一種脫細胞腦組織三維支架的制作方法
【技術(shù)領域】
[0001]本發(fā)明涉及細胞外基質(zhì)(ECM)制備領域，具體地說，本發(fā)明提供了一種脫細胞腦組織三維支架，其是通過使用堿性去離子水處理腦組織獲得。
【背景技術(shù)】
[0002]機體內(nèi)各種器官及組織可以視為由兩部分構(gòu)成:細胞和細胞外成分(也稱為細胞外基質(zhì)，簡稱ECM)。大部分免疫原性的物質(zhì)存在于細胞內(nèi)。相比單一或復合的人工合成生物分子材料，脫去細胞后的細胞外基質(zhì)不僅有更接近天然的生物體內(nèi)的細胞外環(huán)境，而且最大程度保留了其生物活性，在組織工程中得到越來越多的重視和應用。
[0003]對于細胞外基質(zhì)制備的研究始于20世紀90年代初，細胞外基質(zhì)制備是通過脫出組織細胞的方法去除存在于細胞內(nèi)的免疫原性成分，以得到可以用作相應組織的替代物和支架材料的細胞外基質(zhì)。體內(nèi)諸多組織器官的構(gòu)成和特性不盡相同，針對這些組織器官都有各自適合的脫細胞方案，目前脫細胞基質(zhì)的研究多見于真皮、血管、膀胱等組織和器官，對于中樞神經(jīng)組織(包括大腦、小腦、腦干、延髓)的脫細胞基質(zhì)制備還鮮有報道。
[0004]組織的種類、來源、脫細胞方法和消毒滅菌方法都會對ECM造成影響。脫細胞的目標是有效去除細胞和細胞核成分，同時使任何的副反應減小到最小，保留ECM的機械完整性。目前常用的脫細胞方法包括基于物理作用的凍融、壓力處理法；基于酶的核酸酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶處理法；基于化學作用的Triton X_100、SDS、乙酸、氨水處理法等。這些方法均有較大的不足:凍融、壓力處理容易使ECM發(fā)生大量斷裂；各種酶處理容易破壞ECM的超微結(jié)構(gòu)并且酶難以從產(chǎn)品中去除；各種洗滌劑和酸堿同樣容易破壞超微結(jié)構(gòu)，并且可能損傷ECM膠原、糖胺聚糖(GAG)和生長因子，各種有毒洗滌劑和酸堿試劑的使用也給后續(xù)的移植帶來隱患。這些問題在處理組織柔軟、結(jié)構(gòu)疏松，質(zhì)地脆的中樞神經(jīng)組織時更為明顯。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為解決上述問題，發(fā)明人提供了一種脫細胞腦組織三維支架，其是通過使用堿性去離子水處理腦組織獲得。
[0006]本發(fā)明中的“堿性去離子水”是指使用NaOH將pH調(diào)至9_10的去離子水。
[0007]—方面，本發(fā)明提供了一種脫細胞腦組織三維支架，其是通過使用堿性溶液處理大鼠腦組織獲得。
[0008]進一步的方面，使用的堿性溶液為堿性去離子水。
[0009]進一步的方面，具體制備步驟為:
[0010]原材料的獲取:
[0011]取大鼠，深度麻醉處死，在兩分鐘內(nèi)取出整個腦組織，在取出過程中，用PBS (0.0lM ；pH7.2?7.4)始終保持腦組織表面濕潤；
[0012]脫細胞處理:
[0013]用去離子水清洗腦組織標本3次，移至玻璃制培養(yǎng)皿中，加入堿性去離子水(pH9-10);每30分鐘更換新鮮堿性去離子水以保證培養(yǎng)皿中的液體清亮透明；待原材料完全呈透明狀后，使用PBS(0.0lM ;pH7.2?7.4)清洗3次，每次10分鐘；100Kunitz units DNA酶(I型DNase)處理I小時，PBS (0.0lM ；pH7.2?7.4)再次清洗3次，每次10分鐘；整個脫細胞處理過程在脫色搖床上室溫下進行(60-80r/min);
[0014]交聯(lián)處理:
[0015]將經(jīng)上述處理的腦組織組織標本移至預先配置好京尼平溶液中室溫下交聯(lián)48小時；
[0016]消毒:
[0017]在脫色搖床上(60rmp)使用PBS(0.0lM ;pH7.2?7.4)清洗交聯(lián)過的腦組織標本3次，每次3分鐘；將清洗后的腦組織標本投至1%。PAA中消毒6小時后，在脫色搖床上(60rmp)使用無菌PBS (0.0lM ;ρΗ7.2?7.4)再次清洗3次，每次3分鐘；得到的產(chǎn)品在4°C下，無菌PBS溶液內(nèi)保存。
【附圖說明】
[0018]圖1:按照本發(fā)明的方法制備的脫細胞腦組織三維支架肉眼觀察圖，左為新鮮腦組織，中為脫細胞處理后的腦組織，右為脫細胞處理后的腦組織透明度示意圖。
[0019]圖2:按照本發(fā)明的方法制備的脫細胞腦組織三維支架普通HE組織片染色(20Χ)，左為正常腦組織，右為支架。
[0020]圖3:按照本發(fā)明的方法制備的脫細胞腦組織三維支架掃描電鏡圖，左為500倍，右為8000倍(聯(lián)合種子細胞3D培養(yǎng)實驗)。
[0021]圖4:按照本發(fā)明的方法制備的脫細胞腦組織三維支架透射電鏡圖，13500倍。
[0022]圖5:按照本發(fā)明的方法制備的脫細胞腦組織三維支架甲苯胺藍髓鞘成分染色圖，左圖為正常大腦組織，右圖為脫細胞處理所得支架。
[0023]圖6:對照I方法制備的脫細胞腦組織三維支架外觀圖，左圖為氨水處理4小時，右圖為氨水處理24小時。
[0024]圖7:對照2方法制備的脫細胞腦組織三維支架外觀圖。
[0025]圖8、9和10:對照3方法制備的脫細胞腦組織三維支架外觀、普通HE組織片染色、甲苯胺藍髓鞘成分染色圖，左為正常腦組織，右為脫細胞處理后的支架。
[0026]圖11:對照4方法制備的脫細胞腦組織三維支架掃描電鏡圖，左為1000倍，右為10000 倍。
[0027]圖12和13:對照5方法制備的脫細胞腦組織三維支架普通HE組織片染色圖和外觀圖，左為正常腦組織，右為脫細胞處理后的支架。
[0028]圖14:殘留DNA含量檢測電泳圖。
【具體實施方式】
[0029]實施例1本發(fā)明脫細胞腦組織三維支架制備方法:
[0030]原材料的獲取:
[0031]取大鼠(性別不限，體重?280g)，深度麻醉處死，在兩分鐘內(nèi)取出整個腦組織，取出過程中盡可能避免銳利的硬腦膜及周圍骨贅殘端損傷中樞神經(jīng)組織；在取出過程中，用PBS(0.0lM ；pH7.2?7.4)始終保持腦組織表面濕潤；取出后直接開始脫細胞處理，也可以40CT PBS (0.0lM ；pH7.2?7.4)中儲存(但儲存時間不能超過24小時)；
[0032]脫細胞處理:
[0033]整個脫細胞處理過程在脫色搖床上室溫下進行(60-80r/min);用去離子水清洗腦組織標本3次，移至玻璃制培養(yǎng)皿中(直徑約8-lOcm)，加入堿性去離子水(pH 9-10);每30分鐘更換新鮮堿性去離子水以保證培養(yǎng)皿中的液體清亮透明；待原材料完全呈透明狀后(這一過程時間根據(jù)標本體積而定，2 X 5 X 5mm大小體積需要約3小時，整個小腦需要約30小時，大腦半球需要約70小時)，使用PBS (0.0lM ;pH7.2?7.4)清洗3次，每次10分鐘；100Kunitz units DNA 酶(I 型 DNase 美國，Sigma-Aldrich 公司)處理 I 小時，PBS (0.0lM ；pH7.2?7.4)再次清洗3次，每次10分鐘；
[0034]交聯(lián)處理:
[0035]整個交聯(lián)過程在室溫下進行；將經(jīng)上述處理的腦組織組織標本移至預先配置好京尼平(genipin，0.5%，日本，Wako公司)溶液中交聯(lián)48小時(標本由白色變成藍色)。
[0036]消毒:
[0037]使用PBS (0.0lM