發(fā)明背景

1995年，Yamaguchi等人(J.Immunol.Meth.181(1995)259-267)報(bào)告了小鼠免疫球蛋白G的高特異性蛋白水解片段化的方法，該方法使用賴(lài)氨酰內(nèi)肽酶、梭菌蛋白酶、金屬內(nèi)肽酶和V8蛋白酶，由此在反應(yīng)條件下檢測(cè)的梭菌蛋白酶、賴(lài)氨酰內(nèi)肽酶、金屬內(nèi)肽酶和V8蛋白酶選擇性地不切割鉸鏈區(qū)的lgG1和lgG1-CM。

Matsuda等人(FEBS Lett.473(2000)349-357)報(bào)告了使用Lys-C制備Fc片段的方法，通過(guò)MS獲得Fc相關(guān)糖型的信息，用于確定免疫球蛋白G的Fc區(qū)中寡糖的配對(duì)。

Villanueva等人(J.Mass Spectrom.37(2002)974-984)報(bào)告了限制性蛋白質(zhì)水解方法，該方法基于使用結(jié)合基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)的非特異性外蛋白酶，以快速?gòu)膬啥?N-和C-端)繪制蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)要素。

在WO 2005/073732中報(bào)告了高分子量蛋白質(zhì)的分析方法，具體而言，報(bào)告了高分子量蛋白質(zhì)(包括抗體)的反相LC/MS分析方法。

WO 2006/047340涉及用柱使用還原/氧化試劑和離液劑分離多肽的制劑，并分離從所述接觸產(chǎn)生的再折疊活性蛋白質(zhì)?；钚缘鞍卓梢允歉叻肿恿康鞍踪|(zhì)，包括含有Fc結(jié)構(gòu)域的多肽或片段。

Kleemann等人(Anal.Chem.80(2008)2001-2009)報(bào)告了通過(guò)限制性蛋白質(zhì)水解并結(jié)合LC-MS，表征IgG1免疫球蛋白和肽-Fc融合蛋白。使用內(nèi)蛋白酶Lys-C的限制性蛋白質(zhì)水解導(dǎo)致主要切割該賴(lài)氨酸殘基的C-端。

發(fā)明概述

業(yè)已發(fā)現(xiàn)，對(duì)于(多特異性)抗體的多特異性抗體限制性蛋白質(zhì)水解中輕鏈錯(cuò)配的確定，必須在MS分析之前進(jìn)行，因?yàn)橥暾嗵禺愋钥贵w中輕鏈錯(cuò)配的確定被等壓質(zhì)量的干擾阻礙。

因此，如本文中報(bào)告的一個(gè)方面是使用蛋白質(zhì)水解酶的多特異性抗體的限制性消化對(duì)分析多特異性抗體輕鏈配對(duì)的用途。

如本文所報(bào)告的一個(gè)方面是使用蛋白質(zhì)水解酶的多特異性抗體的限制性消化對(duì)確定多特異性抗體中輕鏈錯(cuò)配的用途。

如本文所報(bào)告的一個(gè)方面是使用蛋白質(zhì)水解酶的重組哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)的多特異性抗體的限制性消化對(duì)選擇生產(chǎn)多特異性抗體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的用途。

在所有上述方面的一個(gè)實(shí)施方案中，分析/確定/選擇通過(guò)使用被消化抗體的質(zhì)譜結(jié)果。

如本文所報(bào)告的一個(gè)方面是用于確定多特異性抗體中輕鏈配對(duì)的方法，所述方法包括以下步驟：

a)將包含多特異性抗體的樣本與蛋白質(zhì)水解酶孵育限定的時(shí)間，

b)通過(guò)質(zhì)譜法鑒定由步驟a)的限制性蛋白水解消化獲得的片段的質(zhì)量，和

c)從步驟b)的結(jié)果確定多特異性抗體的輕鏈配對(duì)。

如本文所報(bào)告的一個(gè)方面是用于確定多特異性抗體的輕鏈錯(cuò)配的方法，所述方法包括以下步驟：

a)將包含多特異性抗體的樣本與蛋白質(zhì)水解酶孵育限定的時(shí)間，

b)通過(guò)質(zhì)譜法鑒定由步驟a)的限制性蛋白水解消化獲得的片段的質(zhì)量，和

c)從步驟b)的結(jié)果確定多特異性抗體的輕鏈配對(duì)，從而確定輕鏈錯(cuò)配。

如本文所報(bào)告的一個(gè)方面是用于選擇生產(chǎn)多特異性抗體的重組哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法，所述方法包括以下步驟：

a)將包含一組重組哺乳動(dòng)物細(xì)胞的一個(gè)重組哺乳動(dòng)物細(xì)胞克隆群生產(chǎn)的多特異性抗體的樣本單獨(dú)地與蛋白質(zhì)水解酶孵育限定的時(shí)間，所述一組重組哺乳動(dòng)物細(xì)胞的所有細(xì)胞生成相同的多特異性抗體，

b)通過(guò)質(zhì)譜法鑒定由步驟a)的限制性蛋白質(zhì)水解消化獲得的片段的質(zhì)量，和

c)從步驟b)的結(jié)果確定每個(gè)克隆細(xì)胞群的多特異性抗體的輕鏈錯(cuò)配的存在，和

d)基于步驟c)的結(jié)果選擇生產(chǎn)多特異性抗體的重組細(xì)胞。

在所有方面的一個(gè)實(shí)施方案，蛋白質(zhì)水解酶選自L(fǎng)ys-C、纖溶酶、Asp-N、Arg-C、Glu-C、Ides、胃蛋白酶和胰凝乳蛋白酶。

在一個(gè)實(shí)施方案中多特異性抗體是二價(jià)抗體。

在所有方面的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)水解酶是Lys-C或纖溶酶。

在一個(gè)實(shí)施方案中，多特異性抗體是三或四價(jià)抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，多特異性抗體是包含兩條輕鏈和兩條重鏈的全長(zhǎng)抗體，由此對(duì)重鏈C端直接或經(jīng)由肽接頭綴合一部分(moiety)，所述一部分彼此獨(dú)立地選自無(wú)部分、Fv片段、Fab片段、scFv片段和的scFab片段。

在抗體是四價(jià)抗體、其中結(jié)合位點(diǎn)還附著于重鏈C-端的情況下，可能需要兩種蛋白質(zhì)水解酶的雙酶切消化。

在一個(gè)實(shí)施方案中，多特異性抗體是三價(jià)或四價(jià)多特異性抗體，方法包括通過(guò)與兩種蛋白質(zhì)水解酶混合物孵育的雙消化。

在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)水解酶混合物是纖溶酶和Ides。在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)水解酶混合物是Lys-C和Ides。

在效應(yīng)子沉默的抗體(L234A，L235A突變)的情況下，Ides不切割，必須選擇胃蛋白酶。

在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)水解酶混合物是纖溶酶和胃蛋白酶。在一個(gè)實(shí)施方案中蛋白質(zhì)水解酶混合物是Lys-C和胃蛋白酶。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，多價(jià)抗體是雙特異性抗體。

在所有方面的一個(gè)實(shí)施方案中，孵育持續(xù)至多60分鐘。在所有方面的一個(gè)實(shí)施方案中，孵育持續(xù)20至60分鐘。在所有方面的一個(gè)實(shí)施方案中，孵育持續(xù)35至45分鐘。

在所有方面的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，孵育持續(xù)約40分鐘。

在所有方面的一個(gè)實(shí)施方案，與蛋白質(zhì)水解酶孵育的多特異性抗體是去糖基化的多特異性抗體。

在所有方面的一個(gè)實(shí)施方案中，抗體與酶的重量比為1：150至1：500。在所有方面的一個(gè)實(shí)施方案中，抗體與酶的重量比為1：200至1：400。在所有方面的一個(gè)實(shí)施方案中，抗體與酶的重量比為約1：200。

在所有方面的一個(gè)實(shí)施方案中，與蛋白質(zhì)水解酶孵育的多特異性抗體具有從200至600μg/mL的濃度。

在所有方面的一個(gè)實(shí)施方案中，步驟b)是

b)脫鹽步驟a)的孵育混合物，并通過(guò)質(zhì)譜法鑒定由步驟a)的限制性蛋白質(zhì)水解消化獲得的片段的質(zhì)量。

在所有方面的一個(gè)實(shí)施方案中，多特異性抗體是單克隆多特異性抗體。

在所有方面的一個(gè)實(shí)施方案中，多特異性抗體包含至少兩個(gè)非肽相連的輕鏈。

在所有方面的一個(gè)實(shí)施方案中，多特異性抗體包含至少三個(gè)非肽相連的多肽。

在所有方面的一個(gè)實(shí)施方案中，質(zhì)譜法是在線(xiàn)測(cè)定。

在所有方面的一個(gè)實(shí)施方案中，質(zhì)譜是脫線(xiàn)測(cè)定。在一個(gè)實(shí)施方案中，脫線(xiàn)質(zhì)譜法在脫鹽步驟之后。

發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明

定義

如本文和所附權(quán)利要求書(shū)中所使用的，單數(shù)形式“一個(gè)(a)”，“一個(gè)(an)”，和“該(the)”包括復(fù)數(shù)指代，除非上下文另有明確說(shuō)明。因此，例如，提及“一個(gè)(a)細(xì)胞”包括多個(gè)這樣的細(xì)胞以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其等同物，等等。同樣，術(shù)語(yǔ)“一(a)”(或“一(an)”)，“一個(gè)或多個(gè)”和“至少一個(gè)”可以在本文中互換使用。與此相反，提及“一個(gè)(one)細(xì)胞”不包括多個(gè)這樣的細(xì)胞，而是限于單個(gè)(分離的)細(xì)胞。

還應(yīng)當(dāng)注意的是，術(shù)語(yǔ)“包含”，“包括”和“具有”可以互換使用。

進(jìn)一步還應(yīng)當(dāng)注意的是，術(shù)語(yǔ)“包含”涵蓋了作為限制的術(shù)語(yǔ)“由...組成”。

術(shù)語(yǔ)“抗體”在本文中用于最廣泛的意義，包含各種抗體結(jié)構(gòu)，包括但不限于單克隆抗體、多克隆抗體、多特異性抗體(例如，至少雙特異性抗體)，只要這些抗體結(jié)構(gòu)是多特異性的并包括至少兩個(gè)非肽結(jié)合的輕鏈。

術(shù)語(yǔ)“非肽結(jié)合”表示兩個(gè)多肽不是通過(guò)肽鍵(氨基酸的氨基和羧基基團(tuán)之間形成的)彼此相連。但是這些多肽可以通過(guò)其他共價(jià)鍵(如二硫鍵)或非共價(jià)地相連。

術(shù)語(yǔ)“嵌合”抗體指這樣的抗體，其中重鏈和/或輕鏈的一部分來(lái)自特定的來(lái)源或物種，而重鏈和/或輕鏈的其余部分來(lái)自不同的來(lái)源或物種。

抗體的“種類(lèi)”指的是其重鏈具有的恒定結(jié)構(gòu)域或恒定區(qū)的類(lèi)型。有五大類(lèi)抗體：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，其中有些可進(jìn)一步分為亞類(lèi)(同種型)，例如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA2。對(duì)應(yīng)于免疫球蛋白不同種類(lèi)的重鏈恒定結(jié)構(gòu)域分別被稱(chēng)為α，δ，ε，γ和μ。

本文的術(shù)語(yǔ)“Fc區(qū)”用于定義至少包含恒定區(qū)一部分的免疫球蛋白重鏈的C-端區(qū)域。該術(shù)語(yǔ)包括天然序列Fc區(qū)和變體Fc區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，人IgG重鏈Fc區(qū)從Cys226或從Pro230延伸至重鏈的羧基端。然而，F(xiàn)c區(qū)的C-端賴(lài)氨酸(Lys447)可以存在或可以不存在。除非本文另有規(guī)定，F(xiàn)c區(qū)或恒定區(qū)中氨基酸殘基的編號(hào)依照EU編號(hào)系統(tǒng)，也被稱(chēng)為EU索引，如Kabat,E.A.等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991),NIH Publication 91-3242中描述的。

術(shù)語(yǔ)“全長(zhǎng)抗體”，“完整抗體”和“整個(gè)抗體”在本文中可互換使用，指具有與天然抗體結(jié)構(gòu)基本上相似的結(jié)構(gòu)的抗體或者具有包含如本文所定義的Fc區(qū)的重鏈的抗體。

術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”，“宿主細(xì)胞系”和“宿主細(xì)胞培養(yǎng)物”可互換使用，是指其中已引入外源核酸的細(xì)胞，包括這樣的細(xì)胞的后代。宿主細(xì)胞包括“轉(zhuǎn)化體”和“轉(zhuǎn)化的細(xì)胞”，其包括初次轉(zhuǎn)化的細(xì)胞和來(lái)自其的后代，不考慮傳代數(shù)目。后代可能在核酸含量上與親代細(xì)胞不完全一致，但也可以含有突變。具有與在最初轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中篩選或選擇的功能或生物學(xué)活性相同的功能或生物學(xué)活性的突變體后代包括在本文中。

“人抗體”是指具有如下氨基酸序列的抗體，所述氨基酸序列對(duì)應(yīng)于人或人細(xì)胞、或來(lái)自利用人抗體譜或其他人抗體編碼序列的非人來(lái)源生產(chǎn)的抗體的氨基酸序列。人抗體的這種定義特定地排除包含非人抗原結(jié)合殘基的人源化抗體。

“人源化”抗體是指包含來(lái)自非人HVR氨基酸殘基和來(lái)自人FR氨基酸殘基的嵌合抗體。在某些實(shí)施方案中，人源化抗體將基本上包含至少一個(gè)，通常兩個(gè)可變結(jié)構(gòu)域的全部，其中HVR(例如CDR)的全部或基本上全部對(duì)應(yīng)于非人類(lèi)抗體的那些，和全部或基本上全部對(duì)應(yīng)于人抗體的FR的FR。人源化抗體任選地可以包含來(lái)自人抗體的抗體恒定區(qū)的至少一部分。抗體(例如，非人抗體)的“人源化形式”，是指已經(jīng)歷人源化的抗體。

“分離的”抗體是已經(jīng)從其天然環(huán)境成分中分離的抗體。在一些實(shí)施方案中，抗體被純化至純度大于95％或99％的純度，如，例如，通過(guò)電泳(例如，SDS-PAGE，等電聚焦(IEF)，毛細(xì)管電泳)或色譜(例如，離子交換或反向相HPLC)確定的。對(duì)于抗體純度評(píng)估方法的綜述，見(jiàn)，例如，F(xiàn)latman,S.等人,J.Chromatogr.B 848(2007)79-87。

“分離的”核酸是指已從其天然環(huán)境成分中分離的核酸分子。分離的核酸包括通常含有核酸分子的細(xì)胞中含有的核酸分子，但是所述核酸分子存在于染色體外或在與其天然染色體位置不同的染色體位置。

如本文所用的術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”指從一群基本上同質(zhì)的抗體獲得的抗體，即，包含抗體的群的個(gè)體是相同的和/或結(jié)合相同的表位，除了可能的變體抗體外，所述變體抗體例如，包含天然存在的突變或在生產(chǎn)單克隆抗體制劑過(guò)程中產(chǎn)生，此類(lèi)變體一般少量存在。與典型地包括針對(duì)不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制劑相反，單克隆抗體制劑的各單克隆抗體針對(duì)抗原上的單一決定簇。因此，修飾語(yǔ)“單克隆”表示從基本上同質(zhì)的抗體群獲得的抗體的特征，而不應(yīng)被解釋為需要通過(guò)任何特定的方法生產(chǎn)抗體。例如，根據(jù)本發(fā)明使用的單克隆抗體可通過(guò)多種技術(shù)制備，包括但不限于雜交瘤方法、重組DNA方法、噬菌體展示方法和利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法，這樣的方法和用于制備單克隆抗體的其他示例性方法在本文中描述。

術(shù)語(yǔ)“可變區(qū)”或“可變結(jié)構(gòu)域”指的是參與抗體結(jié)合抗原的抗體重鏈或輕鏈的結(jié)構(gòu)域。天然抗體的重鏈和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域(分別為VH和VL)通常具有類(lèi)似的結(jié)構(gòu)，其中每個(gè)結(jié)構(gòu)域包含四個(gè)保守的框架區(qū)(FR)和三個(gè)高變區(qū)(HVR)。(參見(jiàn)，例如，Kindt,T.J.等人，Kuby Immunology,第6版,W.H.Freeman and Co.,N.Y.(2007)，第91頁(yè))。單一的VH或VL結(jié)構(gòu)域可足以賦予抗原結(jié)合特異性。此外，使用來(lái)自抗體的結(jié)合抗原的VH或VL結(jié)構(gòu)域分別篩選互補(bǔ)的VL或VH結(jié)構(gòu)域文庫(kù)，可以分離結(jié)合特定抗原的抗體。見(jiàn)，例如，Portolano,S.等人,J.Immunol.150(1993)880-887；Clackson,T.等人,Nature 352(1991)624-628)。

如本文所用的術(shù)語(yǔ)“載體”，是指能夠傳播其連接的另一核酸的核酸分子。該術(shù)語(yǔ)包括作為自我復(fù)制的核酸結(jié)構(gòu)的載體，以及整合到其已被導(dǎo)入的宿主細(xì)胞基因組中的載體。某些載體能夠指導(dǎo)其有效連接的核酸的表達(dá)。此類(lèi)載體在本文中稱(chēng)為“表達(dá)載體”。

發(fā)明詳述

本文報(bào)告了基于限制性蛋白質(zhì)水解消化和ESI-MS分析確定多特異性抗體制劑中輕鏈錯(cuò)配的方法。該方法可以被用于質(zhì)量控制或細(xì)胞系選擇。

業(yè)已發(fā)現(xiàn)，對(duì)于(多特異性)抗體的多特異性抗體限制性蛋白質(zhì)水解中輕鏈錯(cuò)配的確定，必須在MS分析之前進(jìn)行，因?yàn)橥暾嗵禺愋钥贵w中輕鏈錯(cuò)配的確定被等壓質(zhì)量干擾(isobaric mass interference)阻礙。

因此，如本文中報(bào)告的一個(gè)方面是使用多特異性抗體的蛋白質(zhì)水解酶的限制性消化分析多特異性抗體的輕鏈配對(duì)的用途。

在二價(jià)多特異性抗體中，即在二價(jià)雙特異性抗體中，一個(gè)輕鏈錯(cuò)配的產(chǎn)品是可能的(參見(jiàn)圖1)。

在本文報(bào)告的方法的一個(gè)示例性實(shí)施方案中，二價(jià)雙特異性抗體的兩個(gè)樣本已經(jīng)被纖溶酶(EC 3.4.21.7)消化。消化后在所有樣本中沒(méi)有出現(xiàn)未切割的完整抗體。在樣本1中可檢測(cè)到約20％的輕鏈錯(cuò)配抗體(見(jiàn)圖3)，而在第二樣本中沒(méi)有檢測(cè)到輕鏈錯(cuò)配抗體(見(jiàn)圖4)。

在如本文報(bào)告的方法的一個(gè)示例性實(shí)施方案中，二價(jià)雙特異性抗體的樣本已被Lys-C限制性消化。在樣本中可檢測(cè)到輕鏈錯(cuò)配抗體(見(jiàn)圖5)。

如果多于2條輕鏈存在時(shí)，例如在三價(jià)或四價(jià)多特異性抗體中，多于一條輕鏈的錯(cuò)配產(chǎn)品是可能的(參見(jiàn)圖2)。在完整抗體的質(zhì)譜分析中，只可能確定輕鏈錯(cuò)配產(chǎn)品的存在，但不是化學(xué)計(jì)量的，并且不能檢測(cè)到潛在的錯(cuò)配方向(參見(jiàn)圖6)。

對(duì)于這一任務(wù)，可以選擇不同的蛋白質(zhì)水解酶：

-Ides：在鉸鏈區(qū)下方切割(不能用于具有L234A，L235A突變的抗體)

-纖溶酶：在鉸鏈區(qū)上方切割

-胃蛋白酶：在鉸鏈區(qū)下方切割；導(dǎo)致降解的Fc區(qū)

-Lys-C：在鉸鏈區(qū)上方切割。

如本文報(bào)告的方法的一個(gè)示例性實(shí)施方案中，四價(jià)雙特異性抗體的樣本已被Lys-C限制性消化。

已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，對(duì)于四價(jià)多特異性抗體，來(lái)自輕鏈1和重鏈1片段形成的Fab區(qū)中的錯(cuò)配可以在0的ISCID得到更好地檢測(cè)，而包含第二輕鏈的Fc區(qū)片段可以在90的ISCID得到更好地檢測(cè)。

為了去除Fc區(qū)，可以使用蛋白A親和色譜法以在酶消化后從Fc區(qū)分離Fab片段。Fab片段在蛋白A親和色譜法的流動(dòng)液(flow-through)中。

嵌合和人源化抗體

在某些實(shí)施方案中，用本文中報(bào)告的方法分析的抗體為嵌合抗體。某些嵌合抗體描述于，例如，US 4,816,567；和Morrison,S.L.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81(1984)6851-6855)。在一個(gè)實(shí)施例中，嵌合抗體包括非人可變區(qū)(例如，來(lái)自小鼠，大鼠，倉(cāng)鼠，兔子，或非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物，如猴的可變區(qū))和人恒定區(qū)。在進(jìn)一步的實(shí)施例中，嵌合抗體是“種類(lèi)轉(zhuǎn)換”的抗體，其中種類(lèi)或亞類(lèi)已從親代抗體改變。嵌合抗體包括其抗原結(jié)合片段。

在某些實(shí)施方案中，嵌合抗體是人源化抗體。通常情況下，非人抗體被人源化以降低對(duì)人的免疫原性，而保留親代非人抗體的特異性和親合性。通常，人源化抗體包含一個(gè)或多個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，其中HVR，例如，CDR(或其部分)來(lái)自非人抗體和FR(或其部分)來(lái)自人抗體序列。人源化抗體任選還將包含人恒定區(qū)的至少一部分。在一些實(shí)施方案中，人源化抗體中的一些FR殘基被來(lái)自非人抗體(例如，HVR殘基來(lái)源的抗體)的相應(yīng)殘基取代，例如，以恢復(fù)或改善抗體特異性或親合性。

人源化抗體和制備其的方法的綜述，例如，在Almagro,J.C.和Fransson,J.,Front.Biosci.13(2008)1619-1633中,還描述在,例如Riechmann,I.等人,Nature 332(1988)323-329；Queen,C.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)10029-10033；US 5,821,337,US 7,527,791,US 6,982,321,和US 7,087,409；Kashmiri,S.V.等人,Methods 36(2005)25-34(描述了特異性決定區(qū)(SDR)接枝)；Padlan,E.A.,Mol.Immunol.28(1991)489-498(描述了“表面重修(resurfacing)”)；Dall’Acqua,W.F.等人,Methods 36(2005)43-60(描述了“FR改組(shuffling)”)；和Osbourn,J.等人,Methods 36(2005)61-68和Klimka,A.等人,Br.J.Cancer 83(2000)252-260(描述了對(duì)FR改組的“指導(dǎo)選擇”方法)。

可用于人源化的人框架區(qū)包括但不限于：使用“最佳擬合”方法選擇的框架區(qū)(見(jiàn)，例如，Sims,M.J.等人,J.Immunol.151(1993)2296-2308；來(lái)自輕鏈或重鏈可變區(qū)特定亞組的人抗體的共有序列的框架區(qū)(見(jiàn)，例如，Carter,P.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992)4285-4289；和Presta,L.G.等人,J.Immunol.151(1993)2623-2632)；人成熟(體細(xì)胞突變的)框架區(qū)或人種系框架區(qū)(見(jiàn)，例如，Almagro,J.C.和Fransson,J.,Front.Biosci.13(2008)1619-1633)；和來(lái)自篩選的FR文庫(kù)的框架區(qū)(參見(jiàn)，例如Baca,M.等人,J.Biol.Chem.272(1997)10678-10684和Rosok,M.J.等人,J.Biol.Chem.271(19969 22611-22618)。

人抗體

在某些實(shí)施方案中，如本文所報(bào)告的方法中分析的抗體是人抗體?？梢允褂帽绢I(lǐng)域中已知的各種技術(shù)來(lái)生產(chǎn)人抗體。人抗體一般性地描述在van Dijk,M.A.和van de Winkel,J.G.,Curr.Opin.Pharmacol.5(2001)368-374和Lonberg,N.,Curr.Opin.Immunol.20(2008)450-459中。

可以通過(guò)向轉(zhuǎn)基因動(dòng)物施用免疫原來(lái)制備人抗體，所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物已被修飾以響應(yīng)抗原挑戰(zhàn)產(chǎn)生完整的人抗體或具有人可變區(qū)的完整的抗體。這些動(dòng)物通常包含人免疫球蛋白基因座的全部或一部分，其取代內(nèi)源性免疫球蛋白基因座，或存在于染色體外或隨機(jī)地整合到動(dòng)物的染色體。在這樣的轉(zhuǎn)基因小鼠中，內(nèi)源性免疫球蛋白基因座已普遍被失活。用于從轉(zhuǎn)基因動(dòng)物獲得人抗體的方法綜述，參見(jiàn)Lonberg,N.,Nat.Biotech.23(2005)1117-1125。還參見(jiàn)，例如US 6,075,181和US 6,150,584，描述了XENOMOUSE^TM技術(shù)；US 5,770,429描述了技術(shù)；US 7,041,870描述了K-M技術(shù),和US 2007/0061900描述了技術(shù))。由這樣的動(dòng)物生成的完整抗體的人可變區(qū)可以被進(jìn)一步修飾，例如，通過(guò)與不同人恒定區(qū)組合。

還可以通過(guò)基于雜交瘤的方法制備人抗體。已經(jīng)描述了人骨髓瘤和小鼠-人雜合骨髓瘤細(xì)胞系用于生產(chǎn)人單克隆抗體(參見(jiàn)，例如，Kozbor,D.,J.Immunol.133(1984)3001-3005；Brodeur,B.R.等人,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,Marcel Dekker,Inc.,New York(1987),第51-63頁(yè)；和Boerner,P.等人,J.Immunol.147(1991)86-95)還在Li,J.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103(2006)3557-3562中描述了通過(guò)人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)生成人抗體。其他方法包括描述于例如US 7，189，826(描述了由雜交瘤細(xì)胞系生產(chǎn)單克隆人IgM抗體)和Ni,J.,Xiandai Mianyixue 26(2006)265-268(描述了人-人雜交瘤)中的那些。人雜交瘤技術(shù)(Trioma技術(shù))也描述于Vollmers,H.P.和Brandlein,S.,Histology和Histopathology 20(2005)927-937以及Vollmers,H.P.和Brandlein,S.,Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27(2005)185-191中。

還可以通過(guò)分離選自人源噬菌體展示文庫(kù)的Fv克隆可變結(jié)構(gòu)域序列來(lái)生成人抗體。這種可變結(jié)構(gòu)域序列然后可以與所希望的人恒定結(jié)構(gòu)域組合。用于從抗體文庫(kù)選擇人抗體的技術(shù)如下所述。

文庫(kù)來(lái)源的抗體

可以通過(guò)篩選組合文庫(kù)中具有所期望的一種或多種活性的抗體來(lái)分離如本文報(bào)告的方法中分析的抗體。例如，用于生成噬菌體展示文庫(kù)和篩選這些文庫(kù)中具有所期望的結(jié)合特征的抗體的各種方法是本領(lǐng)域中已知的。對(duì)這樣的方法進(jìn)行了綜述，例如，在Hoogenboom,H.R.等人,Methods in Molecular Biology 178(2001)1-37中，進(jìn)一步描述在例如McCafferty,J.等人,Nature 348(1990)552-554；Clackson,T.等人,Nature 352(1991)624-628；Marks,J.D.等人,J.Mol.Biol.222(1992)581-597；Marks,J.D.和Bradbury,A.,Methods in Molecular Biology 248(2003)161-175；Sidhu,S.S.等人,J.Mol.Biol.338(2004)299-310；Lee,C.V.等人,J.Mol.Biol.340(2004)1073-1093；Fellouse,F.A.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(2004)12467-12472；和Lee,C.V.等人,J.Immunol.Methods 284(2004)119-132中。

在某些噬菌體展示方法中，VH和VL基因組庫(kù)(repertoire)分別通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)克隆，并在噬菌體文庫(kù)中隨機(jī)重組，然后可以如Winter,G.等人,Ann.Rev.Immunol.12(1994)433-455中描述的篩選其抗原結(jié)合的噬菌體。噬菌體通常展示抗體片段，或是作為單鏈Fv(scFv)片段或作為Fab片段。來(lái)自被免疫來(lái)源的文庫(kù)提供對(duì)免疫原高親合性的抗體，而無(wú)需構(gòu)建雜交瘤。可選擇地，可以(例如，從人)克隆天然組庫(kù)以提供針對(duì)廣泛的非自身抗原還有自身抗原的抗體單一來(lái)源，而沒(méi)有任何免疫，如Griffiths,A.D.等人,EMBO J.12(1993)725-734所述。最后，還可以通過(guò)從干細(xì)胞克隆未重排的V基因區(qū)段、和使用包含編碼高度可變CDR3區(qū)并在體外實(shí)現(xiàn)重排的隨機(jī)序列的PCR引物來(lái)合成地制備天然文庫(kù)，如Hoogenboom,H.R.和Winter,G.,J.Mol.Biol.227(1992)381-388所述。描述人抗體噬菌體文庫(kù)的專(zhuān)利出版物包括，例如：US 5,750,373和US 2005/0079574,US 2005/0119455,US 2005/0266000,US 2007/0117126,US 2007/0160598,US 2007/0237764,US 2007/0292936和US 2009/0002360。

從人抗體文庫(kù)分離的抗體或抗體片段在本文中被認(rèn)為是人抗體或人抗體片段。

多特異性抗體

工程化的蛋白質(zhì)，如能夠結(jié)合兩種或更多種抗原的雙特異性或多特異性抗體在本領(lǐng)域中是公知的。這樣的多特異性結(jié)合蛋白質(zhì)可以使用細(xì)胞融合、化學(xué)綴合、或重組DNA技術(shù)生成。

在某些實(shí)施方案中，如本文報(bào)告的方法中分析的抗體是多特異性抗體，例如至少是雙特異性抗體。多特異性抗體是對(duì)至少兩個(gè)不同位點(diǎn)具有結(jié)合特異性的單克隆抗體。多特異性抗體可以作為全長(zhǎng)抗體來(lái)制備。

用于制備多特異性抗體的技術(shù)包括但不限于具有不同特異性的兩個(gè)免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(duì)的重組共表達(dá)(見(jiàn)Milstein,C.和Cuello,A.C.,Nature 305(1983)537-540,WO 93/08829,和Traunecker,A.等人,EMBO J.10(1991)3655-3659),和“杵臼(knob-in-hole)”工程化(見(jiàn)，例如,US 5,731,168)。多特異性抗體還可以通過(guò)如下制備：用于制備抗體Fc-異二聚體分子的工程化靜電轉(zhuǎn)向效果(WO 2009/089004)；交聯(lián)兩個(gè)或更多個(gè)抗體或片段(參見(jiàn)，例如，US 4,676,980,和Brennan,M.等人,Science 229(1985)81-83)；使用亮氨酸拉鏈產(chǎn)生雙特異性抗體(見(jiàn)，例如，Kostelny,S.A.等人,J.Immunol.148(1992)1547-1553；使用“雙抗體(diabody)”技術(shù)制備雙特異性抗體片段(見(jiàn)，例如，Holliger,P.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)6444-6448)；和使用單鏈Fv(sFv)二聚體(見(jiàn)，例如Gruber,M等人,J.Immunol.152(1994)5368-5374)；和制備三特異性抗體，如，例如，Tutt,A.等人,J.Immunol.147(1991)60-69)中所述。

具有三個(gè)或更多個(gè)功能性抗原結(jié)合位點(diǎn)的工程化抗體，包括“章魚(yú)抗體”也包括在本文中(參見(jiàn)，例如US2006/0025576)。

本文中的抗體或片段還包括“雙作用Fab”或“DAF”，其包含結(jié)合[[PRO]]以及另一不同抗原的抗原結(jié)合位點(diǎn)(參見(jiàn)，例如US2008/0069820)。

本文中的抗體或片段還包括在以下所述的多特異性抗體：WO 2009/080251,WO 2009/080252,WO 2009/080253,WO 2009/080254,WO 2010/112193,WO 2010/115589,WO 2010/136172,WO 2010/145792和WO 2010/145793。

在過(guò)去的近段時(shí)間已經(jīng)開(kāi)發(fā)了各種各樣的重組多特異性抗體形式，例如通過(guò)融合例如IgG抗體形式和單鏈結(jié)構(gòu)域的四價(jià)雙特異性抗體(見(jiàn)例如Coloma,M.J.,等人,Nature Biotech.15(1997)159-163；WO 2001/077342；和Morrison,S.L.,Nature Biotech.25(2007)1233-1234。

還有已開(kāi)發(fā)了其他一些新的形式，其中抗體核心結(jié)構(gòu)(IgA，IgD，IgE，IgG或IgM)不再保留如dia-、tria-或tetrabodies、微型抗體、一些單鏈形式(scFv,Bis-scFv)，其都能夠結(jié)合兩種或更多種抗原，(Holliger,P.,等人,Nature Biotech.23(2005)1126-1136；Fischer,N.,和Léger,O.,Pathobiology 74(2007)3-14；Shen,J.,等人,J.Immunol.Methods 318(2007)65-74；Wu,C.,等人,Nature Biotech.25(2007)1290-1297)。

所有這樣的形式使用接頭融合抗體核心(IgA，IgD，IgE，IgG或IgM)和進(jìn)一步的結(jié)合蛋白(例如scFv)，或者使用接頭融合例如兩個(gè)Fab片段或scFv(Fischer,N.和Léger,O.,Pathobiology 74(2007)3-14)。雖然很明顯，接頭具有用于工程化多特異性抗體的優(yōu)點(diǎn)，其也可能會(huì)導(dǎo)致在治療設(shè)置上的問(wèn)題。事實(shí)上，這些外來(lái)肽可能引發(fā)針對(duì)接頭本身或蛋白和接頭之間連接處的免疫應(yīng)答。此外，這些肽的柔性性質(zhì)使得其更容易被蛋白水解裂解，潛在地導(dǎo)致抗體穩(wěn)定性差、聚集和增加的免疫原性。此外人們可能希望通過(guò)保持與天然存在的抗體的高度相似性保留通過(guò)Fc部分介導(dǎo)的效應(yīng)子功能，如，例如補(bǔ)體依賴(lài)性細(xì)胞毒性(CDC)或抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒性(ADCC)。

因此，理想情況下，應(yīng)著眼于開(kāi)發(fā)在總體結(jié)構(gòu)上與天然存在的抗體(如IGA，IgD，IgE，IgG或IgM)非常相似的多特異性抗體，與人序列具有最小的偏差。

在一種方法中，使用quadroma技術(shù)已經(jīng)生產(chǎn)了與天然抗體非常相似的雙特異性抗體(參見(jiàn)Milstein,C.和Cuello,A.C.,Nature 305(1983)537-540)，其基于表達(dá)具有期望的雙特異性抗體的特異性的鼠單克隆抗體的兩種不同雜交瘤細(xì)胞系的體細(xì)胞融合。由于在所得雜合雜交瘤(或quadroma)細(xì)胞系內(nèi)兩個(gè)不同的抗體重鏈和輕鏈的隨機(jī)配對(duì)，最多生成十種不同的抗體種類(lèi)，其中只有一種是期望的，功能性雙特異性抗體。由于存在錯(cuò)配的副產(chǎn)物以及顯著降低的生產(chǎn)產(chǎn)量，需要復(fù)雜的純化步驟(例如參見(jiàn)Morrison,S.L.,Nature Biotech.25(2007)1233-1234)。一般地如果使用重組表達(dá)技術(shù)，仍然保留了相同的錯(cuò)配副產(chǎn)物的問(wèn)題。

規(guī)避錯(cuò)配副產(chǎn)物問(wèn)題的方法，被稱(chēng)為“knobs-into-holes”，目的是通過(guò)將突變引入CH3結(jié)構(gòu)域修飾接觸界面，迫使兩個(gè)不同的抗體重鏈配對(duì)。在一條鏈上，體積龐大的氨基酸被具有短側(cè)鏈的氨基酸取代，形成“臼”。相反，具有大側(cè)鏈的氨基酸被引入到其他CH3結(jié)構(gòu)域，形成“杵”。通過(guò)共表達(dá)這兩條重鏈(和兩條相同的輕鏈，其必須適合于兩條重鏈)，觀(guān)察到高產(chǎn)率的異源二聚體形式(“杵-臼”)對(duì)(versus)同源二聚體形式(“臼-臼”或“杵-杵”)(Ridgway,J.B.,等人,Protein Eng.9(1996)617-621；和WO 96/027011)。通過(guò)使用噬菌體展示方法以及引入二硫鍵來(lái)穩(wěn)定異源二聚體、重塑兩個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域的相互作用表面，可進(jìn)一步增加異源二聚體的百分比(Merchant,A.M.,等人,Nature Biotech.16(1998)677-681；Atwell,S.,等人,J.Mol.Biol.270(1997)26–35)。對(duì)于knobs-into-holes技術(shù)的新方法描述在例如EP 1 870 459A1中。雖然這種形式似乎非常有吸引力，但是目前沒(méi)有可獲得的描述向臨床進(jìn)展的數(shù)據(jù)。這種策略的一個(gè)重要的限制是兩個(gè)親本抗體的輕鏈必須相同，以防止錯(cuò)配和形成無(wú)活性的分子。因此，該技術(shù)不適合作為從針對(duì)第一和第二抗原的兩種抗體起始容易地開(kāi)發(fā)重組的、針對(duì)三個(gè)或四個(gè)抗原的三或四特異性抗體的基礎(chǔ)，因?yàn)楸仨毷紫葍?yōu)化這些抗體的重鏈和/或相同的輕鏈，然后必須進(jìn)一步加入針對(duì)第三和第四抗原的抗原結(jié)合肽。

WO 2006/093794涉及異源二聚體蛋白結(jié)合組合物。WO99/37791描述了多用途抗體衍生物。Morrison,S.L.,等人,J.Immunol.160(1998)2802-2808涉及可變區(qū)結(jié)構(gòu)域交換對(duì)IgG功能性質(zhì)的影響。

WO 2013/02362涉及異源二聚體多肽。WO2013/12733涉及包含異源二聚體Fc區(qū)的多肽。WO2012/131555涉及工程化的異源二聚體免疫球蛋白。EP 2647707涉及工程化的異源二聚體免疫球蛋白。

WO 2013/026835涉及具有結(jié)構(gòu)域交叉的雙特異性、無(wú)Fc抗體。WO 2009/080251、WO 2009/080252、WO 2009/080253、WO 2009/080254和Schaefer,W.等人,PNAS,108(2011)11187-1191涉及具有結(jié)構(gòu)域交叉的二價(jià)、雙特異性IgG抗體。

在WO2009/080252(還見(jiàn)Schaefer,W.等人,PNAS,108(2011)11187-1191)中描述的為了防止輕鏈錯(cuò)配(CrossMabVH-VL)而在一個(gè)結(jié)合中具有VH/VL取代/交換的多特異性抗體，明顯地減少由針對(duì)第一抗原的輕鏈和針對(duì)第二抗原的錯(cuò)的重鏈錯(cuò)配引起的副產(chǎn)物(與沒(méi)有這樣的結(jié)構(gòu)域交換方法相比)。然而，其制劑不是完全沒(méi)有副產(chǎn)物。主要副產(chǎn)物基于Bence-Jones型相互作用(又見(jiàn)Schaefer,W.等人,PNAS,108(2011)11187-1191；在增補(bǔ)的圖S1I中)。

雙特異性抗體

在一個(gè)實(shí)施方案中多特異性抗體是雙特異性抗體。

如本文所報(bào)告的一個(gè)方面是二價(jià)、雙特異性抗體，其包含

a)特異性結(jié)合第一抗原的抗體的第一輕鏈和第一重鏈，和

b)特異性結(jié)合第二抗原的抗體的第二輕鏈和第二重鏈，其中第二輕鏈和第二重鏈的可變結(jié)構(gòu)域VL和VH相互取代，

其中第一和第二抗原是不同的抗原。

a)中的抗體不包含如b)所報(bào)告的修飾，a)中的重鏈和輕鏈?zhǔn)欠蛛x的鏈。

在b)的抗體中

在輕鏈內(nèi)

可變輕鏈結(jié)構(gòu)域VL被所述抗體的可變重鏈結(jié)構(gòu)域VH取代，

和

在重鏈內(nèi)

可變重鏈結(jié)構(gòu)域VH被所述抗體的可變輕鏈結(jié)構(gòu)域VL取代。

在一個(gè)實(shí)施方案中

i)在a)的第一輕鏈的恒定結(jié)構(gòu)域CL中，第124位氨基酸(根據(jù)Kabat編號(hào))被帶正電的氨基酸取代，和其中在a)的第一重鏈的恒定結(jié)構(gòu)域CH1中，第147位氨基酸或第213位氨基酸(根據(jù)Kabat EU索引編號(hào))被帶負(fù)電的氨基酸取代，

或者

ii)在b)的第二輕鏈的恒定結(jié)構(gòu)域CL中，第124位氨基酸(根據(jù)Kabat編號(hào))被帶正電的氨基酸取代，和其中在b)的第二重鏈的恒定結(jié)構(gòu)域CH1中，第147位氨基酸或第213位氨基酸(根據(jù)Kabat EU索引編號(hào))被帶負(fù)電的氨基酸取代。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中

i)在a)的第一輕鏈的恒定結(jié)構(gòu)域CL中，第124位氨基酸獨(dú)立地被賴(lài)氨酸(K)、精氨酸(R)或組氨酸(H)取代(根據(jù)Kabat編號(hào))(在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，獨(dú)立地被賴(lài)氨酸(K)或精氨酸(R)取代)，和其中在a)的第一重鏈的恒定結(jié)構(gòu)域CH1中，第147位氨基酸或第213位氨基酸獨(dú)立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代(根據(jù)Kabat EU索引編號(hào))，

或者

ii)在b)的第二輕鏈的恒定結(jié)構(gòu)域CL中，第124位氨基酸獨(dú)立地被賴(lài)氨酸(K)、精氨酸(R)或組氨酸(H)取代(根據(jù)Kabat編號(hào))(在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，獨(dú)立地被賴(lài)氨酸(K)或精氨酸(R)取代)，和其中在b)的第二重鏈的恒定結(jié)構(gòu)域CH1中，第147位氨基酸或第213位氨基酸獨(dú)立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代(根據(jù)Kabat EU索引編號(hào))。

在一個(gè)實(shí)施方案中，在第二重鏈的恒定結(jié)構(gòu)域CL中，第124位和123位氨基酸被K取代(根據(jù)Kabat EU索引編號(hào))。

在一個(gè)實(shí)施方案中，在第二輕鏈的恒定結(jié)構(gòu)域CH1中，第147位和213位氨基酸被E取代(根據(jù)Kabat EU索引編號(hào))。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在第一輕鏈的恒定結(jié)構(gòu)域CL中，第124位和123位的氨基酸被K取代，和在第一重鏈的恒定結(jié)構(gòu)域CH1中，第147位和213位的氨基酸被E取代(根據(jù)Kabat EU索引編號(hào))。

在一個(gè)實(shí)施方案中，在第二重鏈的恒定結(jié)構(gòu)域CL中，第124位和123位的氨基酸被K取代，和其中在第二輕鏈的恒定結(jié)構(gòu)域CH1中，第147位和213位氨基酸被E取代，和在第一輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域VL中，第38位的氨基酸被K取代，在第一重鏈的可變結(jié)構(gòu)域VH中，第39位的氨基酸被E取代，在第二重鏈的可變結(jié)構(gòu)域VL中，第38位的氨基酸被K取代，和在第二輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域VH中，第39位的氨基酸被E取代(根據(jù)Kabat EU索引編號(hào))。

如本文所報(bào)告的一個(gè)方面是二價(jià)、雙特異性抗體，其包含

a)特異性結(jié)合第一抗原的抗體的第一輕鏈和第一重鏈，和

b)特異性結(jié)合第二抗原的抗體的第二輕鏈和第二重鏈，其中第二輕鏈和第二重鏈的可變結(jié)構(gòu)域VL和VH相互取代，和其中第二輕鏈和第二重鏈的恒定結(jié)構(gòu)域CL和CH1相互取代，

其中第一和第二抗原是不同的抗原。

a)中的抗體不包含如b)所報(bào)告的修飾，a)中的重鏈和輕鏈?zhǔn)欠蛛x的鏈。

在b)的抗體中

在輕鏈內(nèi)

可變輕鏈結(jié)構(gòu)域VL被所述抗體的可變重鏈結(jié)構(gòu)域VH取代，恒定輕鏈結(jié)構(gòu)域CL被所述抗體的恒定重鏈結(jié)構(gòu)域CH1取代；

和

在重鏈內(nèi)

可變重鏈結(jié)構(gòu)域VH被所述抗體的可變輕鏈結(jié)構(gòu)域VL取代，恒定重鏈結(jié)構(gòu)域CH1被所述抗體的恒定輕鏈結(jié)構(gòu)域CL取代。

如本文所報(bào)告的一個(gè)方面是二價(jià)、雙特異性抗體，其包含

a)特異性結(jié)合第一抗原的抗體的第一輕鏈和第一重鏈，和

b)特異性結(jié)合第二抗原的抗體的第二輕鏈和第二重鏈，其中第二輕鏈和第二重鏈的恒定結(jié)構(gòu)域CL和CH1相互取代，

其中第一和第二抗原是不同的抗原。

a)中的抗體不包含如b)所報(bào)告的修飾，a)中的重鏈和輕鏈?zhǔn)欠蛛x的鏈。

在b)的抗體中

在輕鏈內(nèi)

恒定輕鏈結(jié)構(gòu)域CL被所述抗體的恒定重鏈結(jié)構(gòu)域CH1取代；

和

在重鏈內(nèi)

恒定重鏈結(jié)構(gòu)域CH1被所述抗體的恒定輕鏈結(jié)構(gòu)域CL取代。

如本文所報(bào)告的一個(gè)方面是一種多特異性抗體，其包含

a)特異性結(jié)合第一抗原的全長(zhǎng)抗體，其由兩條抗體重鏈和兩條抗體輕鏈組成，和

b)特異性結(jié)合一至四個(gè)其他抗原(即第二和/或第三和/或第四和/或第五抗原，優(yōu)選特異性結(jié)合一個(gè)其他抗原，即第二抗原)的一、二、三或四個(gè)單鏈Fab片段，

其中在b)中所述的單鏈Fab片段通過(guò)在所述全長(zhǎng)抗體的重鏈或輕鏈的C-或N-端的肽接頭融合至a)中的所述全長(zhǎng)抗體，

其中第一和第二抗原是不同抗原。

在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合第二抗原的一個(gè)或兩個(gè)相同的單鏈Fab片段通過(guò)在所述全長(zhǎng)抗體的重鏈或輕鏈的C-端的肽接頭融合至所述全長(zhǎng)抗體。

在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合第二抗原的一個(gè)或兩個(gè)相同的單鏈Fab片段通過(guò)在所述全長(zhǎng)抗體的重鏈的C-端的肽接頭融合至所述全長(zhǎng)抗體。

在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合第二抗原的一個(gè)或兩個(gè)相同的單鏈Fab片段通過(guò)在所述全長(zhǎng)抗體的輕鏈的C-端的肽接頭融合至所述全長(zhǎng)抗體。

在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合第二抗原的兩個(gè)相同的單鏈Fab片段通過(guò)在所述全長(zhǎng)抗體的每條重鏈或輕鏈的C-端的肽接頭融合至所述全長(zhǎng)抗體。

在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合第二抗原的兩個(gè)相同的單鏈Fab片段通過(guò)在所述全長(zhǎng)抗體的每條重鏈的C-端的肽接頭融合至所述全長(zhǎng)抗體。

在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合第二抗原的兩個(gè)相同的單鏈Fab片段通過(guò)在所述全長(zhǎng)抗體的每條輕鏈的C-端的肽接頭融合至所述全長(zhǎng)抗體。

如本文所報(bào)告的一個(gè)方面是三價(jià)、雙特異性抗體，其包含

a)特異性結(jié)合第一抗原的全長(zhǎng)抗體，其由兩條抗體重鏈和兩條抗體輕鏈組成，

b)第一多肽，其由以下組成

ba)抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)，

或者

bb)抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)和抗體恒定結(jié)構(gòu)域1(CH1)，

其中所述第一多肽通過(guò)所述全長(zhǎng)抗體的兩條重鏈之一的C-端的肽接頭與其VH結(jié)構(gòu)域的N-端融合，

c)第二多肽由以下組成

ca)抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)，

或者

cb)抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)和抗體輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域(CL)，

其中所述第二多肽通過(guò)所述全長(zhǎng)抗體的兩條重鏈的另一條的C-端的肽接頭與VL結(jié)構(gòu)域的N-端融合，

和

其中第一多肽的抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)和第二多肽的抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)一起形成特異性結(jié)合第二抗原的抗原結(jié)合位點(diǎn)，

和

其中第一和第二抗原是不同的抗原。

在一個(gè)實(shí)施方案中，b)中多肽的抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)和c)中多肽的抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)通過(guò)在以下位置之間引入二硫鍵的鏈間二硫鍵橋相連接和穩(wěn)定：

i)重鏈可變結(jié)構(gòu)域第44位至輕鏈可變結(jié)構(gòu)域第100位，或

ii)重鏈可變結(jié)構(gòu)域第105位至輕鏈可變結(jié)構(gòu)域第43位，或

iii)重鏈可變結(jié)構(gòu)域第101位至輕鏈可變結(jié)構(gòu)域第100位(通常根據(jù)Kabat EU索引編號(hào))。

引入非天然二硫鍵橋用于穩(wěn)定的技術(shù)描述在例如WO 94/029350,Rajagopal,V.,等人,Prot.Eng.(1997)1453-59；Kobayashi,H.,等人,Nuclear Medicine&Biology,Vol.25,(1998)387-393；或Schmidt,M.,等人,Oncogene(1999)181711-1721。在一個(gè)實(shí)施方案中b)和c)中多肽的可變結(jié)構(gòu)域之間的任選二硫鍵在重鏈可變結(jié)構(gòu)域第44位和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域第100位之間。在一個(gè)實(shí)施方案中b)和c)中多肽的可變結(jié)構(gòu)域之間的任選二硫鍵在重鏈可變結(jié)構(gòu)域第105位和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域第43位之間(通常根據(jù)Kabat EU索引編號(hào))。在一個(gè)實(shí)施方案中，優(yōu)選三價(jià)、雙特異性抗體在單鏈Fab片段的可變結(jié)構(gòu)域VH和VL之間無(wú)所述任選的二硫鍵穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。

如本文所報(bào)告的一個(gè)方面是一種三特異性或四特異性抗體，其包含

a)特異性結(jié)合第一抗原的全長(zhǎng)抗體的第一輕鏈和第一重鏈，和

b)特異性結(jié)合第二抗原的全長(zhǎng)抗體的第二(經(jīng)修飾)輕鏈和第二(經(jīng)修飾)重鏈，其中可變結(jié)構(gòu)域VL和VH相互取代，和/或其中恒定結(jié)構(gòu)域CL和CH1相互取代，和

c)其中特異性結(jié)合一個(gè)或兩個(gè)其他抗原(即第三和/或第四抗原)的一至四個(gè)抗原結(jié)合肽通過(guò)肽接頭融合至a)和/或b)的輕鏈或重鏈的C-或N-端，

其中第一和第二抗原是不同的抗原。

a)中的抗體不包含如b)中所報(bào)告的修飾，和a)中的重鏈和輕鏈?zhǔn)欠蛛x的鏈。

在一個(gè)實(shí)施方案中，三特異性或四特異性抗體包含c)中的一個(gè)或兩個(gè)特異性結(jié)合一個(gè)或兩個(gè)其他抗原的抗原結(jié)合肽。

在一個(gè)實(shí)施方案中，抗原結(jié)合肽選自scFv片段和scFab片段。

在一個(gè)實(shí)施方案中，抗原結(jié)合肽是scFv片段。

在一個(gè)實(shí)施方案中，抗原結(jié)合肽是scFab片段。

在一個(gè)實(shí)施方案中，抗原結(jié)合肽融合至a)和/或b)的重鏈的C-端。

在一個(gè)實(shí)施方案中，三特異性或四特異性抗體包含c)中的一個(gè)或兩個(gè)特異性結(jié)合一個(gè)其他抗原的抗原結(jié)合肽。

在一個(gè)實(shí)施方案中，三特異性或四特異性抗體包含c)中的特異性結(jié)合第三抗原的兩個(gè)相同的抗原結(jié)合肽。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，這樣的兩個(gè)相同的抗原結(jié)合肽都通過(guò)相同的肽接頭融合至a)和b)的重鏈的C-端。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，兩個(gè)相同的抗原結(jié)合肽是scFv片段或scFab片段。

在一個(gè)實(shí)施方案中，三特異性或四特異性抗體包含c)中的特異性結(jié)合第三和第四抗原的兩個(gè)抗原結(jié)合肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述兩個(gè)抗原結(jié)合肽都通過(guò)相同的肽連接子融合至a)和b)的重鏈的C-端。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述兩個(gè)抗原結(jié)合肽是scFv片段或scFab片段。

如本文所報(bào)告的一個(gè)方面是雙特異性、四價(jià)抗體，其包含

a)特異性結(jié)合第一抗原的抗體的兩條輕鏈和兩個(gè)重鏈(和包含兩個(gè)Fab片段)，

b)特異性結(jié)合第二抗原的抗體的兩個(gè)額外的Fab片段，其中所述額外的Fab片段都通過(guò)肽接頭融合至a)的重鏈的C-或N端，

和

其中，在Fab片段中進(jìn)行了以下的修飾

i)在a)的兩個(gè)Fab片段中，或在b)的兩個(gè)Fab片段中，可變結(jié)構(gòu)域VL和VH相互取代，和/或恒定結(jié)構(gòu)域CL和CH1相互取代，

或

ii)在a)的兩個(gè)Fab片段中可變結(jié)構(gòu)域VL和VH相互取代，和恒定結(jié)構(gòu)域CL和CH1相互取代，

和

在b)的兩個(gè)Fab片段中可變結(jié)構(gòu)域VL和VH相互取代，或恒定結(jié)構(gòu)域CL和CH1相互取代，

或

iii)在a)的兩個(gè)Fab片段中可變結(jié)構(gòu)域VL和VH相互取代，或恒定結(jié)構(gòu)域CL和CH1相互取代，

和

在b)的兩個(gè)Fab片段中可變結(jié)構(gòu)域VL和VH相互取代，和恒定結(jié)構(gòu)域CL和CH1相互取代，

或

ⅳ)在a)的兩個(gè)Fab片段中可變結(jié)構(gòu)域VL和VH相互取代，和在b)的兩個(gè)Fab片段中恒定結(jié)構(gòu)域CL和CH1相互取代，

或

v)在a)的兩個(gè)Fab片段中恒定結(jié)構(gòu)域CL和CH1相互取代，和在b)的兩個(gè)Fab片段中可變結(jié)構(gòu)域VL和VH相互取代，

其中第一和第二抗原是不同的抗原。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述額外的Fab片段都通過(guò)肽接頭融合至a)的重鏈的C-端，或融合至a)的重鏈的N-端。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述額外的Fab片段都通過(guò)肽接頭融合至a)的重鏈的C-端。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述額外的Fab片段都通過(guò)肽連接子融合至a)的重鏈的N-端。

在一個(gè)實(shí)施方案中，在Fab片段中進(jìn)行以下的修飾：

i)在a)的兩個(gè)Fab片段中，或b)的兩個(gè)Fab片段中，可變結(jié)構(gòu)域VL和VH相互取代，

和/或

恒定結(jié)構(gòu)域CL和CH1相互取代。

在一個(gè)實(shí)施方案中，在Fab片段中進(jìn)行以下的修飾：

i)在a)的兩個(gè)Fab片段中，可變結(jié)構(gòu)域VL和VH相互取代，

和/或

恒定結(jié)構(gòu)域CL和CH1相互取代。

在一個(gè)實(shí)施方案中，在Fab片段中進(jìn)行以下的修飾：

i)在a)的兩個(gè)Fab片段中恒定結(jié)構(gòu)域CL和CH1相互取代。

在一個(gè)實(shí)施方案中，在Fab片段中進(jìn)行以下的修飾：

i)在b)的兩個(gè)Fab片段中可變結(jié)構(gòu)域VL和VH相互取代，

和/或

恒定結(jié)構(gòu)域CL和CH1相互取代。

在一個(gè)實(shí)施方案中，在Fab片段中進(jìn)行以下的修飾：

i)在b)的兩個(gè)Fab片段中恒定結(jié)構(gòu)域CL和CH1相互取代。

如本文所報(bào)告的一個(gè)方面是一種雙特異性、四價(jià)抗體，其包含：

a)特異性結(jié)合第一抗原的第一抗體的(經(jīng)修飾)的重鏈，其包含第一VH-CH1結(jié)構(gòu)域?qū)?，其中所述第一抗體的第二VH-CH1結(jié)構(gòu)域?qū)Φ腘-端通過(guò)肽接頭融合至所述重鏈的C-端，

b)所述a)的第一抗體的兩條輕鏈，

c)特異性結(jié)合第二抗原的第二抗體的(經(jīng)修飾)的重鏈，其包含第一VH-CL結(jié)構(gòu)域?qū)?，其中所述第二抗體的第二VH-CH1結(jié)構(gòu)域?qū)Φ腘-端通過(guò)肽接頭融合至所述重鏈的C-端，和

d)所述c)的第二抗體的兩條(經(jīng)修飾)的輕鏈，每條包含CL-CH1結(jié)構(gòu)域?qū)Γ?/p>

其中第一和第二抗原是不同的抗原。

如本文所報(bào)告的一個(gè)方面是雙特異性抗體，其包含

a)特異性結(jié)合第一抗原的第一全長(zhǎng)抗體的重鏈和輕鏈，和

b)特異性結(jié)合第二抗原的第二全長(zhǎng)抗體的重鏈和輕鏈，其中重鏈的N-端通過(guò)肽接頭連接到輕鏈的C-端，

其中第一和第二抗原是不同的。

a)中的抗體不包含如b)報(bào)告的修改，和重鏈和輕鏈?zhǔn)欠蛛x的鏈。

如本文所報(bào)告的一個(gè)方面是雙特異性抗體，其包含

a)特異性結(jié)合第一抗原的全長(zhǎng)抗體，其由兩條抗體重鏈和兩條抗體輕鏈組成，和

b)特異性結(jié)合第二抗原的Fv片段，其包含VH²結(jié)構(gòu)域和VL²結(jié)構(gòu)域，其中兩個(gè)結(jié)構(gòu)域通過(guò)二硫鍵橋相互連接，

其中只有VH²結(jié)構(gòu)域或VL²結(jié)構(gòu)域通過(guò)肽接頭融合至特異性結(jié)合第一抗原的全長(zhǎng)抗體的重鏈或輕鏈，

其中第一和第二抗原是不同的抗原。

在雙特異性(抗體)中a)中的重鏈和輕鏈?zhǔn)欠蛛x的鏈。

在一個(gè)實(shí)施方案中,VH²結(jié)構(gòu)域或VL²結(jié)構(gòu)域的另一個(gè)不通過(guò)肽接頭融合至特異性結(jié)合第一抗原的全長(zhǎng)抗體的重鏈或輕鏈。

在如本文所報(bào)告的所有方面，第一輕鏈包含VL結(jié)構(gòu)域和CL結(jié)構(gòu)域，第一重鏈包含VH結(jié)構(gòu)域、CH1結(jié)構(gòu)域、鉸鏈區(qū)、CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域。

在所有方面的一個(gè)實(shí)施方案中，如本文報(bào)告的抗體是多特異性抗體，其需要至少兩條重鏈多肽的異源二聚化。

已經(jīng)描述了一些為支持異源二聚化的CH 3修飾的方法，例如在WO 96/27011,WO 98/050431,EP 1870459,WO 2007/110205,WO 2007/147901,WO 2009/089004,WO 2010/129304,WO 2011/90754,WO 2011/143545,WO 2012/058768,WO 2013/157954,WO 2013/096291中，其在此作為參考并入本文。通常，在本領(lǐng)域已知的方法中，第一重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域和第二重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域均以互補(bǔ)的方式工程化，使得含有一個(gè)工程化的CH3結(jié)構(gòu)域的重鏈不再與另一相同結(jié)構(gòu)的重鏈同源二聚化(例如CH3工程化的第一重鏈不再與另一CH3工程化的第一重鏈同源二聚化；和CH3工程化的第二重鏈不再與另一CH3工程化的第二重鏈同源二聚化)。從而包含一個(gè)工程化的CH3結(jié)構(gòu)域的重鏈被強(qiáng)制與另一包含以互補(bǔ)方式工程化的CH3結(jié)構(gòu)域的重鏈異源二聚化。對(duì)于本發(fā)明的這個(gè)實(shí)施方案，第一重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域和第二重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域通過(guò)氨基酸取代以互補(bǔ)方式工程化，使得第一重鏈和第二重鏈被強(qiáng)制異源二聚化，而第一重鏈和第二重鏈可以不再同源二聚化(例如由于位阻的原因)。

用于支持本領(lǐng)域中已知的重鏈異源二聚化的不同方法(以上引用和包括的)，預(yù)期為根據(jù)本發(fā)明的多特異性抗體中使用的不同替代，其包括源自特異性結(jié)合第一抗原的第一抗體的“非交叉Fab區(qū)”，和源自特異性結(jié)合第二抗原的第二抗體的“交叉Fab區(qū)”，組合上述的用于本發(fā)明的特定氨基酸取代。

如本文所報(bào)告的多特異性抗體的CH3結(jié)構(gòu)域可通過(guò)“杵臼”技術(shù)改變，該技術(shù)和一些實(shí)例詳細(xì)描述于例如WO 96/027011,Ridgway,J.B.,等人,Protein Eng.9(1996)617-621；和Merchant,A.M.,等人,Nat.Biotechnol.16(1998)677-681。在該方法中改變兩個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域的相互作用表面以增加含有這兩種CH3結(jié)構(gòu)域的兩條重鏈的異源二聚化。(兩條重鏈的)兩個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域的每個(gè)可以是“杵”，而另一個(gè)是“臼”。二硫鍵橋的引入進(jìn)一步穩(wěn)定異源二聚體(Merchant,A.M.,等人,Nature Biotech.16(1998)677-681；Atwell,S.,等人,J.Mol.Biol.270(1997)26-35)，以及增加了產(chǎn)量。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，如本文所報(bào)告的多特異性抗體包含在“杵鏈”的CH3結(jié)構(gòu)域中的T366W突變和在“臼鏈”的CH3結(jié)構(gòu)域中的T366S，L368A，Y407V突變(根據(jù)Kabat EU索引編號(hào))。也可使用CH3結(jié)構(gòu)域之間的額外的鏈間二硫鍵橋(Merchant,A.M.,等人,Nature Biotech.16(1998)677-681)，例如通過(guò)將Y349C突變引入“杵鏈”的CH3結(jié)構(gòu)域和將E356C突變或S354C突變引入“臼鏈”的CH3結(jié)構(gòu)域。因此，在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，如本文所報(bào)告的多特異性抗體包含在兩個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域之一中的Y349C和T366W突變和在兩個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域的另一個(gè)中的E356C,T366S,L368A和Y407V突變，或如本文所報(bào)告的多特異性抗體包含在兩個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域之一中的Y349C和T366W突變和在兩個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域的另一個(gè)中的S354C,T366S,L368A和Y407V突變(在一個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域中的額外Y349C突變和在另一個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域中的額外E356C或S354C突變形成鏈間二硫鍵橋)(根據(jù)Kabat EU索引編號(hào))。

但是還可以替代地或額外地使用由EP 1870459A1描述的其他杵-臼技術(shù)。在一個(gè)實(shí)施方案中如本文所報(bào)告的多特異性抗體包含在“杵鏈”的CH3結(jié)構(gòu)域中的R409D和K370E突變和在“臼鏈”的CH3結(jié)構(gòu)域中的D399K和E357K突變(根據(jù)Kabat EU索引編號(hào))。

在一個(gè)實(shí)施方案中如本文所報(bào)告的多特異性抗體包含在“杵鏈”的CH3結(jié)構(gòu)域中的T366W突變和在“臼鏈”的CH3結(jié)構(gòu)域中的T366S，L368A和Y407V突變，以及額外地在“杵鏈”的CH3結(jié)構(gòu)域中的R409D和K370E突變和在“臼鏈”的CH3結(jié)構(gòu)域中的D399K和E357K突變(根據(jù)Kabat EU索引編號(hào))。

在一個(gè)實(shí)施方案中，如本文所報(bào)告的多特異性抗體包含在兩個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域之一中的Y349C和T366W突變和在兩個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域的另一個(gè)中的S354C,T366S,L368A和Y407V突變，或如本文所報(bào)告的多特異性抗體包含在兩個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域之一中的Y349C和T366W突變和在兩個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域的另一個(gè)中的S354C,T366S,L368A和Y407V突變和額外地在“杵鏈”的CH3結(jié)構(gòu)域中的R409D和K370E突變和在“臼鏈”的CH3結(jié)構(gòu)域中的D399K和E357K突變(根據(jù)Kabat EU索引編號(hào))。

除了“杵-臼技術(shù)”，用于修飾多特異性抗體重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域以增強(qiáng)異源二聚化的其他技術(shù)在本領(lǐng)域中是公知的。這些技術(shù)，尤其是在WO 96/27011,WO 98/050431,EP 1870459,WO 2007/110205,WO 2007/147901,WO 2009/089004,WO 2010/129304,WO 2011/90754,WO 2011/143545,WO 2012/058768,WO 2013/157954和WO 2013/096291中描述的那些，在此預(yù)期為“杵-臼技術(shù)”的替代與如本文所報(bào)告的多特異性抗體組合。

在如本文所報(bào)告的多特異性抗體的一個(gè)實(shí)施方案中，在EP 1870459中描述的方法被用于支持多特異性抗體的第一重鏈和第二重鏈的異源二聚化。這種方法基于將具有相反電荷的帶電氨基酸引入第一和第二重鏈二者之間的CH3/CH3-結(jié)構(gòu)域界面中的特定氨基酸位置。

因此，本實(shí)施方案涉及如本文所報(bào)告的多特異性抗體，其中在抗體的三級(jí)結(jié)構(gòu)中第一重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域和第二重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域形成位于各抗體CH3結(jié)構(gòu)域之間的界面，其中第一重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域和第二重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域的各自的氨基酸序列包括在抗體的三級(jí)結(jié)構(gòu)中位于所述界面的一組氨基酸，其中從位于一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域的界面中的氨基酸組中，將第一氨基酸用帶正電的氨基酸取代，和從位于另一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域的界面中的氨基酸組中，將第二氨基酸用帶負(fù)電的氨基酸取代。根據(jù)本實(shí)施方案的多特異性抗體在本文也稱(chēng)為“CH3(+/-)-工程化的多特異性抗體”(其中縮寫(xiě)“+/-”表示在各CH3結(jié)構(gòu)域中引入的帶相反電荷的氨基酸)。

在如本文所報(bào)告的所述CH3(+/-)-工程化的多特異性抗體的一個(gè)實(shí)施方案中，帶正電的氨基酸選自K、R和H，帶負(fù)電的氨基酸選自E或D。

在如本文所報(bào)告的所述CH3(+/-)-工程化的多特異性抗體的一個(gè)實(shí)施方案中，帶正電的氨基酸選自K和R，帶負(fù)電的氨基酸選自E或D。

在如本文所報(bào)告的所述CH3(+/-)-工程化的多特異性抗體的一個(gè)實(shí)施方案中，帶正電的氨基酸是K，帶負(fù)電的氨基酸選自是E。

在如本文所報(bào)告的所述CH3(+/-)-工程化的多特異性抗體的一個(gè)實(shí)施方案中，在一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域中第409位的氨基酸R被D取代和第位的氨基酸K被E取代，在另一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域中第399位的氨基酸D被K取代和第357位的氨基酸E被K取代(根據(jù)Kabat EU索引編號(hào))。

在如本文所報(bào)告的多特異性抗體的一個(gè)實(shí)施方案中，使用WO2013/157953中描述的方法支持多特異性抗體的第一重鏈和第二重鏈的異源二聚化。在如本文所報(bào)告的所述多特異性抗體的一個(gè)實(shí)施方案中，在一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域中第366位的氨基酸T被K取代，在另一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域中第351位的氨基酸L被D取代(根據(jù)Kabat EU索引編號(hào))。在如本文報(bào)告的所述多特異性抗體的另一實(shí)施方案中，在一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域中第366位的氨基酸T被K取代，第351位的氨基酸L被K取代，在另一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域中第351位的氨基酸L被D取代(根據(jù)Kabat EU索引編號(hào))。

在如本文所報(bào)告的所述多特異性抗體的另一實(shí)施方案中，在一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域中第366位的氨基酸T被K取代和第351位的氨基酸L被K取代，在另一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域中第351位的氨基酸L被D取代(根據(jù)Kabat EU索引編號(hào))。另外以下取代中的至少一個(gè)包括在另一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域中：第349位氨基酸Y被E取代，第349位氨基酸Y被D取代和第368位氨基酸L被E取代(根據(jù)Kabat EU索引編號(hào))。在一個(gè)實(shí)施方案中，第368位氨基酸L被E取代(根據(jù)Kabat EU索引編號(hào))。

在如本文所報(bào)告的多特異性抗體的一個(gè)實(shí)施方案中，使用WO2012/058768中描述的方法支持多特異性抗體的第一重鏈和第二重鏈的異源二聚化。在如本文所報(bào)告的所述多特異性抗體的一個(gè)實(shí)施方案中，在一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域中第351位的氨基酸L被Y取代和第407位的氨基酸Y被A取代，在另一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域中第366位的氨基酸T被A取代和第409位的氨基酸K被F取代(根據(jù)Kabat EU索引編號(hào))。在另一個(gè)實(shí)施方案中，除了以上所述的取代，在一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域中至少一個(gè)以下位置的氨基酸被取代：第411位(原來(lái)為T(mén))、第399位(原來(lái)為D)、第400位(原來(lái)為S)、第405位(原來(lái)為F)、第390位(原來(lái)為N)和第392位(原來(lái)為K)(根據(jù)Kabat EU索引編號(hào))。優(yōu)選的取代為：

-由選自N，R，Q，K，D，E和W的氨基酸取代第411位的氨基酸T(根據(jù)Kabat EU索引編號(hào))，

-由選自R，W，Y和K的氨基酸取代第399位的氨基酸D(根據(jù)Kabat EU索引編號(hào))，

-由選自E，D，R和K的氨基酸取代第400位的氨基酸S(根據(jù)Kabat EU索引編號(hào))，

-由選自I，M，T，S，V和W的氨基酸取代第405位的氨基酸F(根據(jù)Kabat的EU索引編號(hào))；

-由選自R，K和D的氨基酸取代第390位的氨基酸N(根據(jù)Kabat EU索引編號(hào))；和

-由選自V，M，R，L，F(xiàn)和E的氨基酸取代第392位的氨基酸K(根據(jù)Kabat EU索引編號(hào))。

在如本文報(bào)告的所述多特異性抗體的另一個(gè)實(shí)施方案中(根據(jù)WO2012/058768工程化)，在一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域中第351位的氨基酸L被Y取代和第407位的氨基酸Y被A取代，在另一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域中第366位的氨基酸T被V取代和第409位的氨基酸K被F取代(根據(jù)Kabat EU索引編號(hào))。在如本文所報(bào)告的所述多特異性抗體的另一實(shí)施方案中，在一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域中第407位的氨基酸Y被A取代，在另一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域中第366位的氨基酸T被A取代和第409位的氨基酸K被F取代(根據(jù)Kabat EU索引編號(hào))。在所述的上述實(shí)施方案中，在所述另一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域中第392位的氨基酸K被E取代，第411位的氨基酸T被E取代，第399位的氨基酸D被R取代和第400位的氨基酸S被R取代(根據(jù)Kabat EU索引編號(hào))。

在如本文所報(bào)告的多特異性抗體的一個(gè)實(shí)施方案中，使用WO 2011/143545中描述的方法支持多特異性抗體的第一重鏈和第二重鏈的異源二聚化。在如本文所報(bào)告的所述多特異性抗體的一個(gè)實(shí)施方案中，在兩條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域中的氨基酸修飾在第368和/或409位引入(根據(jù)Kabat EU索引編號(hào))。

在如本文所報(bào)告的多特異性抗體的一個(gè)實(shí)施方案中，使用WO 2011/090762中描述的方法支持多特異性抗體的第一重鏈和第二重鏈的異源二聚化。WO 2011/090762涉及根據(jù)“杵臼”技術(shù)的氨基酸修飾。在如本文所報(bào)告的所述CH3(KiH)-工程化的多特異性抗體的一個(gè)實(shí)施方案中，在一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域中第366位的氨基酸T被W取代，在另一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域中第407位的氨基酸Y被A取代(根據(jù)Kabat EU索引編號(hào))。在如本文所報(bào)告的所述CH3(KiH)-工程化的多特異性抗體的另一個(gè)實(shí)施方案中，在一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域中第366位的氨基酸T被Y取代，在另一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域中第407位的氨基酸Y被T取代(根據(jù)Kabat EU索引編號(hào))。

在如本文所報(bào)告的多特異性抗體(其是IgG2同種型)的一個(gè)實(shí)施方案中，使用在WO 2011/090762中描述的方法支持多特異性抗體的第一重鏈和第二重鏈的異源二聚化。

在如本文所報(bào)告的多特異性抗體的一個(gè)實(shí)施方案中，使用WO 2009/089004中描述的方法支持多特異性抗體的第一重鏈和第二重鏈的異源二聚化。在如本文報(bào)告的所述多特異性抗體的一個(gè)實(shí)施方案中，在一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域中第392位的氨基酸K或N被帶負(fù)電的氨基酸取代(在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中被E或D取代，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中被D取代)，在另一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域中第399位的氨基酸D第356位的氨基酸E或D或第357位的氨基酸E被帶正電的氨基酸取代(在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中被K或R取代，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中被K取代，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中第399或356位的氨基酸被K取代)(根據(jù)Kabat EU索引編號(hào))。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，除了上述取代，在一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域中第409位的氨基酸K或R被帶負(fù)電的氨基酸取代(在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中被E或D取代，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中被D取代)(根據(jù)Kabat EU索引編號(hào))。在一個(gè)更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，除了或替代上述取代，在一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域中第439位的氨基酸K和/或第370位的氨基酸K彼此獨(dú)立地被帶負(fù)電的氨基酸取代(在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中被E或D取代，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中被D取代)(根據(jù)Kabat EU索引編號(hào))。

在如本文所報(bào)告的多特異性抗體的一個(gè)實(shí)施方案中，使用WO 2007/147901中描述的方法支持多特異性抗體的第一重鏈和第二重鏈的異源二聚化。在如本文報(bào)告的所述多特異性抗體的一個(gè)實(shí)施方案中，在一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域中第253位的氨基酸K被E取代、第282位的氨基酸D被K取代和第322位的氨基酸K被D取代，在另一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域中第239位的氨基酸D被K取代、第240位的氨基酸E被K取代和第292位的氨基酸K被D取代(根據(jù)Kabat EU索引編號(hào))。

在如本文所報(bào)告的多特異性抗體的一個(gè)實(shí)施方案中，使用WO 2007/110205中描述的方法支持多特異性抗體的第一重鏈和第二重鏈的異源二聚化。

在如本文所報(bào)告的所有方面和實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施方案中，多特異性抗體是雙特異性抗體或三特異性抗體。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，多特異性抗體是雙特異性抗體。

在如本文所報(bào)告的所有方面的一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體是二價(jià)或三價(jià)抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體是二價(jià)抗體。

在如本文所報(bào)告的所有方面的一個(gè)實(shí)施方案中，多特異性抗體具有IgG型抗體的恒定結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)。在如本文所報(bào)告的所有方面的另一實(shí)施方案中，多特異性抗體的特征在于，所述多特異性抗體是人亞類(lèi)IgG1，或者具有突變L234A和L235A的人亞類(lèi)IgG1。在如本文所報(bào)告的所有方面的另一實(shí)施方案中，多特異性抗體的特征在于，所述多特異性抗體是人亞類(lèi)IgG2。在如本文所報(bào)告的所有方面的另一實(shí)施方案中，多特異性抗體的特征在于，所述多特異性抗體是人亞類(lèi)IgG3。在如本文所報(bào)告的所有方面的另一實(shí)施方案中，多特異性抗體的特征在于，所述多特異性抗體是人亞類(lèi)IgG4，或具有額外的突變S228P的人亞類(lèi)IgG4。在如本文所報(bào)告的所有方面的另一實(shí)施方案中，多特異性抗體的特征在于，所述多特異性抗體是人亞類(lèi)IgG1或人亞類(lèi)IgG4。在如本文所報(bào)告的所有方面的另一實(shí)施方案中，多特異性抗體的特征在于，所述多特異性抗體是具有突變L234A和L235A的人亞類(lèi)IgG1(根據(jù)Kabat EU索引編號(hào))。在如本文所報(bào)告的所有方面的另一實(shí)施方案中，多特異性抗體的特征在于，所述多特異性抗體是具有突變L234A、L235A和P329G的人亞類(lèi)IgG1(根據(jù)Kabat EU索引編號(hào))。在如本文所報(bào)告的所有方面的另一實(shí)施方案中，多特異性抗體的特征在于，所述多特異性抗體是具有突變S228P和L235E的人亞類(lèi)IgG4(根據(jù)Kabat EU索引編號(hào))。在如本文所報(bào)告的所有方面的另一實(shí)施方案中，多特異性抗體的特征在于，所述多特異性抗體是具有突變S228P、L235E和P329G的人亞類(lèi)IgG4(根據(jù)Kabat EU索引編號(hào))。

在如本文所報(bào)告的的所有方面的一個(gè)實(shí)施方案中，如本文所特定的包含重鏈(包括CH3結(jié)構(gòu)域)的抗體，包含額外的C-端甘氨酸-賴(lài)氨酸二肽(G446和K447，根據(jù)Kabat EU索引編號(hào))。在如本文所報(bào)告的所有方面的一個(gè)實(shí)施方案中，如本文所特定的包含重鏈(包括CH3結(jié)構(gòu)域)的抗體，包含額外的C-端甘氨酸殘基(G446，根據(jù)Kabat EU索引編號(hào))。

在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體包含第一Fc區(qū)多肽和第二Fc區(qū)多肽，和

其中，

i)第一Fc區(qū)多肽是人IgG1Fc區(qū)多肽和第二Fc區(qū)多肽是人IgG1Fc區(qū)多肽，或

ii)第一Fc區(qū)多肽是具有突變L234A、L235A的人IgG1Fc區(qū)多肽和第二Fc區(qū)多肽是具有突變L234A、L235A的人IgG1Fc區(qū)多肽，或

iii)所述第一Fc區(qū)多肽是具有突變L234A、L235A、P329G的人IgG1Fc區(qū)多肽和第二Fc區(qū)多肽是具有突變L234A、L235A、P329G的人IgG1Fc區(qū)多肽，或

iv)所述第一Fc區(qū)多肽是具有突變L234A、L235A、S354C、T366W的人IgG1Fc區(qū)多肽和所述第二Fc區(qū)多肽是具有突變L234A、L235A、Y349C、T366S、L368A、Y407V的人IgG1Fc區(qū)多肽，或

v)所述第一Fc區(qū)多肽是具有突變L234A、L235A、P329G、S354C、T366W的人IgG1Fc區(qū)多肽和所述第二Fc區(qū)多肽是具有突變L234A、L235A、P329G、Y349C、T366S、L368A、Y407V的人IgG1Fc區(qū)多肽，或

vi)所述第一Fc區(qū)多肽是人IgG4Fc區(qū)多肽和所述第二Fc區(qū)多肽是人IgG4Fc區(qū)多肽，或

vii)所述第一Fc區(qū)多肽是具有突變S228P、L235E的人IgG4Fc區(qū)多肽和所述第二Fc區(qū)多肽是具有突變S228P、L235E的人IgG4Fc區(qū)多肽，或

viii)所述第一Fc區(qū)多肽是具有突變S228P、L235E、P329G的人IgG4Fc區(qū)多肽和所述第二Fc區(qū)多肽是具有突變S228P、L235E、P329G的人IgG4Fc區(qū)多肽，或

ix)所述第一Fc區(qū)多肽是具有突變S228P、L235E、S354C、T366W的人IgG4Fc區(qū)多肽和所述第二Fc區(qū)多肽是具有突變S228P、L235E、Y349C、T366S、L368A、Y407V的人IgG4Fc區(qū)多肽，或

x)所述第一Fc區(qū)多肽是具有突變S228P、L235E、P329G、S354C、T366W的人IgG4Fc區(qū)多肽和所述第二Fc區(qū)多肽是具有突變S228P、L235E、P329G、Y349C、T366S、L368A、Y407V的人IgG4Fc區(qū)多肽。

在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體包含第一Fc區(qū)多肽和第二Fc區(qū)多肽，和

其中所述抗體在第一Fc區(qū)多肽和在第二Fc區(qū)多肽中包含突變組合

i)I253A、H310A和H435A，或

ii)H310A、H433A和Y436A，或

iii)L251D、L314D和L432D，或

iv)i)至iii)的組合。

在如本文所報(bào)告的所有方面的一個(gè)實(shí)施方案中，如本文報(bào)告的抗體是效應(yīng)子沉默抗體。在如本文所報(bào)告的所有方面的一個(gè)實(shí)施方案中，抗體是效應(yīng)子沉默抗體并且其不結(jié)合人FcRn。在如本文所報(bào)告的所有方面的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，是人亞類(lèi)IgG1抗體，其在兩條重鏈上具有突變L234A、L235A、P329G、I253A、H310A和H434A(根據(jù)Kabat索引編號(hào))。

重組方法和組合物

可以使用例如，如在US 4,816,567中描述的重組方法和組合物來(lái)生產(chǎn)抗體。所需的核酸可編碼包含抗體VL的氨基酸序列和/或編碼包含抗體VH的氨基酸序列(例如，抗體的輕鏈和/或重鏈)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，提供包含此類(lèi)核酸的一種或多種載體(例如，表達(dá)載體)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，提供包含此類(lèi)核酸的宿主細(xì)胞。在一個(gè)這樣的實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞包含(例如，已經(jīng)被轉(zhuǎn)化有)：(1)包含核酸的載體，所述核酸編碼包含抗體VL的氨基酸序列和包含抗體VH的氨基酸序列，或(2)第一載體和第二載體，所述第一載體包含編碼包含抗體VL的氨基酸序列的核酸，和所述第二載體包含編碼包含抗體VH的氨基酸序列的核酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是真核的，例如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或淋巴樣細(xì)胞(例如，Y0、NS0、SP20細(xì)胞)。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供制備抗[[PRO]]抗體的方法，其中所述方法包括在適于抗體表達(dá)的條件下，培養(yǎng)如上提供的包含編碼抗體的核酸的宿主細(xì)胞，和任選地從宿主細(xì)胞(或宿主細(xì)胞培養(yǎng)基)回收抗體。

為了重組生產(chǎn)抗體，分離編碼抗體的核酸(例如，如上文所述的)，并插入一種或多種載體，用于在宿主細(xì)胞中進(jìn)一步克隆和/或表達(dá)?？梢允褂贸Ｒ?guī)方法容易地分離和測(cè)序這樣的核酸(例如通過(guò)使用能夠特異性結(jié)合編碼抗體重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)。

用于克隆或表達(dá)編碼抗體的載體的合適的宿主細(xì)胞包括本文所述的原核或真核細(xì)胞。例如，可以在細(xì)菌中生產(chǎn)抗體，尤其是不需要糖基化和Fc效應(yīng)子功能時(shí)。對(duì)于在細(xì)菌中表達(dá)抗體片段和多肽，參見(jiàn)例如，US 5,648,237、US 5,789,199和US 5,840,523。(還參見(jiàn)Charlton,K.A.,In:Methods in Molecular Biology,Vol.248,Lo,B.K.C.(編輯),Humana Press,Totowa,NJ(2003),pp.245-254,其描述了在大腸桿菌中表達(dá)抗體片段)。表達(dá)后，可以在可溶性級(jí)分中從細(xì)菌細(xì)胞糊中分離抗體，并可以進(jìn)一步純化。

除了原核生物，真核微生物如絲狀真菌或酵母也是編碼抗體的載體的合適的克隆或表達(dá)宿主，包括真菌和酵母菌株，其糖基化途徑已經(jīng)被“人源化”，導(dǎo)致生產(chǎn)具有部分或全部人糖基化模式的抗體。見(jiàn)Gerngross,T.U.,Nat.Biotech.22(2004)1409-1414；和Li,H.等人,Nat.Biotech.24(2006)210-215。

對(duì)于糖基化抗體的表達(dá)，合適的宿主細(xì)胞也可來(lái)源于多細(xì)胞生物體(無(wú)脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物)。無(wú)脊椎動(dòng)物細(xì)胞的例子包括植物和昆蟲(chóng)細(xì)胞。已經(jīng)鑒定了許多桿狀病毒株，其可以與昆蟲(chóng)細(xì)胞共同使用，特別是用于草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。

植物細(xì)胞培養(yǎng)物也可以用作宿主。參見(jiàn)，例如，US 5,959,177、US 6,040,498、US 6,420,548、US 7,125,978和US 6,417,429(描述了用于在轉(zhuǎn)基因植物中生產(chǎn)抗體的PLANTIBODIES^TM技術(shù)中)。

脊椎動(dòng)物細(xì)胞也可以用作宿主。例如，適于懸浮生長(zhǎng)的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞系可以是有用的。其他有用的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的例子是用SV40轉(zhuǎn)化的猴腎CV1系(COS-7)；人胚胎腎細(xì)胞系(例如，如Graham,F.L.等人,J.Gen Virol.36(1977)59-74中描述的293或293細(xì)胞)；幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞(BHK)；小鼠支持細(xì)胞(例如，如Mather,J.P.,Biol.Reprod.23(1980)243-252中描述的TM4細(xì)胞)；猴腎細(xì)胞(CV1)；非洲綠猴腎細(xì)胞(VERO-76)；人宮頸癌細(xì)胞(HeLa細(xì)胞)；犬腎細(xì)胞(MDCK；水牛大鼠肝細(xì)胞(BRL 3A)；人肺細(xì)胞(W138)；人肝細(xì)胞(Hep G2)；小鼠乳腺腫瘤(MMT 060562)；TRI細(xì)胞，例如，如Mather,J.P.等人,Annals N.Y.Acad.Sci.383(1982)44-68中所描述的；MRC 5細(xì)胞；和FS4細(xì)胞。其他有用的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞系包括中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞，包括DHFR-CHO細(xì)胞(Urlaub,G.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77(1980)4216-4220)；和骨髓瘤細(xì)胞系，如Y0、NS0和Sp2/0。對(duì)于適于抗體生產(chǎn)的某些哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞系的綜述，參見(jiàn)，例如，Yazaki,P.和Wu,A.M.,Methods in Molecular Biology,Vol.248,Lo,B.K.C.(編輯),Humana Press,Totowa,NJ(2004),pp.255-268。

具體實(shí)施方案

1.多特異性抗體的蛋白質(zhì)水解酶的限制性消化對(duì)分析多特異性抗體輕鏈配對(duì)的用途。

2.多特異性抗體的蛋白質(zhì)水解酶的限制性消化對(duì)確定多特異性抗體中輕鏈錯(cuò)配的用途。

3.重組哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)的多特異性抗體的蛋白質(zhì)水解酶的限制性消化對(duì)選擇生產(chǎn)多特異性抗體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的用途。

4.根據(jù)實(shí)施方方案1至3中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述蛋白質(zhì)水解酶選自L(fǎng)ys-C、Asp-N、Arg-C、Glu-C和胰凝乳蛋白酶。

5.根據(jù)實(shí)施方案4所述的用途，其中蛋白質(zhì)水解酶是Lys-C。

6.根據(jù)實(shí)施方案1至5中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述孵育持續(xù)35至45分鐘。

7.根據(jù)實(shí)施方案6所述的用途，其中所述孵育持續(xù)約40分鐘。

8.根據(jù)實(shí)施方案1至7中任一項(xiàng)所述的用途，其特征在于，與蛋白質(zhì)水解酶孵育的多特異性抗體是去糖基化的多特異性抗體。

9.根據(jù)實(shí)施方案1至8中任一項(xiàng)所述的用途，其中抗體與酶的重量比為約1：200。

10.根據(jù)實(shí)施方案1至9中任一項(xiàng)所述的用途，其中與蛋白質(zhì)水解酶孵育的多特異性抗體具有從200至600μg/mL的濃度。

11.根據(jù)實(shí)施方案1至10中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述多特異性抗體是單克隆多特異性抗體。

12.根據(jù)實(shí)施方案1至11中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述多特異性抗體包含至少兩個(gè)非肽結(jié)合的輕鏈。

13.根據(jù)實(shí)施方案1至11中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述多特異性抗體包含至少三個(gè)非肽結(jié)合的多肽。

14.一種用于確定多特異性抗體中輕鏈配對(duì)的方法，所述方法包括以下步驟：

a)將包含多特異性抗體的樣本與蛋白質(zhì)水解酶孵育限定的時(shí)間，

b)通過(guò)質(zhì)譜法鑒定由步驟a)的限制性蛋白水解消化獲得的片段的質(zhì)量，和

c)從步驟b)的結(jié)果確定多特異性抗體的輕鏈配對(duì)。

15.一種用于確定多特異性抗體的輕鏈錯(cuò)配的方法，所述方法包括以下步驟：

a)將包含多特異性抗體的樣本與蛋白質(zhì)水解酶孵育限定的時(shí)間，

b)通過(guò)質(zhì)譜法鑒定由步驟a)的限制性蛋白水解消化獲得的片段的質(zhì)量，和

c)從步驟b)的結(jié)果確定多特異性抗體的輕鏈配對(duì)，從而確定輕鏈錯(cuò)配。

16.一種用于選擇生產(chǎn)多特異性抗體的重組哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法，所述方法包括以下步驟：

a)將包含一組重組哺乳動(dòng)物細(xì)胞的一個(gè)重組哺乳動(dòng)物細(xì)胞克隆群生產(chǎn)的多特異性抗體的樣本單獨(dú)地與蛋白質(zhì)水解酶孵育限定的時(shí)間，所述一組重組哺乳動(dòng)物細(xì)胞的所有細(xì)胞生成相同的多特異性抗體，

b)通過(guò)質(zhì)譜法鑒定由步驟a)的限制性蛋白水解消化獲得的片段的質(zhì)量，和

c)從步驟b)的結(jié)果確定每個(gè)克隆細(xì)胞群的多特異性抗體的輕鏈錯(cuò)配的存在，和

d)基于步驟c)的結(jié)果選擇生產(chǎn)多特異性抗體的重組細(xì)胞。

17.根據(jù)實(shí)施方案14至16中任一項(xiàng)所述的方法，其中蛋白質(zhì)水解酶選自L(fǎng)ys-C、Asp-N、Arg-C、Glu-C和胰凝乳蛋白酶。

18.根據(jù)實(shí)施方案17所述的方法，其中蛋白質(zhì)水解酶是Lys-C。

19.根據(jù)實(shí)施方案14至18中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述孵育持續(xù)35至45分鐘。

20.根據(jù)實(shí)施方案19所述的方法，其中所述孵育持續(xù)約40分鐘。

21.根據(jù)實(shí)施方案14至20中任一項(xiàng)所述的方法，其中與蛋白質(zhì)水解酶孵育的多特異性抗體是去糖基化的多特異性抗體。

22.根據(jù)實(shí)施方案14至21中任一項(xiàng)所述的方法，其中抗體與酶的重量比為約1：200。

23.根據(jù)實(shí)施方案14至22中任一項(xiàng)所述的方法，其中與蛋白質(zhì)水解酶孵育的多特異性抗體具有從200至600μg/mL的濃度。

24.根據(jù)實(shí)施方案14至23中任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟b)是

b)脫鹽步驟a)的孵育混合物，并通過(guò)質(zhì)譜法鑒定由步驟a)的限制性蛋白水解消化獲得的片段的質(zhì)量。

25.根據(jù)實(shí)施方案14至24中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述多特異性抗體是單克隆多特異性抗體。

26.根據(jù)實(shí)施方案14至25中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述多特異性抗體包含至少兩個(gè)非肽結(jié)合的輕鏈。

27.根據(jù)實(shí)施方案14至25中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述多特異性抗體包含至少三個(gè)非肽結(jié)合的多肽。

附圖說(shuō)明

圖1二價(jià)雙特異性抗體的正確裝配(1)和輕鏈錯(cuò)配(2)形式。

圖2四價(jià)雙特異性抗體的正確裝配(1)和一些輕鏈錯(cuò)配(2，3，4，5)形式。

圖3纖溶酶消化的二價(jià)雙特異性抗體的IE；輕鏈1和重鏈1形成第一結(jié)合位點(diǎn)，輕鏈2和重鏈2形成第二結(jié)合位點(diǎn)；預(yù)期各對(duì)在以下位置：A：輕鏈2+重鏈片段1，B：輕鏈1+重鏈1，C：輕鏈2+重鏈2，D：輕鏈1+重鏈2。

圖4纖溶酶消化的二價(jià)雙特異性抗體的IE；輕鏈1和重鏈1形成第一結(jié)合位點(diǎn)，輕鏈2和重鏈2形成第二結(jié)合位點(diǎn)；預(yù)期各對(duì)在以下位置：A：輕鏈2+重鏈片段1，B：輕鏈1+重鏈1，C：輕鏈2+重鏈2，D：輕鏈1+重鏈2。

圖5限制性L(fǎng)ys-C消化的二價(jià)雙特異性抗體的IE；輕鏈1和重鏈1形成第一結(jié)合位點(diǎn)，輕鏈2和重鏈2形成第二結(jié)合位點(diǎn)；預(yù)期各對(duì)在以下位置：A：輕鏈2+重鏈片段1，B：輕鏈1+重鏈1，C：輕鏈2+重鏈2，D：輕鏈1+重鏈2。

圖6四價(jià)雙特異性抗體的IE；A：3次(time)輕鏈1；B：正確裝配的抗體；C：3次輕鏈2。

圖7蛋白質(zhì)水解酶消化的四價(jià)雙特異性抗體的蛋白A親和色譜法流動(dòng)液的MS分析，ISCID 0；A：正確配對(duì)的Fab，B：錯(cuò)配的Fab。

圖8蛋白質(zhì)水解酶消化的四價(jià)雙特異性抗體的蛋白A親和色譜法流動(dòng)液的MS分析，ISCID 90；A：正確配對(duì)的Fab，B：錯(cuò)配的Fab。

圖9蛋白質(zhì)水解酶消化的四價(jià)雙特異性抗體的蛋白A親和色譜法洗脫液的MS分析，ISCID 0；A：正確配對(duì)的Fc-Fab，B：錯(cuò)配的Fc-Fab。

圖10蛋白質(zhì)水解酶消化的四價(jià)雙特異性抗體的蛋白A親和色譜法洗脫液的MS分析，ISCID 90；A：正確配對(duì)的Fc-Fab，B：錯(cuò)配的Fc-Fab。

圖11胃蛋白酶消化的四價(jià)雙特異性抗體的EI。

提供以下實(shí)施例以幫助真正理解本發(fā)明，其范圍列于所附權(quán)利要求中。應(yīng)當(dāng)理解，可以修改所列的方法而不脫離本發(fā)明的精神。

實(shí)施例

材料和一般方法

關(guān)于人免疫球蛋白輕鏈和重鏈的核苷酸序列的一般信息在以下給出：Kabat,E.A.,等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)。對(duì)抗體鏈的氨基酸的編號(hào)和提及根據(jù)Kabat編號(hào)系統(tǒng)(Kabat,E.A.,等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))如上定義。

重組DNA技術(shù)

使用標(biāo)準(zhǔn)方法操作DNA，如Sambrook,J.等人,Molecular Cloning:A laboratory manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989所述。分子生物學(xué)試劑根據(jù)制造商的說(shuō)明使用。

基因合成

從化學(xué)合成生成的寡核苷酸制備期望的基因區(qū)段。通過(guò)退火和連接寡核苷酸(包括PCR擴(kuò)增)裝配600-1800bp長(zhǎng)的基因區(qū)段，其側(cè)翼有單數(shù)的(singular)限制性?xún)?nèi)切酶切割位點(diǎn)，和隨后經(jīng)由指定的限制性位點(diǎn)，例如KpnI/SacI或AscI/PacI克隆至基于pPCRScript(Stratagene)的pGA4克隆載體。亞克隆基因片段的DNA序列通過(guò)DNA測(cè)序證實(shí)?；蚝铣善胃鶕?jù)給定的說(shuō)明在Geneart(Regensburg,Germany)定制。

DNA序列的確定

通過(guò)MediGenomix GmbH(Martinsried,Germany)或SequiServe GmbH(Vaterstetten,Germany)進(jìn)行雙鏈測(cè)序來(lái)確定DNA序列。

DNA和蛋白質(zhì)序列分析和序列數(shù)據(jù)管理

GCG(Genetics Computer Group,Madison,Wisconsin)軟件包版本10.2和Infomax's Vector NT1高級(jí)套件8.0版用于序列創(chuàng)建、匯譜、分析、注釋和說(shuō)明。

表達(dá)載體

對(duì)于所描述抗體的表達(dá)，應(yīng)用用于瞬時(shí)表達(dá)細(xì)胞(例如在HEK293EBNA或HEK293-F中)的表達(dá)質(zhì)粒變體，其或者基于具有或不具有CMV-內(nèi)含子A啟動(dòng)子的cDNA組構(gòu)(organization)、或者基于具有CMV啟動(dòng)子的基因組組構(gòu)。

除了抗體表達(dá)盒，載體包含：

-復(fù)制起點(diǎn)，其允許該質(zhì)粒在大腸桿菌中復(fù)制，和

-β-內(nèi)酰胺酶基因，其在大腸桿菌中賦予氨芐青霉素抗性。

抗體基因的轉(zhuǎn)錄單位由以下元件組成：

-在5'端的獨(dú)特限制性位點(diǎn)(一個(gè)或多個(gè))

-來(lái)自人巨細(xì)胞病毒的即時(shí)早期增強(qiáng)子和啟動(dòng)子，

-在cDNA組構(gòu)的情況下后續(xù)內(nèi)含子A序列，

-人抗體基因的5'-非翻譯區(qū)，

-免疫球蛋白重鏈信號(hào)序列，

-人抗體鏈(野生型或具有結(jié)構(gòu)域交換)，其作為cDNA組構(gòu)或作為具有免疫球蛋白外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)的基因組組構(gòu)

-3'非翻譯區(qū)，其具有聚腺苷酸化信號(hào)序列，和

-在3'端的獨(dú)特限制性位點(diǎn)(一個(gè)或多個(gè))。

通過(guò)PCR和/或基因合成生成如下所述包含抗體鏈的融合基因，通過(guò)已知的重組方法和技術(shù)通過(guò)連接相應(yīng)的核酸區(qū)段(例如使用各自載體中的獨(dú)特的限制性位點(diǎn))來(lái)裝配。通過(guò)DNA測(cè)序驗(yàn)證亞克隆的核酸序列。對(duì)于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，通過(guò)質(zhì)粒制備從轉(zhuǎn)化的大腸桿菌培養(yǎng)物(Nucleobond AX,Macherey-Nagel)制備大量質(zhì)粒。

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

使用標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，如Current Protocols in Cell Biology(2000),Bonifacino,J.S.,Dasso,M.,Harford,J.B.,Lippincott-Schwartz,J.and Yamada,K.M.(編輯),John Wiley&Sons,Inc.中描述的。

如下所述，通過(guò)在貼壁生長(zhǎng)的HEK293-EBNA或懸浮生長(zhǎng)的HEK29-F細(xì)胞中瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染各表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)多特異性抗體。

在HEK293-EBNA系統(tǒng)中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染

通過(guò)在貼壁生長(zhǎng)的HEK293-EBNA細(xì)胞(表達(dá)Epstein-Barr病毒核抗原的人胚腎細(xì)胞系293；美國(guó)類(lèi)型培養(yǎng)物保藏保藏號(hào)ATCC#CRL-10852,Lot.959 218)中瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染各表達(dá)質(zhì)粒(例如，編碼重鏈和修飾的重鏈以及相應(yīng)的輕鏈和修飾的輕鏈)表達(dá)多特異性抗體，所述HEK293-EBNA細(xì)胞培養(yǎng)在DMEM(Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基，)中，補(bǔ)充有10％Ultra Low IgG FCS(胎牛血清)、2mM L-谷氨酰胺和250μg/ml遺傳霉素(Geneticin)。對(duì)于轉(zhuǎn)染，使用FuGENE^TM6轉(zhuǎn)染試劑(Roche Molecular Biochemicals)，其中FuGENE^TM試劑(μl)與DNA(μg)的比例為4：1(從3：1到6：1的范圍)。使用(修飾的和野生型)輕鏈和重鏈編碼質(zhì)粒1：1(等摩爾)的摩爾比(范圍從1：2至2：1)，分別從各質(zhì)粒表達(dá)蛋白質(zhì)。在第3天將細(xì)胞飼養(yǎng)在L-谷氨酰胺ad 4mM、葡萄糖[Sigma]和NAA中。從轉(zhuǎn)染后第5至11天通過(guò)離心收獲含有多特異性抗體的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液，儲(chǔ)存在-20℃。關(guān)于在例如HEK293細(xì)胞中重組表達(dá)人免疫球蛋白的一般信息提供在Meissner,P.等人,Biotechnol.Bioeng.75(2001)197-203中。

HEK293-F系統(tǒng)中的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染

根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)使用HEK293-F系統(tǒng)(Invitrogen)通過(guò)用相應(yīng)的質(zhì)粒(例如，編碼重鏈和修飾的重鏈，以及相應(yīng)的輕鏈和修飾的輕鏈)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染生成多特異性抗體。簡(jiǎn)單地說(shuō)，用四種表達(dá)質(zhì)粒和293fectin^TM或fectin(Invitrogen)的混合物轉(zhuǎn)染在搖瓶中或者在攪拌發(fā)酵罐中的無(wú)血清FreeStyle^TM293表達(dá)培養(yǎng)基(Invitrogen)中懸浮生長(zhǎng)的HEK293-F細(xì)胞(Invitrogen)。對(duì)于2升搖瓶(Corning)，HEK293-F細(xì)胞以600mL中1.0E*6細(xì)胞/mL的密度接種，并在120rpm、8％CO₂中孵育。第二天，將細(xì)胞以約1.5E*6細(xì)胞/mL的細(xì)胞密度與約42mL A)和B)的混合物轉(zhuǎn)染，其中A)20mL Opti-MEM(Invitrogen)和600μg總質(zhì)粒DNA(1μg/mL)(分別編碼重鏈或修飾的重鏈，以及相應(yīng)的輕鏈，等摩爾比)和B)20mL Opti-MEM+1.2mL 293fectin或fectin(2μl/mL)。根據(jù)葡萄糖消耗在發(fā)酵過(guò)程中加入葡萄糖溶液。5-10天后收獲含有分泌抗體的上清液，從上清中直接純化抗體或?qū)⑸锨逡豪鋬霰４妗?/p>

蛋白質(zhì)測(cè)定

通過(guò)測(cè)定280nm處的光密度(OD)、利用摩爾消光系數(shù)確定純化抗體和衍生物的蛋白質(zhì)濃度，所述摩爾消光系數(shù)根據(jù)Pace,等人,Protein Science,1995,4,2411-1423，基于氨基酸序列計(jì)算。

上清中抗體濃度測(cè)定

在細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中的抗體和衍生物的濃度通過(guò)使用蛋白A瓊脂糖珠(Roche)的免疫沉淀估計(jì)。60μL蛋白A瓊脂糖珠在TBS-NP40(50mM Tris,pH 7.5,150mM NaCl,1％Nonidet-P40)中洗滌三次。隨后，將1-15mL細(xì)胞培養(yǎng)上清液施加到在TBS-NP40中預(yù)平衡的蛋白A瓊脂糖珠上。在室溫下孵育1小時(shí)后，將珠在Ultrafree-MC-過(guò)濾柱(Amicon)上用0.5mL TBS-NP40洗滌一次，用0.5ml 2×磷酸鹽緩沖鹽水(2xPBS，Roche)洗滌兩次，用0.5ml 100mM檸檬酸鈉pH5.0短暫地洗滌四次。通過(guò)添加35μlLDS樣品緩沖液(Invitrogen)洗脫結(jié)合的抗體。分別將樣品的一半與樣品還原劑組合或保持未還原，在70℃下加熱10分鐘。因此，5-30μl施加到4-12％Bis-TrisSDS-PAGE(Invitrogen)(對(duì)于非還原SDS-PAGE，使用MOPS緩沖液，對(duì)于還原SDS-PAGE，使用MES緩沖液和抗氧化運(yùn)行緩沖液添加劑(Invitrogen))，并用考馬斯亮藍(lán)染色。

通過(guò)親和HPLC色譜法定量測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中的抗體和衍生物的濃度。簡(jiǎn)言之，在Agilent HPLC 1100系統(tǒng)上，將含有結(jié)合于蛋白A的抗體和衍生物的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液施加到200mM KH₂PO₄、100mM檸檬酸鈉，pH 7.4中的Applied Biosystems Poros A/20柱上，用200mM NaCl、100mM檸檬酸，pH 2.5從基質(zhì)中洗脫。洗脫的蛋白質(zhì)通過(guò)UV吸光度和峰面積積分進(jìn)行定量。純化的標(biāo)準(zhǔn)IgG1抗體作為標(biāo)準(zhǔn)。

可替代地，通過(guò)Sandwich-IgG-ELISA測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中抗體和衍生物的濃度。簡(jiǎn)言之，用100μL/孔的生物素化抗人IgG捕獲分子F(ab')2<h-Fcγ>BI(Dianova)0.1μg/mL，在室溫下放置1小時(shí)或備選地在4℃過(guò)夜包被StreptaWell高結(jié)合鏈霉親和素A-96孔微量滴定板(Roche)，隨后用200μL/孔PBS、0.05％Tween(PBST,Sigma)洗滌三次。在PBS(Sigma)中系列稀釋的各含有抗體的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液100μL/孔加入到孔中，并在室溫下在微量滴定板搖床上孵育1-2小時(shí)。用200μL/孔PBST洗滌孔三次，用100μl F(ab‘)2<hFcγ>POD(Dianova)，0.1μg/mL作為檢測(cè)抗體在室溫在微量滴定板搖床上放置1-2小時(shí)，檢測(cè)結(jié)合的抗體。用200μL/孔PBST三次洗掉未結(jié)合的檢測(cè)抗體，并通過(guò)加入100μL ABTS/孔檢測(cè)結(jié)合的檢測(cè)抗體。在Tecan氟分光光度計(jì)上在405nm測(cè)量波長(zhǎng)下進(jìn)行吸光度的測(cè)定(參考波長(zhǎng)492nm)。

蛋白質(zhì)純化

參照標(biāo)準(zhǔn)流程從過(guò)濾的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中純化蛋白。簡(jiǎn)言之，將抗體施加到蛋白A Sepharose柱(GE Healthcare)上，并用PBS洗滌?？贵w洗脫液在pH 2.8獲得，隨后立即中和樣品。通過(guò)尺寸排阻色譜法(Superdex 200,GE Healthcare)在PBS或在20mM組氨酸、150mMNaCl pH 6.0中從單體抗體分離聚集的蛋白質(zhì)。合并單體抗體級(jí)分，(如需要)用例如MILLIPORE Amicon Ultra(30MWCO)離心濃縮機(jī)濃縮，冷凍儲(chǔ)存在-20℃或-80℃。提供部分樣品用于隨后的蛋白分析和分析表征，例如通過(guò)SDS-PAGE、尺寸排阻層析(SEC)或質(zhì)譜。

SDS-PAGE

根據(jù)制造商的指示使用Pre-Cast凝膠系統(tǒng)(Invitrogen)。特別是，使用10％或4-12％Bis-Tris Pre-Cast凝膠(pH 6.4)和MES(還原凝膠，具有抗氧運(yùn)行緩沖液添加劑)或MOPS(非還原凝膠)運(yùn)行緩沖液。

分析型尺寸排阻色譜法

通過(guò)HPLC色譜法進(jìn)行用于確定抗體聚集和寡聚狀態(tài)的尺寸排阻色譜法(SEC)。簡(jiǎn)言之，將蛋白A純化的抗體施加到Agilent HPLC 1100系統(tǒng)的300mM NaCl、50mM KH₂PO₄/K₂HPO₄，pH 7.5中的Tosoh TSKgel G3000SW柱上，或Dionex HPLC系統(tǒng)的2×PBS中的Superdex 200柱(GE Healthcare)上。通過(guò)UV吸光度和峰面積積分定量洗脫的蛋白質(zhì)。BioRad凝膠過(guò)濾標(biāo)準(zhǔn)151-1901作為標(biāo)準(zhǔn)。

實(shí)施例1

確定限制性蛋白水解消化后多特異性抗體的輕鏈錯(cuò)配的方法

通過(guò)限制性L(fǎng)ysC消化的交叉單抗(CrossMab)的電噴霧離子化質(zhì)譜法(ESI-MS)分析預(yù)期的一級(jí)結(jié)構(gòu)。有利地，該抗體已預(yù)先去糖基化。

用N-糖苷酶F、在磷酸鹽或Tris或組氨酸緩沖液中，在37℃下使VH/VL交叉單抗去糖基化達(dá)17小時(shí)，蛋白質(zhì)濃度1mg/mL，并且抗體：酶的比率為100：1。用100μg去糖基化的VH/VL交叉單抗在Tris緩沖液pH 8在37℃下進(jìn)行40分鐘限制性L(fǎng)ys-C(Roche Diagnostics GmbH,Mannheim,Germany)消化。

在質(zhì)譜法之前，在Sephadex G25柱(GE Healthcare)上通過(guò)HPLC使樣品脫鹽。

在裝配有TriVersa NanoMate源(Advion)的maXis 4G UHR-QTOF MS系統(tǒng)(Bruker Daltonik)上通過(guò)ESI-MS來(lái)確定總質(zhì)量。

實(shí)施例2

確定四價(jià)雙特異性抗體的輕鏈錯(cuò)配的方法

用N-糖苷酶F、在磷酸鹽或Tris或組氨酸緩沖液中，在37℃下使四價(jià)雙特異性抗體去糖基化達(dá)17小時(shí)，蛋白質(zhì)濃度1mg/mL，并且抗體：酶的比率為100：1。用100μg去糖基化的四價(jià)雙特異性抗體在100mM檸檬酸鹽緩沖液pH3.7在37℃下進(jìn)行16小時(shí)限制性L(fǎng)ys-C(Roche Diagnostics GmbH,Mannheim,Germany)消化，蛋白質(zhì)濃度約0.9mg/mL，并且抗體：酶的比率為50：1。