本發(fā)明涉及可用于提供來自不同解剖部位的癌癥的預(yù)后和引導(dǎo)其治療的分子診斷測試。本發(fā)明包括從基因表達(dá)水平導(dǎo)出基因分類模型。一項(xiàng)應(yīng)用是選擇是否將某些治療劑、如抗血管生成治療劑施用于接受護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)癌癥療法的受試者。另一項(xiàng)應(yīng)用是將癌癥患者劃分成具有良好臨床預(yù)后或不良臨床預(yù)后的那些癌癥患者。本發(fā)明提供可以在臨床試驗(yàn)評(píng)價(jià)新治療劑期間指導(dǎo)療法選擇以及為富集策略選擇患者組的測試。本發(fā)明可以用作某些癌癥的預(yù)后指標(biāo)，所述癌癥包括卵巢癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、肺癌和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤?？梢詮男迈r/冷凍的(FF)或福爾馬林固定石蠟包埋的FFPE患者樣品鑒定血管生成亞型。

背景

制藥業(yè)不斷地追求比目前施用藥物更有效、更特異性或具有更少不良副作用的新藥物治療選項(xiàng)。正在持續(xù)不斷地開發(fā)藥物治療替代品，因?yàn)槿巳簝?nèi)部的遺傳變異性導(dǎo)致許多既定藥物的有效性差異巨大。因此，雖然目前可獲得廣泛類型的藥物治療選項(xiàng)，但是在患者不反應(yīng)的情況下總是需要更多的療法。

傳統(tǒng)上，醫(yī)師使用的治療范式是開具產(chǎn)生就治療疾病而言可能的最高成功率的一線藥物療法。如果一線藥物療法無效，則開具替代性藥物療法。這種范式顯然不是某些疾病的最好治療方法。例如，在疾病如癌癥中，首次治療經(jīng)常最重要并且為成功治療提供最佳機(jī)會(huì)，因此選擇最有效對(duì)抗特定患者疾病的初始藥物的需求增加。

卵巢癌是西方國家全部婦科癌癥中的主要死亡原因。這種高死亡率歸因于大部分患者中在晚期階段診斷。上皮卵巢癌(EOC)構(gòu)成90％的卵巢惡性腫瘤并且劃分成不同的組織學(xué)類別，包括漿液性、粘蛋白狀、子宮內(nèi)膜樣、透明細(xì)胞、過渡、混合和未分化亞型。這些不同組織學(xué)源于不同病因?qū)W的證據(jù)日益增加。最近在用來劃分上皮卵巢癌的方法學(xué)方面取得進(jìn)展(McCluggage，W.G.“Morphological subtypes of ovarian carcinoma:a review with emphasis on new developments and pathogenesis,”Pathology 2011Aug；43(5):420-32)。這種進(jìn)展的結(jié)果之一是先前劃歸為子宮內(nèi)膜樣的許多腫瘤現(xiàn)劃歸為漿液性。

卵巢癌現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)治療是減積手術(shù)和基于鉑紫杉烷的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞毒化療。但是，并非全部患者均響應(yīng)于這種療法，并且占約70％的那些患者將遭遇復(fù)發(fā)?；诮M織學(xué)或分子分類的卵巢癌特異性靶向療法尚未上市。類似地，對(duì)于其他類型的癌癥，仍然不存在選擇適當(dāng)細(xì)胞毒化療藥的精確方式。

微陣列和分子基因組學(xué)的到來具有顯著影響診斷能力和疾病預(yù)后分類的潛力，這可能有助于預(yù)測個(gè)體患者對(duì)確定的治療方案的反應(yīng)。微陣列提供對(duì)大量遺傳信息的分析，因而提供個(gè)體的遺傳指紋。存在這項(xiàng)技術(shù)最終將為定制藥物療法方案提供必需的工具的巨大熱情。

目前，醫(yī)療保健專業(yè)人員擁有幫助他們確定將從化療藥得益的癌癥患者的少數(shù)機(jī)制。鑒定最佳一線藥物是困難的，因?yàn)椴豢色@得精確預(yù)測哪種藥物治療將對(duì)特定癌癥生理學(xué)最有效的方法。這種匱乏導(dǎo)致相對(duì)差的單藥響應(yīng)速度和癌癥發(fā)病和死亡增加。另外，患者經(jīng)常不必要地接受無效、有毒的藥物療法。

血管生成是腫瘤新血管化的關(guān)鍵組分并且是腫瘤形成和轉(zhuǎn)移必需的。因而，它是治療性介入的關(guān)鍵領(lǐng)域并且已經(jīng)與不良預(yù)后和存活減少關(guān)聯(lián)。這已經(jīng)促進(jìn)開發(fā)多種靶向血管生成相關(guān)過程和途徑的藥物，包括Genentech/Roche生產(chǎn)的市場領(lǐng)先者和首個(gè)FDA批準(zhǔn)抗血管生成藥-貝伐珠單抗(Avastin)。

包含貝伐珠單抗的治療方案已經(jīng)展示廣泛的臨床活性^1-10。但是，尚未在大多數(shù)癌癥中在添加貝伐珠單抗至細(xì)胞毒化療后顯示總生存期(OS)益處^8,12-13。這表明大比例的腫瘤一開始就耐藥或迅速形成對(duì)VEGF阻斷作用(貝伐珠單抗的作用機(jī)理)的抵抗性。實(shí)際上，當(dāng)接受貝伐珠單抗單藥療法時(shí)，21％卵巢癌患者、10％腎癌患者和33％直腸癌患者顯示部分消退，從而顯示貝伐珠單抗可能在少數(shù)患者亞組有效，但是這類遞增益處在未選擇的患者中并未達(dá)到顯著^15-18。因此，對(duì)貝伐珠單抗的反應(yīng)的生物標(biāo)志物的使用將改善治療結(jié)果的評(píng)估，因此能夠確定會(huì)從貝伐珠單抗治療接受最大臨床益處的患者亞組。這在轉(zhuǎn)移性乳腺癌的情況下將是特別有意義的，其中不存在臨床有益的生物標(biāo)志物已經(jīng)削弱貝伐珠單抗的應(yīng)用。迄今，尚未經(jīng)臨床驗(yàn)證這類生物標(biāo)志物以預(yù)測貝伐珠單抗的功效。高血壓和VEGF多態(tài)性迄今是顯示潛力的僅有生物標(biāo)志物，但仍存在關(guān)于它們?cè)谂R床環(huán)境下使用的重要問題。

抗血管生成療法的另一種方法是同時(shí)靶向多條生血管途徑，而非選擇性靶向VEGF途徑。理論上，多靶向抗血管生成劑應(yīng)當(dāng)比如貝伐珠單抗之類的藥物更徹底地抑制血管生成并且因此可能產(chǎn)生更大的治療益處。已經(jīng)推測在某些腫瘤中，血管生成可能僅在疾病早期需要VEGF，但隨著疾病進(jìn)展受額外的生血管途徑驅(qū)動(dòng)。因此，通過靶向多條途徑，可以對(duì)抗可能導(dǎo)致抵抗VEGF抑制作用的代償性逃避機(jī)制。

對(duì)其他類型的癌癥，仍然不存在選擇哪些患者將響應(yīng)或?qū)⒉豁憫?yīng)于抗血管生成治療性療法或抗血管生成單藥療法標(biāo)準(zhǔn)護(hù)理的精確方式。

因此需要這樣一種分子診斷測試，所述測試將基于患者對(duì)聯(lián)合標(biāo)準(zhǔn)護(hù)理或作為單藥治療劑的抗血管生成治療劑的預(yù)期反應(yīng)，促進(jìn)患者分類。這將允許快速鑒定應(yīng)當(dāng)接受替代療法的那些患者。這種分子診斷測試應(yīng)當(dāng)預(yù)示以足夠的準(zhǔn)確度預(yù)示不同癌癥類型之間的治療響應(yīng)性。

發(fā)明概述

公開了使用癌癥中表達(dá)的一種或多種生物標(biāo)志物或生物標(biāo)志物集合的方法，其鑒定與涉及免疫反應(yīng)的分子信號(hào)傳導(dǎo)的上調(diào)和涉及血管生成和血管發(fā)育的分子信號(hào)傳導(dǎo)的下調(diào)相關(guān)的癌癥亞型，在本文中被稱為“無血管生成”或“免疫”亞型。生物標(biāo)志物集合可以由表達(dá)特征標(biāo)識(shí)(expression signature)限定，并且表達(dá)特征標(biāo)識(shí)用來向生物標(biāo)志物集合的測量表達(dá)值賦予累積得分。在不同方面，生物標(biāo)志物和表達(dá)特征標(biāo)識(shí)可以形成單參數(shù)或多參數(shù)預(yù)測檢驗(yàn)的基礎(chǔ)，可以使用本領(lǐng)域已知的方法如微陣列、下一代測序(NGS)、Q-PCR、免疫組織化學(xué)、ELISA或可以定量mRNA或蛋白質(zhì)表達(dá)的其他技術(shù)，發(fā)布所述檢驗(yàn)。

此外，本文所述的癌癥亞型是許多類型的癌癥共有的并且不限于單一癌癥疾病類型。因此，本發(fā)明的表達(dá)特征標(biāo)識(shí)不限于單一癌癥類型。在某些示例實(shí)施方案中，無血管生成表達(dá)特征標(biāo)識(shí)包含選自表1中列出的生物標(biāo)志物的兩種或更多種生物標(biāo)志物。在另一個(gè)示例實(shí)施方案中，無血管生成表達(dá)特征標(biāo)識(shí)包含表2或3中列出的兩種或更多種生物標(biāo)志物。在某些其他示例實(shí)施方案中，表達(dá)特征標(biāo)識(shí)包含IGF2、SOX11、INS、CXCL17、SLC5A1、TMEM45A、CXCR2PA、MFAP2、MATN3或RTP4中的一種或多種。在另一個(gè)示例實(shí)施方案中，表達(dá)特征標(biāo)識(shí)包含IGF2、CDR1、COL3A1、SPARC、TIMP3、INS、COL8A1、NUAK1、MATN3和TMEM45A中的一種或多種。在另一個(gè)示例實(shí)施方案中，表達(dá)特征標(biāo)識(shí)包含INS、SPARC、COL8A1、COL3A1、CDR1、NUAK1、TIMP3和MMP14中的一種或多種。在另一個(gè)示例實(shí)施方案中，無血管生成特征標(biāo)識(shí)包含表2中列出的生物標(biāo)志物和它們?nèi)缡褂肞LS分類器(classifier)所確定的相應(yīng)權(quán)重。在另一個(gè)示例實(shí)施方案中，無血管生成特征標(biāo)識(shí)包含表3中列出的生物標(biāo)志物和它們?cè)谂卸üδ軆?nèi)的相應(yīng)等級(jí)。

在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于選擇是否向受試者施用抗血管生成治療劑的方法，其包括：測量來自受試者的樣品中選自表2或表3的一種或多種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平；從所述一種或多種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平評(píng)價(jià)來自受試者的樣品對(duì)于生物標(biāo)志物特征標(biāo)識(shí)是陽性還是陰性的，其中如果所述樣品對(duì)于生物標(biāo)志物特征標(biāo)識(shí)是陽性的，則抗血管生成治療劑是禁忌的。在某些實(shí)施方案中，評(píng)價(jià)所述樣品對(duì)于生物標(biāo)志物特征標(biāo)識(shí)是陽性還是陰性的包括：測定一種或多種生物標(biāo)志物的樣品表達(dá)得分；將樣品表達(dá)得分與閾值得分進(jìn)行比較；和確定所述樣品表達(dá)得分是否高于或等于閾值表達(dá)得分，其中如果所述樣品表達(dá)得分高于或等于閾值得分，則所述樣品對(duì)于生物標(biāo)志物特征標(biāo)識(shí)是陽性的。在進(jìn)一步實(shí)施方案中，所述受試者正在接受或已經(jīng)接受化療劑的治療。

在一個(gè)進(jìn)一步方面，本發(fā)明提供了治療癌癥的方法，其包括向受試者施用化療劑且不施用抗血管生成治療劑，其中基于如本文所述的方法選擇受試者用于治療，且所述受試者對(duì)于所述生物標(biāo)志物特征標(biāo)識(shí)是陽性的。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步方面，提供了治療癌癥的方法，其包括向受試者施用化療劑且不施用抗血管生成治療劑，其中通過測量來自受試者的樣品中選自表2或表3的一種或多種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平來選擇受試者用于治療；從所述生物標(biāo)志物的表達(dá)水平評(píng)價(jià)來自受試者的樣品對(duì)于生物標(biāo)志物特征標(biāo)識(shí)是陽性還是陰性的，其中如果所述樣品對(duì)于生物標(biāo)志物特征標(biāo)識(shí)是陽性的，則選擇受試者用于治療。在又一個(gè)進(jìn)一步方面，本發(fā)明涉及用于治療受試者中的癌癥的化療劑，其中受試者基于如本文所述的方法被選擇用于治療，且對(duì)于所述生物標(biāo)志物特征標(biāo)識(shí)是陽性的，且其中所述受試者不用抗血管生成治療劑治療。本發(fā)明還涉及用于治療受試者中的癌癥的化療劑，其中通過測量來自受試者的樣品中選自表2或表3的一種或多種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平來選擇受試者用于治療；從所述生物標(biāo)志物的表達(dá)水平評(píng)價(jià)來自受試者的樣品對(duì)于生物標(biāo)志物特征標(biāo)識(shí)是陽性還是陰性的，其中如果所述樣品對(duì)于生物標(biāo)志物特征標(biāo)識(shí)是陽性的，則選擇受試者用于治療，且其中所述受試者不用抗血管生成治療劑治療。在一個(gè)進(jìn)一步方面，本發(fā)明涉及治療癌癥的方法，其包括向受試者使用化療劑，其中受試者對(duì)于通過選自表2或表3的一種或多種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平定義的生物標(biāo)志物特征標(biāo)識(shí)是陽性的，且其中不施用抗血管生成治療劑。在又一個(gè)進(jìn)一步方面，本發(fā)明涉及用于治療受試者中的癌癥的化療劑，其中受試者對(duì)于通過選自表2或表3的一種或多種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平定義的生物標(biāo)志物特征標(biāo)識(shí)是陽性的，且其中所述受試者不用抗血管生成治療劑治療。在某些實(shí)施方案中，所述化療劑包含基于鉑的化療劑、烷化劑、抗代謝物(如5FU)、抗腫瘤抗生素、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑、有絲分裂抑制劑或其組合。所述化療劑可以包含基于鉑的化療劑、有絲分裂抑制劑或其組合。在具體實(shí)施方案中，所述化療劑包含卡鉑和/或紫杉醇。所述化療劑可以反映癌癥的護(hù)理治療標(biāo)準(zhǔn)。所述護(hù)理治療標(biāo)準(zhǔn)對(duì)于不同類型的癌癥可以是不同的-例如卵巢癌中的卡鉑，結(jié)直腸癌中的5-FU，頭頸癌中的鉑。根據(jù)本發(fā)明的所有方面，評(píng)價(jià)樣品對(duì)于生物標(biāo)志物特征標(biāo)識(shí)是陽性還是陰性的可以包括測定一種或多種生物標(biāo)志物的樣品表達(dá)得分；將樣品表達(dá)得分與閾值得分進(jìn)行比較；和確定所述樣品表達(dá)得分是否高于或等于閾值表達(dá)得分，其中如果所述樣品表達(dá)得分高于或等于閾值得分，則所述樣品對(duì)于生物標(biāo)志物特征標(biāo)識(shí)是陽性的。根據(jù)本發(fā)明的所有方面，所述受試者可以正患有癌癥。所述癌癥可以是卵巢癌，任選高級(jí)漿液性卵巢癌。本文中，“施用”藥劑與用藥劑“治療”互換使用。

根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步方面，提供了用于確定具有癌癥的受試者的臨床預(yù)后的方法，其包括：測量來自受試者的樣品中選自表2或表3的一種或多種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平；從所述一種或多種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平評(píng)價(jià)來自受試者的樣品對(duì)于生物標(biāo)志物特征標(biāo)識(shí)是陽性還是陰性的，其中如果所述樣品對(duì)于生物標(biāo)志物特征標(biāo)識(shí)是陽性的，則所述受試者具有良好預(yù)后。評(píng)價(jià)所述樣品對(duì)于生物標(biāo)志物特征標(biāo)識(shí)是陽性還是陰性的可以包括：測定生物標(biāo)志物的樣品表達(dá)得分；將樣品表達(dá)得分與閾值得分進(jìn)行比較；和確定所述樣品表達(dá)得分是否高于或等于閾值表達(dá)得分，其中如果所述樣品表達(dá)得分高于或等于閾值得分，則所述樣品對(duì)于生物標(biāo)志物特征標(biāo)識(shí)是陽性的。在某些實(shí)施方案中，良好預(yù)后表明與生物標(biāo)志物特征標(biāo)識(shí)陰性的樣品相比，任選地與樣品表達(dá)得分低于閾值得分的樣品相比，增加的無進(jìn)展存活率或總存活率。在某些實(shí)施方案中，所述受試者正在接受、已經(jīng)接受和/或?qū)⒔邮芑熤委熀?或?qū)⒉唤邮苡每寡苌芍委焺┑闹委?。所述化療治療可以包括施用基于鉑的化療劑、烷化劑、抗代謝物、抗腫瘤抗生素、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑、有絲分裂抑制劑或其組合。所述化療治療可以包括施用基于鉑的化療劑、有絲分裂抑制劑或其組合。在具體實(shí)施方案中，所述化療治療包括施用紫杉醇和卡鉑。所述癌癥可以是卵巢癌或結(jié)直腸癌。

在一個(gè)進(jìn)一步方面，本發(fā)明涉及用于選擇是否向受試者施用貝伐珠單抗的方法，其包括：在從患有卵巢癌的受試者獲得的測試樣品中，所述受試者正在、已經(jīng)和/或?qū)⑹褂没阢K的化療劑和/或有絲分裂抑制劑進(jìn)行治療；測量選自表2的生物標(biāo)志物中的一種、兩種或更多種、最多達(dá)所有的表達(dá)水平；從一種、兩種或更多種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平評(píng)價(jià)來自受試者的樣品對(duì)于生物標(biāo)志物特征標(biāo)識(shí)是陽性還是陰性的，基于所述樣品對(duì)于生物標(biāo)志物特征標(biāo)識(shí)是否是陽性的來選擇治療，其中如果所述樣品對(duì)于生物標(biāo)志物特征標(biāo)識(shí)是陽性的，則貝伐珠單抗是禁忌的。在某些實(shí)施方案中，評(píng)價(jià)樣品對(duì)于生物標(biāo)志物特征標(biāo)識(shí)是陽性還是陰性的包括測定一種、兩種或更多種生物標(biāo)志物的樣品表達(dá)得分；將樣品表達(dá)得分與閾值得分進(jìn)行比較；和確定所述樣品表達(dá)得分是否高于或等于閾值表達(dá)得分，其中如果所述樣品表達(dá)得分高于或等于閾值得分，則所述樣品對(duì)于生物標(biāo)志物特征標(biāo)識(shí)是陽性的。

本發(fā)明還涉及用于確定受試者的臨床預(yù)后的方法，其包括：(a)在從患有卵巢癌的受試者獲得的測試樣品中，所述受試者正在、已經(jīng)和/或?qū)⑹褂没阢K的化療劑和/或有絲分裂抑制劑進(jìn)行治療；(b)測量選自表2或表3的生物標(biāo)志物中的一種或多種、最多達(dá)所有的表達(dá)水平；(c)從所述一種或多種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平評(píng)價(jià)來自受試者的樣品對(duì)于生物標(biāo)志物特征標(biāo)識(shí)是陽性還是陰性的，其中如果所述樣品對(duì)于生物標(biāo)志物特征標(biāo)識(shí)是陽性的，則所述受試者具有良好預(yù)后。評(píng)價(jià)所述樣品對(duì)于生物標(biāo)志物特征標(biāo)識(shí)是陽性還是陰性的可以包括：(i)測定一種或多種生物標(biāo)志物的樣品表達(dá)得分；(ii)將樣品表達(dá)得分與閾值得分進(jìn)行比較；和(iii)確定所述樣品表達(dá)得分是否高于或等于閾值表達(dá)得分，其中如果所述樣品表達(dá)得分高于或等于閾值得分，則所述樣品對(duì)于生物標(biāo)志物特征標(biāo)識(shí)是陽性的。在某些實(shí)施方案中，良好預(yù)后表明與生物標(biāo)志物特征標(biāo)識(shí)陰性的樣品相比，任選地與樣品表達(dá)得分低于閾值得分的樣品相比，增加的無進(jìn)展存活率或總存活率。

根據(jù)本發(fā)明的所有方面，可以測量來自受試者的樣品中選自表2或表3的兩種或更多種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平?？梢詼y量來自受試者的樣品中選自表2或表3的五種或更多種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平。評(píng)價(jià)所述樣品對(duì)于生物標(biāo)志物特征標(biāo)識(shí)是陽性還是陰性的可以包括使用分類樹或隨機(jī)森林。

分類樹(Breiman,Leo；Friedman,J.H.；Olshen,R.A.；Stone,C.J.(1984).Classification and regression trees.Monterey,CA:Wadsworth&Brooks/Cole Advanced Books&Software.ISBN 978-0-412-04841-8)提供了基于邏輯和規(guī)則預(yù)測結(jié)果的方式。通過被稱為二進(jìn)制遞歸分割(這是將數(shù)據(jù)分成分區(qū)/分支的迭代過程)的過程建立分類樹。目標(biāo)是建立區(qū)別預(yù)定義的類別的樹。樹中的每個(gè)節(jié)點(diǎn)對(duì)應(yīng)于變量。為了選擇在節(jié)點(diǎn)處的最佳分割，進(jìn)而考慮每個(gè)變量，其中嘗試和考慮每一可能的分割，并且最佳分割是在每個(gè)分區(qū)內(nèi)的分類標(biāo)記的多樣性中產(chǎn)生最大減少的分割。將其針對(duì)所有變量進(jìn)行重復(fù)，并且選擇勝者作為用于該節(jié)點(diǎn)的最佳分割器。在下一節(jié)點(diǎn)且以該方式繼續(xù)該過程，生成完整樹。分類樹相對(duì)于其他監(jiān)督學(xué)習(xí)方法如判別分析的優(yōu)點(diǎn)之一是，用于構(gòu)建樹的變量可以是分類的，或數(shù)值的，或兩者的混合物。以該方式，可以生成用于基于基因表達(dá)的方向性預(yù)測結(jié)果的分類樹。隨機(jī)森林算法(Breiman,Leo(2001)."Random Forests".Machine Learning 45(1):5-32.doi:10.1023/A:1010933404324)提供了對(duì)分類樹的進(jìn)一步延伸，由此隨機(jī)生成分類樹的集合以形成“森林”，并且從每個(gè)樹預(yù)測的結(jié)果的平均值用于進(jìn)行關(guān)于該結(jié)果的推理。

在一個(gè)方面，提供了用于使用本文中公開的表達(dá)特征標(biāo)識(shí)選擇是否向受試者施用抗血管生成治療劑的方法，所述方法包括從受試者獲得測試樣品，從測試樣品測量生物標(biāo)志物組的表達(dá)水平，測定生物標(biāo)志物組的樣品表達(dá)得分；將樣品表達(dá)得分與閾值得分進(jìn)行比較，和基于表達(dá)得分是否等于或高于閾值而選擇治療。在某些示例實(shí)施方案中，樣品表達(dá)得分等于或高于閾值得分表明抗血管生成劑是禁忌的且不應(yīng)施用于受試者。在某些示例實(shí)施方案中，低于閾值得分的樣品表達(dá)得分表明抗血管生成劑不是禁忌的且可以施用于受試者。如果癌癥的生長速率與不與治療劑接觸的其生長相比由于與治療劑接觸而加快，則治療劑對(duì)于患者是“禁忌的”或“有害的”。可以以各種方式測量癌癥的生長。例如，腫瘤的大小，或測量對(duì)于該腫瘤類型適當(dāng)?shù)哪[瘤標(biāo)志物的表達(dá)。如果治療劑的施用降低患者的總體預(yù)后(無進(jìn)展存活率和總存活率)，則治療劑也可以被認(rèn)為是“禁忌的”或“有害的”。在一個(gè)示例實(shí)施方案中，本文中公開的表達(dá)特征標(biāo)識(shí)可以確定在遵循標(biāo)準(zhǔn)癌癥療法施用抗血管生成劑后的患者的臨床預(yù)后。

在某些示例實(shí)施方案中，所述受試者患有癌癥。所述癌癥可以包括，但不限于，卵巢癌，乳腺癌，結(jié)腸癌，結(jié)直腸癌，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，腎癌，包括腎細(xì)胞癌，肝細(xì)胞癌，甲狀腺癌，胰腺癌，神經(jīng)內(nèi)分泌癌，食道癌，胃腸道間質(zhì)瘤(GIST)，胃癌，肝癌，包括成人原發(fā)性肝癌，淋巴瘤，黑色素瘤，或多發(fā)性骨髓瘤。在某些示例實(shí)施方案中，所述癌癥是卵巢癌。在某些其他示例實(shí)施方案中，所述卵巢癌是高級(jí)漿液性卵巢癌。在某些示例實(shí)施方案中，所述患者可能已經(jīng)接受、正在接受和/或?qū)⒔邮苤委煟鲋委熆梢允鞘茉囌叩陌┌Y類型的護(hù)理治療標(biāo)準(zhǔn)。在某些示例實(shí)施方案中，該可以是護(hù)理治療標(biāo)準(zhǔn)的治療可以包括用化療劑治療。所述化療治療可以包括施用基于鉑的化療劑、烷化劑、抗代謝物、抗腫瘤抗生素、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑、有絲分裂抑制劑或其組合。在某些示例實(shí)施方案中，所述化療治療包括施用基于鉑的化療劑、有絲分裂抑制劑或其組合。在某些其他示例實(shí)施方案中，所述化療治療包括施用卡鉑和紫杉醇。在一個(gè)示例實(shí)施方案中，所述受試者具有高級(jí)漿液性卵巢癌，且先前已經(jīng)接受基于鉑的化療劑和有絲分裂抑制劑。在另一個(gè)示例實(shí)施方案中，所述受試者具有高級(jí)漿液性卵巢癌，且先前已經(jīng)接受卡鉑和紫杉醇。所述抗血管生成治療劑可以是靶向VEGF-途徑的治療劑(如貝伐珠單抗或阿柏西普(aflibercept))，血管生成素-TIE2途徑抑制劑，內(nèi)源性血管生成抑制劑或免疫調(diào)節(jié)劑。在一個(gè)示例實(shí)施方案中，所述抗血管生成治療劑是靶向VEGF-途徑的治療劑。在另一個(gè)示例實(shí)施方案中，所述抗血管生成治療劑是貝伐珠單抗。

在另一個(gè)方面，提供了用于使用本文中公開的表達(dá)特征標(biāo)識(shí)選擇受試者的臨床預(yù)后的方法，所述方法包括從受試者獲得測試樣品，從測試樣品測量生物標(biāo)志物組的表達(dá)水平，測定生物標(biāo)志物組的樣品表達(dá)得分；將樣品表達(dá)得分與閾值表達(dá)得分進(jìn)行比較，其中如果所述表達(dá)得分等于或高于閾值表達(dá)得分，則臨床預(yù)后是良好預(yù)后。在某些示例實(shí)施方案中，良好預(yù)后表明與表達(dá)得分低于閾值得分的受試者相比增加的存活率。在某些示例實(shí)施方案中，所述受試者患有癌癥。所述癌癥可以包括，但不限于，卵巢癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、結(jié)直腸癌或膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。在某些示例實(shí)施方案中，所述癌癥是卵巢癌。在某些其他示例實(shí)施方案中，所述卵巢癌是高級(jí)漿液性卵巢癌。在某些示例實(shí)施方案中，所述受試者可以接受、已經(jīng)接受和/或?qū)⒔邮芑熤委?。所述化療治療可以包括施用基于鉑的化療劑、烷化劑、抗代謝物、抗腫瘤抗生素、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑、有絲分裂抑制劑或其組合。在某些示例實(shí)施方案中，所述化療治療包括施用基于鉑的化療劑、有絲分裂抑制劑或其組合。在某些其他示例實(shí)施方案中，所述化療治療包括施用卡鉑和紫杉醇。在一個(gè)示例實(shí)施方案中，所述受試者具有高級(jí)漿液性卵巢癌，且可以接受、已經(jīng)接受和/或?qū)⒔邮芑阢K的化療劑和有絲分裂抑制劑，如紫杉烷。在另一個(gè)示例實(shí)施方案中，所述受試者具有高級(jí)漿液性卵巢癌，且可以接受、已經(jīng)接受和/或?qū)⒔邮芸ㄣK和紫杉醇。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于上文所列常規(guī)診斷用途如qPCR、NGS、微陣列和免疫測定法如免疫組織化學(xué)、ELISA蛋白質(zhì)印跡法等的試劑盒。這類試劑盒包含分析基因或基因產(chǎn)物表達(dá)和定量mRNA或蛋白質(zhì)表達(dá)的適當(dāng)試劑和說明書。

還公開了用于鑒定具有或沒有無血管生成表型的人腫瘤的方法。在某些示例實(shí)施方案中，這類方法可以用來鑒定對(duì)藥物敏感并對(duì)藥物有反應(yīng)的患者，其中所述藥物直接或間接抑制涉及血管生成的過程。在某些其他示例實(shí)施方案中，這類方法可以用來鑒定對(duì)藥物抵抗或?qū)λ幬锊环磻?yīng)或?qū)⒁圆焕绞椒磻?yīng)的患者，其中所述藥物直接或間接抑制涉及血管生成的過程。

本發(fā)明還涉及指導(dǎo)有效治療患者。另外，提供涉及選擇患者治療方案和為當(dāng)前臨床試驗(yàn)或直接或間接影響血管生成的開發(fā)階段藥物選擇患者的方法。

此外，本文中描述了允許使用福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)的歸檔活組織檢查材料以及新鮮/冷凍(FF)的組織以分析全部轉(zhuǎn)錄物并因此與大部分廣泛可獲得類型的活組織檢查材料相容的方法?？梢允褂脧腇FPE組織、新鮮的冷凍組織或已經(jīng)在溶液如中貯存的新鮮組織所獲得的RNA，確定生物標(biāo)志物表達(dá)水平。

附圖簡述

圖1提供了顯示265份高級(jí)漿液性卵巢癌中的基因表達(dá)數(shù)據(jù)的無監(jiān)督層次聚類分析的熱圖。每一列表示一個(gè)腫瘤中這些探針組的表達(dá)。水平表示所有聚類間的探針組表達(dá)。熱圖上方的條通過如說明框中所述的聚類顏色編碼。第二條針對(duì)類別標(biāo)記進(jìn)行顏色編碼，如說明框中所述。對(duì)應(yīng)于各探針組聚類的功能過程被標(biāo)記于該圖的右側(cè)。

圖2提供了來自265份高級(jí)漿液性卵巢癌中的基因表達(dá)的無監(jiān)督分析的通過聚類的總存活率的Kaplan-Meier分析。

圖3提供了通過愛丁堡(發(fā)現(xiàn))數(shù)據(jù)集中的63-基因特征標(biāo)識(shí)分類器定義的兩個(gè)類別的存活率的Kaplan-Meier分析。促血管生成組由血管生成(Angio)和血管生成-免疫(Angioimmune)亞組。A.無進(jìn)展存活率。B.總存活率。

圖4提供了通過Tothill(驗(yàn)證)數(shù)據(jù)集中的63-基因特征標(biāo)識(shí)分類器定義的兩個(gè)類別的存活率的Kaplan-Meier分析。促血管生成組由血管生成(Angio)和血管生成-免疫(Angioimmune)亞組。A.無進(jìn)展存活率。B.總存活率。

圖5提供了ICON7試驗(yàn)組群中的患者的免疫(圖5A)和促血管生成(圖5B)亞組中的無進(jìn)展存活率的Kaplan Meier曲線。在每個(gè)圖內(nèi)，顯示跨越2個(gè)隨機(jī)化治療組間的存活率差異：1)卡鉑加上紫杉醇化療和2)卡鉑加上紫杉醇化療加上貝伐珠單抗。

圖6提供了ICON7試驗(yàn)組群中的患者的免疫(圖6A)和促血管生成(圖6A)亞組中的總存活率的Kaplan Meier曲線。在每個(gè)圖內(nèi)，顯示跨越2個(gè)隨機(jī)化治療組間的存活率差異：1)卡鉑加上紫杉醇化療和2)卡鉑加上紫杉醇化療加上貝伐珠單抗。

圖7提供了通過63基因特征標(biāo)識(shí)定義的卡鉑和紫杉醇治療的ICON7試驗(yàn)患者的無進(jìn)展生存期(A)和總生存期(B)的Kaplan Meier曲線。

圖8A和8B是表明如適用于結(jié)直腸癌樣品的示例非血管生成特征標(biāo)識(shí)的特定分類性能基準(zhǔn)的圖。

圖9：特征標(biāo)識(shí)開發(fā)：CV下的訓(xùn)練集的AUC。

圖10：特征標(biāo)識(shí)開發(fā)：CV下的訓(xùn)練集的C-指數(shù)。

圖11：特征標(biāo)識(shí)開發(fā)：CV下的訓(xùn)練集的HR。

圖12：特征標(biāo)識(shí)開發(fā)：CV下的ICON7SOC樣品的HR。

圖13：特征標(biāo)識(shí)開發(fā)：CV下的ICON7SOC樣品的C-指數(shù)。

圖14：特征標(biāo)識(shí)開發(fā)：CV下的ICON7免疫樣品的HR。

圖15：特征標(biāo)識(shí)開發(fā)：CV下的ICON7ProAngio樣品的HR。

圖16：核心集合分析：Immune63GeneSig_CoreGenes_Internal Val.png。

圖17：核心集合分析：Immune63GeneSig_CoreGenes_Tothill.png.

圖18：核心集合分析：Immune63GeneSig_CoreGenes_ICON7_SOC.png。

圖19：最小基因集合分析：Immune63GeneSig_MinGenes_Tothill.png。

圖20：ICON7SOC：最小基因集合分析：Immune63GeneSig_MinGenes_ICON7_SOC.png。

圖21：ICON7免疫：最小基因集合分析：Immune63GeneSig_MinGenes_ICON7_Immune.png。

圖22：顯示通過63基因特征標(biāo)識(shí)預(yù)測為血管生成-關(guān)(Angio-Off)(無活性)的樣品相比于預(yù)測為血管生成-開(Angio-On)(活性)的樣品之間的無進(jìn)展存活概率的差異的Kaplan Meier。

圖23：使用血管生成定義基因列表對(duì)Marrisa等人(2013)公開的529份CRC樣品的半監(jiān)督層次聚類分析。

圖24：顯示Marissa CRC數(shù)據(jù)中的血管生成活性亞型和血管生成無活性亞型之間的63基因特征標(biāo)識(shí)得分的區(qū)別的ROC曲線。

圖25：顯示如通過GSE14333CRC數(shù)據(jù)中的63基因特征標(biāo)識(shí)所預(yù)測血管生成活性和血管生成無活性患者(僅治療的)之間的存活率差異的Kaplan Meier曲線。

發(fā)明詳述

除非另外定義，本文中所用的技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語具有與本公開所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所理解的相同意義。分子生物學(xué)中常用術(shù)語的定義可以在以下文獻(xiàn)中找到：Benjamin Lewin,Genes IX,2008年Jones和Bartlet出版(ISBN 0763752223)；Kendrew等人,(編著),The Encyclopedia of Molecular Biology,1994年Blackwell Science Ltd.出版(ISBN 0632021829)；Robert A.Meyers(編著),Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference,1995年VCH Publishers,Inc.出版(ISBN 9780471185710)；Singleton等人,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology第2版,J.Wiley&Sons(New York,N.Y.1994)以及March,Advanced Organic Chemistry Reactions,Mechanisms and Structure第4版,John Wiley&Sons(New York,N.Y.1992)。

除非上下文另外清楚地指出，單數(shù)術(shù)語“一個(gè)/種(a)”、“一個(gè)/種(an)”和“該(the)”包括復(fù)數(shù)稱謂。類似地，除非上下文另外清楚地指出，詞語“或”意指包括“和”。術(shù)語“包含”意指“包括”。在矛盾的情況下，本說明書(包括術(shù)語的解釋)將居主導(dǎo)。

如本文所用，術(shù)語“生物標(biāo)志物組”、“表達(dá)分類器”、“分類器”、“表達(dá)特征標(biāo)識(shí)”或“特征標(biāo)識(shí)”可以互換地使用。所述組通常包括多種生物標(biāo)志物，但可以僅包括單一生物標(biāo)志物，其中該生物標(biāo)志物單獨(dú)可用于本發(fā)明的方法中。

全部出版物、公開的專利文獻(xiàn)和在本申請(qǐng)中援引的專利申請(qǐng)顯示本申請(qǐng)所屬領(lǐng)域的技術(shù)水平。全部出版物、公開的專利文獻(xiàn)和本文中援引的專利申請(qǐng)因而通過引用的方式以相同程度并入本文，如同通過引用方式專門且獨(dú)自地并入每份單獨(dú)的出版物、公開的專利文獻(xiàn)或?qū)＠暾?qǐng)。

概述

當(dāng)前癌癥研究努力的主要目的是通過將分子參數(shù)并入臨床治療決策，增加圍術(shù)期全身性療法在患者中的療效。藥物遺傳學(xué)/基因組學(xué)是涉及個(gè)體對(duì)外來化合物或藥物反應(yīng)的遺傳/基因組因素的研究。對(duì)本發(fā)明生物標(biāo)志物表達(dá)具有刺激性或抑制性作用的藥物或調(diào)節(jié)物可以向個(gè)體施用以(預(yù)防或治療性)治療患者中的癌癥。理想的是結(jié)合這種治療，還考慮該個(gè)體的藥物基因組學(xué)。治療劑代謝的差異有可能因改變藥理活性藥物的劑量和血液濃度之間的關(guān)系而導(dǎo)致嚴(yán)重毒性或治療失敗。因此，理解個(gè)體的藥物基因組學(xué)允許選擇有效藥劑(例如，藥物)用于預(yù)防性或治療性治療。這種藥物基因組學(xué)還可以用來確定適當(dāng)?shù)膭┝亢椭委煼桨?。因此，可以確定個(gè)體中本發(fā)明生物標(biāo)志物的表達(dá)水平，以便因而選擇適當(dāng)藥劑用于個(gè)體的治療性或預(yù)防性治療。

本發(fā)明涉及可用于診斷來自不同解剖部位的癌癥的分子診斷測試，其包括使用與血管生成相關(guān)的一種或多種常見亞型。本發(fā)明包括將受試者鑒定為具有良好或不良臨床預(yù)后的表達(dá)特征標(biāo)識(shí)，和表明是否向受試者施用抗血管生成治療劑的表達(dá)特征標(biāo)識(shí)。通過從病理學(xué)和/或臨床結(jié)果已知的樣品集合獲得樣品的表達(dá)概況，導(dǎo)出該表達(dá)特征標(biāo)識(shí)。樣品可以源自相同的樣品組織類型或不同的組織類型。如本文所用，“表達(dá)概況”包含一組值，所述值代表從給定樣品分析出的每種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平。

隨后使用數(shù)學(xué)模型分析來自樣品集合的表達(dá)概況。不同數(shù)學(xué)模型可以應(yīng)用并且包括但不限于來自以下領(lǐng)域的模型：模式識(shí)別(Duda等人,Pattern Classification,第2版,John Wiley,New York 2001)、機(jī)器學(xué)習(xí)(等人,Learning with Kernels,MIT Press,Cambridge 2002,Bishop,Neural Networks for Pattern Recognition,Clarendon Press,Oxford 1995)、統(tǒng)計(jì)學(xué)(Hastie等人,The Elements of Statistical Learning,Springer,New York 2001)、生物信息學(xué)(Dudoit等人,2002,J.Am.Statist.Assoc.97:77-87,Tibshirani等人,2002,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99:6567-6572)或化學(xué)計(jì)量學(xué)(Vandeginste等人,Handbook of Chemometrics and Qualimetrics,Part B,Elsevier,Amsterdam 1998)。數(shù)學(xué)模型鑒定一種或多種在樣品集合中表達(dá)的最能預(yù)示給定疾病表型的生物標(biāo)志物。一種或多種這些生物標(biāo)志物限定一個(gè)表達(dá)特征標(biāo)識(shí)。因此，表達(dá)特征標(biāo)識(shí)包含被鑒定為最能預(yù)示給定疾病表型的生物標(biāo)志物。在某些示例實(shí)施方案中，該數(shù)學(xué)模型為每種鑒定生物標(biāo)志物定義變量，如權(quán)重。在某些示例實(shí)施方案中，該數(shù)學(xué)模型定義決策函數(shù)。決策函數(shù)還可以定義將樣品集合分成兩個(gè)疾病表型(如，但不限于具有良好和不良臨床預(yù)后的樣品)的閾值得分。在一個(gè)示例實(shí)施方案中，線性分類器限定決策函數(shù)和表達(dá)特征標(biāo)識(shí)。

為了使用限定的表達(dá)特征標(biāo)識(shí)將新樣品分類，分離由該表達(dá)特征標(biāo)識(shí)定義的生物標(biāo)志物(也稱為生物標(biāo)志物組)并且確定該生物標(biāo)志物組的表達(dá)概況。以用來定義該表達(dá)特征標(biāo)識(shí)的相同數(shù)學(xué)模型分析新樣品的生物標(biāo)志物組表達(dá)概況。所述生物標(biāo)志物組可以包含通過表達(dá)特征標(biāo)識(shí)定義的生物標(biāo)志物中的一種或多種。所述生物標(biāo)志物組可以包含通過表達(dá)特征標(biāo)識(shí)定義的生物標(biāo)志物中的一種或多種。在某些示例實(shí)施方案中，所述生物標(biāo)志物組包含表2中列出的生物標(biāo)志物中的一種或多種。在某些其他示例實(shí)施方案中，所述生物標(biāo)志物組包含表2中列出的所有生物標(biāo)志物。在某些示例實(shí)施方案中，所述生物標(biāo)志物組包含表2中列出的生物標(biāo)志物中的一種或多種。在某些其他示例實(shí)施方案中，所述生物標(biāo)志物組包含表2中列出的所有生物標(biāo)志物。在某些示例實(shí)施方案中，該數(shù)學(xué)模型限定新樣品的表達(dá)得分?？梢酝ㄟ^使用非線性、幾何、三角學(xué)或相關(guān)手段，將生物標(biāo)志物的表達(dá)值與相應(yīng)標(biāo)量權(quán)重合并以導(dǎo)出單個(gè)標(biāo)量值，確定該表達(dá)得分。將該表達(dá)得分與閾值得分比較并且基于表達(dá)得分是否大于或等于、或小于閾值得分，將樣品分類。在某些示例實(shí)施方案中，等于或大于閾值得分的樣品表達(dá)得分表明受試者具有良好預(yù)后，且低于閾值得分的樣品表達(dá)得分表明受試者具有不良的臨床預(yù)后。在某些示例實(shí)施方案中，等于或大于閾值得分的樣品表達(dá)得分表明受試者具有所述特征標(biāo)識(shí)。這可以表明良好的臨床預(yù)后。低于閾值得分的樣品表達(dá)得分表明受試者不具有特征標(biāo)識(shí)。這可以表明不良的臨床預(yù)后。

本文中公開的表達(dá)特征標(biāo)識(shí)的一項(xiàng)應(yīng)用是鑒定具有良好和不良臨床預(yù)后的患者。良好或不良預(yù)后可以特定治療背景(如卡鉑/紫杉醇，如本文所討論)的上下文中確定。例如，所述受試者可以正在接受或已經(jīng)接受用于受試者的癌癥類型的標(biāo)準(zhǔn)化療治療?？紤]到治療背景，本文中公開的表達(dá)特征標(biāo)識(shí)還可以用于確定是否應(yīng)當(dāng)向患者施用額外治療劑如抗血管生成治療劑。通過檢查腫瘤中至少一種鑒定的生物標(biāo)志物、任選鑒定的生物標(biāo)志物的集合的表達(dá)，可能確定患者的可能臨床結(jié)果。通過檢查至少一種生物標(biāo)志物、任選生物標(biāo)志物的集合的表達(dá)，因此可能鑒定最需要更激進(jìn)治療方案的那些患者并且同樣消除不必要的治療性療法或不可能顯著改善或可能損害患者臨床結(jié)果的那些療法。本發(fā)明涉及使用至少無進(jìn)展存活率和總存活率預(yù)測臨床預(yù)后。因此，“良好預(yù)后”表明具有與其他癌癥亞型相比表明增強(qiáng)存活率的癌癥亞型的受試者群體，而“不良預(yù)后”或“較差預(yù)后”表明具有與其他癌癥亞型相比表明降低存活率的癌癥亞型的受試者群體?？梢钥紤]的額外預(yù)后因素是種族性和人種、年齡、疾病階段、組織學(xué)、腫瘤等級(jí)、腫瘤標(biāo)志物(例如，CA125)、位點(diǎn)特異性外科療法、殘余疾病的尺度和腫瘤應(yīng)答。在某些示例實(shí)施方案中，將表達(dá)得分等于或高于閾值得分的受試者分類為具有無血管生成亞型。在另一個(gè)示例實(shí)施方案中，將樣品表達(dá)得分高于閾值得分的受試者分類為具有良好臨床預(yù)后。在又另一個(gè)示例實(shí)施方案中，樣品表達(dá)得分高于或等于閾值得分的受試者表明，如果施用抗血管生成治療劑，受試者將可能經(jīng)歷不利影響，或具有較差臨床預(yù)后。

在某些示例實(shí)施方案中，受試者的臨床預(yù)后的確定或額外治療劑的選擇可以在過去、目前或計(jì)劃的化療治療的背景下作出。例如，受試者可以設(shè)置為開始，目前正在接受，或已經(jīng)剛剛完成，用于受試者的癌癥類型的護(hù)理化療治療標(biāo)準(zhǔn)。在某些示例實(shí)施方案中，所述化療治療可以包括施用烷基化劑、抗代謝物、基于鉑的藥物、抗腫瘤抗生素、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑、有絲分裂抑制劑、皮質(zhì)類固醇、基于激素的治療劑或其組合。示例性烷化劑包括氮芥類、亞硝基脲類、烷基磺酸鹽類、三嗪類和乙烯亞胺類。示例性鉑藥物包括順鉑、卡鉑和奧沙利鉑。示例性抗代謝物包括5-氟尿嘧啶、6-巰基嘌呤、卡培他濱、克拉屈濱、氯法拉濱、阿糖胞苷、氟尿苷、氟達(dá)拉濱、吉西他濱、羥基脲、甲氨蝶呤、培美曲塞、噴司他丁和硫鳥嘌呤。示例性抗腫瘤抗生素包括柔紅霉素、阿霉素、表阿霉素、伊達(dá)比星、放線菌素-D、博萊霉素、絲裂霉素-C和米托蒽醌。示例性拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑包括拓?fù)涮婵?、伊立替康、依托泊苷和替尼泊苷。示例性有絲分裂抑制劑包括紫杉烷類、埃博霉素類、長春花生物堿類和雌莫司汀。示例性皮質(zhì)類固醇包括強(qiáng)的松、甲基強(qiáng)的松龍和地塞米松。在某些示例實(shí)施方案中，所述化療可以包括用以下治療：L-門冬酰胺酶、伊馬替尼、吉非替尼、舒尼替尼、硼替佐米、視黃醇、維甲酸、bexaroten、三氧化二砷、fluvestrant、他莫昔芬、托瑞米芬、阿那曲唑、依西美坦、來曲唑、孕激素類、雌激素類、比卡魯胺、氟他胺、尼魯米特、gonadotropoin釋放激素激動(dòng)劑或類似物、利妥昔單抗、阿侖珠單抗、BCG、白介素-2、干擾素-α、沙利度胺和來那度胺。

在某些示例實(shí)施方案中，所述化療治療可以包括環(huán)磷酰胺、甲氨蝶呤和氟尿嘧啶(CMF)治療方案，環(huán)磷酰胺、阿霉素和氟尿嘧啶(CAF)治療方案，表柔比星和環(huán)磷酰胺(EC)治療方案，氟尿嘧啶、表阿霉素和環(huán)磷酰胺(FEC)治療方案，紫杉醇和環(huán)磷酰胺治療方案，紫杉醇和卡鉑治療方案，多柔比星和環(huán)磷酰胺治療方案，或阿霉素和紫杉醇治療方案。在一個(gè)示例實(shí)施方案中，腫瘤輔助癌癥療法包含基于鉑的化療治療方案。在一個(gè)示例實(shí)施方案中，基于鉑的化療治療方案包含紫杉醇和卡鉑。

本文中公開的表達(dá)特征標(biāo)識(shí)的另一項(xiàng)應(yīng)用是將針對(duì)涵蓋抗血管生成療法的治療藥物類別的反應(yīng)分類并針對(duì)治療藥物類別選擇這些患者。通過檢查腫瘤中一組已鑒定生物標(biāo)志物的表達(dá)，可以確定哪種治療藥或藥物組合將最有可能減少癌癥生長速率。還可以確定哪種治療藥或藥物組合將最不可能減少癌癥生長速率和/或哪種可以引起不良影響且因此是禁忌的。通過檢查一組生物標(biāo)志物的表達(dá)，因此可能消除無效或不適當(dāng)?shù)闹委熕?。重要地，在某些?shí)施方案中，可以基于每位患者或基于每種藥物進(jìn)行這些確定。因此，可以決定特定治療方案是否有可能有益于特定患者或患者類型，和/或特定方案是否應(yīng)當(dāng)繼續(xù)進(jìn)行。本發(fā)明提供可以在臨床試驗(yàn)評(píng)價(jià)新治療劑期間指導(dǎo)療法選擇以及為富集策略選擇患者組的實(shí)驗(yàn)。例如，當(dāng)評(píng)價(jià)推定性抗血管生成藥或治療方案時(shí)，本文所公開的表達(dá)特征標(biāo)識(shí)和方法可以用來為臨床試驗(yàn)選擇具有響應(yīng)于抗血管生成劑的癌癥亞型的個(gè)體。

如果與不接觸治療劑時(shí)的癌癥生長相比，癌癥的生長速率因接觸于治療劑被抑制，則這種癌癥“響應(yīng)于”該治療劑?？梢园炊喾N方式測量癌的生長。例如，腫瘤的大小或測量適用于該腫瘤類型的腫瘤標(biāo)記的表達(dá)。在一個(gè)示例實(shí)施方案中，本文所公開的表達(dá)特征標(biāo)識(shí)可以確定在遵循用于患者的癌癥類型的護(hù)理化療療法標(biāo)準(zhǔn)施用抗血管生成劑后的患者的臨床預(yù)后。

與不接觸治療劑時(shí)的癌癥生長相比時(shí)，癌癥的生長速率不因接觸于治療劑被抑制或被抑制到極低程度，則這種癌癥“不響應(yīng)于”該治療劑。如上文所述，可以按多種方式測量癌癥的生長，例如，腫瘤的大小或測量適用于該腫瘤類型的腫瘤標(biāo)記的表達(dá)。不響應(yīng)于治療劑的性質(zhì)是一種高度變異的性質(zhì)，不同的癌癥在不同條件下針對(duì)給定治療劑顯示不同水平的“無響應(yīng)性”。另外，可以使用腫瘤生長尺寸之外的額外標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估無響應(yīng)性的量值，但不限于患者生活質(zhì)量和轉(zhuǎn)移程度。

可以從新鮮/冷凍的(FF)或福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)的患者樣品鑒定血管生成亞型。在一個(gè)示例實(shí)施方案中，癌癥類型是卵巢癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、結(jié)直腸癌、肺癌、前列腺癌或膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。在另一個(gè)示例實(shí)施方案中，癌癥類型是卵巢癌。在又一個(gè)示例實(shí)施方案中，癌癥類型是乳腺癌。在另一個(gè)示例實(shí)施方案中，癌癥類型是肺癌。在另一個(gè)示例實(shí)施方案中，癌癥類型是結(jié)腸癌。在另一個(gè)示例實(shí)施方案中，癌癥類型是前列腺癌。在另一個(gè)示例實(shí)施方案中，癌癥類型是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。

鑒定表達(dá)特征標(biāo)識(shí)

通過分析患者樣品集合中某些生物標(biāo)志物的表達(dá)概況鑒定本發(fā)明的表達(dá)特征標(biāo)識(shí)。適用于本發(fā)明中的生物標(biāo)志物包括DNA、RNA和蛋白質(zhì)。在一個(gè)示例實(shí)施方案中，適合于用于本發(fā)明中的生物標(biāo)志物包括RNA和cDNA。從患者樣品分離生物標(biāo)志物并且測定它們的表達(dá)水平以導(dǎo)出患者樣品集合中分析的每份樣品的一組表達(dá)概況。在某些示例實(shí)施方案中，表達(dá)特征標(biāo)識(shí)鑒定癌組織中觀察到的無血管生成表型，其被鑒定為生物標(biāo)志物組合的高于或等于閾值的特征標(biāo)識(shí)得分，所述表型以免疫反應(yīng)相關(guān)的基因的上調(diào)和與血管生成和血管發(fā)育相關(guān)過程相關(guān)的基因的下調(diào)為特征。

a.表達(dá)概況

在某些實(shí)施方案中，獲得的表達(dá)概況是基因組或核酸表達(dá)概況，其中測定一種或多種核酸在樣品中的量或水平。在這些實(shí)施方案中，經(jīng)分析以產(chǎn)生診斷方法或預(yù)測方法中使用的表達(dá)概況的樣品是核酸樣品。核酸樣品包括核酸群體包含正在分析的細(xì)胞或組織的表型決定性生物標(biāo)志物的表達(dá)信息。在一些實(shí)施方案中，核酸可以包括RNA或DNA核酸，例如，mRNA、cRNA、cDNA等，只要樣品保留獲得該核酸的宿主細(xì)胞或組織的表達(dá)信息即可。樣品可以如本領(lǐng)域已知，以眾多不同方式制備，例如，通過從細(xì)胞分離mRNA，其中使用分離的mRNA作為分離、擴(kuò)增或使用以制備cDNA、cRNA等，如差異性基因表達(dá)領(lǐng)域中已知。因此，測定樣品中mRNA的水平包括從mRNA制備cDNA或cRNA并隨后測量cDNA或cRNA。一般從需要治療的受試者中收獲(例如，使用標(biāo)準(zhǔn)方案通過組織活檢)的細(xì)胞或組織制備樣品，其中可以從中生成這類核酸的細(xì)胞類型或組織包括其中存在待確定表型的表達(dá)模式的任何組織，包括但不限于疾病細(xì)胞或組織、體液等。

可以使用任何便利方案從初始的核酸樣品生成表達(dá)概況。盡管已知產(chǎn)生表達(dá)概況的多種不同方式，如差異性基因表達(dá)/生物標(biāo)志物分析領(lǐng)域中所用的那些，但是一種生成表達(dá)概況的代表性和便利方案類型是基于陣列的基因表達(dá)概況生成方案。這類應(yīng)用是雜交測定法，其中使用這樣的核酸，所述核酸對(duì)待生成的圖譜中待測定/概況分析的每個(gè)基因展示“探針”核酸。在這些測定法中，首先從正在分析的初始核酸樣品制備靶核酸樣品，其中制備可以包括用標(biāo)志物(例如，信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)的成員)標(biāo)記靶核酸。在制備靶核酸樣品之后，將樣品與陣列在雜交條件下接觸，因而在與連接至陣列表面的探針序列互補(bǔ)的靶核酸之間形成復(fù)合物。隨后定性或定量檢測雜交的復(fù)合物的存在?？梢詫?shí)施以生成主題方法中所用表達(dá)概況的特異性雜交技術(shù)包括在以下文獻(xiàn)中描述的技術(shù)：美國專利號(hào)5,143,854；5,288,644；5,324,633；5,432,049；5,470,710；5,492,806；5,503,980；5,510,270；5,525,464；5,547,839；5,580,732；5,661,028；5,800,992；所述專利的公開內(nèi)容所述文獻(xiàn)通過引用的方式并入本文；以及WO 95/21265；WO 96/31622；WO 97/10365；WO 97/27317；EP 373 203；和EP 785 280。在這些方法中，“探針”核酸陣列與如上文所述的靶核酸接觸，所述陣列包含正在確定其表達(dá)的每種生物標(biāo)志物的探針。在雜交條件(例如，如上文所述的嚴(yán)格雜交條件)下實(shí)施接觸，并且隨后移除未結(jié)合的核酸。所得到的雜交核酸樣式提供已經(jīng)探測到的每種生物標(biāo)志物的表達(dá)信息，其中表達(dá)信息涉及基因表達(dá)與否和一般處于何種水平，其中表達(dá)數(shù)據(jù)，即，表達(dá)概況，可以是定性和定量的。

b.疾病和樣品組織來源

在某些示例實(shí)施方案中，患者樣品包括癌癥組織樣品，如歸檔樣品?；颊邩悠穬?yōu)選地來自癌組織，且可以來自已經(jīng)通過預(yù)后、復(fù)發(fā)可能性、長期存活、臨床結(jié)果、治療反應(yīng)、診斷、癌癥分類或個(gè)性化基因組圖譜表征的樣品。如本文所用，癌癥包括但不限于白血病、腦癌、前列腺癌、肝癌、卵巢癌、胃癌、結(jié)直腸癌、喉癌、乳腺癌、皮膚癌、黑素瘤、肺癌、肉瘤、宮頸癌、睪丸癌、膀胱癌、內(nèi)分泌癌癥、子宮內(nèi)膜癌、食管癌、膠質(zhì)瘤、淋巴瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、骨肉瘤、胰腺癌、垂體癌癥、腎癌等。如本文所用，結(jié)直腸癌涵蓋可能在直腸和其他結(jié)腸端口的組織中涉及癌癥的癌癥以及可以單獨(dú)劃歸為結(jié)腸癌或直腸癌的癌癥。在一個(gè)實(shí)施方案中，本文所述的方法指用抗血管生成劑、抗血管生成靶向療法、血管生成信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑(但不限于這些類別)治療過的癌癥。這些癌癥還包括這些癌癥的處于多種發(fā)病階段的亞類和亞型。在某些示例實(shí)施方案中，患者樣品包含卵巢癌樣品。在某些示例實(shí)施方案中，所述卵巢癌樣品是漿液性卵巢癌樣品，如高級(jí)漿液性卵巢癌樣品。在另一個(gè)示例實(shí)施方案中，所述患者樣品包含乳腺癌樣品。在又另一個(gè)示例實(shí)施方案中，所述患者樣品包含膠質(zhì)母細(xì)胞瘤樣品。

“生物樣品”、“樣品”和“測試樣品”在本文中可互換地用來指從個(gè)體獲得或衍生的任何材料、生物流體、組織或細(xì)胞。這包括血液(包括全血、白細(xì)胞、外周血單核細(xì)胞、暗黃覆蓋層、血漿和血清)、痰、淚、粘液、鼻洗液、經(jīng)鼻抽吸物、呼吸、尿、精液、唾液、腦膜液、羊水、腺體液、淋巴液、乳頭抽吸物、支氣管抽吸物、滑液、關(guān)節(jié)抽吸物、腹水、細(xì)胞、細(xì)胞提取物和腦脊液。這還包括前述全部樣品的實(shí)驗(yàn)分離部分。例如，血液樣品可以分離成血清或分離成含有特定類型血細(xì)胞(如紅細(xì)胞或白細(xì)胞(白血球))的部分。如果需要，樣品可以是來自個(gè)體的樣品的組合，如組織和流體樣品的組合。術(shù)語“生物樣品”還包括含有(例如來自糞便樣品、組織樣品或組織活檢樣品的)均化固形物的材料。術(shù)語“生物樣品”還包括從組織培養(yǎng)或細(xì)胞培養(yǎng)物(包括組織切除和活檢樣品)衍生的材料?？梢允褂毛@得生物樣品的任何合適方法；示例性方法例如包括靜脈切開術(shù)、棉拭子(例如，頰拭子)和細(xì)針抽吸活組織檢查術(shù)。也可以例如通過顯微解剖(例如，激光捕獲顯微解剖(LCM)或激光顯微解剖(LMD))、膀胱沖洗、涂片(例如，PAP涂片)或乳管灌洗法采集樣品。從個(gè)體獲得或衍生的“生物樣品”包括從個(gè)體獲得后已經(jīng)按任何適合方式加工(例如，新鮮冷凍的或福爾馬林固定和/或石蠟包埋)的任何此種樣品。如本文定義的本發(fā)明方法可以始于獲得的樣品，因此并不必然地并入從患者獲得樣品的步驟。這些方法可以是對(duì)分離樣品進(jìn)行的體外方法。

如本文所用，術(shù)語“患者”包括人和非人動(dòng)物。用于治療的優(yōu)選患者是人。“患者”、“個(gè)體”和“受試者”在本文中互換地使用。

c.生物標(biāo)志物

如本文所用，術(shù)語“生物標(biāo)志物”可以指基因、mRNA、cDNA、反義轉(zhuǎn)錄物、miRNA、多肽、蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片段或指示基因表達(dá)水平或蛋白質(zhì)產(chǎn)生水平的任何其他核酸序列或多肽序列。當(dāng)生物標(biāo)志物指示個(gè)體中異常過程、疾病或其他狀況或是其跡象時(shí)，通常將這種生物標(biāo)志物描述為與表示個(gè)體中正常過程、不存在疾病或其他狀況或是其跡象的生物標(biāo)志物的表達(dá)水平或值相比過量表達(dá)或表達(dá)不足?！吧险{(diào)”、“上調(diào)的”、“過量表達(dá)”、“過量表達(dá)的”和其任何變型互換地用來指生物樣品中某生物標(biāo)志物的值或水平，所述值或水平大于一般在來自健康或正常個(gè)體的相似生物樣品中檢測到的該生物標(biāo)志物的值或水平(或值或水平范圍)。本術(shù)語還可以指生物樣品中生物標(biāo)志物的值或水平，所述值或水平大于可以在特定疾病的不同階段檢測到的該生物標(biāo)志物的值或水平(或值或水平范圍)。

“下調(diào)”、“下調(diào)的”、“表達(dá)不足”、“表達(dá)不足的”和其任何變型互換地用來指生物樣品中某生物標(biāo)志物的值或水平，所述值或水平小于一般在來自健康或正常個(gè)體的相似生物樣品中檢測到的該生物標(biāo)志物的值或水平(或值或水平范圍)。本術(shù)語還可以指生物樣品中生物標(biāo)志物的值或水平，所述值或水平小于可以在特定疾病不同階段檢測到的該生物標(biāo)志物的值或水平(或值或水平范圍)。

進(jìn)一步，過量表達(dá)或表達(dá)不足的生物標(biāo)志物與該生物標(biāo)志物的表示個(gè)體中正常過程或不存在疾病、疾病亞型或其他狀況或是其跡象的“正?！北磉_(dá)水平或值相比，也可以稱作“差異性表達(dá)”或稱作具有“差異性水平”或“差異性值”。因此，某生物標(biāo)志物的“差異性表達(dá)”也可以稱作距該生物標(biāo)志物“正常”表達(dá)水平的變化。

術(shù)語“差異性生物標(biāo)志物表達(dá)”和“差異性表達(dá)”互換用來指這樣的生物標(biāo)志物，其中所述生物標(biāo)志物在患有特定疾病的受試者中的表達(dá)相對(duì)正常受試者中其表達(dá)、或相對(duì)不同地響應(yīng)于特定療法或具有不同預(yù)后的患者中其表達(dá)被激活到更高或更低的水平。該術(shù)語還包括在相同疾病的不同階段其表達(dá)被激活到更高或更低水平的生物標(biāo)志物。還應(yīng)當(dāng)理解，差異性表達(dá)的生物標(biāo)志物可以在核酸水平或蛋白質(zhì)水平激活或受抑制，或可以經(jīng)受可變剪接以產(chǎn)生不同的多肽產(chǎn)物。這類差異可以由多種變化佐證，所述變化包括多肽的mRNA水平、miRNA水平、反義轉(zhuǎn)錄物水平或蛋白質(zhì)表面表達(dá)、分泌或其他分配作用。差異性生物標(biāo)志物表達(dá)可以包括比較兩種或更多種基因或其基因產(chǎn)物之間的表達(dá)；或比較兩種或更多種基因或其基因產(chǎn)物之間表達(dá)的比率；或甚至比較相同基因的兩種不同加工產(chǎn)物，所述加工產(chǎn)物在正常受試者和患有疾病的受試者之間或在相同疾病的各個(gè)階段之間差異。差異性表達(dá)包括例如正常細(xì)胞和患病細(xì)胞之間或已經(jīng)經(jīng)歷不同疾病事件或疾病階段的細(xì)胞之間生物標(biāo)志物的空間或細(xì)胞表達(dá)模式的定量差異以及定性差異。

在某些示例實(shí)施方案中，生物標(biāo)志物是RNA轉(zhuǎn)錄物。如本文所用，“RNA轉(zhuǎn)錄物”指編碼性RNA和非編碼性RNA，包括信使RNA(mRNA)、可變剪接的mRNA、核糖體RNA(rRNA)、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNA)、核小RNA(snRNA)和反義RNA。測量生物樣品中的mRNA可以用作檢測生物樣品中相應(yīng)蛋白質(zhì)和基因水平的替代。因此，也可以通過檢測適當(dāng)?shù)腞NA，檢測本文所述的任何生物標(biāo)志物或生物標(biāo)志物組。生物標(biāo)志物表達(dá)概況分析方法包括但不限于定量PCR、NGS、RNA印跡、DNA印跡、微陣列、SAGE、免疫測定法(ELISA、EIA、凝集法、散射比濁法、濁度測定法、蛋白質(zhì)印跡法、免疫沉淀法、免疫細(xì)胞化學(xué)、流式細(xì)胞術(shù)、Luminex測定法)和質(zhì)譜法。給定樣品的總體表達(dá)數(shù)據(jù)可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法歸一化，以校正起始物質(zhì)的不同量、提取和擴(kuò)增反應(yīng)的不同效率。

在某些示例實(shí)施方案中，可用于區(qū)分表明良好臨床預(yù)后和不良臨床預(yù)后的癌癥亞型的生物標(biāo)志物可以通過鑒定下述生物標(biāo)志物確定，其中所述生物標(biāo)志物顯示患者數(shù)據(jù)集中樣品之間如使用上文討論的表達(dá)檢測方法和患者樣品集所確定的最高程度變異性。本領(lǐng)域已知的用于鑒定表達(dá)數(shù)據(jù)中高度變異性數(shù)據(jù)點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)方法可以用來鑒定高度變異性生物標(biāo)志物。例如，針對(duì)患者數(shù)據(jù)集的聯(lián)合背景和方差過濾程序。背景程序基于選擇表達(dá)E和表達(dá)方差var_E高于下述閾值的探針組，其中所述述閾值由背景標(biāo)準(zhǔn)偏差σBg(來自表達(dá)控制臺(tái)(Expression Console)軟件)和指定顯著性時(shí)標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分布z_α的分位數(shù)限定，如果下述滿足，則保留a探針組：

E>log₂((z_aσ_Bg))；log₂((var_E)>2[log₂(σ_Bg)-E-log₂(log(2))]

其中a定義顯著性閾值。在某些示例實(shí)施方案中，顯著性閾值是6.3·10^-5。在另一個(gè)示例實(shí)施方案中，顯著性閾值可以在1.0·10^-7至1.0·10^-3之間。

在某些示例實(shí)施方案中，可以進(jìn)一步分析高度變異性生物標(biāo)志物，以將患者數(shù)據(jù)集中的樣本基于相似的基因表達(dá)概況分組成亞型或聚類。例如，可以將生物標(biāo)志物基于其表達(dá)上調(diào)或下調(diào)多大程度地彼此相互關(guān)聯(lián)來聚類。可以使用本領(lǐng)域已知的多種聚類分析技術(shù)。在一個(gè)示例實(shí)施方案中，凝聚層次聚類法用來鑒定癌癥亞型。為了確定每個(gè)亞型的生物學(xué)意義，每個(gè)聚類內(nèi)部的生物標(biāo)志物可以進(jìn)一步定位到它們的相應(yīng)基因并通過交叉引用一個(gè)或多個(gè)基因本體論數(shù)據(jù)庫注釋，所述數(shù)據(jù)庫含有與基因相關(guān)的生物活性和生物學(xué)途徑的信息。在另一個(gè)示例實(shí)施方案中，將聚類中上調(diào)并對(duì)免疫反應(yīng)通用函數(shù)項(xiàng)富集的生物標(biāo)志物分組成推定性無血管生成樣品組并用于表達(dá)特征標(biāo)識(shí)生成。在另一個(gè)示例實(shí)施方案中，將聚類中下調(diào)并對(duì)血管生成和血管發(fā)育富集并上調(diào)和對(duì)免疫反應(yīng)通用函數(shù)項(xiàng)富集的生物標(biāo)志物分組成推定性無血管生成樣品組并用于表達(dá)特征標(biāo)識(shí)生成。在以下實(shí)施例部分中提供實(shí)施生物標(biāo)志物聚類的泛函分析的進(jìn)一步的細(xì)節(jié)。

在一個(gè)示例實(shí)施方案中，可用于導(dǎo)出用于本發(fā)明中的表達(dá)特征標(biāo)識(shí)的生物標(biāo)志物是在表1中列出的標(biāo)志物列出的那些生物標(biāo)志物。發(fā)現(xiàn)這些生物標(biāo)志物具有確定患者對(duì)治療劑反應(yīng)的預(yù)測價(jià)值和/或在鑒定臨床預(yù)后良好或不良的個(gè)體方面具有預(yù)后價(jià)值。

在某些示例實(shí)施方案中，本文所公開的生物標(biāo)志物的表達(dá)與患者是否將由于施用抗血管生成治療劑而經(jīng)歷不利或有利作用相關(guān)。通過檢查一組生物標(biāo)志物的表達(dá)，因此可能消除無效或不適當(dāng)?shù)闹委焺Ｖ匾兀谀承?shí)施方案中，可以基于每位患者或基于每種藥物進(jìn)行這些確定。因此，可以決定特定治療方案是否有可能有益于特定患者或患者類型，和/或特定方案是否應(yīng)當(dāng)繼續(xù)進(jìn)行。

在某些其他示例實(shí)施方案中，本文中公開的生物標(biāo)志物的表達(dá)與患者的總體臨床預(yù)后相關(guān)。通過檢查腫瘤中鑒定到的一組生物標(biāo)志物的表達(dá)，可以確定個(gè)體是否患有與良好臨床預(yù)后或不良臨床預(yù)后相關(guān)的癌癥亞型。重要地，在某些實(shí)施方案中，可以基于每位患者進(jìn)行這些確定。因此，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以使用預(yù)測的預(yù)后輔助選擇適當(dāng)?shù)闹委煼桨敢灾委熁A(chǔ)性疾病，同時(shí)消除很可能產(chǎn)生不利或醫(yī)學(xué)上無保障的不良副作用的那些治療方案。

表1中列出的SEQ ID NO指用來測量示例性轉(zhuǎn)錄組陣列上基因表達(dá)水平的探針組標(biāo)識(shí)符。已經(jīng)使用來自具有不同探針組的不同陣列的表達(dá)數(shù)據(jù)交叉驗(yàn)證本發(fā)明的表達(dá)特征標(biāo)識(shí)，如以下實(shí)施例部分中進(jìn)一步詳述。因此，本文所公開的表達(dá)特征標(biāo)識(shí)和方法不限于使用本文中公開的探針組測量的表達(dá)值。

表1：圖1的聚類中的基因

在某些示例實(shí)施方案中，表1中列舉的全部或部分生物標(biāo)志物可以用于表達(dá)特征標(biāo)識(shí)中。例如，包含表1中生物標(biāo)志物的表達(dá)特征標(biāo)識(shí)可以使用本文提供的方法生成并且可以包含表1中所述的一個(gè)和全部之間的生物標(biāo)志物和其間的每個(gè)和每種組合(例如，4個(gè)選擇的標(biāo)志物、16個(gè)選擇的標(biāo)志物、74個(gè)選擇的標(biāo)志物等)。在一些實(shí)施方案中，所述表達(dá)特征標(biāo)識(shí)包含至少5、10、20、40、60、100、150、200、或300或更多個(gè)標(biāo)志物。在其他實(shí)施方案中，預(yù)測性生物標(biāo)志物組包含不多于5、10、20、40、60、100、150、200、300、400、500，600或700個(gè)標(biāo)志物。在一個(gè)示例實(shí)施方案中，表達(dá)特征標(biāo)識(shí)包括表1中列出的多個(gè)標(biāo)志物。在一些實(shí)施方案中，表達(dá)特征標(biāo)識(shí)包括至少約1％、約5％、約10％、約20％、約30％、約40％、約50％、約60％、約70％、約80％、約90％、約95％、約96％、約97％、約98％、或約99％在表1中列出的標(biāo)志物?？梢允褂帽疚乃龅姆椒ê捅绢I(lǐng)域已知的類似方法，從提供的生物標(biāo)志物裝配出選擇的表達(dá)特征標(biāo)識(shí)。在一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)特征標(biāo)識(shí)含有表1中的全部基因或基因產(chǎn)物。

4.數(shù)學(xué)模型

以下方法可以用來導(dǎo)出區(qū)分響應(yīng)或不響應(yīng)于抗血管生成治療劑的受試者的表達(dá)特征標(biāo)識(shí)，或用作某些癌癥類型的預(yù)后指示劑，包括從上文公開的生物標(biāo)志物導(dǎo)出的表達(dá)特征標(biāo)識(shí)。在某些其他示例實(shí)施方案中，使用決策樹(Hastie等人,The Elements of Statistical Learning,Springer,New York 2001)、隨機(jī)森林法(Breiman,2001 Random Forests,Machine Learning 45:5)、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法(Bishop,Neural Networks for Pattern Recognition,Clarendon Press,Oxford 1995)、判別分析(Duda等人,Pattern Classification,第2版,John Wiley,New York 2001)，包括但不限于線性、對(duì)角線性、二次和對(duì)數(shù)判別分析、微整列預(yù)測分析(PAM,(Tibshirani等人,2002,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99:6567-6572))或類模擬軟獨(dú)立建模分析(SIMCA,(Wold,1976,Pattern Recogn.8:127-139))導(dǎo)出表達(dá)特征標(biāo)識(shí)。

可以聯(lián)合幅度變動(dòng)的真比例尺上的相應(yīng)標(biāo)量權(quán)重，限定生物標(biāo)志物表達(dá)值，所述生物標(biāo)志物表達(dá)值進(jìn)一步通過線性或非線性、幾何、三角學(xué)或相關(guān)手段，借助幾何算法、統(tǒng)計(jì)學(xué)習(xí)算法、貝葉斯算法、消退算法或相似算法合并成單個(gè)標(biāo)量值，所述算法與基于標(biāo)量值的數(shù)學(xué)推導(dǎo)的決策函數(shù)一起提供預(yù)測模型，其中來自樣品的表達(dá)概況可以借助所述預(yù)測模型解析成獨(dú)立類別：指定藥物、藥物類別、分子亞型或治療方案的反應(yīng)個(gè)體或無反應(yīng)個(gè)體、對(duì)其抵抗或不抵抗。從源自藥物反應(yīng)和/或耐藥性已知的患者歷史樣品的一組代表性表達(dá)概況中，在交叉驗(yàn)證、自展或相似采樣技術(shù)下，通過針對(duì)靈敏度、特異性、負(fù)和正預(yù)示值、風(fēng)險(xiǎn)比或其任意組合優(yōu)化的學(xué)習(xí)權(quán)重和決策閾值，形成這類預(yù)測模型。

在一個(gè)實(shí)施方案中，生物標(biāo)志物用來形成其信號(hào)的權(quán)重總和，其中各項(xiàng)權(quán)重可以為正或負(fù)。所產(chǎn)生的總和(“表達(dá)得分”)與預(yù)定的參考點(diǎn)或值比較。參考點(diǎn)或值的比較可以用來診斷或預(yù)測臨床狀況或結(jié)果。

如上文描述，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解，在表1中提供的分類器內(nèi)所包含的生物標(biāo)志物將攜帶用于確定臨床預(yù)后的分類器的不等權(quán)重。因此，盡管少至一種生物標(biāo)志物可以用來診斷或預(yù)測臨床預(yù)后或?qū)χ委焺┑姆磻?yīng)，可以使用更多生物標(biāo)志物增加特異性和靈敏度或診斷或預(yù)測準(zhǔn)確度。

如本文所用，術(shù)語“權(quán)重”指統(tǒng)計(jì)計(jì)算中某項(xiàng)的絕對(duì)量級(jí)。可以使用本領(lǐng)域已知的學(xué)習(xí)方法，基于患者樣品的數(shù)據(jù)集確定基因表達(dá)分類器中每種生物標(biāo)志物的權(quán)重。如本文所用術(shù)語“偏差”或“偏置”指使用培訓(xùn)集中的特征標(biāo)識(shí)基因的平均表達(dá)所導(dǎo)出的常數(shù)項(xiàng)并且用來平均中心化檢驗(yàn)數(shù)據(jù)集中分析的每個(gè)基因。

在某些示例實(shí)施方案中，表達(dá)特征標(biāo)識(shí)由決策函數(shù)限定。決策函數(shù)是使用線性分類器導(dǎo)出的一組權(quán)重表達(dá)值。全部線性分類器使用以下等式定義決策函數(shù)：

f(x)＝w’·x+b＝∑w_i·x_i+b (1)

特定樣品的全部測量值，如微陣列基因表達(dá)強(qiáng)度x_i歸集于矢量x中。每種強(qiáng)度隨后乘以相應(yīng)權(quán)重w_i以在增加偏離項(xiàng)b后獲得決策函數(shù)f(x)的值。在導(dǎo)出決策函數(shù)時(shí)，線性分類器將進(jìn)一步定義將基因表達(dá)數(shù)據(jù)空間分割成兩個(gè)不相交部分的閾值。示例性線性分類器包括但不限于部分最小二乘(PLS)，(Nguyen等人,Bioinformatics 18(2002)39-50)、持向量機(jī)(SVM)(等人,Learning with Kernels,MIT Press,Cambridge 2002)和收縮判別分析(SDA)(等人,Annals of applied statistics 4,503-519(2010))。在一個(gè)示例實(shí)施方案中，線性分類器是PLS線性分類器。

基于訓(xùn)練樣品大集合經(jīng)驗(yàn)地導(dǎo)出決策函數(shù)，例如從顯示良好或不良臨床預(yù)后的患者導(dǎo)出?；诓煌卣魅绲幌抻诮o定治療性治療之前或之后的臨床預(yù)后，閾值將患者組分開。在形成階段(“訓(xùn)練”)從一組結(jié)果已知的患者導(dǎo)出對(duì)這種量(即臨界閾值)的解釋。從訓(xùn)練數(shù)據(jù)通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法先驗(yàn)地固定相應(yīng)的權(quán)重和決策得分的反應(yīng)性/抗性臨界閾。在一個(gè)示例實(shí)施方案中，部分最小二乘判別分析(PLS-DA)用于確定權(quán)重。(L.S.Wold,J.Chemom.1(1987)185-196；D.V.Nguyen,D.M.Rocke,Bioinformatics 18(2002)39-50)。

有效地，這意味數(shù)據(jù)空間，即生物標(biāo)志物表達(dá)值全部可能組合的集合，分裂成兩個(gè)對(duì)應(yīng)于不同臨床分類或預(yù)測的互斥組，例如，一組對(duì)應(yīng)于良好臨床預(yù)后和不良臨床預(yù)后。在整體分類器的背景下，某種生物標(biāo)志物的相對(duì)過量表達(dá)可以增加決策得分(正權(quán)重)或減少?zèng)Q策得分(負(fù)權(quán)重)并且因此有助于例如良好臨床預(yù)后的總決策。

在本發(fā)明的某些示例實(shí)施方案中，將數(shù)據(jù)在應(yīng)用如上文所述的加權(quán)總和之前進(jìn)行非線性轉(zhuǎn)化。這種非線性轉(zhuǎn)化可能包括增加數(shù)據(jù)的維度。還可能隱含地進(jìn)行非線性轉(zhuǎn)化和加權(quán)加合，例如，通過使用kernel函數(shù)進(jìn)行。(等人,Learning with Kernels,MIT Press,Cambridge 2002)。

在某些示例實(shí)施方案中，通過來自相應(yīng)癌癥組織樣品集合的分離RNA和借助分離的RNA與微陣列雜交確定表達(dá)值，導(dǎo)出患者培訓(xùn)集數(shù)據(jù)。在某些示例實(shí)施方案中，導(dǎo)出表達(dá)特征標(biāo)識(shí)中使用的微陣列是轉(zhuǎn)錄組陣列。如本文所用，“轉(zhuǎn)錄組陣列”指含有探針組的微陣列，所述探針組設(shè)計(jì)成與已經(jīng)驗(yàn)證在目的患病組織中表達(dá)的序列雜交。鑒于組織和生物學(xué)背景之間可變剪接作用和可變的多聚A尾加工，針對(duì)衍生自另一個(gè)組織源或生物學(xué)背景的相同基因序列設(shè)計(jì)的探針可將并不與目的患病組織中表達(dá)的轉(zhuǎn)錄物有效結(jié)合，導(dǎo)致丟失可能有意義的生物學(xué)信息。因此，在導(dǎo)出微陣列探針組之前證實(shí)什么序列在患病目的組織中表達(dá)是有益的?？梢岳缤ㄟ^以下方式驗(yàn)證特定疾病背景下表達(dá)的序列：從患病組織樣品集合分離總RNA并測序并且將分離的序列與已知的核酸序列數(shù)據(jù)庫交叉參考以證實(shí)針對(duì)目的患病組織中實(shí)際表達(dá)的序列設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)錄組陣列上的探針組。用于制造轉(zhuǎn)錄組陣列的方法是本領(lǐng)域熟知的并且在通過引用方式并入本文的美國專利申請(qǐng)專利公開號(hào)2006/0134663中描述。在某些示例實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)錄組陣列的探針組設(shè)計(jì)成在轉(zhuǎn)錄物3’末端的300核苷酸內(nèi)部結(jié)合。在通過引用方式并入本文的美國專利申請(qǐng)專利公開號(hào)2009/0082218中描述了用結(jié)合于靶轉(zhuǎn)錄物3’末端的300個(gè)核苷酸內(nèi)部的探針組設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)錄組陣列的方法。在某些示例實(shí)施方案中，在導(dǎo)出本發(fā)明基因表達(dá)概況中使用的微陣列是Almac卵巢癌DSA^TM微陣列(Almac Group,Craigavon，英國)。

可以通過使用這類診斷法如“曲線下面積”(AUC)評(píng)價(jià)線性分類器的性能，選擇最佳線性分類器。AUC指接收者操作特征(ROC)曲線的曲線下面積，二者均是本領(lǐng)域熟知的。AUC量值可用于完整數(shù)據(jù)范圍內(nèi)比較分類器的準(zhǔn)確性。AUC更高的線性分類器具有在兩個(gè)目的組(例如，卵巢癌樣品和正?；?qū)φ諛悠?之間正確劃分未知事物的更大能力。ROC曲線可用于測算特定特征(例如，本文所述的任何生物標(biāo)志物和/或額外生物醫(yī)學(xué)信息的任何項(xiàng))在區(qū)分兩個(gè)群體(例如，響應(yīng)于和不響應(yīng)于治療劑的個(gè)體)時(shí)的性能。一般，基于單一特征的值以遞增順序在整個(gè)群體(例如，病例和對(duì)照)范圍內(nèi)分選特征數(shù)據(jù)。隨后，對(duì)于該特征的每個(gè)值，計(jì)算數(shù)據(jù)的真陽性率和假陽性率。通過計(jì)數(shù)在該特征的值以上的病例數(shù)并且隨后除以總陽性例數(shù)，確定真陽性率。通過計(jì)數(shù)在該特征的值以上的對(duì)照數(shù)并且隨后除以總對(duì)照數(shù)，確定假陽性率。雖然這個(gè)定義涉及其中與對(duì)照相比情況下特征升高的情形，但是這個(gè)定義也適用于其中與對(duì)照相比情況下特征降低的情形(在這種情形下，將計(jì)數(shù)在該特征的值以下的樣品)?？梢詫?duì)單個(gè)特征以及對(duì)其他單一輸出生成ROC曲線，例如，兩種或更多種特征的組合可以按數(shù)學(xué)方式合并(例如，相加、相減、相乘等)以提供單一總和值，并且可以在ROC曲線中繪制這個(gè)單一總和值。另外，可以在ROC曲線中繪制多個(gè)特征的任何組合，其中該組合導(dǎo)出單一輸出值。這些特征組合可以包括一項(xiàng)檢驗(yàn)。ROC曲線是檢驗(yàn)的真陽性率(靈敏度)對(duì)該檢驗(yàn)的假陽性率(1-特異性)的曲線。

在一個(gè)示例實(shí)施方案中，血管生成表達(dá)特征標(biāo)識(shí)涉及表2中詳述的63種生物標(biāo)志物與該表中詳述的相應(yīng)排序、權(quán)重和相關(guān)的偏差或替代性排序、權(quán)重和偏差，這取決于例如疾病背景。在復(fù)合決策得分函數(shù)中，表2在示例分類器中按絕對(duì)遞減權(quán)重的順序排序生物標(biāo)志物。本發(fā)明的方法可以依賴于測量表2中列出的生物標(biāo)志物中的一種或多種、最多達(dá)所有。本發(fā)明的方法可以包括測量來自表2的生物標(biāo)志物中的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60種或每種。在某些實(shí)施方案中，所述方法可以包括測量來自表2的生物標(biāo)志物中的2至5種的表達(dá)水平。

表2

在另一個(gè)示例實(shí)施方案中，血管生成表達(dá)特征標(biāo)識(shí)涉及表3中詳述的63種生物標(biāo)志物與該表中詳述的相應(yīng)排序或替代性排序，這取決于例如疾病背景。在復(fù)合決策得分函數(shù)中，表3在示例分類器中按絕對(duì)遞減權(quán)重的順序排序生物標(biāo)志物。本發(fā)明的方法可以依賴于測量表3中列出的生物標(biāo)志物中的一種或多種、最多達(dá)所有。本發(fā)明的方法可以包括測量來自表3的生物標(biāo)志物中的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60種或每種。在某些實(shí)施方案中，所述方法可以包括測量來自表3的生物標(biāo)志物中的2至5種的表達(dá)水平。

表3

可用于測量生物標(biāo)志物的表達(dá)的探針組顯示于表4中。

表4

在一個(gè)示例實(shí)施方案中，表達(dá)特征標(biāo)識(shí)包含以下生物標(biāo)志物中的所有或部分；IGF2、SOX11、INS、CXCL17、SLC5A1、TMEM45A、CXCR2P1、MFAP2、MATN3、RTP4、COL3A1、CDR1、RARRES3、TNFSF10、NUAK1、SNORD114-14、SRPX、SPARC、GJB1、TIMP3、ISLR、TUBA1A、DEXI、BASP1、PXDN、GBP4、SLC28A3、HLA-DRA、TAP2、ACSL5、CDH11、PSMB9、MMP14、CD74、LOXL1、CIITA、ZNF697、SH3RF2、MIR198、COL1A2、TNFRSF14、COL8A1、C21orf63、TAP1、PDPN、RHOBTB3、BCL11A、HLA-DOB、XAF1、ARHGAP26、POLD2、DPYSL2、COL4A1、ID3、CFB、NID1、FKBP7、TIMP2、RCBTB1、ANGPTL2、ENTPD7、SHISA4和HINT1。

在另一個(gè)示例實(shí)施方案中，表達(dá)特征標(biāo)識(shí)包含IGF2、SOX11、INS和CXCL17以及選自表2中的生物標(biāo)志物列表的至少N種額外生物標(biāo)志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58或59。

在另一個(gè)示例實(shí)施方案中，表達(dá)特征標(biāo)識(shí)包含IGF2、INS、SPARC、TMEM45A、COL8A1以及選自表2中的生物標(biāo)志物列表的至少N種額外生物標(biāo)志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58或59。

在另一個(gè)示例實(shí)施方案中，表達(dá)特征標(biāo)識(shí)包含IGF2、INS、SPARC、TMEM45A、COL8A1、COL3A1、CDR1、NUAK1、TIMP3、LOXL1以及選自表2中的生物標(biāo)志物列表的至少N種額外生物標(biāo)志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52或53。

在另一個(gè)示例實(shí)施方案中，表達(dá)特征標(biāo)識(shí)包含IGF2、TIMP3、INS、CXCR2P1、NUAK1以及選自表2中的生物標(biāo)志物列表的至少N種額外生物標(biāo)志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58或59。

在另一個(gè)示例實(shí)施方案中，表達(dá)特征標(biāo)識(shí)包含IGF2、TIMP3、INS、CXCR2P1、NUAK1、CDR1、MATN3、SOX11、SNORD114-14、COL3A1以及選自表2中的生物標(biāo)志物列表的至少N種額外生物標(biāo)志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52或53。

在另一個(gè)示例實(shí)施方案中，表達(dá)特征標(biāo)識(shí)包含COL3A1、SPARC、CDR1、SRPX、MATN3以及選自表2中的生物標(biāo)志物列表的至少N種額外生物標(biāo)志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58或59。

在另一個(gè)示例實(shí)施方案中，表達(dá)特征標(biāo)識(shí)包含COL3A1、SPARC、CDR1、SRPX、MATN3、TIMP3、CDH11、COL8A1、BCL11A、MMP14以及選自表2中的生物標(biāo)志物列表的至少N種額外生物標(biāo)志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52或53。

在另一個(gè)示例實(shí)施方案中，表達(dá)特征標(biāo)識(shí)包含IGF2、CDR1、COL3A1、SPARC、TIMP3以及選自表2中的生物標(biāo)志物列表的至少N種額外生物標(biāo)志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58或59。

在另一個(gè)示例實(shí)施方案中，表達(dá)特征標(biāo)識(shí)包含IGF2、CDR1、COL3A1、SPARC、TIMP3、INS、COL8A1、NUAK1、MATN3、TMEM45A以及選自表2中的生物標(biāo)志物列表的至少N種額外生物標(biāo)志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58或59。

在另一個(gè)示例實(shí)施方案中，表達(dá)特征標(biāo)識(shí)包含INS、SPARC、COL8A1、COL3A1、CDR1、NUAK1、TIMP3和MMP14以及選自表2中的生物標(biāo)志物列表的至少N種額外生物標(biāo)志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54或55。

另一個(gè)示例實(shí)施方案中，表達(dá)特征標(biāo)識(shí)包含至少INS、SPARC、COL8A1、COL3A1、CDR1、NUAK1、TIMP3和MMP14。另一個(gè)示例實(shí)施方案中，所述表達(dá)特征標(biāo)識(shí)包含至少IGF2、CDR1、COL3A1、SPARC、TIMP3、INS、COL8A1、NUAK1、MATN3、TMEM45A。另一個(gè)示例實(shí)施方案中，所述表達(dá)特征標(biāo)識(shí)包含至少IGF2、CDR1、COL3A1、SPARC、TIMP3。另一個(gè)示例實(shí)施方案中，所述表達(dá)特征標(biāo)識(shí)包含至少COL3A1、SPARC、CDR1、SRPX、MATN3、TIMP3、CDH11、COL8A1、BCL11A、MMP14。另一個(gè)示例實(shí)施方案中，所述表達(dá)特征標(biāo)識(shí)包含至少COL3A1、SPARC、CDR1、SRPX、MATN3。另一個(gè)示例實(shí)施方案中，所述表達(dá)特征標(biāo)識(shí)包含至少COL3A1、SPARC、CDR1、SRPX、MATN3。另一個(gè)示例實(shí)施方案中，所述表達(dá)特征標(biāo)識(shí)包含至少IGF2、TIMP3、INS、CXCR2P1、NUAK1、CDR1、MATN3、SOX11、SNORD114-14、COL3A1。另一個(gè)示例實(shí)施方案中，所述表達(dá)特征標(biāo)識(shí)包含至少IGF2、TIMP3、INS、CXCR2P1、NUAK1。另一個(gè)示例實(shí)施方案中，所述表達(dá)特征標(biāo)識(shí)包含至少IGF2、INS、SPARC、TMEM45A、COL8A1、COL3A1、CDR1、NUAK1、TIMP3、LOXL1。另一個(gè)示例實(shí)施方案中，所述表達(dá)特征標(biāo)識(shí)包含至少IGF2、INS、SPARC、TMEM45A、COL8A1。另一個(gè)示例實(shí)施方案中，所述表達(dá)特征標(biāo)識(shí)包含至少IGF2、SOX11、INS和CXCL17。

在另一個(gè)示例實(shí)施方案中，表達(dá)特征標(biāo)識(shí)包含IGF2以及選自表2中的生物標(biāo)志物列表的至少N種額外生物標(biāo)志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或62。

在另一個(gè)示例實(shí)施方案中，表達(dá)特征標(biāo)識(shí)包含SOX11以及選自表2中的生物標(biāo)志物列表的至少N種額外生物標(biāo)志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或62。

在另一個(gè)示例實(shí)施方案中，表達(dá)特征標(biāo)識(shí)包含INS以及選自表2中的生物標(biāo)志物列表的至少N種額外生物標(biāo)志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或62。

在另一個(gè)示例實(shí)施方案中，表達(dá)特征標(biāo)識(shí)包含CXCL17以及選自表2中的生物標(biāo)志物列表的至少N種額外生物標(biāo)志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或62。

在另一個(gè)示例實(shí)施方案中，表達(dá)特征標(biāo)識(shí)包含CDR1和選自表2中的生物標(biāo)志物列表的至少N種額外生物標(biāo)志物，以及選自表2中的生物標(biāo)志物列表的至少N種額外生物標(biāo)志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或62。

在另一個(gè)示例實(shí)施方案中，表達(dá)特征標(biāo)識(shí)包含COL3A1和選自表2中的生物標(biāo)志物列表的至少N種額外生物標(biāo)志物，以及選自表2中的生物標(biāo)志物列表的至少N種額外生物標(biāo)志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或62。

在另一個(gè)示例實(shí)施方案中，表達(dá)特征標(biāo)識(shí)包含SPARC和選自表2中的生物標(biāo)志物列表的至少N種額外生物標(biāo)志物，以及選自表2中的生物標(biāo)志物列表的至少N種額外生物標(biāo)志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或62。

在另一個(gè)示例實(shí)施方案中，表達(dá)特征標(biāo)識(shí)包含TIMP3和選自表2中的生物標(biāo)志物列表的至少N種額外生物標(biāo)志物，以及選自表2中的生物標(biāo)志物列表的至少N種額外生物標(biāo)志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或62。

在另一個(gè)示例實(shí)施方案中，表達(dá)特征標(biāo)識(shí)包含COL8A1和選自表2中的生物標(biāo)志物列表的至少N種額外生物標(biāo)志物，以及選自表2中的生物標(biāo)志物列表的至少N種額外生物標(biāo)志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或62。

在另一個(gè)示例實(shí)施方案中，表達(dá)特征標(biāo)識(shí)包含NUAK1和選自表2中的生物標(biāo)志物列表的至少N種額外生物標(biāo)志物，以及選自表2中的生物標(biāo)志物列表的至少N種額外生物標(biāo)志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或62。

在另一個(gè)示例實(shí)施方案中，表達(dá)特征標(biāo)識(shí)包含MATN3和選自表2中的生物標(biāo)志物列表的至少N種額外生物標(biāo)志物，以及選自表2中的生物標(biāo)志物列表的至少N種額外生物標(biāo)志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或62。

在另一個(gè)示例實(shí)施方案中，表達(dá)特征標(biāo)識(shí)包含TMEM45A和選自表2中的生物標(biāo)志物列表的至少N種額外生物標(biāo)志物，以及選自表2中的生物標(biāo)志物列表的至少N種額外生物標(biāo)志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或62。

在另一個(gè)示例實(shí)施方案中，表達(dá)特征標(biāo)識(shí)包含CXCR2P1和選自表2中的生物標(biāo)志物列表的至少N種額外生物標(biāo)志物，以及選自表2中的生物標(biāo)志物列表的至少N種額外生物標(biāo)志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或62。

在另一個(gè)示例實(shí)施方案中，表達(dá)特征標(biāo)識(shí)包含SRPX和選自表2中的生物標(biāo)志物列表的至少N種額外生物標(biāo)志物，以及選自表2中的生物標(biāo)志物列表的至少N種額外生物標(biāo)志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或62。

在另一個(gè)示例實(shí)施方案中，表達(dá)特征標(biāo)識(shí)包含CDH11和選自表2中的生物標(biāo)志物列表的至少N種額外生物標(biāo)志物，以及選自表2中的生物標(biāo)志物列表的至少N種額外生物標(biāo)志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或62。

在另一個(gè)示例實(shí)施方案中，表達(dá)特征標(biāo)識(shí)包含BC11A和選自表2中的生物標(biāo)志物列表的至少N種額外生物標(biāo)志物，以及選自表2中的生物標(biāo)志物列表的至少N種額外生物標(biāo)志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或62。

在另一個(gè)示例實(shí)施方案中，表達(dá)特征標(biāo)識(shí)包含LOXL1和選自表2中的生物標(biāo)志物列表的至少N種額外生物標(biāo)志物，以及選自表2中的生物標(biāo)志物列表的至少N種額外生物標(biāo)志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或62。

在另一個(gè)示例實(shí)施方案中，表達(dá)特征標(biāo)識(shí)包含MMP14和選自表2中的生物標(biāo)志物列表的至少N種額外生物標(biāo)志物，以及選自表2中的生物標(biāo)志物列表的至少N種額外生物標(biāo)志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或62。

在另一個(gè)示例實(shí)施方案中，實(shí)例表達(dá)特征標(biāo)識(shí)包含表2中列出的生物標(biāo)志物和相應(yīng)生物標(biāo)志物加權(quán)值。在另一個(gè)示例實(shí)施方案中，實(shí)例表達(dá)特征標(biāo)識(shí)由表2中列出的生物標(biāo)志物和相應(yīng)生物標(biāo)志物加權(quán)值組成。在另一個(gè)示例實(shí)施方案中，實(shí)例表達(dá)得分包含表3中列出的生物標(biāo)志物和等級(jí)。在另一個(gè)示例實(shí)施方案中，實(shí)例表達(dá)特征標(biāo)識(shí)由表3中列出的生物標(biāo)志物和相應(yīng)等級(jí)組成。

在一個(gè)進(jìn)一步方面，本發(fā)明的方法包括對(duì)來自個(gè)體的生物樣品進(jìn)行測定以確定生物標(biāo)志物組中的一種或多種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平，所述生物標(biāo)志物組包含表2或3中列出的生物標(biāo)志物中的所有或部分。

在一個(gè)進(jìn)一步方面，本發(fā)明的方法包括對(duì)來自個(gè)體的生物樣品進(jìn)行測定以確定生物標(biāo)志物組中的一種或多種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平，所述生物標(biāo)志物組包含IGF2、SOX11、INS和CXCL17以及選自表2或3中的生物標(biāo)志物列表的至少N種額外生物標(biāo)志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58或59。

在一個(gè)進(jìn)一步方面，本發(fā)明的方法包括對(duì)來自個(gè)體的生物樣品進(jìn)行測定以確定生物標(biāo)志物組中的一種或多種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平，所述生物標(biāo)志物組包含IGF2、INS、SPARC、TMEM45A、COL8A1以及選自表2或3中的生物標(biāo)志物列表的至少N種額外生物標(biāo)志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58或59。

在一個(gè)進(jìn)一步方面，本發(fā)明的方法包括對(duì)來自個(gè)體的生物樣品進(jìn)行測定以確定生物標(biāo)志物組中的一種或多種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平，所述生物標(biāo)志物組包含IGF2、INS、SPARC、TMEM45A、COL8A1、COL3A1、CDR1、NUAK1、TIMP3、LOXL1以及選自表2或3中的生物標(biāo)志物列表的至少N種額外生物標(biāo)志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、或53。

在一個(gè)進(jìn)一步方面，本發(fā)明的方法包括對(duì)來自個(gè)體的生物樣品進(jìn)行測定以確定生物標(biāo)志物組中的一種或多種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平，所述生物標(biāo)志物組包含IGF2、TIMP3、INS、CXCR2P1、NUAK1以及選自表2或3中的生物標(biāo)志物列表的至少N種額外生物標(biāo)志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58或59。

在一個(gè)進(jìn)一步方面，本發(fā)明的方法包括對(duì)來自個(gè)體的生物樣品進(jìn)行測定以確定生物標(biāo)志物組中的一種或多種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平，所述生物標(biāo)志物組包含IGF2、TIMP3、INS、CXCR2P1、NUAK1、CDR1、MATN3、SOX11、SNORD114-14、COL3A1以及選自表2或3中的生物標(biāo)志物列表的至少N種額外生物標(biāo)志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、或53。

在一個(gè)進(jìn)一步方面，本發(fā)明的方法包括對(duì)來自個(gè)體的生物樣品進(jìn)行測定以確定生物標(biāo)志物組中的一種或多種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平，所述生物標(biāo)志物組包含COL3A1、SPARC、CDR1、SRPX、MATN3以及選自表2或3中的生物標(biāo)志物列表的至少N種額外生物標(biāo)志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58或59。

在一個(gè)進(jìn)一步方面，本發(fā)明的方法包括對(duì)來自個(gè)體的生物樣品進(jìn)行測定以確定生物標(biāo)志物組中的一種或多種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平，所述生物標(biāo)志物組包含COL3A1、SPARC、CDR1、SRPX、MATN3、TIMP3、CDH11、COL8A1、BCL11A、MMP14以及選自表2或3中的生物標(biāo)志物列表的至少N種額外生物標(biāo)志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、或53。

在一個(gè)進(jìn)一步方面，本發(fā)明的方法包括對(duì)來自個(gè)體的生物樣品進(jìn)行測定以確定生物標(biāo)志物組中的一種或多種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平，所述生物標(biāo)志物組包含IGF2、CDR1、COL3A1、SPARC、TIMP3以及選自表2或3中的生物標(biāo)志物列表的至少N種額外生物標(biāo)志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58或59。

在一個(gè)進(jìn)一步方面，本發(fā)明的方法包括對(duì)來自個(gè)體的生物樣品進(jìn)行測定以確定生物標(biāo)志物組中的一種或多種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平，所述生物標(biāo)志物組包含IGF2、CDR1、COL3A1、SPARC、TIMP3、INS、COL8A1、NUAK1、MATN3、TMEM45A以及選自表2或3中的生物標(biāo)志物列表的至少N種額外生物標(biāo)志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、或53。

在一個(gè)進(jìn)一步方面，本發(fā)明的方法包括對(duì)來自個(gè)體的生物樣品進(jìn)行測定以確定生物標(biāo)志物組中的一種或多種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平，所述生物標(biāo)志物組包含INS、SPARC、COL8A1、COL3A1、CDR1、NUAK1、TIMP3和MMP14以及選自表2或3中的生物標(biāo)志物列表的至少N種額外生物標(biāo)志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54或55。

另一個(gè)示例實(shí)施方案中，生物標(biāo)志物組包含至少INS、SPARC、COL8A1、COL3A1、CDR1、NUAK1、TIMP3和MMP14。另一個(gè)示例實(shí)施方案中，所述生物標(biāo)志物組包含至少IGF2、CDR1、COL3A1、SPARC、TIMP3、INS、COL8A1、NUAK1、MATN3、TMEM45A。另一個(gè)示例實(shí)施方案中，所述生物標(biāo)志物組包含至少IGF2、CDR1、COL3A1、SPARC、TIMP3。另一個(gè)示例實(shí)施方案中，所述生物標(biāo)志物組包含至少COL3A1、SPARC、CDR1、SRPX、MATN3、TIMP3、CDH11、COL8A1、BCL11A、MMP14。另一個(gè)示例實(shí)施方案中，所述生物標(biāo)志物組包含至少COL3A1、SPARC、CDR1、SRPX、MATN3。另一個(gè)示例實(shí)施方案中，所述生物標(biāo)志物組包含至少COL3A1、SPARC、CDR1、SRPX、MATN3。另一個(gè)示例實(shí)施方案中，所述生物標(biāo)志物組包含至少IGF2、TIMP3、INS、CXCR2P1、NUAK1、CDR1、MATN3、SOX11、SNORD114-14、COL3A1。另一個(gè)示例實(shí)施方案中，所述生物標(biāo)志物組包含至少IGF2、TIMP3、INS、CXCR2P1、NUAK1。另一個(gè)示例實(shí)施方案中，所述生物標(biāo)志物組包含至少IGF2、INS、SPARC、TMEM45A、COL8A1、COL3A1、CDR1、NUAK1、TIMP3、LOXL1。另一個(gè)示例實(shí)施方案中，所述生物標(biāo)志物組包含至少IGF2、INS、SPARC、TMEM45A、COL8A1。另一個(gè)示例實(shí)施方案中，所述生物標(biāo)志物組包含至少IGF2、SOX11、INS和CXCL17。

在一個(gè)進(jìn)一步方面，本發(fā)明的方法包括對(duì)來自個(gè)體的生物樣品進(jìn)行測定以確定生物標(biāo)志物組中的一種或多種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平，所述生物標(biāo)志物組包含IGF2以及選自表2或3中的生物標(biāo)志物列表的至少N種額外生物標(biāo)志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或62。

在一個(gè)進(jìn)一步方面，本發(fā)明的方法包括對(duì)來自個(gè)體的生物樣品進(jìn)行測定以確定生物標(biāo)志物組中的一種或多種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平，所述生物標(biāo)志物組包含SOX11以及選自表2或3中的生物標(biāo)志物列表的至少N種額外生物標(biāo)志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或62。

在一個(gè)進(jìn)一步方面，本發(fā)明的方法包括對(duì)來自個(gè)體的生物樣品進(jìn)行測定以確定生物標(biāo)志物組中的一種或多種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平，所述生物標(biāo)志物組包含INS以及選自表2或3中的生物標(biāo)志物列表的至少N種額外生物標(biāo)志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或62。

在一個(gè)進(jìn)一步方面，本發(fā)明的方法包括對(duì)來自個(gè)體的生物樣品進(jìn)行測定以確定生物標(biāo)志物組中的一種或多種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平，所述生物標(biāo)志物組包含CXCL17以及選自表2或3中的生物標(biāo)志物列表的至少N種額外生物標(biāo)志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或62。

在一個(gè)進(jìn)一步方面，本發(fā)明的方法包括對(duì)來自個(gè)體的生物樣品進(jìn)行測定以確定生物標(biāo)志物組中的一種或多種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平，所述生物標(biāo)志物組包含SPARC以及選自表2或3中的生物標(biāo)志物列表的至少N種額外生物標(biāo)志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或62。

在一個(gè)進(jìn)一步方面，本發(fā)明的方法包括對(duì)來自個(gè)體的生物樣品進(jìn)行測定以確定生物標(biāo)志物組中的一種或多種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平，所述生物標(biāo)志物組包含TMEM45A以及選自表2或3中的生物標(biāo)志物列表的至少N種額外生物標(biāo)志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或62。

在一個(gè)進(jìn)一步方面，本發(fā)明的方法包括對(duì)來自個(gè)體的生物樣品進(jìn)行測定以確定生物標(biāo)志物組中的一種或多種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平，所述生物標(biāo)志物組包含COL8A1以及選自表2或3中的生物標(biāo)志物列表的至少N種額外生物標(biāo)志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或62。

在一個(gè)進(jìn)一步方面，本發(fā)明的方法包括對(duì)來自個(gè)體的生物樣品進(jìn)行測定以確定生物標(biāo)志物組中的一種或多種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平，所述生物標(biāo)志物組包含COL3A1以及選自表2或3中的生物標(biāo)志物列表的至少N種額外生物標(biāo)志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或62。

在一個(gè)進(jìn)一步方面，本發(fā)明的方法包括對(duì)來自個(gè)體的生物樣品進(jìn)行測定以確定生物標(biāo)志物組中的一種或多種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平，所述生物標(biāo)志物組包含CDR1以及選自表2或3中的生物標(biāo)志物列表的至少N種額外生物標(biāo)志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或62。

在一個(gè)進(jìn)一步方面，本發(fā)明的方法包括對(duì)來自個(gè)體的生物樣品進(jìn)行測定以確定生物標(biāo)志物組中的一種或多種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平，所述生物標(biāo)志物組包含NUAK1以及選自表2或3中的生物標(biāo)志物列表的至少N種額外生物標(biāo)志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或62。

在一個(gè)進(jìn)一步方面，本發(fā)明的方法包括對(duì)來自個(gè)體的生物樣品進(jìn)行測定以確定生物標(biāo)志物組中的一種或多種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平，所述生物標(biāo)志物組包含TIMP3以及選自表2或3中的生物標(biāo)志物列表的至少N種額外生物標(biāo)志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或62。

在一個(gè)進(jìn)一步方面，本發(fā)明的方法包括對(duì)來自個(gè)體的生物樣品進(jìn)行測定以確定生物標(biāo)志物組中的一種或多種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平，所述生物標(biāo)志物組包含LOXL1以及選自表2或3中的生物標(biāo)志物列表的至少N種額外生物標(biāo)志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或62。

在一個(gè)進(jìn)一步方面，本發(fā)明的方法包括對(duì)來自個(gè)體的生物樣品進(jìn)行測定以確定生物標(biāo)志物組中的一種或多種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平，所述生物標(biāo)志物組包含CXCR2P1以及選自表2或3中的生物標(biāo)志物列表的至少N種額外生物標(biāo)志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或62。

在一個(gè)進(jìn)一步方面，本發(fā)明的方法包括對(duì)來自個(gè)體的生物樣品進(jìn)行測定以確定生物標(biāo)志物組中的一種或多種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平，所述生物標(biāo)志物組包含SPARC以及選自表2或3中的生物標(biāo)志物列表的至少N種額外生物標(biāo)志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或62。

在一個(gè)進(jìn)一步方面，本發(fā)明的方法包括對(duì)來自個(gè)體的生物樣品進(jìn)行測定以確定生物標(biāo)志物組中的一種或多種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平，所述生物標(biāo)志物組包含MATN3以及選自表2或3中的生物標(biāo)志物列表的至少N種額外生物標(biāo)志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或62。

在一個(gè)進(jìn)一步方面，本發(fā)明的方法包括對(duì)來自個(gè)體的生物樣品進(jìn)行測定以確定生物標(biāo)志物組中的一種或多種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平，所述生物標(biāo)志物組包含SNORD114-14以及選自表2或3中的生物標(biāo)志物列表的至少N種額外生物標(biāo)志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或62。

在一個(gè)進(jìn)一步方面，本發(fā)明的方法包括對(duì)來自個(gè)體的生物樣品進(jìn)行測定以確定生物標(biāo)志物組中的一種或多種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平，所述生物標(biāo)志物組包含SRPX以及選自表2或3中的生物標(biāo)志物列表的至少N種額外生物標(biāo)志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或62。

在一個(gè)進(jìn)一步方面，本發(fā)明的方法包括對(duì)來自個(gè)體的生物樣品進(jìn)行測定以確定生物標(biāo)志物組中的一種或多種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平，所述生物標(biāo)志物組包含CDH11以及選自表2或3中的生物標(biāo)志物列表的至少N種額外生物標(biāo)志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或62。

在一個(gè)進(jìn)一步方面，本發(fā)明的方法包括對(duì)來自個(gè)體的生物樣品進(jìn)行測定以確定生物標(biāo)志物組中的一種或多種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平，所述生物標(biāo)志物組包含BC11A以及選自表2或3中的生物標(biāo)志物列表的至少N種額外生物標(biāo)志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或62。

在一個(gè)進(jìn)一步方面，本發(fā)明的方法包括對(duì)來自個(gè)體的生物樣品進(jìn)行測定以確定生物標(biāo)志物組中的一種或多種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平，所述生物標(biāo)志物組包含MMP14以及選自表2或3中的生物標(biāo)志物列表的至少N種額外生物標(biāo)志物，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或62。

使用表達(dá)特征標(biāo)識(shí)將新測試樣品分類

為了使用表達(dá)特征標(biāo)識(shí)(如上文描述的那些)將新測試樣品分類，測量癌癥組織中一種或多種生物標(biāo)志物的相對(duì)表達(dá)水平以形成測試樣品表達(dá)概況。在某些示例性實(shí)施方案中，測試樣品表達(dá)概況以復(fù)合決策得分的形式(“表達(dá)得分”)總結(jié)并且與從患者數(shù)據(jù)的培訓(xùn)集導(dǎo)出的閾值得分比較。為了使基于特征如但不限于良好/不良臨床預(yù)后將患者組分為不同組的能力最大化，建立得分閾值?；颊吲嘤?xùn)集數(shù)據(jù)優(yōu)選地從已經(jīng)通過預(yù)后、復(fù)發(fā)可能性、長期存活、臨床結(jié)果、治療反應(yīng)、診斷、癌癥分類或個(gè)性化基因組圖譜表征的癌癥組織樣品導(dǎo)出。來自患者樣品的表達(dá)概況和相應(yīng)決策得分可以與培訓(xùn)集中處于數(shù)學(xué)導(dǎo)出的得分決策閾值的相同側(cè)上的患者樣品特征相關(guān)。在某些示例實(shí)施方案中，優(yōu)化線性分類器標(biāo)量輸出的閾值以使交叉驗(yàn)證下敏感性和特異性的總和最大化，如訓(xùn)練數(shù)據(jù)集內(nèi)部所觀察那樣。

使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法歸一化給定樣品的總體表達(dá)數(shù)據(jù)，以校正起始物質(zhì)的不同量、提取和擴(kuò)增反應(yīng)的不同效率等。

在一個(gè)實(shí)施方案中，通過線性分類器評(píng)價(jià)患者組織樣品的生物標(biāo)志物表達(dá)概況。如本文所用，線性分類器涉及個(gè)體生物標(biāo)志物強(qiáng)度并入復(fù)合決策得分(“決策函數(shù)”)的權(quán)重總和。決策得分隨后與預(yù)定的臨界得分閾值比較，所述臨界得分閾值與敏感性和特異性方面的某個(gè)調(diào)定點(diǎn)相對(duì)應(yīng)，所述調(diào)定點(diǎn)顯示樣品是否等于或高于得分閾值(決策函數(shù)為正)或低于得分閾值(決策函數(shù)為正負(fù))。

對(duì)歸一化數(shù)據(jù)使用線性分類器以得出診斷性或預(yù)后性識(shí)別(例如良好或不良臨床預(yù)后)有效地意指，借助分割超平面，將數(shù)據(jù)空間即分類器中全部基因的表達(dá)值的全部可能組合分割成兩個(gè)不相交的部分。基于訓(xùn)練例子大集合經(jīng)驗(yàn)地導(dǎo)出這種分割，例如從顯示治療劑響應(yīng)性或耐藥性的患者導(dǎo)出。在不喪失一般性的情況下，可以對(duì)除一個(gè)生物標(biāo)志物之外其余生物標(biāo)志物假定某個(gè)固定的值集合，所述值集合將自動(dòng)限定這個(gè)剩余生物標(biāo)志物的閾值，其中決策將因例如治療劑響應(yīng)性或耐藥性而改變。高于這種動(dòng)態(tài)閾值的表達(dá)值則將表明不良臨床預(yù)后(對(duì)于具有負(fù)權(quán)重的生物標(biāo)志物)或良好臨床預(yù)后(對(duì)于具有正權(quán)重的生物標(biāo)志物)。這個(gè)閾值的精確值取決于分類器內(nèi)部全部其他生物標(biāo)志物的實(shí)際測量表達(dá)概況，但是某些生物標(biāo)志物的總體指示作用保持固定，即高值或“相對(duì)過量表達(dá)”總是有助于良好臨床預(yù)后(具有正權(quán)重的基因)或不良臨床預(yù)后(具有負(fù)權(quán)重的基因)。因此，在整體基因表達(dá)分類器的背景下，相對(duì)表達(dá)可以表示某個(gè)生物標(biāo)志物上調(diào)或下調(diào)是否表示良好或較差臨床預(yù)后。在某些示例實(shí)施方案中，高于閾值表達(dá)得分的樣品表達(dá)得分表明受試者具有無血管生成亞型。在某些其他示例實(shí)施方案中，高于閾值得分的樣品表達(dá)得分表明受試者與樣品表達(dá)得分低于閾值得分的受試者相比具有良好臨床預(yù)后。在某些其他示例實(shí)施方案中，高于閾值得分的樣品表達(dá)得分表明，如果施用抗血管生成治療劑，則受試者將可能經(jīng)歷不利影響，或具有不良預(yù)后。

存在許多測量測試樣品表達(dá)概況的適合方法，這取決于待測定生物標(biāo)志物的類型。測量生物樣品中的mRNA可以用作檢測生物樣品中相應(yīng)蛋白質(zhì)水平的替代。因此，也可以通過檢測適當(dāng)?shù)腞NA，從而檢測本文所述的任何生物標(biāo)志物或生物標(biāo)志物組?；虮磉_(dá)概況分析方法包括但不限于微陣列、RT-PCT、qPCR、NGS、RNA印跡法、SAGE、質(zhì)譜法。

通過逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR，接著qPCR)測量mRNA表達(dá)水平。RT-PCR用來從mRNA產(chǎn)生cDNA。cDNA可以用來在qPCR測定法中隨著DNA擴(kuò)增過程進(jìn)行而產(chǎn)生熒光。通過與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，qPCR可以產(chǎn)生絕對(duì)量值如每細(xì)胞的mRNA拷貝數(shù)。RNA印跡法、微陣列、Invader測定法和RT-PCR聯(lián)合毛細(xì)管電泳法已經(jīng)全部用來測量樣品中mRNA的表達(dá)水平。參見Gene Expression Profiling:Methods and Protocols,Richard A.Shimkets編者,Humana Press,2004。

miRNA分子是不編碼但可以調(diào)節(jié)基因表達(dá)的小RNA。適于測量mRNA表達(dá)水平的任何方法也可以用于相應(yīng)的miRNA。最近，許多實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)研究使用miRNA作為疾病的生物標(biāo)志物。許多疾病涉及廣泛轉(zhuǎn)錄性調(diào)節(jié)，并且miRNA可能具有生物標(biāo)志物作用不令人驚訝。在miRNA濃度和疾病之間的聯(lián)系甚至往往比蛋白質(zhì)水平和疾病之間的聯(lián)系更不清楚，然而miRNA生物標(biāo)志物的價(jià)值可能巨大。當(dāng)然，與疾病期間差異性表達(dá)的任何RNA一樣，開發(fā)體外診斷產(chǎn)品面臨的問題將包括如下要求：miRNA幸存于患病細(xì)胞中并容易提取以便分析，或miRNA釋放至血液或其他基質(zhì)中，其中它們必須長時(shí)間幸存足以接受測量。蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物具有相似的要求，不過許多潛在的蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物在病變部位被有意地分泌并在疾病期間以旁分泌方式發(fā)揮作用。許多潛在的蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物設(shè)計(jì)成在合成這些蛋白質(zhì)的細(xì)胞外部發(fā)揮作用。

也可以使用質(zhì)譜方法評(píng)價(jià)基因表達(dá)。多種構(gòu)造的質(zhì)譜儀可以用來檢測生物標(biāo)志物值。幾個(gè)類型的質(zhì)譜儀是可獲得的或可以按各種構(gòu)造產(chǎn)生。從總體上看，質(zhì)譜儀具有以下主要組件：樣品入口、離子源、質(zhì)量分析器、檢測器、真空系統(tǒng)和儀器控制系統(tǒng)及數(shù)據(jù)系統(tǒng)。樣品入口、離子源和質(zhì)量分析器的差異通常限定儀器類型和其能力。例如，入口可以是毛細(xì)管柱液相色譜源或可以是如基質(zhì)輔助激光解吸附中所用的直接探頭或階梯。常用離子源例如是電噴霧，包括納米噴霧和微量噴霧或基質(zhì)輔助激光解吸附。常用的質(zhì)量分析器包括四極質(zhì)量濾器、離子阱質(zhì)量分析器和飛行時(shí)間質(zhì)量分析器。額外的質(zhì)譜法方法是本領(lǐng)域熟知的(參見Burlingame等人,Anal.Chem.70:647R-716R(1998)；Kinter和Sherman,New York(2000))。

可以通過以下任何方法檢測并測量蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物和生物標(biāo)志物值：電噴霧電離質(zhì)譜法(ESI-MS)、ESI-MS/MS、ESI-MS/(MS)n、基質(zhì)-輔助激光解吸附電離飛行時(shí)間質(zhì)譜法(MALDI-TOF-MS)、表面-增強(qiáng)激光解吸附/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜法(SELDI-TOF-MS)、硅表面解吸附/電離(DIOS)、次級(jí)離子質(zhì)譜法(SIMS)、四極飛行時(shí)間(Q-TOF)、串聯(lián)飛行時(shí)間(TOF/TOF)技術(shù)、所謂的ultraflex III TOF/TOF、常壓化學(xué)電離質(zhì)譜法(APCI-MS)、APCI-MS/MS、APCI-(MS)^N、常壓光離子化質(zhì)譜法(APPI-MS)、APPI-MS/MS、和APPI-(MS)^N、四極質(zhì)譜法、傅立葉變換質(zhì)譜法(FTMS)、定量質(zhì)譜法和離子阱質(zhì)譜法。

樣品制備策略在質(zhì)譜表征蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物和確定生物標(biāo)志物值之前用來標(biāo)記和富集樣品。標(biāo)記方法包括但不限于相對(duì)定量和絕對(duì)定量的同量異位素標(biāo)簽(iTRAQ)和細(xì)胞培養(yǎng)物中穩(wěn)定同位素標(biāo)記氨基酸(SILAC)。在質(zhì)譜分析之前用來為候選生物標(biāo)志物蛋白選擇性富集樣品的捕獲試劑包括但不限于適配體、抗體、核酸探針、嵌合體、小分子、F(ab')₂片段、單鏈抗體片段、Fv片段、單鏈Fv片段、核酸、凝集素、結(jié)合配體的受體、親和體(affybody)、納米體、錨蛋白、結(jié)構(gòu)域抗體、替代性抗體支架(例如雙體抗體等)、印跡聚合物、高親和性多聚體、肽模擬物、類肽、肽核酸、蘇糖核酸、激素受體、細(xì)胞因子受體和合成性受體和前述的修飾物及片段。

前述測定法能夠檢測可用于確定患者的臨床預(yù)后和選擇適當(dāng)治療方案的方法中的生物標(biāo)志物值，其中所述方法包括在來自個(gè)體的生物樣品中檢測至少N個(gè)生物標(biāo)志物值，所述生物標(biāo)志物值對(duì)應(yīng)于從表1或表2中提供的生物標(biāo)志物中選出的生物標(biāo)志物，其中如下文詳細(xì)描述，使用所述生物標(biāo)志物值劃分指明該個(gè)體具有良好預(yù)后還是較差預(yù)后，或者如果施用特定治療劑，將接受不利或有利影響。盡管一些所述的預(yù)測性生物標(biāo)志物可單獨(dú)用于預(yù)測臨床預(yù)后，但本文還描述了將生物標(biāo)志物的多個(gè)子集分組的方法，所述多個(gè)子集各自可用作一組兩種或更多種生物標(biāo)志物。因此，本申請(qǐng)的多種實(shí)施方案提供包含N個(gè)生物標(biāo)志物的組合，其中N是至少三個(gè)生物標(biāo)志物。將可以理解可以選擇N是來自前述任一個(gè)所描述范圍以及相似但高階范圍的任何數(shù)字。根據(jù)本文所述的任何方法，可以將生物標(biāo)志物值分別檢測并分類或可以將它們整體檢測并分類，例如以多重分析模式進(jìn)行。

b)微陣列方法

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明利用“寡核苷酸陣列”(本文中也稱作“微陣列”)。微陣列可以用于分析細(xì)胞中生物標(biāo)志物的表達(dá)，并特別用于測量癌癥組織的生物標(biāo)志物表達(dá)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，通過可檢測標(biāo)記的代表細(xì)胞中存在的mRNA轉(zhuǎn)錄物的多核苷酸(例如，從總細(xì)胞mRNA合成的熒光標(biāo)記cDNA或標(biāo)記的cRNA)與微陣列雜交，產(chǎn)生生物標(biāo)志物陣列。微陣列是針對(duì)細(xì)胞或生物體的基因組中多種基因(優(yōu)選地大部分或幾乎全部基因)的產(chǎn)物具有結(jié)合(例如，雜交)位點(diǎn)的有序陣列的表面。微陣列可以按本領(lǐng)域已知的許多方式制造。無論怎樣產(chǎn)生，微陣列總是共有某些特征。陣列是可重復(fù)的，允許產(chǎn)生給定陣列的多個(gè)副本并且容易彼此比較。優(yōu)選地，微陣列微小，通常小于5cm²，并且它們由結(jié)合(例如，核酸雜交)條件下穩(wěn)定的材料制成。微陣列中的給定結(jié)合位點(diǎn)或獨(dú)特結(jié)合位點(diǎn)集合將特異性結(jié)合細(xì)胞中的單基因產(chǎn)物。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，使用位置可尋址的陣列，所述陣列在每個(gè)位置含有序列已知的固定核酸。

將可以理解，當(dāng)產(chǎn)生與細(xì)胞的RNA互補(bǔ)的cDNA并使其與微陣列在合適的雜交條件下雜交時(shí)，與陣列中對(duì)應(yīng)于任何特定基因的位點(diǎn)雜交的水平將反映細(xì)胞中從該基因/生物標(biāo)志物轉(zhuǎn)錄的mRNA的普遍程度。例如，當(dāng)可檢測標(biāo)記(例如，熒光團(tuán)可檢測標(biāo)記)的cDNA或與總細(xì)胞mRNA互補(bǔ)的cRNA與微陣列雜交時(shí)，陣列上與細(xì)胞中不轉(zhuǎn)錄的基因相對(duì)應(yīng)(即，能夠特異性結(jié)合該基因的產(chǎn)物)的位點(diǎn)將幾乎沒有信號(hào)或無信號(hào)(例如，熒光信號(hào))，并且其編碼的mRNA占優(yōu)勢(shì)的基因?qū)⒕哂邢鄬?duì)強(qiáng)的信號(hào)。選擇核酸雜交條件和洗滌條件，從而使探針“特異性結(jié)合”或“特異性雜交”至特定陣列位點(diǎn)，即，探針與具有互補(bǔ)核酸序列的序列陣列位點(diǎn)雜交、形成雙鏈體或結(jié)合，但是不與具有非互補(bǔ)核酸序列的位點(diǎn)雜交。如本文所用，如果較短多核苷酸小于或等于25個(gè)堿基，則使用標(biāo)準(zhǔn)堿基配對(duì)規(guī)則時(shí)不存在錯(cuò)配或如果較短的多核苷酸比25個(gè)堿基長，則不存在超過5％錯(cuò)配時(shí)，則認(rèn)為一個(gè)多核苷酸序列與另一個(gè)多核苷酸序列互補(bǔ)。優(yōu)選地，多核苷酸是完美互補(bǔ)的(無錯(cuò)配)?？梢酝ㄟ^使用例行實(shí)驗(yàn)，實(shí)施包含陰性對(duì)照的雜交分析，展示特異性雜交條件導(dǎo)致特異性雜交。

最佳雜交條件將取決于標(biāo)記探針和固定化多核苷酸或寡核苷酸的長度(例如，寡聚物與超過200個(gè)堿基的多核苷酸)和類型(例如，RNA、DNA、PNA)。核酸特異性(即，嚴(yán)格)雜交條件的一般參數(shù)在如下文獻(xiàn)中描：Sambrook等人,上文，和Ausubel等人,“Current Protocols in Molecular Biology",Greene Publishing and Wiley-interscience,NY(1987)，所述文獻(xiàn)出于全部目的完整并入本文。當(dāng)使用cDNA微陣列時(shí)，常見雜交條件在65℃在5x SSC外加0.2％SDS中雜交4小時(shí)，隨后在25℃在低嚴(yán)格性洗滌緩沖液(1x SSC外加0.2％SDS)中洗滌，隨后在25℃在高嚴(yán)格性洗滌緩沖液(0.1SSC外加0.2％SDS)中洗滌10分鐘(參見Shena等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,第93卷,第10614頁(1996))。還例如在Tijessen,Hybridization With Nucleic Acid Probes",Elsevier Science Publishers B.V.(1993)和Kricka,"Nonisotopic DNA Probe Techniques",Academic Press,SanDiego,Calif.(1992)中提供可用的雜交條件。

c)免疫測定方法

免疫測定方法基于抗體與其相應(yīng)的靶或分析物的反應(yīng)并且根據(jù)具體分析模式，可以檢測樣品中的分析物。為了改善基于免疫反應(yīng)性的分析方法的特異性和靈敏度，經(jīng)常使用單克隆抗體，原因在于它們的特異性表位識(shí)別作用。多克隆抗體也已經(jīng)成功地用于各種免疫測定法中，因?yàn)榕c單克隆抗體相比，它們對(duì)靶的親和力增加。已經(jīng)設(shè)計(jì)免疫測定法用于廣泛類型的生物樣品基質(zhì)。免疫測定法樣式已經(jīng)設(shè)計(jì)成提供定性、半定量和定量結(jié)果。

可以通過使用標(biāo)準(zhǔn)曲線生成定量結(jié)果，所述標(biāo)準(zhǔn)曲線用濃度已知的待檢測特定分析物產(chǎn)生。將源自未知樣品的響應(yīng)或信號(hào)繪制到標(biāo)準(zhǔn)曲線上，并且確立與未知樣品中的靶相對(duì)應(yīng)的量或值。

已經(jīng)設(shè)計(jì)許多免疫測定法樣式。ELISA或EIA可以定量檢測分析物/生物標(biāo)志物。這種方法依賴于標(biāo)志物與分析物或抗體接合并且標(biāo)志物組分直接或間接地包含酶。ELISA試驗(yàn)可以設(shè)定成直接、間接、競爭性或夾心檢測分析物。其他方法依賴于標(biāo)志物，例如，放射性同位素(I¹²⁵)或熒光。額外的技術(shù)例如包括凝集法、散射比濁法、濁度測定法、蛋白質(zhì)印跡法、免疫沉淀法、免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫組織化學(xué)、流式細(xì)胞術(shù)、Luminex測定法和其他方法(參見ImmunoAssay:A Practical Guide,Brian Law編輯，Taylor&Francis,Ltd.出版,2005年版)。

示例性分析模式包含酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、放射免疫測定、熒光、化學(xué)發(fā)光和熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)或時(shí)間分辨-FRET(TR-FRET)免疫測定。用于檢測生物標(biāo)志物的方法的例子包括生物標(biāo)志物免疫沉淀法，隨后是允許區(qū)分大小和肽水平的定量方法，如凝膠電泳法、毛細(xì)管電泳法、薄層電色譜法等。

檢測和/或定量可檢測標(biāo)志物或信號(hào)發(fā)生物質(zhì)的方法取決于標(biāo)志物的性質(zhì)。適當(dāng)酶催化的反應(yīng)(其中可檢測標(biāo)志物是酶；見上文)的產(chǎn)物可以是，而不限于具有熒光、發(fā)光性或放射性或它們可以吸收可見光或紫外光。適于檢測這類可檢測標(biāo)志物的檢測器的例子包括而不限于x射線膠片、放射性活度計(jì)數(shù)器、閃爍計(jì)數(shù)器，分光光度計(jì)、比色計(jì)、熒光計(jì)，光度計(jì)和光密度計(jì)。

任何檢測方法可以按允許任何合適制備、處理和分析反應(yīng)的任何形式進(jìn)行。這可以例如在多孔分析平板(例如，96孔或384孔)中或使用任何合適的陣列或微陣列?？梢允止せ蜃詣?dòng)地產(chǎn)生多種試劑的母液，并且可以使用能夠檢測可檢測標(biāo)志物的市售分析軟件、機(jī)器人和檢測儀器，自動(dòng)進(jìn)行后續(xù)全部抽吸、稀釋、混合、分配、洗滌、溫育、樣品讀出、數(shù)據(jù)采集和分析。

試劑盒

可以在試劑盒中提供執(zhí)行本文所述方法的試劑、工具和/或說明書。例如，試劑盒可以含有用于確定癌癥患者的適當(dāng)治療的試劑、工具和說明書。這種試劑盒可以包括用于從患者(如通過活組織檢查)采集組織樣品的試劑和用于處理組織的試劑。試劑盒還可以包括用于進(jìn)行基因或基因產(chǎn)物表達(dá)分析的一種或多種試劑，如用于進(jìn)行核酸擴(kuò)增(例如RT-PCR、qPCR)、測序(例如下一代測序法)、RNA印跡、蛋白質(zhì)組分析或免疫組織化學(xué)以確定患者樣品中基因或基因產(chǎn)物標(biāo)志物的表達(dá)水平的試劑。例如，可以在這類試劑盒包含用于進(jìn)行RT-PCR的引物、用于進(jìn)行RNA印跡分析的探針和/或用于進(jìn)行蛋白質(zhì)組分析如蛋白質(zhì)印跡法、免疫組織化學(xué)和ELISA分析的抗體。也可以包含用于測定法的適當(dāng)?shù)木彌_液。也可以包含任何這些測定法所要求的檢測試劑。下文更詳細(xì)地描述適當(dāng)?shù)脑噭┖头椒?。試劑盒可以包含檢測表2中至少一種(直至全部)生物標(biāo)志物的表達(dá)水平的合適引物和/或探針。在蛋白質(zhì)水平確定表達(dá)的情況下，試劑盒可以含有對(duì)目的蛋白特異的結(jié)合試劑。結(jié)合試劑可以包括抗體以包含全部片段及其衍生物。在本發(fā)明的多種實(shí)施方案背景下，術(shù)語“抗體”包括對(duì)有關(guān)蛋白質(zhì)具有特異性結(jié)合親和力的全部免疫球蛋白或免疫球蛋白樣分子(以舉例方式包含而不限于IgA、IgD、IgE、IgG和IgM、其組合以及在任何脊椎動(dòng)物中例如在哺乳動(dòng)物如人、山羊、兔和小鼠中免疫反應(yīng)期間產(chǎn)生的類似分子)?？捎糜诒景l(fā)明的多種實(shí)施方案中的特定免疫球蛋白包括IgG同種型?？捎糜诒景l(fā)明的多種實(shí)施方案中的抗體可以是單克隆或多克隆來源的，但一般是單克隆抗體?？贵w可以是人抗體、非人抗體、或人源化形式的非人抗體、或嵌合抗體。充分建立了用于抗體人源化的多種技術(shù)并且可以使用任何合適的技術(shù)。術(shù)語“抗體”還指包含至少一個(gè)特異性識(shí)別并結(jié)合抗原表位的輕鏈或重鏈免疫球蛋白可變區(qū)的多肽配體，并且它擴(kuò)展至保留與有關(guān)蛋白質(zhì)特異性結(jié)合能力的全部抗體衍生物和片段。這些衍生物和片段可以包括Fab片段、F(ab’)₂片段、Fv片段、單鏈抗體、單結(jié)構(gòu)域抗體、Fc片段等。術(shù)語抗體涵蓋同時(shí)由重鏈和輕鏈組成的抗體，還包括(僅)重鏈抗體(它們可以衍生自軟骨魚類或駝?lì)惖亩喾N物種)。在具體實(shí)施方案中，抗體可以工程化，從而對(duì)多于一種蛋白質(zhì)特異，例如具有允許結(jié)合如本文中鑒定的兩種不同靶蛋白(參見表2)的雙特異性。

在一些實(shí)施方案中，試劑盒還可以含有在測試預(yù)測響應(yīng)性時(shí)待施用的特定抗血管生成治療劑。這種藥劑可以按定制用于特定治療的形式如劑型提供。試劑盒可以配有根據(jù)適當(dāng)治療方案施用的合適說明書。

本文中表征的試劑盒還可以包括描述如何進(jìn)行測定法以測量基因或基因產(chǎn)物表達(dá)的說明頁。說明頁還可以包括如何確定參比組群的說明，包括如何測定參比組群中基因或基因產(chǎn)物標(biāo)志物的表達(dá)水平和如何裝配表達(dá)數(shù)據(jù)以建立參比以便與試驗(yàn)患者比較。說明頁還可以包含用于分析試驗(yàn)患者中基因或基因產(chǎn)物表達(dá)和用于將該表達(dá)水平與參比組群中的表達(dá)比較以隨后為試驗(yàn)患者確定適當(dāng)化療的說明。用于確定適當(dāng)化療的方法在上文描述并且可以在說明頁中詳述。

試劑盒中包含的信息資料可以是涉及本文所述方法和/或使用本文所述方法的試劑的描述性資料、指導(dǎo)性資料、銷售資料或其他資料。例如，試劑盒的信息資料可以含有聯(lián)系信息，例如，實(shí)際地址、電子郵件地址、網(wǎng)址或電話號(hào)碼，其中試劑盒的用戶可以獲得關(guān)于進(jìn)行基因表達(dá)分析和解讀結(jié)果的實(shí)質(zhì)信息，特別地當(dāng)這些結(jié)果適用于人對(duì)特定治療劑具有陽性反應(yīng)的可能性時(shí)。

本文中表征試劑盒還可以含有從基因產(chǎn)物標(biāo)志物表達(dá)推斷患者對(duì)特定治療劑具有陽性反應(yīng)的可能性所必需的軟件。

治療劑

如上文描述，本文所述的方法允許將患者劃分為在化療治療之后或與之組合施用抗血管生成治療劑之前、之時(shí)或之后具有良好或較差臨床預(yù)后。用來治療癌癥的某些當(dāng)前這樣的抗血管生成治療劑包括但不限于以下藥物；VEGF途徑靶向治療劑，包括多靶向途徑抑制劑(VEGF/PDGF/FGF/EGFT/FLT-3/c-KIT)、血管生成素-TIE2途徑抑制劑、內(nèi)源性血管生成抑制劑、免疫調(diào)節(jié)劑。VEGF特異性制劑包括但不限于貝伐珠單抗(Avastin)、阿柏西普(VEGFTrap)、IMC-1121B(雷莫蘆單抗(ramucirumab))。多靶向途徑抑制劑包括但不限于、伊馬替尼(Gleevec)、索拉替尼(多吉美(Nexavar))、吉非替尼(易瑞沙(Iressa))、舒尼替尼(索坦(Sutent))、厄洛替尼、Tivozinib、西地尼布(Recentin)、帕唑帕尼(Votrient)、BIBF 1120(Vargatef)、度維替尼、司馬沙尼(Sugen)、阿昔替尼(AG013736)、凡德他尼(Zactima)、尼洛替尼(Tasigna)、達(dá)沙替尼(Sprycel)、伐他拉尼、莫特塞尼、ABT-869、TKI-258。血管生成素-TIE2途徑抑制劑包括但不限于AMG-386、PF-4856884 CVX-060、CEP-11981、CE-245677、MEDI-3617、CVX-241、曲妥珠單抗(Herceptin)。內(nèi)源性血管生成抑制劑包括但不限于血小板反應(yīng)蛋白、內(nèi)皮抑素、腫瘤抑素(Tumstatin)、血管能抑素(Canstatin)、抑制蛋白、血管抑制素、Vasostatin、干擾素α。免疫調(diào)節(jié)劑包括但不限于沙立度胺和來那度胺。在一個(gè)示例實(shí)施方案中，所述抗血管生成劑是貝伐珠單抗。

本發(fā)明進(jìn)一步定義于以下編號(hào)項(xiàng)中：

1.用于選擇是否向受試者施用抗血管生成治療劑的方法，其包括：

從受試者獲得測試樣品；

從獲得自所述受試者的測試樣品測量生物標(biāo)志物組的表達(dá)水平，其中所述生物標(biāo)志物組包含選自表2或表3的一種或多種生物標(biāo)志物；

測定所述生物標(biāo)志物組的樣品表達(dá)得分；

將所述樣品表達(dá)得分與閾值得分進(jìn)行比較；和

基于所述樣品表達(dá)得分是否等于或高于閾值表達(dá)得分而選擇治療，其中如果所述樣品表達(dá)得分高于閾值得分，則抗血管生成治療劑是禁忌的。

2.項(xiàng)1的方法，其中所述受試者正患有癌癥。

3.項(xiàng)2的方法，其中所述癌癥是卵巢癌。

4.項(xiàng)3的方法，其中所述卵巢癌是高級(jí)漿液性卵巢癌。

5.項(xiàng)1至4中任一項(xiàng)的方法，其中所述受試者正在接受或已經(jīng)接受化療治療。

6.項(xiàng)5的方法，其中所述化療治療包括施用基于鉑的化療劑、烷化劑、抗代謝物、抗腫瘤抗生素、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑、有絲分裂抑制劑或其組合。

7.項(xiàng)6的方法，其中所述化療治療包括施用基于鉑的化療劑、有絲分裂抑制劑或其組合。

8.項(xiàng)6的方法，其中所述化療治療包括施用卡鉑和紫杉醇。

9.項(xiàng)1至8中任一項(xiàng)的方法，其中所述抗血管生成治療劑是靶向VEGF-途徑的治療劑，血管生成素-TIE2途徑抑制劑，內(nèi)源性血管生成抑制劑或免疫調(diào)節(jié)劑。

10.項(xiàng)9的方法，其中所述靶向VEGF-途徑的治療劑包括貝伐珠單抗(Avastin)、阿柏西普(VEGF Trap)、IMC-1121B(雷莫蘆單抗(ramucirumab))、伊馬替尼(Gleevec)、索拉替尼(多吉美(Nexavar))、吉非替尼(易瑞沙(Iressa))、舒尼替尼(索坦(Sutent))、厄洛替尼、Tivozinib、西地尼布(Recentin)、帕唑帕尼(Votrient)、BIBF 1120(Vargatef)、度維替尼、司馬沙尼(Sugen)、阿昔替尼(AG013736)、凡德他尼(Zactima)、尼洛替尼(Tasigna)、達(dá)沙替尼(Sprycel)、伐他拉尼(vatalanib)、莫特塞尼、ABT-869、TKI-258或其組合。

11.項(xiàng)16的方法，其中所述血管生成素-TIE2途徑抑制劑包括AMG-386、PF-4856884CVX-060、CEP-11981、CE-245677、MEDI-3617、CVX-241、曲妥珠單抗(Herceptin)或其組合。

12.項(xiàng)9的方法，其中所述內(nèi)源性血管生成抑制劑包括血小板反應(yīng)蛋白、內(nèi)皮抑素、腫瘤抑素(Tumstatin)、血管能抑素(Canstatin)、抑制蛋白、血管抑制素、Vasostatin、干擾素α或其組合。

13.項(xiàng)9的方法，其中所述免疫調(diào)節(jié)劑包括沙利度胺和來那度胺。

14.項(xiàng)10的方法，其中所述靶向VEGF-途徑的治療劑是貝伐珠單抗。

15.項(xiàng)1至14中任一項(xiàng)的方法，其中所述生物標(biāo)志物組包含IGF2、SOX11、INS、CXCL17、SLC5A1、TMEM45A、CXCR2P1、MFAP2、MATN3或RTP4中的一種或多種。

16.項(xiàng)1至14中任一項(xiàng)的方法，其中所述生物標(biāo)志物組包含表2中列出的生物標(biāo)志物。

17.項(xiàng)16的方法，其中使用所述生物標(biāo)志物組中的各生物標(biāo)志物的權(quán)重值和偏差值計(jì)算所述表達(dá)得分，且其中各生物標(biāo)志物的權(quán)重值和偏差值列于表2中。

18.項(xiàng)16的方法，其中使用所述生物標(biāo)志物組中的各生物標(biāo)志物的權(quán)重值計(jì)算所述表達(dá)得分，且其中各生物標(biāo)志物的權(quán)重排序于如表3中定義的遞減絕對(duì)值中。

19.項(xiàng)1至14中任一項(xiàng)的方法，其中所述生物標(biāo)志物組包含IGF2、CDR1、COL3A1、SPARC、TIMP3、INS、COL8A1、NUAK1、MATN3、TMEM45A中的一種或多種。

20.項(xiàng)1至14中任一項(xiàng)的方法，其中所述生物標(biāo)志物組包含INS、SPARC、COLA1、COL3A1、CDR1、NUAK1、TIMP3和MMP14中的一種或多種。

21.用于確定受試者的臨床預(yù)后的方法，其包括：

從患有癌癥的受試者獲得測試樣品；

從獲得自所述受試者的測試樣品測量生物標(biāo)志物組的表達(dá)水平，其中所述生物標(biāo)志物組包含選自表2的一種或多種生物標(biāo)志物；

測定所述生物標(biāo)志物組的樣品表達(dá)得分；

將所述樣品表達(dá)得分與閾值得分進(jìn)行比較；和

基于所述樣品表達(dá)得分是否高于閾值表達(dá)得分而確定所述受試者的臨床預(yù)后，其中如果所述樣品表達(dá)得分高于或等于所述閾值表達(dá)得分，則所述臨床預(yù)后是良好預(yù)后。

22.項(xiàng)21的方法，其中所述良好預(yù)后表明與樣品表達(dá)得分低于所述閾值得分的樣品相比增加的無進(jìn)展存活率或總存活率。

23.項(xiàng)21或項(xiàng)22的方法，其中所述癌癥是卵巢癌。

24.項(xiàng)23的方法，其中所述卵巢癌是高級(jí)漿液性卵巢癌。

25.項(xiàng)21至24中任一項(xiàng)的方法，其中所述化療治療包括施用基于鉑的化療劑、烷化劑、抗代謝物、抗腫瘤抗生素、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑、有絲分裂抑制劑或其組合。

26.項(xiàng)25的方法，其中所述化療治療包括施用基于鉑的化療劑、有絲分裂抑制劑或其組合。

27.項(xiàng)25的方法，其中所述化療治療包括施用紫杉醇和卡鉑。

28.項(xiàng)21至27中任一項(xiàng)的方法，其中所述生物標(biāo)志物組包含IGF2、SOX11、INS、CXCL17、SLC5A1、TMEM45A、CXCR2P1、MFAP2、MATN3或RTP4中的一種或多種。

29.項(xiàng)21至28中任一項(xiàng)的方法，其中所述生物標(biāo)志物組包含表2中列出的生物標(biāo)志物。

30.項(xiàng)29的方法，其中使用所述生物標(biāo)志物組中的各生物標(biāo)志物的權(quán)重值和偏差值計(jì)算所述表達(dá)得分，且其中各生物標(biāo)志物的權(quán)重值和偏差值列于表2中。

31.項(xiàng)29的方法，其中使用所述生物標(biāo)志物組中的各生物標(biāo)志物的權(quán)重值計(jì)算所述表達(dá)得分，且其中各生物標(biāo)志物的權(quán)重排序于如表3中定義的遞減絕對(duì)值中。

32.項(xiàng)21至28中任一項(xiàng)的方法，其中所述生物標(biāo)志物組包含IGF2、CDR1、COL3A1、SPARC、TIMP3、INS、COL8A1、NUAK1、MATN3、TMEM45A中的一種或多種。

33.項(xiàng)21至28中任一項(xiàng)的方法，其中所述生物標(biāo)志物組包含INS、SPARC、COLA1、COL3A1、CDR1、NUAK1、TIMP3和MMP14中的一種或多種。

34.用于選擇是否向受試者施用貝伐珠單抗的方法，其包括：

在從患有卵巢癌的受試者獲得的測試樣品中，所述受試者正在、已經(jīng)和/或?qū)⑹褂没阢K的化療劑和/或有絲分裂抑制劑進(jìn)行治療；

測量選自表2的生物標(biāo)志物中的一種或多種、最多達(dá)所有的表達(dá)水平；

測定一種或多種生物標(biāo)志物的樣品表達(dá)得分；

將所述樣品表達(dá)得分與閾值得分進(jìn)行比較；和

基于所述樣品表達(dá)得分是否高于所述閾值表達(dá)得分而選擇治療，其中如果所述樣品表達(dá)得分高于或等于閾值得分，則貝伐珠單抗是禁忌的。

35.項(xiàng)34的方法，其中所述卵巢癌包含漿液性卵巢癌。

36.項(xiàng)35的方法，其中所述漿液性卵巢癌是高級(jí)漿液性卵巢癌。

37.項(xiàng)34至35中任一項(xiàng)的方法，其中如果貝伐珠單抗是禁忌的，則所述患者用基于鉑的化療劑和/或有絲分裂抑制劑進(jìn)行治療。

38.項(xiàng)34至37中任一項(xiàng)的方法，其中如果所述樣品表達(dá)得分低于所述閾值得分，則所述患者用基于鉑的化療劑和/或有絲分裂抑制劑連同貝伐珠單抗進(jìn)行治療。

39.項(xiàng)34至38中任一項(xiàng)的方法，其中所述基于鉑的化療劑包含卡鉑。

40.項(xiàng)34至39中任一項(xiàng)的方法，其中所述有絲分裂抑制劑包括紫杉烷，任選紫杉醇。

41.項(xiàng)34至40中任一項(xiàng)的方法，其中所述生物標(biāo)志物組包含IGF2、SOX11、INS、CXCL17、SLC5A1、TMEM45A、CXCR2P1、MFAP2、MATN3或RTP4中的一種或多種。

42.項(xiàng)34至40中任一項(xiàng)的方法，其中所述生物標(biāo)志物組包含表2中列出的生物標(biāo)志物。

43.項(xiàng)42的方法，其中使用所述生物標(biāo)志物組中的各生物標(biāo)志物的權(quán)重值和偏差值計(jì)算所述表達(dá)得分，且其中各生物標(biāo)志物的權(quán)重值和偏差值列于表2中。

44.項(xiàng)42的方法，其中使用所述生物標(biāo)志物組中的各生物標(biāo)志物的權(quán)重值計(jì)算所述表達(dá)得分，且其中各生物標(biāo)志物的權(quán)重排序于如表3中定義的遞減絕對(duì)值中。

45.項(xiàng)34至40中任一項(xiàng)的方法，其中所述生物標(biāo)志物組包含IGF2、CDR1、COL3A1、SPARC、TIMP3、INS、COL8A1、NUAK1、MATN3、TMEM45A中的一種或多種。

46.項(xiàng)34至40中任一項(xiàng)的方法，其中所述生物標(biāo)志物組包含INS、SPARC、COLA1、COL3A1、CDR1、NUAK1、TIMP3和MMP14中的一種或多種。

47.確定受試者的臨床預(yù)后的方法，其包括：

a.在從患有卵巢癌的受試者獲得的測試樣品中，所述受試者正在、已經(jīng)和/或?qū)⑹褂没阢K的化療劑和/或有絲分裂抑制劑進(jìn)行治療；

b.測量選自表2的生物標(biāo)志物中的一種或多種、最多達(dá)所有的表達(dá)水平；

c.測定一種或多種生物標(biāo)志物的樣品表達(dá)得分；

d.將所述樣品表達(dá)得分與閾值得分進(jìn)行比較；和

e.基于所述樣品表達(dá)得分是否等于或高于所述閾值表達(dá)得分而確定所述臨床預(yù)后，其中如果所述樣品表達(dá)得分高于或等于所述閾值得分，則所述臨床預(yù)后是良好的臨床預(yù)后。

48.項(xiàng)47的方法，其中所述卵巢癌包含漿液性卵巢癌。

49.項(xiàng)48的方法，其中所述漿液性卵巢癌是高級(jí)漿液性卵巢癌。

50.項(xiàng)47至48中任一項(xiàng)的方法，其中如果所述患者具有良好預(yù)后，則使用貝伐珠單抗的治療是禁忌的。

51.項(xiàng)47至50中任一項(xiàng)的方法，其中如果所述樣品表達(dá)得分低于所述閾值得分，則所述患者用基于鉑的化療劑和/或有絲分裂抑制劑連同貝伐珠單抗進(jìn)行治療。

52.項(xiàng)47至51中任一項(xiàng)的方法，其中所述基于鉑的化療劑包含卡鉑。

53.項(xiàng)47至52中任一項(xiàng)的方法，其中所述有絲分裂抑制劑包括紫杉烷，任選紫杉醇。

54.項(xiàng)47至53中任一項(xiàng)的方法，其中所述生物標(biāo)志物組包含IGF2、SOX11、INS、CXCL17、SLC5A1、TMEM45A、CXCR2P1、MFAP2、MATN3或RTP4中的一種或多種。

55.項(xiàng)47至53中任一項(xiàng)的方法，其中所述生物標(biāo)志物組包含表2中列出的生物標(biāo)志物。

56.項(xiàng)55的方法，其中使用所述生物標(biāo)志物組中的各生物標(biāo)志物的權(quán)重值和偏差值計(jì)算所述表達(dá)得分，且其中各生物標(biāo)志物的權(quán)重值和偏差值列于表2中。

57.項(xiàng)55的方法，其中使用所述生物標(biāo)志物組中的各生物標(biāo)志物的權(quán)重值計(jì)算所述表達(dá)得分，且其中各生物標(biāo)志物的權(quán)重排序于如表3中定義的遞減絕對(duì)值中。

58.項(xiàng)47至52中任一項(xiàng)的方法，其中所述生物標(biāo)志物組包含IGF2、CDR1、COL3A1、SPARC、TIMP3、INS、COL8A1、NUAK1、MATN3、TMEM45A中的一種或多種。

59.項(xiàng)47至52中任一項(xiàng)的方法，其中所述生物標(biāo)志物組包含INS、SPARC、COLA1、COL3A1、CDR1、NUAK1、TIMP3和MMP14中的一種或多種。

本發(fā)明由以下實(shí)施例進(jìn)一步說明，所述實(shí)施例不應(yīng)當(dāng)以任何方式解釋為對(duì)本發(fā)明的范圍加以限制。相反，應(yīng)當(dāng)清楚地理解，可以求助于可在閱讀本說明書后本身啟發(fā)本領(lǐng)域技術(shù)人員而不脫離本發(fā)明精神的多種其他實(shí)施方式、修改及其等同物。

實(shí)施例

實(shí)施例1：組織加工、層次聚類、亞型鑒定和分類器開發(fā)

腫瘤材料

從大體解剖的上皮漿液性卵巢腫瘤FFPE組織樣品組群的基因表達(dá)分析鑒定示例表達(dá)特征標(biāo)識(shí)，所述組織樣品源自NHS Lothian和愛丁堡大學(xué)。

表3：357份上皮卵巢癌樣品的病理學(xué)檢查結(jié)果。

來自FFPE的基因表達(dá)概況分析

使用高純RNA石蠟試劑盒(Roche Diagnostics GmbH,曼海姆，德國)從大體解剖的FFPE組織提取總RNA。將RNA轉(zhuǎn)化成互補(bǔ)性脫氧核糖核酸(cDNA)，隨后使用WT-Ovation^TMFFPE RNA擴(kuò)增系統(tǒng)V2的技術(shù)(NuGEN Technologies Inc.,San Carlos,CA,USA)，將所述cDNA擴(kuò)增并轉(zhuǎn)化成單鏈形式。隨后將擴(kuò)增的單鏈cDNA片段化并使用FL-Ovation^TMcDNA生物素模塊V2(NuGEN Technologies Inc.)進(jìn)行生物素標(biāo)記。隨后片段化和標(biāo)記的cDNA與Almac卵巢癌DSA^TM雜交。已經(jīng)優(yōu)化Almac的卵巢癌DSA^TM研究工具用于分析FFPE組織樣品，這使得利用有價(jià)值的歸檔組織庫成為可能。Almac卵巢癌DSA^TM研究工具是展示正常卵巢組織和癌性卵巢組織中轉(zhuǎn)錄組的創(chuàng)新微陣列平臺(tái)。因此，卵巢癌DSA^TM提供了卵巢疾病和組織背景內(nèi)部轉(zhuǎn)錄組的全面展示，這是使用一般微陣列平臺(tái)不可獲得的。使用Affymentrix掃描儀7G(Affymetrix Inc.,Santa Clara,CA)掃描陣列。

數(shù)據(jù)準(zhǔn)備

使用MAS5預(yù)處理算法實(shí)施概況分析樣品的質(zhì)量控制(QC)。解決了不同的技術(shù)方面：平均噪聲和背景均勻性、當(dāng)前識(shí)別百分?jǐn)?shù)(陣列質(zhì)量)、信號(hào)質(zhì)量、RNA質(zhì)量和雜交質(zhì)量。分析相應(yīng)參數(shù)的分布和中位絕對(duì)偏差并用來鑒定可能的離群值。

Almac的卵巢癌DSA^TM含有主要靶向距3’末端300個(gè)核苷酸內(nèi)部的區(qū)域的探針。因此，調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)Affymetrix RNA質(zhì)量量值，對(duì)于持家基因，除常規(guī)3’/5’比率之外，還使用附帶3’末端探針組強(qiáng)度對(duì)平均背景強(qiáng)度的3’末端探針組強(qiáng)度。檢驗(yàn)雜交對(duì)照以確保它們的強(qiáng)度和當(dāng)前識(shí)別與Affymetrix規(guī)定的要求相符。

層次聚類和功能分析

樣品前處理使用強(qiáng)大的多陣列平均法(Robust Multi-array Average,RMA)[16]來實(shí)施。通過減少變異、降低強(qiáng)度和增加與cDNA產(chǎn)量的相關(guān)性分選數(shù)據(jù)矩陣。過濾與cDNA產(chǎn)量相關(guān)的探針組之后，測試數(shù)據(jù)矩陣的增量子集的聚類穩(wěn)定性：應(yīng)用GAP統(tǒng)計(jì)[17]以計(jì)算樣品和探針組聚類的數(shù)目，而使用部分比較方法[18,19]評(píng)價(jià)聚類組合物的穩(wěn)定性。基于選擇數(shù)目的樣品聚類的最小且最穩(wěn)定的數(shù)據(jù)矩陣確定最終最可變的探針組列表。

將數(shù)據(jù)矩陣針對(duì)中值探針組表達(dá)值均一化之后，使用Euclidean距離和Ward氏關(guān)聯(lián)法[20]進(jìn)行凝聚層次聚類(agglomerative hierarchical clustering)[20]。使用GAP統(tǒng)計(jì)[17]確定樣品和探針組聚類的最佳數(shù)目。使用ANOVA(連續(xù)因子)或卡方分析(離散因子)評(píng)價(jià)跨樣品聚類的臨床參數(shù)因子水平的分布的顯著性，并將其針對(duì)錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(進(jìn)行的測試的p-值和數(shù)目的乘積)進(jìn)行校正。0.05的經(jīng)校正p-值閾值用作顯著性的標(biāo)準(zhǔn)。

使用基于Ensembl v60[http://oct2012.archive.ensembl.org/]的注釋管線將卵巢癌探針組重新映射至基因。使用基因本體論生物過程分類[21]進(jìn)行功能富集分析以鑒定和排序被發(fā)現(xiàn)為與成聚類基因集合相關(guān)的生物學(xué)實(shí)體。將實(shí)體根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)推導(dǎo)的富集得分[22]排序，并針對(duì)多次測試[23]調(diào)整。0.05的經(jīng)校正p-值用作顯著性閾值。將鑒定的富集過程總結(jié)成每個(gè)探針組/基因聚類的總體組功能。

特征開發(fā)和評(píng)價(jià)

亞型鑒定之后，開發(fā)基因特征用于預(yù)測分子組。為了便于將特征應(yīng)用于在不同平臺(tái)上概況分析的樣品，通過將所有探針組總結(jié)成其中值表達(dá)和log2轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)而將探針組重新映射至基因。使用偏最小二乘法[24]用基于五倍交叉驗(yàn)證的10次重復(fù)期間的過濾特征選擇選擇功能/基因而進(jìn)行特征生成。

使用R 2.15.0中的存活包[25]進(jìn)行單變量和多變量存活分析。多變量分析校正以下因素：高級(jí)漿液性：減瘤狀態(tài)、分期、化療和診斷時(shí)的年齡；Tothill：分級(jí)、分期、腫瘤輔助治療和殘余疾病。所有Kaplan-Meier圖都是存活數(shù)據(jù)的單變量表示。

結(jié)果

265份HGS腫瘤經(jīng)歷基于1400個(gè)最可變的探針組(對(duì)應(yīng)于1040種基因)的無監(jiān)督層次聚類。鑒定了三個(gè)樣品聚類和四個(gè)基因聚類(圖1)。HGS聚類和臨床病理特征之間沒有顯著關(guān)聯(lián)。功能分析(圖1)揭示，聚類HGS3的特征在于與免疫反應(yīng)和血管生成/血管發(fā)育相關(guān)的基因的上調(diào)(簡稱為血管生成-免疫(Angioimmune)的聚類)。聚類HGS1與血管生成/血管發(fā)育的上調(diào)(盡管程度明顯小于聚類HGS3)相關(guān)、但不與參與免疫反應(yīng)基因的高表達(dá)相關(guān)(簡稱為血管生成(Angio)的聚類)。聚類HGS2的特征在于參與免疫反應(yīng)的基因的上調(diào)，無參與血管生成或血管發(fā)育的基因的上調(diào)(簡稱為免疫(immune)的聚類)。

根據(jù)亞組的多變量存活分析揭示，與血管生成-免疫(Angioimmune)(HR＝0.58[0.41-0.82],padj＝0.001)和血管生成(Angio)聚類(HR＝0.55[0.37-0.80],padj＝0.001)兩者中的患者相比，免疫(Immune)聚類中的患者具有顯著延長的OS。Kaplan-Meier曲線顯示于圖2中(顯示單變量HR和p-值)。

由于免疫(Immune)聚類中的患者比其他聚類中的那些具有顯著更好的結(jié)果，我們繼續(xù)開發(fā)測定以便在臨床中前瞻性鑒定這些患者。此外，鑒于免疫聚類中的血管生成基因的低表達(dá)，我們假設(shè)該測定可以鑒定不受益于靶向血管生成的療法的群體，盡管需要額外的數(shù)據(jù)集來測試該理論。為了特征標(biāo)識(shí)生成的目的，將血管生成(Angio)和血管生成-免疫(Angioimmune)聚類分組在一起，并標(biāo)記為“促血管生成”組。

然后開發(fā)可以鑒定免疫(immune)聚類中的患者的63-基因生物標(biāo)志物測定法(表2)。與層次聚類分析一致，與其他HGS患者相比，通過該測定法分類為免疫(Immune)聚類中的患者具有顯著改善的無進(jìn)展存活率(PFS)(多變量分析；HR＝0.72[0.52-0.99],p＝0.043)和OS(多變量分析；HR＝0.61[0.44-0.86],p＝0.004)。這些多變量分析針對(duì)減瘤狀態(tài)、分期、化療和診斷時(shí)的年齡進(jìn)行校正。根據(jù)愛丁堡數(shù)據(jù)集中的特征標(biāo)識(shí)識(shí)別的PFS和OS的Kaplan-Meier曲線分別顯示于圖3A和3B中，其中單變量HR性能表示于每個(gè)圖中。

為了將我們的生物標(biāo)志物獨(dú)立地驗(yàn)證為預(yù)后測定法，將其應(yīng)用于Tothill等人.Clinical Cancer Research 2008:14(16):5198-208的數(shù)據(jù)集內(nèi)的HGS卵巢腫瘤。與其他HGS患者相比，被鑒定為免疫(immune)聚類中的患者具有顯著改善的PFS(多變量分析；HR＝0.62[0.41-0.95],p＝0.029)和OS(多變量分析；HR＝0.32[0.19-0.54],p＝0.00001)。這些多變量分析針對(duì)分級(jí)、分期、腫瘤輔助治療和殘留疾病進(jìn)行校正。根據(jù)Tothill數(shù)據(jù)集中的特征標(biāo)識(shí)識(shí)別的PFS和OS的Kaplan-Meier曲線分別顯示于圖4A和4B中，其中單變量HR性能表示于每個(gè)圖中。

實(shí)施例2：“免疫”特征標(biāo)識(shí)的預(yù)測效用的獨(dú)立驗(yàn)證

背景

國際卵巢腫瘤合作7(ICON7)試驗(yàn)是一項(xiàng)婦科癌組間III期試驗(yàn)，該試驗(yàn)評(píng)估向卡鉑和紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)化療同步添加貝伐珠單抗和添加貝伐珠單抗作為延續(xù)治療在原發(fā)性腹膜癌、輸卵管癌、和上皮卵巢癌患者中的效果(Perren TJ,Swart AM,Pfisterer J,Ledermann JA,Pujade-Lauraine E,Kristensen G等人,A phase 3trial of bevacizumab in ovarian cancer.N Engl J Med.365(26):2484-96,Aghajanian C,Blank SV,Goff BA,Judson PL,Teneriello MG,Husain A等人,OCEANS:A randomized,double-blind,placebo-controlled phase III trial of chemotherapy with or without bevacizumab in patients with platinum-sensitive recurrent epithelial ovarian,primary peritoneal,or fallopian tube cancer.Journal of Clinical Oncology.2012；30(17):2039-45)。

已經(jīng)從ICON7報(bào)告患者特征、無進(jìn)展生存期、毒性和初步總生存期數(shù)據(jù)及生活質(zhì)量(QoL)數(shù)據(jù)概要。在標(biāo)準(zhǔn)化療組中，764位女性中696位(91％)按研究方案接受18周化療。在貝伐珠單抗組中，764位女性中719位(94％)接受18周化療和貝伐珠單抗，并且472位(62％)繼續(xù)接受貝伐珠單抗至第54周時(shí)方案完成為止。采用標(biāo)準(zhǔn)化療和貝伐珠單抗時(shí)無進(jìn)展生存期的風(fēng)險(xiǎn)比是0.81(95％CI 0.70-0.94，p＝0.004)。在面臨高進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)(定義為減積手術(shù)后殘余病灶大于1.0cm的國際婦科學(xué)和產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)IV期疾病或III期疾病)的患者中，貝伐珠單抗組中的死亡風(fēng)險(xiǎn)比是0.64(95％CI 0.48-0.85；p＝0.002)。

方法

經(jīng)由醫(yī)學(xué)研究理事會(huì)(MRC)獲得ICON7跟蹤樣品。誠實(shí)的中間人保留來自MRC的相關(guān)臨床數(shù)據(jù)。已經(jīng)基于臨床因素進(jìn)行用于分析樣品概況的隨機(jī)化策略。先前測試所有試劑、陣列和參考樣品并通過合格標(biāo)準(zhǔn)。

為了證實(shí)診斷和組織學(xué)類型，兩個(gè)專業(yè)婦科病理學(xué)家使用H+E載片獨(dú)立地檢查所有樣品，并且使用WT1染色來證實(shí)有問題病例中的漿液性組織學(xué)。從FFPE塊(幾乎完全從附件腫塊，而非腹膜或網(wǎng)膜疾病)取切片，并在明場顯微鏡下大體解剖(macrodissected)以盡可能減少基質(zhì)污染(<10％)。使用的10μm切片的數(shù)量取決于塊中的腫瘤的百分比：塊中的>50％、25-50％和<25％腫瘤含量分別為二、三和四。

使用高純RNA石蠟試劑盒(Roche Diagnostics GmbH,曼海姆，德國)從大體解剖的FFPE組織提取總RNA。將RNA轉(zhuǎn)化成互補(bǔ)性脫氧核糖核酸(cDNA)，隨后使用WT-Ovation^TMFFPE RNA擴(kuò)增系統(tǒng)V2的技術(shù)(NuGEN Technologies Inc.,San Carlos,CA,USA)，將所述cDNA擴(kuò)增并轉(zhuǎn)化成單鏈形式。隨后將擴(kuò)增的單鏈cDNA片段化并使用FL-Ovation^TMcDNA生物素模塊V2(NuGEN Technologies Inc.)進(jìn)行生物素標(biāo)記。隨后片段化和標(biāo)記的cDNA與Almac卵巢癌DSA雜交，以此為基礎(chǔ)，形成這種特征標(biāo)識(shí)。使用Affymentrix掃描儀7G(Affymetrix Inc.,Santa Clara,CA)掃描陣列。

病理學(xué)檢查之后，在具有高級(jí)漿液性卵巢癌的樣品中存在286個(gè)患者；144個(gè)患者來自貝伐珠單抗組，而142個(gè)患者來自無貝伐珠單抗組。據(jù)估計(jì)，69％的患者將在促血管生成患者組中，并且，這在兩個(gè)研究組中將是相同的。

初步研究假設(shè)是，與免疫亞組相比，在“促血管發(fā)生”亞組內(nèi)，將存在貝伐珠單抗的顯著影響，這對(duì)應(yīng)于無進(jìn)展存活的風(fēng)險(xiǎn)比的至少對(duì)半。相比之下，期望的是，在“免疫”亞組中，貝伐珠單抗將充其量沒有效果，或者甚至可以是稍微不利的。

五個(gè)樣品未通過處理QC，從而在高級(jí)漿液性臨床研究數(shù)據(jù)集中存在238個(gè)無進(jìn)展存活事件(83％)。檢測θ＞2(對(duì)應(yīng)于前面段落中概述的貝伐珠單抗的差異作用)的估計(jì)的研究能率(study power)(利用C Schmoor,W Sauerbrei和M Schumacher Sample size considerations for the evaluation of prognostic factors in survival analysis Statist.Med.2000；19:441-452中的公式6)以10％單側(cè)水平的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性為88％。數(shù)據(jù)集中存在147例死亡，且關(guān)于存活的相同分析能率為75％。

無進(jìn)展存活率為主要終點(diǎn)；這是數(shù)據(jù)集中提供的MRC計(jì)算的時(shí)間。這是從隨機(jī)化至進(jìn)展或死亡(由于任何原因)(無論哪個(gè)在先)的時(shí)間。總存活率是次要研究終點(diǎn)。這是從隨機(jī)化至由于任何原因的死亡的時(shí)間。

首先將分層Cox-比例風(fēng)險(xiǎn)模型擬合至無進(jìn)展存活率數(shù)據(jù)。該模型具有隨機(jī)化研究組的單一作用項(xiàng)。然后將第二分層Cox-比例風(fēng)險(xiǎn)模型擬合至無進(jìn)展存活率數(shù)據(jù)。還將該模型分層，但具有用于各層內(nèi)的隨機(jī)化研究組的作用的分開項(xiàng)。

比較兩種擬合模型的對(duì)數(shù)似然性，以確定隨機(jī)化研究組的作用是否依賴于促血管發(fā)生狀態(tài)(卡方檢驗(yàn)，其中自由度對(duì)應(yīng)于層-1的數(shù)目)。如果上面檢驗(yàn)以5％水平的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的，則將評(píng)價(jià)具有各層內(nèi)的隨機(jī)化研究組的分開項(xiàng)的模型的比例風(fēng)險(xiǎn)假設(shè)的適當(dāng)性。

經(jīng)由Grambsch-Therneau檢驗(yàn)[P.Grambsch和T.Therneau(1994),Proportional hazards tests and diagnostics based on weighted residuals.Biometrika,81,515-26]進(jìn)行比例風(fēng)險(xiǎn)的檢驗(yàn)。將無進(jìn)展存活時(shí)間轉(zhuǎn)化為對(duì)數(shù)標(biāo)度用于檢驗(yàn)。分別使用5％水平的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性評(píng)價(jià)對(duì)各層內(nèi)的研究組的各項(xiàng)的檢驗(yàn)。如果在所述層中的一個(gè)或多個(gè)內(nèi)排斥比例風(fēng)險(xiǎn)的檢驗(yàn)，然后使用靈活參數(shù)存活模型在各層內(nèi)擬合受限平均存活模型[P Royston,MKB Parmar The use of restricted mean survival time to estimate the treatment effect in randomized clinical trials when the proportional hazards assumption is in doubt Stat Med,30(2011),pp.2409-2421]。這些模型將使用3自由度來估計(jì)基線分布函數(shù)和1自由度來估計(jì)時(shí)間依賴性治療效果。在每種情況下計(jì)算受限平均值的最大時(shí)間為3年。

對(duì)于總存活率將重復(fù)上述分析。

結(jié)果

對(duì)于分類為免疫亞型中的患者(39％)，當(dāng)與促血管生成的患者相比時(shí)，貝伐珠單抗的添加賦予更差的無進(jìn)展存活率(HR 1.73(1.12-2.68))和總存活率(HR 2.00(1.11-3.61))。參見圖5A-B和6A-B。因此，與沒有免疫癌癥亞型的受試者相比，當(dāng)將貝伐珠單抗添加至其治療方案時(shí)，具有免疫癌癥亞型的受試者表現(xiàn)出不良預(yù)后。

實(shí)施例3：免疫特征標(biāo)識(shí)的預(yù)后效用的獨(dú)立驗(yàn)證

研究的主要目標(biāo)是：1.對(duì)患者的基因表達(dá)數(shù)據(jù)使用63-基因特征標(biāo)識(shí)預(yù)測腫瘤復(fù)發(fā)的個(gè)體風(fēng)險(xiǎn)；2.評(píng)估關(guān)于患者無進(jìn)展存活(PFS)結(jié)果以及總生存期(OS)的特征標(biāo)識(shí)預(yù)后預(yù)測的性能；3.研究臨床協(xié)變量對(duì)關(guān)于無進(jìn)展存活事件的特征標(biāo)識(shí)預(yù)后性能的影響。

該探索性研究在研究的對(duì)照組中包括所有139個(gè)患者。據(jù)估計(jì)，85個(gè)患者(61.2％)將通過基因特征標(biāo)識(shí)歸類為促血管發(fā)生(特征標(biāo)識(shí)為負(fù))。圖表和后續(xù)檢查表明，72例具有無進(jìn)展存活事件，其中該組中發(fā)生46例死亡(關(guān)于患者數(shù)和百分比的信息由Jim Paul提供)。

在Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸下使用樣品大小和能率計(jì)算方法的回顧性能率計(jì)算((Freedman,L.S.(1982).Tables of the number of patients required in clinical trials using the log-rank test.Statistics in Medicine.1:121-129)表明，當(dāng)以雙側(cè)5％水平的顯著性比較“僅免疫”與“促血管生成”分子亞組患者的無進(jìn)展存活率時(shí)，上述研究圖將提供約85％能率來檢測0.5的風(fēng)險(xiǎn)比(HR)。

進(jìn)行使用無進(jìn)展存活作為結(jié)果的至事件的時(shí)間(存活)分析以評(píng)估特征標(biāo)識(shí)的預(yù)后效果。使用Kaplan-Meier(KM)曲線顯現(xiàn)通過血管生成狀態(tài)(“促血管生成或特征標(biāo)識(shí)為負(fù)”和“僅免疫或特征標(biāo)識(shí)為正”)定義的患者群體的存活分布。

進(jìn)行Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸，以便將患者的血管生成狀態(tài)(負(fù)或正)與無進(jìn)展存活事件關(guān)聯(lián)。除了單變量(未調(diào)整)探索以外，進(jìn)行多變量(調(diào)整)Cox模型，以探索特征標(biāo)識(shí)分子亞組(正或負(fù))對(duì)針對(duì)其他重要臨床協(xié)變量的PFS和OS調(diào)整的影響。從其中包括特征標(biāo)識(shí)和標(biāo)準(zhǔn)預(yù)后變量的分析以95％置信區(qū)間報(bào)道所有估計(jì)的影響，而不論其顯著性(P Royston,MKB Parmar The use of restricted mean survival time to estimate the treatment effect in randomized clinical trials when the proportional hazards assumption is in doubt Stat Med,30(2011),pp.2409-2421)。由于大小限制，僅考慮少數(shù)重要協(xié)變量；這些包括FIGO分期，腫瘤分級(jí)，減瘤狀態(tài)，表現(xiàn)狀態(tài)(ECOG)和患者年齡。

在解釋Cox模型結(jié)果之前，研究跨分子亞組的比例風(fēng)險(xiǎn)假設(shè)的適當(dāng)性。與研究試驗(yàn)數(shù)據(jù)的前述分析一致，如果排斥比例風(fēng)險(xiǎn)的檢驗(yàn)，則對(duì)于各分子亞組擬合受限平均存活模型。計(jì)算受限平均值的最大時(shí)間為4年。

結(jié)果

63-基因特征標(biāo)識(shí)在ICON7試驗(yàn)數(shù)據(jù)的對(duì)照組(接受卡鉑加上紫杉醇化療治療)中的高級(jí)漿液性(HGS)卵巢癌患者中是預(yù)后性的。使用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸的結(jié)果顯示，與針對(duì)其他臨床協(xié)變量(包括年齡、分級(jí)、ECOG、減瘤狀態(tài)和分期)調(diào)整之前(單變量HR＝0.48,95％CI＝0.32,0.72；p<0.001)和之后(多變量HR＝0.50；95％CI＝0.32,0.79；p＝0.003)被分類為促血管發(fā)生的患者相比，通過基因特征標(biāo)識(shí)分類為“免疫”分子亞組的患者具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性改進(jìn)的無進(jìn)展存活，參見圖7A。類似地，與針對(duì)其他臨床協(xié)變量調(diào)整之前(單變量HR＝0.46；95％CI＝0.26,0.80；p＝0.006)和之后(多變量HR＝0.53；95％CI＝0.29,0.97；p＝0.041)被分類為促血管發(fā)生的患者相比，分類為免疫分子亞組的患者具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性更好的總存活率，參見圖7B。該數(shù)據(jù)顯示未嚴(yán)重偏離比例假設(shè)。

實(shí)施例4：無血管生成特征標(biāo)識(shí)在結(jié)直腸癌中的預(yù)測性應(yīng)用

獲得了在plus 2陣列(E-GEOD-19862)上從患有復(fù)發(fā)性或轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的貝伐珠單抗反應(yīng)個(gè)體和反應(yīng)個(gè)體組群的基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫獲得的公共陣列數(shù)據(jù)集并使用表2的示例63基因特征標(biāo)識(shí)分析。63基因卵巢免疫特征標(biāo)識(shí)以AUC：0.86(0.60-1.00)預(yù)測響應(yīng)于貝伐珠單抗。參見圖8。

實(shí)施例5：63基因特征標(biāo)識(shí)的概述

樣品：

·內(nèi)部訓(xùn)練樣品：該樣品集由從愛丁堡卵巢癌數(shù)據(jù)庫中檢索到的193份高級(jí)漿液性卵巢樣品組成

·Tothill樣品：這是公開獲得的數(shù)據(jù)集，其中152份高級(jí)漿液性卵巢樣品用于分析

·ICON7樣品：該樣品集由來自卡鉑和紫杉醇的III期隨機(jī)化試驗(yàn)(有或沒有貝伐珠單抗第一線癌癥治療)的284份高級(jí)漿液性樣品組成，其通過MRC(醫(yī)學(xué)研究理事會(huì))獲得。

οICON7SOC(護(hù)理標(biāo)準(zhǔn))-140個(gè)樣品-是指沒有接受貝伐珠單抗的添加的患者

οICON7免疫組-116個(gè)樣品：這是指通過免疫63基因特征標(biāo)識(shí)預(yù)測為免疫組中的ICON7樣品

οICON7促血管生成(ProAngio)組-168個(gè)樣品：這是指通過免疫63基因特征標(biāo)識(shí)預(yù)測為促血管生成組中的ICON7樣品

方法：

特征標(biāo)識(shí)開發(fā)

在5-倍交叉驗(yàn)證(CV)的10次重復(fù)期間使用193個(gè)卵巢HGS樣品的平衡樣品集來開發(fā)使用PLS(Dejong S.Simpls-an Alternative Approach to Partial Least-Squares Regression.Chemometr Intell Lab 1993；18:251-63)(偏最小二乘)方法的特征標(biāo)識(shí)。在特征標(biāo)識(shí)開發(fā)中使用以下步驟：

·使用各基因的中值探針組表達(dá)的log₂轉(zhuǎn)化映射至測量的基因和基因表達(dá)的探針組

·在巢式CV內(nèi)，遵循預(yù)過濾進(jìn)行分位數(shù)歸一化以去除具有低方差、低強(qiáng)度和與cDNA產(chǎn)量的高相關(guān)性的75％基因

·基于關(guān)聯(lián)調(diào)整的t-得分和涉及的特征減少將基因/特征排序，丟棄10％的重要性最低的基因，直到剩余5個(gè)基因

·將63基因特征標(biāo)識(shí)鑒定為在交叉驗(yàn)證下預(yù)測無進(jìn)展存活(PFS)的風(fēng)險(xiǎn)比(HR)為最佳的特征集合

已經(jīng)在CV內(nèi)評(píng)估以下數(shù)據(jù)集以確定63基因特征標(biāo)識(shí)的性能：

·內(nèi)部訓(xùn)練集-193個(gè)樣品

·ICON7SOC(護(hù)理標(biāo)準(zhǔn))-140個(gè)樣品

·ICON7免疫組-116個(gè)樣品

·ICON7促血管生成(ProAngio)組-168個(gè)樣品

核心基因分析

評(píng)估特征標(biāo)識(shí)的核心基因集合的目的是基于其對(duì)當(dāng)從特征標(biāo)識(shí)去除時(shí)的性能的影響確定基因的排序。

該分析涉及來自原始63特征標(biāo)識(shí)基因的10種特征標(biāo)識(shí)基因的1,000,000次隨機(jī)采樣。在每次迭代時(shí)，去除10種隨機(jī)選擇的特征標(biāo)識(shí)基因，并且當(dāng)在以下3個(gè)數(shù)據(jù)集中去除這10種基因時(shí)，使用PFS終點(diǎn)評(píng)估剩余53種基因的性能以確定對(duì)HR性能的影響：

·內(nèi)部驗(yàn)證-72個(gè)樣品

·Tothill HGS(Tothill RW,Tinker AV,George J,等人Novel molecular subtypes of serous and endometrioid ovarian cancer linked to clinical outcome.Clin Cancer Res 2008；14:5198-208)(高級(jí)漿液性)-152個(gè)樣品

·ICON7 SOC(護(hù)理標(biāo)準(zhǔn))-140個(gè)樣品

在這3個(gè)數(shù)據(jù)集各自內(nèi)，基于其納入或排除，基于HR性能的變化(ΔHR)將特征標(biāo)識(shí)基因加權(quán)。排序?yàn)椤?”的基因?qū)Ξ?dāng)去除時(shí)的性能具有最陰性的影響，且排序?yàn)椤?3”的基因?qū)Ξ?dāng)去除時(shí)的性能具有最小的影響。

最少基因分析

評(píng)估最少數(shù)量的基因的目的是確定是否可以在原始特征標(biāo)識(shí)的較小子集內(nèi)實(shí)現(xiàn)顯著性能。

該分析涉及63特征標(biāo)識(shí)基因的10,000次隨機(jī)采樣，其在1種基因/特征開始，最多達(dá)最多25種基因/特征。對(duì)于各隨機(jī)選擇的特征長度，使用PLS機(jī)器學(xué)習(xí)方法在推導(dǎo)的CV和模型參數(shù)下重新開發(fā)特征標(biāo)識(shí)。在各特征長度，對(duì)于以下3個(gè)數(shù)據(jù)集，應(yīng)用所有隨機(jī)選擇的特征標(biāo)識(shí)以計(jì)算特征標(biāo)識(shí)得分：

·Tothill HGS(高級(jí)漿液性)-152個(gè)樣品

·ICON7 SOC(護(hù)理標(biāo)準(zhǔn))-140個(gè)樣品

·ICON7免疫組-116個(gè)樣品

用PFS(無進(jìn)展存活)評(píng)估連續(xù)特征標(biāo)識(shí)得分，以確定HR(風(fēng)險(xiǎn)比)影響。概述在每一特征長度的所有隨機(jī)特征標(biāo)識(shí)的HR，且生成圖以顯現(xiàn)經(jīng)CV的性能。

結(jié)果

特征標(biāo)識(shí)開發(fā)

本部分呈現(xiàn)CV內(nèi)的特征標(biāo)識(shí)開發(fā)的結(jié)果。

·內(nèi)部訓(xùn)練集合：圖9、10和11顯示其中鑒定63基因特征標(biāo)識(shí)的訓(xùn)練集的AUC(受試者工作曲線下面積)、C-指數(shù)(一致性指數(shù))和HR。

·ICON7 SOC:圖12和13顯示CV下的ICON7SOC樣品的HR和C-指數(shù)。

·ICON7免疫組：圖14顯示CV下的ICON7免疫樣品的HR(如通過63基因特征標(biāo)識(shí)鑒定)。

·ICON7促血管生成(ProAngio)組：圖15顯示CV下的ICON7促血管生成(ProAngio)樣品的HR(如通過63基因特征標(biāo)識(shí)鑒定)。

核心基因分析

本部分中提供3個(gè)數(shù)據(jù)集中的63基因特征標(biāo)識(shí)的核心基因分析的結(jié)果。

·內(nèi)部驗(yàn)證：該數(shù)據(jù)集中對(duì)于63個(gè)特征標(biāo)識(shí)基因測量的ΔHR性能顯示于圖16中。該圖突出特征標(biāo)識(shí)中的10個(gè)排序最前的基因，其在保留該數(shù)據(jù)集內(nèi)的良好HR性能中是最重要的。

·Tothill HGS：該數(shù)據(jù)集中對(duì)于63個(gè)特征標(biāo)識(shí)基因測量的ΔHR性能顯示于圖17中。該圖突出特征標(biāo)識(shí)中的10個(gè)排序最前的基因，其在保留該數(shù)據(jù)集內(nèi)的良好HR性能中是最重要的。

·ICON7 SOC：該數(shù)據(jù)集中對(duì)于63個(gè)特征標(biāo)識(shí)基因測量的ΔHR性能顯示于圖18中。該圖突出特征標(biāo)識(shí)中的10個(gè)排序最前的基因，其在保留該數(shù)據(jù)集內(nèi)的良好HR性能中是最重要的。

·評(píng)估這3個(gè)數(shù)據(jù)集間的ΔHR以獲得每個(gè)特征標(biāo)識(shí)基因的組合基因排序。基于核心集合分析指定給特征標(biāo)識(shí)基因的排序已經(jīng)概述于Immune63GeneSig_CoreGenes_HR.txt中。

最少基因分析

本部分中提供3個(gè)數(shù)據(jù)集中的63基因特征標(biāo)識(shí)的最少基因分析的結(jié)果。

·Tothill HGS:該數(shù)據(jù)集中使用1..25的特征長度的特征標(biāo)識(shí)基因的隨機(jī)采樣測量的平均HR性能顯示于圖19中。該圖顯示，為了保留顯著HR性能(即HR<1)，必須選擇最少5個(gè)特征標(biāo)識(shí)基因。

·ICON7 SOC：該數(shù)據(jù)集中使用1..25的特征長度的特征標(biāo)識(shí)基因的隨機(jī)采樣測量的平均HR性能顯示于圖20中。該圖顯示，為了保留顯著HR性能(即HR<1)，必須選擇最少2個(gè)特征標(biāo)識(shí)基因。

·ICON7免疫：該數(shù)據(jù)集中使用1..25的特征長度的特征標(biāo)識(shí)基因的隨機(jī)采樣測量的平均HR性能顯示于圖21中。該圖顯示，為了保留顯著HR性能(即HR<1)，必須選擇最少5個(gè)特征標(biāo)識(shí)基因。

總之，推薦可以使用最少至少5個(gè)基因，且將保留顯著性能。

實(shí)施例6：結(jié)腸癌樣品

樣品和方法

樣品

用63-基因特征標(biāo)識(shí)評(píng)價(jià)來自具有II期、III期或IV期疾病的患者的529份新鮮冷凍(FF)的原代腫瘤樣品，其中232份具有在接受輔助化療之后跟進(jìn)的無進(jìn)展存活數(shù)據(jù)。來自在Affymetrix U133Plus 2.0平臺(tái)上的基因表達(dá)概況分析的微陣列數(shù)據(jù)獲得自公共領(lǐng)域(GEO登錄號(hào)GSE40967)。

特征標(biāo)識(shí)得分計(jì)算

使用以下步驟計(jì)算特征標(biāo)識(shí)得分：

·強(qiáng)健多陣列分析(RMA)背景校正。

·使用中值表達(dá)將探針概述至探針組。

·使用中值表達(dá)將探針組概述至基因。

·以每個(gè)樣品基礎(chǔ)將分位數(shù)歸一化模型應(yīng)用至基因水平矩陣(或矢量)，其將個(gè)別患者基因概況的分布轉(zhuǎn)化為與訓(xùn)練數(shù)據(jù)類似的分布。

·使用特征標(biāo)識(shí)中每個(gè)樣品的表達(dá)的加權(quán)總和來計(jì)算每個(gè)樣品的特征標(biāo)識(shí)得分：

其中w_i為每個(gè)基因的權(quán)重，b_i為基因特異性的偏差，x_i為預(yù)處理之后觀察到的基因表達(dá)水平，且k＝0.2953是恒定偏移

統(tǒng)計(jì)分析

使用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型來估計(jì)63-基因特征標(biāo)識(shí)對(duì)輔助化療之后的無進(jìn)展存活的單變量風(fēng)險(xiǎn)比(HR)效應(yīng)。使用對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)計(jì)算HR估計(jì)的p值。

結(jié)果

圖22提供了接受輔助化療的232個(gè)患者中的特征標(biāo)識(shí)預(yù)測的Kaplan Meier曲線，其顯示63基因特征標(biāo)識(shí)可以用于預(yù)測預(yù)后。從Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸計(jì)算的單變量HR是0.49，其中對(duì)數(shù)秩p＝0.001?！把苌砷_”(“Angio on”)相當(dāng)于生物標(biāo)志物特征標(biāo)識(shí)為負(fù)，且“血管生成關(guān)”(“Angio off”)相當(dāng)于生物標(biāo)志物特征標(biāo)識(shí)為正。

實(shí)施例7：結(jié)直腸癌的亞型的預(yù)后效用

樣品

公共陣列數(shù)據(jù)集獲得自基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(GSE40967)，其包含529個(gè)具有結(jié)直腸癌的患者的組群(Marrisa等人,2013)。在Affymetrix Plus 2.0陣列平臺(tái)上分析樣品概況。該數(shù)據(jù)包含II期、III期和IV期疾病的患者，232個(gè)患者接受輔助化療，其具有隨訪無復(fù)發(fā)的存活(RFS)數(shù)據(jù)。

方法

使用RMA預(yù)處理所有樣品，并且使用Entrez Gene IDs進(jìn)行半監(jiān)督層次聚類分析，其定義圖1中的“血管生成”基因聚類(聚類4)以過濾數(shù)據(jù)矩陣。在針對(duì)中值基因表達(dá)值將過濾的數(shù)據(jù)矩陣標(biāo)準(zhǔn)化之后，使用歐幾里得距離和Ward關(guān)聯(lián)進(jìn)行凝聚層次聚類分析。使用GAP統(tǒng)計(jì)學(xué)確定樣品和基因聚類的最佳數(shù)目。由于用于聚類分析樣品的基因列表對(duì)于血管生成生物學(xué)是高度富集的，這些基因上調(diào)的樣品聚類被類別標(biāo)記為血管生成活性的(或血管生成開(angio on))；且這些基因下調(diào)的那些被類別標(biāo)記為血管發(fā)生無活性的(或血管生成關(guān)(angio off))。

用63-基因特征標(biāo)識(shí)進(jìn)一步檢測樣品，且使用受試者工作特征(ROC)曲線下面積(AUC)評(píng)估63基因特征標(biāo)識(shí)得分和樣品聚類(血管發(fā)生活性或血管發(fā)生無活性)之間的關(guān)聯(lián)。優(yōu)化用于將患者分類為結(jié)直腸癌內(nèi)的血管發(fā)生活性/血管發(fā)生無活性的閾值，以便就如層次聚類分析所定義預(yù)測亞型而言盡可能提高靈敏度+特異性。

使用Kaplan Meier曲線和Cox-比例風(fēng)險(xiǎn)存活分析評(píng)估63-基因特征標(biāo)識(shí)預(yù)測的臨床顯著性。將終點(diǎn)定義為無進(jìn)展存活，且Cox-比例風(fēng)險(xiǎn)模型包括針對(duì)臨床協(xié)變量(年齡；性別；分期；腫瘤位置和MSI狀態(tài))的調(diào)整。

結(jié)果

520個(gè)樣品經(jīng)歷基于219個(gè)基因(定義圖23中的聚類4的基因)的半監(jiān)督的聚類分析。鑒定了兩個(gè)樣品聚類和3個(gè)基因聚類(圖23)。樣品聚類1(273個(gè)患者)的特征在于血管生成基因的表達(dá)的上調(diào)，因此被標(biāo)記為血管生成活性的；且樣品聚類2(256個(gè)患者)的特征在于血管生成基因的表達(dá)的下調(diào)，因此被標(biāo)記為血管生成無活性的。

就預(yù)測兩個(gè)樣品聚類而言對(duì)于63-基因特征標(biāo)識(shí)計(jì)算的AUC為0.86[0.83-0.89]，如圖24中的ROC曲線所描繪。以0.6604的特征標(biāo)識(shí)得分閾值定義用于預(yù)測亞型的靈敏度和特異性的最大總和；這是應(yīng)用于將患者預(yù)測為血管生成活性或血管發(fā)生無活性亞型的閾值。具有特征標(biāo)識(shí)得分>0.6604的患者被分類為血管生成活性的，且具有特征標(biāo)識(shí)得分≤0.6604的患者被分類為血管生成無活性的。

通過特征標(biāo)識(shí)預(yù)測的無進(jìn)展存活的Cox-比例風(fēng)險(xiǎn)建模(針對(duì)臨床協(xié)變量調(diào)整)揭示，與血管生成活性組中的患者相比，血管生成無活性組中的患者具有顯著改善的無進(jìn)展存活(表4：HR＝0.47[0.30-0.76])。Kaplan Meier曲線顯示于圖22中。

表4：使用232個(gè)輔助治療的患者的多變量存活分析

實(shí)施例8：63-基因特征標(biāo)識(shí)的預(yù)后效用的獨(dú)立驗(yàn)證

樣品

公共陣列數(shù)據(jù)集獲得自基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(GSE14333)，其包含290個(gè)具有結(jié)直腸癌的患者的組群(Jorissen等人,2009)。在Affymetrix Plus 2.0平臺(tái)上分析樣品概況。87個(gè)患者接受輔助化療，其具有隨訪無復(fù)發(fā)存活(RFS)。

方法

用分類為血管生成活性或血管生成無活性的63-基因特征標(biāo)識(shí)使用如實(shí)施例5中所定義的0.6604的閾值測試樣品。

使用Kaplan Meier曲線和Cox-比例風(fēng)險(xiǎn)存活分析評(píng)估63-基因特征標(biāo)識(shí)預(yù)測的臨床顯著性。將終點(diǎn)定義為無進(jìn)展存活，且Cox-比例風(fēng)險(xiǎn)模型包括針對(duì)所有可得臨床協(xié)變量(年齡；性別；分期和腫瘤位置)的調(diào)整。

結(jié)果

接受特征標(biāo)識(shí)得分>0.6604的159個(gè)患者被分類為血管生成活性的；且接受特征標(biāo)識(shí)得分≤0.6604的131個(gè)患者被分類為血管生成無活性的。

通過特征標(biāo)識(shí)預(yù)測的無進(jìn)展存活的Cox-比例風(fēng)險(xiǎn)建模(針對(duì)臨床協(xié)變量調(diào)整)揭示，與血管生成活性組中的患者相比，血管生成無活性組中的患者具有顯著改善的無進(jìn)展存活(表5：HR＝0.33[0.14-0.83])。Kaplan Meier曲線顯示于圖25中。

表5：使用87個(gè)輔助治療的患者的多變量存活分析

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