專利名稱：一段丙型肝炎病毒特異性cDNA序列的確定及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一段丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus)特異性cDNA序列的確定及其應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
丙型肝炎是一種由輸血或者血液制品引起的嚴(yán)重傳染疾病，可引發(fā)肝臟損傷及肝癌等嚴(yán)重后果，準(zhǔn)確的診斷是進(jìn)行及時而可靠的治療的依據(jù)，目前只能對丙型肝炎的診斷主要依靠血清學(xué)和免疫學(xué)方法。PCR和基因芯片診斷是一種快速而準(zhǔn)確的檢測方法。而這一類的診斷方法依賴于獲得特異的核酸序列。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明在于通過生物信息學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)，確定了一段丙型肝炎病毒特異核苷酸序列及其PCR引物。該序列和相應(yīng)的PCR引物可用于建立基因芯片和PCR方法進(jìn)行丙型肝炎病毒的診斷。
本發(fā)明的技術(shù)方案為本發(fā)明通過NCBI數(shù)據(jù)庫，按常規(guī)方法確定了長度為222bp的一段丙型肝炎病毒特異cDNA序列及其PCR引物，用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其序列如下caagcaccct atcaggcagt accacaaggc ctttcgcgac ccaacactac tcggctagtg60atctcgcggg ggcacgccca aatttctggg tattgagcgg gttattccaa gaaaggaccc120ggtcacccca gcgattccgg tgtactcacc ggttccgcag accactatgg ctctcccggg180agggggggtc ctggaggctg cacgacactc gtactaacgc ca 222引物序列為1.5’-caagcaccctatctggcagt-3’2.5’-tggcgttagtacgagtgtcg-3’上述丙型肝炎病毒的特異cDNA序列，可作為基因芯片診斷的探針、及PCR擴(kuò)增臨床丙型肝炎的檢測試劑盒及相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)、或直接用于PCR診斷的應(yīng)用。
用本發(fā)明建立的臨床檢測技術(shù)所使用的方法具有快速、準(zhǔn)確、操作簡便、成本低等優(yōu)點。


圖1為臨床標(biāo)本的PCR擴(kuò)增圖譜。1道為標(biāo)準(zhǔn)分子量標(biāo)記；2，3，4，為陰性樣本，沒有擴(kuò)增產(chǎn)物；5位陽性樣本，擴(kuò)增產(chǎn)物大小與預(yù)計的一致.
圖2是測序圖。其中圖2是測定的序列圖譜。
圖3是用Blast軟件對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測序結(jié)果與預(yù)計序列的比較分析。
圖4-A、圖4-B、圖4-C、圖4-D是基因數(shù)據(jù)庫中Blast搜索結(jié)果。
圖5為基因芯片雜交結(jié)果。
具體實施例方式1、首先以丙型肝炎病毒為關(guān)鍵詞，在基因數(shù)據(jù)庫中搜索丙型肝炎病毒的核苷酸序列。共獲得數(shù)條關(guān)系較密切的核苷酸序列，將這些核苷酸序列用NCBI網(wǎng)上的Blast在線使用軟件比對基因數(shù)據(jù)庫中的核苷酸序列(nr)，排出非特異性的核苷酸序列，獲得了丙型肝炎特異性的核苷酸序列。
2、以這段序列設(shè)計了30余對PCR引物，以臨床標(biāo)本提取RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選到一對適合進(jìn)行PCR擴(kuò)增的序列及引物，PCR擴(kuò)增獲得的產(chǎn)物與預(yù)計大小一致(見圖1)；采用臨床陰性標(biāo)本作為模板，沒有擴(kuò)增產(chǎn)物；采用臨床陽性標(biāo)本作為模板，可以得到很純的擴(kuò)增產(chǎn)物，大小222左右，與預(yù)計大小一致(見圖1)。
3、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用T-vector進(jìn)行克隆，并測序(測序結(jié)果見圖2)、通過Blast軟件比對預(yù)計序列，顯示與預(yù)計的序列一致(見圖3)；序列用NCBI網(wǎng)站的Blast搜索基因數(shù)據(jù)庫的DNA/cDNA序列，該序列只與丙型肝炎病毒的cDNA序列一致，而與其它的物種序列沒有同源性(見圖4)。
4、用這一序列標(biāo)記后作為探針與含有3種血液傳染類疾病感染病原物的15個基因位點的基因芯片雜交，只有本發(fā)明序列與此有雜交信號，而其它所有序列與此無雜交信號(見圖5)，圖中每個檢測基因位點有四個重復(fù)，芯片共有15個不同的基因位點和3個對照位點。雜交結(jié)果表明只有本序列有特異信號，而其它均無雜交信號，表明該序列為丙型肝炎病毒的特異序列。
發(fā)明人將上述丙型肝炎病毒的特異cDNA序列，用作基因芯片診斷的探針、及PCR擴(kuò)增臨床丙型肝炎的檢測試劑盒及相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)、或直接用于PCR診斷的應(yīng)用。
發(fā)明人使用云南省三家三甲醫(yī)院提供的96例經(jīng)多種臨床檢測方法確診的丙型肝炎血樣，以基因芯片檢測的方法對本發(fā)明的該序列進(jìn)行驗證，總陽性符合率100％；采用丙型肝炎病毒以外的20種病原物及微生物樣本以基因芯片檢測的方法對該序列進(jìn)行驗證，總陰性符合率100％。
實際應(yīng)用表明用本發(fā)明建立的臨床檢測技術(shù)所使用的方法確有快速、準(zhǔn)確、操作簡便、成本低等優(yōu)點。
SEQUENCE LISTING<110>云南大學(xué)<120>一段丙型肝炎病毒檢測cDNA序列的確定及其應(yīng)用<130>
<140>
<141>
<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>222<212>DNA<213>丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus)<220>
<221>gene<222>(1)..(222)<223>
<400>1caagcaccct atcaggcagt accacaaggc ctttcgcgac ccaacactac tcggctagtg60atctcgcggg ggcacgccca aatttctggg tattgagcgg gttattccaa gaaaggaccc120ggtcacccca gcgattccgg tgtactcacc ggttccgcag accactatgg ctctcccggg180agggggggtc ctggaggctg cacgacactc gtactaacgc ca 22權(quán)利要求
1.一段丙型肝炎病毒特異cDNA序列性的確定，通過NCBI數(shù)據(jù)庫，按常規(guī)方法獲得，其特征在于該段丙型肝炎病毒特異cDNA序列的長度為222bp，其cDNA序列及其PCR擴(kuò)增引物如下caagcaccct atcaggcagt accacaaggc ctttcgcgac ccaacactac tcggctagtg 60atctcgcggg ggcacgccca aatttctggg tattgagcgg gttattccaa gaaaggaccc120ggtcacccca gcgattccgg tgtactcacc ggttccgcag accactatgg ctctcccggg180agggggggtc ctggaggctg cacgacactc gtactaacgc ca 222引物序列為引物15’-caagcaccctatctggcagt-3’引物25’-tggcgttagtacgagtgtcg-3’
2.權(quán)利要求1所述的丙型肝炎病毒特異cDNA序列，可作為作為基因芯片診斷的探針、及PCR擴(kuò)增臨床丙型肝炎的檢測試劑盒及相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一段丙型肝炎病毒特異性cDNA序列的確定及其應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明通過基因數(shù)據(jù)庫資料的搜尋和分析，確定了一段丙型肝炎病毒特異性cDNA序列及PCR擴(kuò)增引物，該序列長度為222bp。通過對人類生殖道丙型肝炎病毒感染標(biāo)本的PCR擴(kuò)增，克隆，獲得該序列，測序證明與預(yù)計序列一致。再經(jīng)生物信息學(xué)方法分析，基因芯片雜交分析，結(jié)果證實了該序列對于丙型肝炎病毒的特異性。丙型肝炎病毒特異性cDNA序列可作為診斷丙型肝炎病毒的基因芯片的探針序列，并通過上述的引物序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，標(biāo)記后進(jìn)行雜交檢測或直接用于PCR診斷。用本發(fā)明建立的臨床檢測技術(shù)所使用的方法具有快速、準(zhǔn)確、操作簡便、成本低等優(yōu)點。
文檔編號C12Q1/68GK1789423SQ20051001108
公開日2006年6月21日 申請日期2005年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月27日
發(fā)明者譚德勇, 余敏, 任永富, 馬明星 申請人:云南大學(xué)