本發(fā)明涉及一種改進的方法，用于制備和提純臺勾霉素B(Tiacumicin B)。特別地，本發(fā)明涉及從干燥的發(fā)酵培養(yǎng)基提純臺勾霉素B，隨后采用提取和色譜技術。根據(jù)本發(fā)明的方法比現(xiàn)有技術的方法簡單并可以容易地用于大規(guī)模商業(yè)生產。

背景技術：

臺勾霉素B的制備方法在US4918174或WO2004014295中有公開。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明涉及制備臺勾霉素B的方法，所述方法包括在用一適當?shù)娜軇┨崛≈暗母稍锇l(fā)酵培養(yǎng)基的步驟。

特別地，本發(fā)明提供一種制備臺勾霉素B的方法，包括步驟：

a)發(fā)酵產生臺勾霉素B的菌株；

b)干燥發(fā)酵培養(yǎng)基；

c)利用溶劑提取所述干燥的材料。

根據(jù)本發(fā)明的所述干燥步驟b)可以通過噴霧干燥或冷凍干燥執(zhí)行。

根據(jù)一個實施例，所述溶劑選自由C1-C5醇、C4-C6醚、C2-C5酮和C2-C5酯組成的組。

根據(jù)另一實施例，所述溶劑選自由甲醇、乙醇、異丙醇和丙酮組成的組。

根據(jù)本發(fā)明的溶劑可以進一步包括水，例如至少1-40％v/v的水，例如至少10-30％v/v的水，例如至少15-20％v/v的水。在本說明書中所指的這些溶劑為水性溶劑。

根據(jù)一個實施例，提供一種制備臺勾霉素B的方法，包括步驟：

a)發(fā)酵產生臺勾霉素B的菌株；

b)干燥發(fā)酵培養(yǎng)基；

c)利用一水性溶劑提取所述干燥的材料，所述水性溶劑包括50-90％v/v的一有機溶劑，所述有機溶劑選自由甲醇、乙醇、異丙醇和丙酮組成的組。

根據(jù)另一實施例，提供一種制備臺勾霉素B的方法，包括步驟：

a)發(fā)酵能夠產生臺勾霉素B的指孢囊菌屬或游動放線菌屬的菌株；

b)干燥發(fā)酵培養(yǎng)基；

c)利用一水性溶劑提取所述干燥的材料，所述水性溶劑包括60-90％v/v的甲醇和乙醇。

所述提取可以使用一溶劑執(zhí)行，所述溶劑選自由甲醇、乙醇、異丙醇和丙酮組成的組。根據(jù)一個實施例，所述溶劑為包括50-90％v/v的甲醇、乙醇、異丙醇或丙酮的水性溶劑。

根據(jù)本發(fā)明所用的溶劑在一個實施例中可以是包括60-90％v/v的有機溶劑的水性溶劑，優(yōu)選包括70-80％v/v的有機溶劑的水性溶劑，更優(yōu)選包括75％v/v的有機溶劑的水性溶劑。所述溶劑可以選自由甲醇、乙醇、異丙醇和丙酮組成的組。

根據(jù)又一實施例，所述干燥由噴霧干燥執(zhí)行，在所述提取步驟中使用的所述水性溶劑為70-80％v/v的甲醇。根據(jù)又一實施例，所述干燥由噴霧干燥執(zhí)行，在所述提取步驟中使用的所述水性溶劑為70-80％v/v的乙醇。

根據(jù)又一實施例，所述干燥由冷凍干燥執(zhí)行，在所述提取步驟中使用的所述水性溶劑為70-80％v/v的甲醇。根據(jù)又一實施例，所述干燥由冷凍干燥執(zhí)行，在所述提取步驟中使用的所述水性溶劑為70-80％v/v的乙醇。

根據(jù)本發(fā)明的方法，溶劑體積和干燥的發(fā)酵培養(yǎng)基的質量之比為1-6ml/g(毫升/克)。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，溶劑體積和干燥的發(fā)酵培養(yǎng)基的質量之比為2-4ml/g。

根據(jù)本發(fā)明的方法，用于在發(fā)酵步驟產生臺勾霉素B的菌株選自由指孢囊菌屬(Dactylosporangium)和游動放線菌屬(Dactylosporangium)組成的組。

下面參考詳細描述、實例和附圖描述本發(fā)明的多個方面，包括各種實施例。

附圖說明

圖1示出了噴霧干燥的發(fā)酵物在不同溶劑濃度的提取效率。

圖2示出了噴霧干燥的發(fā)酵物在不同甲醇濃度的提取產率。

圖3示出了在提取噴霧干燥的發(fā)酵物時在不同體積的75％v/v甲醇水溶液的產率。

具體實施方式

根據(jù)本發(fā)明，任何產生臺勾霉素B的菌株可以用于提供根據(jù)本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)基。根據(jù)一個實施例，臺勾霉素B可以由指孢囊菌屬的亞種hamdenensis NRRL 18085(北部區(qū)域研究實驗室保藏號18085)或德干高原游動放線菌(Actinoplanes deccanensis)ATCC 21983(美國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏號21983)產生。

所述發(fā)酵培養(yǎng)基為包含細菌生物體和臺勾霉素組合物的液態(tài)營養(yǎng)媒介。

所述發(fā)酵培養(yǎng)基的干燥可以通過冷凍干燥執(zhí)行。優(yōu)選的冷凍干燥方法包括將溫度降至-40℃并將壓力降至200mTorr(毫托)，隨后在的溫度-5℃至5℃范圍進行主干燥，隨后在溫度約20℃進行次級干燥。

根據(jù)本發(fā)明，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)選的干燥方法為噴霧干燥。盡管在噴霧干燥時溫度高，Tiacumicin B能夠有高的產率。

一個優(yōu)選的噴霧干燥方法包括180-220℃的入口溫度和80-100℃的出口溫度。進行干燥以實現(xiàn)水含量0％-12％w/w，優(yōu)選水含量低于10％w/w，例如2％-8％w/w。

C1-C5醇是指具有1、2、3、4或5個碳原子的脂肪醇。

C4-C6醚是指具有4、5或6個碳原子的脂肪醚。

C2-C5酮是指具有2、3、4或5個碳原子的脂肪酮。

C2-C5酯是指具有2、3、4或5個碳原子的脂肪酯。

根據(jù)一個實施例，所述干燥的發(fā)酵培養(yǎng)基利用一溶劑提取，所述溶劑選自由甲醇、乙醇、異丙醇和丙酮組成的組。

根據(jù)另一實施例，所述干燥的發(fā)酵培養(yǎng)基利用一水性溶劑提取，所述水性溶劑包括50-90％v/v的有機溶劑，所述有機溶劑選自由甲醇、乙醇、異丙醇和丙酮組成的組；優(yōu)選70–80％v/v，更優(yōu)選75％v/v的有機溶劑，所述有機溶劑選自由甲醇、乙醇、異丙醇和丙酮組成的組。提取的優(yōu)選pH值約為5-7，優(yōu)選6-7，更優(yōu)選7。提取的優(yōu)選溫度為20-25℃。

在提取溶液中的甲醇或乙醇的濃度隨后可以通過蒸發(fā)或稀釋調節(jié)至一適于將臺勾霉素B綁定到一吸附樹脂的濃度，例如50％有機溶劑的水溶液。在綁定到一吸附樹脂后，用一水性溶液清洗以移除未綁定的雜質，例如濃度50％的有機溶劑。所述綁定的臺勾霉素B用包含60-100％的有機溶劑和0-40v/v的水的溶劑洗脫。

實驗數(shù)據(jù)

實例1

利用Niro Mobile Minor牌的帶有二流體噴嘴的噴霧干燥器直接干燥指孢囊菌屬的亞種hamdenensis NRRL 18085?？諝鈮毫?.2巴。入口溫度為約200℃，出口溫度為90-92℃。進氣速率為0.5-1.0升/小時。

噴霧干燥的粉末放入8個5ml的容量燒瓶，每一個約1g。溶劑加至5ml刻度。使用的不同溶劑：乙醇、甲醇、異丙醇、正丙醇、乙腈、丙酮、二甲亞砜、水。這些燒瓶放入一頂置式攪拌器振動一小時。抽取漿狀物并離心分離。用HPLC(高效液相色譜)分析所得的上清液。DMSO(二甲亞砜)是最有效的提取溶劑。但是DMSO因其高沸點而不適于大規(guī)模生產。出乎意料的是，甲醇給出其他溶劑的最高產率。其產率高于乙醇、異丙醇、正丙醇、乙腈和丙酮約50-100％。

實例2

噴霧干燥的指孢囊菌屬的亞種hamdenensis NRRL 18085的發(fā)酵物用不同溶劑和不同溶劑/水的組合物提取。使用100％,75％,50％和25％濃度的乙醇、甲醇、異丙醇和丙酮的水溶液。所用的干燥的發(fā)酵物的重量為體積的5倍(即每毫升溶液200mg粉末)。漿狀物在一頂置式振動器振動4小時。離心分離漿狀物，用HPLC分析上清液。結果如圖1所示。

實例3

噴霧干燥的指孢囊菌屬的亞種hamdenensis NRRL 18085的發(fā)酵物用不同濃度的甲醇水溶液提取。1g發(fā)酵物放入一5ml容量瓶，甲醇/水溶液加至刻度。測試濃度65％,70％,75％,80％和85％的甲醇在純凈水(反滲透水)的溶液。漿狀物在頂置式致動器振動1.5小時。離心分離漿狀物，用HPLC分析所得的上清液。測量上清液的干燥重量。

結果見圖2。

75-80％的甲醇具有提取產率的峰值。隨著甲醇濃度增加，干燥重量下降。對于所有的甲醇濃度，HPLC純度保持一致。

實例4

噴霧干燥的指孢囊菌屬的亞種hamdenensis NRRL 18085的發(fā)酵物用不同體積的75％的甲醇水溶液提取。在不同試管加入1g發(fā)酵物和2、3、4、5、10ml 75％的甲醇。漿狀物在頂置式致動器振動1.5小時。離心分離漿狀物。用HPLC分析所得的上清液。

結果如圖3所示。對于所有的體積，產率類似。

實例5

噴霧干燥的指孢囊菌屬的亞種hamdenensis NRRL 18085的發(fā)酵物用的75％的甲醇/水溶液(在體積里3倍的重量)在攪拌下2小時提取。離心分離漿狀物，在旋轉蒸發(fā)器濃縮，得到50％甲醇的水溶液。濃縮液直接裝載在堆積在色譜柱內的HP20樹脂。用50％的甲醇清洗色譜柱，用梯度50％-100％的甲醇洗脫。產率為92％。

實例6

本發(fā)明的干燥步驟可以通過下例示出的小規(guī)模和大規(guī)模的冷凍干燥執(zhí)行。

6.1小規(guī)模冷凍干燥

4升的指孢囊菌屬的亞種hamdenensis NRRL 18085的發(fā)酵物潑入金屬盤(液體高度1.5-2.0cm)。金屬盤裝入Virtis Genesis牌12ES冷凍干燥器并冷凍至-40℃。在抵達所述溫度后放置2小時。隨后冷凝器降溫至約-50℃并獲得200mTorr的真空度。在600分鐘期間將架溫調至-5℃。隨后架溫迅速調至0℃并保持1250分鐘?？焖賹⒓軠卣{至+5℃，產品在該溫度保持600分鐘。次級的干燥是這樣進行的，快速調至+20℃，產品在該溫度在真空下(200mTorr)保持1250分鐘。隨后盤子移出冷凍干燥器，獲得179g干燥材料。

6.2大規(guī)模冷凍干燥

約110升的指孢囊菌屬的亞種hamdenensis NRRL 18085的發(fā)酵物潑入48個金屬盤(液體高度1.5-2.0cm)。金屬盤裝入兩個冷凍干燥器并冷凍至-20℃。在抵達所述溫度后放置一段時間。隨后冷凝器降溫至約-40℃。隨后獲得約200mTorr的真空度。在44小時期間將架溫調至+40℃。隨后盤子移出冷凍干燥器，獲得6.6kg干燥材料。

400g冷凍干燥的的指孢囊菌屬的亞種hamdenensis NRRL 18085的發(fā)酵物加入2000ml的80％v/v甲醇-水溶液并攪拌1小時。隨后混合物在4500rmp離心分離15分鐘。輕輕倒出上清液(1550ml)。沉淀物中加入1400ml的80％v/v甲醇-水溶液。混合物留置過夜，第二天攪拌1小時。隨后在4500rmp離心分離15分鐘。輕輕倒出上清液(1380ml)。兩個上清液合起來的總體積為2930ml?？偖a率79％。

所述溶液在40℃水浴和減壓下蒸發(fā)。最終的體積為1220ml，包括40％的水，由卡爾費歇滴定法測量。溶液裝入載有HP20樹脂的色譜柱。