一種基于氫核磁共振測定達(dá)托霉素純度的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于氫核磁共振測定達(dá)托霉素純度的方法，步驟如下：(1)測定達(dá)托霉素及內(nèi)標(biāo)物定量目標(biāo)峰在氘代試劑中的縱向弛豫時間(T1)；(2)根據(jù)所測定的T1值設(shè)置核磁共振波普儀的傾倒角和弛豫延遲時間(d1)；(3)根據(jù)步驟(2)中所設(shè)定的參數(shù)測定達(dá)托霉素樣品及內(nèi)標(biāo)物中各定量目標(biāo)峰的積分面積，得出達(dá)托霉素相對于內(nèi)標(biāo)物的摩爾質(zhì)量比；(4)根據(jù)內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量，計(jì)算達(dá)托霉素的純度，根據(jù)以下的公式計(jì)算其純度；W％＝(mIS×HIS×AS×MS×100％)/(MIS×AIS×mS×HS)。本方法具有重復(fù)性好、操作簡便的特點(diǎn)，能夠快速、準(zhǔn)確的檢測達(dá)托霉素的純度，為嚴(yán)格控制達(dá)托霉素的純度提供了新的方法。
【專利說明】
一種基于氫核磁共振測定達(dá)托霉素純度的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于分析技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于氫核磁共振測定達(dá)托霉素純度的方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 達(dá)托霉素為玫瑰孢鏈霉菌產(chǎn)生的環(huán)酯肽類抗生素，具有新穎的化學(xué)結(jié)構(gòu)，如下：
[0004] 其主要通過擾亂細(xì)胞膜對氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)，阻礙細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖的合成達(dá)到殺滅 細(xì)菌的目的。達(dá)托霉素除對革蘭氏陽性菌有較強(qiáng)的殺菌作用外，對已呈現(xiàn)加氧西林、萬古霉 素和利奈唑烷等耐藥性的菌株亦有強(qiáng)力活性。此外，其毒副作用小、不良反應(yīng)輕、治療成本 低等特點(diǎn)，使其成為國內(nèi)外醫(yī)藥企業(yè)研發(fā)的熱點(diǎn)。
[0005] 目前，對達(dá)托霉素純度分析的方法主要是采用高效液相色譜儀、紫外檢測器和C18 反相色譜柱，色譜條件以乙腈-水中加入緩沖鹽，在一定PH下進(jìn)行測定。以上色譜法的主要 不足是：（1)忽視了樣品中可能存在的無紫外吸收的溶劑殘留，如水、乙醇、乙腈等，色譜法 含量測定結(jié)果可能不是達(dá)托霉素的真正純度，仍需要結(jié)合氣相色譜等方法扣除溶劑殘留 量；（2)峰形及出峰時間受水相中緩沖鹽的比例影響較大，進(jìn)而影響純度測定結(jié)果；（3)定量 時需要高純度的達(dá)托霉素作對照品；（4)分析時間較長。因此，研究一種能對達(dá)托霉素純度 進(jìn)行簡便、準(zhǔn)確測定的分析方法對藥物開發(fā)具有重要意義。
[0006] 氫核磁共振法因其具有的高靈敏度、高精確度、分析快速等優(yōu)點(diǎn)已被廣泛應(yīng)用于 有機(jī)化合物的結(jié)構(gòu)解析和定性分析中，然而使用氫核磁共振對某種特定化合物進(jìn)行純度測 定定量分析時，由于影響其測量準(zhǔn)確性的參數(shù)眾多，且無明確規(guī)律可以依循，而各化合物之 間因其結(jié)構(gòu)、性質(zhì)上的差異性，因此構(gòu)建一套基于氫核磁共振法準(zhǔn)確測定化合物純度的體 系十分困難。目前，尚未有基于氫核磁共振法測定達(dá)托霉素原料藥純度的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的就是為了解決上述問題，提供一種基于氫核磁共振測定達(dá)托霉素純 度的方法，它具有準(zhǔn)確、穩(wěn)定、快速的優(yōu)點(diǎn)。
[0008] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0009] -種基于氫核磁共振測定達(dá)托霉素純度的方法，步驟如下：
[0010] ⑴測定達(dá)托霉素及內(nèi)標(biāo)物定量目標(biāo)峰在氖代試劑中的縱向弛豫時間(Tl);
[0011] (2)根據(jù)所測定的Ti值設(shè)置核磁共振波普儀的傾倒角和弛豫延遲時間(cU)，所述傾 倒角為30~90°，弛豫延遲時間（cU)彡（7/3 X Tlmax~5 X Tlmax);
[0012] (3)根據(jù)步驟(2)中所設(shè)定的參數(shù)測定達(dá)托霉素樣品及內(nèi)標(biāo)物中各定量目標(biāo)峰的 積分面積(優(yōu)選:對每一信號6次積分取平均值），得出達(dá)托霉素相對于內(nèi)標(biāo)物的摩爾比；
[0013] (4)根據(jù)內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量，計(jì)算達(dá)托霉素的質(zhì)量，根據(jù)以下的公式計(jì)算其純度；
[0014] ff% = (misXHisXAsXMsX100%)/(MisXAisXmsXHs)
[0015]其中W%為達(dá)托霉素的純度;mis為內(nèi)標(biāo)物的實(shí)際質(zhì)量（內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量X純度），mg; His為內(nèi)標(biāo)物定量目標(biāo)峰的質(zhì)子數(shù);As為達(dá)托霉素定量目標(biāo)峰的積分值;Ms為達(dá)托霉素的摩 爾質(zhì)量，g/mo 1; Mis為內(nèi)標(biāo)物的摩爾質(zhì)量，g/mo 1; Ais為內(nèi)標(biāo)物定量目標(biāo)峰的積分值;ms為達(dá)托 霉素樣品的質(zhì)量，mg; Hs為達(dá)托霉素定量目標(biāo)峰的質(zhì)子數(shù)。
[0016] 優(yōu)選:所述氘代試劑為重水、氘代甲醇或氘代二甲基亞砜(DMS〇-d6)，優(yōu)選為DMS0- d6 〇
[0017] 所述內(nèi)標(biāo)物為其質(zhì)子化學(xué)位移在δΗ 16.0~8.3或δΗ 6.5~4.6或δΗ 0.8~0.0范 圍，而不出現(xiàn)在知4.6~0.8范圍，且室溫條件下不與達(dá)托霉素發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的物質(zhì)，優(yōu)選 為順丁烯二酸，其具有廉價(jià)易得、信號簡單、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。
[0018] 優(yōu)選:所述核磁共振波譜儀的參數(shù)為:共振頻率為400MHz，譜寬20ppm，測試溫度23 °C，傾倒角為30~90°，弛豫延遲時間（cU)為8~100s;采樣時間(AQ)為2.0~4. Is;采樣累加 次數(shù)為32~64次。
[0019] 優(yōu)選：所述達(dá)托霉素定量目標(biāo)峰的化學(xué)位移在δΗ 7.57、3h 7.04、3h 6.95、3h 6.74、5(16.53，更優(yōu)選為5116.53。
[0020] 本發(fā)明的有益效果：
[0021] 氫核磁共振定量過程中通過采用適當(dāng)?shù)膬?nèi)標(biāo)可避免使用被測物的高純度標(biāo)準(zhǔn)品， 同時給出化合物結(jié)構(gòu)信息和定量分析結(jié)果;單次測定能準(zhǔn)確得出達(dá)托霉素的絕對含量，避 免了溶劑殘留對純度的干擾，大大降低了藥物開發(fā)中分析成本，提高了藥物研發(fā)效率。
[0022] 脈沖傾倒角和弛豫延遲時間（cU)是建立氫核磁共振定量方法過程中兩個重要儀 器參數(shù)，直接影響最終定量結(jié)果的準(zhǔn)確性，而在之前運(yùn)用氫核磁共振分析醫(yī)藥產(chǎn)品的方法 中這兩個參數(shù)常被忽視，方法準(zhǔn)確性有待商榷。當(dāng)采用90°脈沖時，具有較好的靈敏度，但此 時cU多5XT lmax是確保含量測定數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性的必須條件，分析時間較長，氫核磁定量快速性 的優(yōu)點(diǎn)得不到發(fā)揮；當(dāng)采用較小脈沖傾倒角時，如30°脈沖，此時cU> (7/3) X Tlmax，就能夠獲 得準(zhǔn)確的分析結(jié)果，且分析時間大大縮短。因此，本專利首先通過測定定量目標(biāo)信號的縱向 弛豫時間)，按照傾倒角為30~90°時，弛豫延遲時間（cU)彡（7/3 X h~5 X Tlmax)的原 則優(yōu)化脈沖傾倒角、弛豫延遲時間（cU)等參數(shù)，在確保方法準(zhǔn)確性的前提下，盡量采用較小 的她豫延遲時間，從而提尚分析樣品的效率。
[0023] 氫核磁共振定量的基礎(chǔ)是在合適的儀器參數(shù)下，定量目標(biāo)信號的積分值與引起該 信號的質(zhì)子數(shù)成正比關(guān)系，通過選擇適當(dāng)?shù)膬?nèi)標(biāo)物，就可直接根據(jù)定量目標(biāo)峰的積分值推 算該信號所屬化合物的摩爾濃度，進(jìn)而計(jì)算各定量化合物的質(zhì)量及純度。定量過程中不需 要特定研發(fā)藥品的對照品，因此，特別適合新藥研發(fā)原料藥的純度測定。與現(xiàn)有技術(shù)相比， 本發(fā)明有如下創(chuàng)新性及優(yōu)勢：
[0024] (1)本發(fā)明系統(tǒng)測定了可用于氫核磁定量的目標(biāo)信號的^值，在此基礎(chǔ)上深入討 論了儀器脈沖傾倒角和弛豫延遲時間等參數(shù)對含量測定結(jié)果的影響，確保了所建立的達(dá)托 霉素純度檢測方法的準(zhǔn)確性。
[0025] (2)本發(fā)明樣品前處理簡單，分析時間短，方便開展對照品較難獲得的新藥品種的 含量分析及質(zhì)量控制，解決了新藥開發(fā)中原料藥純度測定的技術(shù)問題。
[0026]核磁共振定量的原理是含氫有機(jī)化合物NMR波普信號直接與原子數(shù)目成正比，因 此在實(shí)驗(yàn)參數(shù)設(shè)定時，需要被測物和內(nèi)標(biāo)物上的共振峰與其對應(yīng)的原子數(shù)盡可能保持一 致，若選擇不合適位置的氫進(jìn)行純度的測定，會受溶劑中雜質(zhì)以及溶劑本身等干擾峰的影 響較大，被測組分和雜質(zhì)信號之間存在干擾，被測組分和內(nèi)標(biāo)也會出現(xiàn)信號重疊，導(dǎo)致積分 不準(zhǔn)確，檢測結(jié)果重現(xiàn)性差。本發(fā)明中的待檢測物質(zhì)達(dá)托霉素分子量為1000多，結(jié)構(gòu)式如背 景技術(shù)中所記載的，除了羧基、羥基、氨基上等比較活潑的不易測出的氫之外，還有三十多 個不同位置的氫，每一位移峰都會對應(yīng)不同的傾倒角和弛豫延遲時間等參數(shù)，所以選擇哪 個位置的氫進(jìn)行純度測定是目前限制利用氫核磁共振測定達(dá)托霉素純度的技術(shù)難題之一。
[0027] 內(nèi)標(biāo)物的選擇最基本的原則是室溫條件下不與達(dá)托霉素發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的物質(zhì)，但 是在內(nèi)標(biāo)物的物的選擇時還要考慮被測物質(zhì)的氫共振峰與內(nèi)標(biāo)的氫共振峰之間要避免重 疊，目前可用于作為內(nèi)標(biāo)物的物質(zhì)有苯、苯甲酸芐酯、馬來酸、N，N-2甲基甲酰胺、過氧化苯 甲酰、非那西汀、2,4-二硝基甲苯、三氟乙酸鈉，DMS〇-d 5,鄰苯二甲酸氫鉀，磷酸等等，每種 內(nèi)標(biāo)物都有至少一種氫共振峰，待測物質(zhì)達(dá)托霉素的選擇哪個位置的請作為檢測的對象也 是不確定的，所以選擇哪種內(nèi)標(biāo)物，哪種氫共振峰都是沒有任何依據(jù)的，這也是目前限制利 用氫核磁共振測定達(dá)托霉素純度的技術(shù)難題之一。
[0028] 脈沖傾倒角和弛豫延遲時間（cU)是建立氫核磁共振定量方法過程中兩個重要儀 器參數(shù)，直接影響最終定量結(jié)果的準(zhǔn)確性，目前也有研究他們與檢測結(jié)果關(guān)系的文獻(xiàn)報(bào)道， 在實(shí)際測定純度時有一個公認(rèn)測定步驟:將內(nèi)標(biāo)物與待測物質(zhì)溶解于溶劑中，進(jìn)行儀器參 數(shù)設(shè)定的測量，在進(jìn)行參數(shù)的測定時將脈沖傾倒角和弛豫延遲時間等同于共振頻率等參數(shù) 進(jìn)行設(shè)定，導(dǎo)致方法準(zhǔn)確性存在盲目性。本發(fā)明的發(fā)明人在研究中克服了技術(shù)偏見，首先測 定達(dá)托霉素及內(nèi)標(biāo)物定量目標(biāo)峰在氘代試劑中的縱向弛豫時間（Td，再根據(jù)所測定的^值 設(shè)置核磁共振波普儀的傾倒角和弛豫延遲時間(cU)，提高分析樣品的準(zhǔn)確性和效率。
[0029]核磁共振儀需要液氮維持超導(dǎo)磁體產(chǎn)生的強(qiáng)磁場從而保證核磁共振儀的正常運(yùn) 行，測試時通常采用較低溫度以減少液氮的消耗，從而保證核磁共振儀的長時間運(yùn)行;達(dá)托 霉素中含有仲胺基和羥基，容易產(chǎn)生分子間氫鍵，會降低核磁共振圖譜的分辨率，從而降低 了檢測的準(zhǔn)確性，在保證較少液氮消耗的前提下，適當(dāng)升高溫度能夠破壞仲胺基和羥基處 氫鍵的形成，使其質(zhì)子峰譜向高場移動，降低了其化學(xué)位移值，從而提高分辨率，現(xiàn)有技術(shù) 中，在核磁共振檢測過程中的測定溫度基本都選定室溫作為測定溫度，
【申請人】發(fā)現(xiàn)選擇23 °(：保證了較少的消耗液氮，保證核磁共振儀的長時間運(yùn)行，又提高了核磁共振圖譜的分辨 率，增加了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。
【附圖說明】
[0030] 圖1為實(shí)例1中核磁共振氫譜圖；
[0031] 圖2為實(shí)例2中核磁共振氫譜圖；
[0032]圖3為實(shí)例3中核磁共振氫譜圖；
[0033]圖4為實(shí)例4中核磁共振氫譜圖；
[0034]圖5為實(shí)例5中核磁共振氫譜圖；
[0035]圖6為實(shí)例6中核磁共振氫譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0036]下面結(jié)合附圖與實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0037] 稱取達(dá)托霉素4.96mg、順丁稀二酸0.654mg，分別置于核磁管中，加入0.5mL DMS0-d6溶解，用于咕NMR測試。采用質(zhì)子反轉(zhuǎn)-恢復(fù)!^實(shí)驗(yàn)方法測定各定量目標(biāo)峰的縱向弛豫時 間Τι，并用Bruker的Τι計(jì)算程序計(jì)算。設(shè)定脈沖弛豫延遲時間范圍為1秒至30秒。經(jīng)測定以 01^0-(16為溶劑時，順丁烯二酸51 16.02信號峰1'1為2.58，達(dá)托霉素5117.57、5117.04、31 1 6·95、δΗ 6·74、δΗ 6.53處信號Τι分別為 1.3s、1.6s、1.5s、1.4s、1.6s。
[0038] 實(shí)施例1
[0039] 精密稱取達(dá)托霉素樣品10 · 260mg、順丁烯二酸2 · 037mg，分別以600yL、250yL DMS〇-d6溶解，后精密取480yL達(dá)托霉素溶液、20yL順丁烯二酸溶液轉(zhuǎn)移到核磁管中，進(jìn)行咕 NMR測試。核磁共振波譜儀共振頻率為400MHz，90°脈沖，cU為100 s，采樣累加次數(shù)為64次，譜 寬20ppm，測試溫度為23 °C，AQ為4.1 s。
[0040] 如圖1所示，在1H NMR譜中，內(nèi)標(biāo)物順丁烯二酸δΗ 6.02信號峰積分值為1，達(dá)托霉素 知6.53處信號積分值為1.68，根據(jù)公式-1可計(jì)算得到達(dá)托霉素的純度為92.2 %，重復(fù)6次， 標(biāo)準(zhǔn)誤差=〇. 18%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差0.2%。
[0041 ] 實(shí)施例2
[0042]咕匪R測試樣品同實(shí)施例1。核磁共振波譜儀共振頻率為400MHz，90°脈沖，ch為 5〇8，采樣累加次數(shù)為64次，譜寬20??111，測試溫度為23°(：4〇為4.18。
[0043]如圖2所示，在1H NMR譜中，內(nèi)標(biāo)物順丁烯二酸δΗ 6.02信號峰積分值為1，達(dá)托霉素 知6.53處信號積分值為1.69，根據(jù)公式-1可計(jì)算得到達(dá)托霉素的純度為92.8 %，重復(fù)6次， 標(biāo)準(zhǔn)誤差= 0.25%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差0.1%。
[0044] 實(shí)施例3
[0045]咕匪R測試樣品同實(shí)施例1。核磁共振波譜儀共振頻率為400MHz，90°脈沖，ch為 138，采樣累加次數(shù)為32次，譜寬20??111，測試溫度為23°(：40為4.18。
[0046]如圖3所示，在1H NMR譜中，內(nèi)標(biāo)物順丁烯二酸δΗ 6.02信號峰積分值為1，達(dá)托霉素 知6.53處信號積分值為1.75,根據(jù)公式-1可計(jì)算得到達(dá)托霉素的純度為96.1%，重復(fù)6次， 標(biāo)準(zhǔn)誤差=〇. 2 %，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差0.2 %。
[0047] 實(shí)施例4
[0048]咕匪R測試樣品同實(shí)施例1。核磁共振波譜儀共振頻率為400MHz，30°脈沖，ch為 168，采樣累加次數(shù)為32次，譜寬20??111，測試溫度為23°(：40為4.18。
[0049] 如圖4所示，在1H NMR譜中，內(nèi)標(biāo)物順丁烯二酸δΗ 6.02信號峰積分值為1，達(dá)托霉素 知6.53處信號積分值為1.68，根據(jù)公式-1可計(jì)算得到達(dá)托霉素的純度為92.2 %，重復(fù)6次， 標(biāo)準(zhǔn)誤差=〇. 11 %，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差〇. 3 %。
[0050] 實(shí)施例5
[00511咕NMR測試樣品同實(shí)施例1。核磁共振波譜儀共振頻率為400MHz，30°脈沖，cb為8s， 采樣累加次數(shù)為32次，譜寬20??111，測試溫度為23°(：40為4.18。
[0052]如圖5所示，在1H NMR譜中，內(nèi)標(biāo)物順丁烯二酸δΗ 6.02信號峰積分值為1，達(dá)托霉素 知6.53處信號積分值為1.67,根據(jù)公式-1可計(jì)算得到達(dá)托霉素的純度為91.7%，重復(fù)6次， 標(biāo)準(zhǔn)誤差=〇. 13 %，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差0.1 %。
[0053] 實(shí)施例6
[0054] 4 NMR測試樣品同實(shí)施例1。核磁共振波譜儀共振頻率為400MHz，30°脈沖，cb為8s， 采樣累加次數(shù)為32次，譜寬20ppm，測試溫度為23°C，AQ為2. Os。
[0055] 如圖6所示，在1H NMR譜中，內(nèi)標(biāo)物順丁烯二酸δΗ 6.02信號峰積分值為1，達(dá)托霉素 知6.53處信號積分值為1.69，根據(jù)公式-1可計(jì)算得到達(dá)托霉素的純度為92.8 %，重復(fù)6次， 標(biāo)準(zhǔn)誤差=〇. 13 %，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差0.2 %。
[0056] 上述雖然結(jié)合附圖對本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行了描述，但并非對本發(fā)明保護(hù)范 圍的限制，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明白，在本發(fā)明的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員不 需要付出創(chuàng)造性勞動即可做出的各種修改或變形仍在本發(fā)明的保護(hù)范圍以內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種基于氫核磁共振測定達(dá)托霉素純度的方法，其特征是:步驟如下： (1) 測定達(dá)托霉素及內(nèi)標(biāo)物定量目標(biāo)峰在氖代試劑中的縱向弛豫時間(Τι); (2) 根據(jù)所測定的Ti值設(shè)置核磁共振波普儀的傾倒角和弛豫延遲時間(cU)，所述傾倒角 為30~90°，弛豫延遲時間（cU)彡（7/3 X Tlmax~5 X Tlmax); (3) 根據(jù)步驟(2)中所設(shè)定的參數(shù)測定達(dá)托霉素樣品及內(nèi)標(biāo)物中各定量目標(biāo)峰的積分 面積，最終計(jì)算達(dá)托霉素的純度； 所述內(nèi)標(biāo)物為其質(zhì)子化學(xué)位移在16.0~8.3、5h 6.5~4.6或5h 0.8~0.0; 所述達(dá)托霉素定量目標(biāo)峰的化學(xué)位移在5h 7.57、5h 7.04、5h 6.95、5h 6.74、5h 6.53。2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是:所述步驟（1)中氘代試劑為重水、氘代甲醇或氘 代二甲基亞砜。3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是:所述步驟(1)中氘代試劑為DMS〇-d6。4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是:所述步驟(1)中內(nèi)標(biāo)物為順丁烯二酸。5. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是:所述步驟(2)中所述核磁共振波譜儀的參數(shù)傾 倒角為30~90°，弛豫延遲時間（cU)為8~100s。6. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是:所述步驟(2)中所述核磁共振波譜儀的共振頻 率為400MHz，譜寬20ppm，測試溫度23°C，采樣時間為2.0~4.1 s，采樣累加次數(shù)為32~64次。7. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是:所述步驟(3)中積分面積為對每一信號6次積分 取平均值。8. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是：所述達(dá)托霉素定量目標(biāo)峰的化學(xué)位移在δΗ 6.53〇
【文檔編號】G01N24/08GK106018456SQ201610323835
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年5月16日
【發(fā)明人】王志偉, 魏祥玉, 閆慧嬌, 林云良, 李鋒, 趙汝松, 陳躍, 高紅梅
【申請人】山東省分析測試中心