專利名稱：具有δ的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物編碼基因及其應(yīng)用。具體地，涉及兩個(gè)具有完整閱讀框架的嵌合基因RnD6CA和RnD6CB，其分別由來(lái)源于黑茶藨子(Ribesnigrum L.)的三段DNA序列構(gòu)建而成。本發(fā)明還涉及該嵌合基因所編碼的具有Δ6脂肪酸脫氫酶功能的多肽，以及含有該DNA序列的酵母表達(dá)載體和植物表達(dá)載體、宿主細(xì)胞，以及利用該基因分別轉(zhuǎn)化酵母和植物生產(chǎn)γ-亞麻酸的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在脂肪酸代謝過(guò)程中，Δ6脂肪酸脫氫酶(Δ6-fatty aciddesaturase，D6D)催化亞油酸(linoleic acid，LA，18:2Δ9，12)的第6位碳原子脫氫形成γ-亞麻酸(γ-linolenic acid，GLA，18:3Δ6，9，12)[1]。γ-亞麻酸又可通過(guò)碳鏈延長(zhǎng)和脫氫作用進(jìn)一步形成花生四烯酸、前列腺素和白三烯類生理活性物質(zhì)，這些產(chǎn)物在人的大腦發(fā)育、視覺(jué)、過(guò)敏反應(yīng)及心血管運(yùn)動(dòng)等一系列生理功能中產(chǎn)生重要影響。
作為人體的一種必需的不飽和脂肪酸，γ-亞麻酸對(duì)人體具有降血脂、抗脂質(zhì)過(guò)氧化、減肥、抑制潰瘍、增強(qiáng)胰島素、抗血栓性心血管疾病等一系列生物學(xué)功能[1，2]。目前，國(guó)際上γ-亞麻酸已被作為一種新的維生素-維生素F被研究利用[3]。因而，作為γ-亞麻酸生產(chǎn)中的關(guān)鍵酶——Δ6脂肪酸脫氫酶也亦已被越來(lái)越多的研究和利用。迄今為止，Δ6脂肪酸脫氫酶基因已從動(dòng)物[4]、植物[5]、真菌[6]和線蟲(chóng)[7]等不同生物中克隆獲得，并在釀酒酵母[7，8]、番茄[9]、煙草[5，10]、油菜[6，8]和大豆[11]等中成功獲得了表達(dá)。
在植物中，僅月見(jiàn)草(Oenothera sp.)、琉璃苣(Borago officinalisL.)和黑茶藨子等少數(shù)幾種植物含有GLA[12]，琉璃苣[5]和月見(jiàn)草[13]的Δ6脂肪酸脫氫酶基因國(guó)外已有研究報(bào)道，而本專利涉及的兩個(gè)融合基因是來(lái)源于黑茶藨子的Δ6脂肪酸脫氫酶基因的首次報(bào)道。
由于這類基因所編碼的是一個(gè)蛋白，可采用釀酒酵母表達(dá)體系來(lái)進(jìn)行體外表達(dá)，但由于該蛋白定位在葉綠體或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，且為一膜蛋白，在體外表達(dá)體系中即使表達(dá)出來(lái)，亦較難分離純化。故一般采用考察所表達(dá)的蛋白對(duì)外加底物的催化活性的方法來(lái)進(jìn)行功能鑒定。
在所采用的釀酒酵母表達(dá)體系中，受體菌是尿嘧啶缺陷型INVSc I，本身不含LA(亞油酸)和GLA(γ-亞麻酸)，因此，在添加底物亞油酸的條件下，如若在酵母工程菌中檢測(cè)到催化產(chǎn)物γ-亞麻酸，就可以確定外源基因所編碼蛋白在酵母表達(dá)體系中獲得了表達(dá)，對(duì)外加底物產(chǎn)生了催化作用。所以釀酒酵母已經(jīng)作為研究外源的Δ6、Δ12-脂肪酸脫氫酶基因功能性鑒定的最常用、最有效的表達(dá)體系，且已有許多成功的研究報(bào)道[5，6，7]。脂肪酸的檢測(cè)主要采用GC/MS(氣相色譜-質(zhì)聯(lián)用技術(shù))來(lái)完成。其原理是通過(guò)GC(氣相色譜)將不同的脂肪酸組分分離，然后通過(guò)MS(質(zhì)譜)檢測(cè)器分別對(duì)每種組分進(jìn)行質(zhì)譜定性分析，從而確定每一種組分的成分及含量的比較成熟的聯(lián)用分析技術(shù)。
植物中，GLA僅存在于月見(jiàn)草(Oenothera sp.)、琉璃苣(Boragoofficinalis L.)和黑茶藨子等少數(shù)幾種植物中[12]，而這些植物的種子油生產(chǎn)亦成為目前世界上GLA的主要商業(yè)來(lái)源。利用產(chǎn)油真菌發(fā)酵也可提取獲得GLA，但通過(guò)現(xiàn)有的這些生產(chǎn)方式獲得的GLA產(chǎn)量都很低，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足日益增長(zhǎng)的市場(chǎng)需求[13]。因此，利用釀酒酵母或轉(zhuǎn)基因油料作物植株表達(dá)外源Δ6脂肪酸脫氫酶來(lái)生產(chǎn)γ-亞麻酸具有重要的研究意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了兩個(gè)嵌合基因RnD6CA和RnD6CB，其核苷酸序列分別如SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示，這兩個(gè)嵌合基因是利用來(lái)源于黑茶藨子(Ribes nigrum L.)的DNA片段RnD6C和RnD6A，及RnD6C和RnD6B構(gòu)建而成，所編碼的多肽分別如SEQ ID NO6和SEQ ID NO7所示(圖6和7)。
本發(fā)明提供了三個(gè)來(lái)源于黑茶藨子(Ribes nigrum L.)的DNA片段RnD6C、RnD6A、RnD6B，其核苷酸序列分別如SEQ ID NO3、SEQ IDNO4和SEQ ID NO5所示。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供含嵌合基因RnD6CA、RnD6CB的酵母表達(dá)載體，以及利用該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞。在轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞中所表達(dá)的多肽具有Δ6脂肪酸脫氫酶功能，可以催化外加底物亞油酸生成γ-亞麻酸。
本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種含嵌合基因RnD6CA、RnD6CB的植物表達(dá)載體?？墒褂萌魏我环N可以引導(dǎo)外源基因在植物中表達(dá)的表達(dá)載體。這些植物表達(dá)載體包括但不限于雙元農(nóng)桿菌載體，例如pBIN19，pBI121，pB221，含DRE和/或ABRE元件的誘導(dǎo)啟動(dòng)子以及用于單子葉植物微彈轟擊的植物表達(dá)載體。
本發(fā)明的載體也可含有適當(dāng)?shù)膯?dòng)子。在本發(fā)明中可使用任何一種強(qiáng)啟動(dòng)子。這些啟動(dòng)子包括但不限于花椰菜花葉病毒(CaMV 35S)、Ubiqutin、Actin等以及植物組織部位特異表達(dá)啟動(dòng)子等。它可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動(dòng)子結(jié)合使用。
本發(fā)明的表達(dá)載體可通過(guò)使用Ti質(zhì)粒，Ri質(zhì)粒，植物病毒載體，直接的DNA轉(zhuǎn)化，微注射，電穿孔等方式導(dǎo)入植物細(xì)胞。
可用于本發(fā)明轉(zhuǎn)化的植物宿主為雙子葉植物，所述雙子葉植物選自由煙草、油菜、向日葵、大豆、番茄、蓖麻、芝麻和花生等植物組成的組。
本發(fā)明還涉及嵌合基因RnD6CA、RnD6CB在生產(chǎn)γ-亞麻酸中的應(yīng)用。


圖1.嵌合基因RnD6CA的核苷酸序列，SEQ ID NO1。
圖2.嵌合基因RnD6CB的核苷酸序列，SEQ ID NO2。
圖3.RnD6A片段的核苷酸序列，SEQ ID NO3。
圖4.RnD6B片段的核苷酸序列，SEQ ID NO4。
圖5.RnD6C片段的核苷酸序列，SEQ ID NO5。
圖6.嵌合基因RnD6CA所編碼的多肽，SEQ ID NO6，其中劃線部分分別為Cytb5功能域和三個(gè)His Box功能域。
圖7.嵌合基因RnD6CB所編碼的多肽，SEQ ID NO7，其中劃線部分分別為Cytb5功能域和三個(gè)His Box功能域。
圖8.嵌合基因RnD6CA/B的酵母表達(dá)載體圖。
圖9.嵌合基因RnD6CB/B的植物表達(dá)載體圖。
圖10.嵌合基因RnD6CA/B在釀酒酵母中表達(dá)的總脂肪酸GC-MS分析a)INVSc I酵母菌株脂肪酸組成的GC-MS；b)INVSc I酵母菌株脂肪酸組成和加有LA(亞油酸)、GLA(γ-亞麻酸)標(biāo)準(zhǔn)樣品的GC-MS；c)含空載pYES2表達(dá)質(zhì)粒酵母的總脂肪酸GC-MS；d)含空載pYES2表達(dá)質(zhì)粒酵母在添加LA底物誘導(dǎo)后的總脂肪酸GC-MS；e)表達(dá)RnD6CA基因的釀酒酵母在添加LA底物誘導(dǎo)后的總脂肪酸GC-MS，紅色箭頭所指為產(chǎn)物峰；f)產(chǎn)物峰局部放大圖(X10)；g)表達(dá)RnD6CB基因的釀酒酵母添加LA底物誘導(dǎo)后的總脂肪酸GC-MS，箭頭所指為產(chǎn)物峰。
圖11.釀酒酵母中RnD6CA/B基因表達(dá)催化產(chǎn)物GC-MS分析中MS圖譜，aRnD6CA/B的酵母表達(dá)催化產(chǎn)物的MS圖；bγ-亞麻酸標(biāo)準(zhǔn)品的MS圖。
具體實(shí)施例方式
下面參考實(shí)施例和附圖詳細(xì)描述本發(fā)明。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解的是，下述實(shí)施例是舉例說(shuō)明的目的，其不應(yīng)以任何方式解釋為對(duì)本發(fā)明的限制。本發(fā)明的保護(hù)范圍由后附的權(quán)利要求所限定。
實(shí)施例1.嵌合基因的構(gòu)建1.黑茶藨子基因組DNA的制備以北京植物園中種植的黑茶藨子(Ribes nigrum L.)活體植株為材料，取其幼嫩葉片約100mg，于7mL Ep管中加入鋼珠(直徑5mm)，置于液氮中冷凍20-30min，于漩渦器上高速破碎，反復(fù)操作2-3次，至材料完全破碎。加入1-2mL預(yù)熱的CTAB抽提液(參見(jiàn)“精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南”2001，科學(xué)出版社，顏?zhàn)臃f，王海林譯)。混勻。65℃水浴30min。加入等體積氯仿，輕柔抽提約5min。于12000rpm室溫離心10min。取上清，加入1/2體積異丙醇混勻，室溫放置10min沉淀DNA。用Tip頭將沉淀出的DNA挑出，用70％乙醇中洗滌兩次，于70％乙醇中室溫放置30min。除去70％乙醇，空氣中吹干。溶于適量滅菌ddH2O，-20℃保存。
2.RnD6A、RnD6B、RnD6C DNA片段的克隆設(shè)計(jì)引物分別從前面所提取的DNA中克隆RnD6A、RnD6B、RnD6CDNA片段(圖3，4和5)。所用反應(yīng)體系如下PCR反應(yīng)體系(50ul) PCR產(chǎn)物電泳(1％凝膠濃度)后切膠回收目的片段(RnD6A、RnD6B、RnD6C三個(gè)目的片段的大小分別為0.22kb，0.22kb和1.1kb)，連入pMD 18-T載體(Takara Biotech.(Dalian)Co.Ltd)測(cè)序驗(yàn)證。
所用引物分別如下1).RnD6ADNA片段的克隆所用引物正向引物5′-TTGAGCATCATTTGTTCCCTCGATTGCCTCGATGCC-3′(SEQ ID NO8)反向引物Xba I5′-GCGGTCTAGATCACCCCGGGCAGGTGACAGCTT-3′(SEQ IDNO9)2).RnD6B DNA片段的克隆所用引物正向引物5′-TTGAGCATCATTTGTTCCCAAGATTGCCTCGATGCC-3′(SEQ ID NO10)反向引物Xba I5′-GCGGTCTAGATCAGCCATAGGTGTTGACAGCTTCCC-3′(SEQID NO11)3).RnD6C DNA片段的克隆所用引物正向引物Hind III5′-CGCGAAGCTTATGGCTAATGCAATCAAGAAGTACATG-3′(SEQ ID NO12)反向引物5′-GGGAACAAATGATGCTCAATTTGG-3′(SEQ ID NO13)3.嵌合基因RnD6CA和RnD6CB的構(gòu)建利用上面所克隆到的并測(cè)序驗(yàn)證的RnD6A、RnD6B、RnD6C片段為模板，利用PCR技術(shù)獲得嵌合基因RnD6CA和RnD6CB序列，并在兩端引入HindIII與Xba I酶切位點(diǎn)，連入pMD18-T，通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證。
具體操作如下1).制備嵌合基因所用RnD6A、RnD6B、RnDD6C片段利用上面實(shí)施例1中第2節(jié)相同PCR反應(yīng)體系與PCR程序，分別獲得RnD6A、RnD6B、RnD6C片段，通過(guò)凝膠電泳(1％凝膠濃度)回收。其中RnD6A片段利用SEQ ID NO8和SEQ ID NO9所示引物序列通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得；RnD6B片段利用SEQ ID NO10和SEQ ID NO11所示引物序列通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得；RnD6C片段利用SEQ ID NO12和SEQ ID NO13所示引物序列通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得。
2)嵌合基因制備A)RnD6CA嵌合基因的制備將RnD6A(片段1)和RnD6C(片段2)片段融合形成RnD6CA嵌合基因(圖1)。所用引物序列為
正向引物Hind III5′-CGCGAAGCTTATGGCTAATGCAATCAAGAAGTACATG-3′(SEQ IDNO12)反向引物Xba I5′-GCGGTCTAGATCACCCCGGGCAGGTGACAGCTT-3′(SEQ ID NO9)B)RnD6CB嵌合基因的制備將RnD6B(片段1)和RnD6C(片段2)片段融合形成RnD6CB嵌合基因(圖2)。所用引物序列為正向引物Hind III5′-CGCGAAGCTTATGGCTAATGCAATCAAGAAGTACATG-3′(SEQ IDNO12)反向引物Xba I5′-GCGGTCTAGATCAGCCATAGGTGTTGACAGCTTCCC-3′(SEQ IDNO11)利用下面PCR反應(yīng)體系進(jìn)行PCR融合，以獲得嵌合基因融合PCR反應(yīng)體系(20ul) 全長(zhǎng)嵌合基因PCR反應(yīng)體系(50ul) PCR產(chǎn)物電泳后切膠回收，分別獲得RnD6CA和RnD6CB嵌合基因全長(zhǎng)片段(約1.3Kb)，連入pMD18-T載體(左端帶有HindIII酶切位點(diǎn)，右端帶有BamH I酶切位點(diǎn))，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH-5α(請(qǐng)?zhí)峁┚唧w來(lái)源)保存，同時(shí)測(cè)序驗(yàn)證。
實(shí)施例2.嵌合基因酵母載體的構(gòu)建從含有嵌合基因RnD6CA和RnD6CB的pMD18-T載體中，利用HindIII與Xba I酶切位點(diǎn)，雙酶酶切后獲得RnD6CA和RnD6CB基因，定向克隆于酵母表達(dá)載體pYES2.0(購(gòu)自Invitrogen公司)，獲得酵母表達(dá)質(zhì)粒pYRnD6CA和pYRnD6CB，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH-5α保存。其載體圖譜見(jiàn)圖8。
實(shí)施例3.嵌合基因在酵母中的表達(dá)1.酵母的轉(zhuǎn)化參照Invitrogen公司pYES2 Kit(Cat#V285-20)所述方法，將上述嵌合基因的酵母表達(dá)質(zhì)粒pYRnD6CA和pYRnD6CB(質(zhì)粒圖參見(jiàn)圖8)，采用醋酸鋰介導(dǎo)轉(zhuǎn)化釀酒酵母營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株INVSc I(參照Invitrogen公司pYES2 Kit所述轉(zhuǎn)化方法)(購(gòu)于Invitrogen公司)，以空載體pYES2.0質(zhì)粒為對(duì)照，獲得含有各表達(dá)質(zhì)粒的酵母細(xì)胞。
2.酵母轉(zhuǎn)化細(xì)胞的誘導(dǎo)表達(dá)取含嵌合基因酵母表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的酵母單菌落，接種于50ml含2％綿子糖的SC-U培養(yǎng)液中(參照Invitrogen公司pYES2 Kit所述配方)，于搖床上250rpm，28℃培養(yǎng)過(guò)夜。然后加入諾納德P-40(NP-40，購(gòu)自BBI公司)(終濃度1％)、外源亞油酸底物(購(gòu)自Sigma公司)(終濃度為0.003％)，以及酵母表達(dá)誘導(dǎo)物D-半乳糖(購(gòu)自Amresco公司)(終濃度為2％)250rpm，22℃培養(yǎng)48h誘導(dǎo)表達(dá)。
實(shí)施例4.嵌合基因酵母表達(dá)產(chǎn)物對(duì)Δ6脂肪酸脫氫酶底物催化產(chǎn)物的GC-MS分析1.脂肪酸的提取與甲酯化。
離心收集取誘導(dǎo)后的酵母菌體，去離子水洗滌，50℃烘干。取0.1g酵母粉(在實(shí)例3.2中所誘導(dǎo)所獲得的酵母經(jīng)50℃烘干即得)充分研磨，加入5ml 5％KOH-CH3OH(購(gòu)自Aldtich公司)，70℃水浴5h后，加入HCl酸化至其pH值達(dá)2.0。再加入4ml 14％BF3-CH3OH(購(gòu)自Aldtich公司)溶液，70℃水浴1.5h。加入2ml 0.9％NaCI溶液，混勻后靜止片刻。再加入2ml氯仿∶正己烷(V/V 1∶4)抽提，吸取抽提液，N2吹干。最后溶于100μl乙酸乙酯。
2.終產(chǎn)物GC-MS檢測(cè)分析實(shí)驗(yàn)。
所用GC/MS儀為TurboMass(PerkinElmer公司)，柱子BPX-70，30m×0.25mm×0.25vm，柱溫120℃，氣化室溫度230℃。取1μl終產(chǎn)物上樣，分流比10∶1。
3.GC-MS結(jié)果分析對(duì)比圖10a、10b和10c，表明在不添加亞油酸底物條件下，所用酵母工程菌株以及含經(jīng)誘導(dǎo)的空載pYES2表達(dá)質(zhì)粒酵母中沒(méi)有出現(xiàn)新的產(chǎn)物峰出現(xiàn)，說(shuō)明所用酵母工程菌株及空載pYES2表達(dá)質(zhì)粒酵母的總脂肪酸中不含外加底物亞油酸(LA)和催化產(chǎn)物γ-亞麻酸(GLA)。
當(dāng)添加亞油酸底物，并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)，對(duì)照(空載pYES2.O)亦沒(méi)有產(chǎn)物峰γ-亞麻酸(GLA)的出現(xiàn)(參見(jiàn)圖10d)。而pYRnD6CA/B的酵母表達(dá)菌被誘導(dǎo)后，外加底物亞油酸(LA)可以被催化生成γ-亞麻酸(GLA)(參見(jiàn)圖10e和10g)對(duì)比圖10e、10f和10g，可以發(fā)現(xiàn)在保留時(shí)間為7.6分鐘時(shí)，有一個(gè)新的物質(zhì)生成。，其出峰時(shí)間和質(zhì)譜圖與標(biāo)準(zhǔn)品γ-亞麻酸(購(gòu)自Sigma公司)的峰圖及質(zhì)譜圖一致(參見(jiàn)圖11a和11b)，確定為γ-亞麻酸。
以上結(jié)果證明來(lái)源于黑茶藨子的兩個(gè)嵌合基因RnD6CA/B在釀酒酵母中成功表達(dá)，所表達(dá)的蛋白可以催化外加底物亞油酸(LA)生成γ-亞麻酸(GLA)。
實(shí)施例5.嵌合基因RnD6CA/B植物表達(dá)載體的構(gòu)建RnD6CA/B的植物表達(dá)載體的構(gòu)建按常規(guī)分子生物學(xué)手段進(jìn)行(參見(jiàn)“精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南”2001，科學(xué)出版社，顏?zhàn)臃f，王海林譯)。以RnD6CA/B DNA為模板，通過(guò)在正向引物(SEQ ID NO12)中引入BamHI位點(diǎn)(將Hind III換為BamH I位點(diǎn))和反向引物(SEQ ID NO9(RnD6CA)和SEQ ID NO11(RnD6CB))中引入Sac I位點(diǎn)(將Xba I換為Sac I位點(diǎn))，將其插入pBI121雙元表達(dá)載體[14]中的CaMV 35S啟動(dòng)子后面，得到一個(gè)雙元表達(dá)載體pRnD6CA/B，其圖譜如圖9所示。經(jīng)BamH I和SacI酶切、PCR鑒定插入片段無(wú)誤后，轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404[15]，經(jīng)提取質(zhì)粒，酶切、PCR確認(rèn)。該表達(dá)載體可直接用于植物的轉(zhuǎn)化(參見(jiàn)圖9)。
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IB051489-序列表SEQUENCE LISTING<110>中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所<120>具有Δ6脂肪酸脫氫酶功能的嵌合基因及其應(yīng)用<130>IB051489<160>13<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1347<212>DNA<213>人工序列<400>1atggctaatg caatcaagaa gtacatgaca gttgaggagc taaaagtgca taacaagcca60gaggatttgt ggatctctat tcagggtaag gtttacaatg tcactgattg gaaaaaggaa 120cacccaggtg gggatagctc tctcctgaat ctaggtggtc aagatgtcac agatgcattc 180attgcttatc atccaggtac tgcttggcaa tatcttgaca ggttctttac tgggtattat 240ctcaaagatt tcaatgtctc agatgtatcc aaagattata gaaaacttgc atctgagttt 300accaaaatgg gtctttttgc aaagaaaggg catggtgttt tctactcctt ttgtcttggg 360gcattcttgt ttgctgtttg tgtttatggt gttttgtatt ctcaaagttt gtttgtgcat 420ttgtgttgtg gtgggatttt ggggttttta tggatgcaaa gtggttatgc tggtcacgat 480tctgggcatt atcagacaat gtctactcct ttttatacca atttggctca aattcttact 540ggaaattgcc ttagtggtat tagtatggct tggtggaaat ggacccacaa tgctcaccac 600gttgctgtta atagtattga ccatgaccct gatcttcagt acatgccatt ttttgtcctc 660tctcccaaat tgttcaatgg cataacttct cgcttttatg ggaggaagtt ggagtttgat 720gcttttgcta ggttcatggt aagttatcag cattggacat tttatccggt gatgattttt 780gcacgatttt atatgtttgt gcccacgttt tttatgttgc tttcaaagaa aaaagtaccc 840aacagacctt tgaatatagc gggaattatt gtgttctgga tttggtttcc tcttcttgtt 900tcatgccttc ccaattggac tgagaggatg atgtttgtgc tagtgagctt tacagttact 960tcaattcaac acgttacatt ttgtttgaat cactactcgg ctgataatta tatgggacat 1020cctactggga acgattggtt tgagaagcag acaagtggga ctttggacat ttcgtgcccg 1080tcttggatgg attggtttca tggtgggctg caattccaaa ttgagcatca tttgttccct 1140cgattgcctc gatgccagct taggacggtc tctccttttg cgatggagct atgcaagaag 1200
IB051489-序列表cacaatttgc cttataggag tttgtccttt ttggaggcca atgtcgcgac cattatgacg 1260ttgaggactg cagccctgca agcgcgcgac ttgtccaacc cggttccgaa gaacttgctc 1320tgggaagctg tcacctgccc ggggtga 1347<210>2<211>1347<212>DNA<213>人工序列<400>2atggctaatg caatcaagaa gtacatgaca gttgaggagc taaaagtgca taacaagcca60gaggatttgt ggatctctat tcagggtaag gtttacaatg tcactgattg gaaaaaggaa 120cacccaggtg gggatagctc tctcctgaat ctaggtggtc aagatgtcac agatgcattc 180attgcttatc atccaggtac tgcttggcaa tatcttgaca ggttctttac tgggtattat 240ctcaaagatt tcaatgtctc agatgtatcc aaagattata gaaaacttgc atctgagttt 300accaaaatgg gtctttttgc aaagaaaggg catggtgttt tctactcctt ttgtcttggg 360gcattcttgt ttgctgtttg tgtttatggt gttttgtatt ctcaaagttt gtttgtgcat 420ttgtgttgtg gtgggatttt ggggttttta tggatgcaaa gtggttatgc tggtcacgat 480tctgggcatt atcagacaat gtctactcct ttttatacca atttggctca aattcttact 540ggaaattgcc ttagtggtat tagtatggct tggtggaaat ggacccacaa tgctcaccac 600gttgctgtta atagtattga ccatgaccct gatcttcagt acatgccatt ttttgtcctc 660tctcccaaat tgttcaatgg cataacttct cgcttttatg ggaggaagtt ggagtttgat 720gcttttgcta ggttcatggt aagttatcag cattggacat tttatccggt gatgattttt 780gcacgatttt atatgtttgt gcccacgttt tttatgttgc tttcaaagaa aaaagtaccc 840aacagacctt tgaatatagc gggaattatt gtgttctgga tttggtttcc tcttcttgtt 900tcatgccttc ccaattggac tgagaggatg atgtttgtgc tagtgagctt tacagttact 960tcaattcaac acgttacatt ttgtttgaat cactactcgg ctgataatta tatgggacat 1020cctactggga acgattggtt tgagaagcag acaagtggga ctttggacat ttcgtgcccg 1080tcttggatgg attggtttca tggtgggctg caattccaaa ttgagcatca tttgttccca 1140agattgcctc gatgccagct taggaaggtc tctccttttg tgaaagagct ttgcaagaaa 1200cacaatttgc cttataggag tttatcattt tttgaggcca atgttgcaac cattaagacg 1260ttgaggactg ccgccttgca agctcgcgac ctatccaacc ctatttcaaa gaatttgcta 1320tgggaagctg tcaacaccta tggctga 1347<210>3<211>227<212>DNA<213>人工序列
IB051489-序列表<400>3ttgagcatca tttgttccct cgattgcctc gatgccagct taggacggtc tctccttttg60cgatggagct atgcaagaag cacaatttgc cttataggag tttgtccttt ttggaggcca 120atgtcgcgac cattatgacg ttgaggactg cagccctgca agcgcgcgac ttgtccaacc 180cggttccgaa gaacttgctc tgggaagctg tcacctgccc ggggtga 227<210>4<211>227<212>DNA<213>人工序列<400>4ttgagcatca tttgttccca agattgcctc gatgccagct taggaaggtc tctccttttg60tgaaagagct ttgcaagaaa cacaatttgc cttataggag tttatcattt tttgaggcca 120atgttgcaac cattaagacg ttgaggactg ccgccttgca agctcgcgac ctatccaacc 180ctatttcaaa gaatttgcta tgggaagctg tcaacaccta tggctga 227<210>5<211>1139<212>DNA<213>人工序列<400>5atggctaatg caatcaagaa gtacatgaca gttgaggagc taaaagtgca taacaagcca60gaggatttgt ggatctctat tcagggtaag gtttacaatg tcactgattg gaaaaaggaa 120cacccaggtg gggatagctc tctcctgaat ctaggtggtc aagatgtcac agatgcattc 180attgcttatc atccaggtac tgcttggcaa tatcttgaca ggttctttac tgggtattat 240ctcaaagatt tcaatgtctc agatgtatcc aaagattata gaaaacttgc atctgagttt 300accaaaatgg gtctttttgc aaagaaaggg catggtgttt tctactcctt ttgtcttggg 360gcattcttgt ttgctgtttg tgtttatggt gttttgtatt ctcaaagttt gtttgtgcat 420ttgtgttgtg gtgggatttt ggggttttta tggatgcaaa gtggttatgc tggtcacgat 480tctgggcatt atcagacaat gtctactcct ttttatacca atttggctca aattcttact 540ggaaattgcc ttagtggtat tagtatggct tggtggaaat ggacccacaa tgctcaccac 600gttgctgtta atagtattga ccatgaccct gatcttcagt acatgccatt ttttgtcctc 660tctcccaaat tgttcaatgg cataacttct cgcttttatg ggaggaagtt ggagtttgat 720gcttttgcta ggttcatggt aagttatcag cattggacat tttatccggt gatgattttt 780gcacgatttt atatgtttgt gcccacgttt tttatgttgc tttcaaagaa aaaagtaccc 840aacagacctt tgaatatagc gggaattatt gtgttctgga tttggtttcc tcttcttgtt 900tcatgccttc ccaattggac tgagaggatg atgtttgtgc tagtgagctt tacagttact 960tcaattcaac acgttacatt ttgtttgaat cactactcgg ctgataatta tatgggacat 1020
IB051489-序列表cctactggga acgattggtt tgagaagcag acaagtggga ctttggacat ttcgtgcccg 1080tcttggatgg attggtttca tggtgggctg caattccaaa ttgagcatca tttgttccc1139<210>6<211>448<212>PRT<213>人工序列<400>6Met Ala Asn Ala Ile Lys Lys Tyr Met Thr Val Glu Glu Leu Lys Val1 5 10 15His Asn Lys Pro Glu Asp Leu Trp Ile Ser Ile Gln Gly Lys Val Tyr20 25 30Asn Val Thr Asp Trp Lys Lys Glu His Pro Gly Gly Asp Ser Ser Leu35 40 45Leu Asn Leu Gly Gly Gln Asp Val Thr Asp Ala Phe Ile Ata Tyr His50 55 60Pro Gly Thr Ala Trp Gln Tyr Leu Asp Arg Phe Phe Thr Gly Tyr Tyr65 70 75 80Leu Lys Asp Phe Ash Val Ser Asp Val Ser Lys Asp Tyr Arg Lys Leu85 90 95Ala Ser Glu Phe Thr Lys Met Gly Leu Phe Ala Lys Lys Gly His Gly100 105 110Val Phe Tyr Ser Phe Cys Leu Gly Ala Phe Leu Phe Ala Val Cys Val115 120 125Tyr Gly Val Leu Tyr Ser Gln Ser Leu Phe Val His Leu Cys Cys Gly130 135 140Gly Ile Leu Gly Phe Leu Trp Met Gln Ser Gly Tyr Ala Gly His Asp145 150 155 160Ser Gly His Tyr Gln Thr Met Ser Thr Pro Phe Tyr Thr Asn Leu Ala165 170 175Gln Ile Leu Thr Gly Asn Cys Leu Ser Gly Ile Ser Met Ala Trp Trp180 185 190Lys Trp Thr His Asn Ala His His Val Ala Val Asn Ser Ile Asp His195 200 205Asp Pro Asp Leu Gln Tyr Met Pro Phe Phe Val Leu Ser Pro Lys Leu210 215 220Phe Asn Gly Ile Thr Ser Arg Phe Tyr Gly Arg Lys Leu Glu Phe Asp225 230 235 240
IB051489-序列表Ala Phe Ala Arg Phe Met Val Ser Tyr Gln His Trp Thr Phe Tyr Pro245 250 255Val Met Ile Phe Ala Arg Phe Tyr Met Phe Val Pro Thr Phe Phe Met260 265 270Leu Leu Ser Lys Lys Lys Val Pro Asn Arg Pro Leu Asn Ile Ala Gly275 280 285Ile Ile Val Phe Trp Ile Trp Phe Pro Leu Leu Val Ser Cys Leu Pro290 295 300Asn Trp Thr Glu Arg Met Met Phe Val Leu Val Ser Phe Thr Val Thr305 310 315 320Ser Ile Gln His Val Thr Phe Cys Leu Asn His Tyr Ser Ala Asp Asn325 330 335Tyr Met Gly His Pro Thr Gly Asn Asp Trp Phe Glu Lys Gln Thr Ser340 345 350Gly Thr Leu Asp Ile Ser Cys Pro Ser Trp Met Asp Trp Phe His Gly355 360 365Gly Leu Gln Phe Gln Ile Glu His His Leu Phe Pro Arg Leu Pro Arg370 375 380Cys Gln Leu Arg Thr Val Ser Pro Phe Ala Met Glu Leu Cys Lys Lys385 390 395 400His Asn Leu Pro Tyr Arg Ser Leu Ser Phe Leu Glu Ala Asn Val Ala405 410 415Thr Ile Met Thr Leu Arg Thr Ala Ala Leu Gln Ala Arg Asp Leu Ser420 425 430Asn Pro Val Pro Lys Asn Leu Leu Trp Glu Ala Val Thr Cys Pro Gly435 440 445<210>7<211>448<212>PRT<213>人工序列<400>7Met Ala Asn Ala Ile Lys Lys Tyr Met Thr Val Glu Glu Leu Lys Val1 5 10 15His Asn Lys Pro Glu Asp Leu Trp Ile Ser Ile Gln Gly Lys Val Tyr20 25 30Asn Val Thr Asp Trp Lys Lys Glu His Pro Gly Gly Asp Ser Ser Leu
IB051489-序列表35 40 45Leu Asn Leu Gly Gly Gln Asp Val Thr Asp Ala Phe Ile Ala Tyr His50 55 60Pro Gly Thr Ala Trp Gln Tyr Leu Asp Arg Phe Phe Thr Gly Tyr Tyr65 70 75 80Leu Lys Asp Phe Asn Val Ser Asp Val Ser Lys Asp Tyr Arg Lys Leu85 90 95Ala Ser Glu Phe Thr Lys Met Gly Leu Phe Ala Lys Lys Gly His Gly100 105 110Val Phe Tyr Ser Phe Cys Leu Gly Ala Phe Leu Phe Ala Val Cys Val115 120 125Tyr Gly Val Leu Tyr Ser Gln Ser Leu Phe Val His Leu Cys Cys Gly130 135 140Gly Ile Leu Gly Phe Leu Trp Met Gln Ser Gly Tyr Ala Gly His Asp145 150 155 160Ser Gly His Tyr Gln Thr Met Ser Thr Pro Phe Tyr Thr Asn Leu Ala165 170 175Gln Ile Leu Thr Gly Asn Cys Leu Ser Gly Ile Ser Met Ala Trp Trp180 185 190Lys Trp Thr His Asn Ala His His Val Ala Val Asn Ser Ile Asp His195 200 205Asp Pro Asp Leu Gln Tyr Met Pro Phe Phe Val Leu Ser Pro Lys Leu210 215 220Phe Asn Gly Ile Thr Ser Arg Phe Tyr Gly Arg Lys Leu Glu Phe Asp225 230 235 240Ala Phe Ala Arg Phe Met Val Ser Tyr Gln His Trp Thr Phe Tyr Pro245 250 255Val Met Ile Phe Ala Arg Phe Tyr Met Phe Val Pro Thr Phe Phe Met260 265 270Leu Leu Ser Lys Lys Lys Val Pro Asn Arg Pro Leu Asn Ile Ala Gly275 280 285Ile Ile Val Phe Trp Ile Trp Phe Pro Leu Leu Val Ser Cys Leu Pro290 295 300Asn Trp Thr Glu Arg Met Met Phe Val Leu Val Ser Phe Thr Val Thr305 310 315 320Ser Ile Gln His Val Thr Phe Cys Leu Asn His Tyr Ser Ala Asp Asn325 330 335
IB051489-序列表Tyr Met Gly His Pro Thr Gly Asn Asp Trp Phe Glu Lys Gln Thr Ser340 345 350Gly Thr Leu Asp Ile Ser Cys Pro Ser Trp Met Asp Trp Phe His Gly355 360 365Gly Leu Gln Phe Gln Ile Glu His His Leu Phe Pro Arg Leu Pro Arg370 375 380Cys Gln Leu Arg Lys Val Ser Pro Phe Val Lys Glu Leu Cys Lys Lys385 390 395 400His Asn Leu Pro Tyr Arg Ser Leu Ser Phe Phe Glu Ala Asn Val Ala405 410 415Thr Ile Lys Thr Leu Arg Thr Ala Ala Leu Gln Ala Arg Asp Leu Ser420 425 430Asn Pro Ile Ser Lys Asn Leu Leu Trp Glu Ala Val Asn Thr Tyr Gly435 440 445<210>8<211>36<212>DNA<213>人工序列<400>8ttgagcatca tttgttccct cgattgcctc gatgcc36<210>9<211>33<212>DNA<213>人工序列<400>9gcggtctaga tcaccccggg caggtgacag ctt 33<210>10<211>36<212>DNA<213>人工序列<400>10ttgagcatca tttgttccca agattgcctc gatgcc36<210>11<211>36<212>DNA
IB051489-序列表<213>人工序列<400>11gcggtctaga tcagccatag gtgttgacag cttccc36<210>12<211>37<212>DNA<213>人工序列<400>12cgcgaagctt atggctaatg caatcaagaa gtacatg 37<210>13<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>13gggaacaaat gatgctcaat ttgg 2權(quán)利要求
1.一種嵌合基因RnD6CA，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。
2.一種嵌合基因RnD6CB，其核苷酸序列如SEQ ID NO2所示。
3.權(quán)利要求1的嵌合基因RnD6CA所編碼的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO6所示。
4.權(quán)利要求2的嵌合基因RnD6CB所編碼的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO7所示。
5.一種表達(dá)載體，其特征在于包含權(quán)利要求1或2所述的嵌合基因。
6.權(quán)利要求5的表達(dá)載體，其為酵母表達(dá)載體或植物表達(dá)載體。
7.權(quán)利要求6的表達(dá)載體，其中所述植物表達(dá)載體選自pBIN19，pBI121，pB221，或含DRE和/或ABRE元件的誘導(dǎo)啟動(dòng)子以及用于單子葉植物微彈轟擊的植物表達(dá)載體。
8.權(quán)利要求5的表達(dá)載體，其特征在于還包含啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子選自花椰菜花葉病毒CaMV 35S、Ubiqutin、Actin、或植物組織部位特異表達(dá)啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子單獨(dú)或與其它植物啟動(dòng)子結(jié)合使用。
9.一種宿主細(xì)胞，其特征在于包含權(quán)利要求5的表達(dá)載體。
10.權(quán)利要求9的宿主細(xì)胞，其中所述表達(dá)載體是通過(guò)Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接的DNA轉(zhuǎn)化、微注射或電穿孔的方式導(dǎo)入。
11.權(quán)利要求9的宿主細(xì)胞，其為酵母細(xì)胞或植物細(xì)胞。
12.權(quán)利要求11的宿主細(xì)胞，其中所述酵母細(xì)胞為釀酒酵母細(xì)胞，所述植物細(xì)胞為煙草、油菜、向日葵、大豆、番茄、蓖麻、芝麻或花生的細(xì)胞。
13.權(quán)利要求1的嵌合基因RnD6CA或權(quán)利要求2的嵌合基因RnD6CB在生產(chǎn)γ-亞麻酸中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明利用來(lái)源于黑茶藨子(Ribes nigrumL.)DNA中的一個(gè)片段RnD6C(1139bp)與另外兩個(gè)約208bp的片段RnD6A和RnD6B，分別構(gòu)建成兩個(gè)具有完整閱讀框架的嵌合基因RnD6CA、RnD6CB，將其在酵母表達(dá)體系中進(jìn)行了表達(dá)。通過(guò)GC－MS分析表明，在酵母中這兩個(gè)嵌合基因所編碼的蛋白可以催化外加底物亞油酸生成γ－亞麻酸，具有Δ
文檔編號(hào)C12N9/04GK1854298SQ200510011608
公開(kāi)日2006年11月1日 申請(qǐng)日期2005年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月21日
發(fā)明者胡贊民, 陸萬(wàn)香, 胡軍, 陳宇紅, 尹維波 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所