專利名稱：一種單克隆抗體,包含該單克隆抗體的檢測(cè)試劑盒及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于免疫應(yīng)用領(lǐng)域，涉及動(dòng)物分子生物學(xué)、免疫學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域。具體地講本發(fā)明涉及一種特異性單克隆抗體的制備，包含該單克隆抗體的試劑盒及其在雞禽流感病毒抗體診斷檢測(cè)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
眾所周知，禽流感、新城疫、法氏囊、傳染性支氣管炎、傳染性喉氣管炎、馬立克、減蛋綜合癥等疫病是危害全球養(yǎng)禽業(yè)的重要疫病，其中尤以禽流感為甚。2004年初，亞洲部分國家和地區(qū)相繼發(fā)生了H5N1亞型高致病性禽流感，我國也未能幸免，短期內(nèi)全國十多個(gè)省(區(qū))相繼發(fā)生了不同程度的疫情，給亞洲部分國家和地區(qū)的養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，因此亞洲各國政府都對(duì)禽流感的防制高度重視，并相繼提出了一系列的防制措施。在已有的研究中，大多側(cè)重于探索診斷和鑒定雞禽流感病毒的新方法。例如在檢索到的200410014289.9、200310107732.2等專利文獻(xiàn)中分別介紹了這類檢測(cè)方法。而對(duì)雞禽流感病毒抗體的監(jiān)測(cè)和檢測(cè)仍停留在原有的經(jīng)典方法上，如瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)(Agarose gelimmunodiffusion AGID)、血凝抑制試驗(yàn)(Hemagglutination inhibition HI)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-linked Immunosorbent Assay；ELISA)、神經(jīng)氨酸酶抑制試驗(yàn)(Neuraminidaseinhibitor test NIT)、病毒中和試驗(yàn)(Virus Neutralization Test；VNT)等，這些方法有的耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，(如瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)需24～48小時(shí)；血凝抑制試驗(yàn)需2～3小時(shí)；ELISA試驗(yàn)需3～5小時(shí)以上等)，有的需要昂貴的儀器設(shè)備和繁瑣的操作技術(shù)，只能在實(shí)驗(yàn)室完成，不便于適時(shí)和快速診斷。
免疫層析(immunochromatography)是出現(xiàn)于八十年代初期的一種獨(dú)特的免疫分析方式(Glad C，Grubb AO.Immunocapillarymigration with enzyme-labeled antibodiesrapidquantification of C-reactive protein in human plasma.Anal Biochem，1981，116335-340)，該方法的核心技術(shù)是以條狀纖維層析材料為固相，通過毛細(xì)管作用使樣品溶液在層析條上泳動(dòng)，并同時(shí)使樣品中的待測(cè)物與層析材料上針對(duì)待測(cè)物的受體(如抗原或抗體)發(fā)生高特異、高親和性的免疫反應(yīng)。膠體金免疫層析分析(gold-immunochromatography assay GICA)是應(yīng)用膠體金標(biāo)記技術(shù)，以膠體金作為示蹤物，應(yīng)用于抗原抗體反應(yīng)的一種新型免疫標(biāo)記技術(shù)(Osikowicz G et al One-step chromatographic immunoassay for qualitative determination ofchoricogonadotropin in urine.Clin Chem.1990，36，1586)。層析過程中，金標(biāo)記物與事先固相化于層析材料(例如硝酸纖維素膜，即NC膜)上的抗原或抗體(檢測(cè)線)發(fā)生特異性的免疫反應(yīng)而被截留，進(jìn)一步富集，形成肉眼可見紫紅色條帶，從而得到直觀的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，達(dá)到檢測(cè)的目的。這種方法對(duì)所使用的抗原抗體的要求較高，要求具有好的特異性和高純度。
依據(jù)這種原理，已經(jīng)發(fā)展出了很多膠體金免疫層析快速檢測(cè)試紙條。在人醫(yī)應(yīng)用方面，國內(nèi)外已在激素、傳染病病原的抗原和抗體、性病病原、細(xì)菌、寄生蟲、腫瘤標(biāo)記物、心血管病標(biāo)志物、藥物以及其他一些蛋白質(zhì)等方面應(yīng)用了金標(biāo)免疫層析試紙條。在獸醫(yī)應(yīng)用方面，例如在豬瘟、犬細(xì)小病毒病等方面也應(yīng)用了金標(biāo)免疫層析試紙條。在雞疫病診斷和檢測(cè)方面，中國發(fā)明專利公開說明書99101537.1，公開了一種畜禽疫病快速診斷試紙條的制備及應(yīng)用，但該發(fā)明的要點(diǎn)是針對(duì)畜禽疫病病原的檢測(cè)，并未涉及對(duì)雞禽流感病毒抗體的檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的是得到一種特異性強(qiáng)的抗雞IgG Fc的單克隆抗體。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是組裝一種用于檢測(cè)雞禽流感病毒抗體的試劑盒。
本發(fā)明的第三個(gè)目是本發(fā)明的試劑盒在禽流感病毒抗體檢測(cè)中的應(yīng)用。
本發(fā)明的總體技術(shù)路線圖見圖1所示。
本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的本申請(qǐng)人制備了一種特異性強(qiáng)的單克隆抗體，它是抗雞IgG Fc的單克隆抗體，分泌該單克隆抗體的雜交瘤子細(xì)胞系BDRPDP已于2005年3月17日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號(hào)為CCTCC-C200501。申請(qǐng)人利用得到的單克隆抗體和禽流感病毒重組核衣殼蛋白(NP蛋白)為核心試劑構(gòu)建了一種用于快速檢測(cè)雞禽流感病毒抗體的試劑盒。本發(fā)明的試劑盒是由盒體和包含在盒體內(nèi)的96孔酶標(biāo)板條、試紙條、樣品稀釋液組成。試紙條(結(jié)構(gòu)圖如圖2、3所示)是本發(fā)明的試劑盒的核心，它由吸收墊(1)、硝酸纖維素膜(2)、金標(biāo)墊(3)、樣品墊(4)按圖示的順序依次粘附在不吸水的支撐薄片(7)上組裝而成的。金標(biāo)墊上涂覆有膠體金標(biāo)記的本發(fā)明制備的單克隆抗體；硝酸纖維素膜上包被有檢測(cè)線(5)和質(zhì)控線(6)，其中檢測(cè)線為本發(fā)明制備的禽流感病毒重組核衣殼蛋白(NP蛋白)，質(zhì)控線為本發(fā)明制備的抗鼠IgG抗體。樣品稀釋液為8％鹽水。所述硝酸纖維素膜、吸收墊、金標(biāo)墊、樣品墊、不吸水的支撐薄片均購自Millipore公司。所述親和層析柱購自AmershamBiosciences公司。所述用于篩選抗雞IgG Fc單克隆抗體的雞IgG Fc片斷、鼠源單抗亞型鑒定試劑盒均購自ROCKLAND公司。
本發(fā)明的原理是選用親和純化的對(duì)雞禽流感病毒抗體有特異性的重組核衣殼蛋白(NP蛋白)作為檢測(cè)線，抗雞IgG Fc片斷單克隆抗體作為膠體金標(biāo)記的抗體，利用間接法Shyu RH等，Colloidal gold-based immunochromatographic assay for detection of ricin J Toxicon2002，40(3)255-258來檢測(cè)被檢材料中是否含有雞禽流感病毒抗體。檢測(cè)時(shí)，樣品中所有的雞IgG分子的Fc先和金標(biāo)記抗雞IgG Fc單克隆抗體結(jié)合，由于毛細(xì)管作用，反應(yīng)復(fù)合物沿包被膜向前泳動(dòng)，若樣品中有抗雞禽流感病毒的特異性抗體，到達(dá)檢測(cè)線時(shí)，遇到包被在硝酸纖維素膜上的重組核衣殼蛋白(NP蛋白)，就會(huì)形成NP蛋白-抗體-金標(biāo)記單克隆抗體復(fù)合物，從而富集在檢測(cè)線上，形成紅色沉淀線；不是抗雞禽流感病毒的非特異性抗體形成的抗體-金標(biāo)記單克隆抗體復(fù)合物則通過檢測(cè)線，富集在質(zhì)控線上，形成紅色沉淀線，判為陽性結(jié)果。若樣品中不含有雞禽流感病毒抗體，反應(yīng)復(fù)合物到達(dá)檢測(cè)線時(shí)，遇到捕獲抗原就不會(huì)形成NP蛋白-抗體-金標(biāo)記單克隆抗體復(fù)合物，反應(yīng)復(fù)合物通過檢測(cè)線，富集在質(zhì)控線上，形成紅色沉淀線，判為陰性結(jié)果。
與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)1、對(duì)雞禽流感病毒抗體的檢測(cè)，具有特異性強(qiáng)，靈敏度高，檢測(cè)時(shí)間短(15～20分鐘)，檢測(cè)樣品范圍寬(血清、卵黃、肌肉組織浸出液均可)的特點(diǎn)；2、本發(fā)明的檢測(cè)方法不需要任何特殊儀器、設(shè)備，具有檢測(cè)成本低的特點(diǎn)；3、本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒操作簡(jiǎn)便，不需由專業(yè)人員操作；4、本發(fā)明的試劑盒儲(chǔ)存方便，對(duì)溫度要求不高，在4～8℃下有效保存期可達(dá)一年；在室溫下可保存六個(gè)月。


圖1本發(fā)明的總體技術(shù)路線2本發(fā)明試紙條的側(cè)視圖，圖中1為吸收墊，2為硝酸纖維素膜，3為金標(biāo)墊，4為樣品墊，5為檢測(cè)線，6為質(zhì)控線，7為不吸水的支撐薄片條圖3本發(fā)明試紙條的俯視圖，圖中1為吸收墊，2為硝酸纖維素膜，3為金標(biāo)墊，4為樣品墊，5為檢測(cè)線，6為質(zhì)控線，7為不吸水的支撐薄片條圖4本發(fā)明涉及的NP重組蛋白表達(dá)質(zhì)粒的物理構(gòu)建5本發(fā)明檢測(cè)試紙條結(jié)果判定示意圖，圖中1為陽性結(jié)果，2為陰性結(jié)果，3、4為試紙條失效。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例11、抗雞IgG Fc單克隆抗體的制備參照薛慶善《體外培養(yǎng)的原理與技術(shù)》科學(xué)出版社2001年版，中的方法利用發(fā)明人所在的微生物與免疫實(shí)驗(yàn)室提取的雞IgG免疫Balb/C小鼠(購自湖北省醫(yī)科院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，免疫程序是取含雞IgG 50～100μg的蛋白溶液與等體積的佛氏完全佐劑(購自sigma公司)乳化，注射小鼠腹腔，以后每間隔十天加強(qiáng)一次，換用不完全佐劑乳化(sigma)。最后于融合前三天，(最好與上次免疫相隔4周以上)，腹腔強(qiáng)化免疫，抗原量加倍，不加佐劑。融合時(shí)，取經(jīng)最后強(qiáng)化免疫的Balb/C鼠一只，眼眶放血處死(收集血清，即為陽性血清)，在75％酒精中浸泡5min消毒。無菌取出小鼠脾臟，分離出脾細(xì)胞，與新鮮制備的SP2/0骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0骨髓瘤細(xì)胞購自衛(wèi)生部武漢生物制品所)按1～2×107u個(gè)SP2/0與108個(gè)免疫細(xì)胞(1∶10～1∶15)的比例于50mL離心管中混勻，1500r/m，離心10min。倒凈上清(可用滅菌的濾紙吸干)，輕輕敲擊管底，使細(xì)胞沉淀略加松動(dòng)。將裝有細(xì)胞混合物的離心管放于37℃水浴中。然后在1min內(nèi)慢慢滴入預(yù)溫至37℃的50％聚乙二醇(PEG)0.8mL(購自sigma公司產(chǎn)品)，邊加邊輕輕用吸管尖攪拌，繼續(xù)攪拌1min。然后慢慢加入37℃預(yù)溫的1640(購自sigma公司商業(yè)培養(yǎng)基)基礎(chǔ)液10mL。具體方法為第一分鐘逐滴滴入1mL。第二分鐘加1mL，第3～4分鐘加3mL，第5分鐘加其余的5mL，每次加時(shí)需緩慢加入，并不斷輕輕地?cái)嚢?。最后加?0mL 1640液，也需慢慢加入。800r/m離心5min，去上清，于37℃放置5～8min。用HAT(購自Sigma公司商品)培養(yǎng)基懸浮，同時(shí)也用HAT培養(yǎng)基懸浮制備好的飼養(yǎng)脾細(xì)胞并與融合后的細(xì)胞混合，根據(jù)需要補(bǔ)加適量的HAT培養(yǎng)基，分種于96孔培養(yǎng)板中，約250μL/孔。一次融合可接種4～8塊96孔板。根據(jù)需要也可少種，一般按SP2/0的細(xì)胞數(shù)計(jì)算，每孔接種量約含104左右個(gè)SP2/0細(xì)胞。于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。融合后第二天開始觀察有無污染，于第4天補(bǔ)加1滴HAT培養(yǎng)基，第8～10天吸去100μL培養(yǎng)基換HT(購自sigma公司)培養(yǎng)基100μL。待融合細(xì)胞集落長(zhǎng)至培養(yǎng)孔1/4，培養(yǎng)基略變黃時(shí)，進(jìn)行抗體檢測(cè)。采用購自ROCKLAND公司的雞IgG Fc片斷作為篩選抗原，利用ELISA方法篩選出分泌抗雞IgGFc片斷抗體的陽性孔。對(duì)篩選出來的陽性孔立刻用有限稀釋法(參照薛慶善《體外培養(yǎng)的原理與技術(shù)》科學(xué)出版社2001年版)進(jìn)行克隆、篩選。經(jīng)過3～4次克隆，最終篩選出分泌抗雞IgG Fc片斷的單克隆雜交瘤細(xì)胞系。對(duì)篩選出的該單克隆雜交瘤細(xì)胞系，申請(qǐng)人將其命名為BDRPDP，并于2005年3月17日送中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏編號(hào)為CCTCC-C200501。對(duì)該細(xì)胞系進(jìn)行了染色體計(jì)數(shù)，結(jié)果顯示，SP2/0的染色體的平均數(shù)為70，脾細(xì)胞染色體為40條，而雜交瘤細(xì)胞的染色體數(shù)目在80～94之間。均高于兩親本細(xì)胞的染色體數(shù)目，說明融合細(xì)胞的確是SP2/0細(xì)胞與脾細(xì)胞的雜交產(chǎn)物，雜交瘤細(xì)胞的染色體數(shù)目明顯多于骨髓瘤細(xì)胞SP2/0的染色體。將該細(xì)胞系注射Balb/C小鼠腹腔，生產(chǎn)單克隆抗體。采用購自ROCKLAND公司的鼠源單抗亞型鑒定試劑盒(MouseMab Isotyping Test Kit)對(duì)本發(fā)明所得到的單克隆抗體進(jìn)行亞型鑒定，結(jié)果為小鼠IgG1亞類。
2、單克隆抗體的純化參照朱立平等《免疫學(xué)常用實(shí)驗(yàn)方法》人民軍醫(yī)出版社2000版中的方法取所得的小鼠腹水5ml與適量的二氧化硅混合，加入等體積的巴比妥緩沖液，室溫振蕩1h后，室溫靜置30min，取上清于潔凈離心管中，4℃，3000r/m離心10min；取上清液8ml，加入16ml0.06mol醋酸鈉緩沖液，用HCL調(diào)pH值至4.5，充分?jǐn)嚢柘戮従徏尤胄了?32μl后，室溫?cái)嚢?0min，然后轉(zhuǎn)入4℃冰箱充分沉淀2h，4℃，15000r/m離心30min，得上清液22ml，加入2.2ml0.1M的磷酸緩沖液，用NaOH調(diào)pH值至7.6，攪拌下緩緩加入硫酸銨至終濃度為0.277g/ml，4℃冰箱充分沉淀2h后，4℃，12000r/m離心30min，棄上清，沉淀用5ml 0.1M的磷酸緩沖液重懸，裝入透析袋，對(duì)5000ml 0.01M pH7.2磷酸鹽緩沖液(PBS)充分透析后，再對(duì)2000ml蒸餾水透析，最后對(duì)3000ml三蒸去離子水透析，將充分透析好的蛋白溶液用聚乙二醇-20000(PEG-20000)濃縮至3ml，然后4℃，12000r/m離心30min，棄沉淀，收集上清液，測(cè)得蛋白濃度為1.6mg/ml。經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定為純化的單克隆抗體，純度為98％。該單克隆抗體可用于制備檢測(cè)雞禽流感病毒抗體的試劑。
實(shí)施例2雞禽流感病毒NP蛋白的制備所使用的分子生物學(xué)方法參見文獻(xiàn)薩姆布魯克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T主編(金冬雁，黎孟楓等譯)。分子克隆實(shí)驗(yàn)指南。第二版，北京科學(xué)出版社，1992中提供的方法進(jìn)行。
1、NP基因的克隆與測(cè)序本發(fā)明所涉及的NP基因是申請(qǐng)人自己克隆得到的，該基因的序列已在GeneBank數(shù)據(jù)庫中登錄，登錄號(hào)為AY788915。該序列與已知序列有97％的同源性。NP基因的克隆與測(cè)序具體方法是用發(fā)明人所在的微生物與免疫實(shí)驗(yàn)室分離得到的一株禽流感毒株A/chicken/China/HSS2004(H9N2)GeneBank登錄號(hào)為AY788915，病毒的分離和鑒定見文獻(xiàn)李自力等 湖北省禽流感的診斷及病毒株的分離與初步鑒定，中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2001，23(3)146-148尿囊腔接種AIV于9-11日齡健康雞胚，棄24小時(shí)前死胚，收集24-96小時(shí)的雞胚尿囊液；4℃條件下4,000rpm離心30min，取上清；4℃條件下30,000rpm離心60min濃縮病毒。用pH7.2的PBS(DEPC處理水配制)溶解沉淀，分裝后-70℃保存?zhèn)溆?。根?jù)參考文獻(xiàn)(鄧國華等，禽流感病毒分離株A/Chicken/Xinjiang/1/96(H14N5)NP基因序列分析 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào) 1998年06期)設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增NP基因。上游引物P1AGGGTACCTAA TCACTCACTGA；下游引物P2TGGAATTCTTTAATTGTCGTACTCCTC。P1位于啟動(dòng)子上游，加有KpnI位點(diǎn)，P2包含有終止密碼子，加入了EcoRI位點(diǎn)，兩酶切位點(diǎn)用下劃線標(biāo)出。兩引物之間包含有NP基因完整的閱讀框架。取適量病毒懸液提取RNA，按TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.2.1說明書中提供的方法，擴(kuò)增出DNA，采用UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒(E.Z.N.A Gel Extraction Kit)回收純化RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，將回收的RT-PCR產(chǎn)物直接與購自TaKaRa公司的克隆載體pMD18-T進(jìn)行連接反應(yīng)，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到試劑盒(購自TaKaRa公司的商業(yè)試劑盒)中感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌DH5α中，用α互補(bǔ)檢查轉(zhuǎn)化效果。挑取陽性克隆，采用堿裂解法(薩姆布魯克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T主編(金冬雁，黎孟楓等譯)。分子克隆實(shí)驗(yàn)指南。第二版，北京科學(xué)出版社，1992版)提取重組質(zhì)粒DNA，并對(duì)重組質(zhì)粒DNA進(jìn)行鑒定。將鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pMD-NP，并送中國上海博亞生物技術(shù)公司進(jìn)行測(cè)序，然后將序列測(cè)定結(jié)果與GeneBank中的有關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行同源性比較和分折。
2、表達(dá)載體pKG-NP的構(gòu)建pMD-NP用NcoI和SalI酶切后，回收1.5kb左右的片段，然后將此片段與用同樣的酶酶切的Amersham Biosciences公司的表達(dá)載體pGEX-KG連接，構(gòu)建表達(dá)載體。重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化新鮮制備的DH5α感受態(tài)細(xì)胞，并將轉(zhuǎn)化菌涂布含氨芐青霉素的LB瓊脂平板37℃培養(yǎng)過夜。挑數(shù)個(gè)單菌落培養(yǎng)過夜后用堿裂解法小量制備質(zhì)粒，進(jìn)行酶切分析和PCR擴(kuò)增鑒定。將得到的陽性克隆命名為pKG-NP。包含該重組質(zhì)粒的大腸桿菌(Escherichia coliBL21/pKG-NP)保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏日2005年3月29日；保藏編號(hào)CCTCC M205026。對(duì)陽性克隆用堿裂解法大量制備質(zhì)粒DNA，并分裝凍存于-20℃。重組表達(dá)質(zhì)粒pKG-NP構(gòu)建流程如圖4所示3、NP蛋白的表達(dá)將構(gòu)建好的表達(dá)質(zhì)粒pKG-NP轉(zhuǎn)入表達(dá)用大腸桿菌的感受態(tài)細(xì)胞BL21 codon plus(BL21codon plus購自Stratagene公司)中，涂布到含有相應(yīng)抗生素(氯霉素25μg/mL，四環(huán)素10μg/mL，氨芐青霉素60μg/mL)的LB平皿上，37℃培養(yǎng)16-18h，長(zhǎng)出單菌落。挑取數(shù)個(gè)單菌落于加有相應(yīng)抗生素(氯霉素25μg/mL，四環(huán)素10μg/mL，氨芐青霉素60μg/mL)的3mL LB中培養(yǎng)過夜，進(jìn)行細(xì)菌活化。將過夜培養(yǎng)物按比例1∶50稀釋入新鮮的LB培養(yǎng)基中，37℃中振蕩培養(yǎng)(250-300rpm)到OD600＝0.5-0.8時(shí)，加入終濃度為1mmol/L異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)，繼續(xù)培養(yǎng)誘導(dǎo)表達(dá)3h。4℃條件下8,000rpm離心15min，收集細(xì)菌。細(xì)菌用0.01M pH7.2磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌一次后離心，反復(fù)快速凍融3-4次，用適量緩沖液STE(配方100.0mmol/LNaCl，10.0mmol/L Tris-Cl，1.0mmol/L EDTA pH8.0)重懸。用大超聲頭，設(shè)定10個(gè)循環(huán)和50％的間隔時(shí)間，在冰浴中超聲破碎1min。4℃條件下12,000rpm離心15min，棄沉淀，將上清對(duì)0.01M pH7.2 PBS進(jìn)行充分透析后濃縮至體積為5mL，按蛋白純化柱(HiTrap affiniy columns，Amersham Biosciences公司產(chǎn)品)說明書提供的程序進(jìn)行親和層析純化，得到純化的NP蛋白。該蛋白可用于制備檢測(cè)禽流感病毒抗體的試劑。
實(shí)施例3兔抗鼠IgG抗體的制備參見何昭陽等主編，《動(dòng)物免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》長(zhǎng)春吉林科學(xué)技術(shù)出版社，2002中的方法利用發(fā)明人所在的微生物與免疫實(shí)驗(yàn)室提取的Balb/C小鼠IgG免疫健康家兔，制備高特異性、高效價(jià)的兔抗鼠IgG高免血清，對(duì)高免血清采用飽和硫酸銨沉淀法進(jìn)行粗提，經(jīng)G-200過柱后得到高純度的兔抗鼠IgG抗體。利用該抗體可作為質(zhì)控線。
實(shí)施例4硝酸纖維素膜的制備1、包被緩沖液的配制含6％甲醇的0.01M pH7.2PBS緩沖液為包被緩沖液，0.22μ膜濾過，置4℃?zhèn)溆茫行谝恢堋?000ml 6％甲醇的0.01M pH7.2PBS緩沖液配方NaCl8g，KCl 0.2g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，KH2PO40.2g，甲醇60ml，雙蒸去離子水定容至1000ml。
2、硝酸纖維素膜的制備用包被緩沖液將NP蛋白稀釋到5～10μg/ml，調(diào)整機(jī)器，劃線為T線，即為檢測(cè)線，T線靠近金標(biāo)墊端，距金標(biāo)墊端約5mm；用包被緩沖液將兔抗鼠IgG抗體稀釋到5～10μg/ml，調(diào)整機(jī)器，劃線為C線，即為控制線，C線靠近吸收墊，距吸收墊約3mm。兩線距離5～8mm，線應(yīng)細(xì)致、均勻。37℃烘干，封裝備用。
實(shí)施例5膠體金、金標(biāo)記單克隆抗體的制備1、溶液的配制(1)氯金酸的配制用雙蒸去離子水溶解氯金酸，配成1％溶液，置4℃?zhèn)溆茫行谒膫€(gè)月。1000ml1％氯金酸溶液配方10g氯金酸；雙蒸去離子水定容至1000ml。
(2)檸檬酸三鈉的配制用雙蒸去離子水溶解檸檬酸三鈉，配成1％溶液，0.22μ膜濾過，置4℃?zhèn)溆?，有效期容?000ml。
(3)0.1M碳酸鉀的配制用雙蒸去離子水配制，0.22μ膜濾過，置4℃?zhèn)溆?，有效期四個(gè)月。1000ml 0.1M碳酸鉀溶液配方13.8g碳酸鉀；雙蒸去離子水定容至1000ml。
(4)2％PEG-20000的配制用雙蒸去離子水配制，0.22μ膜濾過，置4℃?zhèn)溆?，有效期四個(gè)月。1000ml2％PEG-20000溶液配方20g PEG-20000；雙蒸去離子水定容至1000ml。
(5)標(biāo)記洗滌保存液的配制2％牛血清白蛋白(BSA)，0.05％疊氮鈉(NaN3)，0.01M pH7.2 PBS溶液，0.22μ膜濾過，置4℃?zhèn)溆?，有效期四個(gè)月。1000ml標(biāo)記洗滌保存液配方20gBSA，0.5g NaN3，0.01M pH7.2 PBS溶液定容至1000ml。
2、膠體金的制備用雙蒸去離子水將1％氯金酸稀釋成0.01％，置電爐煮沸，按每100ml 0.01％氯金酸加入2ml 1％檸檬酸三鈉，繼續(xù)煮沸，直到液體呈亮紅色即停止加熱，冷卻至室溫后補(bǔ)足失水。制備好的膠體金外觀應(yīng)純凈、透亮、無沉淀和漂浮物，有效期一周。
3、膠體金標(biāo)記單克隆抗體的制備用0.1M碳酸鉀調(diào)膠體金的pH值至8.2，按8～10μg抗體/ml膠體金加入抗雞IgG Fc單克隆抗體，磁力攪拌器混勻30min，攪拌下加入BSA至終濃度為1％，靜置1小時(shí)。13000rpm、4℃離心30min，棄上清，沉淀用標(biāo)記洗滌保存液洗滌兩次，用十分之一初始膠體金體積的標(biāo)記洗滌保存液將沉淀重懸，置4℃?zhèn)溆?，有效期一周?br> 實(shí)施例6金標(biāo)墊的制備1、封閉液的配制
2％ BSA，0.1％ Triton X-100、0.05％ NaN3，0.01M pH7.2 PBS溶液，0.22μm微孔濾膜濾過，置4℃?zhèn)溆茫行谒膫€(gè)月。1000ml封閉液配方20g BSA，0.5g NaN3、1ml Triton X-100、0.01M pH7.2PBS溶液定容至1000ml。
2、金標(biāo)墊的制備；將金標(biāo)墊浸泡于封閉液中30min后，于37℃烘干。然后將制備好的金標(biāo)記抗體均勻的鋪在金標(biāo)墊上，每毫升溶液鋪20平方厘米，冷凍干燥，封裝，置4℃?zhèn)溆谩?br> 實(shí)施例7試紙條樣品墊的制備1、封閉液的配制2％ BSA，0.1％Triton X-100、0.05％ NaN3，0.01M pH7.2 PBS溶液，0.22μm微孔濾膜濾過，置4℃?zhèn)溆茫行谒膫€(gè)月。1000ml封閉液配方20g BSA，0.5g NaN3、1ml Triton X-100、0.01M pH7.2PBS溶液定容至1000ml。
2、樣品墊的制備將樣品墊浸泡于封閉液中30min后，于37℃烘干，封裝，置4℃?zhèn)溆谩?br> 實(shí)施例8試紙條的組裝將硝酸纖維素膜、玻璃纖維、吸收墊、樣品墊按圖依次層疊起來，切成3mm寬的小條。每十小條一包，加入干燥劑，真空封裝。4～8℃保存，有效期一年；常溫保存，有效期6個(gè)月。
實(shí)施例9快速檢測(cè)雞禽流感病毒抗體的試劑盒組成1、快速檢測(cè)雞禽流感病毒抗體的試劑盒包括①、試紙條 一包(10條/包)②、樣品稀釋液 一瓶(10ml/瓶)③、帶底座的96孔酶標(biāo)板條 一條(12孔/條)2、相關(guān)溶液的配制樣品稀釋液樣品稀釋液為8％ NaCl溶液。配制方法80g NaCl，加蒸餾水定容至1000ml。
實(shí)施例10本發(fā)明試劑盒的使用方法1、樣品制備雞血清樣品的制備，取5μl待撿血清置于96孔板孔內(nèi)，用8％鹽水稀釋至100μl；或者將血清樣品用8％鹽水稀釋20倍后，取100μl置于96孔板孔內(nèi)。雞卵黃樣品的制備，取5μl待撿卵黃置于96孔板孔內(nèi)，用8％鹽水稀釋至100μl；或是將卵黃樣品用8％鹽水稀釋20倍后，取100μl置于96孔板孔內(nèi)。雞肌肉組織浸出液樣品的制備，取約1g肌肉組織置于玻璃勻漿器內(nèi)，加入2ml 8％鹽水，充分勻漿后，3,000rpm離心15min，取上清液100μl置于96孔板孔內(nèi)。
2、檢測(cè)取出試劑盒，室溫平衡20分鐘；打開包裝袋，取出試紙條，將試紙條的樣品墊端浸入制備好的樣品中，15～20分鐘內(nèi)判定結(jié)果。
3、結(jié)果判定如圖5所示，當(dāng)試紙條出現(xiàn)肉眼可見的紫紅色質(zhì)控線，沒有出現(xiàn)肉眼可見的紫紅色檢測(cè)線，結(jié)果判為陰性，記為“-”；當(dāng)試紙條出現(xiàn)肉眼可見的紫紅色質(zhì)控線，同時(shí)也出現(xiàn)肉眼可見的紫紅色檢測(cè)線，結(jié)果判為陽性，記為“+”；檢測(cè)線顏色越深說明被檢測(cè)樣品的抗體水平越高；當(dāng)試紙條沒出現(xiàn)肉眼可見的紫紅色質(zhì)控線，不管有沒有出現(xiàn)肉眼可見的紫紅色檢測(cè)線，結(jié)果都判為檢測(cè)試紙條失效，應(yīng)廢棄。
實(shí)施例11快速檢測(cè)雞禽流感病毒抗體的試劑盒的制備及應(yīng)用1、快速檢測(cè)雞禽流感病毒抗體的試劑盒的制備按實(shí)施例1-10的方法制備快速檢測(cè)雞禽流感病毒抗體的試劑盒。
2、快速檢測(cè)雞禽流感病毒抗體的試劑盒的應(yīng)用2.1、雞標(biāo)準(zhǔn)血清的檢測(cè)①特異性試驗(yàn)分別將標(biāo)準(zhǔn)的雞禽流感病毒H5、H7、H9亞型陽性血清、雞新城疫(ND)陽性血清、雞傳染性支氣管炎(IB)陽性血清、雞傳染性法氏囊(IBD)陽性血清(以上各標(biāo)準(zhǔn)血清均購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所)按實(shí)施例8所述本發(fā)明方法(GICA)進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果見表1。表1顯示，本發(fā)明檢測(cè)試紙條與標(biāo)準(zhǔn)的禽流感病毒H5、H7、H9亞型陽性血清試驗(yàn)后，質(zhì)控線及檢測(cè)線均出現(xiàn)明顯的紫紅色條帶；而與生理鹽水(空白)、SPF雞陰性血清、標(biāo)準(zhǔn)雞新城疫病毒(ND)、雞傳染性法氏囊病毒(IBD)、雞傳染性支氣管炎病毒(IB)等陽性血清試驗(yàn)后，檢測(cè)線不出現(xiàn)紫紅色條帶。這表明本發(fā)明試紙條特異性高，與雞的其他呼吸道疫病病毒抗體無任何交叉反應(yīng)。
表1 應(yīng)用本發(fā)明的檢測(cè)試紙條對(duì)雞標(biāo)準(zhǔn)血清檢測(cè)結(jié)果

②敏感性試驗(yàn) 將雞禽流感病毒H5、H7、H9亞型標(biāo)準(zhǔn)陽性血清(購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所)分別進(jìn)行倍比稀釋，最終稀釋度為1∶2048，各取100μl稀釋好的樣品按本發(fā)明方法(GICA)進(jìn)行試驗(yàn)。同時(shí)，用常規(guī)血凝抑制(HI)和瓊脂擴(kuò)散法(AGID)沈關(guān)心，周汝麟。現(xiàn)代免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)(第二版) [M]，湖北科學(xué)技術(shù)出版社，2002測(cè)定H5、H7、H9標(biāo)準(zhǔn)陽性血清的效價(jià)。試驗(yàn)結(jié)果見表2。結(jié)果表明，本發(fā)明檢測(cè)試紙條法的靈敏度高于瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)，與血凝抑制法的效果相當(dāng)。
表2 本發(fā)明與常規(guī)檢測(cè)方法對(duì)禽流感病毒抗體檢測(cè)的敏感性試驗(yàn)結(jié)果

2.2、送檢雞血清樣品的檢測(cè)從湖北、河南等地的3個(gè)雞場(chǎng)共采集166份雞血清，按本發(fā)明方法(GICA)進(jìn)行試驗(yàn)。同時(shí)，用常規(guī)血凝抑制(HI)和瓊脂擴(kuò)散方法(AGID)測(cè)定效價(jià)。結(jié)果見3。表3顯示，GICA法檢出率為56％(93/166)，HI法為58％(97/166)，二者符合率為84％(78/93，HI陽性/GICA陽性)；AGID法檢出率為30％(50/166)，比GICA法檢出率低，是因?yàn)镚ICA法的敏感度比AGID高128倍(8/1024)，使得GICA法陽性時(shí)而AGID法為陰性，二者的符合率為90％(45/50，AGID陽性/GICA陽性)。
表3 本發(fā)明的試紙條法與幾種常規(guī)方法的比較檢測(cè)效果

2.3 雞卵黃樣品的檢測(cè)一般來講，從雞卵黃液中檢測(cè)禽流感抗體時(shí)，卵黃液稀釋1倍后的效價(jià)與血清效價(jià)相當(dāng)。因此，也能直接用雞的卵黃液來代替血清進(jìn)行禽流感抗體效價(jià)的檢測(cè)。從河南、湖北等地的雞場(chǎng)隨機(jī)抽取成年蛋雞雞蛋100枚，按本發(fā)明方法(GICA)進(jìn)行試驗(yàn)。同時(shí)，用常規(guī)方法血凝抑制及瓊脂擴(kuò)散測(cè)定效價(jià)。結(jié)果見表4，顯示GICA法檢出率為68％(68/100)，HI法為72％(72/100)，二者符合率為96％(65/68，HI陽性/GICA陽性)；AGID法檢出率為44％(44/100)，比GICA法檢出率低，是因?yàn)镚ICA法的敏感度比AGID高128倍(8/1024)，使得GICA法陽性時(shí)而AGID法為陰性，二者的符合率為98％(43/44，GICA陽性/AGID陽性)。
表4 本發(fā)明的試紙條法與幾種常規(guī)檢測(cè)方法的比較


2.4 雞肌肉組織浸出液樣品的檢測(cè)；從湖北某雞場(chǎng)隨機(jī)抽取成年蛋雞100羽，采集血清后安常規(guī)方法進(jìn)行HI試驗(yàn)和AGID試驗(yàn)，再將雞處死后取肌肉組織，按本發(fā)明方法(GICA)進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見表5。結(jié)果表明，GICA法檢出率為52％(52/100)，HI法為55％(55/100)，二者符合率為100％(52/52，HI陽性/GICA陽性)；AGID法檢出率為27％(27/100)，比GICA法檢出率低，是因?yàn)镚ICA法的敏感度比AGID高128倍(8/1024)，使得GICA法陽性時(shí)而AGID法為陰性，二者的符合率為93％(25/27，GICA陽性/AGID陽性)。說明本發(fā)明的檢測(cè)試紙條完全可以作為常規(guī)方法用于市場(chǎng)上雞肉產(chǎn)品禽流感的快速檢測(cè)。
表5 本發(fā)明試紙條法與幾種常規(guī)方法對(duì)雞肌肉組織浸出液樣品檢測(cè)效果的比較

盡管本發(fā)明的內(nèi)容是結(jié)合本實(shí)施例進(jìn)行說明，但是不能認(rèn)為是對(duì)本發(fā)明范圍的限制，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求書限定。另外，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在所附權(quán)利要求書限定的范圍內(nèi)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種改動(dòng)或修飾，這些改動(dòng)或修飾形式同樣落在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種雜交瘤細(xì)胞系BDRPDP，保藏在CCTCC，保藏編號(hào)為CCTCC-C200501。
2.一種能夠?qū)ｉT識(shí)別雞IgG Fc的單克隆抗體。
3.包含權(quán)利要求2的檢測(cè)試劑盒。
4.權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于所說的試劑盒是檢測(cè)雞禽流感病毒抗體的試劑盒。
5.一種適用于檢測(cè)雞禽流感病毒抗體的試劑盒，它包含盒體、設(shè)在盒體內(nèi)的96孔酶標(biāo)板條、試紙條和樣品稀釋液。
6.權(quán)利要求5所述的一種適用于檢測(cè)雞禽流感病毒抗體的試劑盒，其中的試紙條是由樣品墊、吸收墊、涂覆有金標(biāo)記抗雞IgG Fc單克隆抗體的金標(biāo)墊、包被有NP重組蛋白的檢測(cè)線(4)和包被有抗鼠IgG的質(zhì)控線(5)的硝酸纖維素膜依次按吸收墊(1)、硝酸纖維素膜(2)、金標(biāo)墊(3)、樣品墊(4)的順序粘貼在不吸水的支撐薄片(7)上構(gòu)成。
7.權(quán)利要求5和6所述的一種適用于檢測(cè)雞禽流感病毒抗體的試劑盒，其中的樣品稀釋液為8％鹽水。
8.權(quán)利要求3-7任一項(xiàng)所述的試劑盒在檢測(cè)雞禽流感病毒抗體中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于快速檢測(cè)雞禽流感病毒抗體的試劑盒。該試劑盒包含盒體、設(shè)在盒體內(nèi)的96孔酶標(biāo)板條、試紙條和樣品稀釋液。其中的試紙條是由樣品墊、吸收墊、涂覆有金標(biāo)記抗雞IgG Fc單克隆抗體的金標(biāo)墊、包被有NP重組蛋白的檢測(cè)線和包被有抗鼠IgG的質(zhì)控線的硝酸纖維素膜依次按吸收墊、硝酸纖維素膜、金標(biāo)墊、樣品墊的順序粘貼在不吸水的支撐薄片上構(gòu)成。本發(fā)明還涉及一種能產(chǎn)生特異單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系BDRPDP和能夠?qū)ｉT識(shí)別雞IgGFc的單克隆抗體的制備。所述的試劑盒檢測(cè)禽流感病毒抗體具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便和診斷快速的顯著優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N5/16GK1687406SQ20051001152
公開日2005年10月26日 申請(qǐng)日期2005年4月1日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月1日
發(fā)明者畢丁仁, 彭大鵬, 李自力, 華艷, 胡思順, 肖運(yùn)才, 石德時(shí), 劉梅, 許清榮 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)