專利名稱：一種基因工程菌、其構(gòu)建方法和其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。具體來說，本發(fā)明涉及一種基因工程菌、其構(gòu)建方法和其用途。
背景技術(shù)：
冠菌素C18H25NO4，分子量為319，由一個含氨基酸的冠烷酸(coronamic acid)和一個聚酮結(jié)構(gòu)的冠菌酸(coronafacic acid)兩個組分以酰氨鍵連結(jié)而成。最初的文獻(xiàn)報到它是一種植物毒素。但最近研究發(fā)現(xiàn)冠菌素與植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)脫落酸、茉莉酸有類似的功能，而且活性是后兩者的數(shù)千倍，可作為后兩者(較為昂貴，生產(chǎn)上很難推廣開)的替代物。冠菌素屬純天然品，在生產(chǎn)上應(yīng)用不會對環(huán)境造成污染，是一種環(huán)境友好型生物調(diào)節(jié)劑。但目前對于冠菌素的研究一直停留在實(shí)驗(yàn)室階段。原因是它的發(fā)酵生產(chǎn)成本太高，國際上沒有產(chǎn)品，只是個別實(shí)驗(yàn)室為了研究需要，純化了少量樣品。限制其產(chǎn)業(yè)化的最重要因素就是缺少常溫(26℃-28℃)下高產(chǎn)的優(yōu)良菌株。
有關(guān)研究表明丁香假單胞菌大豆致病變種(Pseudomonassyringae pv.glycinea)產(chǎn)生冠菌素的量與溫度密切相關(guān)，在18℃時產(chǎn)量最高，約20mg/l，24℃產(chǎn)量僅為25％，到28℃時幾乎檢測不到冠菌素(David，1993)。Ullrich等認(rèn)為合成冠菌素的酶系受溫度控制的(budde et.al 1998；Ullrich et.al 1993；Bender et.al 1996Rangaswamyet.al 1997；Ullrich，2000)。
目前，要生產(chǎn)冠菌素只能用18℃的低溫發(fā)酵，這樣則要消耗大量的電、水等資源用于控溫。這與我國資源虧乏的國情不相應(yīng)。也極大地提高了生產(chǎn)成本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于獲得一種能夠用于在常溫下發(fā)酵生產(chǎn)冠菌素的基因工程菌株。
本發(fā)明的另一目的是提供該菌株的構(gòu)建方法。
本發(fā)明的再一個目的是提供該基因工程菌的用途。
本發(fā)明發(fā)明人經(jīng)過深入研究，獲得了一種溫度控制基因突變失活的丁香假單胞菌大豆致病變種(Pseudomonas syringae pv.glycinea)菌株，從而完成了本發(fā)明。該菌株已于2004年12月21日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)(地址北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號中國科學(xué)院微生物研究所)，保藏號為CGMCC1276。
構(gòu)建本發(fā)明的丁香假單胞菌大豆致病變種CGMCC1276的方法包括如下步驟1、將Tn5轉(zhuǎn)座子S17-1插入到出發(fā)菌的基因組中；2、篩選溫度控制基因突變失活的菌株獲得所述菌株，獲得所述菌株。
所述方法詳述如下1、將Tn5轉(zhuǎn)座子S17-1插入到出發(fā)菌的基因組中；選取質(zhì)粒載體pRL1063a，其中具有Tn5轉(zhuǎn)座子S17-1(如圖1)。將質(zhì)粒載體pRL1063a和出發(fā)菌株(丁香假單胞菌大豆致病變種(P.syringae pv.glycinea))分別在含有卡那霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)；將培養(yǎng)的好的質(zhì)粒載體pRL1063a和出發(fā)菌株混合，在搖床上培養(yǎng)，使Tn5轉(zhuǎn)座子S17-1插入到出發(fā)菌株的基因組中；離心，棄去上清液，將所得菌體沉淀進(jìn)行培養(yǎng)。
得到的培養(yǎng)物為質(zhì)粒載體pRL1063a、出發(fā)菌株、插入轉(zhuǎn)座子S17-1的突變菌株的混合物。
本步驟優(yōu)選的是將質(zhì)粒載體pRL1063a和出發(fā)菌株分別在含有濃度為5μg/L-15μg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)；按體積比1∶1-2取質(zhì)粒載體pRL1063a和出發(fā)菌株混合，在溫度為26℃-32℃，轉(zhuǎn)速為150rpm/min-300rpm/min搖床上作用20-40分鐘，以10000r/min-20000r/min離心5-15分鐘，棄去上清液，將菌體沉淀接種到LB固體培養(yǎng)基上，在溫度為26℃-32℃條件下培養(yǎng)12-48小時。
本步驟更優(yōu)選的是將質(zhì)粒載體pRL1063a和出發(fā)菌株分別在含有濃度為10μg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)；按體積比1∶1.2取生長對數(shù)期的質(zhì)粒載體pRL1063a和出發(fā)菌株混合，在溫度為30℃，轉(zhuǎn)速為200rpm/min搖床上作用30分鐘，以12000r/min離心10min，用生理鹽水洗滌兩次，棄去上清夜，將菌體沉淀接種到LB固體培養(yǎng)基上，在溫度為30℃條件下培養(yǎng)24小時。
2、篩選溫度控制基因突變失活的菌株，該步驟包括以下三個階段(1)將步驟1所得培養(yǎng)物用液體培養(yǎng)基懸浮，涂布到同時含有卡那霉素和鏈霉素的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)；將長出的單菌落轉(zhuǎn)接到新的同時含有卡那霉素和鏈霉素的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)。
得到的培養(yǎng)物為質(zhì)粒載體pRL1063a和插入轉(zhuǎn)座子S17-1的突變菌株。
本步驟優(yōu)選的是將步驟1所得培養(yǎng)物用MG液體培養(yǎng)基懸浮，涂布到MG固體培養(yǎng)基(卡那霉素濃度為5μg/L-15μg/L、鏈霉素濃度為20μg/L-40μg/L)上，在溫度為26℃-32℃條件下培養(yǎng)5-10天，將長出的單菌落轉(zhuǎn)接到新的MG固體培養(yǎng)基(卡那霉素濃度為5μg/L-15μg/L、鏈霉素濃度為20μg/L-40μg/L)上，在溫度為26℃-32℃條件下培養(yǎng)24-36小時。
本步驟更優(yōu)選的是將步驟1所得培養(yǎng)物用MG液體培養(yǎng)基懸浮，涂布到MG固體培養(yǎng)基(Keane PJ，Kerr A，New PB.1970)(卡那霉素濃度為10μg/L、鏈霉素濃度為30μg/L)平板上，在溫度為30℃條件下培養(yǎng)7-8天，將長出的單菌落轉(zhuǎn)接到新的MG固體培養(yǎng)基(卡那霉素濃度為10μg/L、鏈霉素濃度為30μg/L)平板上，在溫度為30℃條件下培養(yǎng)48小時。
(2)將步驟(1)所得培養(yǎng)物以luxAB基因?yàn)槟康幕蜻M(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增基因?yàn)閘uxAB，引物P15′-TTT GTT CGG CTT GGT ATCGC-3′；P25′-ATT GCT TAG GTC CAT TCT CA-3′。選取能擴(kuò)出目的基因片段的菌落(如圖2)進(jìn)行培養(yǎng)；所得培養(yǎng)物為插入轉(zhuǎn)座子S17-1的突變菌株。
本步驟優(yōu)選的是將步驟(1)所得培養(yǎng)物以luxAB基因?yàn)槟康幕蜻M(jìn)行PCR擴(kuò)增，選取能擴(kuò)出目的基因片段的菌落，在溫度為26℃-32℃條件下培養(yǎng)12-48小時；本步驟更優(yōu)選的是將步驟(1)所得培養(yǎng)物以luxAB基因?yàn)槟康幕蜻M(jìn)行PCR擴(kuò)增，選取能擴(kuò)出目的基因片段的菌落，接種在MG固體培養(yǎng)基上，在溫度為30℃條件下培養(yǎng)(12-48小時)。
(3)將步驟(2)所得培養(yǎng)物接種到同時含有卡那霉素和鏈霉素的液體培養(yǎng)基中，在搖床上培養(yǎng)，轉(zhuǎn)接到新培養(yǎng)基中，在溫度26℃-28℃發(fā)酵培養(yǎng)，選取可生產(chǎn)冠菌素的菌株。
本步驟優(yōu)選的是將步驟(2)所得培養(yǎng)物接種到MG液體培養(yǎng)基(卡那霉素濃度為5μg/L-15μg/L、鏈霉素濃度為20μg/L-40μg/L)中，在溫度26℃-30℃，轉(zhuǎn)速150rpm/min-300rpm/min搖床上培養(yǎng)到OD值達(dá)到0.6-0.8時，按接種量的1％-3％轉(zhuǎn)接到HSC(David，1993)培養(yǎng)基中，在溫度26℃-28℃，轉(zhuǎn)速150rpm/min-300rpm/min搖床上培養(yǎng)2-10天，選取可生產(chǎn)冠菌素的菌株。
本步驟更優(yōu)選的是將步驟(2)所得培養(yǎng)物接種到MG液體培養(yǎng)基(卡那霉素濃度為10μg/L、鏈霉素濃度為30μg/L)中，在溫度為28℃，轉(zhuǎn)速260rpm/min搖床上培養(yǎng)到OD值達(dá)到0.7時，按接種量的2％轉(zhuǎn)接到HSC培養(yǎng)基中，在溫度28℃，轉(zhuǎn)速260rpm/min搖床上培養(yǎng)5天，選取可生產(chǎn)冠菌素的菌株。
本發(fā)明選用的質(zhì)粒載體pRL1063a，其優(yōu)點(diǎn)是含有l(wèi)uxAB基因(細(xì)菌沒有)，并含有多個選擇標(biāo)記及插入位點(diǎn)等。
本發(fā)明選用的Tn5轉(zhuǎn)座子S17-1含有卡那霉素抗性基因和鏈霉素抗性基因，且該轉(zhuǎn)座子對環(huán)境是安全的。
本發(fā)明提供的溫控基因突變失活的基因工程菌可用于常溫發(fā)酵生產(chǎn)冠菌素。
在用本發(fā)明提供的菌株發(fā)酵生產(chǎn)冠菌素的不同階段，可以采用以下不同的培養(yǎng)基A培養(yǎng)基、B固體培養(yǎng)基、B液體培養(yǎng)基、C培養(yǎng)基，其具體組成如下A培養(yǎng)基蛋白胨 1％酵母浸膏 0.5％NaCl 0.5％瓊脂 1.5％pH 7.0B液體培養(yǎng)基甘露醇 1％谷氨酸鈉 0.2％KH2PO40.05％NaCl 0.02％MgSO4·7H2O 0.02％pH 7.0B固體培養(yǎng)基B液體培養(yǎng)基加1.5％的瓊脂。
C培養(yǎng)基NH4C1 1.0gMgSO4·7H2O 0.2gKH2PO44.1gK2HPO43.6gKNO30.3g2mMFeCl310mlH2O 890mlpH 6.8本發(fā)明通過Tn5轉(zhuǎn)座子突變法將轉(zhuǎn)座子S17-1插入到出發(fā)菌株的溫度調(diào)控基因上，使該基因突變失活，從而使突變的新菌株丁香假單胞菌大豆致病變種CGMCC1276可以在常溫(26℃-28℃)下產(chǎn)生冠菌素，并且高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)，產(chǎn)量可達(dá)35mg/L-40mg/L，從而解決了18℃低溫發(fā)酵的高成本問題。
生物材料保藏說明丁香假單胞菌大豆致病變種(Pseudomonas syringaepv.glycinea)CGMCC1276，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，地址北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號CGMCC1276，保藏日期2004年12月21日。


圖1為質(zhì)粒PRL1063a結(jié)構(gòu)示意圖。
圖2為PCR結(jié)果圖。泳道M為DNA分子量標(biāo)記，泳道1為pRL1063a為質(zhì)粒載體，泳道2-10為插入轉(zhuǎn)座子S17-1的突變菌株。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1將質(zhì)粒載體pRL1063a和出發(fā)菌株分別在含有濃度為10μg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)；按體積比1∶1.2取生長對數(shù)期的質(zhì)粒載體pRL1063a和出發(fā)菌株混合，在溫度為30℃，轉(zhuǎn)速為200rpm/min搖床上作用30分鐘，12000r/min離心10min，用生理鹽水洗滌兩次，棄去上清夜，將菌體沉淀接種到LB固體培養(yǎng)基上，在溫度為30℃條件下培養(yǎng)24小時。得到的培養(yǎng)物為質(zhì)粒載體pRL1063a、出發(fā)菌株、插入轉(zhuǎn)座子S17-1的突變菌株的混合物。
將培養(yǎng)好的菌體沉淀用牙簽刮下，用MG液體培養(yǎng)基懸浮，涂布到MG固體培養(yǎng)基(卡那霉素濃度為10μg/L、鏈霉素濃度為30μg/L)平板上，在溫度為30℃條件下培養(yǎng)7-8天，將長出的單菌落轉(zhuǎn)接到新的MG固體培養(yǎng)基(卡那霉素濃度為10μg/L、鏈霉素濃度為30μg/L)平板上，在溫度為30℃條件下培養(yǎng)48小時。得到的培養(yǎng)物為質(zhì)粒載體pRL1063a、插入轉(zhuǎn)座子S17-1的突變菌株的混合物。
以luxAB基因?yàn)槟康幕蜻M(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物P15′-TTT GTTCGG CTT GGT ATC GC-3′；P25′-ATT GCT TAG GTC CAT TCTCA-3′，選取能擴(kuò)出目的基因片段的菌落(如圖2)，在溫度為30℃條件下培養(yǎng)24小時。所得培養(yǎng)物為插入轉(zhuǎn)座子S17-1的突變菌株。
接種培養(yǎng)好的菌落到MG液體培養(yǎng)基(卡那霉素濃度為10μg/L、鏈霉素濃度為30μg/L)中，在溫度為28℃，轉(zhuǎn)速260rpm搖床上培養(yǎng)到OD值達(dá)到0.7時，按接種量的2％轉(zhuǎn)接到HSC培養(yǎng)基中，在溫度28℃，轉(zhuǎn)速260rpm/min搖床上培養(yǎng)5天，提取冠菌素。提取出的冠菌素用色譜淋洗劑甲醇溶解，進(jìn)行高效液相色譜檢測。冠菌素產(chǎn)量為37.5mg/l。
實(shí)施例2將質(zhì)粒載體pRL1063a和出發(fā)菌株分別在含有濃度為5μg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)；按體積比1∶1取生長對數(shù)期的質(zhì)粒載體pRL1063a和出發(fā)菌株混合，在溫度為26℃，轉(zhuǎn)速為150rpm/min搖床上作用20分鐘，以20000r/min離心5min，用生理鹽水洗滌一次，棄去上清夜，將菌體沉淀接種到LB固體培養(yǎng)基上，在溫度為26℃條件下培養(yǎng)12小時。得到的培養(yǎng)物為質(zhì)粒載體pRL1063a、出發(fā)菌株、插入轉(zhuǎn)座子S17-1的突變菌株的混合物。
將培養(yǎng)好的菌體沉淀用牙簽刮下，用MG液體培養(yǎng)基懸浮，涂布到MG固體培養(yǎng)基(卡那霉素濃度為5μg/L、鏈霉素濃度為20μg/L)平板上，在溫度為26℃條件下培養(yǎng)5天，將長出的單菌落轉(zhuǎn)接到新的MG固體培養(yǎng)基(卡那霉素濃度為5μg/L、鏈霉素濃度為20μg/L)平板上，在溫度為26℃條件下培養(yǎng)24小時。得到的培養(yǎng)物為質(zhì)粒載體pRL1063a、插入轉(zhuǎn)座子S17-1的突變菌株的混合物。
以luxAB基因?yàn)槟康幕蜻M(jìn)行PCR擴(kuò)增，選取能擴(kuò)出目的基因片段的菌落(如圖2)，在溫度為26℃條件下培養(yǎng)12小時；所得培養(yǎng)物為插入轉(zhuǎn)座子S17-1的突變菌株。
接種培養(yǎng)好的菌落到MG液體培養(yǎng)基(卡那霉素濃度為5μg/L、鏈霉素濃度為20μg/L)中，在溫度為26℃，轉(zhuǎn)速150rpm/min搖床上培養(yǎng)到OD值達(dá)到0.6時，按接種量的1％轉(zhuǎn)接到HSC培養(yǎng)基中，在溫度26℃，轉(zhuǎn)速150rpm/min搖床上培養(yǎng)2天，提取冠菌素。提取出的冠菌素用色譜淋洗劑甲醇溶解，進(jìn)行高效液相色譜檢測。冠菌素產(chǎn)量為35mg/l。
實(shí)施例3將質(zhì)粒載體pRL1063a和出發(fā)菌株分別在含有濃度為15μg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)；按體積比1∶2取生長對數(shù)期的質(zhì)粒載體pRL1063a和出發(fā)菌株混合，在溫度為32℃，轉(zhuǎn)速為300rpm/min搖床上作用40分鐘，10000r/min離心15min，棄去上清夜，將菌體沉淀接種到LB固體培養(yǎng)基上，在溫度為32℃條件下培養(yǎng)48小時。得到的培養(yǎng)物為質(zhì)粒載體pRL1063a、出發(fā)菌株、插入轉(zhuǎn)座子S17-1的突變菌株的混合物。
將培養(yǎng)好的菌體沉淀用牙簽刮下，MG用液體培養(yǎng)基懸浮，涂布到MG固體培養(yǎng)基(卡那霉素濃度為15μg/L、鏈霉素濃度為40μg/L)平板上，在溫度為32℃條件下培養(yǎng)10天，將長出的單菌落轉(zhuǎn)接到新的MG固體培養(yǎng)基(卡那霉素濃度為15μg/L、鏈霉素濃度為40μg/L)平板上，在溫度為32℃條件下培養(yǎng)36小時。得到的培養(yǎng)物為質(zhì)粒載體pRL1063a、插入轉(zhuǎn)座子S17-1的突變菌株的混合物。
以luxAB基因?yàn)槟康幕蜻M(jìn)行PCR擴(kuò)增，選取能擴(kuò)出目的基因片段的菌落(如圖2)，在溫度為32℃條件下培養(yǎng)48小時；所得培養(yǎng)物為插入轉(zhuǎn)座子S17-1的突變菌株。
接種培養(yǎng)好的菌落到MG液體培養(yǎng)基(卡那霉素濃度為15μg/L、鏈霉素濃度為40μg/L)中，在溫度為30℃，轉(zhuǎn)速300rpm/min搖床上培養(yǎng)到OD值達(dá)到0.8時，按接種量的3％轉(zhuǎn)接到HSC培養(yǎng)基中，在溫度28℃，轉(zhuǎn)速300rpm/min搖床上培養(yǎng)10天，提取冠菌素。提取出的冠菌素用色譜淋洗劑甲醇溶解，進(jìn)行高效液相色譜檢測。冠菌素產(chǎn)量為40mg/l。
實(shí)施例4接種丁香假單胞菌大豆致病變種CGMCC1276的單菌落到裝有B液體培養(yǎng)基(卡那霉素濃度為10μg/L、鏈霉素濃度為30μg/L)的試管中，在溫度26℃，轉(zhuǎn)速260rpm/min搖床上培養(yǎng)種子液。當(dāng)種子液OD值達(dá)到0.7時，取1ml轉(zhuǎn)接到500ml三角瓶、內(nèi)裝50mlC培養(yǎng)基(卡那霉素濃度為10μg/L、鏈霉素濃度為30μg/L)中，在溫度26℃，轉(zhuǎn)速260rpm/min搖床上培養(yǎng)5天，提取冠菌素。進(jìn)行三個重復(fù)處理。進(jìn)行高效液相色譜檢測，確認(rèn)是冠菌素，產(chǎn)量達(dá)37.5mg/l。
實(shí)施例5接種丁香假單胞菌大豆致病變種CGMCC1276的單菌落到裝有B液體培養(yǎng)基(卡那霉素濃度為10μg/L、鏈霉素濃度為30μg/L)的試管中，在溫度28℃，轉(zhuǎn)速260rpm/min搖床上培養(yǎng)36-48小時，為一級種子液。
將250ml B液體培養(yǎng)基分裝于三個500ml三角瓶中。將培養(yǎng)好的一級種子液按1-2％接種量分別接種于上述三個500ml三角瓶中，在溫度28℃，轉(zhuǎn)速260rpm/min搖床上培養(yǎng)36-48小時，為二級種子液。
用7升的發(fā)酵罐內(nèi)裝5升的C培養(yǎng)基，用常規(guī)高壓熱蒸汽滅菌發(fā)滅菌后，按1-2％接種量接種二級種子液，通氣攪拌。發(fā)酵溫度28℃，發(fā)酵pH5.5-6.8。
發(fā)酵時間達(dá)到5天時下罐。下罐發(fā)酵液以大網(wǎng)格樹脂吸附法回收產(chǎn)品，并用乙醇洗脫，經(jīng)重結(jié)晶，得到無色結(jié)晶狀冠菌素產(chǎn)品，產(chǎn)量為37.3mg/l。
權(quán)利要求
1.一種基因工程菌，該菌株為丁香假單胞菌大豆致病變種(Pseudomonas syringae pv.glycinea)CGMCC 1276。
2.權(quán)利要求1所述基因工程菌的構(gòu)建方法，該方法包括如下步驟(1)將Tn5轉(zhuǎn)座子S17-1插入到出發(fā)菌的基因組中；(2)篩選溫度控制基因突變失活的菌株。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所說的篩選溫度控制基因突變失活的菌株步驟包括如下三個階段a)將步驟(1)所得培養(yǎng)物用液體培養(yǎng)基懸浮，涂布到同時含有卡那霉素和鏈霉素的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)；將長出的單菌落轉(zhuǎn)接到新的同時含有卡那霉素和鏈霉素的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)；b)將步驟a)所得培養(yǎng)物以luxAB基因?yàn)槟康幕蜻M(jìn)行PCR擴(kuò)增，選取能擴(kuò)出目的基因片段的菌落進(jìn)行培養(yǎng)；c)將步驟b)所得培養(yǎng)物接種到同時含有卡那霉素和鏈霉素的液體培養(yǎng)基中，在搖床上培養(yǎng)，轉(zhuǎn)接到新培養(yǎng)基中，在溫度26℃-28℃發(fā)酵培養(yǎng)，選取可生產(chǎn)冠菌素的菌株。
4.權(quán)利要求1所述的基因工程菌的用途，其特征在于將所述菌株用于冠菌素的發(fā)酵生產(chǎn)中。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基因工程菌(丁香假單胞菌大豆致病變種CGMCC 1276)、其構(gòu)建方法及其用途。該工程菌是利用Tn5轉(zhuǎn)座子S17－1插入到出發(fā)菌的基因組中，使其溫度控制基因失活而獲得的。該菌株可在發(fā)酵溫度為26℃－28℃的條件下用于工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)冠菌素。產(chǎn)量與出發(fā)菌(發(fā)酵溫度為18℃)相近，可達(dá)35mg/l－40mg/l。
文檔編號C12N1/21GK1673353SQ20051001146
公開日2005年9月28日 申請日期2005年3月23日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月23日
發(fā)明者李召虎, 張家常, 段留生, 李建民, 田曉莉, 王保民, 焦睿, 吳惠玲, 何鐘佩, 翟志席, 奚勤 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)