、100或0個(gè)拷貝T124A1模板，并一式三份在52、52.7、54、55.9、58.4、60.3、61.4或62℃下在CFX 96Touch儀器(Bio-Rad)中溫育100分鐘。測定的轉(zhuǎn)變點(diǎn)示于圖4中。X軸提供了反應(yīng)的溫育溫度，而Y軸提供了測定的轉(zhuǎn)變時(shí)間(以分鐘計(jì))。對于各個(gè)溫度，示出了4個(gè)相鄰的條，從左至右為：10,000個(gè)拷貝模板/微升、1000個(gè)拷貝模板/微升、100個(gè)拷貝模板/微升或無模板對照。如圖4所示，在這些反應(yīng)條件下，該試驗(yàn)在52-62℃的整個(gè)溫度范圍內(nèi)在1000個(gè)拷貝模板/微升下，并且在一些溫度下在至少低至100個(gè)拷貝模板/微升的模板濃度下有效地?cái)U(kuò)增了模板。

實(shí)施例4-在人基因組DNA的存在下擴(kuò)增模板核酸

使用如本文提供的方法擴(kuò)增靶核酸。在人DNA的存在下準(zhǔn)備反應(yīng)以測定靶核酸T124A1(上文所述的)。使用第一引物“RLX0892”(上文所述的)和第二引物“RLX0893”(上文所述的)來擴(kuò)增T124A1。

制備160微升的反應(yīng)混合物，每一個(gè)含有：50mM乙酸鉀，20mM Tris-乙酸鹽(pH 7.9)，10mM乙酸鎂，1mM DTT，20μg牛血清白蛋白(BSA)，0.8M甜菜堿，各為1.4mM的dATP、dTTP、dGTP和dCTP，0.4x59(Life Technologies)，0.8單位/μl Bst DNA聚合酶(New England BioLabs)，0.016單位/μl AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(New England Biolabs)，1單位/μl鼠核糖核酸酶抑制劑(New England Biolabs)，0.8μM的第一引物RLX0892，0.8μM的第二引物RLX0893，和每微升1,000、100或0個(gè)拷貝T124A1模板，以及0、1、2.5、5或10納克的人基因組DNA，并在56℃下在CFX 96Touch儀器(Bio-Rad)中溫育100分鐘。測定的轉(zhuǎn)變點(diǎn)示于圖5中。X軸提供了反應(yīng)中人基因組DNA(“hDNA”)的量，而Y軸提供了測定的轉(zhuǎn)變時(shí)間(以分鐘計(jì))。對于hDNA的每個(gè)量，示出了4個(gè)相鄰的條，從左至右為：1000個(gè)拷貝模板/微升、100個(gè)拷貝模板/微升或無模板。如圖5所示，在這些反應(yīng)條件下，該試驗(yàn)在至少10ng hDNA的存在下在1000個(gè)拷貝模板/微升下有效地?cái)U(kuò)增了模板。而且，反應(yīng)中加入hDNA僅引起了NTC轉(zhuǎn)變時(shí)間相對較小的降低，即使在5或10ng hDNA的濃度下。

實(shí)施例5-從病毒裂解物洗脫液擴(kuò)增模板核酸

使用如本文提供的方法從含有靶標(biāo)的兩個(gè)不同樣品中擴(kuò)增靶核酸。在以下兩個(gè)樣品中制備靶核酸T124A1：1)含有分離的T124A1RNA分子(如在實(shí)施例1中的)的樣品，以及2)含有從甲型流感H3N2病毒樣品中分離的核酸的樣品。T124A1是HA3基因的一部分，并因此被預(yù)期存在于從甲型流感H3N2病毒中分離的核酸的樣品中。根據(jù)制造商的說明用Chemagic病毒DNA/RNA試劑盒(PerkinElmer)制備甲型流感病毒裂解物。通過qPCR定量兩個(gè)不同樣品中的T124A1的濃度，并且稀釋樣品以將樣品中T124A1的濃度歸一化。使用第一引物“RLX0892”和第二引物“RLX0893”擴(kuò)增T124A1。

制備25微升的反應(yīng)混合物，每一個(gè)含有：50mM乙酸鉀，20mM Tris-乙酸鹽(pH 7.9)，10mM乙酸鎂，1mM DTT，20μg牛血清白蛋白(BSA)，0.8M甜菜堿，各為1.4mM的dATP、dTTP、dGTP和dCTP，2uM59(Life Technologies)，0.8單位/μl Bst DNA聚合酶(New England BioLabs)，0.016單位/μl AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(New England Biolabs)，1單位/μl鼠核糖核酸酶抑制劑(New England Biolabs)，0.8μM的第一引物RLX0892，0.8μM的第二引物RLX0893以及每微升10,000、1000或0個(gè)拷貝T124A1模板，并在56℃下在CFX 96Touch儀器(Bio-Rad)中溫育100分鐘。測定的轉(zhuǎn)變點(diǎn)示于圖6中。X軸提供了反應(yīng)中的模板拷貝數(shù)/微升，而Y軸提供了測點(diǎn)的轉(zhuǎn)變點(diǎn)(以分鐘計(jì))。對于模板拷貝數(shù)/微升的各個(gè)量，示出了2個(gè)相鄰的條，從左至右為：分離的T124A1和甲型流感病毒裂解物。還示出了NTC的轉(zhuǎn)變點(diǎn)。如圖6中所示，在這些反應(yīng)條件下，該試驗(yàn)有效地?cái)U(kuò)增了分離的T124A1模板以及甲型流感病毒裂解物中的T124A1模板。

實(shí)施例6-模板核酸的擴(kuò)增

使用如本文提供的方法擴(kuò)增靶核酸。準(zhǔn)備反應(yīng)以測定T129D1的54核苷酸部分，其為乙型流感病毒血凝素(HA)基因(RNA分子)的298核苷酸部分。在SEQ ID NO:90中提供了T129D1的核苷酸序列。第一引物“A8”(核苷酸序列：5’TCTTGAGAGAACCCACTAAC 3’)(SEQ ID NO:86)和第二引物“B8”(核苷酸序列：5’TCTCAAGAATTTGGTCTTCC 3’)(SEQ ID NO:87)用于擴(kuò)增T129D1。在這兩種引物中，前8個(gè)核苷酸(從5’末端)是尾區(qū)，而最后的12個(gè)核苷酸是模板結(jié)合區(qū)。這些引物一起靶向T129D1的54核苷酸部分。

制備100微升的反應(yīng)混合物，其含有：50mM乙酸鉀，20mM Tris-乙酸鹽(pH 7.9)，10mM乙酸鎂，1mM DTT，20μg牛血清白蛋白(BSA)，0.8M甜菜堿，各為1.4mM的dATP、dTTP、dGTP和dCTP，0.4x59(Life Technologies)，0.8單位/μl Bst DNA聚合酶(New England BioLabs)，0.016單位/μl AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(New England Biolabs)，1單位/μl鼠核糖核酸酶抑制劑(New England Biolabs)，0.8μM的第一引物A8，0.8μM的第二引物B8以及每微升100,000T129D1模板，并在58℃下在CFX 96Touch儀器(Bio-Rad)中溫育100分鐘。100分鐘后，從反應(yīng)中取出樣品并將其連接入克隆載體。使用針對于克隆位點(diǎn)的載體特異性引物對含有反應(yīng)產(chǎn)物的載體進(jìn)行測序。多個(gè)示例性測序反應(yīng)的結(jié)果的一部分示于圖7中。測序結(jié)果表明形成了具有期望的結(jié)構(gòu)的多聯(lián)體。特別地，在這些實(shí)例中，在反應(yīng)產(chǎn)物的單一鏈中，存在來自T129D1基因的靶向的54核苷酸序列的多個(gè)拷貝，這些拷貝由A8引物的尾區(qū)的序列(5’TCTTGAGA 3’)(SEQ ID NO:88)分隔開。在圖7中，僅顯示了T129D1的第二次(從左至右)出現(xiàn)的一部分；序列在圖中所示的核苷酸之外繼續(xù)。

實(shí)施例7-具有與內(nèi)部基序互補(bǔ)的尾區(qū)的引物

為了進(jìn)一步描述本文提供的實(shí)施方式，其中引物尾區(qū)含有與靶核酸內(nèi)的內(nèi)部基序互補(bǔ)的序列，現(xiàn)將提供具有示例性核酸序列的實(shí)例。可提供54個(gè)核苷酸總長度的多核苷酸模板(“實(shí)施例7模板”)。實(shí)施例7模板對應(yīng)于圖10的元件1000。實(shí)施例7模板的序列如下：5’TCGCTTGAACTGAGGACTTAGCGCCTAGAAACTTGGCTCAGGTAACCAACTGGT 3’(SEQ ID NO:92)。以5’至3’方向描述實(shí)施例7模板，第一下劃線序列是多核苷酸模板的第二部分(例如類似于圖10中提供的元件1002)，第二下劃線序列是內(nèi)部基序(例如對應(yīng)于圖10中提供的元件1003)，第三下劃線序列是多核苷酸模板的第一部分(例如對應(yīng)于圖10中提供的元件1001)。實(shí)施例7模板和本文提供的其他序列的特定核苷酸可就它們在5’至3’方向讀取的各自序列中的位置而被提及。因此，例如，實(shí)施例7模板的5’端的“T”在第1位置，與5’端的“T”相鄰的“C”在第2位置，以此類推。可提供24個(gè)核苷酸總長度的第一引物(“實(shí)施例7第一引物”)。實(shí)施例7第一引物對應(yīng)于圖10的元件1010。實(shí)施例7第一引物的序列如下：5’CTAGAAACACCAGTTGGTTACCTG 3’(SEQ ID NO:93)。下劃線序列是實(shí)施例7第一引物的第一區(qū)域/尾區(qū)(對應(yīng)于圖10的元件1011)，而非下劃線序列是實(shí)施例7第一引物的第二區(qū)域/模板結(jié)合區(qū)(對應(yīng)于圖10的元件1012)。還應(yīng)當(dāng)注意以下事實(shí)，實(shí)施例7第一引物的第一區(qū)域具有與實(shí)施例7模板的內(nèi)部基序相同的核苷酸序列。實(shí)施例7第一引物可如下與實(shí)施例7模板退火：當(dāng)實(shí)施例7模板和實(shí)施例7第一引物被定向?yàn)槭沟脤?shí)施例7模板的3’端和實(shí)施例7第一引物的5’端面向相同的方向時(shí)，實(shí)施例7第一引物的非下劃線序列(以5’至3’方向讀取，如ACCAG…)與實(shí)施例7模板的第一部分(以3’至5’方向讀取，如TGGTC...)退火。更具體地，在實(shí)施例7第一引物的第9位置的“A”與在實(shí)施例7模板的第54位置的“T”配對，在實(shí)施例7第一引物的第10位置的“C”與在實(shí)施例7模板的第53位置的“G”配對，在實(shí)施例7第一引物的第11位置的“C”與在實(shí)施例7模板的第52位置的“G”配對，等等。當(dāng)實(shí)施例7第一引物與實(shí)施例7模板退火時(shí)，如本文其他地方所述，具有鏈置換活性的聚合酶可延伸實(shí)施例7第一引物，以生成實(shí)施例7第一引物延伸產(chǎn)物。實(shí)施例7第一引物延伸產(chǎn)物將具有5’至3’方向的核苷酸序列：5’CTAGAAACACCAGTTGGTTACCTGAGCCAAGTTTCTAGGCGCTAAGTCCTCAGTTCAAGCGA 3’(SEQ ID NO:94)。以5’至3’方向描述實(shí)施例7第一引物延伸產(chǎn)物，第一非下劃線序列是實(shí)施例7第一引物的第一區(qū)域的序列，第一下劃線序列是與實(shí)施例7模板的第一部分互補(bǔ)的序列，第二下劃線序列是實(shí)施例7第一引物延伸產(chǎn)物的內(nèi)部基序的序列，第三下劃線序列是與實(shí)施例7模板的第二部分互補(bǔ)的序列。在實(shí)施方式中，當(dāng)實(shí)施例7第一引物延伸產(chǎn)物與實(shí)施例7模板退火時(shí)，在一些情況下，實(shí)施例7第一引物延伸產(chǎn)物的一部分(它是實(shí)施例7第一引物的第一區(qū)域的序列)可與實(shí)施例7第一引物延伸產(chǎn)物的內(nèi)部基序暫時(shí)退火，使得在第1位置的“C”與在實(shí)施例7第一引物延伸產(chǎn)物的第38位置的“G”退火，在第2位置的“T”與在第37位置的“A”退火，在第3位置的“A”與在第36位置的“T”退火，以此類推，直到在第8位置的“C”與在第31位置的“G”退火。當(dāng)實(shí)施例7第一引物延伸產(chǎn)物的一部分(它是實(shí)施例7第一引物的第一區(qū)域的序列)與實(shí)施例7第一引物延伸產(chǎn)物的內(nèi)部基序的一部分暫時(shí)退火時(shí)，這些部分之間的實(shí)施例7第一引物延伸產(chǎn)物的部分(包括，例如，與實(shí)施例7模板的第一部分互補(bǔ)的序列)可變?yōu)椴慌c實(shí)施例7模板退火，從而有助于，例如，實(shí)施例7第一引物的另一拷貝與實(shí)施例7模板的結(jié)合，以及另外的實(shí)施例7第一引物延伸產(chǎn)物的后續(xù)生成。

還可提供24個(gè)核苷酸總長度的第二引物(“實(shí)施例7第二引物”)。實(shí)施例7第二引物對應(yīng)于圖10的元件1020。實(shí)施例7第二引物的序列如下：5’GTTTCTAGTCGCTTGAACTGAGGA 3’(SEQ ID NO:95)。下劃線序列是實(shí)施例7第二引物的第一區(qū)域(對應(yīng)于圖10的元件1021)，而非下劃線序列是實(shí)施例7第二引物的第二區(qū)域(對應(yīng)于圖10的元件1022)。實(shí)施例7第二引物可如下與實(shí)施例7第一引物延伸產(chǎn)物退火：在實(shí)施例7第二引物的第9位置的“T”與在實(shí)施例7第一引物延伸產(chǎn)物的第62位置的“A”配對，在實(shí)施例7第二引物的第10位置的“C”與在實(shí)施例7第一引物延伸產(chǎn)物的第61位置的“G”配對，在實(shí)施例7第二引物的第11位置的“G”與在實(shí)施例7第一引物延伸產(chǎn)物的第60位置的“C”配對，以此類推。實(shí)施例7第二引物可由如本文其他地方所述具有鏈置換活性的聚合酶進(jìn)行延伸，以產(chǎn)生實(shí)施例7第二引物延伸產(chǎn)物。實(shí)施例7第二引物延伸產(chǎn)物將具有5’至3’方向的核苷酸序列：5’GTTTCTAGTCGCTTGAACTGAGGACTTAGCGCCTAGAAACTTGGCTCAGGTAACCAACTGGTGTTTCTAG 3’(SEQ ID NO:96)。以5’至3’方向描述實(shí)施例7第二引物延伸產(chǎn)物，第一非下劃線序列是實(shí)施例7第二引物的第一區(qū)域的序列，第一下劃線序列是實(shí)施例7模板的第二部分的序列，第二下劃線序列是實(shí)施例7第二引物延伸產(chǎn)物的內(nèi)部基序的序列，第三下劃線序列是實(shí)施例7模板的第一部分的序列，第四非下劃線序列是實(shí)施例7第二引物的第一區(qū)域的序列和與實(shí)施例7第一引物的第一區(qū)域互補(bǔ)的序列的序列。在實(shí)施方式中，當(dāng)實(shí)施例7第二引物延伸產(chǎn)物與實(shí)施例7第一引物延伸產(chǎn)物退火時(shí)，在一些情況下，實(shí)施例7第二引物延伸產(chǎn)物的一部分(它是實(shí)施例7第二引物的第一區(qū)域的序列)可與實(shí)施例7第二引物延伸產(chǎn)物的內(nèi)部基序暫時(shí)退火，使得在第1位置的“G”與在實(shí)施例7第二引物延伸產(chǎn)物的第40位置的“C”退火，在第2位置的“T”與在第39位置的“A”退火，在第3位置的“T”與在第38位置的“A”退火，以此類推，直到在第8位置的“G”與在第33位置的“C”退火。當(dāng)實(shí)施例7第二引物延伸產(chǎn)物的一部分(它是實(shí)施例7第二引物的第一區(qū)域的序列)與實(shí)施例7第二引物延伸產(chǎn)物的內(nèi)部基序暫時(shí)退火時(shí)，這些部分之間的實(shí)施例7第二引物延伸產(chǎn)物的部分(包括，例如，實(shí)施例7模板的第二部分的序列)可變?yōu)椴慌c實(shí)施例7第一引物延伸產(chǎn)物退火，從而有助于，例如，實(shí)施例7第二引物的另一拷貝與實(shí)施例7第一引物延伸的結(jié)合，以及另外的實(shí)施例7第二引物延伸產(chǎn)物的后續(xù)生成。

在實(shí)施方式中，本文其他地方提供的方法可根據(jù)以上概述的一般機(jī)理進(jìn)行。本文其他地方提供的關(guān)于引物、靶核酸、反應(yīng)條件、反應(yīng)產(chǎn)物等的任何描述和細(xì)節(jié)可應(yīng)用于涉及以上在實(shí)施例7中描述的一般機(jī)理的反應(yīng)。

實(shí)施例8-SNP檢測

本文提供的方法用于鑒定在靶核酸中的SNP/突變。提供了靶核酸的兩種版本，它們相差一個(gè)核苷酸。該核酸模板的版本1(“版本1模板”；還被稱為“野生型”序列)的第一鏈具有5’至3’方向的序列：GCATTCATCACGTTTTTGCGAGTCCTTTCCTCCCACCAACAGCAGGGATTCTGAAGAGATGGGGACAGTT(SEQ ID NO:97)。以5’至3’方向描述版本1模板，第一下劃線序列是版本1模板的第二部分，第二下劃線序列是版本1模板的內(nèi)部基序，第三下劃線序列是版本1模板的第一部分。該核酸模板的版本2(“版本2模板”；還被稱為“SNP”序列)的第一鏈具有5’至3’方向的序列：GCATTCATCACGTTTTTGCGAGTCCTTTCCTCCCACCAACAGCAGGGATTCTGAAGAGATGGGGACAGTT(SEQ ID NO:98)。以5’至3’方向描述版本2模板，第一下劃線序列是版本2模板的第二部分，第二下劃線序列是版本2模板的內(nèi)部基序，第三下劃線序列是版本2模板的第一部分。版本1模板和版本2模板序列僅在各自模板的內(nèi)部基序序列中相差一個(gè)核苷酸。具體地，版本1模板在序列的第31位置具有“A”(用粗體和斜體字體強(qiáng)調(diào))，而版本2模板在序列的第31位置具有“T”(用粗體和斜體字體強(qiáng)調(diào))。還提供了第一引物和第二引物以擴(kuò)增模板序列。第一引物(“實(shí)施例8引物1”)具有序列：5’TCCATCCCAACTGTCCCCATCT3’(SEQ ID NO:99)。下劃線序列是實(shí)施例8引物1的第一區(qū)域/尾區(qū)，而非下劃線序列是實(shí)施例8引物1的第二區(qū)域/模板結(jié)合區(qū)。第二引物(“實(shí)施例8引物2”)具有序列：5’GGGATGGAGCATTCATCACGTTT 3’(SEQ ID NO:100)。下劃線序列是實(shí)施例8引物2的第一區(qū)域/尾區(qū)，而非下劃線序列是實(shí)施例8引物2的第二區(qū)域/模板結(jié)合區(qū)。

對于版本1模板或版本2模板進(jìn)行如本文其他地方所述的單獨(dú)的擴(kuò)增反應(yīng)，版本1模板和版本2模板的反應(yīng)都使用實(shí)施例8引物1和實(shí)施例8引物2作為引物。對于每個(gè)模板進(jìn)行相同的條件下的多個(gè)反應(yīng)。

在版本1模板反應(yīng)中，當(dāng)實(shí)施例8引物1與版本1模板退火且通過聚合酶生成實(shí)施例8引物1的延伸產(chǎn)物(“版本1模板引物1延伸產(chǎn)物”)時(shí)，版本1模板引物1延伸產(chǎn)物將具有如下序列：5’TCCATCCCAACTGTCCCCATCTCTTCAGAATCCCTGCTGTTGGTGGGAGGAAAGGACTCGCAAAAACGTGATGAATGC(SEQ ID NO:101)。以5’至3’方向描述版本1模板引物1延伸產(chǎn)物，第一非下劃線序列是實(shí)施例8引物1的第一區(qū)域/尾區(qū)的序列，第一下劃線序列是與版本1模板的第一部分互補(bǔ)的序列，第二下劃線序列是版本1模板引物1延伸產(chǎn)物的內(nèi)部基序的序列(其中黑體、斜體“T”是感興趣的核苷酸)，第三下劃線序列是與版本1模板的第二部分互補(bǔ)的序列。根據(jù)本文所述的方法，在實(shí)施方式中，對應(yīng)于實(shí)施例8引物1序列的第一區(qū)域/尾區(qū)的序列的版本1模板引物1延伸產(chǎn)物的部分可與版本1模板引物1延伸產(chǎn)物的內(nèi)部基序暫時(shí)退火，使得在第1位置的“T”與在第52位置的“A”退火，在第2位置的“C”與在第51位置的“G”退火，在第3位置的“C”與在第50位置的“G”退火，以此類推，直到在第8位置的“C”與在第45位置的“G”退火。值得注意的是，對應(yīng)于實(shí)施例8引物1序列的第一區(qū)域/尾區(qū)的序列的版本1模板引物1延伸產(chǎn)物的部分與版本1模板引物1延伸產(chǎn)物的內(nèi)部基序序列完全互補(bǔ)(即在8組配對的核苷酸中的任一組之間沒有錯(cuò)配)。

在版本2模板反應(yīng)中，當(dāng)實(shí)施例8引物1與版本2模板退火且通過聚合酶生成實(shí)施例8引物1的延伸產(chǎn)物(“版本2模板引物1延伸產(chǎn)物”)時(shí)，版本2模板引物1延伸產(chǎn)物將具有如下序列：5’TCCATCCCAACTGTCCCCATCTCTTCAGAATCCCTGCTGTTGGTGGGAGGAAAGGACTCGCAAAAACGTGATGAATGC(SEQ ID NO:102)。以5’至3’方向描述版本2模板延伸產(chǎn)物，第一非下劃線序列是實(shí)施例8引物1的第一區(qū)域/尾區(qū)的序列，第一下劃線序列是與版本2模板的第一部分互補(bǔ)的序列，第二下劃線序列是版本2模板引物1延伸產(chǎn)物的內(nèi)部基序的序列(其中黑體、斜體“A”是感興趣的核苷酸)，第三下劃線序列是與版本2模板的第二部分互補(bǔ)的序列。根據(jù)本文所述的方法，在實(shí)施方式中，對應(yīng)于實(shí)施例8引物1序列的第一區(qū)域/尾區(qū)的序列的版本2模板引物1延伸產(chǎn)物的部分可與版本2模板引物1延伸產(chǎn)物的內(nèi)部基序暫時(shí)退火，使得在第1位置的“T”與在第52位置的“A”退火，在第2位置的“C”與在第51位置的“G”退火，在第3位置的“C”與在第50位置的“G”退火，以此類推，直到在第8位置的“C”與在第45位置的“G”退火。值得注意的是，對應(yīng)于實(shí)施例8引物1序列的第一區(qū)域/尾區(qū)的序列的版本2模板引物1延伸產(chǎn)物的部分與版本2模板引物1延伸產(chǎn)物的內(nèi)部基序序列不完全互補(bǔ)，因?yàn)樵诘?位置的“A”與在第49位置的“A”之間存在錯(cuò)配。因此，通過比較版本1模板引物1延伸產(chǎn)物與版本2模板引物1延伸產(chǎn)物，與版本2模板引物1延伸產(chǎn)物中的內(nèi)部基序相比，對應(yīng)于實(shí)施例8引物1的第一區(qū)域/尾區(qū)的各自延伸產(chǎn)物的部分將與版本1模板引物1延伸產(chǎn)物中的內(nèi)部基序更大互補(bǔ)并且將更穩(wěn)定地退火。具體地，版本1模板引物1延伸產(chǎn)物中的序列“TCCATCCC”與版本1模板引物1延伸產(chǎn)物中的內(nèi)部基序完全互補(bǔ)(8個(gè)核苷酸中的8個(gè)可正確配對)，而版本2模板引物1延伸產(chǎn)物中的序列“TCCATCCC”與版本2模板引物1延伸產(chǎn)物中的內(nèi)部基序不完全互補(bǔ)(8個(gè)核苷酸中僅有7個(gè)可正確配對)。通常，對應(yīng)于引物尾區(qū)的延伸產(chǎn)物的部分與該延伸產(chǎn)物中的內(nèi)部基序之間更大的互補(bǔ)性導(dǎo)致這兩個(gè)部分之間更穩(wěn)定的退火。當(dāng)延伸產(chǎn)物被配置為使得這兩個(gè)部分退火時(shí)，這可加快本文提供的反應(yīng)的速率，例如，通過根據(jù)本文提供的方法，允許新的引物與經(jīng)由延伸產(chǎn)物的區(qū)域的內(nèi)部退火或經(jīng)由提高的多聯(lián)體形成速率而暴露的互補(bǔ)鏈中未退火的核苷酸的結(jié)合。

對于版本1模板和版本2模板引物2延伸產(chǎn)物還存在如上所述的類似機(jī)理，其中延伸產(chǎn)物的尾區(qū)的部分對于版本1模板引物2延伸產(chǎn)物而言完全互補(bǔ)，但對于版本2模板引物2延伸產(chǎn)物而言不完全互補(bǔ)。

圖11顯示采用這些模板和引物的擴(kuò)增反應(yīng)的結(jié)果，其中X軸表示時(shí)間，Y軸表示相對熒光單位(RFU)(指示擴(kuò)增的DNA)。如圖11所示，采用版本1模板(“野生型”序列)的擴(kuò)增反應(yīng)比采用版本2模板(“SNP”序列)的反應(yīng)更快發(fā)生。因此，這些結(jié)果表明，本文提供的方法可用于例如區(qū)別具有單核苷酸變異的序列。

實(shí)施例9-SNP檢測

本文提供的方法用于鑒定在人類靶核酸中的SNP/突變。BRCA1蛋白質(zhì)的Q356R變異可能與增加的癌癥風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。例如，當(dāng)在野生型BRCA1蛋白質(zhì)的356氨基酸位置處編碼谷氨酰胺的密碼子(核苷酸序列CAG)具有核苷酸序列CGG，使得該密碼子編碼精氨酸而非谷氨酰胺時(shí)，可發(fā)生Q356R變異。

獲得了BRCA1基因組序列的一部分的四種不同版本，該基因組序列的部分除了其他核苷酸之外還含有356氨基酸位置的以下密碼子。第一版本(“野生型靶標(biāo)”)在356氨基酸位置處含有編碼谷氨酰胺的野生型密碼子(序列CAG)，并且具有5’至3’方向的核苷酸序列：AAGATGTTCCTTGGATAACACTAAATAGCAGCATTCGAAAGTTAATGAGTGGTTTTCCAGA(SEQ ID NO:103)。第二版本(“Q356R靶標(biāo)”)在356氨基酸位置處含有編碼精氨酸的密碼子(序列CGG)，并且具有5’至3’方向的核苷酸序列：AAGATGTTCCTTGGATAACACTAAATAGCAGCATTCGAAAGTTAATGAGTGGTTTTCCAGA(SEQ ID NO:104)。第三版本(“Q356P靶標(biāo)”)在356氨基酸位置處含有編碼脯氨酸的密碼子(序列CCG)，并且具有5’至3’方向的核苷酸序列：AAGATGTTCCTTGGATAACACTAAATAGCAGCATTCGAAAGTTAATGAGTGGTTTTCCAGA(SEQ ID NO:105)。第四版本(“Q356L靶標(biāo)”)在356氨基酸位置處含有編碼亮氨酸的密碼子(序列CTG)，并且具有5’至3’方向的核苷酸序列：AAGATGTTCCTTGGATAACACTAAATAGCAGCATTCGAAAGTTAATGAGTGGTTTTCCAGA(SEQ ID NO:106)。在以上四個(gè)靶標(biāo)的每一個(gè)中，在5’至3’方向上，第一下劃線序列是靶標(biāo)的第二部分，第二下劃線序列是靶標(biāo)的內(nèi)部基序，第三下劃線序列是靶標(biāo)的第一部分。

以上四個(gè)靶標(biāo)序列僅在各自靶標(biāo)的內(nèi)部基序中相差一個(gè)核苷酸。具體地，野生型靶標(biāo)在序列的第37位置具有“A”(用粗體和斜體字體強(qiáng)調(diào))，而Q356R靶標(biāo)在序列的第37位置具有“G”，Q356P靶標(biāo)在序列的第37位置具有“C”，而Q356L靶標(biāo)在序列的第37位置具有“T”。還提供了第一引物和第二引物以擴(kuò)增靶標(biāo)序列。第一引物(“實(shí)施例9引物1”)具有序列：5’ATTCAGAATCTGGAAAACCACTC 3’(SEQ ID NO:107)。下劃線序列是實(shí)施例9引物1的第一區(qū)域/尾區(qū)，而非下劃線序列是實(shí)施例9引物1的第二區(qū)域/模板結(jié)合區(qū)。第二引物(“實(shí)施例9引物2”)具有序列：5’TTCTGAATAAGATGTTCCTTGGAT 3’(SEQ ID NO:108)。下劃線序列是實(shí)施例9引物2的第一區(qū)域/尾區(qū)，而非下劃線序列是實(shí)施例9引物2的第二區(qū)域/模板結(jié)合區(qū)。

對于以上四個(gè)靶標(biāo)中的每一個(gè)進(jìn)行如本文所述的單獨(dú)的擴(kuò)增反應(yīng)，全部四個(gè)靶標(biāo)的反應(yīng)均使用實(shí)施例9引物1和實(shí)施例9引物2作為引物。反應(yīng)的條件如下：50mM乙酸鉀，20mM Tris-乙酸鹽，pH 7.9，10mM乙酸鎂，1mM DTT，0.8M甜菜堿，2uM59(Life Technologies)，0.8單位/μl Bst DNA聚合酶(New England BioLabs)，0.8μM實(shí)施例9引物1，0.8μM實(shí)施例9引物2，和10個(gè)拷貝的靶分子/μl。將反應(yīng)在56℃下保持90分鐘，并采用CFX Manager軟件(Bio-Rad)使用單閾值方法確定每個(gè)反應(yīng)的拐點(diǎn)。對于每個(gè)靶標(biāo)進(jìn)行相同的條件下的多個(gè)反應(yīng)。

所述擴(kuò)增反應(yīng)根據(jù)本文其他地方，例如，如實(shí)施例8中所述的機(jī)理而發(fā)生。例如，在每個(gè)各自的反應(yīng)中，實(shí)施例9引物1和實(shí)施例9引物2延伸產(chǎn)物由以上每個(gè)靶標(biāo)核酸形成，以形成例如野生型靶標(biāo)實(shí)施例9引物1延伸產(chǎn)物，Q356R靶標(biāo)實(shí)施例9引物1延伸產(chǎn)物，Q356P靶標(biāo)實(shí)施例9引物1延伸產(chǎn)物和Q356L靶標(biāo)實(shí)施例9引物1延伸產(chǎn)物，以及由實(shí)施例9引物2從每個(gè)靶標(biāo)延伸的相應(yīng)的延伸產(chǎn)物。

值得注意的是，例如，對應(yīng)于實(shí)施例9引物1的第一區(qū)域/尾區(qū)的野生型靶標(biāo)實(shí)施例9引物1延伸產(chǎn)物的部分與野生型靶標(biāo)實(shí)施例9引物1延伸產(chǎn)物中的內(nèi)部基序完全互補(bǔ)，而對應(yīng)于針對Q356R靶標(biāo)、Q356P靶標(biāo)和Q356L靶標(biāo)引物1延伸產(chǎn)物中每一個(gè)的實(shí)施例9引物1的第一區(qū)域/尾區(qū)的延伸產(chǎn)物的部分與各自延伸產(chǎn)物中的內(nèi)部基序不完全互補(bǔ)。具體地，如上所述，在涉及靶序列的第37位置的核苷酸的位置處具有單核苷酸錯(cuò)配。該錯(cuò)配可能影響本文提供的反應(yīng)的速率。

采用每一個(gè)不同靶標(biāo)進(jìn)行的測定的平均拐點(diǎn)時(shí)間如下：野生型靶標(biāo)：24.5分鐘；Q356R靶標(biāo)：49.5分鐘；Q356P靶標(biāo)：55.7分鐘，Q356L靶標(biāo)：59.8分鐘。因此，如所述測定的拐點(diǎn)時(shí)間所示，所述反應(yīng)可容易地區(qū)分在內(nèi)部基序中相差一個(gè)核苷酸的靶標(biāo)。與其他靶標(biāo)相比，采用野生型靶標(biāo)進(jìn)行的測定的顯著更快的拐點(diǎn)時(shí)間可能是對應(yīng)于實(shí)施例9引物1的第一區(qū)域/尾區(qū)的野生型靶標(biāo)實(shí)施例9引物1延伸產(chǎn)物的部分與野生型靶標(biāo)實(shí)施例9引物1延伸產(chǎn)物中的內(nèi)部基序之間完全互補(bǔ)的結(jié)果，這不同于對應(yīng)于實(shí)施例9引物1的第一區(qū)域/尾區(qū)的Q356R靶標(biāo)、Q356P靶標(biāo)和Q356L靶標(biāo)實(shí)施例9引物1延伸產(chǎn)物的部分與各自的實(shí)施例9引物1延伸產(chǎn)物中的內(nèi)部基序之間的不完全互補(bǔ)。類似的推論還適用于引物2延伸產(chǎn)物的延伸產(chǎn)物。

實(shí)施例10-流感N9基因擴(kuò)增

使用本文提供的方法從含有甲型流感病毒亞型H7N9的樣品中擴(kuò)增神經(jīng)氨酸酶基因(N9)的一部分。在5’至3’方向上，來自N9的靶序列為(DNA形式)：AACTTTAAGGACGAACAAGAGAGAAGGTAAACCTACAACCACTACAAACAAAGTAATATTATCAACAAATAATAACAAACCGAACACAACCAACAAAGT(SEQ ID NO:109)。用于擴(kuò)增所述模板的第一引物具有5’至3’方向的序列：CTTCCATTTGAAACAACCAACAC(SEQ ID NO:110)。描述第一引物，下劃線區(qū)域是該引物的尾區(qū)/第一區(qū)域，非下劃線區(qū)域是第二區(qū)域/模板結(jié)合區(qū)。用于擴(kuò)增所述模板的第二引物具有5’至3’方向的序列：AATGGAAGTTGAAATTCCTGCTTG(SEQ ID NO:111)。描述第二引物，下劃線區(qū)域是該引物的尾區(qū)/第一區(qū)域，非下劃線區(qū)域是第二區(qū)域/模板結(jié)合區(qū)。如本文所述的多個(gè)反應(yīng)使用第一引物和第二引物進(jìn)行，其中所述反應(yīng)含有模板序列或不含模板序列。含有所述模板的反應(yīng)具有每一反應(yīng)250,000個(gè)拷貝模板序列。所述反應(yīng)的結(jié)果提供于圖12中。X軸上的數(shù)字為分鐘，Y軸值為相對熒光單位(RFU)。如圖所示，在模板化反應(yīng)中，RFU在約20分鐘時(shí)快速升高，這表明模板序列的擴(kuò)增。在無模板反應(yīng)中約60分鐘時(shí)及以后的RFU增加是非特異性背景產(chǎn)物的結(jié)果。

除非另外指出，本文提供的核苷酸和氨基酸序列是人工序列。

盡管本文中已經(jīng)示出并描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，但對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，這些實(shí)施方式僅以示例的方式提供。前述的描述并非詳盡的或?qū)⒈景l(fā)明限于所公開的精確的實(shí)施方式，并且根據(jù)以上教導(dǎo)在不脫離本發(fā)明的情況下其他的修改和變化是可能的。無論優(yōu)選與否的任何特征均可與無論優(yōu)選與否的任何其他特征相組合。還應(yīng)當(dāng)理解，雖然出于方便的目的，本文中已經(jīng)使用有限數(shù)目的術(shù)語和短語描述了本文提供的發(fā)明，但本發(fā)明也可以使用本文未提供的同樣準(zhǔn)確描述本發(fā)明的其他術(shù)語和短語進(jìn)行描述。所附權(quán)利要求書不應(yīng)被解釋為包括裝置加功能的限定，除非這樣的限定在給定的權(quán)利要求中使用短語“用于…的裝置”而被明確闡述。應(yīng)當(dāng)理解，如此處的說明書和隨后的權(quán)利要求書全文中所使用，“一個(gè)”、“一種”和“該”的含義包括復(fù)數(shù)指代對象，除非上下文另有明確規(guī)定。例如，提及“測定”可以指一個(gè)測定或多個(gè)測定。此外，如此處的說明書和隨后的權(quán)利要求書全文中所使用，“之中”的含義包括“之中”和“之上”，除非上下文另有明確規(guī)定。如在此處的說明書和隨后的整個(gè)權(quán)利要求書中所用的，描述為含有第二個(gè)對象的“至少一部分”的第一對象可含有所有量的/完整的第二對象。如在此處的說明書和隨后的整個(gè)權(quán)利要求書中所用的，術(shù)語“包含”、“包括”和“含有”以及相關(guān)的時(shí)態(tài)是包含在內(nèi)且開放式的，并且不排除附加的、未敘述的要素或方法步驟。而且，在一些情況下，拓寬詞語和短語諸如“一個(gè)或多個(gè)(一種或多種)”、“至少”、“但不限于”或其他類似的短語的存在不應(yīng)被理解為在這類拓寬短語可能不存在的情況下意味著較窄的情況是有意或需要的。最后，如此處的說明書和隨后的權(quán)利要求書全文中所使用，“或”的含義同時(shí)包括結(jié)合的和分離的，除非上下文另有明確規(guī)定。因此，除非上下文另外明確規(guī)定，術(shù)語“或”包括“和/或”。

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