本發(fā)明涉及源于霍氏格里蒙菌的重組膠原酶和細(xì)胞分離用酶劑。

背景技術(shù)：

胰臟中包含向十二指腸內(nèi)分泌消化酶的外分泌腺和內(nèi)分泌腺的胰島。將對(duì)調(diào)節(jié)血糖濃度起重要作用的胰島從胰臟分離并純化，移植給處于胰島素依賴狀態(tài)的1型糖尿病等的患者的治療方法稱為胰島移植。胰島由于可以以點(diǎn)滴的方式注入體內(nèi)，因此是低侵害性的，患者的身體負(fù)擔(dān)低。

另一方面，胰臟的約九成是外分泌腺，分離胰島的技術(shù)難，成功率極低?，F(xiàn)在，作為細(xì)胞分離用的酶劑，包含源于溶組織棱狀芽胞桿菌(Clostridium histolyticum)的稱為膠原酶H(ColH)和膠原酶G(ColG)的亞型的混合物，用于從胰臟分離胰島而在醫(yī)療現(xiàn)場(chǎng)被使用。但是，胰臟的組織結(jié)構(gòu)因年齡、肥胖程度而不同，因此只有在胰島分離用的酶劑與被提供的胰臟組織適合的情況下胰島分離才會(huì)成功。

所述ColH和ColG是具有多個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)造的多結(jié)構(gòu)域(multi-domain)蛋白質(zhì)，其活性與結(jié)構(gòu)域的組合和相對(duì)的配置有關(guān)(非專利文獻(xiàn)1)。根據(jù)非專利文獻(xiàn)1，源于棱菌屬的膠原酶，共同地，包括催化結(jié)構(gòu)域(以下有時(shí)稱為CD)、多囊腎樣結(jié)構(gòu)域(以下有時(shí)稱為PKD)、膠原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(以下有時(shí)稱為CBD)3種，ColH是由1個(gè)CD、2個(gè)PKD、1個(gè)CBD形成的以CD-PKD-PKD-CBD表示的結(jié)構(gòu)域構(gòu)造，ColG是由1個(gè)CD、1個(gè)PKD、2個(gè)CBD形成的以CD-PKD-CBD-CBD表示的結(jié)構(gòu)域構(gòu)造。非專利文獻(xiàn)1公開(kāi)了：CBD的N末端側(cè)結(jié)合鈣，通過(guò)除掉鈣，結(jié)構(gòu)域的N末端部發(fā)生構(gòu)造變化；鈣對(duì)膠原的結(jié)合是重要的；鈣有助于ColH的穩(wěn)定化等。

另一方面，作為源于比活性高的微生物的膠原酶，有霍氏格里蒙菌源膠原酶(非專利文獻(xiàn)2)。已知是包含前體區(qū)、催化結(jié)構(gòu)域、接頭區(qū)和前肽酶C末端結(jié)構(gòu)域(以下也稱為PPC)的、分子量84kDa的膠原酶，BLAST檢索的結(jié)果是，與ColH、ColG的同源性低。另外，鑒于霍氏格里蒙菌源膠原酶難以低價(jià)獲得的問(wèn)題，還提出了構(gòu)建使用了基因工程學(xué)手法的用于該膠原酶生產(chǎn)的技術(shù)的方法(專利文獻(xiàn)1)。該專利文獻(xiàn)1中記載了：制作包含霍氏格里蒙菌源膠原酶的完整編碼區(qū)的基因的桿粒(bacmid)pCC1BAC-2的方法，使用桿粒pCC1BAC-2制作橋石短芽孢桿菌(Brevibacillus choshinensis)重組體，由此制造霍氏格里蒙菌源膠原酶的方法。

現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)1:日本特開(kāi)2010-263880號(hào)公報(bào)

非專利文獻(xiàn)

非專利文獻(xiàn)1:大林尚美、村山和隆，多結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)膠原酶的分子內(nèi)構(gòu)象變化的解析，生化學(xué)，第85卷，第8號(hào)，pp692-699，2013年

非專利文獻(xiàn)2:Teramura Naoko etc,Cloning of a Novel Collagenase Gene from the Gram-Negative Bacterium Grimontia(Vibrio)hollisae 1706B and Its Efficient Expression in Brevibacillus choshinensis,Journal of Bacteriology,June 2011vol.193no.12p.3049-3056.

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的問(wèn)題

在胰島移植之外的醫(yī)療現(xiàn)場(chǎng)，使用容易得到的ColH和ColG的混合物。但是，ColH和ColG的結(jié)構(gòu)域構(gòu)造不同，根據(jù)ColH和ColG的配合比，性能會(huì)發(fā)生變化，因此活性不穩(wěn)定。另一方面，不易調(diào)整配合比成為使胰島分離的成功率降低的一個(gè)原因。因此，希望開(kāi)發(fā)出不用混合、活性穩(wěn)定的細(xì)胞分離用酶劑。

另一方面，所述非專利文獻(xiàn)1公開(kāi)的霍氏格里蒙菌源膠原酶的比活性高，專利文獻(xiàn)1中也公開(kāi)了使用了基因工程學(xué)的霍氏格里蒙菌源膠原酶的生產(chǎn)方法。但是，源于霍氏格里蒙菌的膠原酶的比活性有時(shí)會(huì)發(fā)生變動(dòng)。如果每個(gè)制造批次的比活性不同，則難以以相同的方案來(lái)使用不同批次的產(chǎn)品。進(jìn)而，如果經(jīng)時(shí)活性降低，則有時(shí)由于使用量變化因而細(xì)胞收量變化，或者有時(shí)通過(guò)進(jìn)行過(guò)度的分解處理從而給予細(xì)胞負(fù)荷。另一方面，霍氏格里蒙菌源膠原酶的結(jié)構(gòu)域的詳細(xì)情況還不清楚，比活性降低的原因也不明。因此，渴望開(kāi)發(fā)出來(lái)源于比活性穩(wěn)定的霍氏格里蒙菌的膠原酶的重組膠原酶。

進(jìn)而，細(xì)胞分離的請(qǐng)求不受胰島限定。肝臟、心臟、肺、腎臟、脾臟、腎上腺、肌肉之外、甲狀腺、唾液腺、腮腺腺胞、乳腺組織等腺組織、骨、軟骨等骨組織、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、脂肪組織等有時(shí)也可以在分離細(xì)胞后使用。對(duì)于良好地維持分離細(xì)胞的移植性等來(lái)說(shuō)，細(xì)胞的損傷少，移植率高是重要的。因此，希望開(kāi)發(fā)出各種細(xì)胞的分離性優(yōu)異，且移植率優(yōu)異的細(xì)胞分離劑。

胰島移植的成功率也依賴于被分離的胰島中殘留的酶量，殘留酶量越多移植率越低。優(yōu)選細(xì)胞清洗后殘留酶少，這在其他臟器、細(xì)胞中也是同樣的。因此，期待清洗組織后，可以迅速?gòu)慕M織分離，或者降低殘留在清洗組織中時(shí)的膠原酶活性，能夠避免或減少細(xì)胞障礙的新型膠原酶。

在此種狀況下，本發(fā)明的目的是提供膠原酶活性優(yōu)異且源于比活性穩(wěn)定的新型霍氏格里蒙菌的重組膠原酶。

本發(fā)明的目的還在于提供使用了由此得到的源于新型霍氏格里蒙菌的重組膠原酶的細(xì)胞分離用酶劑。

解決問(wèn)題的方法

本發(fā)明人等對(duì)霍氏格里蒙菌源膠原酶的基因進(jìn)行詳細(xì)研究后，發(fā)現(xiàn)：如果前體區(qū)為分泌信號(hào)序列、即使除去PPC也具有高的膠原酶活性、如果連結(jié)CD和PPC的接頭區(qū)序列的C末端起第3個(gè)氨基酸殘基為甘氨酸的話，則可以維持穩(wěn)定的膠原活性等，從而完成了本發(fā)明。

即，本發(fā)明提供一種源于霍氏格里蒙菌的重組膠原酶，其特征在于，是來(lái)自于從N末端向C末端包含膠原酶催化結(jié)構(gòu)域、接頭區(qū)序列和前肽酶C末端結(jié)構(gòu)域的霍氏格里蒙菌源膠原酶的重組膠原酶，至少不包含所述前肽酶C末端結(jié)構(gòu)域。

另外，本發(fā)明提供上述霍氏格里蒙菌來(lái)源的重組膠原酶，其特征在于，所述接頭區(qū)是被任一的酰胺鍵切斷的接頭片段。

另外，本發(fā)明提供上述霍氏格里蒙菌來(lái)源的重組膠原酶，其特征在于，所述接頭片段的C末端起第3個(gè)氨基酸殘基是甘氨酸。

另外，本發(fā)明提供上述霍氏格里蒙菌來(lái)源的重組膠原酶，其特征在于，所述接頭片段是所述接頭區(qū)中所含的由-G₁-X₁-Y₁-G₂-X₂-Y₂-表示的氨基酸序列的Y₁與G₂之間被切斷了的接頭片段，式中，G₁和G₂表示甘氨酸，X₁、Y₁、X₂和Y₂各自表示可以相同也可以不同的氨基酸殘基。

另外，本發(fā)明提供上述霍氏格里蒙菌來(lái)源的重組膠原酶，其特征在于，是所述接頭片段的C末端為-Gly-Asp-Ser、-Gly-Asn-Glu、-Gly-Glu-Ser、或-Gly-Asn-Thr中的任一種的重組膠原酶。

另外，本發(fā)明提供包含上述重組膠原酶的細(xì)胞分離用酶劑。

另外，本發(fā)明提供上述細(xì)胞分離用酶劑，其特征在于，用于選自由胰島、肝臟、心臟、肺、腎臟、脾臟、腎上腺、肌肉、甲狀腺、唾液腺、腮腺腺胞、乳腺組織、骨、軟骨、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、脂肪組織和纖維芽細(xì)胞組成的組中的1種以上細(xì)胞的分離。

發(fā)明效果

通過(guò)本發(fā)明，能夠提供源于比活性穩(wěn)定的霍氏格里蒙菌的重組膠原酶。如果用包含該重組膠原酶的細(xì)胞分解用酶劑培養(yǎng)摘出的臟器，則可以高效地分離細(xì)胞。

附圖說(shuō)明

圖1是說(shuō)明霍氏格里蒙菌源膠原酶的結(jié)構(gòu)域構(gòu)造、接頭區(qū)的序列、以及編碼重組60kDa膠原酶、重組62kDa膠原酶的氨基酸序列的圖。

圖2表示實(shí)施例1的結(jié)果的圖，是表示純化酶的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖的圖。74kDa表示74kDa膠原酶，62kDa表示重組62kDa膠原酶，60kDa表示重組60kDa膠原酶，M表示標(biāo)記物。

圖3是表示實(shí)施例2中，測(cè)定74kDa膠原酶、重組62kDa膠原酶和重組60kDa膠原酶剛剛純化后的比活性的經(jīng)時(shí)變化的結(jié)果的圖。

圖4是表示實(shí)施例3中，將重組62kDa膠原酶在溫度4℃保存后的比活性的經(jīng)時(shí)變化的圖。

圖5是表示實(shí)施例4的結(jié)果的圖，是表示酶液中所含的重組62kDa膠原酶的濃度與分解組織量和非分解組織量的變化的圖。

圖6是表示實(shí)施例5和比較例1的結(jié)果的圖，是表示使用重組62kDa膠原酶、或源于棱菌屬的膠原酶(Liberase)進(jìn)行胰臟消化實(shí)驗(yàn)，分解而得到的胰島的個(gè)數(shù)與IEQ的結(jié)果的圖。胰島的個(gè)數(shù)的結(jié)果示于圖6A，IEQ的結(jié)果示于圖6B。

圖7是表示實(shí)施例5中，使用重組62kDa膠原酶分離出的胰島的光學(xué)顯微鏡照片的圖。

圖8是表示實(shí)施例6的結(jié)果的圖，是表示移植胰島后的STZ誘導(dǎo)糖尿病小鼠與未移植的小鼠的血糖值的推移、和摘出的胰島移植腎、組織染色的結(jié)果的圖。小鼠的血糖值的推移的結(jié)果示于圖8A，摘出的胰島移植腎、組織染色的結(jié)果示于圖8B。

圖9是表示實(shí)施例7中分離的肝細(xì)胞的相差顯微鏡照片圖像的圖。

圖10是表示實(shí)施例8、比較例2的結(jié)果的圖，圖10A是表示對(duì)重組62kDa膠原酶對(duì)膠原纖維的結(jié)合能力的結(jié)果，圖10B是表示棱菌屬來(lái)源的膠原酶(Liberase)對(duì)膠原纖維的結(jié)合能力的結(jié)果。

圖11是表示實(shí)施例8、比較例2的結(jié)果的圖，是表示清洗后的膠原纖維被殘留的膠原酶經(jīng)時(shí)分解后的狀況的圖。

圖12是表示實(shí)施例10的結(jié)果的圖，是表示使重組62kDa膠原酶作用于I型、II型、III型、IV型、V型、和VI型膠原后的電泳像的圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明的第一方面是一種源于霍氏格里蒙菌的重組膠原酶，其特征在于，是來(lái)自于從N末端向C末端包含膠原酶催化結(jié)構(gòu)域、接頭區(qū)序列和前肽酶C末端結(jié)構(gòu)域的霍氏格里蒙菌源膠原酶的重組膠原酶，至少不包含所述前肽酶C末端結(jié)構(gòu)域。

(1)霍氏格里蒙菌

作為產(chǎn)生膠原酶的微生物，已知棱菌屬(Chrostridium sp.)、弧菌屬(Vibrio sp.)、芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)、鏈霉菌屬(Streptomyces sp.)等，但本發(fā)明使用的膠原酶來(lái)自于格里蒙菌屬(Grimontia sp.)。這里，霍氏格里蒙菌例如可以作為ATCC No.33564或ATCC No.33565而購(gòu)入。

(2)霍氏格里蒙菌源膠原酶

霍氏格里蒙菌源膠原酶的氨基酸序列的結(jié)構(gòu)域構(gòu)造示于圖1A?！?4kDa膠原酶”所表示的結(jié)構(gòu)域構(gòu)造是對(duì)應(yīng)于霍氏格里蒙菌源膠原酶的全衣殼序列的結(jié)構(gòu)域構(gòu)造。從N末端向C末端，氨基酸編號(hào)1～87是前體區(qū)，氨基酸編號(hào)88～615是催化結(jié)構(gòu)域區(qū)域(CD)，氨基酸編號(hào)616～687是接頭區(qū)，氨基酸編號(hào)688～749是PPC結(jié)構(gòu)域區(qū)域(PPC)。由767個(gè)氨基酸構(gòu)成，分子量是84kDa。作為霍氏格里蒙菌源膠原酶的一例，霍氏格里蒙菌1706B株的膠原酶的氨基酸序列示于序列號(hào)1，完整編碼區(qū)的DNA序列示于序列號(hào)2。這里，判明了所述前體區(qū)是分泌信號(hào)序列。只不過(guò)，不明確分泌信號(hào)序列是否是在翻譯的任一階段中脫離。本發(fā)明中，將具有前體區(qū)的膠原酶和缺失前體區(qū)的膠原酶兩者作為霍氏格里蒙菌源膠原酶。缺失前體區(qū)的霍氏格里蒙菌源膠原酶的分子量是74kDa。該結(jié)構(gòu)域構(gòu)造作為“74kDa膠原酶”而示于圖1A。

(3)源于霍氏格里蒙菌的重組膠原酶

本發(fā)明的源于霍氏格里蒙菌的重組膠原酶來(lái)自于霍氏格里蒙菌。其結(jié)構(gòu)域構(gòu)造只要是至少不含PPC的構(gòu)造即可。例如，就所述圖1A的84kDa膠原酶所示的結(jié)構(gòu)域構(gòu)造而言，是氨基酸編號(hào)688以后的序列缺失，從N末端向C末端由前體區(qū)、CD、接頭區(qū)構(gòu)成的重組膠原酶。還可以是缺失前體區(qū)，由CD和接頭區(qū)形成的重組膠原酶。如后述的實(shí)施例所示，確定了即使缺失PPC也能發(fā)揮出高的膠原酶活性，且膠原酶活性穩(wěn)定。進(jìn)而，本發(fā)明的霍氏格里蒙菌來(lái)源的重組膠原酶，如后述實(shí)施例所示，清洗后的膠原酶活性降低，細(xì)胞障礙降低。

本發(fā)明的霍氏格里蒙菌來(lái)源的重組膠原酶的接頭區(qū)也可以是其氨基酸序列的一部分缺失的接頭片段。本發(fā)明中的“接頭片段”，意味著接頭區(qū)的任一酰胺鍵被切斷后的物質(zhì)。例如，圖1A的84kDa膠原酶所示的結(jié)構(gòu)域構(gòu)造中，第616～687的接頭區(qū)的任一的酰胺鍵被切斷后的構(gòu)造。圖1A的“重組62kDa膠原酶”是具有由第616～646的31個(gè)氨基酸形成的接頭片段的例子，圖1A的“重組60kDa膠原酶”是具有由第616～624的9個(gè)氨基酸形成的接頭片段的例子。

所述接頭片段的C末端起第3個(gè)氨基酸殘基優(yōu)選是甘氨酸。C末端起第3個(gè)氨基酸殘基是甘氨酸的重組膠原酶，如后述的實(shí)施例所示，膠原酶活性的穩(wěn)定性優(yōu)異。所述接頭區(qū)，如序列號(hào)1所示，包含由-G₁-X₁-Y₁-G₂-X₂-Y₂-(式中，G₁和G₂表示甘氨酸，X₁、Y₁、X₂和Y₂各自表示可以相同也可以不同的氨基酸殘基。)表示的氨基酸序列。接頭區(qū)如果在所述氨基酸序列的Y₁和G₂之間被切斷，則C末端起第3個(gè)氨基酸成為甘氨酸。

為了方便，圖1A所示的“84kDa膠原酶”的接頭區(qū)的氨基酸序列的一部分示于圖1B?！?0kDa”表示“重組60kDa膠原酶”的C末端，“62kDa”表示“重組62kDa膠原酶”的C末端。重組60kDa膠原酶的C末端是接頭區(qū)的由-GDSGAG-表示的序列的S與G之間被切斷了的膠原酶，重組62kDa膠原酶是由-GNTGLP-表示的序列的T與G之間被切斷了的膠原酶。其結(jié)果是，C末端起第3個(gè)氨基酸殘基均成為甘氨酸。這里，所述接頭區(qū)中的所述-G₁X₁Y₁G₂X₂Y₂-中的切斷，如圖1B所示，也可以是第637與第638之間、第642與第643之間被切斷了。

本發(fā)明的重組膠原酶的C末端優(yōu)選為由所述-G₁-X₁-Y₁-G₂-X₂-Y₂-(式中、G₁和G₂表示甘氨酸，X₁、Y₁、X₂和Y₂各自表示可以相同也可以不同的氨基酸殘基。)表示的氨基酸序列的Y₁與G₂之間被切斷了的接頭片段。這是因?yàn)椋哂衁₁與G₂之間被切斷了的接頭片段的重組膠原酶的比活性經(jīng)歷長(zhǎng)時(shí)間也是穩(wěn)定的。因此，C末端，例如優(yōu)選是-GDS、-GNE、-GES和-GNT中的任一種。圖1B所示的序列中，如果所述氨基酸序列的Y₁與G₂之間被切斷，則C末端成為上述序列。

將缺失所述前體區(qū)和PPC、具有規(guī)定的接頭片段、氨基酸編號(hào)第88～第624的氨基酸序列的重組60kDa膠原酶的氨基酸序列示于序列號(hào)3，氨基酸編號(hào)第88～第646的氨基酸序列的重組62kDa膠原酶的氨基酸序列示于序列號(hào)4。進(jìn)而，將具有從84kDa膠原酶缺失前體區(qū)后的氨基酸編號(hào)第88～第767的氨基酸序列的膠原酶設(shè)為74kDa膠原酶，將其氨基酸序列示于序列號(hào)5。

本發(fā)明的重組膠原酶的保存穩(wěn)定性優(yōu)異的理由不明確。但是，對(duì)具有PPC的74kDa膠原酶和沒(méi)有PPC的重組膠原酶的比活性和穩(wěn)定性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，由于74kDa膠原酶具有更高的比活性，因此存在PPC自身有膠原結(jié)合能力，輔助CD的膠原酶活性的可能性。可以推定：本發(fā)明的重組膠原酶，通過(guò)缺失輔助膠原酶活性的PPC，膠原酶活性穩(wěn)定，且增加了通過(guò)清洗而從組織分離的分離性。這里，本發(fā)明的重組膠原酶，若缺失PPC，則也可以是缺失接頭區(qū)的酶。

(4)重組膠原酶的制造方法

作為制備本發(fā)明的重組膠原酶時(shí)的轉(zhuǎn)化用DNA，是至少將對(duì)應(yīng)于CD的氨基酸序列編碼的DNA，更優(yōu)選是將包括CD和接頭區(qū)的一部分的氨基酸序列編碼的DNA。進(jìn)而，也可以是在N末端側(cè)具有對(duì)應(yīng)于前體區(qū)的氨基酸序列的DNA。接頭區(qū)的C末端可以優(yōu)選使用由接頭區(qū)序列中所含的-G₁X₁Y₁G₂X₂Y₂-表示的序列的Y₁與G₂之間被切斷了的序列。作為能夠用于制作不含PPC、C末端起第3個(gè)是甘氨酸的重組膠原酶的DNA，可以使用編碼下述(I)所示的氨基酸序列的DNA。

式(I)：

AVEQCDLSQFQTTSSNQLMAAIRQQGASCVNALFSADTGVQEAAFSSNHMYNVAQYTRTLAQQYAGGGSDELEALYLYLRAGYYAEFYNSNITFLSWVTPAVKGAVDAFVQNAHFYDNGDAHGKVLNEVIITMDSAGLQHAYLDVVTQWLTRWNAQYAEHWYMRNAVNGVFTLLFGGQWNNQYTSLIGEQTALVTALQAFALDRTKVNSPTEFMAANAARELGRLARYTDATIAPKVTEGLTAIFGQYPSYGDGDAIWLGAADTASYYADCSQFNICGFEDALRDAALNQTFICSDTIKIRSQDMSQAQHLAACDKMAYEESFFHTTLETGNQPVADDHNTQLQVNIFNSDTDYGKYAGPIFGIDTNNGGMYLEGNPANVGNIPNFIAYEASYANPDHFVWNLEHEYVHYLDGRFNMYGDFGTPTELVVWWSEGVAEYVSRVNDNPQAIATIQDGSTYTLAQVFDTTYDGFDVDRIYRWGYLAVRFMFERHPDEVQRMLSATRQGRWAEYKAIISGWANQYQSEFAQW-X

其中，X是由TEALAKGDSGAGNGEGTGSGNEGGGESGGNT或TEALAKGDS表示的多肽。序列號(hào)3是X為TEALAKGDS時(shí)的氨基酸序列，序列號(hào)4是X為TEALAKGDSGAGNGEGTGSGNEGGGESGGNT時(shí)的氨基酸序列。這里，上述式所使用的字母表示以下的氨基酸。A:丙氨酸、C:半胱氨酸、D:天冬氨酸、E:谷氨酸F：苯丙氨酸、G：甘氨酸、H:組氨酸、I:異亮氨酸、K:賴氨酸、L:亮氨酸、M:蛋氨酸、N:天冬酰胺、P:脯氨酸、Q:谷氨酰胺、R:精氨酸、S:絲氨酸、T:蘇氨酸、V:纈氨酸、W:色氨酸、Y:酪氨酸。

為了制備本發(fā)明的重組膠原酶，制備包含將上述氨基酸序列編碼的DNA的重組載體，在所述重組載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，制備具有膠原酶活性的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞而使其產(chǎn)生具有膠原酶活性的基因產(chǎn)物即可。這樣的重組蛋白質(zhì)的制造方法可以使用基因工程的技術(shù)來(lái)進(jìn)行。例如，從霍氏格里蒙菌的基因組文庫(kù)中選擇含霍氏格里蒙菌源膠原酶基因的克隆體，在將該克隆體作為模板而編碼所述序列號(hào)3、序列號(hào)4的DNA片段的5’側(cè)附加Nco I位點(diǎn)，在3’側(cè)附加Hind III位點(diǎn)，通過(guò)Expand High Fidelity PCR System(羅氏)進(jìn)行擴(kuò)增，將擴(kuò)增后的片段通過(guò)Nco I-Hind III進(jìn)行處理回收，將回收后的該DNA片段插入質(zhì)粒載體等來(lái)制備重組質(zhì)粒，使用它來(lái)轉(zhuǎn)化例如橋石短芽孢桿菌(Brevibacillus choshinensis)HPD31-SP3株等，制作橋石短芽孢桿菌重組體?；蛘撸部梢詫⒃谝院羰细窭锩删茨z原酶基因的克隆體作為模板，在編碼所述序列號(hào)3、序列號(hào)4的DNA片段的兩端，附加了與插入的直鏈狀表達(dá)載體的兩末端相同的15堿基對(duì)的序列的DNA片段進(jìn)行制備和擴(kuò)增，將該擴(kuò)增后的DNA片段和直鏈狀表達(dá)載體混合后，用新Tris-PEG法導(dǎo)入橋石短芽孢桿菌HPD31-SP3株等來(lái)制作重組質(zhì)粒和重組體。如果將如此得到的橋石短芽孢桿菌重組體進(jìn)行培養(yǎng)，則可以使培養(yǎng)上清中產(chǎn)生霍氏格里蒙菌源膠原酶基因產(chǎn)物。

從培養(yǎng)物中采集和純化作為目標(biāo)物質(zhì)的重組膠原酶的方法，可以按照一般的酶的采集以及純化手段來(lái)進(jìn)行。例如，通過(guò)將培養(yǎng)物離心或過(guò)濾等將菌體分離，使用通常的分離手段例如基于有機(jī)溶劑沉淀法、鹽析、超濾膜進(jìn)行的濃縮等，通過(guò)柱色譜等從該培養(yǎng)濾液中進(jìn)行純化的方法。

另外，本發(fā)明的源于霍氏格里蒙菌的重組膠原酶，可以從用事前不含前體區(qū)的DNA轉(zhuǎn)化后的宿主細(xì)胞生產(chǎn)重組膠原酶，也可以從用含前體區(qū)的DNA轉(zhuǎn)化后的宿主細(xì)胞產(chǎn)生重組膠原酶，在翻譯中或翻譯后使前體區(qū)脫離。

(5)細(xì)胞分離用酶劑

用本發(fā)明的制造方法得到的重組膠原酶，可以與以往的膠原酶同樣地使用，例如可以作為細(xì)胞分離用酶劑來(lái)使用。作為從摘出臟器分離細(xì)胞的對(duì)象，有胰島、肝臟、心臟、肺、腎臟、脾臟、腎上腺、肌肉之外、甲狀腺、唾液腺、腮腺腺胞、乳腺組織等腺組織、骨、軟骨等骨組織、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、脂肪組織、纖維芽細(xì)胞等。不限于摘出組織，在膠原培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)的培養(yǎng)細(xì)胞的分離中也是合適的。特別是本發(fā)明所得的重組膠原酶，由于比活性是穩(wěn)定性的，因此可以適合作為用于從摘出的胰臟臟器分離胰島的細(xì)胞分離用酶劑來(lái)使用。如后述的實(shí)施例所示，對(duì)清洗組織的膠原酶活性低，細(xì)胞損傷少。

本發(fā)明使用的細(xì)胞分離用酶劑中可以進(jìn)一步含有金屬蛋白酶、絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶等其他成分。作為金屬蛋白酶，有嗜熱菌蛋白酶、分散酶(dispase)、源于梭菌蛋白酶的中性蛋白酶等。作為絲氨酸蛋白酶，有胰蛋白酶、彈性蛋白酶等，作為半胱氨酸蛋白酶，有木瓜凝乳蛋白酶等。

(6)細(xì)胞分離方法

在摘出的臟器、動(dòng)物組織中添加本發(fā)明的細(xì)胞分離用酶劑，培養(yǎng)預(yù)定時(shí)間。若將摘出物用添加有上述細(xì)胞分離用酶劑、進(jìn)而在添加有其他成分的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，則可以將所述摘出組織的細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞間結(jié)合分離，分離出細(xì)胞。從組織分離出的細(xì)胞浮游在培養(yǎng)液中的情況下，通過(guò)過(guò)濾、離心等從培養(yǎng)液回收分離出的細(xì)胞即可。

本發(fā)明中，使用胰臟臟器作為摘出臟器，可以將胰島分離。胰島通過(guò)膠原與胰臟內(nèi)的其他組織結(jié)合，因此通過(guò)用膠原酶培養(yǎng)，可以將胰島從其他組織游離。例如，從摘出的胰臟臟器的胰管注入本發(fā)明的細(xì)胞分離用酶劑，培養(yǎng)預(yù)定時(shí)間。培養(yǎng)時(shí)間根據(jù)使用的組織的狀態(tài)、細(xì)胞分離用酶劑中所含的重組膠原酶量等來(lái)適當(dāng)選擇即可。胰島比其他組織輕，因此可以在培養(yǎng)后通過(guò)密度梯度離心分離法等進(jìn)行純化。另外，不限于胰島，可以適合用于肝臟、心臟、肺、腎臟、脾臟、腎上腺、肌肉之外、甲狀腺、唾液腺、腮腺腺胞、乳腺組織等腺組織、骨、軟骨等骨組織、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、脂肪組織、纖維芽細(xì)胞等任一的細(xì)胞分離。

實(shí)施例

下面，舉出實(shí)施例來(lái)具體說(shuō)明本發(fā)明，但這些實(shí)施例對(duì)本發(fā)明沒(méi)有任何限制。

(實(shí)施例1)

將含霍氏格里蒙菌源膠原酶的完整編碼區(qū)的基因的桿粒pCC1BAC-2(保藏編號(hào)；NITE BP-00739：保藏日(原保藏)；2009年4月28日：保藏機(jī)構(gòu)的名稱；獨(dú)立行政法人產(chǎn)品評(píng)定技術(shù)基礎(chǔ)機(jī)構(gòu)專利微生物保藏中心(NPMD)：保藏機(jī)構(gòu)地址；日本國(guó)2920818千葉縣木更津市上總鐮足2-5-8)作為模板，在由序列號(hào)5的肽序列誘導(dǎo)的該膠原酶基因的部分序列(長(zhǎng)度2040bp)的5’側(cè)附加Nco I位點(diǎn)，在3’側(cè)附加Hind III位點(diǎn)，通過(guò)Expand High Fidelity PCR System(羅氏)進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)中使用下述引物組。引物的序列之中，下劃線表示制限酶位點(diǎn)。

Fwd:AAACCATGGCTTTCGCTGCGGTTGAACAGTGTGATCT(序列號(hào)6)

Rvs:AAAAAGCTTTTACTGACGACACTGGTTAC(序列號(hào)7)

對(duì)擴(kuò)增后的片段用Nco I-Hind III進(jìn)行處理回收，將回收后的該DNA片段插入質(zhì)粒載體pNY326的克隆位點(diǎn)，制作pNY326-Col.74。用該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化橋石短芽孢桿菌HPD31-SP3株，制作重組體。

另外，將含霍氏格里蒙菌源膠原酶的完整編碼區(qū)的基因的桿粒pCC1BAC-2(NITE BP-00739)作為模板，使用下述引物組利用PCR反應(yīng)，將由所述序列號(hào)3的肽序列誘導(dǎo)的該膠原酶基因的部分序列(長(zhǎng)度1611bp)分離。引物的序列之中，下劃線表示與直鏈狀載體兩端的序列相同的序列。

引物：

Fwd:CCCATGGCTTTCGCTGCGGTTGAACAGTGTGATCT(序列號(hào)8)

Rvs:CATCCTGTTAAGCTTACTGTCGCCCTTCGCCAGC(序列號(hào)9)

另外，使用下述引物組利用PCR反應(yīng)來(lái)制備直鏈狀表達(dá)載體pNY326。引物的序列之中，用下劃線表示與插入的DNA片段兩端的序列相同的序列。

引物：

Fwd:AAGCTTAACAGGATGCGGGG(序列號(hào)10)

Rvs:AGCGAAAGCCATGGGAGCAA(序列號(hào)11)

通過(guò)上述，將編碼序列號(hào)3的重組60kDa膠原酶的DNA片段(1611bp)和直鏈狀表達(dá)載體pNY326以摩爾比2：1進(jìn)行混合后，用新Tris-PEG法導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞并且將橋石短芽孢桿菌HPD31-SP3株轉(zhuǎn)化，制作質(zhì)粒pNY326-Col.60和重組體。

同樣地進(jìn)行操作，使用以下引物組，利用PCR反應(yīng)將由上述序列號(hào)4的肽序列誘導(dǎo)的該膠原酶基因的部分序列(長(zhǎng)度1677bp)分離。引物的序列之中，用下劃線表示與直鏈狀載體兩端的序列相同的序列。

引物：

Fwd:CCCATGGCTTTCGCTGCGGTTGAACAGTGTGATCT(序列號(hào)12)

Rvs:CATCCTGTTAAGCTTAGGTATTACCACCAGATTCA(序列號(hào)13)

接著，進(jìn)行與上述同樣的操作來(lái)制備直鏈狀表達(dá)載體pNY326，制作包含編碼序列號(hào)4的重組62kDa膠原酶的DNA片段(1677bp)的質(zhì)粒pNY326-Col.62和重組體。通過(guò)上述操作，制作3種橋石短芽孢桿菌重組體。

將所述3種橋石短芽孢桿菌重組體各自在100ml的2SYN培養(yǎng)基(20g/L葡萄糖、40g/L Bacto大豆胨、5g/L Bacto酵母粉、0.15g/L CaCl₂·2H₂O、50μg/mL新霉素)中于30℃培養(yǎng)48小時(shí)。將含霍氏格里蒙菌源膠原酶基因產(chǎn)物的培養(yǎng)液離心，將得到的上清用0.2μm過(guò)濾器過(guò)濾滅菌。接著，將上清用HPLC系統(tǒng)純化，分級(jí)。HPLC系統(tǒng)通過(guò)使用了DEAE-Sepharose的陰離子交換柱色譜進(jìn)行。將各培養(yǎng)上清供于柱而使膠原酶吸附后，使NaCl濃度從0.2至1M連續(xù)地上升，同時(shí)使50mM的Bis-Tris HCl緩沖液(pH7)流過(guò)，使膠原酶分離溶出。將溶出液按溶出順序每次4ml地進(jìn)行采集，分級(jí)。然后，通過(guò)超濾除去30kDa以下的物質(zhì)，用含0.2M的NaCl和5mM的CaCl₂的4℃的50mM Tris HCl緩沖液進(jìn)行透析，得到精制后的74kDa膠原酶、重組62kDa膠原酶和重組60kDa膠原酶。

精制酶的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖示于圖2。74kDa表示74kDa膠原酶，62kDa表示重組62kDa膠原酶，60kDa表示重組60kDa膠原酶。

(實(shí)施例2)

按下述方法測(cè)定實(shí)施例1中所得的74kDa膠原酶、重組62kDa膠原酶和重組60kDa膠原酶的比活性的經(jīng)時(shí)變化。測(cè)定結(jié)果示于圖3。74kDa在剛剛純化后為18,000(U/mg)的活性，但在24小時(shí)后降低至11,500(U/mg)，活性經(jīng)時(shí)降低。與此相對(duì)，重組62kDa膠原酶和重組60kDa膠原酶從剛剛純化后到24小時(shí)時(shí)，均在12,000(U/mg)前后變化，膠原酶活性穩(wěn)定。

膠原酶的比活性測(cè)定：在包含用熒光標(biāo)記后的I型膠原(FITC-膠原)0.05％、5mM的CaCl₂、200mM的NaCl的50mM的Tris HCl(pH7.5)中混合膠原酶0.5μg，加熱到30℃。30分鐘后，添加EDTA使酶反應(yīng)停止。在反應(yīng)液中添加含有等量的70％乙醇的50mM的Tris HCl(pH9.5)，提取分解物，用熒光分光光度計(jì)測(cè)定熒光強(qiáng)度。圖中1單位(U)的意思是將膠原1μg在30℃用1分鐘進(jìn)行分解的活性。

(實(shí)施例3)

對(duì)于將實(shí)施例1中所得的重組62kDa膠原酶以溫度4℃保存時(shí)的比活性的經(jīng)時(shí)變化進(jìn)行了評(píng)價(jià)。第0天的比活性值設(shè)為100％時(shí)的相對(duì)值示于圖4。如圖4所示，在100天的期間中能夠穩(wěn)定地維持高的比活性。這里，重組60kDa膠原酶也顯示出同樣的穩(wěn)定性。

(實(shí)施例4)

使用實(shí)施例1中所得的重組62kDa膠原酶進(jìn)行了胰臟消化實(shí)驗(yàn)。從小鼠分離出胰臟，從胰管向HBSS緩沖液1ml中注入包含重組62kDa膠原酶0.00625～0.20mg和嗜熱菌蛋白酶(羅氏應(yīng)用科學(xué)公司制、商品名“LiberaseC/T”的內(nèi)包物)0.012mg的酶液，在37℃孵育15分鐘。之后，對(duì)通過(guò)了開(kāi)孔1mm篩的部分(分解組織)和殘留在篩上的(非分解組織)的蛋白量進(jìn)行測(cè)定。依賴于酶液中所含的重組62kDa膠原酶的濃度，分解組織量增加，與其相伴，非分解組織量降低。結(jié)果示于圖5。如圖5所示，重組62kDa膠原酶的濃度為0.05mg/ml，反應(yīng)達(dá)到平穩(wěn)期。

(實(shí)施例5)

與實(shí)施例4同樣地，使用實(shí)施例1中所得的重組62kDa膠原酶進(jìn)行胰臟消化實(shí)驗(yàn)，測(cè)定分解得到的胰島的個(gè)數(shù)，評(píng)價(jià)IEQ(胰島當(dāng)量(Islet Equivalent)：將直徑為150μm的胰島規(guī)定為1的、表示胰島的體積的國(guó)際單位)。將重組62kDa膠原酶的濃度的差異引起的胰島個(gè)數(shù)的結(jié)果示于圖6A，將IEQ的結(jié)果示于圖6B。另外，分離出的胰島的光學(xué)顯微鏡照片示于圖7。

(比較例1)

代替實(shí)施例1中所得的重組62kDa膠原酶，使用棱菌屬來(lái)源的膠原酶(羅氏應(yīng)用科學(xué)公司制、商品名“LiberaseC/T”)，除此以外，進(jìn)行與實(shí)施例5同樣的操作，評(píng)價(jià)胰島的個(gè)數(shù)和IEQ。將結(jié)果一并記載于圖6A、圖6B。實(shí)施例1中所得的重組62kDa膠原酶，與以往的市售品同樣地，可以從胰臟組織分離出胰島。

(實(shí)施例6)

將實(shí)施例5中所得的胰島移植到STZ誘導(dǎo)糖尿病小鼠的腎皮膜下，經(jīng)時(shí)地測(cè)定血糖值。在未移植胰島的對(duì)照組(n＝3：STZ-1、STZ-2、STZ-3)中，顯示高血糖值，與此相對(duì)，胰島移植組(n＝5：STZ/islet-1～STZ/islet-5)中，移植后血糖值很快降低至正常水平。移植后第39天摘出移植了胰島的腎臟，則血糖值再次上升。結(jié)果示于圖8A。摘出的胰島移植腎及其局部放大照片示于圖8B的左端的上下2行。另外，進(jìn)行了摘出了胰島移植腎的蘇木精-伊紅染色(H&E染色)時(shí)，在腎皮膜下對(duì)胰島進(jìn)行確認(rèn)，進(jìn)而用抗胰島素抗體將胰島染色(圖8B)。這些顯示：通過(guò)實(shí)施例1中所得的重組62kDa膠原酶，可以分離出保持了胰島功能的胰島。

(實(shí)施例7)

使用實(shí)施例1中所得的重組62kDa膠原酶進(jìn)行了肝臟消化實(shí)驗(yàn)。將麻酔后的大鼠肝臟在HBSS緩沖液灌流下脫血而除去鈣，接著在肝臟內(nèi)將重組62kDa膠原酶0.05mg/ml和嗜熱菌蛋白酶0.01mg/ml灌流10分鐘而添加鈣后，摘出肝臟。將摘出肝臟進(jìn)行冰冷卻，用手術(shù)刀切碎，用紗布和濾網(wǎng)過(guò)濾。除去死細(xì)胞后將肝臟細(xì)胞離心回收。肝細(xì)胞的相差顯微鏡照片示于圖9。將該肝細(xì)胞培養(yǎng)7天后，生存率為98％。

(實(shí)施例8)

對(duì)實(shí)施例1中所得的重組62kDa膠原酶與膠原纖維的結(jié)合能力和清洗后殘留于膠原纖維的膠原酶活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

將豬皮膠原纖維5mg和400μl的含0.2M的NaCl、5mM的CaCl₂的Tris HCl緩沖液(pH7.5)加入內(nèi)置過(guò)濾器的離心柱(spin column)，以10,000rpm進(jìn)行2分鐘的離心，用所述緩沖液清洗膠原纖維，進(jìn)行總共5次的離心分離。

將清洗液廢棄，向所述離心柱的過(guò)濾器上的膠原纖維中添加酶混合液(包含重組62kDa膠原酶0.2mg/ml、卵白蛋白0.2mg/ml、鄰二氮雜菲4mM、NaCl0.2M、CaCl₂5mM的Tris HCl緩沖液(pH7.5))100μl，于4℃靜置30分鐘，使重組62kDa膠原酶與膠原纖維結(jié)合。

接著，以10,000rpm進(jìn)行2分鐘的離心分離，將所述過(guò)濾器上的膠原纖維與通過(guò)過(guò)濾器的混合液分離。將該混合液的一部分用SDS-PAGE分析。另外，為了比較，不添加豬皮膠原纖維、進(jìn)行與上述同樣的處理而得到的混合液也用SDS-PAGE分析。結(jié)果以圖10A的“混合液/膠原纖維“-”、“+””表示。就重組62kDa膠原酶的條帶而言，“+”為變淡，“-”為變濃。重組62kDa膠原酶如果與膠原纖維混合，則表示與膠原纖維結(jié)合。這里，圖10中，M表示標(biāo)記物。

接著，將離心柱內(nèi)的膠原酶所結(jié)合的膠原纖維回收到2ml管中，加入包含0.2M的NaCl、5mM的CaCl₂、0.1mg/ml的膠原肽、4mM的鄰二氮雜菲的Tris HCl緩沖液(pH7.5)，于4℃靜置10分鐘后，以10,000rpm進(jìn)行2分鐘的離心，用所述膠原肽含有緩沖液清洗沉淀物，進(jìn)行總共5次的離心分離。5次清洗上清分別用SDS-PAGE分析。結(jié)果以圖10A的“酶結(jié)合膠原纖維的膠原肽清洗上清/1，2，3，4，5”表示。數(shù)值表示上清的清洗次數(shù)。清洗第1次至第5次期間均顯示為：重組62kDa膠原酶的條帶淡，結(jié)合于膠原纖維的重組62kDa膠原酶即使用膠原肽清洗也殘留在膠原纖維中。

另外，向通過(guò)離心分離而得的膠原酶所結(jié)合的膠原纖維中，添加500μl的包含0.2M的NaCl、5mM的CaCl₂、2μg/ml的ZnSO₄·7H₂O的Tris HCl緩沖液，于37℃靜置。靜置開(kāi)始時(shí)、開(kāi)始后1小時(shí)、3小時(shí)、5小時(shí)、7小時(shí)、17小時(shí)、20小時(shí)后目視觀察。聚集在2ml管底部的膠原纖維的經(jīng)時(shí)變化示于圖11。另外，靜置20小時(shí)后的上清用SDS-PAGE分析。SDS-PAGE的結(jié)果示于圖10A的“清洗后纖維上清/20h”。靜置20小時(shí)后的上清，出現(xiàn)濃的膠原分解物的條帶，與膠原纖維結(jié)合的膠原酶表現(xiàn)出即使清洗也殘留于膠原纖維、發(fā)揮膠原酶活性。這里，“清洗后纖維上清/20h”中，與膠原分解物的條帶一同出現(xiàn)了濃的62kDa的條帶，顯示膠原分解后膠原酶迅速分離。

(比較例2)

代替重組62kDa膠原酶，使用同量的棱菌屬來(lái)源的膠原酶(羅氏應(yīng)用科學(xué)公司制、商品名“LiberaseC/T”)，除此以外，與實(shí)施例8同樣地進(jìn)行操作。結(jié)果示于圖10B和圖11。

如圖10B所示，存在膠原纖維的“+”的柱中，Liberase(膠原酶)的條帶淡，Liberase與膠原纖維結(jié)合的情況，用膠原肽清洗膠原酶結(jié)合膠原纖維時(shí)的清洗上清在清洗1～5期間，Liberase的條帶淡，膠原酶即使用膠原肽清洗也殘留于膠原纖維的情況等，顯示出與重組62kDa膠原酶相同的傾向。

另一方面，如圖11所示，觀察到殘留于膠原纖維的膠原酶的酶活性在重組62kDa膠原酶和Liberase之間而并不相同。圖11中，殘留酶的膠原酶活性越高，膠原纖維量降低越快。關(guān)于膠原纖維量降低的程度，重組62kDa膠原酶的比Liberase低。胰島分離等處理中，通過(guò)殘留酶而產(chǎn)生細(xì)胞障礙，因此優(yōu)選分離出胰島后，酶不殘留、即使存在殘留酶膠原酶活性也降低。如圖10A和圖10B所示，重組62kDa膠原酶和Liberase與膠原纖維結(jié)合，即使用膠原肽將其清洗5次，其一部分也殘存于膠原纖維上。但是，殘留的酶的活性與兩者并不相同，與Liberase相比，重組62kDa膠原酶的膠原酶活性降低。雖然詳細(xì)原因不明確，但推定一個(gè)原因是重組62kDa膠原酶與Liberase不同，沒(méi)有與膠原纖維結(jié)合的“CBD”。由于不存在“CBD”，因此與膠原纖維的結(jié)合不緊密，基于殘留酶的膠原酶活性可能會(huì)產(chǎn)生差異。

(實(shí)施例9)

對(duì)于實(shí)施例1中所得的重組62kD膠原酶和棱菌屬來(lái)源的膠原酶(羅氏應(yīng)用科學(xué)公司制、商品名“LiberaseC/T”)的、對(duì)熒光標(biāo)記后的I型膠原(以下、稱為FITC-膠原。)和合成基質(zhì)N-(3[2-呋喃]丙烯酰基)-Leu-Gly-Pro-Ala(以下、稱為FALGPA。)的分解活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

FITC-膠原使用包含0.2M的NaCl、5mM的CaCl₂的50mM的Tris-HCl(pH7.5、30℃)緩沖液，F(xiàn)ALGPA使用包含0.4M的NaCl、40mM的CaCl₂的50mM二甲苯胺(pH7.5、30℃)。以FITC-膠原作為基質(zhì)時(shí)，添加上述膠原酶0.5μg，以FALGPA作為基質(zhì)時(shí)，添加重組62kD膠原酶1.0μg、或LiberaseC/T2.5μg。用酶標(biāo)儀對(duì)FALGPA進(jìn)行檢測(cè)和定量，評(píng)價(jià)FALGPA分解活性。在反應(yīng)體系1ml中，1mg酶每1分鐘分解1μmole的所述肽的活性作為比活性1U/mg而算出，將得到的比活性示于表1。重組62kD膠原酶不僅能夠分解膠原，而且對(duì)合成基質(zhì)FALGPA的分解活性優(yōu)異，因此有不僅對(duì)膠原而且對(duì)明膠的分解性也優(yōu)異的啟示。

[表1]

(實(shí)施例10)

使用實(shí)施例1中所得的重組62kDa膠原酶，評(píng)價(jià)針對(duì)I型、II型、III型、IV型、V型、和VI型膠原的活性。向0.5mg/ml的上述膠原中添加溶解于含有0.2M的NaCl和5mM的CaCl₂的50mM的Tris-HCl緩沖液(pH7.5)中的1μg/ml的膠原酶，在30℃下培養(yǎng)，培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)、1小時(shí)后、3小時(shí)后、5小時(shí)后取樣，通過(guò)電泳進(jìn)行分析。另外，為了進(jìn)行比較，使用棱菌屬來(lái)源的膠原酶(羅氏應(yīng)用科學(xué)公司制、商品名“LiberaseC/T”)進(jìn)行同樣的操作。結(jié)果示于圖12。這里，圖12中，62kDa表示使用了重組62kDa膠原酶的柱，Liberase表示使用了棱菌屬來(lái)源的膠原酶的柱。

I型膠原中，由α1(I)和α2(I)的3小時(shí)后、5小時(shí)后的條帶的消失的程度，推定與Liberase相比，重組62kDa膠原酶更迅速地分解I型膠原。該傾向在II型、III型、IV型、V型、VI型膠原中也同樣被觀察到。特別是IV型和V型膠原，相比使用重組62kDa膠原酶反應(yīng)3小時(shí)或5小時(shí)反應(yīng)后的條帶變淡，在Liberase中，條帶沒(méi)有消失。關(guān)于VI型膠原，相比使用重組62kDa膠原酶使其反應(yīng)72小時(shí)后的條帶變淡，在Liberase中的條帶沒(méi)有消失。有重組62kDa膠原酶對(duì)于Liberase不容易分解的膠原也可能能夠分解的啟示。

在不脫離本發(fā)明的廣義精神和范圍的情況下，本發(fā)明能夠進(jìn)行各種設(shè)施方式和變形。另外，上述實(shí)施方式用于說(shuō)明本發(fā)明，不限定本發(fā)明的范圍。即，本發(fā)明的范圍不是實(shí)施方式，而是如權(quán)利要求書(shū)所示。而且，權(quán)利要求書(shū)的范圍以及與其同等發(fā)明意義范圍內(nèi)實(shí)施的各種變形都視為本發(fā)明的范圍。

本發(fā)明以2014年3月6日提出申請(qǐng)的日本國(guó)特愿2014-044205號(hào)為基礎(chǔ)。本說(shuō)明書(shū)中將日本國(guó)特愿2014-044205號(hào)的說(shuō)明書(shū)、權(quán)利要求書(shū)、附圖全部作為參照而引入。

工業(yè)上的可利用性

根據(jù)本發(fā)明，可以提供比活性穩(wěn)定的重組膠原酶和含該重組膠原酶的細(xì)胞分離用酶劑，是有用的。

保藏編號(hào)

NITE BP-00739