專利名稱：：改進向細(xì)菌細(xì)胞中導(dǎo)入dna的方法改進向細(xì)菌細(xì)胞中導(dǎo)入DNA的方法對生物材料保藏的引用本申請包含對生物材料保藏的引用，所述保藏通過提述并入本文。對序列表的引用本申請包含計算機可讀格式的序列表。所述計算機可讀格式通過提述并入本文。
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：發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及改進向細(xì)菌宿主細(xì)胞中導(dǎo)入DNA的方法。相關(guān)領(lǐng)域描述II型限制性內(nèi)切核酸酶據(jù)報道是將DNA導(dǎo)入細(xì)菌的有效屏障(Briggs等,1994,J;p/zW朋c/五謂.ra扁e"to/M.cra6油gy60:2006-2010;Accetto等，2005，F(xiàn)五MSM/cra^o/ogy247:177-183)。已經(jīng)在芽孢桿菌屬中表征了很多II型限制性內(nèi)切核酸酶，并且已從芽孢桿菌屬菌種分離出很多商業(yè)上可得到的限制性內(nèi)切核酸酶(Roberts,等'2005,iVwc/e/c^c/血7e"wc/z33:230-232)。由于宿主DNA受到相應(yīng)的DNA曱基轉(zhuǎn)移酶的修飾，所以宿主DNA受到保護，免受其天然限制性內(nèi)切核酸酶的切割。限制性內(nèi)切核酸酶和DNA曱基轉(zhuǎn)移酶通常在基因組中彼此相鄰，構(gòu)成限制-修飾(R-M)系統(tǒng)。這些基因在轉(zhuǎn)錄上可以會聚(convergent)、發(fā)散(divergent)或順序方式定向。雖然限制性內(nèi)切核酸酶彼此之間只有很小的序列相似性(即使有的話)，但已經(jīng)在很多限制性內(nèi)切核酸酶中發(fā)現(xiàn)了有限的氨基酸基序，PD…D/EXK(Pingoud和Jeltsch,2001，M/c/e/cWe"arc/229:3705-3727)。相反，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了DNA曱基轉(zhuǎn)移酶的幾個通常的基序(Kumar等，1994,A^c/e/c爿c/A六e化wc/z22:1-10;Smith等，1990,/V"cmizV^o//;eAto/cwfl/Jcfld簡少o/iSWewcesf7S^87:826-830)，其允許通過首先鑒定限制性內(nèi)切核酸酶的更同源的相應(yīng)DNA曱基轉(zhuǎn)移酶來鑒定限制性內(nèi)切核酸酶。將DNA導(dǎo)入細(xì)菌宿主細(xì)胞，例如地衣芽孢桿菌，可為低效率的方法，其產(chǎn)生很少的轉(zhuǎn)化體(即使有的話)。本領(lǐng)域中需要將DNA導(dǎo)入細(xì)菌宿主細(xì)胞的新方法，以改進獲得包含所述DNA的轉(zhuǎn)化體的效率。本發(fā)明涉及將DNA導(dǎo)入細(xì)菌宿主細(xì)胞的改進的方法。發(fā)明概述本發(fā)明涉及選自下組的編碼DNA曱基轉(zhuǎn)移酶的分離的多核苷酸(a)編碼多肽的多核苷酸，所述多肽包含與SEQIDNO:2的氨基酸l至381具有至少60%序列同一性的氨基酸序列；(b)多核苷酸，其包含與SEQIDNO:1的核苷酸1至1143具有至少60%序列同一性的核苷酸序列；(c)多核苷酸，其在至少中嚴(yán)緊性條件下與SEQIDNO:1的核苷酸1至1143或其全長互補鏈雜交；和(d)多核芬酸，其編碼包含取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQIDNO:2的氨基酸1至381的變體。本發(fā)明還涉及選自下組的分離的DNA曱基轉(zhuǎn)移酶(a)多肽，其包含與SEQIDNO:2的氨基酸1至381具有至少60%序列同一性的氨基S吏序列；(b)多肽，其由包含與SEQIDNO:1的核苷酸1至1143具有至少60%序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸編碼；(c)多肽,其由在至少中嚴(yán)緊條件下與SEQIDNO:1的核苦酸1至1143或其全長互補鏈雜交的多核苷酸編碼；和(d)變體，其包含取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQIDNO:2的氨基酸1至381。本發(fā)明還涉及選自下組的編碼限制性內(nèi)切核酸酶的分離的多核苷酸(a)多核苷酸，其編碼包含與SEQIDNO:4的氨基酸1至337具有至少60%序列同一性的多肽；(b)多核苷酸，其包含與SEQIDNO:3的核苷酸1至1011具有至少60%序列同一性的核苷酸序列；(c)多核苷酸，其在至少中嚴(yán)緊條件下與SEQIDNO:3的核苷酸1至1011或其全長互補鏈雜交；和(d)多核苷酸，其編碼包含取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQIDNO:4的氨基酸1至337的變體。本發(fā)明還涉及選自下組的分離的限制性內(nèi)切核酸酶(a)多肽，其包含與SEQIDNO:4的氨基酸1至337具有至少60%序列同一性的氨基酸序列；(b)多肽，其由包含與SEQIDNO:3的核苷酸1至1011具有至少60%序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸編碼；(c)多肽，其由在至少中嚴(yán)緊條件下與SEQIDNO:3的核苷酸1至1011或其全長互補鏈雜交的多核芬酸編碼；和(d)變體，其包含取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQIDNO:4的^ij^酸1至337。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生細(xì)菌轉(zhuǎn)化體的方法，其包括(a)將DNA導(dǎo)入第一細(xì)菌宿主細(xì)胞，所述細(xì)胞包含編碼DNA曱基轉(zhuǎn)移酶的多核苷酸，以將DNA曱基化；其中編碼DNA曱基轉(zhuǎn)移酶的多核苷酸選自下組(i)多核苷酸，其編碼包含與SEQIDNO:2的氨基酸1至381具有至少60%序列同一性的氨基酸序列的多肽；(ii)多核苷酸，其包含與SEQIDNO:1的核苷酸1至1143具有至少60%序列同一性的核普酸序列；(iii)多核苷酸，其在至少中嚴(yán)緊條件下可與SEQIDNO:1的核芬酸1至1143或其全長互補^i雜交；和(iv)多核香酸，其編碼包含取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQIDNO:2的氨基酸1至381的變體；和其中DNA曱基轉(zhuǎn)移酶與SEQIDNO:2的氨基酸1至381的DNA曱基轉(zhuǎn)移酶具有相同的特異性(specificity)。(b)將來自第一細(xì)菌宿主細(xì)胞的曱基化DNA轉(zhuǎn)移入第二細(xì)菌宿主細(xì)胞；其中第二細(xì)菌宿主細(xì)胞包含能降解DNA但不能降解曱基化DNA的限制性內(nèi)切核酸酶；和(c)分離包含曱基化DNA的第二細(xì)菌宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化體。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生細(xì)菌轉(zhuǎn)化體的方法，其包括(a)用DNA曱基轉(zhuǎn)移酶將DNA體外曱基化，以產(chǎn)生曱基化DNA;其中DNA曱基轉(zhuǎn)移酶選自下組(i)多肽，其包含與SEQIDNO:2的氨基酸1至381具有至少60%序列同一性的氨基酸序列；(ii)多肽，其由包含與SEQIDNO:1的核苷酸1至1143具有至少60%序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸編碼；(iii)多肽，其由在至少中嚴(yán)緊條件下與SEQIDNO:1的核芬酸1至1143或其全長互補鏈雜交的多核苷酸編碼；和(iv)變體，其包含取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQIDNO:2的氨基酸1至381;和其中DNA曱基轉(zhuǎn)移酶與SEQIDNO:2的氨基酸1至381的DNA曱基轉(zhuǎn)移酶有相同的特異性。(b)將曱基化DNA導(dǎo)入細(xì)菌宿主細(xì)胞，其中細(xì)菌宿主細(xì)胞包含能降解DNA但不能降解曱基化DNA的限制性內(nèi)切核酸酶；和(c)分離包含曱基化DNA的細(xì)菌宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化體。說本發(fā)明還涉及產(chǎn)生細(xì)菌轉(zhuǎn)化體的方法，其包括(a)將DNA導(dǎo)入包含編碼限制性內(nèi)切核酸酶的多核香酸的細(xì)菌宿主細(xì)胞中，所述多核苷酸是失活的(inactivated);其中編碼限制性內(nèi)切核酸酶的多核香酸選自下組(i)多核香酸，其編碼包含與SEQIDNO:4的氨基酸1至337具有至少60%序列同一性的氨基齡列的多肽；(ii)多核苷酸，其包含與SEQIDNO:3的核苷酸1至1011具有至少60%序列同一性的核苷酸序列；(iii)多核苷酸，其在至少中嚴(yán)緊條件下與SEQIDNO:3的核苷酸1至1011或其全長互補^t連雜交；和(iv)多核苷酸，其編碼包含取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQIDNO:4的氨基酸1至337的變體。其中限制性內(nèi)切核酸酶與SEQIDNO:4的氨基酸1至337的限制性內(nèi)切核酸酶有相同的特異性；和其中編碼限制性內(nèi)切核酸酶的多肽的失活防止導(dǎo)入的DNA,皮限制性內(nèi)切核酸酶消化，且無需在將DNA導(dǎo)入細(xì)菌宿主細(xì)胞前用DNA曱基轉(zhuǎn)移酶將DNA曱基化；和(b)分離包含DNA的細(xì)菌宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化體。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生具有生物活性的多肽的方法，其包括(a)在有益于產(chǎn)生該多肽的條件下培養(yǎng)包含導(dǎo)入的DNA的細(xì)菌宿主細(xì)胞，其中在將導(dǎo)入細(xì)菌宿主細(xì)胞之前，通過選自下組的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶將DNA曱基化(i)多肽，其包含與SEQIDNO:2的氨基酸1至381具有至少60%序列同一性的氨基酸序列；(H)多肽'其由包含與SEQIDNO:1的核苷酸1至1143具有至少60%序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸編碼；(iii)多肽，其由在至少中嚴(yán)緊條件下與SEQIDNO:1的核苷酸1至1143或其全長互補鏈雜交的多核苷酸編碼；和(iv)變體，其包含取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQIDNO:2的氨基酸1至381;其中DNA曱基轉(zhuǎn)移酶與SEQIDNO:2的氨基酸1至381的DNA曱基轉(zhuǎn)移酶具有相同的特異性；和其中曱基化防止導(dǎo)入的DNA被細(xì)菌宿主細(xì)胞的限制性內(nèi)切核酸酶消化；和(b)回收所述具有生物活性的多肽。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生具有生物活性的多肽的方法，其包括(a)在有益于產(chǎn)生該多肽的條件下培養(yǎng)包含導(dǎo)入的DNA的細(xì)菌宿主細(xì)胞，所述DNA編碼所述具有生物活性的多肽或與所述多肽表達(dá)有關(guān)；其中細(xì)菌宿主細(xì)胞包含編碼限制性內(nèi)切核酸酶的多核香酸，所述多核香酸是失活的；其中編碼限制性內(nèi)切核酸酶的多核普酸選自下組(i)多核香酸，其編碼包含與SEQIDNO:4的氨基酸1至337具有至少60°/。序列同一性的氨基*列的多肽；(ii)多核苷酸，其包含與SEQIDNO:3的核普酸1至1011具有至少60%序列同一性的核苷酸序列；(iii)多核苷酸，其在至少中嚴(yán)緊條件下與SEQIDNO:3的核苷酸1至1011或其全長互補鏈雜交；和(iv)多核苷酸，其編碼包含取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQIDNO:4的氨基酸1至337的變體。其中限制性內(nèi)切核酸酶與SEQIDNO:4的氨基酸1至337的限制性內(nèi)切核酸酶有相同的特異性；和其中編碼限制性內(nèi)切核酸酶的多核苷酸的失活防止導(dǎo)入的DNA被限制性內(nèi)切核酸酶消化，且無需在將DNA導(dǎo)入細(xì)菌宿主細(xì)胞之前用DNA曱基轉(zhuǎn)移酶將DNA曱基化；和(b)回收所述具有生物活性的多肽。本發(fā)明還涉及上述細(xì)菌宿主細(xì)胞。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生親本細(xì)菌細(xì)胞的突變體的方法，其包括(a)向親本細(xì)菌細(xì)胞中導(dǎo)入包含核酸構(gòu)建體的DNA，以使親本細(xì)菌細(xì)胞中編碼多肽的基因失活，這產(chǎn)生與在相同條件下培養(yǎng)時的親本細(xì)胞相比產(chǎn)生較少的所述多肽的突變體細(xì)胞；其中細(xì)菌宿主細(xì)胞包含編碼限制性內(nèi)切核酸酶的多核苷酸，所述多核苷酸是失活的；其中編碼限制性內(nèi)切核酸酶的多核苷酸選自下組(i)多核苷酸，其編碼包含與SEQIDNO:4的氨基酸1至337具有至少60%序列同一性的氨基Sl/f列的多肽；(ii)多核苦酸，其包含與SEQIDNO:3的核苷酸1至1011具有至少60%序列同一性的核苷酸序列；(iii)多核苷酸，其在至少中嚴(yán)緊條件下與SEQIDNO:3的核苷酸1至1011或其全長互補鏈雜交；和(iv)多核苷酸，其編碼包含取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQIDNO:4的氨基酸1至337的變體。其中限制性內(nèi)切核酸酶與SEQIDNO:4的氨基酸1至337的限制性內(nèi)切核酸酶有相同的特異性；和其中編碼限制性內(nèi)切核酸酶的多核苷酸的失活防止導(dǎo)入的DNA被限制性內(nèi)切核酸酶消化，且無需在將DNA導(dǎo)入親本細(xì)菌細(xì)胞之前用DNA曱基轉(zhuǎn)移酶將DNA曱基化；和(b)分離突變體細(xì)胞。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生親本細(xì)菌細(xì)胞的突變體的方法，其包括(a)向親本細(xì)菌細(xì)胞中導(dǎo)入包含核酸構(gòu)建體的DNA，以使親本細(xì)菌細(xì)胞中編碼所述多肽的基因失活，這產(chǎn)生與在相同條件下培養(yǎng)時的親本細(xì)胞相比產(chǎn)生較少的所述多肽的突變體細(xì)胞；其中在導(dǎo)入細(xì)菌宿主細(xì)胞之前，用選自下組的DNA曱基轉(zhuǎn)移酶將DNA曱基化(i)多肽，其包含與SEQIDNO:2的氨基酸1至381具有至少60%序列同一性的氨基酸序列；(ii)多肽，其由包含與SEQIDNO:1的核苷酸l至1143具有至少60。/。序列同一性的核苷Sl序列的多核苷酸編碼；(iii)多肽，其由在至少中嚴(yán)緊條件下與SEQIDNO:1的核苷酸1至1M3或其全長互補鏈雜交的多核苷酸編碼；和(iv)變體，其包含取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQIDNO:2的氨基酸1至381。其中DNA曱基轉(zhuǎn)移酶與SEQIDNO:2的氨基S臾1至381的DNA曱基轉(zhuǎn)移酶有相同的特異性；和其中曱基化防止導(dǎo)入的DNA被親本細(xì)菌細(xì)胞的限制性內(nèi)切核酸酶消化；和(b)分離突變體細(xì)胞。附圖簡述圖1A和IB顯示地衣芽孢桿菌M.B1U904IIDNA曱基轉(zhuǎn)移酶的基因組DNA序列和推導(dǎo)的氨基酸序列(分別為SEQIDNO:1和2)。圖2顯示地衣芽孢桿菌Blil卯411限制性內(nèi)切核酸酶的基因組DNA序列和推導(dǎo)的氨基酸序列(分別為SEQIDNO:3和4)。圖3顯示地衣芽孢桿菌Blil90411限制-修飾系統(tǒng)的基因組DNA序列(SEQIDNO:5)，其包含編碼Blil卯4II限制性內(nèi)切核酸酶和M.Blil904IIDNA曱基轉(zhuǎn)移酶的基因。Blil904H限制性內(nèi)切核酸酶編碼區(qū)的反向互補體(reversecomplement)用雙下劃線表示，而M.Blil90411DNA曱基轉(zhuǎn)移酶編碼區(qū)的反向互補體用單下劃線表示。圖4顯示pMDT138的限制圖譜。圖5顯示pKK223-3的限制圖譜。圖6顯示pNBT51的限制圖語。圖7顯示pNBT52的限制圖鐠。圖8顯示pNBT53的限制圖譜。圖9顯示pNBT54的限制圖譜。圖10顯示pNBT35的限制圖譜。圖11顯示pNBT30的限制圖譜。圖12顯示pNBT31的限制圖譜。圖13顯示pNBT36的限制圖譜。圖14顯示pMDT100的限制圖i普。圖15顯示pMDT156的限制圖譜。圖16顯示pMDT134的限制圖語。圖17顯示pMDT131的限制圖譜。圖18顯示pMDT139的限制圖譜。定義MJBlil90411DNA甲基轉(zhuǎn)移酶術(shù)語"M.B1U904IIDNA曱基轉(zhuǎn)移酶"在本文中定義為DNA(月包嘧咬-5)-曱基轉(zhuǎn)移酶(DNA(cytosine-5)-methyltransferase)(E.C.2丄1.37)，其催化曱基從S-腺苷-L-蛋氨酸轉(zhuǎn)移至序列GCNGC中的DNA上，得到S-腺苷-L-高半胱氨酸和包含5-曱基胞嘧啶的DNA。就本發(fā)明而言，根據(jù)Pfeifer等，1983,J5Zoc/n'm.^cta740:323-30所述的步驟測定DNA曱基轉(zhuǎn)移酶活性。一個單位的DNA曱基轉(zhuǎn)移酶活性是在20pl的總反應(yīng)體積中在1小時內(nèi)針對相應(yīng)限制性內(nèi)切核酸酶的切割保護1昭XDNA所需的量。本發(fā)明的DNA曱基轉(zhuǎn)移酶具有下述多肽的DNA曱基轉(zhuǎn)移酶活性的至少20%,優(yōu)選至少40%,更優(yōu)選至少50%,更優(yōu)選至少60%,更優(yōu)選至少70%,更優(yōu)選至少80%,甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%,和甚至最優(yōu)選至少100%,所述多肽包含如下或由如下組成如SEQIDNO:2的氨基酸1至381所示的氨基酸序列。Blil904II限制性內(nèi)切核酸酶術(shù)語"Blil90411限制性內(nèi)切核酸酶"在本文中定義為II型限制性內(nèi)切核酸酶，其催化DNA的位點特異性內(nèi)溶核切割(endonucleolyticcleavage),以得到特定的雙鏈DNA片段(EC3.1.21.4)。就本發(fā)明而言，根據(jù)已建立的用于II型限制性內(nèi)切核酸酶的步驟(例如，Jeltsch和Pingoud，2001，MeAoAMo/.A'o/.160:287-308)測定Blil90411限制性內(nèi)切核酸酶活性。根據(jù)定義，一個單位的限制性內(nèi)切核酸酶活性將在37"C在60分鐘內(nèi)完全消化50(il反應(yīng)液中的一|堪底物DNA。本發(fā)明的限制性內(nèi)切核酸酶具有下述多肽的限制性內(nèi)切核酸酶活性的至少20%,優(yōu)選至少40%,更優(yōu)選至少50%,更優(yōu)選至少60%,更優(yōu)選至少70%,更優(yōu)選至少80%，甚至更優(yōu)選至少90%,最優(yōu)選至少95%,和甚至最優(yōu)選至少100%，所述多肽包含如下或由如下組成如SEQIDNO:4的氨基酸1至337所示的氨基Si序列。限制j務(wù)飾系統(tǒng)術(shù)語"限制-修飾系統(tǒng)"在本文中定義為限制性內(nèi)切核酸酶，保護DNA免受限制性內(nèi)切核酸酶切割的相應(yīng)的DNA曱基轉(zhuǎn)移酶，和編碼這兩個酶的基因。分離的多肽術(shù)語"分離的多肽"用于本文中指由其來源分離的多肽。在優(yōu)選的方面，所述多肽為至少1°/。純，至少5。/。純，更優(yōu)選至少10%，更優(yōu)選至少20%純，更優(yōu)選至少40%純，更優(yōu)選至少60%純，甚至更優(yōu)選至少80%純，和最優(yōu)選至少90°/。純的，如通過SDS-PAGE測定的?；旧霞兊亩嚯男g(shù)語"基本上純的多肽，，在本文表示多肽制備物，所述多肽制備物按重量計含有至多10%,優(yōu)選至多8%,更優(yōu)選至多6%，更優(yōu)選至多5%,更優(yōu)選至多4%,更優(yōu)選至多3%，甚至更優(yōu)選至多2%,最優(yōu)選至多1%,并且甚至最優(yōu)選至多0.5。/。的與其天然或重組結(jié)合的(assodated)的其它多肽材料。因此，優(yōu)選所述基本上純的多肽是按存在于制備物中的全部多肽材料的重量計至少92%純，優(yōu)選至少94%純，更優(yōu)選至少95°/。純，更優(yōu)選至少96%純，更優(yōu)選至少96%純，更優(yōu)選至少97%純，更優(yōu)選至少98%純，甚至更優(yōu)選至少99%純，最優(yōu)選至少99.5%純，并且甚至最優(yōu)選100%純的。本發(fā)明的多肽優(yōu)選是基本上純的形式，即，所述多肽制備物基本上(essentially)不含與其天然或重組結(jié)合的其它多肽材料。這能夠通過以下方式實現(xiàn)，例如，通過公知的重組方法或通過經(jīng)典純化方法來制備多肽。同一性參數(shù)"同一性"描述兩個氨基酸序列之間或兩個核苷酸序列之間的相關(guān)性。就本發(fā)明而言，兩個氨基酸序列之間的序列同一性程度使用Needleman-^Vunsch算法(Needleman和Wunsch，1970,^Mo/.所o/.48:443-453)來測定，如在EMBOSS軟件包(EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Rice等，2000，7Ve"A/"Gewe"cs16:276-277)的Needle程序中所執(zhí)行的，優(yōu)選使用3.0.0版或以后的版本。使用的可選參數(shù)為缺口開放罰分(gapopenpenalty)10,缺口延伸罰分(gapextensionpenalty)0.5,和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版)取代矩陣。使用Needle標(biāo)記為"最長同一性"的輸出結(jié)果(使用-nobrief選項獲得)作為百分比同一性，并計算如下(相同殘基xl00)/(比對長度-比對中缺口的總數(shù))就本發(fā)明而言，兩個脫氧核苷酸序列之間的序列同一'li程度使用Needleman-^Vunsch算法(Needleman和Wunsch,1970，見上文)測定，如EMBOSS軟件包(EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Rice等，2000,見上文)的Needle程序所執(zhí)行的，優(yōu)選使用3.0.0版或以后的版本。使用的可選參數(shù)為缺口開放罰分10，缺口延伸罰分0.5，和EDNAFULL(NCBINUC4.4的EMBOSS版)取代矩陣。使用Needle標(biāo)記為"最長同一性，，的輸出結(jié)果(使用-nobrief選項獲得)作為百分比同一性，并計算如下(相同脫氧核糖核苷酸xl00)/(比對長度-比對中缺口的總數(shù))多肽片段術(shù)語"多肽片段"在本文中定義為從SEQIDNO:2或SEQIDNO:4的氨基和/或羧基末端缺失一個或多個氨基酸的多肽，或其同源序列；其中所述片段分別具有DNA甲基轉(zhuǎn)移酶或限制性內(nèi)切核酸酶活性。在優(yōu)選的方面，SEQIDNO:2或其同源物的片段含有至少320個氨基酸殘基，更優(yōu)選至少340個氨基酸殘基，并且最優(yōu)選至少360個氨基酸殘基。在另一個優(yōu)選的方面，SEQIDNO:4或其同源物的片段含有至少290個氨基酸殘基，更優(yōu)選至少305個氨基酸殘基，并且最優(yōu)選至少320個氨基酸殘基。亞序列術(shù)語"亞序列(subsequence)"在本文中定義為從SEQIDNO:1或SEQIDNO:3的5，和/或3，端缺失一個或多個核苷酸的核苷酸序列，或其同源序列；其中所述亞序列分別編碼具有DNA曱基轉(zhuǎn)移酶活性或限制性內(nèi)切核酸酶的多肽片段。在優(yōu)選的方面，SEQIDNO:1或其同源物的亞序列含有至少960個核芬酸，更優(yōu)選至少1020個核芬酸，并且最優(yōu)選至少1080個核苷酸。在另一個優(yōu)選的方面，SEQIDNO:3或其同源物的亞序列含有至少870個核苷酸，更優(yōu)選至少915個核苷酸，并且最優(yōu)選至少960個核普酸。等位變體(allelicvariant):術(shù)語"等位變體"在本文中表示占據(jù)相同染色體基因座的基因的任何兩種或兩種以上可選形式。等位變異通過突變天然地發(fā)生，并且可導(dǎo)致種群內(nèi)的多態(tài)性?；蛲蛔兛梢允浅聊?在編碼的多肽中無變化)或可以編碼具有改變的氨基^列的多肽。多肽的等位變體是由基因的等位變體編碼的多肽。分離的多核苷酸術(shù)語"分離的多核苷酸"用于本文中指從來源分離的多核苷酸。在優(yōu)選的方面，所述多核苷酸為至少1%純，優(yōu)選至少5%純，更優(yōu)選至少10%純，更優(yōu)選至少20%純，更優(yōu)選至少40°/。純，更優(yōu)選至少60%純，甚至更優(yōu)選至少80%純，并且最優(yōu)選至少90%純的，如通過瓊脂糖電泳測定的?；旧霞兊亩嗪塑账嵝g(shù)語"基本上純的多核苷酸"用于本文指不含其它外來的或不期望的核苦酸的多核苷酸制備物，并且所述多核苷酸制備物處于適合于在遺傳工程的蛋白質(zhì)生產(chǎn)體系中使用的形式。因此，基本上純的多核苷酸按重量計含有至多10%,優(yōu)選至多8%，更優(yōu)選至多6%,更優(yōu)選至多5%,更優(yōu)選至多4%，更優(yōu)選至多3%,甚至更優(yōu)選至多2%，最優(yōu)選至多1%,并且甚至最優(yōu)選至多0.5%的與其天然或重組結(jié)合的其它多核苷酸材料。然而，基本上純的多核苦酸可以包括天然存在的5'和3，非翻譯區(qū)，例如啟動子和終止子。優(yōu)選基本上純的多核苷酸是按重量計至少90%純，優(yōu)選至少92%純，更優(yōu)選至少94%純，更優(yōu)選至少95%純，更優(yōu)選至少96%純，更優(yōu)選至少97%純，甚至更優(yōu)選至少98%純，最優(yōu)選至少99%，并且甚至最優(yōu)選至少99.5%純的。本發(fā)明所述多核苷酸優(yōu)選為基本上純的形式，即，所述多核苷酸制備物基本上不含與其天然或重組結(jié)合的其它多核苷酸材料。所述多核苷酸可以是基因組、cDNA、RNA、半合成、合成來源的，或它們的任何組合。核酸構(gòu)建體術(shù)語"核酸構(gòu)建體"用于本文指單鏈或雙鏈的核酸分子，其分離自天然存在的基因，或?qū)⑵湫揎椧员緛聿淮嬖谟?nototherwiseexist)自然界中的方式含有核酸的區(qū)段。當(dāng)所述核酸構(gòu)建體含有表達(dá)本發(fā)明的編碼序列所需的調(diào)控序列時，術(shù)語核酸構(gòu)建體與術(shù)語"表達(dá)盒"同義。調(diào)控序歹'J(controls叫uence):術(shù)i吾"調(diào)4空序列"在本文定義為包4舌表達(dá)編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸所必需的所有組分。各種調(diào)控序列對于編碼所述多肽的核苷酸序列可以是天然的或外源的，或各種調(diào)控序列對于彼此可以是天然的或外源的。這些調(diào)控序列包括但不限于前導(dǎo)序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列和轉(zhuǎn)錄終止子。最少的情況，調(diào)控序列包括啟動子和轉(zhuǎn)錄和翻譯的終止信號。調(diào)控序列可具有用于導(dǎo)入特異性限制位點的接頭，所述特異性限制位點促進調(diào)控序列與編碼多肽的核普酸序列編碼區(qū)的連接?？刹僮鞯剡B接術(shù)語"可操作地連接"在本文表示這樣的構(gòu)型，其中將調(diào)控序列置于相對于多核苷酸序列的編碼序列的合適位置，使得調(diào)控序列指導(dǎo)多肽的編碼序列的表達(dá)。編碼序列當(dāng)用于本文時術(shù)語"編碼序列"的意思是直接指定其蛋白產(chǎn)物的氨基酸序列的核苷酸序列。編碼序列的邊界通常由開讀框確定，所述開讀框通常以ATG起始密碼子或可供選擇的起始密碼子如GTG和TTG開始，并且以終止密碼子如TAA、TAG和TGA結(jié)束。編碼序列可以是DNA、cDNA、合成的或重組的核苷酸序列。表達(dá)術(shù)語"表達(dá)"包括涉及多肽產(chǎn)生的任何步驟，其包括但不限于轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。表達(dá)載體術(shù)語"表達(dá)載體，，在本文定義為線性的或環(huán)狀的DNA分子，其包含編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸與提供用于其表達(dá)的額外核苷酸可操作地連接。宿主細(xì)月包如本文中所使用的術(shù)語"宿主細(xì)胞"包括任何細(xì)胞類型，所述細(xì)胞類型對于使用核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合(conjugation)等是易感的(susceptible)。導(dǎo)入術(shù)語"導(dǎo)入，，及其變化形式在本文定義為將DNA轉(zhuǎn)入細(xì)菌細(xì)胞?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域任何已知方法完成向細(xì)菌細(xì)胞中導(dǎo)入DNA，所述方法包括，但不限于，轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合等。轉(zhuǎn)化術(shù)語"轉(zhuǎn)化，，在本文定義為將純化的DNA導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞，使DNA作為染色體整合體或作為自復(fù)制的染色體外載體保留。術(shù)語"轉(zhuǎn)化"通常應(yīng)該理解為包括轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合等。轉(zhuǎn)染術(shù)語"轉(zhuǎn)染"在本文定義為用病毒核酸轉(zhuǎn)化細(xì)菌細(xì)胞。轉(zhuǎn)導(dǎo)術(shù)語"轉(zhuǎn)導(dǎo)"在本文定義為將來自第一細(xì)菌細(xì)胞的DNA包裝入病毒顆粒，并通過用病毒顆粒感染第二細(xì)胞，將細(xì)菌DNA轉(zhuǎn)入第二細(xì)菌細(xì)胞。接合術(shù)語"接合"在本文定義為通過細(xì)胞與細(xì)胞的接觸，將DNA直接從一個細(xì)菌細(xì)胞轉(zhuǎn)移至另一個細(xì)菌細(xì)胞。轉(zhuǎn)化體術(shù)語"轉(zhuǎn)化體"在本文定義為通常涵蓋任何已經(jīng)向其中導(dǎo)入DNA的細(xì)菌宿主細(xì)胞。因此，術(shù)語"轉(zhuǎn)化體"包括轉(zhuǎn)染體、接合體等。供體細(xì)胞術(shù)語"供體細(xì)胞"在本文定義為通過任何方法導(dǎo)入另一個細(xì)胞的DNA的來源細(xì)胞。受體細(xì)胞術(shù)語"受體細(xì)月包"在本文定義為DNA導(dǎo)入的細(xì)胞。修飾術(shù)語"修飾"在本文的意思是，對由SEQIDNO:2的氨基酸l至381或SEQIDNO:4的氨基酸1至337組成的多肽或其同源序列的任何化學(xué)修飾，以及對編碼所述多肽的DNA的遺傳操作。所述修飾可以是一個或多個(幾個)氨基酸的取代、缺失和/或插入，以及一個或多個(幾個)氨基酸側(cè)鏈的置換。人工變體當(dāng)用在本文時，術(shù)語"人工變體，，的意思是具有限制性內(nèi)切核酸酶或DNA曱基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽，所述多肽分別由表達(dá)SEQIDNO:1的核芬酸1至1043或SEQIDNO:3的核苷酸1至1011或其同源序列的修飾的多核苷酸序列的生物體產(chǎn)生。所述修飾的多核苷酸序列通過人為干預(yù)(humanintervention),通過修飾SEQIDNO:1或SEQIDNO:3或其同源序列中公開的核苷酸序列來獲得。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及產(chǎn)生細(xì)菌轉(zhuǎn)化體的方法，其包括:(a)將DNA導(dǎo)入包含編碼DNA曱基轉(zhuǎn)移酶的多核苷酸的第一細(xì)菌宿主細(xì)胞，以將DNA曱基化；其中編碼DNA曱基轉(zhuǎn)移酶的多核苷酸選自下組(i)多核苷酸，其編碼包含與SEQIDNO:2的氨基酸1至381具有至少60%序列同一性的氨基酸序列的多肽；(ii)多核香酸，其包含與SEQIDNO:1的核苷酸1至1143具有至少60%序列同一性的核苷酸序列；(iii)多核苷酸，其在至少中嚴(yán)緊條件下與SEQIDNO:1的核苷酸1至1M3或其全長互補鏈雜交；和(iv)多核苷酸，其編碼包含取^C、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQIDNO:2的M酸1至381的變體；并且其中DNA曱基轉(zhuǎn)移酶與SEQIDNO:2的氨基酸1至381的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶具有相同的特異性；(b)將曱基化的DNA從第一細(xì)菌宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)移進第二細(xì)菌宿主細(xì)胞；其中第二細(xì)菌宿主細(xì)胞包含能降解DNA但不能降解甲基化DNA的限制性內(nèi)切核酸酶；和(c)分離包含甲基化DNA的第二細(xì)菌宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化體。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生細(xì)菌轉(zhuǎn)化體的方法，其包括(a)在體外用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶將DNA曱基化，以產(chǎn)生曱基化的DNA;其中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶選自下組(i)多肽，其包含與SEQIDNO:2的氣基酸1至381具有至少60%序列同一性的氨基酸序列；(ii)多肽，其由包含與SEQIDNO:1的核苷酸1至1143具有至少60%序列同一性的核苷酸序列的多核芬酸編碼；(iii)多肽，其由在至少中嚴(yán)緊條件下與SEQIDNO:1的核苷酸1至1143或其全長互補鏈雜交的多核苷酸編碼；和(iv)變體，其包含取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQIDNO:2的氨基酸1至381;并且其中DNA曱基轉(zhuǎn)移酶與SEQIDNO:2的氨基酸1至381的DNA曱基轉(zhuǎn)移酶具有相同的特異性；(b)將曱基化的DNA導(dǎo)入細(xì)菌宿主細(xì)胞；其中細(xì)菌宿主細(xì)胞包含能降解DNA但不能降解曱基化DNA的限制性內(nèi)切核酸酶；和(c)分離包含曱基化DNA的細(xì)菌宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化體。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生細(xì)菌轉(zhuǎn)化體的方法，其包括(a)將DNA導(dǎo)入包含編碼限制性內(nèi)切核酸酶的多核苷酸的細(xì)菌宿主細(xì)胞，所述多核苷酸是失活的；其中編碼限制性內(nèi)切核酸酶的多核苷酸選自下組(i)多核苷酸，其編碼包含與SEQIDNO:4的氨基酸1至337具有至少60%序列同一性的氨基酸序列的多肽；(ii)多核苷酸，其包含與SEQIDNO:3的核苷酸1至1011具有至少60%序列同一性的核苷酸序列；(iii)多核苷酸，其在至少中嚴(yán)緊條件下與SEQIDNO:3的核苷酸1至1011或其全長互補鏈雜交；和(iv)多核苷酸，其編碼包含取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQIDNO:4的氨基酸1至337的變體；其中限制性內(nèi)切核酸酶與SEQIDNO:4的氨基S臾1至337的限制性內(nèi)切核酸酶具有相同的特異性，并且其中編碼限制性內(nèi)切核酸酶的多核苷酸的失活防止導(dǎo)入的DNA被限制性內(nèi)切核酸酶消化，且無需在將DNA導(dǎo)入細(xì)菌宿主細(xì)胞之前用DNA曱基轉(zhuǎn)移酶將DNA曱基化，和(b)分離包含DNA的細(xì)菌宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化體。在本發(fā)明的方法中，將DNA導(dǎo)入細(xì)菌宿主細(xì)胞可以通過下述方式完成(l)將編碼細(xì)菌宿主細(xì)胞的限制性內(nèi)切核酸酶的多核苷酸失活，使導(dǎo)入的DNA不被限制性內(nèi)切核酸酶降解或(2)在導(dǎo)入細(xì)菌宿主細(xì)胞之前用DNA曱基轉(zhuǎn)移酶將DNA曱基化，使導(dǎo)入的甲基化DNA不被細(xì)菌宿主細(xì)胞的限制性內(nèi)切核酸酶降解。DNA曱基轉(zhuǎn)移酶或限制性內(nèi)切核酸酶對于細(xì)菌宿主細(xì)胞可以是天然的或外源的。在一個方面，可以在體外完成DNA的曱基化。例如，可以回收本發(fā)明的DNA曱基轉(zhuǎn)移酶并將其用于在S-腺苷-L-曱硫氨酸存在的情況下將DNA曱基化，得到S-腺苷-L-高半胱氨酸和含5-甲基胞嘧啶的DNA。在另一個方面，DNA的甲基化可以在體內(nèi)完成。例如，可通過下述方式完成DNA的曱基化從細(xì)菌宿主細(xì)胞(受體細(xì)胞)克隆編碼DNA曱基轉(zhuǎn)移酶的多核苷酸，并在另一個細(xì)菌細(xì)胞(供體細(xì)胞)中表達(dá)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶編碼序列，其中將DNA導(dǎo)入并曱基化，然后將曱基化DNA轉(zhuǎn)移或?qū)霃闹蟹蛛x出DNA甲基轉(zhuǎn)移酶編碼序列的細(xì)菌宿主細(xì)胞(受體細(xì)胞)。在另一個方面，編碼DNA曱基轉(zhuǎn)移酶的多核香酸可以獲得自不是受體細(xì)胞的另一種生物體。在又一個方面，供體宿主細(xì)胞可以已經(jīng)包含本發(fā)明編碼DNA曱基轉(zhuǎn)移酶的多核苷酸或其同源物。將曱基化DNA導(dǎo)入細(xì)菌宿主細(xì)胞可以通過下述方式完成由第一細(xì)菌細(xì)胞轉(zhuǎn)移入第二細(xì)菌細(xì)胞，即，通過接合，或者從第一細(xì)菌細(xì)胞分離曱基化DNA,然后將分離的曱基化DNA導(dǎo)入第二細(xì)菌細(xì)胞，例如，通過轉(zhuǎn)化。與常規(guī)方法相比，本發(fā)明的方法將獲得的轉(zhuǎn)化體數(shù)目增加至至少10倍，優(yōu)選至少100倍，更優(yōu)選至少1000倍，甚至更優(yōu)選至少10,000倍，并且最不用本發(fā)明的DNA曱基轉(zhuǎn)移酶將DNA曱基化。限制性內(nèi)切核酸酶基因和DNA曱基轉(zhuǎn)移酶基因及它們的酶在第一個方面，本發(fā)明涉及編碼具有DNA曱基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽的分離的多核苷酸，所述多肽包含下述氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:2的氨基酸1至381具有至少60%,優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%,更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%,更優(yōu)選至少85%,甚至更優(yōu)選至少90%,最優(yōu)選至少95%，并且甚至最優(yōu)選至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列同一性程度，所述多肽具有DNA曱基轉(zhuǎn)移酶活性(下文中的"同源多肽"或"同源物")。在優(yōu)選的方面，所述具有DNA曱基轉(zhuǎn)移酶活性的同源多肽包含氨基S銀列，所述氨基S銀列與SEQIDNO:2的氨基酸1至381相差十個氨基酸，優(yōu)選相差五個氨基酸，更優(yōu)選相差四個氨基酸，甚至更優(yōu)選相差三個氨基酸，最優(yōu)選相差兩個氨基酸，并且甚至最優(yōu)選相差一個氨基酸。本發(fā)明的分離的多核苷酸優(yōu)選編碼具有DNA曱基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽，所述多肽包含SEQIDNO:2的氨基酸序列或其等位變體；或其具有DNA曱基轉(zhuǎn)移酶活性的片段。在優(yōu)選的方面，多肽包含SEQIDNO:2的氨基酸序列。在另一個優(yōu)選的方面，多肽包含SEQIDNO:2的氨基酸l至381，或其等位變體；或其具有DNA曱基轉(zhuǎn)移酶活性的片段。在另一個優(yōu)選方面，多肽包含SEQIDNO:2的氨基酸l至381。在另一個優(yōu)選方面，多肽由SEQIDNO:2的氨基酸序列，或其等位變體；或其具有DNA曱基轉(zhuǎn)移酶活性的片段組成。在另一個優(yōu)選方面，多肽由SEQIDNO:2的氨基酸序列組成。在另一個優(yōu)選方面，多肽由SEQIDNO:2的氨基酸1至381，或其等位變體；或其具有DNA曱基轉(zhuǎn)移酶活性的片段組成。在另一個優(yōu)選方面，多肽由SEQIDNO:2的氨基酸1至381組成。本發(fā)明還涉及分離的多核苷酸，其包含編碼具有DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽的核苦酸序列。在優(yōu)選的方面，所述核香酸序列列于SEQIDNO:1中。在另一個更優(yōu)選的方面，核苷酸序列為包含于大腸桿菌NRRLB-41967中的質(zhì)粒pMDT138所包含的序列。在另一個優(yōu)選的方面，核苷酸序列是SEQIDNO:1的核苷酸1至1143。在另一個更優(yōu)選的方面，核苷酸序列是包含于大腸桿菌NRRLB-41967中的質(zhì)粒pMDT138所包含的SEQIDNO:1的核苷酸l至1143。本發(fā)明還包括編碼具有SEQIDNO:2的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，其由于遺傳密碼的簡并性而不同于SEQIDNO:1。本發(fā)明還涉及SEQIDNO:1的亞序列，其編碼具有限制性內(nèi)切核酸酶活性的SEQIDNO:2的片段。在另一個第一方面，本發(fā)明涉及編碼具有限制性內(nèi)切核酸酶活性的多肽的分離的多核苷酸，所述多肽包含下述氨基酸序列，所述氨基S臾序列與SEQIDNO:4的氨基酸1至337具有優(yōu)選至少60%,更優(yōu)選至少65%,更優(yōu)選至少70%,更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%,更優(yōu)選至少85%，甚至更優(yōu)選至少90%,最優(yōu)選至少95%，并且甚至最優(yōu)選至少96%、至少97%、至少98%或至少99°/0的序列同一性程度，所述多肽具有限制性內(nèi)切核酸酶活性(在下文中"同源多肽'，或"同源物")。在優(yōu)選的方面，所述具有限制性內(nèi)切核酸酶活性的同源多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:4的氨基酸1至337相差十個氨基酸，優(yōu)選相差五個氨基酸，更優(yōu)選相差四個氨基酸，甚至更優(yōu)選相差三個氨基酸，最優(yōu)選相差兩個氨基酸，并且甚至最優(yōu)選相差一個氨基酸。本發(fā)明的分離的多核苷酸優(yōu)選編碼包含SEQIDNO:4的氨基S殳序列的具有限制性內(nèi)切核酸酶活性的多肽或其等位變體；或其具有限制性內(nèi)切核酸酶活性的或其具有限制性內(nèi)切核酸酶活性的片段。在另一個優(yōu)選方面，多肽包含SEQIDNO:4的氨基酸l至337。在另一個優(yōu)選方面，多肽由SEQIDNO:4的氨基酸序列，或其等位變體；或其具有限制性內(nèi)切核酸酶活性的片段組成。在另一個優(yōu)選方面，多肽由SEQIDNO:4的氨基酸序列組成。在另一個優(yōu)選方面，多肽由SEQIDNO:4的氨基酸l至337,或其等位變體；或其具有限制性內(nèi)切核酸酶活性的片段組成。在另一個優(yōu)選方面，多肽由SEQIDNO:4的氨基酸1至337組成。本發(fā)明還涉及分離的多核苷酸，其包含編碼具有限制性內(nèi)切核酸酶活性的多肽的核芬S臾序列。在另一個優(yōu)選的方面，所述核苷酸序列列于SEQIDNO:3中。在另一個更優(yōu)選的方面，核苷酸序列為包含于大腸桿菌NRRLB-41968中的質(zhì)粒pMDT156所包含的序列。在另一個優(yōu)選的方面，核苷酸序列是SEQIDNO:3的核普酸l至1011。在另一個更優(yōu)選的方面，核苷酸序列是包含于大腸桿菌NRRLB-41968中的質(zhì)粒pMDT156所包含的SEQIDNO:3的核苷酸1至1011。本發(fā)明還包括編碼具有SEQIDNO:4的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，其由于遺傳密碼的簡并性而不同于SEQIDNO:3。本發(fā)明還涉及SEQIDNO:3的亞序列，其編碼具有限制性內(nèi)切核酸酶活性的SEQIDNO:4的片段。在第二方面，本發(fā)明涉及編碼具有DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽的分離的多核苷酸，所述多核苷酸在非常低嚴(yán)緊條件下，優(yōu)選低嚴(yán)緊條件下，更優(yōu)選中嚴(yán)緊條件下，更優(yōu)選中-高嚴(yán)緊條件下，甚至更優(yōu)選高嚴(yán)緊條件下，并且最優(yōu)選非常高嚴(yán)緊條件下，與以下序列雜交(i)SEQIDNO:1的核苷酸1至1143，(ii)(i)的亞序列，或(iii)(i)或(ii)的全長互補鏈(J.Sambrook，E.F.Fritsch，和T.Maniatis,1989，M/ecw/arC7函'"g'爿丄a6orato^yMa"wa/,第2版,ColdSpringHarbor,NewYork)。SEQIDNO:1的亞序列含有至少100個連續(xù)的核苷酸或優(yōu)選至少200個連續(xù)的核苷酸。此外，所述亞序列可編碼具有DNA曱基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽片段。在另一個第二方面，本發(fā)明涉及編碼具有限制性內(nèi)切核酸酶活性的多肽的分離的多核苷酸，所述多核苷酸在非常低嚴(yán)緊條件下，優(yōu)選低嚴(yán)緊條件下，更優(yōu)選中嚴(yán)緊條件下，更優(yōu)選中-高嚴(yán)緊條件下，甚至更優(yōu)選高嚴(yán)緊條件下，并且最優(yōu)選非常高嚴(yán)緊條件下，與以下序列雜交(i)SEQIDNO:3的核苷酸1至1011,(ii)(i)的亞序列，或(iii)(i)或(ii)的全長互補鏈(J.Sambrook,E.F.Fritsch，和T.Maniatis,1989,見上文)。SEQIDNO:3的亞序列含有至少100個連續(xù)的核苷酸或優(yōu)選至少200個連續(xù)的核苦酸。此外，所述亞序列可編碼具有限制性內(nèi)切核酸酶活性的多肽片段。SEQIDNO:1或SEQIDNO:3的核苦酸序列或其亞序列，以及SEQIDNO:2或SEQIDNO.'4的氨基酸序列或其片段，可用于設(shè)計核酸探針，以根據(jù)本領(lǐng)域內(nèi)公知的方法從不同屬和種的菌林鑒定和克隆編碼具有限制性內(nèi)切核酸酶活性或DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽的DNA。具體而言，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡方法，可將這些探針用于與感興趣的屬或種的基因組DNA雜交，以鑒定和分離其中相應(yīng)的基因。這些探針可明顯短于完整序列，但長度上應(yīng)為至少14，優(yōu)選至少25,更優(yōu)選至少35，并且最優(yōu)選至少70個核苷酸。然而，優(yōu)選所述核酸探針長度為至少100個核苷酸。例如，所述核酸探針長度上可以是至少200個核苷酸，優(yōu)選至少300個核苷酸，更優(yōu)選至少400個核苷酸，或最優(yōu)選至少500個核苷酸。甚至可以使用更長的探針，例如，長度是至少600個核苷酸，至少優(yōu)選至少700個核苦酸，更優(yōu)選至少800個核苷酸，或最優(yōu)選至少900個核苷酸的核酸探針。DNA和RNA探針二者均可使用。通常將探針標(biāo)記以探測相應(yīng)的基因(例如，用32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白(avidin)標(biāo)記)。這些探針包含于本發(fā)明中。因而，可從由這些其它生物體制備的基因組DNA文庫中篩選DNA,所述DNA與上述探針雜交并且編碼具有限制性內(nèi)切核酸酶或DNA曱基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽。可以通過瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳，或其它分離技術(shù)分離來自這些其它生物體的基因組DNA?？梢詫碜晕膸斓腄NA或分離的DNA了鑒定與SEQIDNO:l或SEQIDNO:3或其亞序列同源的克隆或DNA,將所述載體材料用在Sounthern印跡中。就本發(fā)明而言，雜交表示核苷S吏序列在非常低至非常高的嚴(yán)緊條件下與標(biāo)記的核酸探針雜交，所述核酸探針對應(yīng)于SEQIDNO:l或SEQIDNO:3所示的核苷酸序列、它的全長互補鏈或其亞序列。可使用X射線片(X-rayfilm)檢測在這些條件下與核酸探針雜交的分子。在優(yōu)選的方面，核酸探針是多核苷酸，其包含編碼SEQIDNO:2的多肽的核苷酸序列，或其亞序列。在另一個優(yōu)選方面，核酸探針是SEQIDNO:1或其全長互補鏈。在另一個優(yōu)選方面，核酸探針是SEQIDNO:1的成熟多肽方面，核酸探針是包含于大腸桿菌NRRLB-41967中的質(zhì)粒pMDT138所包含的多核香酸，其中所述其核芬酸序列編碼具有DNA曱基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽。在另一個優(yōu)選方面，核酸探針是包含于大腸桿菌NRRLB-41967中的質(zhì)粒pMDT138所包含的成熟多肽編碼區(qū)。在另一個優(yōu)選的方面，核酸#:針是多核苷酸，其包含編碼SEQIDNO:4的多肽的核香酸序列，或其亞序列。在另一個優(yōu)選方面，核酸探針是SEQIDNO:3或其全長互補鏈。在另一個優(yōu)選方面，核酸探針是SEQIDNO:3的成熟多肽編碼區(qū)。在另一個優(yōu)選方面，核酸探針是包含于大腸桿菌NRRLB-41968中的質(zhì)粒pMDT156所包含的多核苷酸，其中所述其核苷酸序列編碼具有限制性內(nèi)切核酸酶活性的多肽。在另一個優(yōu)選方面，核酸探針是包含于大腸桿菌NRRLB-41968中的質(zhì)粒pMDT156所包含的成熟多肽編碼區(qū)。對于長度至少100個核苷酸的長探針，將非常低至非常高的嚴(yán)緊條件定義為在42。C，在5XSSPE、0.3%SDS、200嗎/ml已剪切并且變性的鮭精DNA中，并且對于非常低和低嚴(yán)緊性為25%的曱酰胺、對于中和中-高嚴(yán)緊性為35%的曱酰胺、或?qū)τ诟吆头浅８邍?yán)緊性為50%的曱酰胺，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡法進行預(yù)雜交和雜交最佳12至24小時。對于長度為至少100個核苷酸的長探針，使用2XSSC、0.2。/。SDS優(yōu)選至少在45。C(非常低嚴(yán)緊性)，更優(yōu)選至少在50。C(低嚴(yán)緊性)，更優(yōu)選至少在55。C(中嚴(yán)緊性)，更優(yōu)選至少在60。C(中-高嚴(yán)緊性)，甚至更優(yōu)選至少在65。C(高嚴(yán)緊性)，并且最優(yōu)選至少在70。C(非常高嚴(yán)緊性)將載體材料最終洗滌三次，每次15分鐘。對于長度大約15個核苷酸至大約70個核苷酸的短探針，將嚴(yán)緊條件定義為在比才艮才居Bolton和McCarthy計算法(1962，Praceai/"gsAgA^do""/jcacfewy0/5We"ces48:1390)得出的Tm低大約5°C至大約10。C,在0.9MNaCl,0.09MTris-HClpH7.6,6mMEDTA,0.5%NP-40，1xDenhardt溶液，1mM焦碌酸鈉(sodiumpyrophosphate),1mM磷酸二氳鈉(sodiummonobasicphosphate),0.1mMATP和0.2mg每ml的酵母RNA中，才艮據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡步驟進行預(yù)雜交、雜交和雜交后洗滌最佳12至24小時。對于長度大約15個核苷酸至大約70個核苷酸的短探針，將所述載體材料在6xSSC加0.1%SDS中洗滌一次15分鐘，并用6xSSC在比計算的Tm低5。C至10。C的溫度下洗滌兩次，每次15分鐘。在第三個方面，本發(fā)明涉及編碼人工變體的分離的多核香酸，所述人工變體包含取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQIDNO:2或SEQIDNO:4或其同源序列；或其成熟多肽。優(yōu)選氨基酸改變對性質(zhì)是較不重要的(ofaminornature),即保守的氨基酸取代或插入，其不顯著影響蛋白質(zhì)的折疊和/或活性；小缺失，通常缺失1至大約30個氨基酸；小的氨基或羧基末端延伸，例如氨基末端曱硫氨酸殘基；多至大約20-25個殘基的小接頭肽；或通過改變凈電荷或其它功能來促進純化的小延伸(例如多組氨酸區(qū)(polyhistidinetract)、抗原表位(antigenicepitope)或結(jié)合域(bindingdomain))。保守取代的實例是在以下組之內(nèi)堿性氨基酸組(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸組(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸組(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸組(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳族氨基酸組(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸組(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和曱硫氨酸)。通常不改變比活性(specificactivity)的氨基酸取代是本領(lǐng)域已知的，并且由例^口H.Neurath,口R丄.Hill,1979，/w，TTze乃'otefra，AcademicPress,NewYork4笛述。最普遍發(fā)生的交換是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。除了20個基本氨基酸，非基本氨基酸(例如4-羥脯氨酸、6-7V-曱基賴氨酸、2-氨基異丁酸、異纈氨酸和a-甲基絲氨酸)可以取代野生型多肽的氨基酸殘基。有限數(shù)量的非保守氨基酸、不由遺傳密碼編碼的氨基酸和非天然氨基酸可以取代氨基酸殘基。"非天然氨基酸，，在蛋白質(zhì)合成后已經(jīng)過修飾，和/或在它們的側(cè)鏈具有不同于基本氨基酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)。非天然氨基酸能夠以化學(xué)方法合成，并且優(yōu)選是商業(yè)上可獲得的，包括六氫吡啶羧酸(pipecolicadd)、噻唑烷羧酸(thiazolidinecarboxylicacid)、脫氫脯氨酸、3-和4-曱基脯氨酸，和3,3-二曱基脯氨酸。如，氨基酸改變可改進多肽的熱穩(wěn)定性，改變底物特異性，改變最適pH等。能夠根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法，例如定位誘變或丙氨酸分區(qū)誘變法(Cunningham和Wells,1989,&/e"ce244:1081-1085)來鑒定親本多肽中的必需氨基酸。在后一技術(shù)中，將單一丙氨酸突變導(dǎo)入到分子中的每個殘基，并且測試所得突性)以鑒定對于所述分子的活性關(guān)鍵的氨基酸殘基。同樣參見Hilton等，1996，J!Ao/.Ozem.271:4699-4708。酶的活性部位或其它的生物相互作用也能夠通過結(jié)構(gòu)的物理分析而測定，如通過以下這些技術(shù)如核i茲共振、晶體學(xué)、電子衍射或光親和標(biāo)記，連同推定的接觸位點氨基酸的突變來測定。參見例如deVos等，1992,5We"ce255:306-312;Smith等，1992,JMo/.說o/.224:899-904;Wlodaver等，1992,F五5S309:59-64。必需氨基酸的身份(identity)也能夠從與多肽的同一性分析來推斷，所述多肽與根據(jù)本發(fā)明的多肽相關(guān)。能夠使用已知的誘變、重組和/或改組(shuffling)方法，然后是有關(guān)的篩選方法，例如那些由Reidhaar-Olson和Sauer，1988,5We"ce241:53-57;Bowie和Sauer，1989,Prac.A^/,^cadSc/.86:2152-2156;WO95/17413;或WO95/22625公開的那些方法來進行并測試單個或多個氨基酸取代、缺失和/或插入。能夠使用的其它方法包括易錯PCR、噬菌體展示(例如，Lowman等，1991,歷oc/zem.30:10832-10837;美國專利號5,223,409;WO92/06204)和區(qū)域定向的誘變(Derbyshire等，1986，46:145;Ner等，1988，DA^47:127)。誘變/改組方法能夠與高通量、自動化的篩選方法組合以檢測由宿主細(xì)胞表達(dá)的克隆的、誘變的多肽的活性(Ness等，1999,胸匿腸fec/z"o/ogy17:893-896)。能夠從宿主細(xì)胞回收編碼活性多肽的誘變的DNA分子，并且使用本領(lǐng)域內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)方法快速測序。這些方法允許快速確定感興趣的多肽中單個氨基酸殘基的重要性，并且能夠應(yīng)用于未知結(jié)構(gòu)的多肽。SEQIDNO:2的氨基酸1至381的氨基酸取代、缺失和/或插入的總數(shù)是10,優(yōu)選9，更優(yōu)選8，更優(yōu)選7，更優(yōu)選至多6，更優(yōu)選5，更優(yōu)選4，甚至更優(yōu)選3，最優(yōu)選2，并且甚至最優(yōu)選l。SEQIDNO:4的氨基酸1至337的氨基酸取代、缺失和/或插入的總數(shù)是10,優(yōu)選9,更優(yōu)選8，更優(yōu)選7，更優(yōu)選至多6,更優(yōu)選5，更優(yōu)選4，甚至更優(yōu)選3，最優(yōu)選2，并且甚至最優(yōu)選l。本發(fā)明還涉及選自下組的分離的曱基轉(zhuǎn)移酶(a)多肽，其包含與SEQIDNO:2的氨基酸1至381具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%,更優(yōu)選至少70%,更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%,更優(yōu)選至少85%,甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，和甚至最優(yōu)選至少96%，至少97%，至少98%，或者至少99%序列同一性的氨基酸序列；(b)多肽，其由包含與SEQIDNO:1的核苷酸1至1143具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%,更優(yōu)選至少70%,更優(yōu)選至少75%,更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%,和甚至最優(yōu)選至少96%,至少97%,至少98%,或者至少99%序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸編碼；(c)多肽，其由在優(yōu)選至少中嚴(yán)緊條件下，更優(yōu)選至少中-高嚴(yán)緊條件下，和最優(yōu)選至少高嚴(yán)緊條件下，與SEQIDNO:l的核苷酸1至1143或其全長互補鏈雜交的多核苷酸編碼；和(d)變體，包含取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQIDNO:2的氨基酸1至381。本發(fā)明還涉及選自下組的分離的限制性內(nèi)切核酸酶(a)多肽，其包含與SEQIDNO:4的氨基酸1至337具有優(yōu)選至少60%,更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%,更優(yōu)選至少75%,更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%,和甚至最優(yōu)選至少96%，至少97%，至少98%,或者至少99%序列同一性的氨基酸序列；(b)多肽，其由包含與SEQIDNO:3的核苷酸1至1011具有優(yōu)選至少60%,更優(yōu)選至少65%,更優(yōu)選至少70%,更優(yōu)選至少75%,更優(yōu)選至少80%,更優(yōu)選至少85%，甚至更優(yōu)選至少90%,最優(yōu)選至少95%，和甚至最優(yōu)選至少96%，至少97%,至少98%,或者至少99%序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸編碼；(c)多肽，其由在優(yōu)選至少中嚴(yán)緊條件下，更優(yōu)選至少中-高嚴(yán)緊條件下，和最優(yōu)選至少高嚴(yán)緊條件下，與SEQIDNO:3的核苷酸1至1011或其全長互補鏈雜交的多核苷酸編碼；和(d)變體，包含取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQIDNO:4的氨基酸1至337。限制性內(nèi)切核酸酶基因的失活在本發(fā)明的方法中，可以通過將限制性內(nèi)切核酸酶編碼多肽失活而完成DNA向細(xì)菌宿主細(xì)胞的導(dǎo)入，所述多肽對于細(xì)菌宿主細(xì)胞是天然或外源的，從而導(dǎo)入的DNA不被限制性內(nèi)切核酸酶降解。多核苷酸可以是限制-修飾系統(tǒng)的組分?？梢允褂帽绢I(lǐng)域公知的方法，例如基因的插入、破壞、置換或缺失，完成細(xì)菌宿主細(xì)胞中本發(fā)明的限制性內(nèi)切核酸酶基因或其同源物的失活。待失活的基因部分可以是，例如，編碼區(qū)或表達(dá)編碼區(qū)所需的調(diào)節(jié)元件。這種調(diào)節(jié)或調(diào)控序列的實例可以是啟動子序列或其功能部分，即，足以影響核苷酸序列表達(dá)的部分。用于可能的修飾的其他調(diào)控序列包括，但不限于，前導(dǎo)序列、前肽序列、信號序列、轉(zhuǎn)錄終止子和轉(zhuǎn)錄激活子。通過基因缺失技術(shù)消除或減少基因的表達(dá)，可以實現(xiàn)將本發(fā)明的限制性內(nèi)切核酸酶基因的失活?；蛉笔Ъ夹g(shù)能部分或全部去除基因，從而消除其表達(dá)。在這樣的方法中，可以使用經(jīng)過構(gòu)建連續(xù)包含基因側(cè)翼的5，和3，區(qū)的質(zhì)粒，通過同源重組完成基因的缺失?？梢詫⑦B續(xù)的5'和3，區(qū)導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞，例如，在溫度敏感質(zhì)粒上，如pE194,其在許可的溫度與選擇性標(biāo)記結(jié)合以允許質(zhì)粒在細(xì)胞中建立。然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至不許可的溫度，以選擇質(zhì)粒整合入染色體在同源側(cè)翼區(qū)之一的細(xì)胞。通過選擇選擇性標(biāo)記而選擇質(zhì)粒的整合。源側(cè)翼區(qū)的重組事件。涂布細(xì)胞以獲得單菌落，檢查菌落中選擇性標(biāo)記的丟失(參見，例如，Perego,1993,于A丄.So畫shein,J.A.Hoch，和R.Losick編，5acz7/w^smZ/77/j(3"(i(9//ze/"GVaw-尸os/Z7.ve5acfen'a，第42章，AmericanSocietyofMicrobiology,Washington,D.C.)。也可通過在本發(fā)明的限制性內(nèi)切核酸酶基因或其轉(zhuǎn)錄或翻譯所必需的調(diào)控元件中導(dǎo)入、取代，或去除一個或多個核苷酸來完成所述基因的失活。例如，可以插入或去除核苷酸^v而導(dǎo)致終止密碼子的導(dǎo)入，起始密碼子的去除，或開放閱讀框的移碼(frame-shift)。可按照本領(lǐng)域已知的方法通過定位誘變或PCR產(chǎn)生的誘變來完成這種修飾或失活。參見，例如，Botstein和Shortle，19S5,Science229:1193-1201;Lo等，1984,PraceW"gsA/a"o加/爿cafife，0/5We"cas[/>SL481:2285-2289;Higuchi等，1988，iVwc/efcj".tfei&searc/z16:7351-7367;Shimada，1996，Me仇嵐艦57:157-165;Ho等，1989,G簡77:51-59;Horton等，1989，Ge恥77:61-68;及Sarkar和Sommer,1990，腸rec/2m々腿8:404-407。也可通過將本發(fā)明的限制性內(nèi)切核酸酶基因插入包含與該基因同源的核酸片段的整合型質(zhì)粒，產(chǎn)生同源區(qū)的復(fù)制序列并且在復(fù)制區(qū)之間并入載體DNA，從而通過基因破壞技術(shù)來完成所述基因的失活。如果插入載體將基因的基因破壞就能夠消除基因表達(dá)。破壞構(gòu)建體可以僅為伴有與基因同源的5，和3'區(qū)的選擇性標(biāo)記基因。選擇性標(biāo)記使得能夠鑒定包含破壞基因的轉(zhuǎn)化體。也可通過基因轉(zhuǎn)換(geneconversion)的方法，完成本發(fā)明的限制性內(nèi)切核酉吏酵的失活(參見，例J(口,Iglesias牙口Trautner,1983,A/o/ecw/arGWzeraZ(7e"e"cx189:73-76)。例如，在基因轉(zhuǎn)換方法中，將相應(yīng)于基因的核苷酸序列在體外誘變以產(chǎn)生缺陷性核普酸序列，隨后將其轉(zhuǎn)化入親本細(xì)菌細(xì)胞中以產(chǎn)生缺陷基因。通過同源重組，所述缺陷性核苷酸序列替代了所述基因。理想的是所述缺陷基因或基因片段還編碼標(biāo)記，其可用于選擇包含缺陷基因的轉(zhuǎn)化體。例如，可以將缺陷基因?qū)肱c選擇性標(biāo)記有關(guān)的非復(fù)制的或溫度敏感型質(zhì)粒。通過在不允許質(zhì)粒復(fù)制的條件下對標(biāo)記進行選擇而選擇質(zhì)粒的整合。通過檢查菌落中選擇性標(biāo)記的丟失和突變基因的獲得，來選擇導(dǎo)致基因替換的第二次重組事件(參見，例如，Perego,1993,見上文)。或者，缺陷性核酸序列可以包含基因的一個或多個核苷酸的插入、取代或缺失，如下所述。也可以使用與本發(fā)明限制性內(nèi)切核酸酶基因的核苷酸序列互補的核香酸序列通過確定的反義技術(shù)來完成所述基因的失活(Parish和Stoker,1997，F(xiàn)五MSAf/cro&o/ogy丄e"ers154:151-157)。更具體地，可通過導(dǎo)入與所述基因的核苦酸序列互補的核苷酸序列來減少或消除細(xì)菌細(xì)胞的基因表達(dá)，所述互補的核苦酸序列可以在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄并且能夠與細(xì)胞中產(chǎn)生的mRNA雜交。在允許所述互補反義核苦酸序列與mRNA雜交的條件下，由此減少或消除翻譯的蛋白質(zhì)的量。也可以通過RNA干擾技術(shù)完成失活(參見，例如，美國專利6,506,559)?？梢允褂帽绢I(lǐng)域公知的方法，通過隨機或特異性誘變，進一步完成本發(fā)明的限制性內(nèi)切核酸酶基因的失活，所述方法包括，但不限于，化學(xué)誘變(參見，例如，Hopwood,TTze/yo/油'o"M她她inMe/7zc^M/cra6〖o(jì)/。gy(J.R.Norris和D.W.Ribbons編)363-433頁，AcademicPress,NewYork,1970)和轉(zhuǎn)座(參見，例如，Youngman等，1983,Prac,iVa"Jcad5W.80:2305-2309)。可以通過向親本細(xì)胞施以誘變，并且選擇其中已將所述基因的表達(dá)減少或消除的突變體細(xì)胞來進行基因的修飾。誘變可為特異性的或隨機的，可以例如通過如下方式進行使用合適的物理或化學(xué)誘變劑，使用合適的寡核苷酸，或?qū)⑺鯠NA序列進行PCR產(chǎn)生的誘變。此外，可以通過使用這些誘變方法的任何組合來進行誘變。適合于本發(fā)明目的的物理或化學(xué)誘變劑的實例包括紫外線(UV)照射、羥胺、N-曱基-N'-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)、N-甲基-N，-亞硝基胍(NTG)、O-曱基羥胺、亞硝酸、乙基曱烷磺酸酯(ethylmethanesulphonate)(EMS)、亞硫酸氫鈉、甲酸和核苷酸類似物。當(dāng)使用這些試劑時，通常通過如下方式來進行所述誘變在合適條件下存在優(yōu)選的誘變劑時溫育^H秀變的親本細(xì)胞，并選擇顯示基因表達(dá)減少的或無基因表達(dá)的突變體細(xì)胞。在優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞中限制性內(nèi)切核酸酶的失活未用選擇性標(biāo)i己ii4亍才示i己?？赏ㄟ^在反-選擇(counter-selection)培養(yǎng)基中培育突變體，來去除選擇性標(biāo)記基因。其中選擇性標(biāo)記包含其5，和3，末端側(cè)翼的重復(fù)序列，所述重復(fù)序列將在對突變體細(xì)胞進行反-選擇時，通過同源重組促進選擇性標(biāo)記基因的出環(huán)(loopout)。通過向突變體細(xì)胞導(dǎo)入包含缺陷基因的5'和3，區(qū)但缺少選擇性標(biāo)記基因的核酸片段，然后在反-選擇培養(yǎng)基上選擇，從而通過同源重組去除選擇性標(biāo)記基因。通過同源重組，用缺少選擇性標(biāo)記基因的核酸片段替代包含選擇性標(biāo)記基因的缺陷基因。也可以使用本領(lǐng)域其他已知方法。核酸構(gòu)建體可以用許多方式操作編碼本發(fā)明目的多肽，例如具有生物活性的多肽，或DNA曱基轉(zhuǎn)移酶或限制性內(nèi)切核酸酶的多核苷酸以用于多核苷酸在合適的細(xì)菌宿主細(xì)胞中的表達(dá)，例如使目的DNA曱基化或用于產(chǎn)生和回收DNA曱基轉(zhuǎn)移酶，使其能用于體外曱基化。依賴于核酸構(gòu)建體或載體或細(xì)菌宿主細(xì)胞，在將多核苷酸的核苷酸序列插入核酸構(gòu)建體或載體之前對其進行操作可能是理想的或必需的。使用克隆方法修飾核苷Sl/f列的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。包含編碼目的多肽的多核香酸的核酸構(gòu)建體與一個或多個調(diào)控序列可操作地連接，所述調(diào)控序列在細(xì)菌宿主細(xì)胞中在與該調(diào)控序列相容的條件下指導(dǎo)編碼序列的表達(dá)。每個調(diào)控序列對于編碼目的多肽的核苷酸序列可以是天然或外源的。這樣的調(diào)控序列包括，但不限于，前導(dǎo)序列、啟動子、信號序列和轉(zhuǎn)錄終止子。最少的情況，調(diào)控序列包括啟動子和轉(zhuǎn)錄和翻譯的終止信號。調(diào)控序列可以提供有用于導(dǎo)入特異性限制位點的接頭，所述特異性限制位點促進調(diào)控序列與編碼多肽的核苷酸序列編碼區(qū)的連接。調(diào)控序列可以是合適的啟動子序列，其是由用于表達(dá)核苷酸序列的細(xì)菌宿主細(xì)胞識別的核苷酸序列。啟動子序列含有介導(dǎo)目的多肽表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。啟動子可以是在所選細(xì)菌宿主細(xì)胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的任何核苷酸序列，并可獲得自指導(dǎo)與細(xì)菌宿主細(xì)胞同源或異源的具有生物活性的胞外或胞內(nèi)多肽的合成的基因。用于指導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體在細(xì)菌細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的合適啟動子的實例是從下述獲得的啟動子大腸桿菌/ac操縱子、天藍(lán)色鏈霉菌(&^ptomj^Mcoe"co/or)瓊脂糖酶基因(&^4)、枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因CsacS)、地衣芽孢桿菌a-淀粉酶基因(am;;Z)、嗜熱脂肪芽孢桿菌產(chǎn)麥芽淀粉酶基因(am少M)、解淀粉芽孢桿菌a-淀粉酶基因(amy0、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因、枯草芽孢桿菌矽L4和;9必基因和原核(3-內(nèi)酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等，1978，/V0ceecf/"g5o/f/zeiVa"owa/乂ca(iemyo/Sci'ewcesC/5L475:3727-3731》以及toc啟動子(DeBoer等，1983,Pracee(iz'"gso/f/zeAto/owa/o/5We"cesf/5！^80:21-25)。另夕卜的啟動子在"Useflilproteinsfromrecombinantbacteria"于5He"f折c^meWca"，1980,242:74-94中；和J.Sambrook,E.F.Fritsch，和T.Maniatis,1989,Mo/ecw/arC7om'唯爿Z^orafc^Mawwa/,第2版,ColdSpringHarbor,NewYork中描述。調(diào)控序列也可以是合適的轉(zhuǎn)錄終止子序列，是由宿主細(xì)胞識別以終止轉(zhuǎn)錄的序列。所述終止子序列與編碼DNA曱基轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列的3，末端可操作地連接。在所選細(xì)菌宿主細(xì)胞中有功能的任何終止子都可用于本發(fā)明中。調(diào)控序列還可以是合適的前導(dǎo)序列，其是對于細(xì)菌細(xì)胞的翻譯重要的mRNA非翻if區(qū)。前導(dǎo)序列可操作地連接于指導(dǎo)具有生物活性的多肽合成的核苷酸序列的5，-末端。在所選細(xì)菌宿主細(xì)胞中有功能的任何前導(dǎo)序列都可用于本發(fā)明中。調(diào)控序列還可以是信號肽編碼區(qū)，其編碼與多肽的氨基末端相連的氨基酸序列，其可指導(dǎo)表達(dá)的多肽進入細(xì)胞的分泌途徑。信號肽編碼區(qū)對于所述多肽可為天然的或可從外部來源獲得。核苷酸序列的編碼序列的5'端可固有地包含信號肽編碼區(qū)，其與編碼分泌多肽的編碼區(qū)片段一起天然地連接在翻譯閱讀框中?？蛇x地，編碼序列5'端可含有信號肽編碼區(qū)，其對于所述編碼序列的部分來說是外源的且編碼分泌的多肽。外源信號肽編碼區(qū)在編碼序列不通常地含有信號肽編碼區(qū)時可能是必需的?；蛘?，相對于與編碼序列正常結(jié)合的天然信號肽編碼區(qū)，外源信號肽編碼區(qū)可以簡單地取代天然信號肽編碼區(qū)以獲得增強的多肽分泌。信號肽編碼去可以獲得自芽孢桿菌菌屬菌種的淀粉酶或蛋白酶基因。然而，指導(dǎo)表達(dá)的多肽進入所選細(xì)菌宿主細(xì)胞的分泌途徑的任何信號肽編碼區(qū)可用于本發(fā)明中。對于細(xì)菌細(xì)胞例如芽孢桿菌屬細(xì)胞有效的信號肽編碼區(qū)是從如下獲得的信號肽編碼區(qū)芽孢桿菌屬NCIB11837產(chǎn)麥芽糖淀粉酶基因、嗜熱脂肪芽孢31桿菌a-淀粉酶基因、地衣芽孢桿菌枯草蛋白酶(subtilisin)基因、地衣芽孢桿菌卩-內(nèi)酰胺酶基因、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶基因(w;^r，",5*,";Wl力和枯草芽孢桿菌p/x4基因。另外的信號肽由Simonen和Palva，1993，Af/cra&'o/og/ca/7ev/e將57:109-137描述。調(diào)控序列還可以是mRNA穩(wěn)定序列。術(shù)語"mRNA穩(wěn)定序列"在本文中定義為位于啟動子區(qū)下游和多核苦酸的編碼序列上游的序列，啟動子區(qū)與其可操作地連接，使由啟動子區(qū)合成的所有mRNA可以凈皮加工以產(chǎn)生mRNA轉(zhuǎn)錄子，其5，末端具有穩(wěn)定子序列。在mRNA轉(zhuǎn)錄子的5'末端存在這樣的穩(wěn)定子序列增加了它們的半衰期(Agaisse和Lereclus,1994，見上文，Hue等,1995,Jowma/o/BacfenWogF177:3465-3471)。mRNA加工/穩(wěn)定序列與細(xì)菌16S核糖體RNA的3，末端互補。在優(yōu)選的方面，mRNA加工/穩(wěn)定序列產(chǎn)生基本單一長度的轉(zhuǎn)錄子，其5，末端有穩(wěn)定序列。mRNA加工/穩(wěn)定序列優(yōu)選為與細(xì)菌16S核糖體RNA的3'末端互補的序列。參見美國專利6,255,076和5,955,310。對于細(xì)菌細(xì)胞有效的mRNA加工/穩(wěn)定序列是WO94/25612中公開的蘇云金芽孢桿菌co///Z4mRNA加工/穩(wěn)定序列，或其部分，所述序列保持mRNA加工/穩(wěn)定功能，或Hue等，1995,/o"r"a/q/^acfe〃'o/ogy177:3465-3471中公開的枯草芽孢桿菌SP82mRNA加工/穩(wěn)定序列，或其部分，所述序列保持mRNA加工/穩(wěn)定功能。然后可以使用本領(lǐng)域已知的方法或本文所述用于表達(dá)目的多肽的那些方法將核酸構(gòu)建體導(dǎo)入細(xì)菌宿主細(xì)胞。重組表達(dá)載體在本發(fā)明的方法中，可以使用重組表達(dá)載體來重組產(chǎn)生多肽，所述重組表達(dá)載體包含編碼目的多肽(例如，具有生物活性的多肽，或本發(fā)明的DNA曱基轉(zhuǎn)移酶或限制性內(nèi)切核酸酶)的多核苷酸，啟動子，和轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號。上述各種核酸和調(diào)控序列可以結(jié)合在一起以產(chǎn)生重組表達(dá)載體，所述載體可以包括一個或多個方便的限制位點以允許在這些位點插入或取代指導(dǎo)目的多肽合成的核苷酸序列?？蛇x地，可通過將包含所述序列的核苷酸序列或核酸構(gòu)建體插入合適的用于表達(dá)的載體中來表達(dá)核苷酸序列。在制備表達(dá)載體的過程中，將編碼序列置于載體中，使得該編碼序列與用于表達(dá)和可能的分泌的合適的調(diào)控序列可操作地連接。重組表達(dá)載體可以是任何載體，其能夠方便地進行重組DNA步驟，并且能夠產(chǎn)生核苷酸序列的表達(dá)。載體的選擇將通常依賴于載體與將導(dǎo)入該載體的細(xì)菌細(xì)胞的相容性。載體可以是線狀或閉合環(huán)狀質(zhì)粒。載體可以是自主復(fù)制載體，即，作為染色體外實體(entity)存在的載體，其復(fù)制獨立于染色體復(fù)制，例如，質(zhì)粒、染色體外元件、微型染色體(minichromosome)或人工染色體。載體可以含有任何用于確保自復(fù)制的手段(means)?；蛘撸d體可以是一種當(dāng)被導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞中時，整合到基因組中并且與整合了該載體的染色體一起復(fù)制的載體。載體系統(tǒng)可以是單獨的載體或質(zhì)?；騼蓚€或更多的載體或質(zhì)粒，其共同含有待導(dǎo)入芽孢桿菌屬細(xì)胞基因組的完整DNA(totalDNA)，或者轉(zhuǎn)座子(transposon)。當(dāng)導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞時，載體可以整合入細(xì)菌細(xì)胞基因組。為了整合入宿主細(xì)胞基因組，載體可依賴于編碼目的多肽的多核苷酸的序列或用于通過同源或非同源重組整合入基因組的任何其它載體元件?；蛘?，載體可以含有額外的核苷酸序列，用于指導(dǎo)通過同源重組整合入宿主細(xì)胞基因組染色體中的精確位置。為了增加在精確位置整合的可能性，整合元件應(yīng)該優(yōu)選含有足夠數(shù)目的核酸，如100至10,000堿基對，優(yōu)選400至10,000堿基對，并且最優(yōu)選800至10,000堿基對，其與相應(yīng)的目標(biāo)序列具有高度序列同一性以增強同源重組的概率。整合元件可以是任何序列，其與宿主細(xì)胞基因組中的目標(biāo)序列同源。此外，整合元件可以是非編碼或編碼的核苷酸序列。另一方面，可通過非同源重組將載體整合入宿主細(xì)胞基因組中。為了自主復(fù)制，載體可以進一步包含復(fù)制起點，其使載體能夠在所述的細(xì)菌細(xì)胞中自主地復(fù)制。細(xì)菌復(fù)制起點的實例是允許在大腸桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的復(fù)制起點，和允許在芽孢桿菌屬中復(fù)制的質(zhì)粒pUB110、pE194、pTA1060和pAMBl的復(fù)制起點。復(fù)制起點可以是具有突變使其在細(xì)菌細(xì)胞中的功能對溫度敏感的復(fù)制起點(參見,例如，Ehrlich，1978,尸raceW"g^o/壺Ato/o""/jca<3fem_yo/(SWe"c&75:1433-1436)。可以將多于一個拷貝的指導(dǎo)目的多肽合成的核苷酸序列導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞以增強核苷酸序列的表達(dá)。核苷酸序列的穩(wěn)定擴增可通過如下方式獲得使用本領(lǐng)域公知的方法將至少一個額外拷貝的序列整合入細(xì)菌細(xì)胞基因組并選擇轉(zhuǎn)載體優(yōu)選地含有一個或多個選^^性標(biāo)記，其允許簡單選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。選擇性標(biāo)記是基因，其產(chǎn)物提供殺生物劑抗性、對重金屬的抗性、對營養(yǎng)缺陷型的原養(yǎng)性(prototrophytoauxotrophs)等。細(xì)菌選擇性標(biāo)記的實例是來自枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的tfa/基因，或賦予抗生素抗性的標(biāo)記，所述抗生素抗性例如氨千青霉素、卡那霉素、紅霉素、氯霉素或四環(huán)素抗性。此外，可以通過共轉(zhuǎn)化完成選擇，例如，如WO91/09129中所述，其中選擇性標(biāo)記在單獨的載體上。用于連接上述元件以構(gòu)建重組表達(dá)載體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的(參見，例如，Sambrook等，1989,見上文)。將DNA導(dǎo)入芽孢桿菌屬細(xì)胞可，例如，通過如下實現(xiàn)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，Chang和Cohen,1979，iWo/ecw/flrGe"era/Ge"Wcs168:111-115)，<吏用感受態(tài)纟田月包(參見，例戈口，Young禾口Spizizen,1961,/oi/r"a/o/Bacten'o/ogy81:823-829或Dubnau禾口Davidoff-Abelson，1971，Jow/77a/。/i/o/ecw/ar56:209-221),電穿孑L(參見，侈寸^口，Shigekawa禾口Dower,1988，5/ofec/zm々we;6:742-75l)或接合(參見，例如，Koehler和Thome,1987,Jowma/o/5acten'o/o_gy169:5771-5278)。將DNA導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞可，例如，通過如下實現(xiàn)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，Hanahan,1983，/Mo/.傷o/.166:557-580),或電穿孔(參見,例如，Dower等，1988,iVwc/e/c16:6127-6145)。將DNA導(dǎo)入鏈霉菌屬細(xì)胞可，例如，通過如下實現(xiàn)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和電穿孔(參見，例如，Gong等，2004,尸0/^71&^^0/.(Pra/z^)49:399-405)，接合(參見，例如，Mazodier等，1989，乂萬fl"e/7'o/.171:3583-3585),或轉(zhuǎn)導(dǎo)(參見，例如，Burke等，2001，尸rac.Ato/JcaJ.5W.t/X498:6289-6294)。將DNA導(dǎo)入假單胞菌屬細(xì)胞可，例如，通過如下實現(xiàn)電穿孔(參見，例如，Choi等，2006,7!Mfcra&o/.64:391-397)或才姿合(參見，例如，Pinedo和Smets,2005,^cp/.五"Wra".A//craZ/o/.71:51-57)。將DNA導(dǎo)入鏈球菌屬細(xì)胞可，例如，通過如下實現(xiàn)天然感受態(tài)(參見，例如，Perry和Kuramitsu，1981,/"/ec/./wm"".32:1295-1297),原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，Catt和Jollick,1991,Mz'cra6/肌68:189-207)，電穿孔(參見，例如，Buckley等，1999,jpp/.MfcraWo/.65:3800-3804)或接合(參見，例如，Clewell,1981，M'cra^b/.iev.45:409-436)。然而，可以使用已知用于將DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞的任何方法。細(xì)菌宿主細(xì)月包本發(fā)明還涉及包含核酸構(gòu)建體或重組表達(dá)載體的細(xì)菌宿主細(xì)胞，所述核酸構(gòu)建體或重組表達(dá)載體包含編碼目的多肽的多核香酸，所述目的多肽為，例如，具有生物活性的多肽，或本發(fā)明的限制性內(nèi)切核酸酶或DNA曱基轉(zhuǎn)移酶。本發(fā)明還涉及包含編碼限制性內(nèi)切核酸酶的多核苦酸的細(xì)菌宿主細(xì)胞，所述多核苷酸是失活的；其中編碼限制性內(nèi)切核酸酶的多核苷酸選自下組(a)多核苷酸，其編碼包含與SEQIDNO:4的氨基酸1至337具有優(yōu)選至少60%,更優(yōu)選至少65°/0,更優(yōu)選至少70%,更優(yōu)選至少75%,更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%,甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%,和甚至最優(yōu)選至少96%,至少97%,至少98%,或至少99%序列同一性的氨基酸序列的多肽；(b)多核香酸，其包含與SEQIDNO:3的核香酸1至1011具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%,更優(yōu)選至少75%,更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%,甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%,和甚至最優(yōu)選至少96%,至少97%,至少98%，或至少99%序列同一性的核苷酸序列；和(c)多核苷酸，其在至少中嚴(yán)緊條件下，更優(yōu)選至少中-高嚴(yán)緊條件下，和最優(yōu)選至少高嚴(yán)緊條件下，與SEQIDNO:3的核香酸1至1011或其全長互補鏈雜交；其中限制性內(nèi)切核酸酶與SEQIDNO:4的氨基酸1至337的限制性內(nèi)切核酸酶具有相同的特異性；和其中編碼限制性內(nèi)切核酸酶的多核苷酸的失活防止導(dǎo)入細(xì)菌宿主細(xì)胞的DNA被限制性內(nèi)切核酸酶消化，且無需在導(dǎo)入宿主細(xì)胞之前用DNA曱基轉(zhuǎn)移酶將DNA曱基化。本發(fā)明還涉及包含核酸構(gòu)建體或重組表達(dá)載體的細(xì)菌宿主細(xì)胞，所述核酸構(gòu)建體或重組表達(dá)載體包含編碼具有生物活性的多肽或與所述多肽表達(dá)有關(guān)的DNA,其中包含DNA的細(xì)菌宿主細(xì)胞通過本文所述的用于將DNA導(dǎo)入這種宿主細(xì)胞的方法之一獲得。細(xì)菌宿主細(xì)胞可以是任何革蘭氏陽性細(xì)菌或革蘭氏陰性細(xì)菌，所述細(xì)菌包含限制-修飾系統(tǒng)，如本文所述。革蘭氏陽性細(xì)菌包括，但不限于，芽孢桿菌屬、鏈球菌屬、鏈霉菌屬、葡萄球菌屬(Stop/^/ococcuy)、腸球菌屬(EVteracoccw力、享L4干菌屬(LactoZ)ac〃/w)、享L^求菌屬(丄actococcw力、才炎菌屬(C7os^7-(i&附)、地芽孑包4干菌屬(G^c^"c/〃M力和Oce""oZ)ac/〃wj屬。革蘭氏陰性細(xì)菌包括，但不限于，大腸桿菌、^i單胞菌屬、沙門氏菌屬0^/附0^//")、彎曲桿菌屬(Campy/o6ac&r)、螺桿菌屬(7/e//co6acfer)、黃桿菌屬(F/avo^3cfer/iwz)、才炎4干菌屬(FzwoZfl"en.MW)、泥4干菌屬(/(vofe(3cter)、奈瑟氏菌屬(7Ve/^eWa)和脲原體屬(t7re—osma)。在本發(fā)明的方法中，細(xì)菌宿主細(xì)胞可以是任何芽孢桿菌屬細(xì)胞。在本發(fā)明的應(yīng)用中有用的芽孢桿菌屬細(xì)胞包括，但不限于，嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌(萬acz7/wc/m^7)、凝結(jié)芽孢桿菌、堅強芽孢桿菌、杣爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞。在優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是解淀粉芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌細(xì)胞。在更優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是解淀粉芽孢桿菌細(xì)胞。在另外的更優(yōu)選方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是克勞氏芽孢桿菌細(xì)胞。在另外的更優(yōu)選方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是地衣芽孢桿菌細(xì)胞。在另外的更優(yōu)選方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是枯草芽孢桿菌細(xì)胞。在本發(fā)明的方法中，細(xì)菌宿主細(xì)胞可以是任何鏈球菌屬細(xì)胞。在本發(fā)明的實踐中有用的鏈球菌屬細(xì)胞包括，但不限于，似馬鏈球菌(&reptococcusegw/w'冊'to)、酉良膿《ili求菌(5^e;tococcus1p少oge"e力、乳房《連5求菌(&reptococcz^w6en.)和馬MJ求菌獸瘟亞種(5^eptococciwe《i,subsp.Zooep/cfew/cw力。在優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是似馬鏈球菌細(xì)胞。在另一個優(yōu)選方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是釀膿鏈球菌細(xì)胞。在另一個優(yōu)選方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是乳房鏈球菌細(xì)胞。在另一個優(yōu)選方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是馬鏈球菌獸瘟亞種細(xì)胞。在本發(fā)明的方法中，細(xì)菌宿主細(xì)胞可以是任何鏈霉菌屬細(xì)胞。在本發(fā)明的實踐中有用的鏈球菌屬細(xì)胞包括，但不限于，不產(chǎn)色鏈霉菌CS^eptomyc"ac/zromogewe力、除蟲鏈霉菌(浙eptomycesave削"/fo)、天藍(lán)色鏈霉菌(;S^eptomyc&vcoe/Zco/or)、灰色4連霉菌(;SVreptomycesgr&ez^)和淺青紫《連霉菌在優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是不產(chǎn)色鏈霉菌細(xì)胞。在另一個優(yōu)選方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是除蟲鏈霉菌細(xì)胞。在另一個優(yōu)選方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是天藍(lán)色鏈霉菌細(xì)胞。在另一個優(yōu)選方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是灰色鏈霉菌細(xì)胞。在另一個優(yōu)選方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是淺青紫鏈霉菌細(xì)胞。在本發(fā)明涉及用DNA曱基轉(zhuǎn)移酶將目的DNA曱基化的方法中，用于曱基化的細(xì)菌細(xì)胞將可能與最終的宿主細(xì)菌細(xì)胞不同。用于曱基化的細(xì)菌細(xì)胞可以是細(xì)菌細(xì)胞，其中已導(dǎo)入對細(xì)胞是外源的本發(fā)明的DNA曱基轉(zhuǎn)移酶基因，或是細(xì)菌細(xì)胞，其中DNA曱基轉(zhuǎn)移酶基因?qū)?xì)胞是天然的。在本發(fā)明另外的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞可以額外包含修飾，例如，其他基因的缺失或破壞，所述基因可能對目的多肽的生產(chǎn)、回收或應(yīng)用有害。在優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是蛋白酶缺陷型細(xì)胞。在更優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞，例如芽孢桿菌屬細(xì)胞，包含qp^;和的破壞或缺失。在另一個優(yōu)選方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞不產(chǎn)生孢子。在另一個更優(yōu)選方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞，例如，芽孢桿菌屬細(xì)胞，包含s;o/Z4C的破壞或缺失。在另一個優(yōu)選方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞，例如，芽孢桿菌屬細(xì)胞，包含與表面活性素(surfactin)的生物合成有關(guān)的基因之一的破壞或缺失，例如sr/丄sc/B、w/C和^/D。參見，例如，美國專利No.5,958,728。其他基因，例如，flm，y五基因，其對目的多肽的產(chǎn)生、回收或應(yīng)用有害，也可以破壞或缺失。DNA在本發(fā)明的方法中，導(dǎo)入細(xì)菌宿主細(xì)胞的DNA可以是任何目的DNA。DNA對于目的細(xì)菌宿主細(xì)胞可以是天然的或異源(外源)的。DNA可以編碼具有目的生物活性的任何多肽。多肽對于目的細(xì)菌宿主細(xì)胞可以是天然的或異源(外源)的。術(shù)語"異源多肽"在本文中定義為對宿主細(xì)胞不是天然的多肽；天然多肽，其中進行了結(jié)構(gòu)修飾，例如，缺失、取代和/或插入，以使天然多肽改變；或作為通過重組DNA技術(shù)對編碼多肽的DNA搡作的結(jié)果，例如更強的啟動子，而其表達(dá)在量上改變的天然多肽。多肽可以是下述多肽和雜合多肽的天然存在的等位變體和工程改造的變體。術(shù)語"多肽"在本文并不指特定長度的編碼產(chǎn)物，因此，包括肽、寡肽和蛋白質(zhì)。術(shù)語"多肽"還包括雜合多肽，其包含獲得自至少兩個不同多肽的部分或全部多肽序列的組合，其中一個或多個多肽可以對真菌細(xì)胞是異源的。多肽進一步包括多肽的天然存在的等位變體和工程改造的變體。在優(yōu)選的方面，多肽是抗體、抗原、抗微生物肽、酶、生長因子、激素、immunodilator、神經(jīng)遞質(zhì)、受體、報告蛋白質(zhì)、結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)錄因子。在更優(yōu)選的方面，多肽是氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂合酶、異構(gòu)酶或連接酶。在最優(yōu)選的方面，多肽是(X-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、角質(zhì)酶、環(huán)式糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、a-半乳糖苦酶、(3-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、葡糖腦香脂酶、a-葡糖苷酶、P-葡糖苦酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苦酶、變構(gòu)酶、氧化酶、果膠S吏分解酶、過氧化物酶、磷脂酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、尿激酶或木聚糖酶。在另一個優(yōu)選方面，多肽是白蛋白、膠原、原彈性蛋白、彈性蛋白或明膠。在另一個優(yōu)選方面，多肽是雜合多肽，其包含獲得自至少兩個不同多肽的部分或完整多肽序列的組合，其中一個或多個多肽對于細(xì)菌宿主細(xì)胞可以是異源的。在另一個優(yōu)選的方面，多肽是融合多肽，其中將另外的多肽融合到所述多肽或其片段的N末端或C末端。通過將編碼一種多肽的核苷酸序列(或其部分)與編碼另一種多肽的核苷酸序列(或其部分)融合而產(chǎn)生融合多肽。產(chǎn)生融合多肽的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，且包括連接編碼多肽的編碼序列以使它們在閱讀框中，并且使融合多肽的表達(dá)在相同啟動子和終止子的控制下。編碼目的多肽的DNA可以獲得自任何原核、真核或其他來源。就本發(fā)明而言，用于本文與給定的來源有關(guān)的術(shù)語"獲得自"，意思是多肽由所述來源產(chǎn)生，或由其中插入了來自所述來源的基因的細(xì)胞產(chǎn)生。用于分離或克隆編碼目的多肽的DNA的技術(shù)是本領(lǐng)域內(nèi)已知的，且包括從基因組DNA分離，從cDNA制備，或其組合?？赏ㄟ^例如使用熟知的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)實現(xiàn)從這種基因組DNA克隆目的多核苷酸。參見，例如，Innis等,1990，PC7尸rotoco/s:爿GWcfetoMef/zo<isawd4pp//ca"o",AcademicPress,NewYork?？寺〔襟E可以涉及包含編碼多肽的核S餅列的期望核酸片段的切除與分離，向載體分子中插入片段，和將重組載體并入突變真菌細(xì)胞，其中將復(fù)制多個拷貝或克隆的核S踏列。DNA可以是基因組、cDNA、RKA、半合成、合成來源的，或它們的任意組合?？梢杂迷S多方式操作編碼目的多肽的DNA以提供DNA在合適的細(xì)菌宿主細(xì)胞中的表達(dá)。核酸構(gòu)建體和用于編碼目的多肽的DNA的重組表達(dá)載體的構(gòu)建可以如本文在本發(fā)明的DNA曱基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)中所述進行。DNA還可以是調(diào)控序列，例如，啟動子，用于操作目的基因的表達(dá)。調(diào)控序列的非限定性實例在本文中描述。DNA可以進一步是用于將細(xì)菌細(xì)胞中目的基因失活的核酸構(gòu)建體。DNA不限定于上述公開的具體實例的范圍，因為這些實例意欲作為本發(fā)明幾個方面的i兌明。產(chǎn)生方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明還涉及產(chǎn)生具有生物活性的多肽的方法，其包括(a)在有益于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)細(xì)菌宿主細(xì)胞，所述細(xì)胞包含導(dǎo)入的編碼具有生物活性多肽或與所述多肽表達(dá)有關(guān)的DNA;其中在導(dǎo)厶宿主細(xì)胞之前用選自下組的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶將￡>NA曱基化(i)多肽，其包含與SEQIDNO:2的氨基酸1至381具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%,更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%,甚至更優(yōu)選至少90%,最優(yōu)選至少95%，和甚至最優(yōu)選至少96%,至少97%，至少98%,或至少99%的序列同一性的氨基酸序列；(ii)多肽，其由包含與SEQIDNO:1的核苷酸1至1143具有優(yōu)選至少60%,更優(yōu)選至少65%,更優(yōu)選至少70。/。，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%,甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%,和甚至最優(yōu)選至少96%，至少97%,至少98%，或至少99%的序列同一性的核苷@吏序列的多核苷酸編碼；(iii)多肽，其由在至少中嚴(yán)緊條件下，更優(yōu)選至少中-高嚴(yán)緊條件下，和最優(yōu)選至少高嚴(yán)緊條件下，與SEQIDNO:1的核苷酸1至1143或其全長互補鏈雜交的多核苷酸編碼；和(iv)變體，其包含取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQIDNO:2的氨基酸1至381。其中DNA曱基轉(zhuǎn)移酶與SEQIDNO:2的氨基酸1至381的DNA曱基轉(zhuǎn)移酶具有相同的特異性，并且對于細(xì)菌宿主細(xì)胞是天然的；和其中曱基化防止導(dǎo)入的DNA被細(xì)菌宿主細(xì)胞的限制性內(nèi)切核酸酶消化；和(b)回收所述具有生物活性的多肽。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生具有生物活性的多肽的方法，其包括(a)在有益于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)細(xì)菌宿主細(xì)胞，所述細(xì)胞包含導(dǎo)入的編碼具有生物活性多肽或與所述多肽表達(dá)有關(guān)的DNA;其中細(xì)菌宿主細(xì)胞包含編碼限制性內(nèi)切核酸酶的多核苷酸，所述多核苷酸是失活的；其中編碼限制性內(nèi)切核酸酶的多核苷酸選自下組(i)多核苷酸，其編碼包含與SEQIDNO:4的氨基酸1至337具有優(yōu)選至少60°/。，更優(yōu)選至少65%,更優(yōu)選至少70%,更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80°/。，更優(yōu)選至少85°/。，甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，和甚至最優(yōu)選至少96%，至少97%，至少98%,或至少99%的序列同一性的氨基酸序列的多肽；(ii)多核苷酸，其包含與SEQIDNO:3的核香酸1至1011具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%,更優(yōu)選至少70%,更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%,更優(yōu)選至少85%,甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%,和甚至最優(yōu)選至少96%，至少97%，至少98%,或至少99%的序列同一性的核苷酸序列；和(iii)多核苷酸，其在至少中嚴(yán)緊條件下，更優(yōu)選至少中-高嚴(yán)緊條件下，和最優(yōu)選至少高嚴(yán)緊條件下，與SEQIDNO:3的核苦酸1至1011或其全長互補鏈雜交；其中限制性內(nèi)切核酸酶與SEQIDNO:4的氨基酸l至337的限制性內(nèi)切核酸酶具有相同的特異性；和其中編碼限制性內(nèi)切核酸酶的多核苷酸的失活防止導(dǎo)入的DNA被限制性內(nèi)切核酸酶消化，且無需在將DNA導(dǎo)入細(xì)菌宿主細(xì)胞之前用DNA曱基轉(zhuǎn)移酶將DNA曱基化；和(b)回收所述具有生物活性的多肽。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生具有限制性內(nèi)切核酸酶活性的多肽的方法，其包括(a)在有益于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)細(xì)菌宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞包含本發(fā)明的編碼具有限制性內(nèi)切核酸酶活性的多肽的多核苷酸；和(b)回收所述具有限制性內(nèi)切核酸酶活性的多肽。本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生具有DNA曱基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽的方法，包括(a)在有益于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)細(xì)菌宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞包含本發(fā)明的編碼具有DNA曱基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽的多核苷酸；和(b)回收所述具有DNA曱基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽。使用本領(lǐng)域已知的方法在適合于產(chǎn)生目的多肽的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)菌宿主細(xì)胞。例如，可以通過在合適培養(yǎng)基中和允許表達(dá)和/或分離目的多肽的條件下進行的搖瓶培養(yǎng)，和實驗室或工業(yè)發(fā)酵罐中的小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、補料分批或固態(tài)發(fā)酵)來培養(yǎng)細(xì)胞。使用本領(lǐng)域已知的方法在合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，所述營養(yǎng)培養(yǎng)基包含碳源和氮源和無機鹽。合適的培養(yǎng)基能夠從商業(yè)供應(yīng)商獲得或可以根據(jù)公布的組成制備(例如，在美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中)。分泌的目的多肽能夠從培養(yǎng)基中直接回收?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的對于目的多肽是特異性的方法來檢測所述多肽。這些^r測方法可包括特異性抗體的使用、高效液相色語、毛細(xì)管電泳、酶產(chǎn)物的形成、酶底物的消失或SDS-PAGE。例如，酶試驗(enzymeassay)可用于測定酶的活性。對于很多酶，用于測定酶活性的方法在本領(lǐng)域中已知(參見，例^口，D,Schomburg禾口M.Salzmann(編),五"2^附e//"wcfeooA:，Springer-Verlag,NewYork,1990)。用于測定本發(fā)明的限制性內(nèi)切核酸酶或DNA曱基轉(zhuǎn)移酶活性的試驗在本文描述。所得多肽可以使用本領(lǐng)域已知的方法回收。例如，目的多肽可以通過常規(guī)方法從培養(yǎng)基中分離，所述常規(guī)方法包括但不限于離心、過濾、提取、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀。然后分離的多肽可以通過多種本領(lǐng)域已知的方法進一步純化，所述方法包括但不限于層析(例如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳方法(例如，制備型(preparative)等電聚焦)、差示溶解度(例如，碌』交4妄沉淀)或才是耳又(參見，例如，Prafe/"Pw折ctm-。"，J,-C.Janson和LarsRyden編，VCHPublishers,NewYork,1989)?；虻氖Щ畋景l(fā)明還涉及產(chǎn)生親本細(xì)菌細(xì)胞突變體的方法，其包括(a)將包含核酸構(gòu)建體的DNA導(dǎo)入親本細(xì)菌細(xì)胞，使親本細(xì)菌細(xì)胞中編碼多肽的基因失活，這們、Jw、J,卞4、湖肥乂胞；其中細(xì)菌宿主細(xì)胞包含編碼限制性內(nèi)切核酸酶的多核苷酸，所述多核苷酸是失活的，并且編碼限制性內(nèi)切核酸酶的多核苷酸選自下組(i)多核苷酸，其編碼包含與SEQIDNO:4的氨基酸1至337具有優(yōu)選至少60%,更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%,更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%,更優(yōu)選至少85%,甚至更優(yōu)選至少90%,最優(yōu)選至少95%，和甚至最優(yōu)選至少96%,至少97%,至少98%,或至少99%的序列同一性的氨基酸序列的多肽；(ii)多核苷酸，其包含與SEQIDNO:3的核苷酸1至1011具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%,更優(yōu)選至少70%,更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%,更優(yōu)選至少85%，甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%,和甚至最優(yōu)選至少96%,至少97%，至少98%,或至少99%的序列同一性的核苷酸序列；和(iii)多核苷酸，其在至少中嚴(yán)緊條件下，更優(yōu)選至少中-高嚴(yán)緊條件下，和最優(yōu)選至少高嚴(yán)緊條件下，與SEQIDNO:3的核苷酸1至1011或其全長互補鏈雜交；和(iv)多核苷酸，其編碼變體，所述變體包含取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQIDNO:4的氨基酸1至337;其中限制性內(nèi)切核酸酶具有與SEQIDNO:4的氨基酸1至337的限制性內(nèi)切核酸酶相同的特異性，并且其中編碼限制性內(nèi)切核酸酶的多核苷酸的失活防止導(dǎo)入的DNA被限制性內(nèi)切核酸酶消化，且無需在將DNA導(dǎo)入親本細(xì)菌細(xì)胞之前用DNA曱基轉(zhuǎn)移酶將DNA甲基化；和(b)分離突變體細(xì)胞。本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生親本細(xì)菌細(xì)胞突變體的方法，其包括(a)將包含核酸構(gòu)建體的DNA導(dǎo)入親本細(xì)菌細(xì)胞，使親本細(xì)菌細(xì)胞中編碼多肽的基因失活，這產(chǎn)生與在相同條件下培養(yǎng)時的親本細(xì)胞相比產(chǎn)生4支少的所述多肽的突變體細(xì)胞；其中在導(dǎo)入細(xì)菌宿主細(xì)胞之前通過選自下組的DNA曱基轉(zhuǎn)移酶將DNA曱基化(i)多肽，其包含與SEQIDNO:2的氨基酸1至381具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%,更優(yōu)選至少75%,更優(yōu)選至少80%,更優(yōu)選至少85%，甚至更優(yōu)選至少90%,最優(yōu)選至少95%,和甚至最優(yōu)選至少96%，至少97%,至少98%,或至少99%的序列同一性的氨基酸序列；(ii)多肽，其由包含與SEQIDNO:1的核苷酸1至1143具有優(yōu)選至少60%,更優(yōu)選至少65%,更優(yōu)選至少70%,更優(yōu)選至少75%,更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%,甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%,和甚至最優(yōu)選至少96%，至少97°/。，至少98%，或至少99%的序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸編碼；(iii)多肽，其由在至少中嚴(yán)緊條件下，更優(yōu)選至少中-高嚴(yán)緊條件下，和最優(yōu)選至少高嚴(yán)緊條件下，與SEQIDNO:1的核苷酸1至1143或其全長互補鏈雜交的多核苦酸編碼；和(iv)變體，其包含取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQIDNO:2的氨基酸1至381;其中DNA曱基轉(zhuǎn)移酶具有與SEQIDNO:2的氨基酸1至381的DNA曱基轉(zhuǎn)移酶相同的特異性，并且其中曱基化防止導(dǎo)入的DNA被親本細(xì)菌細(xì)胞的限制性內(nèi)切核酸酶消化；和(b)分離突變體細(xì)胞?？梢允褂帽疚乃龇椒?gòu)建包含失活基因的突變體細(xì)胞。主細(xì)胞特別有用。因此，本發(fā)明進一步涉及產(chǎn)生天然或外源多肽的方法，其包括(a)在有益于多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)突變體細(xì)胞；和(b)回收所述多肽。術(shù)語"外源多肽"在本文定義為對于宿主細(xì)胞不是天然的多肽，其中經(jīng)過修飾以改變天然序列的天然蛋白質(zhì)，或作為通過重組DNA技術(shù)對宿主細(xì)胞操作的結(jié)果其表達(dá)在量上發(fā)生改變的天然蛋白質(zhì)。能在這樣的突變體中表達(dá)的多肽的實例在本文描述。用于培養(yǎng)和純化目的產(chǎn)物的方法可以通過本領(lǐng)域已知和本文所述的方法進行。通過下述實施例進一步描述本發(fā)明，但不應(yīng)將下述實施例理解為對本發(fā)明范圍的限制。實施例DNA測序使用AppliedBiosystemsModel3130XGeneticAnalyzer(3130X型遺傳分析儀)(AppliedBiosystems,FosterCity,CA,USA)，利用染料終止子化學(xué)(Giesecke等，1992，7owr"a/o/Kra/.MeAoA38:47-60)進行DNA測序。使用phred/phrap/consed(UniversityofWashington,Seattle,WA,USA)用測序特定引物組裝序列。菌林在枯草芽孢桿菌168A4中構(gòu)建芽孢桿菌屬質(zhì)粒?？莶菅挎邨U菌168A4源自枯草芽孢桿菌模式菌抹(typestrain)168(BGSC1A1,BacillusGeneticStockCenter(芽孢桿菌屬遺傳保藏中心)，Columbus,OH),并在^att4C、opr五、和amy五基因中有缺失。這四個基因的缺失基本如針對枯草芽孢桿菌A164A5所述的進^"，該方法在美國專利No.5,891,701中有詳細(xì)描述。培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基由每升10g胰蛋白胨、5g酵母提取物和5gNaCl組成。LB平板由LB培養(yǎng)基與每升15g細(xì)菌用瓊脂組成。LB氨芐青霉素培養(yǎng)基由LB培養(yǎng)基與每毫升100嗎氨芐青霉素(過濾除菌，高壓滅菌后加入)組成。LB氨芐青霉素平板由LB氨芐青霉素培養(yǎng)基與每升15g細(xì)菌用瓊脂組成。VY培養(yǎng)基由每升25g小牛肉浸出液(vealinftision)(BDDiagnostics,43FranklinLakes,NJ，USA)和5g酵母提取物組成。2XYT培養(yǎng)基由每升16g胰蛋白胨、10g酵母提取物和5gNaCl組成。2XYT氨千青霉素培養(yǎng)基由2XYT培養(yǎng)基和每毫升100嗎氨千青霉素(過濾除菌，高壓滅菌后加入)組成。2XYT氨千青霉素平板由每升2XYT氨芐青霉素培養(yǎng)基和15g細(xì)菌用瓊脂組成。LBS培養(yǎng)基由LB培養(yǎng)基和0.5M山梨醇組成。LBSM培養(yǎng)基由LBS培養(yǎng)基和0.38M甘露醇組成。TBAB培養(yǎng)基由DifcoTryptoseBloodAgarBase(胰際蛋白血瓊脂基礎(chǔ))(BDDiagnostics,FranklinLakes,NJ,USA)組成。TBAB氯霉素平板由TBAB培養(yǎng)基和每毫升5)ig氯霉素組成。TBAB新霉素平板由TBAB培養(yǎng)基和每毫升6新霉素組成。TBAB紅霉素/林可霉素平板由TBAB和每毫升1嗎紅霉素和25嗎林可霉素組成。TY培養(yǎng)基由下述物質(zhì)組成每升20g胰蛋白胨、5g酵母提取物、6mgFeCl2'4H20、1mgMnCl2.4H20和15mgMgS04-7H20。TY平板由TY培養(yǎng)基和每升20g細(xì)菌用瓊脂組成。TY氯霉素平板由包含每毫升6jug氯霉素的TY平板培養(yǎng)基組成。LBPG平板由包含0.01MKsP04和0.4%葡萄糖的LB平板培養(yǎng)基組成。實施例1:確定地衣芽孢桿菌菌抹SJ1904的基因組序列由使用454DNA測序技術(shù)(Margulies等，2005，Atoww437:376-380)產(chǎn)生的重疊群(contig)確定地衣芽孢桿菌菌株SJ1904完整染色體的基因組序列，使用Sanger測序技術(shù)讀出隨機配對序列(randompaired),并且，為了關(guān)閉缺口和解析重復(fù)序列，由基因組DNA的PCR片段讀出。使用Phrap組裝測序數(shù)據(jù)，并在Consed中編輯和查看。使用Glimmer(Delcher等，1999，7Vwc/e/c爿cz'Aie化wc/z27:4636-4641)由基因組DNA序列預(yù)測基因模型。使用E-值閾值為1X10—5的BLASTP,通過與無冗余數(shù)據(jù)庫PIR-NREF(Wu等，2002,A^c/e/c爿c/AWeye"rc/30:35-37)的比較，對基因模型進行機器注解。實施例2:地衣芽孢桿菌M.Blil90411DNA曱基轉(zhuǎn)移酶基因的鑒定使用BLASTP(Altschul等，1997,iVwc/e/c爿dAieye『c/225:3389-3402)將地衣芽孢桿菌菌抹SJ1904基因模型的推定的氨基酸序列與來自REBASE(Roberts,R丄，Macelis,M.，Rebase.2005)的蛋白質(zhì)序列進行比較。因為DNA曱基轉(zhuǎn)移酶具有中等水平的序列保守性，所以這項分析鑒定了這個基因組中所有推定的DNA曱基轉(zhuǎn)移酶。使用Prints-S16版，如通過InterProScanv3.3版所實施的，鑒定M.Blil90411中的胞嘧啶特異性DNA甲基轉(zhuǎn)移酶特征(signature)。此外，發(fā)現(xiàn)存在于胞嘧啶特異性DNA曱基轉(zhuǎn)移酶中的六個高度保守的基序(motif)在地衣芽孢桿菌M.Blil904IIDNA曱基轉(zhuǎn)移酶中也是保守的。實施例3:地衣芽孢桿菌M.Blil90411DNA曱基轉(zhuǎn)移酶基因的表征地衣芽孢桿菌MJBlil90411DNA曱基轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列(SEQIDNO:l)和推定的氨基酸序列(SEQIDNO:2)如圖1A和1B中所示。編碼序列為1014bp,其包括終止密碼子。編碼區(qū)為36.1%G+C。編碼的預(yù)測蛋白質(zhì)為337個氨基酸，分子量為38.5kDa。使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,見上文)，如EMBOSS的Needle程序中所執(zhí)行的，缺口開放罰分為10，缺口延伸罰分為0.5，使用EBLOSUM62矩陣，確定氨基酸序列的比較配對全局比對。比對顯示，地衣芽孢桿菌M.Blil90411DNA曱基轉(zhuǎn)移酶的推定氨基酸序列與韋氏芽孢桿菌CBac/〃wC-5胞嘧啶特異性DNA曱基轉(zhuǎn)移酶前體(UniRef100—Q2AVE0)具有64%的同一'性，并且與Ocea"oZ)acf〃"s的胞嘧啶特異性DNA曱基轉(zhuǎn)移酶(UniReflO(^Q8EL98)具有47%的同一性。當(dāng)使用Needle標(biāo)記為"最長同一性，，的輸出結(jié)果作為百分比同一性并如下計算時(相同的殘基xl00)/(比對長度-比對中缺口數(shù)目)，地衣芽孢桿菌M.Blil90411DNA曱基轉(zhuǎn)移酶的推定氨基酸序列與韋氏芽孢桿菌C-5胞嘧啶特異性DNA曱基轉(zhuǎn)移酶前體(UniRef100—Q2AVE0)具有68.5%的同一性，并且與(9cea"o6""7/w//ze，ww;y的胞嘧啶特異性DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(UniRef100—Q8EL98)具有55.9%的同一性。實施例4:地衣芽孢桿菌Blil904IIII型限制性內(nèi)切核酸酶基因的鑒定II型限制性內(nèi)切核酸酶彼此之間通常沒有序列同一性，當(dāng)它們具有相似的DNA限制性位點時也只有很小的同一性。此外，II型限制性內(nèi)切核酸酶通常在指定的限制-修飾系統(tǒng)中位于其相應(yīng)DNA曱基轉(zhuǎn)移酶的旁邊。此外，目前表征的所有限制性內(nèi)切核酸酶基因都大于450bp(Kong,等，2000，7Vwc/e/c^cz'dyie"arc/z28:3216-3223)。使用這些標(biāo)準(zhǔn)，由地衣芽孢桿菌SJ1904經(jīng)注解的基因模型鑒定出大于450bp并且位于地衣芽孢桿菌M.Blil904IIDNA曱基轉(zhuǎn)移酶基因旁邊的假定基因作為II型限制性內(nèi)切核酸酶基因Blil904H。實施例5:地衣芽孢桿菌Blil904IIII型限制性內(nèi)切核酸酶基因的表征地衣芽孢桿菌B1U904IIII型限制性內(nèi)切核酸酶基因的核苷酸序列(SEQIDNO:3)和推定的氨基酸序列(SEQIDNO:4)示于圖2。編碼序列為1146bp，其包括終止密碼子。編碼區(qū)為36.3%G+C。編碼的預(yù)測蛋白質(zhì)為381個氨基酸，分子量為43.7kDa。使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，/Mo/.歷o/.48:443-453)，如EMBOSS的Needle程序中所執(zhí)行的，缺口開放罰分為10,缺口延伸罰分為0.5,使用EBLOSUM62矩陣，確定氨基酸序列的比較配對全局比對。比對顯示，地衣芽孢桿菌Blil904IIII型限制性內(nèi)切核酸酶的推定氨基酸序列與韋氏芽孢桿菌假設(shè)蛋白質(zhì)(UniRef100—Q2AVE3)具有45%的同一性，并且與嗜冷單胞菌菌種CNPT3假設(shè)蛋白質(zhì)(UniRef100—Q1ZE16)具有32.6%的同一性。當(dāng)使用Needle標(biāo)記為"最長同一性"的輸出結(jié)果作為百分比同一性并如下計算時(相同的殘基xlOO)/(比對長度-比對中缺口數(shù)目)，地衣芽孢桿菌M.Blil90411DNA曱基轉(zhuǎn)移酶的推定氨基酸序列與韋氏芽孢桿菌假設(shè)蛋白質(zhì)(UniRefl00一Q2AVE3)具有47%的同一性，并且與嗜冷單胞菌CNPT3假設(shè)蛋白質(zhì)(UniRef100—Q1ZE16)具有47.2%的同一性。實施例6:地衣芽孢桿菌M.Blil90411DNA曱基轉(zhuǎn)移酶基因的克隆為在枯草芽孢桿菌中表達(dá)而通過PCR克隆地衣芽孢桿菌M.Blil90411DNA曱基轉(zhuǎn)移酶基因。沖艮據(jù)Pitcher等,1989,丄成如/.她ra6/。/.8:151-156的方法從地衣芽孢桿菌SJ1904分離基因組DNA。圖3顯示了包含編碼Blil904II限制性內(nèi)切核酸酶和M.Blil90411DNA曱基轉(zhuǎn)移酶的基因的地衣芽孢桿菌染色體區(qū)域。使用如下所示的引物999611和999612，通過PCR從地衣芽孢桿菌SJ1904基因組DNA擴增地衣芽孢桿菌SJ1904染色體的約1043bp片段，其包括M.Blil卯411DNA曱基轉(zhuǎn)移酶基因的核糖體結(jié)合位點和編碼區(qū)，包含SEQIDNO:5的核香酸2019-3049(圖3)。引物999611并入了Sacl限制性位點，而引物999612并入了M/wI限制性位點。引物999611:5'-GAGCTCTGCAAGGAGGTATAATTTTG-3'(SEQIDNO:6)引物999612:5'-ACGCGTTTATTCAGCTATTGCATATTC畫3'(SEQIDNO:7)使用尸々PLATINUMDNA聚合酶(Invitrogen，Carlsbad,CA,USA)進行PCR。擴增反應(yīng)液(50pl)由下述組成IX尸々擴增緩沖液(Invitrogen，Carlsbad,CA,USA)，lmMMgS04，300nM每種dNTP，0.3liM每條引物，1.25單位PLATINUM尸/xDNA聚合酶，和約200ng模板DNA。使用ROBOCYCLER40溫度循環(huán)儀(StratageneCorporation,LaJolla，CA,USA)進行反應(yīng)，程序為95。C2分鐘的1個循環(huán)；95。C1分鐘、55。C1分鐘和68°C1分鐘的30個循環(huán)；和68。C3分鐘的1個循環(huán)。使用用于測序的ZEROBLUNTTOPOPCR克隆試劑盒(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)將獲得的約1043bpPCR產(chǎn)物克隆入載體pCR4Blunt,并根據(jù)制造商說明轉(zhuǎn)化入ONESHOTTOP10化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞中。使用PlasmidMidi試劑盒(QIAGENInc.,Valencia,CA，USA)從一個轉(zhuǎn)化體分離質(zhì)粒DNA,并通過用五coRI、Wcol和S"flBI消化然后在TBE(50mMTris堿-50mM硼酸-lmMEDTA二鈉)中的0.8%瓊脂糖電泳進行驗證，用五coRI消化獲得3939bp和1061bp的期望片段；iVcol為3217bp和1783bp;而S"aBI為4165bp和835bp。通過DNA測序確定克隆的PCR片段的DNA序列。將這個質(zhì)粒命名為pMDT138(圖4)。根據(jù)制造商說明，將質(zhì)粒pMDT138轉(zhuǎn)化入大腸桿菌XL1-Blue細(xì)胞(StratageneCorporation,LaJolla，CA，USA)，在37。C在2XYT氨芐青霉素平板上選擇氨,青霉素抗性。將一個轉(zhuǎn)化體命名為MDT45，并按照布達(dá)佩斯條約的條款于2006年9月7日將其保藏在農(nóng)業(yè)研究機構(gòu)專利培養(yǎng)物保藏中心北區(qū)研究中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection,NorthernRegionalResearchCenter),1815UniversityStreet,Peoria,Illinois,61604,并且給予登錄號NRRLB-41967。47實施例7:pMDT100的構(gòu)建質(zhì)粒pMDT100是大腸桿菌復(fù)制子，其包含P呵L4199/P短共有amyQ/PaylllA/cryIIIAstab三串聯(lián)啟動子，其驅(qū)動克勞氏芽孢桿菌堿性蛋白酶基因0/^//)的表達(dá)。這個a/r/7表達(dá)盒和pC194的caf基因(Horinouchi和Weisblum,1982，■/5acten'o/.150:804-814)兩側(cè)側(cè)翼為枯草芽孢桿菌a-淀粉酶(amy^)基因的片段，允許通過雙同源重組經(jīng)由兩個awj必片段在枯草芽孢桿菌染色體的am少五基因座插入aprF表達(dá)盒和基因。用另一個基因替代pMDT100中的a/^7/基因允許將所述基因插入并在枯草芽孢桿菌中表達(dá)。pMDT100的構(gòu)建如下所述。質(zhì)粒pNBT51。根據(jù)生產(chǎn)商的說明，使用QIAGEN⑧質(zhì)粒試劑盒(QIAGENInc.,Valencia,CA,USA)從大腸桿菌宿主DH5a分離質(zhì)粒pNBTIO(pDG268MCS-PrC0/mA/cryIIIAstab/SAV;美國專利No.6,255,076)，并用C/al和Seal消化。裂解發(fā)生在a/^/Z編碼序列約326密碼子處的C7al位點，而不是約23密碼子處的C/al位點，這是由于大腸桿菌DamDNA曱基轉(zhuǎn)移酶而通過曱基化阻斷。使用Klenow片,殳(NewEnglandBiolabs,Inc.,Beverly,MA,USA)和dNTP,根據(jù)制造商的說明將C7al末端平端化。通過TBE緩沖液中0.8%的瓊脂糖電泳分析消化的質(zhì)粒，并使用QIAQUICK⑧凝膠提取試劑盒(QIAGENInc.，Valencia,CA,USA)純化約6615bp的載體片段。用&/I和消4b質(zhì)粒pOS4301(BacillusGeneticStockCenter,OhioStateUniversit,Columbus,OH，USA),并使用Klenow片段和dNTP將Sa/I末端平端化，如上所述。通過TBE緩沖液中0.8%的瓊脂糖電泳分析消化的質(zhì)粒，并^f吏用QIAQUICK⑧凝膠提取試劑盒純化攜帶大腸桿菌m^轉(zhuǎn)錄終止子的約840bp片段?？梢?人載體pKK223-3(GEHealthcare,Piscataway,NJ,USA)(圖5)分離同樣的840bpSa/I/6bal片段。根據(jù)制造商的說明，用T4DNA連接酶(RocheDiagnosticsCorporation,Indianapolis,IN,USA)將pNBTIO載體片段和攜帶終止子的片段連接在一起，并根據(jù)制造商的說明，用連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a(GibcoBRL,Gaithersburg,MD,USA),在37。C在2XYT氨千青霉素平板上選擇氨芐青霉素抗性。將得到的質(zhì)粒命名為pNBT51(pDG268-PcryinA/cryniAstab/SAVA)(圖6)。質(zhì)粒pNBT52。用胡I消化質(zhì)粒pNBT51,在11°C用T4DNA聚合酶(RocheDiagnosticsCorporation,Indianapolis,IN,USA)和25jiM每種dNTP溫育20分鐘，將末端平端化，然后75。C溫育10分鐘，將聚合酶熱失活。然后用Dralll消化末端平端化的質(zhì)粒，并通過TBE緩沖液中的0.8%瓊脂糖電泳分析，使用QIAQUICK⑧凝膠提取試劑盒純化約5920bp的載體片段。用DraIII和￡c/136II消化質(zhì)粒pNBT20(pDG268MCS國P短共有amyQ/SAV;美國專利No.6,255,076)，并且使用QIAQUICK⑧凝膠提取試劑盒純化約1641bp的攜帶短共有twy^啟動子(P短共有amyQ)的片段。如上所述連接pNBT51載體片段和P短共有amyQ片段，并如上所述用連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a,在37。C在2XYT氨千青霉素平板上選擇氨千青霉素抗性。使用QIAPREP8小型制備試劑盒(QIAGEN,Valencia,CA,USA)從幾個轉(zhuǎn)化體分離質(zhì)粒DNA,用5^/2I消化，并通過TBE緩沖液中的0.8%瓊脂糖電泳分析。將具有期望的約4873bp和2688bp的限制性片段的一個質(zhì)粒命名為pNBT52(pDGM8-P短共有amyQ/PcryIIIA/crylIIAstab/SAVA)(圖7)。質(zhì)粒。NBT53。用胡I和^cl消化質(zhì)4立pNBT6(pHP13amp-SAV;美國專利No.6,255,076),并通過TBE緩沖液中的0.8%瓊脂糖電泳分析，使用QIAQUICK⑧凝膠提取試劑盒純化約6438bp的載體片段。用S力I和&cl消化質(zhì)粒pNBT52,并通過TBE緩沖液中0.8%的瓊脂糖電泳分析，并且^f吏用QIAQUICK⑧凝膠提取試劑盒純化約727bp的攜帶P短共有amyQ/PcryIIIA/cryIIIAstab串聯(lián)啟動子的片段。如上所述連接pNBT6載體片段和P短共有呵q/Pc,.ymA/cryIIIAstab片段，并如上所述用連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a,在37。C在2XYT氨千青霉素平板上選擇氨千青霉素抗性。使用QIAPREP8小型制備試劑盒(QIAGEN,Valencia,CA,USA)，從幾個轉(zhuǎn)化體分離質(zhì)粒DNA，用尸vwll消化，并通過TBE緩沖液中的0.8%瓊脂糖電泳分析。將具有期望的約4903bp、1320bp和942bp的限制性片段的一個質(zhì)粒命名為pNBT53(pHP13amp-P短共有呵Q/PcrymA/crylIIAstab/SAV)(圖8)。質(zhì)粒。NBT54。用和5amHI消化質(zhì)粒pNBTl(pDG268MCS;美國專利No.6,255,076)，并通過TBE緩沖液中的0.8%瓊脂糖電泳分析，使用QIAQUICK⑧凝膠提取試劑盒純化約6040bp的載體片段。用S/I和5amHI消化質(zhì)粒pNBT53，并通過TBE緩沖液中0.8%的瓊脂糖電泳分析，并且使用QIAQUICK⑧凝膠提取試劑盒純化約1953bp的攜帶P短共有amyQ/PcryfflA/crylIIAstab/SAV盒的片段。如上所述連接pNBTl載體片段和P短共有amyQ/PcrymA/crylIIAstab/SAV片段，并如上所述用連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a,在37。C在2XYT氨千青霉素平板上選擇氨千青霉素抗性。使用QIAPREP8小型制備試劑盒，乂人幾個轉(zhuǎn)化體分離質(zhì)粒DNA,并通過用鄰I和5amHI同時消化，然后是TBE緩沖液中的0.8%瓊脂糖電泳來分析。將具有期望的約6040bp和1953bp的限制性片段的一個質(zhì)粒命名為pNBT54(pDG268MCS-P短共有amyQ/PcrymA/crylIIAstab/SAV)(圖9)。質(zhì)粒pNBT35。用鄰I和5amHI消化質(zhì)粒pNBT2(pDG268MCSA-PrcryiiiA/cryIIIAstab/SAV;美國專利No.6,255,076)，并通過TBE纟爰沖液中的0.8%瓊脂糖電泳分析，使用QIAQUICK⑧凝膠提取試劑盒純化約5394bp的載體片段。用胡I和^amHI消化質(zhì)粒pNBT54，并通過TBE緩沖液中0.8°/。的瓊脂糖電泳分析，并且使用QIAQUICK⑧凝膠提取試劑盒純化約1953bp的攜帶P短共有呵Q/Pcry隱/crylIIAstab/SAV盒的片段。如上所述連接pNBT2載體片段和P^*amyQ/PcrymA/cryinAstab/SAV片段，并如上所述用連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a,在37。C在2XYT氨千青霉素平板上選擇氨千青霉素抗性。使用QIAPREP8小型制備試劑盒，從幾個轉(zhuǎn)化體分離質(zhì)粒DNA，用TVcoI消化，并通過TBE緩沖液中的0.8%瓊脂糖電泳分析。將具有期望的約5492bp和1855bp的限制性片段的一個質(zhì)粒命名為pNBT35(pDG268MCSA-P短共有amyQ/PcrymA/cryIIIAstab/SAV)(圖10)。質(zhì)粒pNBT30。構(gòu)建質(zhì)粒pNBT30，以包含基因啟動子的amyL4199變體的PCR克隆(美國專利No.6,100,063)。根據(jù)Pitcher等，1989，見上文的方法分離地衣芽孢桿菌SJ1904的基因組DNA。使用如下所示的引物950872和991151，通過PCR從地衣芽孢桿菌SJ1卯4的基因組DNA擴增amy丄W卯啟動子(P呵L4199)基因。引物950872并入鄰I限制性位點，而引物并入Sacl限制性位點和PamyL4199的變體核苷酸。引物950872:5'-CCAGGCCTTAAGGGCCGCATGCGTCCTTCTTTGTGCT-3'(SEQIDNO:8)引物991151:5'-GAGCTCCTTTCAATGTGATACATATGA-3'(SEQIDNO:9)根據(jù)制造商的推薦，使用AMPLITAQGoldDNA聚合酶(AppliedBiosystems,FosterCity,CA，USA)進行PCR,只是MgCl2濃度是3mM，而不是標(biāo)準(zhǔn)的1.5mM。擴增反應(yīng)物(50jil)由下述組成10mMTris-HCl(pH8.3),50mMKCl，3.0mMMgCl2，200)iM每種dNTP,0.5(iM每條引物，0.25單位AMPLITAQGoldDNA聚合酶，和約200ng模板DNA。在ROBOCYCLER40溫度循環(huán)儀中進行PCR，程序為95。C9分鐘的1個循環(huán)；95°C1分鐘、55。C1分鐘和72°C1分鐘的30個循環(huán)；和72°C3分鐘的1個循環(huán)。使用TOPOTA克隆試劑盒(Invitrogen,Carlsbad,CA，USA)將得到的約625bp的PCR產(chǎn)物克隆入載體pCR2.1,并根據(jù)制造商的說明轉(zhuǎn)化入ONESHOTTOP10化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞(Invitrogen,Carlsbad,CA，USA)。使用QIAPREP8微型制備試劑盒從幾個轉(zhuǎn)化體分離質(zhì)粒DNA，并通過用五coRI消化，然后是TBE緩沖液中0.8%的瓊脂糖電泳來分析克隆的PCR片段的存在。將一個具有預(yù)期的約3913bp和640bp的限制性片段的質(zhì)粒命名為pNBT30(pCR2.1-amyL4199)(圖11)。通過DNA測序確認(rèn)克隆的PCR片段的DNA序列。質(zhì)粒pNBT31。用S力I和feci消化質(zhì)粒pNBT3(pDG268MCSAneo-PrcryIIIA/cryinAstab/SAV;美國專利No.6,255,076),并通過TBE緩沖液中的0.8%瓊脂糖電泳分析，使用QIAQUICK⑧凝膠提取試劑盒純化約7931bp的載體片段。用S/I和&cI消化質(zhì)粒pNBT30,并通過TBE緩沖液中0.8%的瓊脂糖電泳分析，并且使用QIAQUICK⑧凝膠提取試劑盒純化約612bp的攜帶PamyL4199的片段。如上所述連接pNBT3載體片段和P呵L4，片段，并根據(jù)制造商的說明用連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-Blue細(xì)胞(StratageneCorporation,LaJolla，CA,USA)，在37。C在2XYT氨芐青霉素平板上選擇氨芐青霉素抗性。使用QIAPREP8微型制備試劑盒從幾個轉(zhuǎn)化體分離質(zhì)粒DNA，用AfeI消化，并通過TBE緩沖液中的0.8%瓊脂糖電泳分析。將具有預(yù)期的約6802bp和1741bp的限制性片段的一個質(zhì)粒命名為pNBT31(圖12)。質(zhì)粒pNBT36。用消化質(zhì)粒pNBT35,并使用T4DNA聚合酶和dNTP將末端平端化，如上所述。然后將末端平端化的質(zhì)粒用消化，并通過TBE緩沖液中的0.8%瓊脂糖電泳分析。使用QIAQUICK⑧凝膠提取試劑盒純化約5808bp的載體片段。用DraIII和五co13611消化質(zhì)粒pNBT31,并通過TBE緩沖液中0.8%的瓊脂糖電泳分析，并且使用QIAQUICK⑧凝月交^是取試劑盒純化約2150bp攜帶P呵L4，的片段。如上所述連接pNBT35載體片段和P呵L4！99片段，并根據(jù)制造商的說明用連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌SURE⑧細(xì)胞(StratageneCorporation,LaJolla，CA,USA)，在37。C在2XYT氨千青霉素平板上選擇氨千青霉素抗性。使用QIAPREP8微型制備試劑盒從幾個轉(zhuǎn)化體分離質(zhì)粒DNA,用TVcoI消化，并通過TBE緩沖液中的0.8%瓊脂糖電泳分析。將具有預(yù)期的約515492bp和2466bp的限制性片l殳的一個質(zhì)粒命名為pNBT36(圖13)。質(zhì)粒pMDT100。用和Sacl消化質(zhì)粒pNBT13(pDG268Aneo-Pamyi7PcryiiiA/crylIIAstab/SAV;美國專利No.6,255,076)，并使用QIAQUICK⑧凝膠提取試劑盒純化約6395bp的載體片段。用DraIII和SacI消化質(zhì)粒pNBT36，并通過TBE緩沖液中0.8%的瓊脂糖電泳分析，并且使用QIAQUICK⑧凝膠提取試劑盒純化約28"bp的攜帶P呵L"99/P咖yQ(sc/PcrylIIA三串聯(lián)啟動子的片段。如上所述連接pNBT13載體片段和P呵L4199/P肌yQ(sc/PcrylIIA片段，并如上所述用連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌SURE⑧細(xì)胞，在37。C在2XYT氨芐青霉素平板上選擇氨千青霉素抗性。使用QIAPREP⑧8微型制備試劑盒從幾個轉(zhuǎn)化體分離質(zhì)粒DNA，用^al消化，并通過TBE緩沖液中的0.8%瓊脂糖分析。將具有預(yù)期的約4974bp和4294bp的限制性片段的一個質(zhì)粒命名為pMDT100(圖14)。實施例8:地衣芽孢桿菌M.Blil904IIDNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)將地衣芽孢桿菌M.Blil90411DNA曱基轉(zhuǎn)移酶基因插入枯草芽孢桿菌的染色體中，以在該宿主中表達(dá)DNA曱基轉(zhuǎn)移酶，從而在枯草芽孢桿菌中使DNA甲基化。用和Mwl消化質(zhì)粒pMDT100并通過TBE緩沖液中0.8%的瓊脂片唐電泳分析，并使用QIAQUICK⑧凝膠提取試劑盒純化約8100bp的載體片段。用SacI和WM消化質(zhì)粒pMDT138,并且使用QIAQUICK⑧凝膠提取試劑盒純化約1033bp的攜帶M,Blil904n基因的片段。如上所述連接pMDT100載體片段和M.Blil卯4H基因片段。此連接將M.Blil904H基因置于P呵L"99/P短共有amyQ/P^yiiiA/cryIIIAstab啟動子的下游和apr//轉(zhuǎn)錄終止子的上游。根據(jù)Anagnostopoulos和Spizizen,1961,乂5a"m'o/.81:741-746的方法用連接物轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌168A4，在37。C在TBAB氯霉素平一反上選4奪氯霉素抗性的轉(zhuǎn)化體。在37。C在TBAB新霉素平板上篩選對于新霉素壽l感的抗氯霉素轉(zhuǎn)化體，以確定是否通過雙交換已將DNA插入到枯草芽孢桿菌染色體的am)必基因中。4吏用如下所示的引物994112和999592(其分別在三串聯(lián)啟動子和M.Blil90411DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因中結(jié)合)和如下所示的引物999611和960456(其分別在M.Blil904IIDNA曱基轉(zhuǎn)移酶基因和amy五基因中結(jié)合)，通過PCR確認(rèn)在amy￡基因座存在M.Blil90411DNA甲基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)盒。將在am_y￡基因座包含基因和M.Bli1904IIDNA曱基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)盒的一個這沖羊的轉(zhuǎn)化體，命名為枯草芽孢桿菌MDTIOI。引物994112:5'-GCGGCCGCTCGCTTTCCAATCTGA畫3'(SEQIDNO:10)引物999592:5'-ATCGATCAGCTTGGATAAACCCTA-3'(SEQIDNO:11)引物999611:5'-GAGCTCTGCAAGGAGGTATAATTTTG-3'(SEQIDNO:12)引物960456:5'-CGTCGACGCCTTTGCGGTAGTGGTGCTT-3'(SEQIDNO:13)根據(jù)制造商的說明，使用TaqDNA聚合酶(NewEnglandBiolabs，Inc.,Beverly,MA,USA)進行PCR。擴增反應(yīng)物(50pl)由下述組成10mMTris-HCl(pH8.3)，50mMKCl，3.0mMMgCl2,200每種dNTP，0.5nM每條引物，0.25單位TaqDNA聚合酶，和約200ng基因組DNA。在ROBOCYCLER40溫度循環(huán)儀中進行PCR，程序為95°C2分鐘的1個循環(huán)；95°C2分鐘、55°C2分鐘和72°C2分鐘的30個循環(huán)；和72°C3分鐘的1個循環(huán)。為了證實克隆的M.Blil904IIDNA曱基轉(zhuǎn)移酶能將DNA曱基化，從表達(dá)曱基轉(zhuǎn)移酶的芽孢桿菌屬菌抹分離質(zhì)粒DNA,并測試DNA曱基化。才艮據(jù)Anagnostopoulos和Spizizen,1961,見上文的方法，用質(zhì)粒pCJ791(美國/〉開申請No.20030175902)轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌菌才朱168A4和MDT101,在34。C在TBAB紅霉素/林可霉素平板上選擇紅霉素抗性。使用QIAGENPlasmidMidi試劑盒，從枯草芽孢桿菌168A4和枯草芽孢桿菌MDT101的各一個轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒pCJ791DNA。根據(jù)Xue等，1999，J.M/c油'o/.齒Ws34(3):183-191的方法，通過電穿孔用來自枯草芽孢桿菌MDT101轉(zhuǎn)化體的pCJ791DNA轉(zhuǎn)化地衣芽孢桿菌SJ1904。簡而言之，使用l-5mlLBS培養(yǎng)基中生長的地衣芽孢桿菌的過夜培養(yǎng)液接種50ml新鮮LBS培養(yǎng)基，并在37。C和250rpm培育培養(yǎng)物。培養(yǎng)物生長至靜止期，在緩慢生長期(指數(shù)生長期結(jié)束后1-3小時)后，當(dāng)培養(yǎng)經(jīng)歷生長速率增加時，通過在6500xg離心收獲細(xì)胞。用50ml冰冷的MSG(0.5M甘露醇，0.5M山梨醇，10%甘油)將細(xì)胞洗滌兩次，并重懸于約750piMSG中。如下轉(zhuǎn)化細(xì)胞或?qū)⒓?xì)胞在-2(TC保存。在電極間距為1mm的電穿孔杯中，60^電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞與質(zhì)粒DNA混合，并使用設(shè)置為25nF、200Q和1.0kV的GENEPULSER(Bio-RadLaboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)施力口于電脈沖。然后將電穿孔細(xì)胞轉(zhuǎn)移至包含0.2|iig紅霉素每ml的950piLBSM培養(yǎng)基，誘導(dǎo)紅霉素抗性。在34。C和250rpm將轉(zhuǎn)化體培育2.5-3小時，然后在34。C在TBAB紅霉素/林可霉素平板上選擇紅霉素抗性。使用QIAGEN⑧PlasmidMidi試劑盒從一個地衣芽孢桿菌SJ1904轉(zhuǎn)化體分離質(zhì)粒pCJ791DNA。用4HI并用&cI消化分離自枯草芽孢桿菌168A4、枯草芽孢桿菌MDT101和地衣芽孢桿菌SJ1904的質(zhì)粒pCJ791DNA。質(zhì)粒pCJ791具有12個F做4HI識別位點和三個&cI識別位點。尸"w4HI切割序列GCNGC處的DNA,它能消化來自枯草芽孢桿菌168A4的pCJ791質(zhì)粒DNA,但不能消化來自枯草芽孢桿菌MDT101或地衣芽孢桿菌SJ1卯4的pCJ791質(zhì)粒DNA,說明來自后兩種來源的質(zhì)粒DNA在GCNGC位點甲基化。I切割序列GAGCTC處的DNA,因此不受序列GCNGC甲基化的影響，能切割來自所有三種來源的pCJ791質(zhì)粒DNA。實施例9:地衣芽孢桿菌Blil90411限制性內(nèi)切核酸酶基因的克隆通過PCR克隆地衣芽孢桿菌Blil90411限制性內(nèi)切核酸酶編碼區(qū)。根據(jù)Pitcher等，1989,見上文的方法分離地衣芽孢桿菌SJ1904基因組DNA。圖3顯示地衣芽孢桿菌染色體區(qū)域，其包含編碼Blil90411限制性內(nèi)切核酸酶和M.Blil90411DNA曱基轉(zhuǎn)移酶的基因。使用如下所示的引物060625和060626,通過PCR從地衣芽孢桿菌SJ1904基因組DNA擴增包括Blil90411基因的編碼區(qū)的地衣芽孢桿菌SJ1904染色體的約1158bp片段，其包含SEQIDNO:5的核芬酸443-1588(圖3)。引物060625并入XpI限制性位點，而引物060626并入BamHI限制性位點。引物060625:5'-GGTACCATGTTCTATACTAATCAACC-3'(SEQIDNO:14)引物060626:5'-GGATCCTTATTTGTTTTCATTTTCAA-3'(SEQIDNO:15)使用P/xDNA聚合酶(Irwitrogen,Carlsbad,CA，USA)進行PCR。擴增反應(yīng)物(50pl)由下述組成IX尸/x擴增緩沖液(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)，1.5mMMgS04,300|iM每種dNTP,0.3每條引物，1.25單位PLATINUMP/xDNA聚合酶，和約200ng模板DNA。在ROBOCYCLER40溫度循環(huán)儀中進行反應(yīng)，程序為95。C2分鐘的1個循環(huán)；95°C1分鐘、55。C1分鐘和68。C1分鐘的30個循環(huán)；和68°C3分鐘的1個循環(huán)。使用測序用ZeroBluntTOPOPCR克隆試劑盒(Invitrogen,Carlsbad,CA:USA),將獲得的約1158bp的PCR產(chǎn)物克隆入pCR4Blunt，并才艮據(jù)制造商的說明轉(zhuǎn)化入ONESHOTTOP10化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞。使用QIAGENPlasmidMidi試劑盒從一個轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒DNA,并通過用￡coRI消化，然后是TBE緩沖液中的0.8%瓊脂糖電泳來確認(rèn)，其產(chǎn)生期望的3939bp、897bp和279bp的片段。通過DNA測序確認(rèn)克隆的PCR片段的DNA序列。將這個質(zhì)粒命名為pMDT156(圖15)，并將包含該質(zhì)粒的大腸桿菌TOP10轉(zhuǎn)化體命名為MDT46。根據(jù)布達(dá)佩斯條約的條款于2006年9月7日將MDT46保藏于農(nóng)業(yè)研究機構(gòu)專利培養(yǎng)物保藏中心北區(qū)研究中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection,NorthernRegionalResearchCenter),1815UniversityStreet,Peoria,Illinois,61604,并給予登錄號NRRLB-41968。實施例10:構(gòu)建地衣芽孢桿菌Blil90411限制性內(nèi)切核酸酶基因的缺失型通過PCR構(gòu)建地衣芽孢桿菌B1U904II限制性內(nèi)切核酸酶的缺失型，以允許地衣芽孢桿菌中天然基因的缺失。根據(jù)Pitcher等，1989,見上文的方法，從地衣芽孢桿菌SJ1卯4分離基因組DNA,通過PCR從Blil904H染色體基因座擴增兩個片段。使用如下所述的引物999592和999593,通過PCR從地衣芽孢桿菌SJ1904基因組DNA擴增地衣芽孢桿菌SJ1904染色體中Blil904II基因上游約505bp的片H其中包含SEQIDNO:5的核苷酸1616-2102。引物999592并入C7aI限制性位點。引物999592:5'-ATCGATCAGCTTGGATAAACCCTA-3'(SEQIDNO:16)引物999593:5'-TTCACAAGATCTATTTCTTCTTTCAGACCC-3'(SEQIDNO:17)使用PLATINUM尸/xDNA聚合酶，如實施例6中所述進行PCR。4吏用引物999594和999595，乂人地衣芽孢桿菌SJ1卯4基因組DNA擴增包括Blil90411基因的最后42個密碼子加下游DNA的地衣芽《包桿菌SJ190455染色體的約507bp片段，其包含SEQIDNO:5的核苷酸l-487。引物999594并入7VwI限制性位點。引物9995945'-AGAAATAGATCTTGTGAAATGGGTTCTTAT誦3'(SEQIDNO:18)引物999595:5'-GCGGCCGCTCATGTTCCCATATTCTT畫3'(SEQIDNO:19)使用PLATINUM尸々DNA聚合酶，如實施例6中所述進行PCR，除了MgS04濃度為1.5mM。末端。因此，兩個擴增物具有互補的末端，允許兩個PCR片段的融合，如下所述。根據(jù)制造商的說明，使用QIAQUICK⑧PCR純化試劑盒(QIAGENInc.，Valencia,CA,USA)從兩個擴增物去除引物。使用兩個擴增物作為第三次PCR的模板DNA,使用引物999592和999595，通過引物999593和999594序列提供的互補末端將兩個片段融合。使用PLATINUM/^DNA聚合酶，如實施例6中所述進行PCR，只是模板DNA由各2|il的兩個擴增物組成。使用QIAQUICK⑧凝膠提取試劑盒純化得到的約994bpPCR產(chǎn)物，并使用測序用ZeroBluntTOPOPCR克隆試劑盒將其克隆入載體pCR4Blunt,并如實施例6中所述轉(zhuǎn)化入ONESHOTTOP10化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞。使用BIOROBOT9600(QIAGENInc.,Valencia,CA，USA)從幾個轉(zhuǎn)化體純化質(zhì)粒DNA,并通過用五coRI和M3rt消化，然后是TBE緩沖液中的0.8%瓊脂糖電泳來測試克隆的PCR片段的存在和方向。將一個五coRI片段為約3939bp和1012bp和A^I片段為約M31bp的質(zhì)粒命名為pMDTlM(圖l6),并將通過DNA測序驗證克隆的PCR片段的DNA序列。實施例11:構(gòu)建地衣芽孢桿菌Blil90411限制性內(nèi)切核酸酶基因缺失質(zhì)粒構(gòu)建溫度敏感型質(zhì)粒，以允許地衣芽孢桿菌中的BU1904II限制性內(nèi)切核酸酶基因的缺失。構(gòu)建質(zhì)粒pMDT131，以產(chǎn)生可賦予氯霉素抗性的溫度敏感型質(zhì)粒。用EcoRI消化質(zhì)粒pMRT074(美國公開申請2003/0175902)，然后用T4DNA聚合酶加dNTP處理以產(chǎn)生平末端，如實施例7中所述。然后用iVod消化質(zhì)粒，通過TBE緩沖液中的0.8。/。瓊脂糖電泳分析，并使用QIAQUICK⑧凝膠提取試劑盒純化約4355bp的載體片段。用五co47HI和消化質(zhì)粒pNBTl，通過TBE緩沖液中的0.8%瓊脂糖電泳分析，并使用QIAQUICK⑧凝膠提取試劑盒純化約1222bp的攜帶caf基因和多克隆位點的片段。使用T4DNA連接酶，如上所述連接pMRT074載體片段和pNBTlcaf片段，并根據(jù)Anagnostopoulos和Spizizen,1961,見上文的方法，用連接物轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌168A4,在34。C在TBAB氯霉素平板上選擇氯霉素抗性。使用QIAGENPlasmidMidi試劑盒從一個轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒DNA，并通過用BamHI消化，然后是TBE緩沖液中的0.8%瓊脂糖電泳來確認(rèn)，其可產(chǎn)生期望的約3779bp和1802bp的片段。將得到的質(zhì)粒命名為pMDTBl(圖H)。構(gòu)建質(zhì)粒pMDT139,以產(chǎn)生適合從地衣芽孢桿菌染色體缺失Blil90411基因的質(zhì)粒。根據(jù)制造商的說明，用質(zhì)粒pMDT134轉(zhuǎn)化大腸桿菌SCS110(StratageneCorporation,LaJolla，CA，USA)，其對于DNA曱基轉(zhuǎn)移酶Dam是缺陷的，在37i:在2XYT氨千青霉素平板上選擇氨千青霉素抗性。使用QIAGENPlasmidMidi試劑盒從一個轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒DNA,得到能用C7al(在一定程度上受Dam曱基化抑制)消化的pMDT134質(zhì)粒DNA。用C/al和A^fl消化質(zhì)粒pMDT134DNA，并通過TBE緩沖液中的0.8%瓊脂糖電泳分析，并使用QIAQUICK⑧凝膠提取試劑盒純化攜帶缺失的Blil904II基因的約986bp片段。用C/al和消化質(zhì)粒pMDT131,并通過TBE緩沖液中的0.8%瓊脂糖電泳分析，并使用QIAQUICK⑧凝膠提取試劑盒純化約5569bp的載體片段。使用T4DNA連接酶，如上所述，連接pMDT131載體片段和缺失的Blil904II基因片段，并根據(jù)Anagnostopoulos和Spizizen,1961,見上文的方法，用連接物轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌168A4，在34。C在TBAB氯霉素平板上選擇氯霉素抗性。使用QIAGENPlasmidMidi試劑盒從一個轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒DNA，并通過用消化而確認(rèn)，其得到期望的約4334bp和2220bp的片段。將得到的質(zhì)粒命名為pMDT139(圖18)。實施例12:地衣芽孢桿菌SJ1904中Blil904II基因的缺失從地衣芽孢桿菌SJ1904的染色體缺失地衣芽孢桿菌Blil90411限制性內(nèi)切核酸酶基因，以測試對將DNA導(dǎo)入地衣芽孢桿菌的作用。如下從地衣芽孢桿菌SJ1904的染色體缺失Blil90411基因。根據(jù)Xue等,1999,見上文的方法，如實施例8中所述，通過電穿孔用質(zhì)粒pMDT139轉(zhuǎn)化地衣芽孢桿菌SJ1904。在34。C和250rpm培育轉(zhuǎn)化體2.5-3小時，然后在34。C在TBAB紅霉素/林可霉素平板上選擇紅霉素抗性。在50。C使一個這樣的轉(zhuǎn)化體在帶有紅霉素選擇的TBAB平板上生長，以選擇在Blil90411基因座pMDT139整合入染色體的整合物。然后在無選擇的條件下在34。C使一個這樣的整合體在VY培養(yǎng)基中生長，以允許整合質(zhì)粒的切除和丟失。在37。C將培養(yǎng)物涂布在LB平板上，測試菌落對紅霉素的敏感性，說明質(zhì)粒的丟失。如下使用EXTRACT-N-AMPtm植物PCR試劑盒(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO，USA),用引物999592和999595(如上所述)，通過PCR測試幾個紅霉素敏感的克隆。通過將菌落懸浮于來自試劑盒的50(il提取溶液并在95。C溫育10分鐘而裂解地衣芽孢桿菌細(xì)胞。然后每個裂解懸浮液與50)Lil來自試劑盒的稀釋溶液混合，根據(jù)制造商的說明，在PCR中各使用4(iL將一個克隆命名為地衣芽孢桿菌MDT269，所述克隆中PCR擴增得到約994bp的片段，說明Blil卯4II基因從染色體上缺失。實施例13:地衣芽孢桿菌SJ1904和MDT269的轉(zhuǎn)化進行轉(zhuǎn)化實驗，以確定Blil90411限制性內(nèi)切核酸酶和曱基轉(zhuǎn)移酶M.Blil90411對將DNA導(dǎo)入地衣芽孢桿菌的影響。如實施例8中所述，從枯草芽孢桿菌168A4、枯草芽孢桿菌MDT101和地衣芽孢桿菌SJ1904的轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒pCJ791。如實施例8中所述制備地衣芽孢桿菌菌抹SJ1904和MDT269的電感受態(tài)細(xì)胞。用分離自三種芽孢桿菌來源的pCJ791質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化兩種地衣芽孢桿菌菌抹。對于每個轉(zhuǎn)化，在電才及間3巨為1mm的電轉(zhuǎn)化杯中，用200ng質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化60電感受態(tài)細(xì)胞，其中使用GENEPULSER,設(shè)定為25pF、200Q和1.0kV。轉(zhuǎn)化一式三份(intriplicate)進行。轉(zhuǎn)化結(jié)果示于表1。用來自枯草芽孢桿菌168A4(不表達(dá)曱基轉(zhuǎn)移酶M.BU1904II)的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化地衣芽孢桿菌SJ1904(具有野生型Blil90411限制性內(nèi)切核酸酶基因)時，得到很低的轉(zhuǎn)化頻率。然而，用由曱基轉(zhuǎn)移酶M.Blil90411(來自枯草芽孢桿菌MDTIOI或地衣芽孢桿菌SJ1904)曱基化的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化地衣芽孢桿菌SJ1904時，得到高的轉(zhuǎn)化效率。此外，在用來自三種來源任一個的質(zhì)粒DNA(無論是否被甲基轉(zhuǎn)移酶M.Bli190411曱基化)轉(zhuǎn)化地衣芽孢桿菌MDT269(缺失Blil90411限制性內(nèi)切核酸酶基因)時，獲得了高的轉(zhuǎn)化效率。結(jié)果顯示，通過/A^達(dá)M,Bli190411DNA曱基轉(zhuǎn)移酶的宿主菌抹分離質(zhì)粒DNA(這修飾了質(zhì)粒DNA)，或者通過缺失受體地衣芽孢桿菌菌抹中的Blil90411限制性內(nèi)切核酸酶基因，可以顯著改進地衣芽孢桿菌通過用質(zhì)粒DNA電穿孔的轉(zhuǎn)化。表1.用分離自枯草芽孢桿菌168A4、枯草芽孢桿菌MDT101和地衣芽孢桿菌SJ1904的pCJ791質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化地衣芽孢桿菌SJ1904。1轉(zhuǎn)化頻率是三次重復(fù)的平均值士標(biāo)準(zhǔn)偏差。地衣芽孢桿菌菌抹pCJ791DNA的來源轉(zhuǎn)化體每嗎DNA1地衣芽孢桿菌SJ1904(野生型Blil9(MII基因)枯草芽孢桿菌168A4(無甲基轉(zhuǎn)移酶M.Bli1904H基因)17±15枯草芽孢桿菌MDTIOI(克隆的曱基轉(zhuǎn)移酶M.Blil904II基因)1.6xl04±8.3xl03地衣芽孢桿菌SJ1904(天然的曱基轉(zhuǎn)移酶M.Blil904II基因)1.2><104±5.7xl03地衣芽孢桿菌MDT269(缺失Blil904II基因)枯草芽孢桿菌168A4(無曱基轉(zhuǎn)移酶M.Bli190411基因)6.4xl03±9.6xl02枯草芽孢桿菌MDTIOI(克隆的曱基轉(zhuǎn)移酶M.Blil904II基因)7.2xl03±2.1xl03地衣芽孢桿菌SJ1904(天然的甲基轉(zhuǎn)移酶M,Bli190411基因)4.1xio3±5.8xl02實施例14:用體外曱基化的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化地衣芽孢桿菌根據(jù)Alegre等，2004,F五MSM/cra6/ofogy丄e/fera241:73-77的方法制備地衣芽孢桿菌SJ1904的無細(xì)胞提取物(CFE)。如Alegre等，2004,見上文所述，通過用CFE和S-腺苦曱硫氨酸(SAM)處理，將分離自枯草芽孢桿菌168A4的質(zhì)粒pCJ791曱基化。此外，進行對照實驗，其中CFE以用于制備CFE的緩沖液替代。處理后，用酚和氯仿4是取DNA，用異丙醇沉淀，并重懸于20^水中。然后如實施例8中所述，使用200ngpCJ791質(zhì)粒DNA,或者如上所述處理或者未處理，通過電穿孔轉(zhuǎn)化地衣芽孢桿菌SJ1904。轉(zhuǎn)化一式三份進行。轉(zhuǎn)化結(jié)果示于表2。用已經(jīng)由CFE加SAM處理的質(zhì)粒DNA進行轉(zhuǎn)化得到的轉(zhuǎn)化頻率是用未處理的質(zhì)粒DNA或僅用SAM處理的質(zhì)粒DNA進行轉(zhuǎn)化的100倍以上。這些結(jié)果證實質(zhì)粒DNA的體外曱基化改進了地衣芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化。表2.用體外曱基化的pCJ791質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化地衣芽孢桿菌SJ1904。質(zhì)粒DNA分離自枯草芽孢桿菌168A4。1轉(zhuǎn)化頻率是三次重復(fù)的平均值士標(biāo)準(zhǔn)偏差。<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>實施例15:地衣芽孢桿菌限制-修飾系統(tǒng)對枯草芽孢桿菌中接合質(zhì)粒轉(zhuǎn)移(conjugalplasmidtransfer)的影響使用質(zhì)粒pCJ791測試了地衣芽孢桿菌限制-修飾系統(tǒng)對接合質(zhì)粒轉(zhuǎn)移的影響，所述質(zhì)粒由于存在轉(zhuǎn)移起點on丁，可以通過接合從合適的供體細(xì)胞轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞。一個這樣的合適接合供體菌抹是枯草芽孢桿菌PP289-5(WO96/029418),其在編碼D-丙氨酸消旋酶的w/(d"/)基因中具有缺失，并包含質(zhì)粒pBC16(賦予四環(huán)素抗性)和pLS20，其可賦予4吏含on丁質(zhì)粒移動的能力。根據(jù)Anagnostopoulos和Spizizen，1961,見上文的方法，用分離自枯草芽孢桿菌MDT101的基因組DNA轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌PP289-5，在37。C在TY氯霉素平板上選擇氯霉素抗性。將一個這樣的轉(zhuǎn)化體(其在a/w)必基因座包含c加基因和M.Blil90411DNA曱基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)盒)命名為枯草芽孢桿菌AEB71L根據(jù)Anagnostopoulos和Spizizen,1961,見上文的方法，用質(zhì)粒pCJ791轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌PP289-5和AEB711,在34。C在TBAB紅霉素/林可霉素平板上選擇紅霉素抗性。將一個PP289-5轉(zhuǎn)化體命名為枯草芽孢桿菌MDT104,并將一個AEB711轉(zhuǎn)化體命名為枯草芽孢桿菌MDT105。通過接合，使用枯草芽孢桿菌供體菌株MDT104和MDT105將質(zhì)粒pCJ791轉(zhuǎn)移至地衣芽孢桿菌受體菌才朱SJ1904和MDT269。地衣芽孢桿菌SJ1904和MDT269在LBPG平板上在30。C生長過夜。地衣芽孢桿菌MDT104和MDT105在包含每ml100jigD-丙氨酸、10嗎四環(huán)素和5嗎紅霉素的LBPG平板上在30。C生長過夜。然后將每個菌抹的細(xì)胞重懸于TY培養(yǎng)基中，并測定450nm處的光密度(OD)。根據(jù)OD,使用00450為50的100(il細(xì)胞懸浮液的等同物，將等量的一抹供體菌株和一抹受體菌抹混合。將混合物涂布在含100jigD-丙氨酸每ml的LB平板上并在30。C溫育。在這些條件下，供體和受體菌抹都能生長，并且可以通過接合將質(zhì)粒pCJ791從供體轉(zhuǎn)移至受體。在溫育6小時后，細(xì)胞懸浮與lmlTY培養(yǎng)基中，將等分試樣涂布于包含2嗎紅霉素每ml的TY平板上，并將平板在30。C培育過夜。在這些條件下，只有地衣芽孢桿菌轉(zhuǎn)移接合子(transconjugant)(已經(jīng)通過接合轉(zhuǎn)移接受了質(zhì)粒pCJ791的受體細(xì)胞)能生長。缺乏D-丙氨酸使aW-陰性供體不能生長，而存在紅霉素使原始受體不能生長。對于供體和受體菌抹的四種不同組合，比較了每次接合得到的轉(zhuǎn)移接合子的數(shù)目。接合結(jié)果示于表3。當(dāng)使用枯草芽孢桿菌MDT104(不包含M.Blil90411DNA甲基轉(zhuǎn)移酶)作為供體，地衣芽孢桿菌SJ1904(具有野生型Blil904II限制性內(nèi)切核酸酶基因)作為受體時，獲得低的接合頻率。然而，當(dāng)使用枯草芽孢桿菌MDT105(表達(dá)M.Bli190411DNA曱基轉(zhuǎn)移酶)作為供體(無論哪種受體)或者當(dāng)使用地衣芽孢桿菌MDT269(缺失Blil90411限制性內(nèi)切核酸酶基因)作為受體(無論哪種供體)時，獲得高的接合頻率。結(jié)果顯示，通過使用表達(dá)M.Blil90411DNA曱基轉(zhuǎn)移酶的供體菌抹(這修飾了質(zhì)粒DNA),或者通過缺失受體地衣芽孢桿菌菌抹中的Blil90411限制性內(nèi)切核酸酶基因，顯著改進了地衣芽孢桿菌的接合。表3.將質(zhì)粒pCJ791從枯草芽孢桿菌供體菌株MDT104和MDT105接合轉(zhuǎn)移至地衣芽^^桿菌菌才朱SJ1904和MDT269。列出了三次獨立實-驗A、B和C中每次的轉(zhuǎn)移接合子數(shù)目。地衣芽孢桿菌受體菌抹枯草芽孢桿菌供體菌抹每次實驗的轉(zhuǎn)移接合子地衣芽孢桿菌SJ1904枯草芽孢桿菌MDT104A3300(野生型Bli190411限制性內(nèi)(無M.Bli1904IIDNA曱基轉(zhuǎn)B1730切核酸酶基因)移酶基因)C380枯草芽孢桿菌MDT105A500,000(克隆的M.Blil卯4HDNA甲B970,000基轉(zhuǎn)移酶基因)C153,000地衣芽孢桿菌MDT269枯草芽孢桿菌MDT104A516,000(缺失Bli1904II限制性內(nèi)切(無M.Bli190411DNA曱基轉(zhuǎn)B1,170,000核酸酶基因)移酶基因)C152,000枯草芽孢桿菌MDT105A957,000(克隆的M,Bli190411DNA曱B1,700,000基轉(zhuǎn)移酶基因)C1,350,00061生物材料的保藏依據(jù)布達(dá)佩斯條約的條款，下述的生物材料已經(jīng)保藏于農(nóng)業(yè)研究機構(gòu)專利培養(yǎng)物保藏中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection),北區(qū)研究中心(NorthernRegionalResearchCenter),1815UniversityStreet,Peoria,Illinois,61604，并給出了下述的登錄號保藏物登錄號保藏日期大腸桿菌MDT45(pMDT138)NRRLB-419672006年9月7曰大腸桿菌MDT46(pMDT156)NRRLB-419682006年9月7日所述菌抹于下述條件下保藏確保在本專利申請未決期間，由專利與商標(biāo)委員依據(jù)37C.F.R.§1.14和35U.S.C.§122授權(quán)的人能夠獲得該培養(yǎng)物。該保藏物為所保藏菌抹的基本上純的培養(yǎng)物。在提交了該申請的副本，或其后續(xù)文本的國家，依據(jù)該外國專利法律的要求，可以獲得該保藏物。然而，應(yīng)當(dāng)理解，保藏物的可用性并不構(gòu)成對實施本發(fā)明的許可，實施本發(fā)明是對政府行為所授予的專利權(quán)的侵犯。本文描述的和要求保護的發(fā)明并不局限于本文所公開的具體實施方案的范圍內(nèi)，因為這些實施方案意欲作為本發(fā)明幾個方面的說明。任何等同的實施方案意欲在本發(fā)明的范圍內(nèi)。事實上，從前面的說明中，除本文所顯示和描述的之外，本發(fā)明的多種修改對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的。這些修改也意欲落入所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。在沖突的情況下，以包括定義的本公開為準(zhǔn)。本文引用了許多參考文獻(xiàn)，其公開的內(nèi)容通過提述以其整體并入。權(quán)利要求1.選自下組的分離的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(a)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，其包含與SEQIDNO2的氨基酸1至381具有優(yōu)選至少60％，更優(yōu)選至少65％，更優(yōu)選至少70％，更優(yōu)選至少75％，更優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少85％，甚至更優(yōu)選至少90％，最優(yōu)選至少95％，和甚至最優(yōu)選至少97％序列同一性的氨基酸序列；(b)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，其由包含與SEQIDNO1的核苷酸1至1143具有優(yōu)選至少60％，更優(yōu)選至少65％，更優(yōu)選至少70％，更優(yōu)選至少75％，更優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少85％，甚至更優(yōu)選至少90％，最優(yōu)選至少95％，和甚至最優(yōu)選至少97％序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸編碼；(c)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，其由在優(yōu)選至少中嚴(yán)緊條件下，更優(yōu)選至少中-高嚴(yán)緊條件下，和最優(yōu)選至少高嚴(yán)緊條件下，與SEQIDNO1的核苷酸1至1143或其全長互補鏈雜交的多核苷酸編碼；和(d)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的變體，包含取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQIDNO2的氨基酸1至381。2.權(quán)利要求1的DNA曱基轉(zhuǎn)移酶，其包含如下或由如下組成SEQIDNO:2的氨基酸1至381，或其具有DNA曱基轉(zhuǎn)移酶活性的片段。3.權(quán)利要求1的DNA曱基轉(zhuǎn)移酶，其由包含如下或由如下組成的多核芬酸編碼SEQIDNO:1的核苷酸l至1143,或其編碼具有DNA曱基轉(zhuǎn)移酶活性的片段的亞序列。4.權(quán)利要求1的DNA曱基轉(zhuǎn)移酶，其由包含于大腸桿菌NRRLB-41967中的質(zhì)粒pMDT138所包含的多核苷酸編碼。5.編碼權(quán)利要求1-4中任一項的DNA曱基轉(zhuǎn)移酶的分離的多核苷酸。6.包含權(quán)利要求5的多核苷酸的核酸構(gòu)建體或重組表達(dá)載體，所述多核苷酸與在表達(dá)宿主中指導(dǎo)多肽產(chǎn)生的一個或多個調(diào)控序列可操作連接。7.包含權(quán)利要求5的多核苷酸的重組宿主細(xì)胞。8.產(chǎn)生DNA曱基轉(zhuǎn)移酶的方法，其包括(a)在有益于產(chǎn)生DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求7的重組宿主細(xì)胞；和(b)回收所述的DNA曱基轉(zhuǎn)移酶。9.選自下組的分離的限制性內(nèi)切核酸酶(a)多肽，其包含與SEQIDNO:4的氨基酸1至337具有優(yōu)選至少60%,更優(yōu)選至少65°/。，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%,更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，甚至更優(yōu)選至少90°/。，最優(yōu)選至少95%,和甚至最優(yōu)選至少97%序列同一性的氨基酸序列；(b)多肽，其由包含與SEQIDNO:3的核香酸1至1011具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%,更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%,更優(yōu)選至少80%,更優(yōu)選至少85%,甚至更優(yōu)選至少90%,最優(yōu)選至少95%，和甚至最優(yōu)選至少97%序列同一性的核苦酸序列的多核苷酸編碼；(c)多肽，其由在優(yōu)選至少中嚴(yán)緊條件下，更優(yōu)選至少中-高嚴(yán)緊條件下，和最優(yōu)選至少高嚴(yán)緊條件下，與SEQIDNO:3的核苷酸1至1011或其全長互補鏈雜交的多核苷酸編碼；和(d)變體，包含取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQIDNO:4的氨基酸1至337。10.權(quán)利要求9的限制性內(nèi)切核酸酶，其包含如下或由如下組成SEQIDNO:2的氨基酸1至381，或其具有限制性內(nèi)切核酸酶活性的片段。11.權(quán)利要求9的限制性內(nèi)切核酸酶，其由包含如下或由如下組成的多核苷酸編碼SEQIDNO:1的核苷酸1至1143,或其編碼具有限制性內(nèi)切核酸酶活性的片段的亞序列。12.權(quán)利要求9的限制性內(nèi)切核酸酶，其由包含于大腸桿菌NRRLB-41968中的質(zhì)粒pMDT156包含的多核苷酸編碼。13.編碼權(quán)利要求9-12中任一項的限制性內(nèi)切核酸酶的分離的多核苷酸。14.包含權(quán)利要求13的多核苷酸的核酸構(gòu)建體或重組表達(dá)載體，其與在表達(dá)宿主中指導(dǎo)多肽產(chǎn)生的一個或多個調(diào)控序列可才喿作連接。15.包含權(quán)利要求13的多核苷酸的重組宿主細(xì)胞。16.產(chǎn)生限制性內(nèi)切核酸酶的方法，其包括(a)在有益于產(chǎn)生限制性內(nèi)切核酸酶的條件下培養(yǎng)包含權(quán)利要求13的多核苷酸的重組宿主細(xì)胞；和(b)回收所述限制性內(nèi)切核酸酶。17.產(chǎn)生細(xì)菌轉(zhuǎn)化體的方法，其包括(a)將DNA導(dǎo)入第一細(xì)菌宿主細(xì)胞，所述細(xì)胞包含權(quán)利要求5的編碼DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的多核苷酸，以產(chǎn)生甲基化的DNA;其中所述DNA曱基轉(zhuǎn)移酶與SEQIDNO:2的氨基酸1至381的DNA曱基轉(zhuǎn)移酶具有相同的特異性；和(b)將來自第一細(xì)菌宿主細(xì)胞的甲基化DNA轉(zhuǎn)移入第二細(xì)菌宿主細(xì)胞，其中所述第二細(xì)菌宿主細(xì)胞包含能降解DNA但不能降解曱基化DNA的限制性內(nèi)切核酸酶；和(c)分離包含曱基化DNA的第二細(xì)菌宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化體。18.通過權(quán)利要求17的方法獲得的轉(zhuǎn)化體。19.產(chǎn)生細(xì)菌轉(zhuǎn)化體的方法，其包括(a)用權(quán)利要求1-4中任一項的DNA曱基轉(zhuǎn)移酶將DNA體外曱基化，以產(chǎn)生曱基化DNA;其中所述DNA曱基轉(zhuǎn)移酶與SEQIDNO:2的氨基酸1至381的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶有相同的特異性；(b)將曱基化DNA導(dǎo)入細(xì)菌宿主細(xì)胞，其中細(xì)菌宿主細(xì)胞包含能降解DNA但不能降解甲基化DNA的限制性內(nèi)切核酸酶；和(c)分離包含曱基化DNA的細(xì)菌宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化體。20.通過權(quán)利要求19的方法獲得的轉(zhuǎn)化體。21.產(chǎn)生細(xì)菌轉(zhuǎn)化體的方法，其包括(a)將DNA導(dǎo)入細(xì)菌宿主細(xì)胞中，所述細(xì)胞包含編碼限制性內(nèi)切核酸酶的權(quán)利要求13的多核苷酸，所述多核苷酸是失活的；其中限制性內(nèi)切核酸酶與SEQIDNO:4的氨基酸1至337的限制性內(nèi)切核酸酶有相同的特異性；和其中編碼限制性內(nèi)切核酸酶的多核苷酸的失活使導(dǎo)入的DNA不被限制性內(nèi)切核酸酶消化，且無需在將DNA導(dǎo)入細(xì)菌宿主細(xì)胞前用DNA曱基轉(zhuǎn)移酶將DNA曱基化；和(b)分離包含所述DNA的細(xì)菌宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化體。22.通過權(quán)利要求21的方法獲得的轉(zhuǎn)化體。23,產(chǎn)生具有生物活姓的多肽的方法，其包括(a)在有益于產(chǎn)生所述多肽的條件下培養(yǎng)細(xì)菌宿主細(xì)胞，所述細(xì)胞包含導(dǎo)入的編碼具有生物活性的多肽或與該多肽表達(dá)有關(guān)的DNA;其中在將DNA導(dǎo)入細(xì)菌宿主細(xì)胞之前通過權(quán)利要求1-4中任一項的DNA曱基轉(zhuǎn)移酶將DNA曱基化；其中DNA曱基轉(zhuǎn)移酶與SEQIDNO:2的氨基酸1至381的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶有相同的特異性，而且對于細(xì)菌宿主細(xì)胞是天然的或外源的；和其中曱基化防止導(dǎo)入的DNA被所述細(xì)菌宿主細(xì)胞的限制性內(nèi)切核酸酶消化；和(b)回收所述具有生物活性的多肽。24.產(chǎn)生有生物活性的多肽的方法，其包括(a)在有益于產(chǎn)生所述多肽的條件下培養(yǎng)細(xì)菌宿主細(xì)胞，所述細(xì)胞包含導(dǎo)入的編碼具有生物活性的多肽或與該多肽表達(dá)有關(guān)的DNA;其中細(xì)菌宿主細(xì)胞包含權(quán)利要求13的編碼限制性內(nèi)切核酸酶的多肽，所述多肽是失活的；其中限制性內(nèi)切核酸酶與SEQIDNO:4的氨基酸l至337的限制性內(nèi)切核酸酶有相同的特異性，和其中編碼限制性內(nèi)切核酸酶的多肽的失活防止導(dǎo)入的DNA,皮所述限制性內(nèi)切核酸酶消化，且無需在將DNA導(dǎo)入細(xì)菌宿主細(xì)胞前用DNA曱基轉(zhuǎn)移酶將DNA曱基化；和(b)回收所述具有生物活性的多肽。25.產(chǎn)生親本細(xì)菌細(xì)胞的突變體的方法，其包括(a)向親本細(xì)菌細(xì)胞中導(dǎo)入包含核酸構(gòu)建體的DNA，以使親本細(xì)菌細(xì)胞中編碼多肽的基因失活，這產(chǎn)生與在相同條件下培養(yǎng)時的親本細(xì)胞相比產(chǎn)生較少的所述多肽的突變體細(xì)胞；其中在將DNA導(dǎo)入細(xì)菌宿主細(xì)胞前，通過權(quán)利要求1-4中任一項的DNA曱基轉(zhuǎn)移酶將DNA曱基化；其中所述DNA甲基轉(zhuǎn)移酶與SEQIDNO:2的氨基酸1至381的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶有相同的特異性；和其中曱基化防止導(dǎo)入的DNA^皮親本細(xì)菌細(xì)胞的限制性內(nèi)切核酸酶消化；和(b)分離所述突變體細(xì)胞。26.通過權(quán)利要求25的方法獲得的突變體細(xì)菌細(xì)胞。27.權(quán)利要求26的突變體細(xì)胞，其進一步包含編碼天然或異源蛋白質(zhì)的基因。28.產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法，其包括(a)在有益于所述蛋白質(zhì)產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求27的突變體細(xì)胞；和(b)回收所述蛋白質(zhì)。29.產(chǎn)生親本細(xì)菌細(xì)胞的突變體的方法，其包括(a)向親本細(xì)菌細(xì)胞中導(dǎo)入包含核酸構(gòu)建體的DNA,以使親本細(xì)菌細(xì)胞中編碼多肽的基因失活，這產(chǎn)生與在相同條件下培養(yǎng)時的親本細(xì)胞相比產(chǎn)生較少的所述多肽的突變體細(xì)胞；其中親本細(xì)菌宿主細(xì)胞包含權(quán)利要求13的編碼限制性內(nèi)切核酸酶的多核苷酸，所述多核苷酸是失活的；其中所述限制性內(nèi)切核酸酶與SEQIDNO:4的氨基酸1至337的限制性內(nèi)切核酸酶有相同的特異性；和其中編碼限制性內(nèi)切核酸酶的多核苷酸的失活防止導(dǎo)入的DNA被限制性內(nèi)切核酸酶消化，且無需在將DNA導(dǎo)入親本細(xì)菌細(xì)胞前用DNA曱基轉(zhuǎn)移酶將DNA曱基化；和(b)分離所述突變體細(xì)胞。30.通過權(quán)利要求29的方法獲得的突變體細(xì)菌細(xì)胞。31.權(quán)利要求30的突變體細(xì)胞，其還包含編碼天然或異源蛋白質(zhì)的基因。32.產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法，其包括(a)在有益于所述蛋白質(zhì)產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求31的突變體細(xì)胞；和(b)回收所述蛋白質(zhì)。全文摘要本發(fā)明涉及改進向細(xì)菌宿主細(xì)胞中導(dǎo)入DNA的方法。文檔編號C12N9/10GK101595214SQ200780050643公開日2009年12月2日申請日期2007年11月29日優(yōu)先權(quán)日2006年11月29日發(fā)明者邁克爾·托馬斯,邁克爾·雷伊申請人:諾維信股份有限公司