本領(lǐng)域涉及植物育種和遺傳學(xué)，具體地，涉及可用于植物中以賦予耐旱性的重組DNA構(gòu)建體。
背景技術(shù)：
：：對植物的脅迫可由生物和非生物試劑造成。例如，脅迫的生物原因包括病原體感染、昆蟲攝食、以及被另一種植物諸如槲寄生寄生。非生物脅迫包括例如過量或不足的可用水、溫度極限、以及合成化學(xué)品諸如除草劑。非生物脅迫是世界范圍內(nèi)作物減產(chǎn)的主要原因，造成主要作物的平均收率損失大于50％(Boyer，J.S.(1982)Science218：443-448；Bray，E.A.等人(2000)InBiochemistryandMolecularBiologyofPlants，Buchannan編輯，B.B.等人，Amer.Soc.PlantBiol.，第1158-1249頁)。在各種非生物脅迫中，干旱是在世界范圍內(nèi)限制作物產(chǎn)量的主要因素，并且在各種發(fā)育階段期間，將植物暴露于水分限制環(huán)境中似乎會激活各種生理和發(fā)育變化。盡管已出版了許多關(guān)于非生物脅迫應(yīng)答的分子機制和干旱脅迫耐受性的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的綜述(Valliyodan，B.和Nguyen，H.T.(2006)Curr.Opin.PlantBiol.9：189-195；Wang，W.等人，(2003)Planta218：1-14；Vinocur，B.和Altman，A.(2005)Curr.Opin.Biotechnol.16：123-132；Chaves，M.M.和Oliveira，M.M.(2004)J.Exp.Bot.55：2365-2384；Shinozaki，K.等人(2003)Curr.Opin.PlantBiol.6：410-417；Yamaguchi-Shinozaki，K.和Shinozaki，K.(2005)TrendsPlantSci.10：88-94)，但是理解干旱脅迫感知、傳導(dǎo)和耐受性的基本生物化學(xué)和分子機制也是生物學(xué)上的一個主要挑戰(zhàn)。非生物脅迫應(yīng)答的分子方面的早期工作通過差異和/或差減分析(Bray，E.A.(1993)PlantPhysiol.103：1035-1040；Shinozaki，K.和Yamaguchi-Shinozaki，K.(1997)PlantPhysiol.115：327-334；Zhu，J.-K.等人(1997)Crit.Rev.PlantSci.16：253-277；Thomashow，M.F.(1999)Annu.Rev.PlantPhysiol.PlantMol.Biol.50：571-599)；和其它方法實現(xiàn)，包括候選基因的選擇以及這一基因或其活性產(chǎn)物在脅迫下的表達分析，或通過在良好限定的應(yīng)激物系統(tǒng)中的功能性互補實現(xiàn)(Xiong，L.和Zhu，J.-K.(2001)PhysiologiaPlantarum112：152-166)。另外，已使用涉及鑒定和分離調(diào)控基因突變的正向和反向遺傳學(xué)研究為所觀察到的在脅迫下基因表達的變化提供證據(jù)(Xiong，L.和Zhu，J.-K.(2001)PhysiologiaPlantarum112：152-166)。激活標(biāo)簽可用于鑒定能夠影響性狀的基因，這一方法已經(jīng)用于擬南芥(模式植物物種)中(Weigel，D.等人(2000)PlantPhysiol.122：1003-1013)。轉(zhuǎn)錄增強子元件的插入可主要激活和/或提高鄰近內(nèi)源性基因的表達，因此該方法可以用于選擇涉及農(nóng)學(xué)上重要的表型(包括非生物脅迫耐受性，諸如改善的耐旱性)的基因。技術(shù)實現(xiàn)要素：本公開涵蓋以下實施方案：1.一種分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸包含：(a)編碼包含與SEQIDNO：4具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；或(b)SEQIDNO：2的核苷酸序列；或(c)SEQIDNO：3的核苷酸序列；或(d)與(a)或(b)或(c)的全長核苷酸序列具有至少85％同一性的核苷酸序列；或(e)(a)或(b)或(c)或(d)的核苷酸序列的全長互補序列，其中全長互補序列和該核苷酸序列由相同數(shù)目的核苷酸組成并且100％互補，多核苷酸在植物中的過表達增強耐旱性。分離的多核苷酸編碼包含SEQIDNO：4的氨基酸序列的多肽。核苷酸序列可包含SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的核苷酸序列。2.一種重組DNA構(gòu)建體，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接到至少一個異源調(diào)控序列的根據(jù)實施方案1所述的分離的多核苷酸。3.一種在其基因組中包含重組DNA構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植物，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接到至少一個異源調(diào)控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼包含與SEQIDNO：4具有至少85％序列同一性的氨基酸序列的DN-DTP1(表達蛋白)多肽，并且其中與對照植物相比，所述轉(zhuǎn)基因植物表現(xiàn)出增加的耐旱性和/或百草枯耐受性。4.一種在其基因組中包含重組DNA構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植物，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接到至少一個調(diào)控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼包含與SEQIDNO：4具有至少85％序列同一性的氨基酸序列的多肽，并且其中與對照植物相比，所述植物表現(xiàn)出至少一個農(nóng)學(xué)特性的改變。任選地，在水分限制條件下，與對照植物相比，該植物表現(xiàn)出所述至少一個農(nóng)學(xué)特性的所述改變。至少一個農(nóng)學(xué)性狀可為谷粒收率或生物質(zhì)，并且改變可為增加。5.一種根據(jù)實施方案3或4所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物選自：稻、玉米、大豆、向日葵、高粱、卡諾拉、小麥、苜蓿、棉花、大麥、粟、甘蔗和柳枝稷。6.根據(jù)實施方案3或4或5所述的轉(zhuǎn)基因植物的種子，其中所述種子在其基因組中包含重組DNA構(gòu)建體，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接到至少一個調(diào)控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼包含與SEQIDNO：4相比具有至少85％序列同一性的氨基酸序列的多肽，并且其中與對照植物相比，由所述種子產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物表現(xiàn)出增加的耐旱性，或至少一個其它農(nóng)學(xué)特性的改變，或兩者。至少一個其它農(nóng)學(xué)性狀可為谷粒收率、生物質(zhì)、或組合，并且改變可為增加。7.一種增加植物耐旱性的方法，所述方法包括：(a)向可再生的植物細(xì)胞中引入重組DNA構(gòu)建體，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接到至少一個調(diào)控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼包含與SEQIDNO：4具有至少85％序列同一性的氨基酸序列的多肽；(b)由步驟(a)之后的可再生的植物細(xì)胞再生轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含重組DNA構(gòu)建體；以及(c)獲得來源于步驟(b)的轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含重組DNA構(gòu)建體并且與對照植物相比表現(xiàn)出增加的耐旱性。8.一種改善耐旱性的方法，所述方法還包括：(a)將根據(jù)實施方案3或4或5所述的植物與第二植物雜交以產(chǎn)生子代種子；(b)收獲并種植所述子代種子以產(chǎn)生后續(xù)世代的至少一個子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含根據(jù)實施方案3所述的重組DNA構(gòu)建體；(c)將所述子代植物與所述第二植物雜交以產(chǎn)生至少一個回交子代種子；以及任選地；(d)在附加的世代重復(fù)步驟(b)和(c)以產(chǎn)生與所述第二植物相比具有改善的耐旱性的植物。9.一種評估植物耐旱性的方法，所述方法包括：(a)獲得轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含重組DNA構(gòu)建體，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接到至少一個調(diào)控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼包含與SEQIDNO：4具有至少85％序列同一性的氨基酸序列的多肽；(b)獲得來源于所述轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含重組DNA構(gòu)建體；以及(c)與對照植物相比，評估子代植物的耐旱性。10.一種確定植物中至少一個農(nóng)學(xué)特性的改變的方法，所述方法包括：(a)獲得轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含重組DNA構(gòu)建體，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接到至少一個調(diào)控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼包含與SEQIDNO：4具有至少85％序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含重組DNA構(gòu)建體；(b)獲得來源于所述轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含重組DNA構(gòu)建體；以及(c)與對照植物相比，確定子代植物是否表現(xiàn)出至少一個農(nóng)學(xué)特性的改變。任選地，所述確定步驟(c)包括確定在水分限制條件下，與對照植物相比，轉(zhuǎn)基因植物是否表現(xiàn)出至少一個農(nóng)學(xué)特性的改變。至少一個農(nóng)學(xué)性狀可為谷粒收率、生物質(zhì)、或組合，并且改變可為增加。11.根據(jù)實施方案7-10中任一項所述的方法，其中所述植物選自：稻、玉米、大豆、向日葵、高粱、卡諾拉、小麥、苜蓿、棉花、大麥、粟、甘蔗和柳枝稷。12.一種包含增強內(nèi)源性多核苷酸的表達的重組轉(zhuǎn)錄激活元件的稻轉(zhuǎn)基因植物，其中所述多核苷酸編碼與SEQIDNO：4具有90％同一性的氨基酸序列。13.一種增加田間稻植物耐旱性的方法，所述方法包括(a)在稻植物中表達編碼稻DN-DTP1多肽的重組核酸；(b)使稻植物在田間在作物生長條件下生長，其中稻植物暴露于干旱條件；以及(c)增加稻植物的耐旱性。14.一種增加田間稻植物的收率的方法，所述方法包括(a)在稻植物中表達編碼稻DN-DTP1多肽的重組核酸；(b)使稻植物在田間在作物生長條件下生長，其中稻植物暴露于干旱條件；以及(c)增加稻植物的谷粒收率。15.一種鑒定導(dǎo)致OsDN-DTP1多肽的表達或活性增加的OsDN-DTP1基因的等位基因的方法，所述方法包括以下步驟：(a)對突變型植株群體進行遺傳篩選；(b)鑒定表現(xiàn)出OsDN-DTP1多肽或其同源物的表達或活性增加的一個或多個突變型植株；以及(c)從突變型植株鑒定OsDN-DTP1等位基因或其同源物。16.一種篩選OsDN-DTP1的等位基因的方法，所述方法包括(a)利用靶向OsDN-DTP1基因的寡核苷酸引物對從一個或多個稻群體中分離的一個或多個基因組DNA片段進行測序；(b)分析OsDN-DTP1基因的調(diào)控或編碼區(qū)中DNA序列的差異；以及(c)將OsDN-DTP1的等位基因與增加的耐旱性或收率相關(guān)聯(lián)。17.一種稻轉(zhuǎn)基因植物，所述稻轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含導(dǎo)致OsDN-DTP1多肽的表達增加的重組構(gòu)建體，其中所述多肽包含SEQIDNO：4。在另一個實施方案中，本公開涉及一種包含可操作地連接到至少一個調(diào)控序列的本公開的分離的多核苷酸中的任一個的重組DNA構(gòu)建體，以及包含所述重組DNA構(gòu)建體的細(xì)胞、植物、或種子。細(xì)胞可為真核細(xì)胞，例如酵母、昆蟲或植物細(xì)胞；或原核細(xì)胞，例如細(xì)菌細(xì)胞。附圖和序列表簡述由以下的“具體實施方式”及構(gòu)成本申請的一部分的附圖和序列表可以更全面地理解本公開。圖1提供通過實時PCR分析獲得的獨立轉(zhuǎn)基因稻事件的葉中OsDN-DTPl轉(zhuǎn)基因的相對表達水平。在ZH11-TC中的基礎(chǔ)表達水平設(shè)為1.00，在OsDN-DTP1事件中的表達水平示出為與ZH11-TC相比的成倍增加。圖2示出在生長季節(jié)海南田間不同發(fā)育階段的土壤體積含水量的變化。圖3提供表明在CaMV35S啟動子下稻OsDN-DTP1基因在擬南芥中的過表達(事件AtDP0006.06、AtDP0006.09、AtDP0006.11)可顯著增加耐旱性的照片和附圖。A.轉(zhuǎn)基因擬南芥中的OsDN-DTP1基因的半定量PCR分析；B.復(fù)水后第3天的存活率；以及C.在復(fù)水后第3天獲得的照片。WT，野生型Columbia；VC，空載體DP0009轉(zhuǎn)化體。表1序列表中提供的核苷酸和氨基酸序列的SEQIDNO表2.T1世代AH00838植株在溫室條件下的耐旱性測定表3.T2世代AH00838植株在溫室條件下的耐旱性測定表4.T2世代OsDN-DTP1稻植株在田間干旱條件下的谷粒收率測定表5.T2世代OsDN-DTP1轉(zhuǎn)基因稻植株在轉(zhuǎn)基因事件水平上(第1個實驗)的百草枯耐受性測定表6.T2世代OsDN-DTP1轉(zhuǎn)基因稻植株在轉(zhuǎn)基因事件水平上(第2個實驗)的百草枯耐受性測定表1.序列表中提供的核苷酸和氨基酸序列的SEQIDNO序列表包含核苷酸序列的單字母密碼和氨基酸序列的三字母密碼，如根據(jù)NucleicAcidsRes.13：3021-3030(1985)和BiochemicalJ.219(No.2)：345-373(1984)中所述的IUPAC-IUBMB標(biāo)準(zhǔn)所定義的，所述文獻通過引用并入本文。用于核苷酸和氨基酸序列數(shù)據(jù)的符號和格式遵循37C.F.R.§1.822中列出的規(guī)則。具體實施方式本文列出的每個參考文獻的公開內(nèi)容據(jù)此全文以引用方式并入。如本文中和所附權(quán)利要求書中所用，單數(shù)形式“一個/種”和“所述”包括復(fù)數(shù)指代，除非上下文清楚表明并非如此。因此，例如，提及“植物”包括多個這種植物；提及“細(xì)胞”包括一個或多個細(xì)胞以及本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的其等同物，以此類推。如本文所用：術(shù)語“OsDN-DTP1”是指賦予耐旱性和/或百草枯耐受性表型并且由稻基因座Os04g0208800編碼的稻蛋白。術(shù)語“DTP”和“耐旱性表型”在本文可互換使用?！癉TP1多肽”是指具有耐旱性表型的蛋白質(zhì)并且在本文指OsDN-DTP1多肽和來自其它生物體的其同源物。OsDN-DTP1多肽(SEQIDNO：4)由稻基因座Os04g0208800處的核苷酸序列(SEQIDNO：3)編碼。此蛋白不具有任何先前指定的功能或注釋。術(shù)語“單子葉植物(monocot)”和“單子葉的植物(monocotyledonousplant)”在本文可互換使用。本公開的單子葉植物包括禾本科植物。術(shù)語“雙子葉植物(dicot)”和“雙子葉的植物(dicotyledonousplant)”在本文可互換使用。本公開的雙子葉植物包括以下科：十字花科、豆科和茄科。術(shù)語“全長互補序列(fullcomplement)”和“全長互補序列(full-lengthcomplement)”在本文可互換使用，并且是指給定核苷酸序列的互補序列，其中互補序列和核苷酸序列由相同數(shù)目的核苷酸組成并且100％互補?！氨磉_序列標(biāo)簽”(“EST”)是來源于cDNA文庫的DNA序列并且因此代表已轉(zhuǎn)錄的序列。EST通常通過cDNA插入片段的單程測序(singlesequencingpass)獲得。將整個cDNA插入片段的序列稱為“全長插入序列”(“FIS”)。“重疊群(Contig)”序列是由可選自但不限于EST、FIS和PCR序列的兩種或更多種序列裝配成的序列。編碼整個或功能性蛋白的序列稱為“完全基因序列”(“CGS”)并且可源自FIS或重疊群。術(shù)語“性狀”是指植物或特定的植物材料或細(xì)胞的生理、形態(tài)、生化或物理特性。在一些情況下，此特性對人眼是可見的，諸如種子或植株大小，或者可通過生物化學(xué)技術(shù)測量，諸如檢測種子或葉的蛋白質(zhì)、淀粉或油含量，或者通過觀察代謝或生理過程，例如通過測量對水剝奪或特定鹽或糖或氮濃度的耐受性，或者通過觀察一個或多個基因的表達水平，或者通過農(nóng)藝觀察結(jié)果諸如滲透脅迫耐受性或收率?！稗r(nóng)學(xué)特性”是可測量參數(shù)，包括但不限于綠度、谷粒收率、生長速率、總生物質(zhì)或累積速率、成熟時的鮮重、成熟時的干重、果實產(chǎn)量、谷粒收率、總植株氮含量、果實氮含量、種子氮含量、營養(yǎng)組織中的氮含量、總植株游離氨基酸含量、果實游離氨基酸含量、種子游離氨基酸含量、營養(yǎng)組織中的游離氨基酸含量、總植株蛋白質(zhì)含量、果實蛋白質(zhì)含量、種子蛋白質(zhì)含量、營養(yǎng)組織中的蛋白質(zhì)含量、耐旱性、氮吸收、根倒伏、收獲指數(shù)、莖桿倒伏、植株高度、穗高、穗長、耐鹽性、分蘗數(shù)、圓錐花序大小、早期幼苗活力以及低溫脅迫下的出苗情況。增加的生物質(zhì)可測量為例如與對照植物相比植株高度、植株總?cè)~片面積、植株鮮重、植株干重或植株谷粒收率的增加。增加植株的生物質(zhì)或大小的能力將具有若干重要的商業(yè)應(yīng)用。作物栽培品種可發(fā)育以產(chǎn)生更高收率的待用于食物、飼料、纖維和/或生物燃料的植物的營養(yǎng)部分。增大的葉尺寸可具有特別的意義。增加的葉生物質(zhì)可以用于增加植物衍生的藥用或工業(yè)產(chǎn)品的生產(chǎn)。增加的分檗數(shù)可具有特別的意義并且可用于增加收率?？傊仓旯夂献饔玫脑黾油ǔＭㄟ^增加植株的葉片面積來實現(xiàn)。另外的光合作用能力可用于增加來源于特定植物組織的收率，包括葉、根、果實或種子，或允許植株在減小的光強度或在高光強度下生長。另一種組織諸如根組織的生物質(zhì)的改變可用于改善植株在苛刻環(huán)境條件(包括干旱或營養(yǎng)缺乏)下生長的能力，因為較大的根可更好地接觸或吸收水或營養(yǎng)物質(zhì)。對于一些觀賞植物，提供較大的品種的能力將為高度期望的。對于許多植物，包括結(jié)果子的樹、用于木材生產(chǎn)的樹、或充當(dāng)觀察或風(fēng)遮擋物的樹和灌木，增加的高度提供改善的有益效果，諸如以更大的收率或改善的遮擋的形式?！稗D(zhuǎn)基因”是指其基因組因異源核酸(諸如重組DNA構(gòu)建體)的存在而發(fā)生改變的任何細(xì)胞、細(xì)胞系、愈傷組織、組織、植株部分或植株。本文所用的術(shù)語“轉(zhuǎn)基因”包括那些最初的轉(zhuǎn)基因事件以及從最初的轉(zhuǎn)基因事件通過有性雜交或無性繁殖而產(chǎn)生的那些，并且不涵蓋通過常規(guī)植物育種方法或通過自然發(fā)生的事件(諸如隨機異花受精、非重組病毒感染、非重組細(xì)菌轉(zhuǎn)化、非重組轉(zhuǎn)座或自發(fā)突變)進行的基因組(染色體或染色體外)改變。“對照”或“對照植物”或“對照植物細(xì)胞”提供用于度量其中已針對目的基因通過諸如轉(zhuǎn)化實現(xiàn)了遺傳改變的主題植物或植物細(xì)胞的表型變化的參考點，并且已被影響。主題植物或植物細(xì)胞可從作了如此改變的植物或細(xì)胞遺傳而來，且將包含該改變。對照植物或植物細(xì)胞可包括例如：(a)野生型植物或細(xì)胞，即具有與用于進行遺傳改變的起始材料相同的基因型的植物或細(xì)胞，該遺傳改變會得到主題植物或細(xì)胞；(b)具有與起始材料相同的基因型但已用無效構(gòu)建體(即，用對目的性狀不具有已知效果的構(gòu)建體，諸如包含標(biāo)記基因的構(gòu)建體)轉(zhuǎn)化的植物或植物細(xì)胞；(c)為主題植物或植物細(xì)胞的子代中的非轉(zhuǎn)化分離子的植物或植物細(xì)胞；(d)在遺傳上與主題植物或植物細(xì)胞相同但不暴露于會誘導(dǎo)目的基因的表達的條件或刺激因素的植物或植物細(xì)胞；或者(e)處于目的基因不被表達的條件下的主題植物或植物細(xì)胞本身。在本公開中，WT、ZH11-TC、VC和CK指示對照植物。WT表示野生型稻或擬南芥植株，ZH11-TC表示從組織培養(yǎng)的中花11產(chǎn)生的稻植株，VC表示用DP0005或DP0009的空載體轉(zhuǎn)化的植株，并且CK表示分離的無效植株。“基因組”應(yīng)用于植物細(xì)胞時，不僅涵蓋細(xì)胞核內(nèi)存在的染色體DNA，而且涵蓋細(xì)胞的亞細(xì)胞組分(例如線粒體、質(zhì)體)內(nèi)存在的細(xì)胞器DNA?！爸参铩卑▽φ曛参?、植物器官、植物組織、種子和植物細(xì)胞以及它們的子代的標(biāo)引。植物細(xì)胞包括但不限于來自種子、懸浮培養(yǎng)物、胚芽、分生區(qū)域、愈傷組織、葉、根、苗、配子體、孢子體、花粉和小孢子的細(xì)胞?！白哟卑参锏娜魏魏罄m(xù)世代?！稗D(zhuǎn)基因植物”包括對在其基因組內(nèi)包含異源多核苷酸的植物的標(biāo)引。例如，異源多核苷酸穩(wěn)定地整合在基因組內(nèi)，使得該多核苷酸得以傳遞到連續(xù)世代。異源多核苷酸可單獨地或者作為重組DNA構(gòu)建體的一部分整合到基因組中。T0植株直接從轉(zhuǎn)化和再生過程中回收。T0植株的子代稱為T1(第一代子代)、T2(第二代子代)等。與序列有關(guān)的“異源”是指該序列源于外來物種，或者，如果源于同一物種的話，則是通過蓄意人為干預(yù)對其天然形式在組成和/或基因座方面進行實質(zhì)性修飾得到的序列?！岸嗪塑账帷薄ⅰ昂怂嵝蛄小?、“核苷酸序列”和“核酸片段”可互換使用并且是指單鏈或者雙鏈的RNA和/或DNA的聚合物，其任選含有合成的、非天然的或改變的核苷酸堿基。-核苷酸(通常以其5′-單磷酸鹽形式存在)通過如下的單字母代碼指代：“A”表示腺苷酸或脫氧腺苷酸，“C”表示胞苷酸或脫氧胞苷酸，并且“G”表示鳥苷酸或脫氧鳥苷酸，分別對應(yīng)RNA或DNA；“U”表示尿苷酸；“T”表示脫氧胸苷酸；“R”表示嘌呤(A或G)；“Y”表示嘧啶(C或T)；“K”表示G或T；“H”表示A或C或T；“I”表示肌苷；并且“N”表示任一核苷酸?！岸嚯摹?、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白質(zhì)”在本文中可互換使用，指氨基酸殘基的聚合物。這些術(shù)語適用于其中一個或多個氨基酸殘基為相應(yīng)的天然存在的氨基酸的人工化學(xué)類似物的氨基酸聚合物，以及適用于天然存在的氨基酸聚合物。術(shù)語“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白質(zhì)”還可以包括如下修飾，包括但不限于：糖基化、脂質(zhì)連接和硫酸化、谷氨酸殘基的γ-羧化、羥化和ADP-核糖基化?！靶攀筊NA(mRNA)”指沒有內(nèi)含子且可被細(xì)胞翻譯成蛋白質(zhì)的RNA?！癱DNA”指與mRNA模板互補且用反轉(zhuǎn)錄酶從mRNA模板合成的DNA。cDNA可以是單鏈的，或者可用DNA聚合酶I從Klenow片段轉(zhuǎn)化成雙鏈形式。“成熟”蛋白是指經(jīng)翻譯后加工的多肽；即，初級翻譯產(chǎn)物中存在的任何前肽或原肽被移除。“前體”蛋白是指mRNA的初級翻譯產(chǎn)物；即，前肽和原肽仍然存在。前肽和原肽可以是并且不限于細(xì)胞內(nèi)定位信號?！胺蛛x的”是指這樣的物質(zhì)，諸如核酸分子和/或蛋白質(zhì)，該物質(zhì)基本上不含在天然存在的環(huán)境中通常與其相伴隨或相互作用的組分，或者說是該物質(zhì)被從所述組分移出。分離的多核苷酸可從它們天然存在于其中的宿主細(xì)胞純化。技術(shù)人員已知的常規(guī)核酸純化方法可用于獲得分離的多核苷酸。該術(shù)語也涵蓋重組多核苷酸和化學(xué)合成的多核苷酸。“重組的”是指例如通過化學(xué)合成或者通過用基因工程技術(shù)操縱分離的核酸區(qū)段來實現(xiàn)的兩個原本分離的序列區(qū)段的人工組合?！爸亟M的”也包括指涉已經(jīng)通過引入異源核酸而進行了修飾的細(xì)胞或載體，或源自經(jīng)過這樣修飾的細(xì)胞的細(xì)胞，但不涵蓋天然發(fā)生的事件(例如自發(fā)突變、自然轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)導(dǎo)/轉(zhuǎn)座)對細(xì)胞或載體的改變，所述天然發(fā)生的事件諸如不經(jīng)蓄意人為干預(yù)而發(fā)生的那些事件?！爸亟MDNA構(gòu)建體”是指在自然界中通常不會一起存在的核酸片段的組合。因此，重組DNA構(gòu)建體可以包含源自不同來源的調(diào)控序列和編碼序列，或者源自相同來源、但是以不同于自然界中存在的方式排列的調(diào)控序列和編碼序列。術(shù)語“入門克隆”和“入門載體”在本文可互換使用?！罢{(diào)控序列”是指位于編碼序列上游(5′非編碼序列)、內(nèi)部或下游(3′非編碼序列)并且影響相關(guān)聯(lián)編碼序列的轉(zhuǎn)錄、RNA加工或穩(wěn)定性、或翻譯的核苷酸序列。調(diào)控序列可以包括但不限于啟動子、翻譯前導(dǎo)序列、內(nèi)含子、以及聚腺苷酸化識別序列。術(shù)語“調(diào)控序列”和“調(diào)控元件”在本文中可互換使用?！皢幼印笔侵改軌蚩刂屏硪缓怂崞蔚霓D(zhuǎn)錄的核酸片段?！霸谥参镏杏泄δ艿膯幼印笔侵改軌蚩刂浦参锛?xì)胞中的基因轉(zhuǎn)錄的啟動子，無論其是否來源于植物細(xì)胞?！敖M織特異性啟動子”和“組織優(yōu)選啟動子”可指主要但未必專門在一種組織或器官中表達，但是也可以在一種特定細(xì)胞或細(xì)胞類型中表達的啟動子。“發(fā)育調(diào)控的啟動子”是指其活性由發(fā)育事件確定的啟動子。“可操作地連接”是指核酸片段聯(lián)結(jié)成單一片段，使得一個核酸片段的功能受到另一個核酸片段的調(diào)控。例如，在啟動子能夠調(diào)控核酸片段的轉(zhuǎn)錄時，該啟動子與該核酸片段可操作地連接?！氨磉_”是指功能產(chǎn)物的產(chǎn)生。例如，核酸片段的表達可指核酸片段的轉(zhuǎn)錄(例如生成mRNA或功能RNA的轉(zhuǎn)錄)和/或mRNA翻譯成前體或成熟蛋白質(zhì)。“表型”意指細(xì)胞或生物體的可檢測的特征。在將核酸片段(例如，重組DNA構(gòu)建體)插入細(xì)胞中的語境中，“引入”意指“轉(zhuǎn)染”或“轉(zhuǎn)化”或“轉(zhuǎn)導(dǎo)”，并且包括指代將核酸片段摻入到真核或原核細(xì)胞中，其中該核酸片段可摻入到細(xì)胞的基因組(例如染色體、質(zhì)粒、質(zhì)體或線粒體DNA)中，轉(zhuǎn)化成自主復(fù)制子或瞬時表達(例如，轉(zhuǎn)染的mRNA)?！稗D(zhuǎn)化的細(xì)胞”是任何其中已引入了核酸片段(例如重組DNA構(gòu)建體)的細(xì)胞。本文所用的“轉(zhuǎn)化”是指穩(wěn)定轉(zhuǎn)化和瞬時轉(zhuǎn)化兩者?！胺€(wěn)定轉(zhuǎn)化”是指核酸片段引入到宿主生物的基因組中而得到遺傳學(xué)上穩(wěn)定的遺傳。一旦穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，該核酸片段就穩(wěn)定整合在該宿主生物及任何后續(xù)世代的基因組中。“瞬時轉(zhuǎn)化”是指核酸片段引入到宿主生物的細(xì)胞核或者含DNA的細(xì)胞器中而得到?jīng)]有遺傳學(xué)上穩(wěn)定遺傳的基因表達?！暗任换颉笔腔蛘紦?jù)染色體上給定基因座的兩種或更多種另選形式之一。當(dāng)二倍體植物中一對同源染色體上的給定基因座處存在的等位基因相同時，該植物在該基因座處是純合的。如果二倍體植物中一對同源染色體上的給定基因座處存在的等位基因不同，則該植物在該基因座處是雜合的。如果在二倍體植物中一對同源染色體中的僅一條染色體上存在轉(zhuǎn)基因，則該植物在該基因座處是半合的。“葉綠體轉(zhuǎn)運肽”是與蛋白質(zhì)一起翻譯并且將該蛋白質(zhì)引導(dǎo)至葉綠體或其中制備該蛋白質(zhì)的細(xì)胞中存在的其它質(zhì)體類型的氨基酸序列?！叭~綠體轉(zhuǎn)運序列”是指編碼葉綠體轉(zhuǎn)運肽的核苷酸序列?！靶盘栯摹笔桥c蛋白質(zhì)一起翻譯并且將該蛋白質(zhì)引導(dǎo)至分泌系統(tǒng)的氨基酸序列(Chrispeels.(1991)Ann.Rev.PlantPhys.PlantMol.Biol.42：21-53)。如果蛋白質(zhì)將被引導(dǎo)至液泡，那么還可添加液泡靶向信號(出處同上)，或者如果引導(dǎo)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，那么可添加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(出處同上)。如果蛋白質(zhì)將被引導(dǎo)至細(xì)胞核，那么應(yīng)去除任何存在的信號肽并且相反地包括核定位信號(Raikhel.(1992)PlantPhys.100：1627-1632)?！熬€粒體信號肽”是將前體蛋白引導(dǎo)到線粒體中的氨基酸序列(Zhang和Glaser.(2002)TrendsPlantSci7：14-21)。確定各種多核苷酸和多肽序列的關(guān)系的方法是已知的。如本文所用，“參考序列”是用作序列比較基準(zhǔn)的限定的序列。參考序列可以是指定序列的子集或全體；諸如全長cDNA或基因序列的區(qū)段，或者可以是完全的cDNA或基因序列。如本文所用，“比較窗口”是指多核苷酸或多肽序列的連續(xù)和指定的區(qū)段，其中該比較窗口中的該序列相比于參考序列(不包含添加或缺失)可包含添加或缺失(即空位)，以便兩條序列的最佳比對。通常，比較窗口長度為至少20個連續(xù)核苷酸或氨基酸，并且任選地可為30、40、50、100個或者更長。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，為避免由于在序列中加入空位所致的與參考序列的高度相似性，通常引入空位罰分并從匹配數(shù)扣除空位罰分。任何兩條序列之間的序列同一性百分比的確定可使用數(shù)學(xué)算法來完成。用于序列比較的此類數(shù)學(xué)算法的示例包括Myers和Miller.(1988)CABIOS4：11-17的算法；Smith等人(1981)Adv.Appl.Math.2：482的局部比對算法；Needleman和Wunsch.(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的全局比對算法；Pearson和Lipman.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：2444-2448的局部搜索比對方法；Karlin和Altschul.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA872264的算法，如Karlin和Altschul.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：5873-5877中所改進的?？衫眠@些數(shù)學(xué)算法的計算機執(zhí)行進行序列的比較以確定序列同一性。此類執(zhí)行包括但不限于：PC/Gene程序(可購自Intelligenetics，MountainView，California)中的CLUSTAL；GCGWisconsinGeneticsSoftwarePackage版本10(可購自AccelrysInc.，9685ScrantonRoad，SanDiego，California，USA)中的ALIGN程序(版本2.0)和GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA；以及生物信息學(xué)計算軟件包(Inc.，Madison，WI)的程序。使用這些程序的比對可以使用默認(rèn)參數(shù)進行。以下文獻對CLUSTAL程序進行了詳細(xì)描述：Higgins等人(1988)Gene73：237-244；Higgins等人(1989)CABIOS5：151-153；Corpet等人(1988)NucleicAcidsRes.16：10881-10890；Huang等人(1992)CABIOS8：155-165andPearson等人(1994)Meth.Mol.Biol.24：307-331。ALIGN程序基于Myers和Miller(1988)(出處同上)的算法。當(dāng)比較氨基酸序列時，ALIGN程序可使用PAM120加權(quán)殘基表(weightresiduetable)、空位長度罰分12和空位罰分4。Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403的BLAST程序基于Karlin和Altschul(1990)(出處同上)的算法。BLAST核苷酸搜索可用BLASTN程序、得分＝100、字長＝12來進行，以獲得與編碼本公開蛋白質(zhì)的核苷酸序列同源的核苷酸序列。BLAST蛋白質(zhì)搜索可用BLASTN程序、score(得分)＝50、wordlength(字長)＝3來進行，以獲得與本公開的蛋白質(zhì)或多肽同源的氨基酸序列。為了出于比較目的獲得帶空位的比對結(jié)果，可以如Altschul等人(1997)NucleicAcidsRes.25：3389中所述利用GappedBLAST(在BLAST2.0中)。另選地，PSI-BLAST(在BLAST2.0中)可用于執(zhí)行檢測分子之間遠源關(guān)系的迭代搜索(Altschul等人(1997)，出處同上)。當(dāng)利用BLAST時，可使用GappedBLAST、PSI-BLAST以及相應(yīng)程序的默認(rèn)參數(shù)(例如，BLASTN用于核苷酸序列，BLASTX用于蛋白質(zhì))(美國政府的國家衛(wèi)生研究院(NationalInstitutesofHealth)的國家醫(yī)學(xué)圖書館(NationalLibraryofMedicine)的國家生物技術(shù)信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation))。比對可以通過手動檢測進行。配對序列同一性/相似性值可使用GAP版本10利用以下參數(shù)獲得：核苷酸序列的％同一性和％相似性采用GAP權(quán)重50和長度權(quán)重3以及nwsgapdna.cmp評分矩陣；氨基酸序列的％同一性和％相似性采用GAP權(quán)重8和長度權(quán)重2以及BLOSUM62評分矩陣；以及它們的任何等同程序。所謂“等同程序”意指任何這樣的序列比較程序，其對于任何兩條所考慮的序列，相比于GAP版本10所產(chǎn)生的對應(yīng)的比對，產(chǎn)生出具有相同的核苷酸或氨基酸殘基匹配和相同的序列同一性百分比的比對。GAP使用Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的算法，以找到兩個完全序列的比對，該比對使匹配數(shù)最大并使空位數(shù)最小。GAP考慮所有可能的比對和空位位置，并產(chǎn)生具有最大數(shù)目的匹配堿基和最少的空位的比對。它使得可以提供以匹配堿基為單位的空位形成罰分和空位延伸罰分。GAP對于其插入的每個空位，必須利用匹配的空位形成罰分?jǐn)?shù)。如果選擇大于零的空位延伸罰分，GAP對于每個插入的空位必須另外利用空位長度乘以空位延伸罰分。對于蛋白質(zhì)序列，GCGWisconsinGeneticsSoftwarePackage的版本10中的默認(rèn)空位形成罰分值和空位延伸罰分值分別為8和2。對于核苷酸序列，默認(rèn)空位形成罰分為50，而默認(rèn)空位延伸罰分為3?？瘴恍纬闪P分和空位延伸罰分可以以選自0至200的整數(shù)來表示。因此，例如，空位形成罰分和空位延伸罰分可為0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65或更大。GAP給出該家族中的具有最佳比對的一個成員?？赡艽嬖谶@個家族的許多成員，但其它成員不具有更好的品質(zhì)。GAP顯示用于比對的四個優(yōu)值因素：品質(zhì)、比率、同一性和相似性。品質(zhì)是為了將序列進行比對而最大化的指標(biāo)(metric)。比率是品質(zhì)除以較短片段中的堿基數(shù)。同一性百分比是實際匹配的符號的百分比。相似性百分比是相似的符號的百分比。將相應(yīng)于空位的符號忽略。當(dāng)一對符號的評分矩陣值大于或等于0.50(相似性閾值)時，評定為相似性。GCGWisconsinGeneticsSoftwarePackage的版本10中使用的評分矩陣為BLOSUM62(Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：10915)。除非另行指出，本文提供的序列的多重比對使用ClustalV比對方法(Higgins和Sharp.(1989)CABIOS.5：151-153)，利用默認(rèn)參數(shù)(空位罰分＝10，空位長度罰分＝10)進行。用于使用ClustalV方法進行氨基酸序列的逐對比對和同一性百分比計算的默認(rèn)參數(shù)是KTUPLE＝1、空位罰分＝3，窗口＝5以及對角線保存(DIAGONALSSAVED)＝5。對于核酸，這些參數(shù)是KTUPLE＝2、空位罰分＝5，窗口＝4，對角線保存＝4。在用ClustalV程序進行序列比對后，有可能通過觀察相同程序上的“序列距離”表來獲得“同一性百分比”和“趨異度”值。除非另行指出，本文提供并受權(quán)利要求書保護的同一性百分比和趨異度以此方式計算。如本文所用，“序列同一性”或“同一性”在兩個多核苷酸或多肽序列的情形中是指當(dāng)在指定的比較窗口上進行比對以獲得最大對應(yīng)時兩個序列中相同的殘基。當(dāng)序列同一性百分比針對蛋白質(zhì)使用時，認(rèn)識到不相同的殘基位置往往差別在于保守氨基酸置換，其中氨基酸殘基由具有相似化學(xué)性質(zhì)(例如電荷或疏水性)的其它氨基酸殘基置換，因此不會改變分子的功能性質(zhì)。當(dāng)序列差別在于保守置換，則可以上調(diào)序列同一性百分比以校正置換的保守性質(zhì)。差別在于這種保守置換的序列被稱為具有“序列相似性”或“相似性”。用于作出這個調(diào)整的手段是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。通常，這涉及將保守置換評定為部分錯配而不是完全錯配，從而增加序列同一性百分比。因此，例如，如果相同的氨基酸給予1分，非保守置換給予0分，則保守置換給予0至1之間的得分。保守置換的評分是例如在程序PC/GENE(Intelligenetics，MountainView，Califomia)中所執(zhí)行那樣進行計算。如本文所用，“序列同一性百分比”通過以下方式計算：確定在兩個序列中出現(xiàn)相同核酸堿基或氨基酸殘基的位置的數(shù)目以得到匹配的位置的數(shù)目，將匹配的位置的數(shù)目除以比較窗口中位置的總數(shù)目，然后將結(jié)果乘以100。本文使用的標(biāo)準(zhǔn)重組DNA和分子克隆技術(shù)是本領(lǐng)域所熟知的，并且在如下文獻中更全面地描述：Sambrook，J.、Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，MolecularCloning：ALaboratoryManual；ColdSpringHarborLaboratoryPress：ColdSpringHarbor，1989(下文“Sambrook”)。實施方案包括分離的多核苷酸和多肽，以及可用于賦予耐旱性的重組DNA構(gòu)建體；包含這些重組DNA構(gòu)建體的組合物(諸如植物或種子)；以及利用這些重組DNA構(gòu)建體的方法。分離的多核苷酸和多肽：本公開包括以下分離的多核苷酸和多肽：一種分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸包含：(i)編碼多肽的核酸序列，所述多肽基于ClustalV比對方法與SEQIDNO：4具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的序列同一性；或(ii)(i)的核酸序列的全長互補序列，其中(i)的核酸序列和全長互補序列由相同數(shù)目的核苷酸組成并且100％互補。上述分離的多核苷酸中的任一個可用于本公開的任何重組DNA構(gòu)建體。編碼的多肽的過表達增加植物耐旱性和/或百草枯耐受性活性。一種具有氨基酸序列的分離的多肽，所述氨基酸序列基于ClustalV比對方法與SEQIDNO：4具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的序列同一性。多肽優(yōu)選為DN-DTP1多肽。多肽的過表達增加植物耐旱性和/或百草枯耐受性活性。一種分離的多核苷酸，其包含(i)基于ClustalV比對方法與SEQIDNO：3具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的序列同一性的核酸序列；或(ii)(i)的核酸序列的全長互補序列。上述分離的多核苷酸中的任一個可用于本公開的任何重組DNA構(gòu)建體。分離的多核苷酸優(yōu)選地編碼DN-DTP1多肽。這種多肽的過表達改善植物耐旱性和/或百草枯耐受性活性。重組DNA構(gòu)建體：在一個方面，本公開包括重組DNA構(gòu)建體。在一個實施方案中，重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接到至少一個調(diào)控序列(例如，在植物中有功能的啟動子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含(i)編碼基于ClustalV比對方法與SEQIDNO：4具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的序列同一性的氨基酸序列的核酸序列；或(ii)(i)的核酸序列的全長互補序列。在另一個實施方案中，重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接到至少一個調(diào)控序列(例如，在植物中有功能的啟動子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含(i)基于ClustalV比對方法與SEQIDNO：3具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的序列同一性的核酸序列；或(ii)(i)的核酸序列的全長互補序列。在另一個實施方案中，重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接到至少一個調(diào)控序列(例如，在植物中有功能的啟動子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼DN-DTP1多肽。此多肽具有耐旱性和/或百草枯耐受性活性，并且可來自例如水稻、澳洲野生稻(Oryzaaustraliensis)、短舌野生稻(Oryzabarthii)、光稃稻(Oryzaglaberrima)(非洲稻)、闊葉稻(Oryzalatifolia)、長雄野生稻(Oryzalongistaminata)、南方野生稻(Oryzameridionalis)、藥用稻(Oryzaofficinalis)、斑點野生稻(Oryzapunctata)、鬼仔稻(Oryzarufipogon)(普通野生稻或紅稻)、尼伐拉稻(Oryzanivara)(印度野生稻)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)、玉米(Zeamays)、大豆(Glycinemax)、煙豆(Glycinetabacina)、野大豆(Glycinesoja)或短絨野大豆(Glycinetomentella)。應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會知道，本公開不僅僅涵蓋特定的示例性序列。在給定位點產(chǎn)生化學(xué)等同的氨基酸，但不影響編碼多肽的功能特性的核酸片段變化是本領(lǐng)域熟知的。例如，疏水氨基酸丙氨酸的密碼子可被編碼另一個疏水性較小的殘基諸如甘氨酸，或疏水性較大的殘基諸如纈氨酸、亮氨酸或異亮氨酸的密碼子置換。類似地，還可預(yù)期一個帶負(fù)電的殘基置換為另一個，諸如天冬氨酸置換為谷氨酸，或一個帶正電的殘基置換為另一個，諸如賴氨酸置換為精氨酸的變化產(chǎn)生功能等同的產(chǎn)物。還可預(yù)期使多肽分子的N-端和C-端部分改變的核苷酸變化不會改變多肽的活性。每個所推薦的改變均在本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)內(nèi)，正如確定編碼產(chǎn)物的生物活性的保留。調(diào)控序列：本公開的重組DNA構(gòu)建體可包含至少一個調(diào)控序列。調(diào)控序列可為啟動子。多種啟動子可用于本公開的重組DNA構(gòu)建體。啟動子可基于期望的結(jié)果進行選擇，并且可包括組成型啟動子、組織特異性啟動子、誘導(dǎo)型啟動子、或其它用于在宿主生物中的表達的啟動子。使得基因在大多數(shù)時間在大多數(shù)細(xì)胞類型中表達的啟動子通常稱為“組成型啟動子”。候選基因在35S或UBI啟動子的控制下的高水平的組成型表達可具有多效作用，但是可估計在由組成型啟動子驅(qū)動時候選基因的功效。組織特異性和/或脅迫誘導(dǎo)型啟動子的使用可消除不期望的效果，但保持了增強耐旱性的能力。這種效應(yīng)已經(jīng)在擬南芥中觀察到(Kasuga等人(1999)NatureBiotechnol.17：287-91)。適用于植物宿主細(xì)胞的組成型啟動子包括例如WO99/43838和美國專利6,072,050中公開的Rsyn7啟動子和其它組成型啟動子的核心啟動子；CaMV35S核心啟動子(Odell等人(1985)Nature313：810-812)；稻肌動蛋白(McElroy等人(1990)PlantCell2：163-171)；遍在蛋白(Christensen等人(1989)PlantMol.Biol.12：619-632以及Christensen等人(1992)PlantMol.Biol.18：675-689)；pEMU(Last等人(1991)Theor.Appl.Genet.81：581-588)；MAS(Velten等人(1984)EMBOJ.3：2723-2730)；ALS啟動子(美國專利5,659,026)，等等。其它組成型啟動子包括例如以下美國專利中論述的那些：5,608,149、5,608,144、5,604,121、5,569,597、5,466,785、5,399,680、5,268,463、5,608,142、以及6,177,611。在選擇用于本公開的方法的啟動子時，可希望使用組織特異性啟動子或發(fā)育調(diào)控的啟動子。組織特異性啟動子或發(fā)育調(diào)控的啟動子是DNA序列，其選擇性地調(diào)控DNA序列在植物的細(xì)胞/組織中，諸如在對于雄穗發(fā)育、種子形成、或兩者至關(guān)重要的那些細(xì)胞/組織中的表達，并且通常將這種DNA序列的表達限于植物的感興趣的發(fā)育期(例如雄穗發(fā)育或種子成熟)。使得期望的時間和空間表達的任何可鑒定的啟動子可用于本公開的方法中。許多葉優(yōu)選的啟動子在本領(lǐng)域中是已知的(Yamamoto等人(1997)PlantJ.12(2)：255-265；Kwon等人(1994)PlantPhysiol.105：357-367；Yamamoto等人(1994)PlantCellPhysiol.35(5)：773-778；Gotor等人(1993)PlantJ.3：509-518；Orozco等人(1993)PlantMol.Biol.23(6)：1129-1138；以及Matsuoka等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(20)：9586-9590)。為種子或胚特異性且可用于本公開的啟動子包括大豆Kunitz胰蛋白酶抑制劑(Kti3，Jofuku和Goldberg.(1989)PlantCell1：1079-1093)、convicilin、豌豆球蛋白和豆球蛋白(豌豆子葉)(Rerie，W.G.等人(1991)Mol.Gen.Genet.259：149-157；Newbigin，E.J.等人(1990)Planta180：461-470；Higgins，T.J.V.等人(1988)Plant.Mol.Biol.11：683-695)、玉米蛋白(玉米胚乳)(Schemthaner，J.P.等人(1988)EMBOJ.7：1249-1255)、菜豆蛋白(菜豆子葉)(Segupta-Gopalan，C.等人(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.82：3320-3324)、植物凝集素(菜豆子葉)(Voelker，T.等人(1987)EMBOJ.6：3571-3577)、B-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白(大豆子葉)(Chen，Z-L等人(1988)EMBOJ.7：297-302)、谷蛋白(稻胚乳)、大麥醇溶蛋白(大麥胚乳)(Marris，C.等人(1988)PlantMol.Biol.10：359-366)、麥谷蛋白和麥醇溶蛋白(小麥胚乳)(Colot，V.等人(1987)EMBOJ.6：3559-3564)?？刹僮鞯剡B接到嵌合基因構(gòu)造中的異源編碼區(qū)的種子特異性基因的啟動子在轉(zhuǎn)基因植物中保持它們的時間和空間表達模式。此類示例包括：用以在擬南芥和甘藍型油菜種子中表達腦啡肽的擬南芥2S種子貯藏蛋白基因啟動子(Vanderkerckhove等人(1989)Bio/Technology7：L929-932)、用以表達熒光素酶的菜豆凝集素和菜豆β-菜豆蛋白啟動子(Riggs等人(1989)PlantSci.63：47-57)、以及用以表達氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶的小麥麥谷蛋白啟動子(Colot等人(1987)EMBOJ6：3559-3564)。誘導(dǎo)型啟動子響應(yīng)于內(nèi)源性或外源性刺激的存在，例如通過化學(xué)化合物(化學(xué)誘導(dǎo)劑)或響應(yīng)于環(huán)境、激素、化學(xué)和/或發(fā)育信號選擇性地表達可操作地連接的DNA序列。誘導(dǎo)型或調(diào)控型啟動子包括例如，通過光、熱、脅迫、洪澇或干旱、植物激素、創(chuàng)傷或化學(xué)品諸如乙醇、茉莉酮酸酯、水楊酸或安全劑調(diào)控的啟動子。在某些實施方案中使用的啟動子包括以下：1)脅迫誘導(dǎo)型啟動子RD29A(Kasuga等人(1999)NatureBiotechnol.17：287-291)；2)脅迫誘導(dǎo)型啟動子Rab17(Vilardell等人(1991)PlantMol.Bio.17：985-993；KampBusk等人(1997)PlantJ11(6)：1285-1295)；3)大麥啟動子B22E，其表達對于發(fā)育中的玉米谷粒的花梗是特異性的(“PrimaryStructureofaNovelBarleyGeneDifferentiallyExpressedinImmatureAleuroneLayers”.Klemsdal，S.S.等人(1991)Mol.Gen.Genet.228(1/2)：9-16)；以及4)玉米啟動子Zag2(“IdentificationandmolecularcharacterizationofZAG1，themaizehomologoftheArabidopsisfloralhomeoticgeneAGAMOUS”，Schmidt，R.J.等人(1993)PlantCell5(7)：729-737；“Structuralcharacterization，chromosomallocalizationandphylogeneticevaluationoftwopairsofAGAMOUS-likeMADS-boxgenesfrommaize”，Theissen等人(1995)Gene156(2)：155-166；NCBIGenBank登錄號X80206))。Zag2轉(zhuǎn)錄物可在授粉前5天至授粉后7至8天(“DAP”)檢測到，并且指導(dǎo)在發(fā)育中的雌性花序的心皮中的表達，以及對于發(fā)育中的玉米谷粒的核具有特異性的Ciml。Ciml轉(zhuǎn)錄物在授粉前4至5天至授粉后6至8天檢測到。其它可用的啟動子包括可來源于其表達與發(fā)育中的雌性小花母系相關(guān)的基因的任何啟動子。對于多核苷酸在發(fā)育中的種子組織中的表達，特別有意義的啟動子包括種子優(yōu)選的啟動子，尤其是早期谷粒/胚啟動子和晚期谷粒/胚啟動子。授粉后谷粒發(fā)育大致分成三個主要階段。谷粒生長的停滯期發(fā)生在授粉后約0至10-12天。在此期間，谷粒的質(zhì)量不顯著生長，而是發(fā)生將決定谷?；盍Φ闹匾录?例如，建成細(xì)胞數(shù)目)。線性籽粒灌漿期(lineargrainfillstage)起始于授粉后約10-12天并且持續(xù)至授粉后約40天。在谷粒發(fā)育的這一階段，谷粒獲得幾乎所有其最終質(zhì)量，并且產(chǎn)生了各種貯藏產(chǎn)物(即淀粉、蛋白質(zhì)、油)。最后，成熟期發(fā)生于從授粉后約40天至收獲。在谷粒發(fā)育的這一階段，谷粒變得靜止并且開始干燥，為發(fā)芽之前的長休眠期做準(zhǔn)備。如本文所定義，“早期谷粒/胚啟動子”是主要在發(fā)育的停滯期(即授粉后約0至約12天)期間驅(qū)動在發(fā)育中的種子中的表達的啟動子。如本文所定義，“晚期谷粒/胚啟動子”主要在授粉后約12天至成熟期間驅(qū)動在發(fā)育中的種子中的表達。在表達窗中可存在一些重疊。啟動子的選擇將取決于所用的ABA相關(guān)序列和期望的表型。早期谷粒/胚啟動子包括例如在特定組織中在授粉后5天具有活性的Ciml(WO00/11177)，所述專利以引用方式并入本文。其它早期谷粒/胚啟動子包括在授粉后7-10天具有活性的種子優(yōu)選的啟動子endl和在授粉后9-14天在整個谷粒中具有活性且在授粉后10天在胚乳和果皮中具有活性的end2(WO00/12733)，所述專利以引用方式并入本文。可用于本公開的某些方法的另外的早期谷粒/胚啟動子包括種子優(yōu)選的啟動子ltp2(美國專利5,525,716)；玉米Zm40啟動子(美國專利6,403,862)；玉米nuclc(美國專利6,407,315)；玉米ckx1-2啟動子(美國專利6,921,815和美國專利申請公布號2006/0037103)；玉米lecl啟動子(美國專利7,122,658)；玉米ESR啟動子(美國專利7,276,596)；玉米ZAP啟動子(美國專利申請公布號20040025206和20070136891)；玉米啟動子eepl(美國專利申請公布號20070169226)；以及玉米啟動子ADF4(美國專利申請60/963,878，2007年8月7日提交)。用于調(diào)控本公開的核苷酸序列在植物中的表達的另外的啟動子是莖特異性啟動子，包括苜蓿S2A啟動子(GenBank登錄號EF030816；Abrahams等人(1995)PlantMol.Biol.27：513-528)和S2B啟動子(GenBank登錄號EF030817)等，所述參考文獻以引用方式并入本文。啟動子可以完全源自天然基因，或由源自天然存在的不同啟動子的不同元件組成，或甚至包含合成性DNA區(qū)段。用于本公開的某些實施方案的啟動子可包括：RIP2、mLIP15、ZmCOR1、Rab17、CaMV35S、RD29A、B22E、Zag2、SAM合成酶、ubiquitin、CaMV19S、nos、Adh、蔗糖合成酶、R-等位基因、維管組織優(yōu)選的啟動子S2A(Genbank登錄號EF030816)和S2B(Genbank登錄號EF030817)，以及來自玉米的組成型啟動子GOS2；根優(yōu)選啟的動子，諸如玉米NAS2啟動子、玉米Cyclo啟動子(US2006/0156439，公布于2006年7月13日；US7,268,226，公布于2007年9月11日)、玉米ROOTMET2啟動子(WO05063998，公布于2005年7月14日；U.S.7,214,855，公布于2007年5月8日)、CR1BIO啟動子(WO06055487，公布于2006年5月26日；U.S.7,268,270，公布于2007年9月11日；U.S.7,456,334，公布于2008年11月25日)、CRWAQ81啟動子(WO05035770，公布于2005年4月21日；U.S.7,411，112，公布于2008年8月12日)以及玉米ZRP2.47啟動子(NCBI登錄號U38790；GINo.1063664)。本公開的重組DNA構(gòu)建體還可包含其它調(diào)控序列，包括但不限于翻譯前導(dǎo)序列、內(nèi)含子、以及聚腺苷酸化識別序列。在某些實施方案中，重組DNA構(gòu)建體還包含增強子或沉默子。可將內(nèi)含子序列添加至5′非翻譯區(qū)、蛋白質(zhì)編碼區(qū)或3′非翻譯區(qū)以增加在細(xì)胞溶膠中積聚的成熟信息的量。在植物和動物表達構(gòu)建體中的轉(zhuǎn)錄單位中包含可剪接的內(nèi)含子，已證實在mRNA水平上和蛋白水平上都能增加基因表達最高達1000倍(Buchman和Berg.(1988)Mol.CellBiol.8：4395-4405；Callis等人(1987)GenesDev.1：1183-1200)。任何植物可被選擇用于鑒定待用于本公開的重組DNA構(gòu)建體的調(diào)控序列和DN-DTP1多肽基因。用于分離基因和調(diào)控序列的合適的植物靶標(biāo)的示例將包括但不限于：苜蓿、蘋果、杏、擬南芥、洋薊、芝麻菜、蘆筍、鱷梨、香蕉、大麥、菜豆、甜菜、黑莓、藍莓、西蘭花、芽甘藍、卷心菜、卡諾拉、香瓜、胡蘿卜、木薯、蓖麻、菜花、芹菜、櫻桃、菊苣、芫荽葉、柑橘、克萊門式小柑橘、三葉草、椰子、咖啡、玉米、棉花、越橘、黃瓜、花旗松、茄子、萵苣菜、茅菜、桉樹、茴香、無花果、大蒜、葫蘆、葡萄、柚子、蜜露、豆薯、奇異果、萵苣、韭菜、檸檬、酸橙、火炬松、亞麻籽、芒果、甜瓜、蘑菇、蜜桃、堅果、燕麥、油棕、蕓苔、秋葵、橄欖、洋蔥、桔子、觀賞植物、棕櫚、番木瓜樹、歐芹、歐洲防風(fēng)草、豌豆、桃樹、花生、梨樹、胡椒、柿樹、松樹、菠蘿、車前草、李子、石榴、白楊、馬鈴薯、南瓜、溫柏、輻射松、紅菊苣、蘿卜、油菜籽、樹莓、稻、裸麥、高粱、南方松、大豆、菠菜、南瓜、草莓、糖用甜菜、甘蔗、向日葵、甘薯、楓香樹、柳枝稷、橘子、茶樹、煙草、番茄、黑小麥、草、蕪菁、葡萄樹、西瓜、小麥、山藥以及西葫蘆。組合物：本公開的組合物是一種植物，所述植物在其基因組中包含本公開的重組DNA構(gòu)建體中的任一個(諸如以上論述的構(gòu)建體中的任一個)。組合物還包括所述植物的任何子代，以及由植物或其子代獲得的任何種子，其中子代或種子在其基因組內(nèi)包含重組DNA構(gòu)建體。子代包括通過植物的自花授粉或異型雜交獲得的后續(xù)世代。子代還包括雜交種和近交系。在雜交種子繁殖的作物中，可將成熟的轉(zhuǎn)基因植物進行自花授粉以產(chǎn)生純合的近交植物。近交植物產(chǎn)生含有新引入的重組DNA構(gòu)建體的種子。這些種子可生長以產(chǎn)生將表現(xiàn)出改變的農(nóng)學(xué)特性(例如，任選在水分限制條件下具有增強的農(nóng)學(xué)特性)的植株，或這些種子用于育種程序以產(chǎn)生雜交種子，所述雜交種子可生長以產(chǎn)生將表現(xiàn)出此類改變的農(nóng)學(xué)特性的植株。種子可為玉米種子或稻種子。植物可以是單子葉植物或雙子葉植物，例如稻或玉米或大豆植物，諸如玉米雜交植物或玉米近交植物。植物還可以是向日葵、高粱、卡諾拉、小麥、苜蓿、棉花、大麥、粟、甘蔗或柳枝稷。重組DNA構(gòu)建體可穩(wěn)定整合到植物的基因組中。具體實施方案包括但不限于以下：1.一種在其基因組中包含重組DNA構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植物(例如，稻或玉米或大豆植物)，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接到至少一個調(diào)控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼包含基于ClustalV比對方法與SEQIDNO：4具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽，并且其中與對照植物相比，所述植物表現(xiàn)出增加的耐旱性和/或百草枯耐受性。與對照植物相比，所述植物還可表現(xiàn)出至少一個農(nóng)學(xué)特性的改變。2.一種在其基因組中包含重組DNA構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植物(例如，稻或玉米或大豆植物)，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接到至少一個調(diào)控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼DN-DTP1多肽，并且其中與對照植物相比，所述植物表現(xiàn)出增加的耐旱性。與對照植物相比，所述植物還可表現(xiàn)出至少一個農(nóng)學(xué)特性的改變。3.一種在其基因組中包含重組DNA構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植物(例如，稻或玉米或大豆植物)，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接到至少一個調(diào)控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼DN-DTP1多肽，并且其中與對照植物相比，所述植物表現(xiàn)出至少一個農(nóng)學(xué)特性的改變。4.一種在其基因組中包含重組DNA構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植物(例如，稻或玉米或大豆植物)，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接到至少一個調(diào)控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼包含基于ClustalV比對方法與SEQIDNO：4具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽，并且其中與對照植物相比，所述植物表現(xiàn)出至少一個農(nóng)學(xué)特性的改變。5.根據(jù)實施方案1-4中所述的以上植物的任何子代，根據(jù)實施方案1-4中所述的以上植物的任何種子，根據(jù)實施方案1-4中所述的以上植物的子代的任何種子，以及來自根據(jù)實施方案1-4中所述的以上植物及其子代中的任一個的細(xì)胞。在前述實施方案1-5或其它實施方案中的任一個中，DN-DTP1多肽可來自水稻(Oryzasativa)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)、玉米(Zeamays)、大豆(Glycinemax)、煙豆(Glycinetabacina)、野生大豆(Glycinesoja)或短絨野大豆(Glycinetomentella)。在前述實施方案1-5或其它實施方案中的任一個中，重組DNA構(gòu)建體可包含至少一個在植物中有功能的啟動子作為調(diào)控序列。在前述實施方案1-5或其它實施方案中的任一個中，至少一個農(nóng)學(xué)特性的改變可以是增加也可以是降低。在前述實施方案1-5或其它實施方案中的任一個中，至少一個農(nóng)學(xué)特性可選自綠度、谷粒收率、生長速率、生物質(zhì)、成熟時的鮮重、成熟時的干重、果實收率、谷粒收率、總植株氮含量、果實氮含量、種子氮含量、營養(yǎng)組織中的氮含量、總植株游離氨基酸含量、果實游離氨基酸含量、種子游離氨基酸含量、營養(yǎng)組織中的游離氨基酸含量、總植株蛋白質(zhì)含量、果實蛋白質(zhì)含量、種子蛋白質(zhì)含量、營養(yǎng)組織中的蛋白質(zhì)含量、耐旱性、氮吸收、根倒伏、收獲指數(shù)、莖桿倒伏、植株高度、穗高、穗長、耐鹽性、分蘗數(shù)、圓錐花序大小、早期幼苗活力以及低溫脅迫下的出苗情況。例如，至少一個農(nóng)學(xué)特性的改變可以是谷粒收率、綠度或生物質(zhì)的增加。在前述實施方案1-5或其它實施方案中的任一個中，在水分限制條件下，與對照植物相比，植物可表現(xiàn)出至少一個農(nóng)學(xué)特性的改變。在前述實施方案1-5或其它實施方案中的任一個中，在氧化脅迫(例如百草枯)條件下，與對照植物相比，植物可表現(xiàn)出至少一個農(nóng)學(xué)特性的改變?！案珊怠笔侵钢参锟捎盟臏p少，特別是較長時間的缺水或者在關(guān)鍵生長時間段發(fā)生，可造成植物損傷，或阻止植物的成功生長(例如，限制植物生長或谷粒收率)。“耐旱性”是指植物在干旱下存活并且沒有表現(xiàn)出實質(zhì)性的生理或物理退化的能力，和/或一段時間干旱后復(fù)水時恢復(fù)的能力。多肽的“耐旱活力”表示相對于參考植物或?qū)φ罩参?，該多肽在轉(zhuǎn)基因植物中的過表達賦予增加的轉(zhuǎn)基因植物耐旱性。植物“增加的耐旱性”是相對于參考植物或?qū)φ罩参镞M行測量的，并且反映了植物在干旱條件下存活的能力，并且與在類似干旱條件下生長的參考植物或?qū)φ罩参锵啾?，具有較小的生理或物理退化，或者植物在一段時間干旱后復(fù)水時，比對照植物更顯著和/或更快速地恢復(fù)的能力?！鞍俨菘荨?1，1-二甲基-4，4-聯(lián)吡啶鎓二氯化物)是葉面施用的非選擇性的聯(lián)吡啶鎓除草劑，并且導(dǎo)致進一步對植物造成損害或阻止其成功生長的光致氧化脅迫。“百草枯耐受性”是植物的性狀，反映了與參考植物或?qū)φ罩参锵啾?，?dāng)用百草枯溶液處理時改善的存活和/或生長能力。植物“增加的百草枯耐受性”是相對于參考植物或?qū)φ罩参餃y量的，并且反映了植物在用百草枯溶液處理后存活的能力，并且與參考植物或?qū)φ罩参锵啾龋哂休^小的生理或物理退化。一般來講，對相對低水平的百草枯的耐受性可用作非生物脅迫耐受性諸如耐旱性的標(biāo)記。“氧化脅迫”反映了在反應(yīng)性氧物質(zhì)的系統(tǒng)性表現(xiàn)和生物系統(tǒng)易于去除反應(yīng)性中間體或修復(fù)所造成的損傷的能力之間的失衡。細(xì)胞正常氧化還原狀態(tài)的紊亂可通過過氧化物和自由基的產(chǎn)生造成毒性作用，所述過氧化物和自由基損害細(xì)胞的所有組分，包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA。http：//en.wikipedia.org/wiki/Oxidative_stress.以下示例描述了用于模擬干旱條件和/或評估耐旱性的一些代表性方案和技術(shù)。還可通過在模擬或天然存在的干旱條件下，在田間測試中植物保持足夠收率(至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％收率)的能力來評估耐旱性(例如，通過測量在干旱條件下與非干旱條件相比基本上相等的收率，或者通過測量在干旱條件下與對照或參考植物表現(xiàn)出的收率損失相比較小的收率損失)。諸如恢復(fù)度、存活率、百草枯耐受率、基因表達水平、水使用效率、編碼蛋白的水平或活性、以及其它參數(shù)的參數(shù)通常相對于對照細(xì)胞或?qū)φ罩参镎故尽！皩φ铡被颉皩φ罩参铩被颉皩φ罩参锛?xì)胞”提供度量其中已針對目的基因?qū)崿F(xiàn)了遺傳改變(諸如轉(zhuǎn)化)的受試植物或植物細(xì)胞的表型變化的參考點。受試植物或植物細(xì)胞可從作了如此改變的植物或細(xì)胞遺傳而來，且將包含該改變。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將易于認(rèn)識到在使用如本文所述的組合物或方法評估或測量轉(zhuǎn)基因植物的農(nóng)學(xué)特性或表型時待利用的合適的對照或參照植物。例如，通過非限制性例示：1.轉(zhuǎn)化植物的子代，其相對于重組DNA構(gòu)建體為半合的，使得子代分成包含或不包含重組DNA構(gòu)建體的植物：包含重組DNA構(gòu)建體的子代通常將相對于不包含重組DNA構(gòu)建體的子代進行測量。不包含重組DNA構(gòu)建體的子代是對照或參考植物。2.將重組DNA構(gòu)建體滲入到近交系中，諸如在稻或玉米中，或者滲入到一個品種中，諸如在大豆中：滲入系將通常相對于親本近交系或品系進行測量(即，親本近交系或品系為對照或參考植物)。3.雙雜交系，其中第一雜交系由兩個親本近交系產(chǎn)生，并且第二雜交系由相同的兩個親本近交系產(chǎn)生，不同的是，親本近交系中的一個包含重組DNA構(gòu)建體：第二雜交系將通常相對于第一雜交系進行測量(即，第一雜交系為對照或參考植物)。4.包含重組DNA構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植物：該植物可相對于不包含重組DNA構(gòu)建體但是具有與該植物相當(dāng)?shù)倪z傳學(xué)背景的對照植物進行評估或測量(例如，與包含重組DNA構(gòu)建體的植物相比共享至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％，85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的核遺傳物質(zhì)序列同一性)。存在許多可用于植物遺傳學(xué)背景的分析、比較和表征的基于實驗室的技術(shù)；其中有同工酶電泳、限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)、隨機擴增多態(tài)性DNA(RAPD)、隨機引物聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(AP-PCR)、DNA擴增指紋識別(DAF)、序列特征性擴增區(qū)域(SCAR)、擴增片段長度多態(tài)性和簡單序列重復(fù)(SSR)(也稱為微衛(wèi)星)。對照植物或植物細(xì)胞可包括例如：(a)野生型(WT)植物或細(xì)胞，即具有與用于進行遺傳改變的起始材料相同的基因型的植物或細(xì)胞，該遺傳改變得到主題植物或細(xì)胞；(b)具有與起始材料相同的基因型但已用無效構(gòu)建體(即，用對目的性狀不具有已知效果的構(gòu)建體，諸如包含標(biāo)記基因的構(gòu)建體)轉(zhuǎn)化的植物或植物細(xì)胞；(c)為主題植物或植物細(xì)胞的子代中的非轉(zhuǎn)化分離體的植物或植物細(xì)胞；(d)遺傳上與主題植物或植物細(xì)胞相同但未暴露于將誘導(dǎo)目的基因表達的條件或刺激的植物或植物細(xì)胞；或者(e)處于其中目的基因不表達的條件下的主題植物或植物細(xì)胞本身。對照可包括多個代表一個或多個以上類別的個體；例如，“c”類的非轉(zhuǎn)化分離體的集合通常稱為批量無效對照(bulknull)。方法：方法包括但不限于用于增加植物耐旱性的方法、用于評估植物耐旱性的方法、用于增加百草枯耐受性的方法、用于改變植物農(nóng)學(xué)特性的方法、用于確定植物農(nóng)學(xué)特性改變的方法、以及用于生產(chǎn)種子的方法。植物可以是單子葉植物或雙子葉植物，例如，稻、玉米或大豆植物。植物也可以是向日葵、卡諾拉、小麥、苜蓿、棉花、稻、大麥、粟、甘蔗或高粱。種子可以是玉米或大豆種子，例如玉米雜交種子或玉米近交種子。方法包括但不限于以下；一種用于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的方法，包括使用本公開的分離的多核苷酸中的一種或多種轉(zhuǎn)化細(xì)胞，其中，在特定實施方案中，細(xì)胞為真核細(xì)胞，例如酵母、昆蟲或植物細(xì)胞；或原核細(xì)胞，例如細(xì)菌細(xì)胞。一種用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括使用本公開的分離的多核苷酸或重組DNA構(gòu)建體中的任一個轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，以及由轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生轉(zhuǎn)基因植物，其中，由該方法獲得的轉(zhuǎn)基因植物和轉(zhuǎn)基因種子可以在本公開的其它方法中使用。一種用于從細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物中分離本公開的多肽的方法，其中細(xì)胞包含重組DNA構(gòu)建體，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接到至少一個調(diào)控序列的本公開的多核苷酸，并且其中轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞在適合重組DNA構(gòu)建體表達的條件下生長。一種用于改變本公開的多肽在宿主細(xì)胞中的表達水平的方法，包括：(a)使用本公開的重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；以及(b)使轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞在適合重組DNA構(gòu)建體表達的條件下生長，其中重組DNA構(gòu)建體的表達導(dǎo)致本公開的多肽在轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中的水平改變。一種增加植物耐旱性和/或百草枯耐受性的方法，包括：(a)向可再生的植物細(xì)胞中引入重組DNA構(gòu)建體，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接到至少一個調(diào)控序列(例如，在植物中有功能的啟動子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼包含基于ClustalV比對方法與SEQIDNO：4具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽；(b)由步驟(a)之后的可再生的植物細(xì)胞再生轉(zhuǎn)基因植物，其中轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含重組DNA構(gòu)建體并且與對照植物相比表現(xiàn)出增加的耐旱性和/或百草枯耐受性；以及(c)獲得來源于轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含重組DNA構(gòu)建體并且與對照植物相比表現(xiàn)出增加的耐旱性和/或百草枯耐受性。一種評估植物耐旱性和/或百草枯耐受性的方法，包括(a)獲得轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含重組DNA構(gòu)建體，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接到至少一個調(diào)控序列(例如，在植物中有功能的啟動子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼包含基于ClustalV比對方法與SEQIDNO：4具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽；(b)獲得來源于所述轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中子代植物在其基因組中包含重組DNA構(gòu)建體；以及(c)與對照植物相比，評估子代植物的耐旱性和/或百草枯耐受性。一種確定植物農(nóng)學(xué)特性改變的方法，包括(a)獲得轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含重組DNA構(gòu)建體，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接到至少一個調(diào)控序列(例如，在植物中有功能的啟動子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼包含基于ClustalV比對方法與SEQIDNO：4相比具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽；(b)獲得來源于所述轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中子代植物在其基因組中包含重組DNA構(gòu)建體；以及(c)確定任選地在水分限制條件下，與對照植物相比，子代植物是否表現(xiàn)出至少一個農(nóng)學(xué)特性的改變。一種生產(chǎn)種子(例如，可以作為耐旱性出售產(chǎn)品銷售的種子)的方法包括前述方法中的任一個，還包括由所述子代植物獲得種子，其中所述種子在它們的基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體。在前述方法中的任一個或本公開的方法的任何其它實施方案中，在所述引入步驟中，所述可再生的植物細(xì)胞可包括愈傷組織細(xì)胞、胚性愈傷組織細(xì)胞、配子細(xì)胞、分生細(xì)胞或未成熟胚芽的細(xì)胞?？稍偕闹参锛?xì)胞可以來源于近交玉米植株。在前述方法中的任一個或本公開的方法的任何其它實施方案中，所述再生步驟可包括以下：(i)在包含胚性促進激素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞直至觀察到愈傷組織；(ii)將步驟(i)的所述轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞轉(zhuǎn)移至包括組織促進激素的第一培養(yǎng)基；以及(iii)將步驟(ii)之后的所述轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞在第二培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)，以允許芽伸長、根發(fā)育或兩者。在前述方法中的任一個或本公開的方法的任何其它實施方案中，至少一個農(nóng)學(xué)特性可選自綠度、谷粒收率、生長速率、生物質(zhì)、成熟時的鮮重、成熟時的干重、果實收率、谷粒收率、總植株氮含量、果實氮含量、種子氮含量、營養(yǎng)組織中的氮含量、總植株游離氨基酸含量、果實游離氨基酸含量、種子游離氨基酸含量、營養(yǎng)組織中的氨基酸含量、總植株蛋白質(zhì)含量、果實蛋白質(zhì)含量、種子蛋白質(zhì)含量、營養(yǎng)組織中的蛋白質(zhì)含量、耐旱性、氮吸收、根倒伏、收獲指數(shù)、莖桿倒伏、植株高度、穗高、穗長、分蘗數(shù)、圓錐花序大小、耐鹽性、早期幼苗活力以及低溫脅迫下的出苗情況。至少一個農(nóng)學(xué)特性的改變可以是谷粒收率、綠度或生物質(zhì)的增加。在前述方法中的任一個或本公開的方法的任何其它實施方案中，在水分限制條件下，與對照植物相比，植物可表現(xiàn)出至少一個農(nóng)學(xué)特性的改變。在前述方法中的任一個或本公開的方法的任何其它實施方案中，存在另選方案將包含可操作地連接到至少一個調(diào)控序列的多核苷酸的重組DNA構(gòu)建體引入可再生的植物細(xì)胞中。例如，可以將調(diào)控序列(諸如一個或多個增強子，任選地作為轉(zhuǎn)座元件的部分)引入可再生的植物細(xì)胞，然后對其中調(diào)控序列可操作地連接到編碼本公開的多肽的內(nèi)源基因的事件進行篩選。可以通過任何合適的技術(shù)將本公開的重組DNA構(gòu)建體引入植物中，包括但不限于直接DNA攝取、化學(xué)處理、電穿孔、顯微注射、細(xì)胞融合、感染、載體介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移、轟擊或農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。用于植物轉(zhuǎn)化和再生的技術(shù)已在國際專利公布WO2009/006276中有所描述，所述專利公布的內(nèi)容以引用方式并入本文。此外，修改或改變宿主內(nèi)源基因組DNA的方法是可用的。這包括改變宿主天然DNA序列或預(yù)先存在的轉(zhuǎn)基因序列，所述轉(zhuǎn)基因序列包括調(diào)控元件、編碼和非編碼序列。這些方法也用于使核酸靶向基因組中預(yù)先工程改造的靶標(biāo)識別序列。例如，本文所述的經(jīng)基因修飾的細(xì)胞或植物使用“定制的”大范圍核酸酶生成，所述大范圍核酸酶的產(chǎn)生用于修飾植物基因組(例如WO2009/114321；Gao等人(2010)PlantJournal1：176-187)。另一個定點工程改造通過使用限制性酶的限制特性結(jié)合的鋅指結(jié)構(gòu)域識別(例如，Urnov等人(2010)NatRevGenet.11(9)：636-46；Shukla等人(2009)Nature459(7245)：437-41)。包含編碼感興趣的蛋白質(zhì)的外來的、外源的分離的核酸片段的植物的發(fā)育或再生在本領(lǐng)域是熟知的?？墒乖偕仓曜曰ㄊ诜垡蕴峁┘兒系霓D(zhuǎn)基因植株。另外，將從再生植株獲得的花粉與農(nóng)學(xué)上重要的株系的種子培育植株進行雜交。反過來，用來自這些重要株系的植株的花粉對再生植株進行授粉。用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法來培植含有所需多肽的轉(zhuǎn)基因植株。技術(shù)人員還將理解，可通過核酸序列的突變引入變化，從而引起所編碼的mRNA的表達或所編碼的多肽的氨基酸序列的變化，從而分別導(dǎo)致mRNA或蛋白質(zhì)或兩者的生物活性的改變。參見例如2014年8月20日提交的美國專利申請14/463687中描述的方法，所述專利申請全文以引用的方式并入本文。因此，變體核酸分子可通過向本文所公開的相應(yīng)的核酸序列或周圍序列中引入一個或多個核苷酸置換、添加和/或缺失而產(chǎn)生。此類變體核酸序列也被本發(fā)明涵蓋。變體核酸序列可通過沿著基因區(qū)的全部或部分隨機引入序列變化來制備，包括但不限于化學(xué)或輻射誘變以及寡核苷酸介導(dǎo)的誘變(OMM)(Beetham等人1999；Okuzaki和Toriyama2004)。另選地或除此之外，序列變化可在特定選定位點使用雙鏈斷裂技術(shù)引入，所述技術(shù)諸如ZNF、定制歸巢核酸內(nèi)切酶、TALEN、CRISPR/CAS(也稱為向?qū)NA/Cas核酸內(nèi)切酶系統(tǒng))(2014年8月20日提交的美國專利申請14/463687)、或其它基于蛋白質(zhì)和/或核酸的誘變技術(shù)?？舍槍Ω淖兊幕钚詫λ米凅w進行篩選。應(yīng)當(dāng)理解，所述技術(shù)通常不互相排斥。事實上，所述各種方法可單獨或組合使用、并行或連續(xù)使用，以產(chǎn)生或獲得多樣的序列變體。實施例以下實施例進一步說明本公開的某些實施方案，其中份和百分比是按重量計，度是攝氏度，除非另行指出。應(yīng)當(dāng)理解，這些實施例雖然說明本公開的各實施方案，但僅以舉例說明的方式給出。由以上討論和這些實施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可確定本公開的必要特征，并且在不脫離本公開的實質(zhì)和范圍的前提下，可作出本公開的各種變化和修改以使本公開適合于各種應(yīng)用和條件。因此，除了本文顯示和描述的那些之外，本領(lǐng)域技術(shù)人員由前文的描述將顯而易見地知道本公開的各種修改。此類修改也旨在落入所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。實施例1具有激活標(biāo)簽構(gòu)建體的稻群體的創(chuàng)建在該研究中，使用基于4XCaMV35S增強子的二元構(gòu)建體，并且由通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化進行轉(zhuǎn)化的中花11(中花11水稻)建立稻激活標(biāo)簽群體。中花11由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所培育。本研究中使用的第一批種子由BeijingWeimingKaituoAgricultureBiotechCo.，Ltd.提供。用具有載體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化由胚芽誘導(dǎo)的愈傷組織。建立所生成的轉(zhuǎn)基因事件并且收獲轉(zhuǎn)基因種子以形成稻激活標(biāo)簽群體。實施例2鑒定在溫室條件下具有增強耐旱性的株系的幼苗篩選耐旱性的幼苗篩選在溫室中進行。提供兩種類型的燈作為光源，即鈉燈和金屬鹵化物燈，比率為1∶1。燈提供16h/8h的光照/黑暗周期，并且放置在苗床上部大約1.5m處。晴天時，苗床上部30cm處的光強度測量為10,000-20,0001x，而陰天時為6,000-10,0001x，相對濕度在30％至90％的范圍內(nèi)，并且溫度在20℃至35℃的范圍內(nèi)。在第一輪篩選中，使用T1種子。耐旱性篩選中，使用來自突變型稻株系的14株生長一致的幼苗和16株ZH11-TC幼苗(由組織培養(yǎng)過程產(chǎn)生的中花11)。幼苗種植在裝有種植土壤(來自北京輝業(yè)盛達中心(BeijingHuiYeShengDaCenter)的FangJie土)、蛭石(北京清源世紀(jì)園藝中心(BeijingQingYuanShiJiGardenCenter))和沙子(北京順屯建材市場(BeijingShuntunConstructionMaterialMarket))的混合物(V∶V∶V＝3∶3∶2)的一個托盤中。在所有幼苗生長到三葉期時，停止?jié)菜?，并將托盤放在干燥的位置，直至葉片卷曲(根據(jù)季節(jié)大約9-15天)。將托盤轉(zhuǎn)移到水池中，使幼苗恢復(fù)5-7天，然后對植物的恢復(fù)度進行評分。使用以下評分系統(tǒng)：一個綠莖＝1，一個綠葉＝1，半個綠莖或綠葉＝0.5，三分之一綠葉＝0.2，零綠葉或零綠莖＝O。恢復(fù)度是綠色組織得分的總和，并且數(shù)據(jù)采用SAS軟件進行統(tǒng)計分析。與對照表現(xiàn)出明顯不同的株系被認(rèn)為是最初的陽性株系。在以下測試中使用T2種子。篩選20或60株植株，并且僅相對于通過組織培養(yǎng)過程由中花11產(chǎn)生的植株，使用SAS軟件進行分析(P＜0.05)。存活率也用作篩選參數(shù)，其為存活植株占總植株數(shù)的百分比。將通過以上篩選的株系種植在溫室土壤中或田中(根據(jù)季節(jié))，以用于收獲葉材料并且進行T-DNA旁側(cè)序列和候選基因的分子克隆。一般來講，從同一株系的30株生長一致的幼苗中收獲20-30g新鮮的葉組織，將其在液氮中冷凍并且儲存于-80℃冷凍機中。實施例3株系A(chǔ)H00838的結(jié)果在重復(fù)的溫室干旱篩選測定中，株系A(chǔ)H00838始終顯示出與ZH11-TC(由組織培養(yǎng)過程產(chǎn)生的中花11)相比增強的耐旱性。如表2中所示，來自株系A(chǔ)H00838的14株T1植株中的9株(64.3％)在溫室干旱脅迫條件下恢復(fù)或存活；然而僅31.2％ZH11-TC植株存活。結(jié)果表明，與ZH11-TC相比，AH00838具有顯著增強的耐旱性。還在T2世代進行觀察。進行三輪篩選。在第一輪篩選中，70％的AH00838植株存活，而僅19％ZH11-TC存活。AH00838稻植株的存活率和平均恢復(fù)度顯著優(yōu)于ZH11-TC，盡管在以下兩輪篩選中干旱脅迫增加(表3)。這些結(jié)果進一步說明，AH00838在幼苗期在溫室干旱條件下具有增強的耐旱性。表2.AH00838植株在T1世代在溫室條件下的耐旱性測定表3.AH00８３8稻植株在T2世代在溫室條件下的耐旱性測定按照這些結(jié)果，進行另外的工作以鑒定有助于增強AH00838植株耐旱性的基因。實施例4激活標(biāo)簽基因的鑒定耐旱性株系A(chǔ)H00838中T-DNA插入基因座側(cè)翼基因使用以下兩個標(biāo)準(zhǔn)程序中的一者或兩者鑒定：(1)質(zhì)粒拯救(FriedrichJ.Behringer和JuneI.Medford.(1992)，PlantMolecularBiologyReporter第10卷，2：190-198)；以及(2)反向PCR(M.J.McPherson和PhilipQuirke.(1991)，PCR：apracticalapproach，137-146)。對于具有復(fù)合的多聚T-DNA插入物的株系，質(zhì)粒拯救和反向PCR均被證明不足以鑒定候選基因。在這些情況下，可采用其它程序，包括TAILPCR(Liu等人(1995)，PlantJ.8：457-463)。成功的測序結(jié)果是單個DNA片段含有一個T-DNA邊緣序列和側(cè)翼基因序列。當(dāng)獲得位于T-DNA插入物側(cè)翼的基因序列的標(biāo)簽時，可以通過與公開獲得的稻基因組序列比對來鑒定候選基因。具體地，離增強子元件/T-DNARB和LB最近的注釋基因是激活的候選基因。為了證實鑒定的基因鄰近T-DNA并排除DNA片段是嵌合克隆產(chǎn)生物的可能性，利用T-DNA中的一個oligo和對于局部基因組DNA特異的一個oligo對基因組DNA進行診斷PCR。給出PCR產(chǎn)物的基因組DNA樣品被認(rèn)為代表T-DNA插入。這個分析也驗證了同一個株系中發(fā)生多于一個插入事件的情況，例如，如果在質(zhì)粒拯救和/或反向PCR分析中鑒定了多個不同的基因組片段。使用CTAB方法從AH00838株系的葉組織中分離基因組DNA(Murray，M.G.和W.F.Thompson.(1980)NucleicAcidsRes.8：4321-4326)。通過2μL限制性酶BglII(NEB)酶切10μg來自AH00838的基因組DNA。在自連和通過電穿孔轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌DH5α中之后，使用P2up5389和P2down3534引物，通過菌落PCR驗證含氨芐青霉素平板上的存活菌落。P2up5389：5′-ACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCC-3′(SEQIDNO：5)P2down3534：5′-AACCCACTCGTGCACCCAACTGATC-3′(SEQIDNO：6)PCR反應(yīng)混合物和程序：PCR循環(huán)：對含氨芐青霉素平板上的所有存活菌落進行分析并且它們?nèi)吭诃傊悄z電泳產(chǎn)生大小為約4kb的條帶。對4kbDNA片段測序之后，獲得AH00838中T-DNA的旁側(cè)序列。此核苷酸序列示出為SEQIDNO：1。T-DNA插入AH00838基因組的4號染色體中，并且在AH00838的稻基因組中僅存在一個T-DNA插入基因座。OsDN-DTP1基因鄰近T-DNA插入基因座，并且AH00838株系具有增強的耐旱性，因此克隆了該基因并驗證了其在耐旱性和其它農(nóng)學(xué)性狀改善中的功能。實施例5OsDN-DTP1基因克隆和載體構(gòu)建使用KOD-FXPCR混合液(TOYOBO)，使用中花11稻的cDNA作為PCR模板擴增OsDN-DTP1(Os04g0208800)基因。引物為：45-Os04g0208800-F：5′AAAGGATCCTACATTATTACATATGTTCCGTTC-3′(SEQIDNO：7)45-Os04g0208800-R：5′-GGCGTTGCTGGTGCCGTTCAG-3′(SEQIDNO：8)在引物45-Os04g0208800-F中設(shè)計加有下劃線的BamHI位點。擴增預(yù)期的400bpDNA片段，將其純化、通過BamHI酶切，并且與通過BglII和NruI酶切的過表達載體DP0005連接。通過限制性圖譜和DNA測序確認(rèn)正確的克隆(DP0006)。OsDN-DTP1cDNA和CDS的核苷酸序列以及其編碼的蛋白分別在SEQIDNO：2、SEQIDNO：3和SEQIDNO：4中示出。實施例6DP0005和DP0009的載體構(gòu)建由pCAMBIA1300(Cambia，Brisbane，Australia)構(gòu)建DP0005。使用模板pCAMBIA1300以及引物35sF和35sR擴增CaMV35S啟動子。限制性酶位點HindIII和PstI分別添加在35SCaMV啟動子5’端和3’端。35sF：5′-AAGCTTAGAGCAGCTTGGCAACATGGTGGAGCAC-3′(SEQIDNO：9)35sR：5′-CTGCAGAGAGATAGATTTGTAGAGAGAG-3′(SEQIDNO：10)該擴增的CaMV35S啟動子片段通過HindIII和PstI酶切并且連接到HindIII-PstI酶切的pCAMBIA1300中以產(chǎn)生pCAMBIA1300-35s。使用模板pCAMBIA1303以及引物TnosF和TnosR擴增終止子NOSpolyA。限制性酶位點PstI+BglII+KpnI+NcoI+salI和BamHI分別設(shè)計在終止子NOSpolyA5’端和3’端引物中。TnosF：5′-CTGCAGAGATCTGGTACCGGTCGCCACCATGGAAGTCGACGTTTCTTGTTTCTTAAGATTGAATCCTGTTG-3′(SEQIDNO：11)TnosR：5′-GGATCCTCTAGTCCCGATCTAGTAACATAG-3′(SEQIDNO：12)使用PstI和BamHI酶切終止子NOSpolyA片段并且將其連接到PstI-BamHI酶切的載體中。所制備的載體設(shè)計為pCAMBIA1300-35s-Tnos。使用來自pAsRED2(ClontechLaboratoriesInc.)的AsRED基因并且將其插入pCAMBIA1300-35s-Tnos載體中以制備pCAMBIA1300-35s-AsRED-Tnos。為了便于構(gòu)建基因表達載體，新的終止子NOSpolyA片段在5′端具有BamHI+NruI+SalI位點并且在3′端具有EcoRI。引物為：TnosF2：5′-CCGGGATCCTCGCGAGTCGACCTCCAAGCTGGGCCACAACTGAAG-3′(SEQIDNO：13)TnosR2：5′-CGAGAATTCTCTAGTCCCGATCTAGTAACATAG-3′(SEQIDNO：14)使用pCAMBIA1300-35s-AsRED-Tnos作為模板通過PCR擴增新的終止子NOSpolyA片段。將此DNA片段用BamHI和EcoRI酶切，并且連接至用BamHI和EcoRI酶切的pCAMBIA1300-35s-AsRED-Tnos以制備DP0005，即用于OsDN-DTP1的過表達載體骨架。將DP0005用BglII和BamHI酶切，然后自連，用于從DP0005中消除AsRED基因，以制備DP0009。實施例7OsDN-DTP1轉(zhuǎn)基因稻事件通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法將空載體(DP0005，VC)和過表達載體(DP0006)單獨轉(zhuǎn)化到中花11中。在T2世代進行耐旱性測定。將幼苗在75mg/L潮霉素溶液中培養(yǎng)至約1-2cm的長度，持續(xù)3-5天。只有存活的植株(潮霉素抗性)用于田間干旱測定。通過實時PCR分析測量OsDN-DTP1轉(zhuǎn)基因在轉(zhuǎn)基因DP0006稻植株中的表達水平。從不同的DP0006稻植株收集葉樣品，并且使用實時PCR程序，諸如來自的反轉(zhuǎn)錄試劑盒和RealTime-PCR(SYBRRPremixExTaqTM，TaKaRa)。使用EF-1基因作為對照以顯示來自標(biāo)簽株系和VC的樣品的擴增和上樣量是類似的。優(yōu)化每個基因的測定條件。使用RNAisoPlus試劑盒(Takara)根據(jù)制造商的說明書，從4葉期DP0006植株的約50mg葉組織中提取總RNA。通過RevertAidTM第一鏈cDNA合成試劑盒(Fermentas)，由500ng總RNA制備cDNA。根據(jù)手冊(ABI)使用7,500Fast實時PCR設(shè)備進行實時PCR(SYBRRPremixExTaqTM，TaKaRa)。用于OsDN-DTP1基因的實時PCR的引物在以下列出：DP0006-1：5′-CAACCACAACGCGTATG-3′(SEQIDNO：15)DP0006-2：5′-CCTACCAGCTGCAATGC-3′(SEQIDNO：16)如圖1中所示，OsDN-DTP1基因在DP0006事件中過表達，但是在VC(空載體DP0005)植株中沒有可檢測的表達。在事件DP0006.09中的表達水平顯著高于在其它事件中的表達水平。實施例8通過OsDN-DTP1基因的過表達增強耐旱性轉(zhuǎn)化稻植株的田間干旱篩選在海南省進行。對于待測試的每個轉(zhuǎn)基因事件，將100粒陽性種子在水中室溫浸泡16h，在培養(yǎng)箱中于35-37℃萌發(fā)36h，并且種植在田間苗床。在三葉期時，將幼苗移植到測試田中，每個轉(zhuǎn)基因事件進行4次重復(fù)，每次重復(fù)10株植株，并且四次重復(fù)種植在同一塊地中。將在綠色熒光燈下不顯示紅色(分離的無效對照)的陰性種子在同一塊地上種植在轉(zhuǎn)基因事件旁邊，并且在統(tǒng)計分析中用作對照。水稻植株使用殺蟲劑和化肥正常管理。孕穗期停止?jié)菜?，以在開花期產(chǎn)生干旱脅迫，這取決于天氣條件(溫度和濕度)。在海南省的三亞，在1-2月，移植后25天稻植株停止?jié)菜?。在干旱脅迫期間稻植株復(fù)水一或兩次，以避免苛刻的條件并保持合理的收率。使用TDR300(SpectrumTechnologies，Inc.)在每塊地的10個位點每三天測量土壤含水量。在實驗期間觀察并記錄植株表型。表型包括抽穗時間、葉片卷曲度、以及敏旱性和耐旱性。尤其要注意中午時的葉片卷曲度。季節(jié)結(jié)束時，每個株系在每行中間收獲24株代表性的稻植株，并測量每株的籽粒重量。籽粒重量數(shù)據(jù)通過ASReml程序使用SAS-AN0VA-綜合模型進行統(tǒng)計分析。圖2顯示，在抽穗期和成熟期，土壤體積含水量從28％降低至10％，典型的開花期干旱脅迫。在成熟期期間，據(jù)發(fā)現(xiàn)，在干旱脅迫后，與VC(DP0005產(chǎn)生的事件)植株和CK(分離的無效對照)植株相比，轉(zhuǎn)基因事件DP0006.04、DP0006.05和DP0006.15具有顯著較好的穗結(jié)實率和籽粒飽滿度。收率數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析表明，4個OsDN-DTP1轉(zhuǎn)基因事件(表4)的收率顯著高于VC(數(shù)據(jù)未示出)和CK(表4)。結(jié)果表明，在田間干旱條件下，OsDN-DTP1轉(zhuǎn)基因在稻中的過表達提高耐旱性和穗結(jié)實率以及籽粒飽滿度，并且增強的耐旱性與OsDN-DTP1轉(zhuǎn)基因表達水平相關(guān)。表4.OsDN-DTP1稻植株在T2世代在田間干旱條件下的谷粒收率測定株系每株的谷粒收率(g)P值P≤0.05DP0006.0411.780.027YCK9.03DP0006.0511.730.008YCK8.44DP0006.1411.120.010YCK8.44DP0006.1512.270.001YCK8.67實施例9轉(zhuǎn)基因稻植株的實驗室百草枯測定百草枯(1，1-二甲基-4，4-聯(lián)吡啶鎓二氯化物)是葉面施用的非選擇性的聯(lián)吡啶鎓除草劑，并且是世界上最廣泛使用的除草劑之一，控制多種農(nóng)作物如玉米、稻、大豆等中的雜草。在植物細(xì)胞中，百草枯通過從光合體系I接收電子并接著與氧反應(yīng)以產(chǎn)生超氧化物和過氧化氫而主要靶向葉綠體，其改變植物抵抗光致氧化脅迫的能力。干旱脅迫通常在植物中引起增加的反應(yīng)性氧物質(zhì)(ROS)，有時植物的耐旱性與增強的抗氧化能力相關(guān)聯(lián)。百草枯是有效的氧化脅迫誘導(dǎo)劑；其大大增加ROS產(chǎn)生并且抑制抗氧化劑體系的活性所必需的還原性等效物和化合物的再生。ROS生成在非生物脅迫條件下增強，并且植物應(yīng)答從耐受至死亡變化，這取決于脅迫強度和其相關(guān)ROS水平。相對低的百草枯水平可模擬脅迫相關(guān)ROS產(chǎn)生并且用作植物脅迫生物學(xué)中的脅迫耐受性標(biāo)記(HasaneenM.N.A.(2012)Herbicide-Properties，SynthesisandControlofWeeds，檢索自http：//www.intechopen.com/books/ISBN978-953-307-803-8)。因此，測試了耐旱性轉(zhuǎn)基因稻植株的百草枯耐受性。百草枯測定方法：通過百草枯測定對來自O(shè)sDN-DTP1轉(zhuǎn)基因稻株系的9-10個轉(zhuǎn)基因事件的轉(zhuǎn)基因稻植株進行測試。使用組織培養(yǎng)的中花11植株(ZH11-TC)作為對照。將T2轉(zhuǎn)基因種子滅菌并使其發(fā)芽，并且在具有28-30℃的溫度和～30％的濕度的生長室中培養(yǎng)。將發(fā)芽的種子置于底部有孔的管中，并且在30℃下在水中培養(yǎng)5天，直到一葉和一頂芽期。選擇高度為約3.5-4cm的生長一致的幼苗進行百草枯測試。在本實驗中使用隨機化區(qū)塊設(shè)計。存在5個區(qū)塊，每個區(qū)塊具有16×12個孔。將各轉(zhuǎn)基因事件置于一排中(12株植株/事件)，并且將ZH11-TC對照在一個區(qū)塊中隨機放置在3排(3×12植株)中。然后將幼苗在10h光照/14h黑暗循環(huán)下用0.8μM百草枯溶液處理7天，并且處理的幼苗首先遇到黑暗并吸收百草枯溶液，百草枯溶液每兩天更換。處理7天后，對綠色的幼苗進行計數(shù)?？傮w上保持綠色的沒有損傷的那些幼苗被視為百草枯耐受性幼苗；而具有變白的葉或莖的那些幼苗不被視為百草枯耐受性幼苗。使用耐受率作為該性狀篩選的參數(shù)，其為保持綠色并顯示出耐受性表型的植物占總植株數(shù)的百分比。使用統(tǒng)計模型“Y～seg+事件(seg)+rep+誤差”、隨機效應(yīng)“rep”、以及統(tǒng)計方法“SASProcGlimmix”，在構(gòu)建體水平(所有轉(zhuǎn)基因植株與對照相比較)和轉(zhuǎn)基因事件水平(不同轉(zhuǎn)基因事件與對照相比較)上對數(shù)據(jù)進行分析。在百草枯測定中對OsDN-DTP1轉(zhuǎn)基因稻測試3次。在第一個實驗中，在百草枯溶液處理7天之后，600株OsDN-DTP1轉(zhuǎn)基因幼苗中的387株(65％)保持綠色并且顯示出百草枯耐受性表型，而來自ZH11-TC幼苗的180株幼苗中的93株(52％)顯示出百草枯耐受性表型。所篩選的全部OsDN-DTP1轉(zhuǎn)基因幼苗的耐受率顯著大于ZH11-TC對照的耐受率(P值＝0.0015)。這些結(jié)果表明，在構(gòu)建體水平上，與ZH11-TC對照相比，OsDN-DTP1轉(zhuǎn)基因幼苗表現(xiàn)出百草枯耐受性增強。在轉(zhuǎn)基因事件水平上的進一步分析表明，與ZH11-TC對照相比，10個事件中的6個具有顯著更大的耐受率。這些結(jié)果說明，在幼苗期，在構(gòu)建體和轉(zhuǎn)基因事件水平上，與ZH11-TC稻植株相比，OsDN-DTP1轉(zhuǎn)基因稻植株具有增強的百草枯耐受性。進行另兩個實驗以進一步驗證OsDN-DTP1轉(zhuǎn)基因稻的百草枯耐受性。在第二個實驗中，564株OsDN-DTP1轉(zhuǎn)基因幼苗中的284株(50％)保持綠色并且顯示出百草枯耐受性表型，而來自ZH11-TC幼苗的216株幼苗中的76株(35％)顯示出百草枯耐受性表型。所篩選的全部OsDN-DTP1轉(zhuǎn)基因幼苗的耐受率顯著大于ZH11-TC對照的耐受率(P值＝0.0003)。在第三個實驗中，564株OsDN-DTP1轉(zhuǎn)基因幼苗中的297株(53％)保持綠色并且顯示出百草枯耐受性表型，而來自ZH11-TC幼苗的216株幼苗中的59株(27％)顯示出百草枯耐受性表型。所篩選的全部OsDN-DTP1轉(zhuǎn)基因幼苗的耐受率顯著大于ZH11-TC對照(P值＝0.0000)。第二個實驗的在轉(zhuǎn)基因事件水平上的分析在表6中示出。這些結(jié)果說明，在幼苗期，在構(gòu)建體和轉(zhuǎn)基因事件水平上，與ZH11-TC稻植株相比，OsDN-DTP1轉(zhuǎn)基因稻植株具有增強的百草枯耐受性。OsDN-DTP1基因在增強轉(zhuǎn)基因植物的百草枯耐受性或抗氧化能力中具有功能。OsDN-DTP1基因的過表達可增強發(fā)育期間轉(zhuǎn)基因植物的田間耐旱性，如實施例8中所述；并且百草枯測定中的交叉驗證結(jié)果進一步證實了OsDN-DTP1在增強植物的耐旱性中起作用。表5.OsDN-DTP1轉(zhuǎn)基因稻植株在T2世代在轉(zhuǎn)基因事件水平上(第1個實驗)的百草枯耐受性測定表6.OsDN-DTP1轉(zhuǎn)基因稻植株在T2世代在轉(zhuǎn)基因事件水平上(第2個實驗)的百草枯耐受性測定實施例10用OsDN-DTP1基因轉(zhuǎn)化擬南芥為了了解OsDN-DTP1基因是否可改善雙子葉植物的耐旱性或其它性狀，使用花浸法將OsDN-DTP1基因(載體DP0006)和空載體DP0009(VC)轉(zhuǎn)化到擬南芥中并且鑒定轉(zhuǎn)基因植株(Clough，S.T.和Bent，A.F.(1998)ThePlantJournal16，735-743；Zhang，X.等人(2006)NatureProtocols1：641-646)。為了鑒定轉(zhuǎn)基因子代，通過首先用70％乙醇處理1min，接著用50％漂白劑/50％水/0.05％X-100處理8min對擬南芥種子進行表面滅菌；在無菌水中沖洗3次，直到水看起來澄清并且沒有任何黃色；并且重懸于無菌水中并鋪在包含適當(dāng)抗生素的選擇平板上。將平板干燥，直到水干燥并且種子在平板上變得穩(wěn)定。通過在4℃放置3天使種子春化；然后將種子移到處于長日照條件下的生長室中。在選擇平板上生長7-10天之后，具有健康的綠色子葉和真葉以及延伸到MS選擇培養(yǎng)基中的根的幼苗被視為轉(zhuǎn)化體。然后將轉(zhuǎn)化體移栽在裝有水飽和土壤的托盤中，并且將托盤移到生長室中以允許植株在持續(xù)光照下生長，以收集種子。通過PCR分析進一步確認(rèn)轉(zhuǎn)基因植株。OsDN-DTP1基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的表達水平通過半定量PCR測定進行分析。轉(zhuǎn)化的擬南芥幼苗的總RNA如實施例7中所述進行提取。獲得cDNA，使用肌動蛋白基因作為對照，并且使用DP0006-1和DP0006-2作為OsDN-DTP1轉(zhuǎn)基因的引物。肌動蛋白的引物列出如下：肌動蛋白-F：5′-AGGCACCTCTTAACCCTAAAGC-3′(SEQIDNO：17)肌動蛋白-R：5′-GGACAACGGAATCTCTCAGC-3′(SEQIDNO：18)PCR反應(yīng)混合物和程序：PCR循環(huán)：如圖3A中所示，OsDN-DTP1轉(zhuǎn)基因在AtDP0006.06、AtDP0006.09和AtDP0006.11中過表達。在野生型和VC植株中沒有可檢測的表達。事件AtDP0006.06中的表達水平顯著低于事件AtDP0006.09和AtDP0006.11。為了表征OsDN-DTP1轉(zhuǎn)基因擬南芥植株在干旱脅迫下的性能，將野生型(Columbia)、VC植株(DP0009轉(zhuǎn)化體)以及3株AtDP0006轉(zhuǎn)基因事件種植在種植土壤中，在正常澆水條件下生長4周。在干旱處理之前將種植土壤澆水至飽和，并且使擬南芥植株在不澆水的情況下生長約12天。當(dāng)土壤的相對水含量降低至約3％時，使擬南芥植株復(fù)水3天。進行3次測量并且使用12株植株。在干旱處理期間，野生型植株和VC植株的萎蔫程度比AtDP0006事件更明顯，并且在復(fù)水后第3天，轉(zhuǎn)基因AtDP0006事件比野生型植株和VC植株生長得好(圖3C)。在復(fù)水之后，多于50％的轉(zhuǎn)基因植株存活，而野生型植株和VC植株的相應(yīng)的存活率小于18％。這些結(jié)果說明，OsDN-DTP1轉(zhuǎn)基因的過表達顯著增強了雙子葉植物擬南芥的耐旱性。此外，這些結(jié)果進一步顯示，單子葉植物的基因(來自稻的OsDN-DTP1)可以在雙子葉植物(擬南芥)中具有功能。當(dāng)前第1頁1 2 3 當(dāng)前第1頁1 2 3