專利名稱：異種無細(xì)胞真皮支架及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)皮膚組織工程技術(shù)領(lǐng)域，是一種新型的異種無細(xì)胞真皮支架及其制備方法。
背景技術(shù)：
嚴(yán)重深度燒、創(chuàng)傷及難愈性潰瘍等都需要解決快速有效封閉創(chuàng)面的問題。目前臨床上主要利用自體皮封閉創(chuàng)面，不僅會(huì)增加新創(chuàng)面，而且對(duì)于大面積皮膚缺損患者常常存在自體皮源不足的問題。為此，希望通過組織工程技術(shù)在體外構(gòu)建皮膚替代物，這種人工皮膚由真皮支架和種子細(xì)胞組成，但至今尚無理想的真皮支架。目前國(guó)外臨床應(yīng)用的真皮支架產(chǎn)品Alloderm是將異體皮通過去除其中的細(xì)胞成分而獲得，雖然具有較好的臨床效果，但存在來源有限、價(jià)格昂貴、病毒感染等問題。異種皮雖然來源豐富，尤其是豬皮，其真皮結(jié)構(gòu)與人較為接近，但目前國(guó)內(nèi)還沒有成熟產(chǎn)品，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)結(jié)果表明，其存在血管化速度慢、具有免疫原性和占位性(不能被新生組織及時(shí)取代)等問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明采用具有豐富來源的乳豬皮為皮源，通過適當(dāng)改變其空間結(jié)構(gòu)和表面物理化學(xué)性狀，從而達(dá)到加快血管化速度、降低免疫排斥反應(yīng)和占位性的目的。
制備方法如下試劑與材料Dispase II酶Sigma公司，胰蛋白酶Difco進(jìn)口分裝，NaCl上海建鑫化工試劑廠、SDS上海華舜生物工程有限公司、戊二醛 中國(guó)醫(yī)藥(集團(tuán))上海化學(xué)試劑公司去表皮液0.025％Dispase II、1mol/L NaCl的無菌水溶液1.取皮考慮到皮膚的色澤和膠原成分，選用白色乳豬皮為皮源，體重不超過40kg，取其腹側(cè)、背部皮，修剪去除皮下組織。
2.制備無基底膜的真皮支架，以便與自體刃厚皮結(jié)合封閉創(chuàng)面(1)分離真皮層利用劈皮機(jī)進(jìn)一步去除皮下組織和部分真皮層，再用劈皮機(jī)分離真皮層，厚度不超過0.3mm，用0.05％洗必泰溶液浸泡消毒，無菌生理鹽水充分漂洗；
(2)去細(xì)胞成分將分離到的真皮層在室溫下用0.5％ SDS溶液或0.5％Triton X-100溶液作用24～48小時(shí)，振蕩或攪拌，得無細(xì)胞真皮；(3)修飾空間結(jié)構(gòu)將無細(xì)胞真皮用無菌生理鹽水充分漂洗，而后用0.25％胰蛋白酶(PBS溶液配制，pH 7.0～7.4)浸泡，4℃，作用2～4小時(shí)，適度振蕩或攪拌，從而真皮膠原纖維間隙增加，以便為創(chuàng)面細(xì)胞增殖和新生膠原的分泌提供適當(dāng)?shù)目臻g，加快血管化速度，降低占位性的發(fā)生；(4)修飾表面物理化學(xué)性狀將上述無細(xì)胞真皮用無菌生理鹽水充分漂洗，而后用0.02％新鮮配制的戊二醛溶液浸泡，室溫下作用10～30min，以便將暴露的氨基酸殘基側(cè)鏈羥基封閉，降低免疫原性；(5)消毒用無菌生理鹽水充分漂洗后，封裝，60Co 100 Gy消毒，即成無基底膜真皮支架產(chǎn)品。
3.制備具有基底膜的真皮支架(1)制備皮層利用劈皮機(jī)先去除乳豬皮的皮下組織和部分真皮層，所剩余的皮層中含真皮層和表皮層，厚度不超過0.3mm，將其用0.05％洗必泰溶液浸泡消毒，無菌生理鹽水充分漂洗；(2)去表皮層將所得皮層用去表皮液4℃浸泡24～48小時(shí)，揭去表皮層，得真皮層。其余各步驟與上述制備無基底膜真皮支架的第(2)～(5)相同，制成具有基底膜的真皮支架。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1制備無基底膜的真皮支架1.取皮考慮到皮膚的色澤和膠原成分，選用白色乳豬皮為皮源，體重不超過40kg，取其腹側(cè)、背部皮，修剪去除皮下組織。
2.分離真皮層利用劈皮機(jī)先去除皮下組織和部分真皮層，再用劈皮機(jī)分離所需真皮層，厚度0.3mm；用0.05％洗必泰溶液浸泡消毒，無菌生理鹽水漂洗3次，每次10分鐘；3.去細(xì)胞成分將分離到的真皮層用0.5％ SDS溶液，在室溫下作用36小時(shí)，振蕩，得無細(xì)胞真皮。
4.修飾空間結(jié)構(gòu)用無菌生理鹽水充分漂洗(3次，每次10分鐘)無細(xì)胞真皮，而后用0.25％胰蛋白酶(PBS溶液配制，pH 7.0)浸泡，4℃，作用2小時(shí)，適度振蕩，使真皮膠原纖維間隙增加；5.修飾表面物理化學(xué)性狀用無菌生理鹽水充分漂洗(3次，每次10分鐘)上述無細(xì)胞真皮，而后用0.02％新鮮配制的戊二醛溶液浸泡，室溫下作用20分鐘；6.消毒用無菌生理鹽水充分漂洗(3次，每次10分鐘)，封裝，60Co 100 Gy消毒，得無基底膜真皮支架。
使用時(shí)，將真皮支架放置在深度皮膚缺損創(chuàng)面上，上面覆蓋自體刃厚皮(0.3mm)。優(yōu)點(diǎn)取刃厚皮結(jié)合真皮支架封閉創(chuàng)面可以達(dá)到中厚皮或全厚皮的效果，同時(shí)降低供皮區(qū)瘢痕增生的可能性；供皮區(qū)可快速愈合，必要時(shí)可以多次供皮。
實(shí)施例2制備具有基底膜的真皮支架1.制備皮層取皮后利用劈皮機(jī)先去除乳豬皮的皮下組織和部分真皮層，所剩余的皮層中含真皮層和表皮層，厚度不超過0.3mm，將其用0.05％洗必泰溶液浸泡消毒，無菌生理鹽水漂洗3次，每次10分鐘；2.去表皮層上述所得皮層用去表皮液(含0.025％Dispase II、1mol/L NaCl的無菌水溶液)4℃浸泡36小時(shí)，揭去表皮層，得真皮層。其余各步驟同實(shí)施例1的第3-6，得具有基底膜的真皮支架。
使用時(shí)，先與人成纖維細(xì)胞、表皮細(xì)胞共培養(yǎng)，真皮面種植成纖維細(xì)胞，基底膜面培養(yǎng)表皮細(xì)胞，得到組織工程化的皮膚替代物。優(yōu)點(diǎn)以異種無細(xì)胞真皮為支架在體外構(gòu)建復(fù)合皮，用于封閉深度皮膚缺損，其性狀和功能接近于自體皮。對(duì)供皮區(qū)的依賴性小。
權(quán)利要求
1.一種異種無細(xì)胞真皮支架的制備方法，包括取皮、分離真皮層、去細(xì)胞成分、消毒、封裝，其特征在于還包括對(duì)無細(xì)胞真皮層的空間結(jié)構(gòu)和表面物理化學(xué)性狀的修飾，亦即將無細(xì)胞真皮層用胰蛋白酶浸泡處理，使真皮膠原纖維間隙增加；再用戊二醛溶液浸泡，以改變真皮支架表面的物化性狀。
2.按權(quán)利要求1所述異種無細(xì)胞真皮支架的制備方法，其特征在于異種皮為乳豬皮，所分離的真皮層無基底膜。
3.按權(quán)利要求1所述異種無細(xì)胞真皮支架的制備方法，其特征在于異種皮為乳豬皮，所分離的真皮層具有基底膜。
4.權(quán)利要求1所述異種無細(xì)胞真皮支架制備方法所制得的真皮支架。
5.權(quán)利要求2所述異種無細(xì)胞真皮支架制備方法所制得的無基底膜的真皮支架。
6.權(quán)利要求3所述異種無細(xì)胞真皮支架制備方法所制得的具有基底膜的真皮支架。
7.權(quán)利要求4、5、6所述真皮支架用于封閉燒、創(chuàng)傷創(chuàng)面的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)皮膚組織工程技術(shù)領(lǐng)域,是一種新型的異種無細(xì)胞真皮支架及其制備方法。嚴(yán)重?zé)?、?chuàng)傷及難愈性潰瘍等都需快速有效封閉創(chuàng)面。異種皮來源豐富,尤其是豬皮,其真皮結(jié)構(gòu)與人較為接近,但目前用豬皮制作的真皮支架存在血管化速度慢、具有免疫原性和占位性等缺陷。本發(fā)明選用乳豬皮制作真皮支架,對(duì)無細(xì)胞真皮支架進(jìn)行空間結(jié)構(gòu)和表面物化性狀修飾,亦即將無細(xì)胞真皮層用胰蛋白酶處理,使真皮膠原纖維間隙增加,以利于創(chuàng)面的細(xì)胞增殖和加快血管化速度;用戊二醛溶液浸泡處理,以改變真皮支架表面的物化性狀,降低免疫排斥反應(yīng)和占位性。
文檔編號(hào)A61L27/00GK1387923SQ02112478
公開日2003年1月1日 申請(qǐng)日期2002年7月11日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月11日
發(fā)明者夏照帆, 田建廣, 唐洪泰, 郇京寧, 肖仕初, 程大勝, 王光毅 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)