專利名稱：列管式取向排列結構細胞支架及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種具有列管式取向排列結構的組織工程用生物可降解細胞支架。
本發(fā)明還涉及上述細胞支架的制備方法。
背景技術：
組織工程是將工程學原理同細胞學和組織生物學原理結合在一起以替代有缺陷(已老化、受損傷或病態(tài))組織和器官的科學。它是先將自體細胞或干細胞在生物材料所制備、與所需修復的組織或器官具有相同構形的支架上進行體外培養(yǎng)擴增、而后再植入體內(nèi)的病損部位、使之繁衍、從而最終達到修復重建組織或器官、恢復功能的目的。由于通過組織工程再造的組織和器官不但可以同人工替代物一樣進行大批量的生產(chǎn)，而且可同天然的組織和器官一樣具有功能、還可防止免疫排斥的產(chǎn)生，因此可以完全解決如今在組織和器官的修復重建臨床上所采用的自體移植、異體移植、異種移植和人工器官等方法所存在的免疫排斥、供源不足，和功能不全等問題，被認為是最有望徹底解決組織和器官修復和治療難題的途徑。
組織工程的核心是構建由細胞與細胞支架結合而成的復合體，因此細胞、細胞支架，以及組織和器官的形成和再生是組織工程的三大要素。其中細胞支架的功能是為細胞的增殖、繁衍提供三維空間、提供營養(yǎng)、進行氣體交換、排除廢物，并且決定新生組織、器官的形狀和大小。所以細胞支架必須保證能讓細胞很好地貼附、生長和繁衍，因此細胞支架必須具有良好的細胞親和性；為保證細胞能在整個支架的各部分都得到繁衍生長、可以很好地進行氣體交換和排除廢物，細胞支架必須具有一定的孔徑和互相溝通的三維孔結構；為了保證新生的組織和器官具有與需再生的組織和器官有同相同形狀大小，細胞支架還必須具有一定的幾何形狀；更為重要的是為保證細胞支架能隨著細胞的生長而逐漸消失、從而不影響細胞的繁衍，細胞支架還必須具備與細胞繁衍速度相匹配的生物降解速度、能在體內(nèi)的生理環(huán)境下逐漸降解、由大分子變成小分子，以至最終被機體代謝或吸收。從臨床應用出發(fā)，對于如關節(jié)軟骨、肌腱、周圍神經(jīng)、脊髓等具有取向結構的組織，則不但要求細胞支架能滿足以上的各種性能要求，而且還要求細胞支架具有列管式取向結構，可使細胞能按照支架的取向結構繁衍和生長，以形成與天然組織結構相似的取向組織。因此具有列管式取向結構的細胞支架對于組織工程化關節(jié)軟骨、肌腱、周圍神經(jīng)、脊髓等具有取向結構的組織重建和再生具有特別重要的意義。
制備具有一定孔結構細胞支架的技術很多，包括溶液澆鑄和制孔劑成型技術、相分離技術、氣體制孔技術、乳液凍結干燥技術、快速成型技術、纖維編織技術，以及多種方法聯(lián)合應用的技術等(王身國，中國康復理論和實踐，2002，8(5)267-269)。通過以上的技術可以制備用不同材質制備的、孔徑從幾微米到幾百微米，呈單一孔結構或多種孔結構，具有纖維狀、棒狀、板狀、膜狀、管狀等不同形狀、不同厚度，不同大小的各種細胞支架，也可制備用一種或幾種材料制備、呈一種或多種孔結構的復合結構細胞支架，以供多細胞組織工程細胞培養(yǎng)的需要。但是用這些技術卻無法制成呈列管式取向結構的細胞支架，特別是不能制成既具有管狀的一級孔、又具有管壁的微小孔(二級孔)可使管管間相通的列管式取向結構細胞支架。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種列管式取向排列結構細胞支架。
本發(fā)明的又一目的在于提供上述細胞支架的制備方法。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的列管式取向排列結構細胞支架，具有管狀的列管式取向排列的一級孔，其管壁具有二級孔，一級孔和一級孔之間由二級孔使之相互連通，一級孔的孔徑為40-300微米，二級孔的孔徑為0.01-3微米。本發(fā)明的細胞支架可應用于組織工程化關節(jié)軟骨、肌腱、周圍神經(jīng)、脊髓等方面。
本發(fā)明提供的制備上述細胞支架的方法，是采用溫度梯度引導溶液熱致相分離的技術，利用溶劑的結晶、而后在減壓下升華來形成孔結構；其中利用在溫度梯度的推動下大量的第一溶劑自下而上地結晶生長形成取向的列管結構；利用冷凍速度的快慢和冷凍溫度的高低來形成不同粗細的管徑；利用添加第二溶劑來形成管壁的二級微孔。
具體地說，本發(fā)明提供的制備方法，其主要步驟是a)取一塑料直筒，垂直放置在相同直徑的金屬棒上；b)用第一溶劑溶解生物可降解材料，配置成重量比為1-10％的溶液；c)在步驟b的溶液中加入第二溶劑，其加入量為第一溶劑重量的0.01-5.0％，攪拌均勻后靜止10-12小時；d)將步驟c的溶液倒入塑料直筒；e)冷卻金屬棒下端，并逐漸降溫，降溫速度為0.01-2.5℃/分鐘，降溫范圍為+37至-196℃，使生物可降解材料溶液中的溶劑結晶固化；f)將步驟e的固化物取出，于-40至-50℃干燥48-72小時，使溶劑升華。
本發(fā)明中，制備列管式取向結構細胞支架的塑料筒由聚乙烯、聚丙烯、聚四氟乙烯，或聚對苯二甲酸乙二醇酯制成。其下端的金屬棒為銀棒、不銹鋼棒、鈦合金棒，或鋁棒。金屬棒的長度可為5-25厘米。
本發(fā)明中，用作列管式取向結構的細胞支架的生物降解高分子材料成分為合成脂肪族聚酯類生物降解高分子材料，它們是聚L-丙交酯(PLLA)、聚DL-丙交酯(PDLLA)、共聚(L-丙交酯/DL-丙交酯)(PLLA-co-PDLLA)、共聚(丙交酯/乙交酯)(PLGA)、聚己內(nèi)酯(PCL)、聚(乙交酯/丙交酯/己內(nèi)酯)三元共聚物(PGLC)、聚己內(nèi)酯/聚醚嵌段共聚物(PCE)、聚己內(nèi)酯/聚醚/聚丙交酯三元共聚物(PCEL)，以及聚β-羥丁酯(PHB)、聚β-羥戊酯(PHV)和聚羥基酸(PHA)；或以上兩種合成脂肪族聚酯類生物降解高分子的共混物；合成脂肪族聚酯的分子量為40000-300000，共混物的重量比為95∶5-50∶50。
本發(fā)明中，用作列管式取向結構細胞支架的生物可降解材料成分也可為天然生物降解高分子材料，它們是殼聚糖、明膠、膠原蛋白、海藻酸鈉，或以上兩種天然生物降解高分子的共混物，共混物的重量比為95∶5-50∶50。
本發(fā)明中，用作列管式取向結構細胞支架的生物可降解材料成分中也可包含第三組分，如生長因子那樣的生物可降解活性物質成分，其中所述的生長因子是神經(jīng)生長因子(NGF)、成纖細胞生長因子(FGF)、上皮生長因子(EGF)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)、轉化生長因子(TGF-β)、骨衍生性生長因子(BDGF)中的一種或幾種共混物。生長因子與生物降解高分子材料的重量比為0.0001-0.01∶1。
本發(fā)明中，用作列管式取向結構細胞支架材料的第三組分還可包括或如磷酸三鈣、羥基磷灰石那樣的生物可降解無機物質成分。無機物質與生物降解高分子材料的重量比為0.01-0.30∶1。
本發(fā)明中，根據(jù)所用的生物可降解材料的性質，用于配制溶液以形成管狀孔(一級孔)的主要溶劑，即第一溶劑為有機溶劑如苯、二氧六環(huán)、四氫呋喃、丙酮；以及水劑，如蒸餾水、濃度為0.5-15.0％(重量)的酸溶液。
本發(fā)明中，添加于第一溶劑中用于使在管壁形成微孔(二級孔)的第二溶劑為能與第一溶劑共溶的溶劑，如水、丙酮、苯、四氫呋喃、氯仿。第二溶劑的用量為第一溶劑的0.01-5.0％(重量)。
本發(fā)明中，采用的降溫速度為0.01-2.5℃/分鐘，降溫范圍為+37至-196℃。


圖1為本發(fā)明的細胞支架示意圖。
具體實施例方式
如附圖1所示，本發(fā)明的細胞支架中一級管狀孔(a)呈列管式取向排列，其孔徑在40-300微米范圍，支架的管壁具有二級孔(b)，其孔徑在50納米-3微米范圍。一級孔和一級孔之間由二級孔使之相互連通，所以實際上形成的細胞支架上各孔之間均是相互連通的。
實施例1取分子量為40000的0.5克聚L-丙交酯(PLLA)用二氧六環(huán)配成1％(重量)的溶液，置于前述的裝置的塑料直筒中。將溶液從28℃起以0.2℃/分鐘的降溫速度對裝置下端的金屬棒進行冷卻，直到0℃為止使結晶生長完全。然后冷凍干燥48小時使溶劑完全脫除，得到一級孔徑為280±20微米的列管式取向結構細胞支架。
實施例2取分子量為60000的1.5克聚DL-丙交酯(PDLLA)用四氫呋喃配成3％(重量)的溶液，置于前述的裝置的塑料直筒中。將溶液從26℃起以0.4℃/分鐘的降溫速度對裝置下端的金屬棒進行冷卻，直到-20℃為止使結晶生長完全。然后冷凍干燥48小時使溶劑完全脫除，得到一級孔徑為150±20微米的列管式取向結構細胞支架。
實施例3取分子量為50000的2.5克共聚(L-丙交酯/DL-丙交酯)(PLLA-co-PDLLA)用丙酮配成5％(重量)的溶液，置于前述的裝置的塑料直筒中。將溶液從29℃起以0.8℃/分鐘的降溫速度對裝置下端的金屬棒進行冷卻，直到-80℃為止使結晶生長完全。然后冷凍干燥48小時使溶劑完全脫除，得到一級孔徑為100±10微米的列管式取向結構細胞支架。
實施例4取分子量為100000的3.5克聚DL-丙交酯(PDLLA)用二氧六環(huán)配成7％(重量)的溶液，置于前述的裝置的塑料直筒中。將溶液從29℃起以2.0℃/分鐘的降溫速度對裝置下端的金屬棒進行冷卻，直到-196℃為止使結晶生長完全。然后冷凍干燥48小時使溶劑完全脫除，得到一級孔徑為40±5微米的列管式取向結構細胞支架。
實施例5取分子量為250000的4.5克聚L-丙交酯(PLLA)用二氧六環(huán)配成9％(重量)的溶液，置于前述的裝置的塑料直筒中。將溶液從26℃起以0.4℃/分鐘的降溫速度對裝置下端的金屬棒進行冷卻，直到-20℃為止使結晶生長完全。然后冷凍干燥48小時使溶劑完全脫除，得到一級孔徑為120±15微米的列管式取向結構細胞支架。
實施例6取分子量為80000的0.5克共聚(丙交酯/乙交酯)(PLGA)用二氧六環(huán)配成1％(重量)的溶液，置于前述的裝置的塑料直筒中。將溶液從24℃起以0.4℃/分鐘的降溫速度對裝置下端的金屬棒進行冷卻，直到-20℃為止使結晶生長完全。然后冷凍干燥48小時使溶劑完全脫除，得到一級孔徑為280±20微米的列管式取向結構細胞支架。
實施例7取分子量為60000的1.5克共聚(丙交酯/乙交酯)(PLGA)用二氧六環(huán)配成3％(重量)的溶液，置于前述的裝置的塑料直筒中。將溶液從19℃起以0.4℃/分鐘的降溫速度對裝置下端的金屬棒進行冷卻，直到-20℃為止使結晶生長完全。然后冷凍干燥48小時使溶劑完全脫除，得到一級孔徑為150±20微米的列管式取向結構細胞支架。
實施例8取分子量為50000的2.5克聚己內(nèi)酯/聚醚嵌段共聚物(PCE)用二氧六環(huán)配成5％(重量)的溶液，置于前述的裝置的塑料直筒中。將溶液從21℃起以0.01℃/分鐘的降溫速度對裝置下端的金屬棒進行冷卻，直到0℃為止使結晶生長完全。然后冷凍干燥48小時使溶劑完全脫除，得到一級孔徑為240±20微米的列管式取向結構細胞支架。
實施例9取分子量為55000的3.5克聚己內(nèi)酯/聚醚/聚丙交酯三元共聚物(PCEL)用二氧六環(huán)配成7％(重量)的溶液，置于前述的裝置的塑料直筒中。將溶液從20℃起以1.5℃/分鐘的降溫速度對裝置下端的金屬棒進行冷卻，直到-80℃為止使結晶生長完全。然后冷凍干燥48小時使溶劑完全脫除，得到一級孔徑為80±10微米的列管式取向結構細胞支架。
實施例10取分子量為40000的1.5克PLGA和分子量為80000的聚DL-丙交酯(PDLLA)3.0克用二氧六環(huán)配成9％(重量)的溶液，置于前述的裝置的塑料直筒中。將溶液從24℃起以2.5℃/分鐘的降溫速度對裝置下端的金屬棒進行冷卻，直到-196℃為止使結晶生長完全。然后冷凍干燥48小時使溶劑完全脫除，得到一級孔徑為40±5微米的列管式取向結構細胞支架。
實施例11取0.5克聚(乙交酯/丙交酯/己內(nèi)酯)三元共聚物(PGLC)用苯配成1％(重量)的溶液，置于前述的裝置的塑料直筒中。將溶液從24℃起以0.4℃/分鐘的降溫速度對裝置下端的金屬棒進行冷卻，直到-20℃為止使結晶生長完全。然后冷凍干燥48小時使溶劑完全脫除，得到一級孔徑為120±15微米的列管式取向結構細胞支架。
實施例12取1.5克聚(乙交酯/丙交酯/己內(nèi)酯)三元共聚物(PGLC)用苯配成3％(重量)的溶液，置于前述的裝置的塑料直筒中。將溶液從24℃起以0.6℃/分鐘的降溫速度對裝置下端的金屬棒進行冷卻，直到-20℃為止使結晶生長完全。然后冷凍干燥48小時使溶劑完全脫除，得到一級孔徑為300±10微米的列管式取向結構細胞支架。
實施例132.5克殼聚糖用1.0％醋酸水溶液配置成5％(重量比)的溶液，置于前述的裝置的塑料直筒中。將溶液從28℃起以1.5℃/分鐘的降溫速度對裝置下端的金屬棒進行冷卻，直到-80℃為止使結晶生長完全。然后冷凍干燥48小時使溶劑完全脫除，得到一級孔徑為80±10微米的列管式取向結構細胞支架。
實施例14用蒸餾水配置成明膠水溶液，其余條件同實施例13，得到一級孔徑為70±10微米的列管式取向結構細胞支架。
實施例15取1.5克PLLA，用二氧六環(huán)/氯仿＝95/5(重量比)的混合溶劑配置成3％(質量比)的溶液，置于前述的裝置的塑料直筒中。將溶液從25℃起以0.2℃/分鐘的降溫速度對裝置下端的金屬棒進行冷卻，直到0℃為止使結晶生長完全。然后冷凍干燥48小時使溶劑完全脫除，得到一級孔徑為150±20微米、列管壁有孔徑為0.01-1微米二級孔的列管式取向結構細胞支架。
實施例16取2.5克PLLA，用四氫呋喃/苯＝95/5(重量比)的混合溶劑配置成5％(重量比)的溶液，置于前述的裝置的塑料直筒中。將溶液從25℃起以0.4℃/分鐘的降溫速度對裝置下端的金屬棒進行冷卻，直到-20℃為止使結晶生長完全。然后冷凍干燥48小時使溶劑完全脫除，得到一級孔徑為120±15微米、列管壁有孔徑為0.1-2微米二級孔的列管式取向結構細胞支架。
實施例17取0.5克PLGA，用丙酮/四氫呋喃＝95/5(重量比)的混合溶劑配置成3％(重量比)的溶液，置于前述的裝置的塑料直筒中。將溶液從25℃起以0.4℃/分鐘的降溫速度對裝置下端的金屬棒進行冷卻，直到-20℃為止使結晶生長完全。然后冷凍干燥48小時使溶劑完全脫除，得到一級孔徑為120±20微米、列管壁有孔徑為0.1-2.5微米二級孔的列管式取向結構細胞支架。
實施例18取5克PLGA和0.05微克成纖細胞生長因子(FGF)，用二氧六環(huán)/水＝98.5/1.5(重量比)的混合溶劑配置成3％(重量比)的溶液，置于前述的裝置的塑料直筒中。將溶液從37℃起以0.4℃/分鐘的降溫速度對裝置下端的金屬棒進行冷卻，直到-20℃為止使結晶生長完全。然后冷凍干燥48小時使溶劑完全脫除，得到一級孔徑為110±20微米、列管壁有孔徑為0.05-1.5微米二級孔的列管式取向結構細胞支架。
實施例19取5克PLGA和1.0克粒徑小于10微米的磷酸三鈣粉末，用二氧六環(huán)/丙酮＝99/1(重量比)的混合溶劑配置成5％(重量比)的溶液，置于前述的裝置的塑料直筒中。將溶液從28℃起以0.8℃/分鐘的降溫速度對裝置下端的金屬棒進行冷卻，直到-80℃為止使結晶生長完全。然后冷凍干燥48小時使溶劑完全脫除，得到一級孔徑為100±20微米、列管壁有孔徑為0.01-0.5微米二級孔的列管式取向結構細胞支架。
實施例20取2.25克PLGA和0.25克粒徑小于10微米的羥基磷灰石粉末，用二氧六環(huán)/四氫呋喃＝99.99/0.01(重量比)的混合溶劑配置成5％(重量比)的溶液，置于前述的裝置的塑料直筒中。將溶液從26℃起以0.2℃/分鐘的降溫速度對裝置下端的金屬棒進行冷卻，直到0℃為止使結晶生長完全。然后冷凍干燥48小時使溶劑完全脫除，得到一級孔徑為120±15微米、列管壁有孔徑為0.01-0.5微米二級孔的列管式取向結構細胞支架。
權利要求
1.一種列管式取向排列結構細胞支架，具有管狀的列管式取向排列的一級孔，列管壁上具有二級孔，一級孔和一級孔之間由二級孔使之相互連通，一級孔的孔徑為40-300微米，二級孔的孔徑為0.01-3微米。
2.制備權利要求1細胞支架的方法，主要步驟是a)取一塑料直筒，垂直放置在相同直徑的金屬棒上；b)用第一溶劑溶解生物可降解材料，配置成重量比為1-10％的溶液；c)在步驟b的溶液中加入第二溶劑，其加入量為第一溶劑重量的0.01-5.0％，攪拌均勻后靜止10-12小時；d)將步驟c的溶液倒入塑料直筒；e)冷卻金屬棒下端，并逐漸降溫，降溫速度為0.01-2.5℃/分鐘，降溫范圍為+37至-196℃，使生物可降解材料溶液中的溶劑結晶固化；f)將步驟e的固化物取出，于-40至-50℃干燥48-72小時，使溶劑升華；所述的生物可降解材料為分子量40000-300000的合成脂肪族聚酯類生物降解材料中的一種或一種以上的共混物；或天然生物可降解材料中的一種或一種以上共混物；所述共混物的重量比為95∶5-50∶50；所述的第一溶劑為苯、二氧六環(huán)、四氫呋喃、丙酮、水或重量濃度為0.5-15.0％的酸溶液；所述的第二溶劑是能與第一溶劑共溶的溶劑，水、丙酮、苯、四氫呋喃或氯仿。
3.權利要求2的制備方法，其特征在于，所述塑料筒由聚乙烯、聚丙烯、聚四氟乙烯或聚對苯二甲酸乙二醇酯制成。
4.權利要求2的制備方法，其特征在于，所述金屬棒為銀棒、不銹鋼棒、鈦合金棒，或鋁棒，金屬棒的長度為5-25厘米。
5.權利要求2的制備方法，其特征在于，所述合成脂肪族聚酯類生物可降解材料是聚L-丙交酯、聚DL-丙交酯、共聚(L-丙交酯/DL-丙交酯)、共聚(丙交酯/乙交酯)、聚己內(nèi)酯、聚(乙交酯/丙交酯/己內(nèi)酯)三元共聚物、聚己內(nèi)酯/聚醚嵌段共聚物、聚己內(nèi)酯/聚醚/聚丙交酯三元共聚物，聚β-羥丁酯、聚β-羥戊酯、聚羥基酸中的一種或一種以上的共混物。
6.權利要求2的制備方法，其特征在于，所述天然生物可降解材料是殼聚糖、明膠、膠原蛋白、海藻酸鈉中的一種或一種以上的共混物。
7.權利要求2的制備方法，其特征在于，步驟b中的生物可降解材料中加入有生長因子，生長因子與生物可降解材料的重量比為0.0001-0.01∶1。
8.權利要求7的制備方法，其特征在于，所述的生長因子是神經(jīng)生長因子、成纖細胞生長因子、上皮生長因子、骨形態(tài)發(fā)生蛋白、轉化生長因子、骨衍生性生長因子中的一種或幾種共混物。
9.權利要求2的制備方法，其特征在于，步驟b中的生物可降解材料中加入有生物可降解無機物質，無機物質與生物可降解材料的重量比為0.01-0.30∶1。
10.權利要求9的制備方法，其特征在于，所述無機物質是磷酸三鈣或羥基磷灰石。
全文摘要
一種列管式取向排列結構細胞支架及制備方法，在下端垂直安置有一金屬棒的塑料直筒的裝置內(nèi)，采用逐漸降溫以形成溫度梯度而引導溶液熱致相分離的技術制備。細胞支架的材料是合成脂肪族聚酯類生物降解高分子材料、天然生物降解高分子材料，或共混物，材料中包含如生長因子那樣的生物可降解活性物質或生物可降解無機物質為第三組分。制備列管式取向排列結構細胞支架用的溶劑為第一溶劑，或混合有第二溶劑的第一溶劑。采用自下而上逐漸降溫的技術，降溫速度為0.01－2.5℃/分鐘，降溫范圍為+37至－196℃，最終得到管狀的一級孔孔徑為40－300微米、管壁的二級微孔孔徑為0.01－3微米的組織工程用列管式取向結構細胞支架。
文檔編號C12N5/08GK1824772SQ200510011350
公開日2006年8月30日 申請日期2005年2月25日 優(yōu)先權日2005年2月25日
發(fā)明者王身國, 楊飛, 貝建中 申請人:中國科學院化學研究所