本申請(qǐng)要求于2013年12月9日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào)61/913,905和2013年12月9日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào)61/913,911的權(quán)益，將其內(nèi)容通過(guò)引用以其全文結(jié)合在此。對(duì)以電子方式提交的序列表的參考所述序列表的官方副本經(jīng)由EFS-Web作為ASCII格式序列表以電子方式提交，文件名為“APA136054_ST25.txt”，創(chuàng)建于2014年11月14日，并且具有97千字節(jié)大小，并且與本說(shuō)明書同時(shí)提交。包含在這一ASCII格式文件中的序列表是本說(shuō)明書的一部分并且通過(guò)引用以其全部?jī)?nèi)容結(jié)合在此。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域。提供了編碼殺有害生物蛋白的新穎的基因。這些蛋白和編碼它們的核酸序列在制備殺有害生物配制品中以及在生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因抗有害生物植物中是有用的。發(fā)明背景蘇云金桿菌是革蘭氏陽(yáng)性產(chǎn)芽孢土壤細(xì)菌，其特征在于其產(chǎn)生晶狀內(nèi)含體的能力，所述晶狀內(nèi)含體特異性地對(duì)于昆蟲的某些目和種具有毒性，但對(duì)于植物和其他非靶生物是無(wú)害的。因此，包括蘇云金桿菌菌株或它們的殺昆蟲蛋白質(zhì)的組合物可用作環(huán)境上可接受的殺昆蟲劑以用于控制農(nóng)業(yè)昆蟲有害生物或者各種人或動(dòng)物疾病的昆蟲媒介。來(lái)自蘇云金桿菌的晶體(Cry)蛋白(δ-內(nèi)毒素)具有主要針對(duì)鱗翅目、半翅目、雙翅目、以及鞘翅目幼蟲的有效的殺昆蟲活性。這些蛋白還已經(jīng)顯示針對(duì)膜翅目、同翅目、虱目、食毛目、以及蜱螨亞綱有害生物目(Acaripestorder)、連同其他無(wú)脊椎動(dòng)物目(如線蟲動(dòng)物門、扁形動(dòng)物門、以及原生動(dòng)物門肉鞭毛蟲亞門)的活性(費(fèi)特遜(Feitelson)(1993)蘇云金桿菌家族樹(TheBacillusThuringiensisfamilytree).先進(jìn)的工程殺有害生物劑(AdvancedEngineeredPesticides)，馬塞爾穧德克爾格式(MarcelDekker,Inc.)，紐約，紐約州(N.Y.))。這些蛋白最初主要基于它們的殺昆蟲活性而分類為CryI至CryV。這些主要的類別是鱗翅類特異的(I)、鱗翅類與雙翅目特異的(II)、鞘翅目特異的(III)、雙翅目特異的(IV)、以及線蟲特異的(V)與(VI)。這些蛋白質(zhì)進(jìn)一步分類成亞家族；在每個(gè)家族內(nèi)更高度相關(guān)的蛋白質(zhì)被指定了分組字母例如Cry1A、Cry1B、Cry1C等等。在每個(gè)分組內(nèi)更加密切相關(guān)的蛋白質(zhì)被給予諸如Cry1C1、Cry1C2等的名稱?；诎被嵝蛄型葱远皇抢ハx靶標(biāo)特異性描述了Cry基因的命名法(克里克莫爾(Crickmore)等人(1998)微生物學(xué)與分子生物學(xué)評(píng)論(Microbiol.Mol.Biol.Rev.)62:807-813)。在此分類中，每種毒素被指定了獨(dú)特的名稱，其中包括第一級(jí)(primaryrank)(阿拉伯?dāng)?shù)字)、第二級(jí)(secondaryrank)(大寫字母)、第三級(jí)(tertiaryrank)(小寫字母)、以及第四級(jí)(quaternaryrank)(另一個(gè)阿拉伯?dāng)?shù)字)。在第一級(jí)中，羅馬數(shù)字已被換成阿拉伯?dāng)?shù)字。具有低于45％的序列一致性的蛋白質(zhì)具有不同的第一級(jí)，第二和第三級(jí)的標(biāo)準(zhǔn)分別為78％和95％。晶體蛋白不展示殺昆蟲活性，直至其被攝取并溶解在昆蟲中腸之中。被攝取的原毒素在昆蟲消化道中被蛋白酶水解成活性毒性分子。(和懷特利(Whiteley)(1989)微生物學(xué)評(píng)論(Microbiol.Rev.)53:242-255)。這種毒素與靶幼蟲的中腸中的頂端刷狀緣受體結(jié)合并插入頂端膜中，產(chǎn)生離子通道或孔，從而導(dǎo)致幼蟲死亡。δ-內(nèi)毒素通常具有五個(gè)保守的序列結(jié)構(gòu)域和三個(gè)保守的結(jié)構(gòu)性結(jié)構(gòu)域(參見，例如戴馬格德(deMaagd)等人(2001)遺傳學(xué)趨勢(shì)17:193-199)。第一個(gè)保守的結(jié)構(gòu)性結(jié)構(gòu)域由7個(gè)α螺旋組成并且參與膜插入和孔形成。結(jié)構(gòu)域II由排列成希臘鑰匙構(gòu)型的三個(gè)β片層組成并且結(jié)構(gòu)域III由“果凍卷”結(jié)構(gòu)中的兩個(gè)反向平行的β片層組成(deMaagd等人，2001，上文)。結(jié)構(gòu)域II和III參與受體識(shí)別和結(jié)合，并且因此被認(rèn)為是毒素特異性的決定簇。由于昆蟲可能帶來(lái)破壞、以及通過(guò)控制昆蟲有害生物在產(chǎn)量方面的改進(jìn)，對(duì)于發(fā)現(xiàn)新形式的殺有害生物毒素存在著不斷的需要。發(fā)明概述在此提供了用于向細(xì)菌、植物、植物細(xì)胞、組織以及種子賦予殺有害生物活性的組合物和方法。組合物包括針對(duì)殺有害生物的和殺昆蟲的多肽的核酸分子編碼序列、包括那些核酸分子的載體、以及包括這些載體的宿主細(xì)胞。組合物還包括這些殺有害生物多肽序列以及針對(duì)那些多肽的抗體。這些核苷酸序列可以用在DNA構(gòu)建體或表達(dá)盒中，以用于在多種生物(包括微生物和植物)中進(jìn)行轉(zhuǎn)化和表達(dá)。這些核苷酸或氨基酸序列可以是合成序列，這些合成序列已經(jīng)被設(shè)計(jì)為用于在一種生物中表達(dá)，該生物包括但不局限于：一種微生物或一種植物。組合物還包括含有本發(fā)明的核苷酸序列的細(xì)菌、植物、植物細(xì)胞、組織、以及種子。具體地說(shuō)，提供了編碼一種殺有害生物蛋白的分離的或重組的核酸分子。另外，涵蓋了與這些殺有害生物蛋白相應(yīng)的氨基酸序列。具體地，本發(fā)明提供了一種分離的或重組的核酸分子，該核酸分子包括編碼SEQIDNO:5-26中所示的氨基酸序列的核苷酸序列、或在SEQIDNO:1-4中列出的核苷酸序列、以及它們的生物活性變體和片段。還涵蓋了與本發(fā)明的一個(gè)核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列、或與本發(fā)明的一個(gè)序列或其互補(bǔ)物雜交的核苷酸序列。另外還提供了包括本發(fā)明的核苷酸序列或者編碼本發(fā)明的氨基酸序列的核苷酸序列以及它們的生物活性變體和片段的載體、宿主細(xì)胞、植物以及種子。提供了用于產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的方法、以及用于使用這些多肽來(lái)控制或殺死鱗翅目、半翅目、鞘翅目、線蟲、或雙翅目有害生物的方法。還包括用于檢測(cè)在樣品中的本發(fā)明的這些核酸和多肽的方法和試劑盒。本發(fā)明的這些組合物和方法用于產(chǎn)生具有增強(qiáng)的有害生物抗性或耐受性的生物。這些生物以及包括這些生物的組合物對(duì)于農(nóng)業(yè)目的是所希望的。本發(fā)明的組合物還用于產(chǎn)生具有殺有害生物活性的改變的或改進(jìn)的蛋白、或檢測(cè)在產(chǎn)物或生物中的殺有害生物蛋白或核酸的存在。詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明描繪了用于調(diào)節(jié)生物(特別是植物或植物細(xì)胞)中的有害生物抗性或耐受性的組合物和方法?！翱剐浴笔侵冈撚泻ι?例如，昆蟲)在攝取或以其他方式接觸本發(fā)明的多肽類之后被殺死。“耐受性”是指該有害生物的運(yùn)動(dòng)、攝食、繁殖、或其他功能的損害或降低。這些方法涉及用編碼本發(fā)明的一種殺有害生物蛋白的核苷酸序列來(lái)轉(zhuǎn)化生物。具體地說(shuō)，本發(fā)明的核苷酸序列用于制備具有殺有害生物活性的植物和微生物。因此，提供了轉(zhuǎn)化的細(xì)菌、植物、植物細(xì)胞、植物組織以及種子。組合物是桿菌或其他物種的殺有害生物核酸和蛋白質(zhì)。這些序列用于隨后轉(zhuǎn)化到感興趣的生物中的表達(dá)載體的構(gòu)建，作為用于其他同源(或部分同源的)基因的分離的探針，以及用于通過(guò)本領(lǐng)域中已知的方法(如，結(jié)構(gòu)域交換或DNA改組)來(lái)產(chǎn)生改變的殺有害生物蛋白，例如內(nèi)毒素的Cry1、Cry2以及Cry9家族成員。這些蛋白用于控制或殺死鱗翅目、半翅目、鞘翅目、雙翅目、以及線蟲有害生物種群、以及用于生產(chǎn)具有殺有害生物活性的組合物。關(guān)于“殺有害生物毒素”或“殺有害生物蛋白”是指一種毒素，該毒素具有針對(duì)一種或多種有害生物的毒性，包括但不局限于：鱗翅目、雙翅目、半翅目以及鞘翅目、或線蟲動(dòng)物門成員、或者與這種蛋白質(zhì)具有同源性的一種蛋白質(zhì)。已經(jīng)從生物中分離出殺有害生物蛋白，這些生物包括例如，芽孢桿菌、雙酶梭菌、以及日本甲蟲類芽孢桿菌(Paenibacilluspopilliae)。殺有害生物蛋白包括從在此披露的全長(zhǎng)核苷酸序列中推導(dǎo)出的氨基酸序列、以及比這些全長(zhǎng)序列更短的氨基酸序列(或者由于使用了一個(gè)可替代的下游起始位點(diǎn)、或者由于產(chǎn)生一個(gè)較短的具有殺有害生物活性的蛋白的加工過(guò)程)。加工可以在表達(dá)該蛋白的生物內(nèi)發(fā)生，或在該有害生物攝取該蛋白之后發(fā)生。因此，在此提供了新穎的分離或重組的核苷酸序列，這些序列賦予了殺有害生物活性。這些核苷酸序列編碼與已知的δ-內(nèi)毒素或二元毒素具有同源性的多肽。還提供了殺有害生物蛋白的氨基酸序列。由這種基因的翻譯而產(chǎn)生的蛋白允許細(xì)胞控制或殺死攝取了該蛋白的有害生物。分離的核酸分子、以及它們的變體和片段本發(fā)明的一個(gè)方面涉及分離的或重組的核酸分子，這些核酸分子包括編碼殺有害生物蛋白和多肽或它們的生物活性部分的核苷酸序列；以及足以用作雜交探針來(lái)鑒定編碼具有序列同源性的區(qū)域的蛋白質(zhì)的核酸分子的核酸分子。在此還涵蓋了能夠在如在此的其他部分所定義的嚴(yán)格條件下與本發(fā)明的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。如在此所使用的，術(shù)語(yǔ)“核酸分子”旨在包括DNA分子(例如，重組DNA、cDNA或基因組DNA)和RNA分子(例如，mRNA)以及使用核苷酸類似物產(chǎn)生的DNA或RNA的類似物。這種核酸分子可以是單鏈或雙鏈的，但優(yōu)選是雙鏈DNA?！胺蛛x的”或“重組的”核酸序列(或DNA)被用在此處是指一種核酸序列(或DNA)，該核酸序列(或DNA)不再存在于它的自然環(huán)境中(例如，在體外或在重組細(xì)菌或植物宿主細(xì)胞中)。在一些實(shí)施例中，一種分離的或重組的核酸是不含有在衍生出該核酸的生物的基因組DNA中天然地位于該核酸側(cè)翼的序列(即，位于該核酸的5'和3'末端的序列)(優(yōu)選編碼蛋白質(zhì)的序列)。出于本發(fā)明的目的，“分離的”當(dāng)用于指核酸分子時(shí)不包括分離的染色體。例如，在不同實(shí)施例中，編碼δ-內(nèi)毒素的分離的核酸分子可以包含小于約5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列，這些核苷酸序列天然地側(cè)翼于衍生出該核酸的細(xì)胞的基因組DNA中的核酸分子。在不同的實(shí)施例中，基本上不含有細(xì)胞物質(zhì)的一種δ內(nèi)毒素蛋白包括具有少于約30％、20％、10％或5％(按干重計(jì))的非δ內(nèi)毒素蛋白(在此也被稱“污染蛋白質(zhì)”)的蛋白質(zhì)制劑。編碼本發(fā)明的蛋白的核苷酸序列包括SEQIDNO:1-4中列出的序列及其變體、片段和互補(bǔ)物。關(guān)于“互補(bǔ)物”是指與給定的核苷酸序列足夠地互補(bǔ)使得它可以與該給定的核苷酸序列雜交由此形成一個(gè)穩(wěn)定的雙鏈體的核苷酸序列。對(duì)于由這些核苷酸序列所編碼的殺有害生物蛋白的相應(yīng)氨基酸序列在SEQIDNO:5-26中列出。本發(fā)明還涵蓋了以下核酸分子，這些核酸分子是這些編碼殺有害生物蛋白的核苷酸序列的片段。關(guān)于“片段”是指編碼一種殺有害生物蛋白的核苷酸序列的一個(gè)部分。核苷酸序列的一個(gè)片段可以編碼殺有害生物蛋白的生物活性部分，或者它可以是使用以下披露的方法可以用作一種雜交探針或PCR引物的一個(gè)片段。作為編碼殺有害生物蛋白的一個(gè)核苷酸序列片段的核酸分子包括至少約50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1350、1400個(gè)連續(xù)核苷酸，或達(dá)到在此披露的一種全長(zhǎng)的編碼殺有害生物蛋白的核苷酸序列中存在的核苷酸的數(shù)目，這取決于所預(yù)期的用途。關(guān)于“連續(xù)的”核苷酸旨在指彼此鄰近的核苷酸殘基。本發(fā)明的核苷酸序列的片段將編碼保留殺有害生物蛋白的生物活性、并且因此保留殺有害生物活性的蛋白質(zhì)片段。因此，還涵蓋了在此披露的多肽的生物活性片段。關(guān)于“保留活性”是指該片段將具有至少約30％、至少約50％、至少約70％、80％、90％、95％或更高的該殺有害生物蛋白的殺有害生物活性。在一個(gè)實(shí)施例中，該殺有害生物活性是殺鞘翅目活性。在另一個(gè)實(shí)施例中，該殺有害生物活性是殺鱗翅目活性。在另一個(gè)實(shí)施例中，該殺有害生物活性是殺線蟲活性。在另一個(gè)實(shí)施例中，該殺有害生物活性是殺雙翅目活性。在另一個(gè)實(shí)施例中，該殺有害生物活性是殺半翅目活性。用于測(cè)量殺有害生物活性的方法在本領(lǐng)域是熟知的。參見例如查普拉(Czapla)和朗(Lang)(1990)經(jīng)濟(jì)昆蟲學(xué)雜志(J.Econ.Entomol.)83:2480-2485；安德魯斯(Andrews)等人(1988)生物化學(xué)雜志(Biochem.J.)252:199-206；馬羅內(nèi)(Marrone)等人(1985)經(jīng)濟(jì)昆蟲學(xué)雜志(J.ofEconomicEntomology)78:290-293；以及美國(guó)專利號(hào)5,743,477，所有這些文獻(xiàn)都通過(guò)引用以其全文結(jié)合在此。編碼一種殺有害生物蛋白的核苷酸序列的片段(該序列編碼本發(fā)明的蛋白的生物活性部分)將編碼至少約15、25、30、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050個(gè)相鄰氨基酸，或高達(dá)存在于本發(fā)明的全長(zhǎng)殺有害生物蛋白中的氨基酸的全部數(shù)量。在一些實(shí)施例中，片段是蛋白酶切片段。例如，蛋白酶切片段可以相對(duì)于SEQIDNO:2、3、4、5、6或7具有至少約30個(gè)氨基酸、至少約40個(gè)氨基酸、至少約50個(gè)、至少約100個(gè)氨基酸、約120、約130、約140、約150、約160、約170、約180、約190、約200、約210、約220、約230、約240、約250、約275、約300、約350、約400、約450、約500、或約550個(gè)氨基酸的N末端或C末端截短。在一些實(shí)施例中，在此所涵蓋的這些片段是由例如通過(guò)蛋白酶解或通過(guò)在編碼序列中插入終止密碼子來(lái)除去C末端結(jié)晶結(jié)構(gòu)域而產(chǎn)生。在一些實(shí)施例中，在此所涵蓋的這些片段是由除去N末端信號(hào)肽而產(chǎn)生。N末端截短可以在N末端進(jìn)一步包括甲硫氨酸殘基。本發(fā)明的優(yōu)選殺有害生物蛋白是通過(guò)與SEQIDNO:1-4的核苷酸序列足夠地一致的核苷酸序列編碼的，或者這些殺有害生物蛋白是與SEQIDNO:5-26中所列出的氨基酸序列足夠地一致的。關(guān)于“足夠地一致”是指使用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)、使用在此所描述的比對(duì)程序之一，一種氨基酸或核苷酸序列與參考序列相比較具有至少約60％或65％序列一致性、約70％或75％序列一致性、約80％或85％序列一致性、約90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列一致性。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到，可以對(duì)這些數(shù)值進(jìn)行適當(dāng)?shù)卣{(diào)整以便通過(guò)考慮密碼子簡(jiǎn)并性、氨基酸相似性、閱讀框定位、等等來(lái)確定由兩個(gè)核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)的相應(yīng)一致性。為了確定兩個(gè)氨基酸序列或兩個(gè)核酸的一致性百分比，針對(duì)最佳比較目的而比對(duì)這些序列。這兩個(gè)序列之間的一致性百分比是由這些序列共有的相同位置的數(shù)目的函數(shù)(即，一致性百分比＝相同位置的數(shù)目/位置(例如，重疊位置)的總數(shù)目x100)。在一個(gè)實(shí)施例中，這兩個(gè)序列是相同長(zhǎng)度的。在另一個(gè)實(shí)施例中，該一致性百分比是貫穿參考序列(即，在此披露的如SEQIDNO:1-26中任一項(xiàng)的序列)的整體來(lái)計(jì)算的。在兩個(gè)序列之間的一致性百分比可以使用與以下說(shuō)明的那些相似的技術(shù)來(lái)確定，其中允許或不允許空位。在計(jì)算一致性百分比中，對(duì)典型地準(zhǔn)確的匹配進(jìn)行計(jì)數(shù)?？瘴?，即，比對(duì)中在一個(gè)序列中存在殘基而在另一個(gè)序列中不存在的位置，其被視為具有不一致殘基的位置。兩個(gè)序列之間的一致性百分比的確定可以通過(guò)使用數(shù)學(xué)算法來(lái)完成。用于兩個(gè)序列的比較的數(shù)學(xué)算法的一個(gè)非限制性實(shí)例是卡爾林(Karlin)和阿爾丘爾(Altschul)(1990)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)87:2264的算法，它在卡爾林和阿爾丘爾(1993)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊90:5873-5877中進(jìn)行了修改。這種算法被結(jié)合到阿爾丘爾(Altschul)等人(1990)分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)215:403的BLASTN和BLASTX程序中。BLAST核苷酸搜索可以用BLASTN程序(得分＝100、字長(zhǎng)＝12)來(lái)進(jìn)行，以獲得與本發(fā)明的殺有害生物樣核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白質(zhì)搜索可以用BLASTX程序(得分＝50、字長(zhǎng)＝3)來(lái)進(jìn)行，以獲得與本發(fā)明的殺有害生物蛋白分子同源的氨基酸序列。為了獲得用于比較目標(biāo)的有缺口的比對(duì)，可以利用如在阿爾丘爾等人(1997)核酸研究(NucleicAcidsRes.)25:3389)中所述的有缺口的BLAST(BLAST2.0中)?？商娲兀梢允褂肞SI-Blast進(jìn)行迭代搜索，該迭代搜索檢測(cè)分子之間的遠(yuǎn)近關(guān)系。參見阿爾丘爾(Altschul)等人(1997)同上。當(dāng)利用BLAST、空位BLAST和PSI-Blast程序時(shí)，可以使用對(duì)應(yīng)的程序(例如，BLASTX和BLASTN)的默認(rèn)參數(shù)。還可以通過(guò)檢查，手動(dòng)進(jìn)行比對(duì)。用于序列比較的一種數(shù)學(xué)算法的另一個(gè)非限制實(shí)例是ClustalW算法(希金斯(Higgins)等人(1994)核酸研究(NucleicAcidsRes.)22:4673-4680))。ClustalW比較了序列并且比對(duì)了該氨基酸或DNA序列的整體，并且因此可以提供有關(guān)整個(gè)氨基酸序列的序列保守性的數(shù)據(jù)。ClustalW算法用于幾個(gè)可商購(gòu)的DNA/氨基酸分析軟件包，如VectorNTIProgramSuite的ALIGNX模塊(英杰公司(InvitrogenCorporation)，卡爾斯巴德(Carlsbad)，加利福尼亞(CA))。用ClustalW進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)之后，可以估算出氨基酸一致性百分?jǐn)?shù)。用于ClustalW比對(duì)分析的軟件程序的另一個(gè)非限制性實(shí)例是GENEDOCTM。GENEDOCTM(卡爾穧尼古拉斯公司(KarlNicholas))允許在多個(gè)蛋白質(zhì)之間評(píng)估氨基酸(或DNA)相似性和一致性。用于比較序列的數(shù)學(xué)算法的另一個(gè)非限制性實(shí)例是邁爾斯(Myers)和米勒(Miller)(1988)生物科學(xué)中的計(jì)算機(jī)應(yīng)用(CABIOS)4:11-17的算法。這種算法被結(jié)合到ALIGN程序(版本2.0)中，該程序是GCG威斯康星遺傳學(xué)軟件包(WisconsinGeneticsSoftwarePackage)(版本10)(可商購(gòu)自阿塞勒德公司(Accelrys,Inc.)，斯克蘭頓路9685號(hào)(9685ScrantonRd.)，圣地亞哥(SanDiego)，加利福尼亞州，美國(guó))的一部分。當(dāng)利用ALIGN程序來(lái)比較多個(gè)氨基酸序列時(shí)，可以使用一個(gè)PAM120權(quán)重殘基表、空位長(zhǎng)度罰分12、以及空位罰分4。除非另有說(shuō)明，GAP版本10(它采用了尼德爾曼(Needleman)和翁施(Wunsch)(1970)分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)48(3):443-453的算法)將使用以下參數(shù)用于測(cè)定序列一致性或相似性：對(duì)于核苷酸序列的一致性％以及相似性％，使用GAP權(quán)重50和長(zhǎng)度權(quán)重3，以及nwsgapdna.cmp評(píng)分矩陣；對(duì)于氨基酸序列的一致性％以及相似性％，使用GAP權(quán)重8和長(zhǎng)度權(quán)重2以及BLOSUM62評(píng)分程序。還可以使用等效程序。關(guān)于“等效程序”是指以下任何序列比較程序，該程序針對(duì)所研究的任何兩個(gè)序列、當(dāng)與由GAP版本10所產(chǎn)生的相應(yīng)比對(duì)相比時(shí)產(chǎn)生一個(gè)比對(duì)，該比對(duì)具有相同的核苷酸殘基匹配以及一個(gè)相同的序列一致性百分比。本發(fā)明還涵蓋了變體核酸分子。編碼殺有害生物蛋白的核苷酸序列的“變體”包括編碼在此披露的殺有害生物蛋白、但由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而保守性地不同的那些序列以及如以上所討論的足夠一致的那些序列。天然存在的等位基因變體可以使用所熟知的分子生物學(xué)技術(shù)來(lái)鑒定，例如像以下所概括的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)以及雜交技術(shù)。變體核苷酸序列還包括合成地衍生的核苷酸序列，這些核苷酸序列已經(jīng)例如通過(guò)使用定點(diǎn)誘變而產(chǎn)生但它們?nèi)跃幋a了在本發(fā)明中所披露的殺有害生物蛋白，如以下所討論。本發(fā)明所涵蓋的變體蛋白是有生物活性的，即它們繼續(xù)具有所希望的天然蛋白的生物活性，即殺有害生物活性。關(guān)于“保留活性”是指該片段將具有至少約30％、至少約50％、至少約70％、或至少約80％的該天然蛋白的殺有害生物活性。用于測(cè)量殺有害生物活性的方法在本領(lǐng)域是熟知的。參見例如查普拉(Czapla)和朗(Lang)(1990)經(jīng)濟(jì)昆蟲學(xué)雜志(J.Econ.Entomol.)83:2480-2485；安德魯斯(Andrews)等人(1988)生物化學(xué)雜志(Biochem.J.)252:199-206；馬羅內(nèi)(Marrone)等人(1985)經(jīng)濟(jì)昆蟲學(xué)雜志(J.ofEconomicEntomology)78:290-293；以及美國(guó)專利號(hào)5,743,477，所有這些文獻(xiàn)都通過(guò)引用以其全文結(jié)合在此。熟練的技術(shù)人員將進(jìn)一步意識(shí)到，可以通過(guò)突變本發(fā)明的核苷酸序列來(lái)引入變化，由此導(dǎo)致在這些編碼的殺有害生物蛋白的氨基酸序列中的變化，而不改變這些蛋白質(zhì)的生物活性。因此，可以通過(guò)將一個(gè)或多個(gè)核苷酸置換、添加、或缺失引入到在此披露的相應(yīng)核苷酸序列中而產(chǎn)生分離的核酸分子變體，使得將一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換、添加、或缺失引入到編碼的蛋白中。可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)(如定點(diǎn)誘變和PCR介導(dǎo)的誘變)來(lái)引入突變。這樣的變體核苷酸序列也由本發(fā)明所涵蓋。例如，可以在一個(gè)或多個(gè)、預(yù)測(cè)的、非必需氨基酸殘基處做出保守性氨基酸置換。一個(gè)“非必需”氨基酸殘基是可以從一種殺有害生物蛋白的野生型序列改變的而不改變生物活性的殘基，而一個(gè)“必需”氨基酸殘基是生物活性所需要的?！氨Ｊ匦园被嶂脫Q”是其中氨基酸殘基被具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基替換的置換。在本領(lǐng)域中已經(jīng)定義了具有類似側(cè)鏈的氨基酸殘基的家族。這些家族包括具有以下的氨基酸：堿性側(cè)鏈(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)，酸性側(cè)鏈(例如天冬氨酸、谷氨酸)，不帶電極性側(cè)鏈(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，非極性側(cè)鏈(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)，β-支鏈的側(cè)鏈(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)以及芳香族側(cè)鏈(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。δ-內(nèi)毒素通常具有五個(gè)保守的序列結(jié)構(gòu)域和三個(gè)保守的結(jié)構(gòu)性結(jié)構(gòu)域(參見，例如戴馬格德(deMaagd)等人(2001)遺傳學(xué)趨勢(shì)(TrendsGenetics)17:193-199)。第一個(gè)保守的結(jié)構(gòu)性結(jié)構(gòu)域由7個(gè)α螺旋組成并且參與膜插入和孔形成。結(jié)構(gòu)域II由排列成希臘鑰匙構(gòu)型的三個(gè)β片層組成并且結(jié)構(gòu)域III由“果凍卷”結(jié)構(gòu)中的兩個(gè)反向平行的β片層組成(戴馬格德(deMaagd)等人，2001，同上)。結(jié)構(gòu)域II和III參與受體識(shí)別和結(jié)合，并且因此被認(rèn)為是毒素特異性的決定簇。氨基酸置換可以在保留功能的非保守性區(qū)域中做出。通常，此類置換并非針對(duì)保守的氨基酸殘基、或針對(duì)在保守基序內(nèi)的氨基酸殘基而做出，其中此類殘基是蛋白活性所必需的。保守的并且對(duì)于蛋白質(zhì)活性可能是必需的殘基的實(shí)例包括例如以下殘基，這些殘基在與本發(fā)明的序列相似或相關(guān)的毒素的比對(duì)中所包括的所有蛋白質(zhì)之間是相同(例如，在同源蛋白的比對(duì)中是相同的殘基)。保守的但可能允許保守性氨基酸置換、并且仍保留活性的殘基的實(shí)例包括例如以下殘基，這些殘基在與本發(fā)明的序列相似或相關(guān)的毒素的比對(duì)中所包括的所有蛋白質(zhì)之間僅具有保守性置換(例如，在比對(duì)同源蛋白中所包括的所有蛋白質(zhì)之間僅具有保守性置換的殘基)。然而，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，功能性變體在保守的殘基中可以具有少量的保守性或非保守性改變?？商娲?，可以通過(guò)沿著該編碼序列的全部或部分隨機(jī)地引入突變(如通過(guò)飽和誘變)來(lái)制備變體核苷酸序列，并且可以針對(duì)賦予殺有害生物活性的能力來(lái)篩選得到的突變體以鑒定保留活性的突變體。在誘變之后，可以重組表達(dá)編碼的蛋白，并且可以使用標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)定技術(shù)來(lái)測(cè)定蛋白的活性。使用諸如PCR、雜交、以及類似的方法可以鑒定出相應(yīng)的殺有害生物序列，這樣的序列與本發(fā)明的序列具有實(shí)質(zhì)性上的一致性。參見例如薩姆布魯克(Sambrook)和拉塞爾(Russell)(2001)分子克隆：實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(MolecularCloning:ALaboratoryManual.)(冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(ColdSpringHarborLaboratoryPress)，冷泉港(ColdSpringHarbor)，紐約)以及英尼斯(Innis)等人(1990)PCR方案：方法和應(yīng)用指導(dǎo)(PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications)(學(xué)術(shù)出版社(AcademicPress)，紐約)。在一種雜交方法中，該殺有害生物核苷酸序列的全部或部分可以用于篩選cDNA或基因組文庫(kù)。用于構(gòu)建此類cDNA和基因組文庫(kù)的方法在本領(lǐng)域內(nèi)通常是已知的，并且披露于薩姆布魯克和拉塞爾，2001，同上。所謂的雜交探針可以是基因組DNA片段、cDNA片段、RNA片段、或其他寡核苷酸，并且可以用一個(gè)可檢測(cè)基團(tuán)(如32P、或任何其他可檢測(cè)的標(biāo)記物，如其他放射性同位素、一種熒光化合物、一種酶、或一種酶輔因子)進(jìn)行標(biāo)記?？梢曰谠诖伺兜囊阎木幋a殺有害生物蛋白的核苷酸序列通過(guò)標(biāo)記合成寡核苷酸來(lái)制備用于雜交的探針?？梢粤硗獾厥褂煤?jiǎn)并引物，這些引物是基于在該核苷酸序列或編碼的氨基酸序列中的保守性核苷酸或氨基酸殘基而設(shè)計(jì)的。這種探針典型地包括以下核苷酸序列的區(qū)域，這些核苷酸序列區(qū)域在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明的編碼殺有害生物蛋白的核苷酸序列或它的片段或變體的至少約12個(gè)、至少約25個(gè)、至少約50、75、100、125、150、175、或200個(gè)連續(xù)核苷酸進(jìn)行雜交。用于制備用于雜交的探針的方法通常是本領(lǐng)域已知的，并且披露于薩姆布魯克和拉塞爾，2001(同上)中，該文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合在此。例如，在此披露的完整的殺有害生物序列、或它的一個(gè)或多個(gè)部分可以用作探針，該探針能夠與相應(yīng)的殺有害生物蛋白樣序列以及信使RNA特異性地雜交。為了實(shí)現(xiàn)在不同的條件下的特異性雜交，這樣的探針包括以下序列，這些序列是獨(dú)特的并且長(zhǎng)度優(yōu)選為至少約10個(gè)核苷酸、或長(zhǎng)度為至少約20個(gè)核苷酸。這樣的探針可以用于通過(guò)PCR從一種選擇的生物中擴(kuò)增相應(yīng)的殺有害生物序列。這種技術(shù)可以用于從一種所希望的生物中分離另外的編碼序列，或用作一種診斷性測(cè)定以便確定在一種生物中的編碼序列的存在。雜交技術(shù)包括雜交篩選平板接種的DNA文庫(kù)(噬斑抑或菌落；參見，例如薩姆布魯克等人(1989)分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)(第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約))。因此，本發(fā)明涵蓋了用于雜交的探針以及能夠與本發(fā)明的核苷酸序列的全部或部分(例如，至少約300個(gè)核苷酸、至少約400個(gè)、至少約500、1000、1200、1500、2000、2500、3000、3500個(gè)核苷酸、或者達(dá)到在此披露的一個(gè)核苷酸序列的全長(zhǎng))雜交的核苷酸序列。這樣的序列的雜交可以在嚴(yán)格條件下進(jìn)行?！皣?yán)格條件”或“嚴(yán)格雜交條件”是指以下條件，在這些條件下與其他序列相比一種探針將與它的目標(biāo)序列雜交達(dá)到一個(gè)可檢測(cè)地更大的程度(例如，超過(guò)背景至少2倍)。嚴(yán)格條件是序列依賴性的并且在不同的情形下將會(huì)不同。通過(guò)控制雜交和/或洗滌條件的嚴(yán)格性，可以鑒定出與該探針100％互補(bǔ)的目標(biāo)序列(同源探測(cè))。可替代地，可以調(diào)整嚴(yán)格條件以允許序列中的一些錯(cuò)配，這樣使得檢測(cè)到更低程度的相似性(異源探測(cè))。通常，探針的長(zhǎng)度為小于約1000個(gè)核苷酸，優(yōu)選地長(zhǎng)度小于500個(gè)核苷酸。典型地，嚴(yán)格條件將是以下條件，在這些條件下鹽濃度在pH7.0至8.3下是小于約1.5MNa離子、典型地約0.01至1.0MNa離子濃度(或其他鹽類)，并且溫度對(duì)于短探針(例如，10至50個(gè)核苷酸)為至少約30℃，而對(duì)于長(zhǎng)探針(例如，超過(guò)50個(gè)核苷酸)為至少約60℃。還可以通過(guò)加入去穩(wěn)定劑(如甲酰胺)實(shí)現(xiàn)嚴(yán)格條件。示例性低嚴(yán)格條件包括在37℃下在30％至35％甲酰胺、1MNaCl、1％SDS(十二烷基硫酸鈉)的緩沖溶液中進(jìn)行雜交以及在50℃至55℃下在1X至2XSSC(20XSSC＝3.0MNaCl/0.3M檸檬酸三鈉)進(jìn)行洗滌。示例性中等嚴(yán)格條件包括在37℃下在40％至45％甲酰胺、1.0MNaCl、1％SDS中進(jìn)行雜交以及在55℃至60℃下在0.5X至1XSSC中進(jìn)行洗滌。示例性高嚴(yán)格條件包括在37℃下在50％甲酰胺、1MNaCl、1％SDS中進(jìn)行雜交以及在60℃至65℃下在0.1XSSC中進(jìn)行洗滌。任選地，洗滌緩沖液可包括約0.1％至約1％SDS。雜交的持續(xù)時(shí)間通常是小于約24小時(shí)，通常為約4至約12小時(shí)。特異性典型地取決于雜交后洗滌的功能，關(guān)鍵因素是最終洗滌溶液的離子強(qiáng)度以及溫度。對(duì)于DNA-DNA雜合體，Tm可以從邁因科思(Meinkoth)和瓦爾(Wahl)(1984)分析生物化學(xué)(Anal.Biochem.)138:267-284的等式中進(jìn)行估計(jì)：Tm＝81.5℃+16.6(logM)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L；其中M是一價(jià)陽(yáng)離子的摩爾濃度，％GC是在DNA中鳥苷和胞嘧啶核苷酸的百分比，％form是在雜交溶液中甲酰胺的百分比，并且L是以堿基對(duì)計(jì)的雜合體的長(zhǎng)度。Tm是50％的互補(bǔ)靶序列與完美匹配的探針雜交時(shí)的溫度(在限定的離子強(qiáng)度及pH下)。對(duì)于每1％錯(cuò)配，Tm降低約1℃；因此，可調(diào)整Tm、雜交的和/或洗滌的條件以便雜交至具有所希望的一致性的序列。例如，如果找到具有>90％一致性的序列，則Tm可以降低10℃。一般來(lái)說(shuō)，將嚴(yán)格條件選擇為比特定序列及其互補(bǔ)物在限定的離子強(qiáng)度以及pH下的熱熔點(diǎn)(Tm)低約5℃。然而，極嚴(yán)格條件可利用低于熱熔點(diǎn)(Tm)1℃、2℃、3℃或4℃的雜交和/或洗滌；中等嚴(yán)格條件可利用低于熱熔點(diǎn)(Tm)6℃、7℃、8℃、9℃或10℃的雜交和/或洗滌；低嚴(yán)格條件可利用低于熱熔點(diǎn)(Tm)11℃、12℃、13℃、14℃、15℃或20℃的雜交和/或洗滌。使用該方程、雜交和洗滌組成以及所希望的Tm，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)理解，雜交的和/或洗滌的溶液嚴(yán)格性的變化固有地得到了描述。如果所希望的錯(cuò)配程度導(dǎo)致小于45℃(水性溶液)或32℃(甲酰胺溶液)的Tm，則優(yōu)選增加SSC濃度，這樣使得可以使用更高的溫度。對(duì)核酸雜交的廣泛指導(dǎo)見于以下文獻(xiàn)：泰森(Tijssen)(1993)生物化學(xué)和分子生物學(xué)中的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)-使用核酸探針雜交(LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology-HybridizationwithNucleicAcidProbes)，第I部分，第2章(愛思唯爾(Elsevier)，紐約)；以及奧蘇貝爾(Ausubel)等人編著(1995)現(xiàn)代分子生物學(xué)方法(CurrentProtocolsinMolecularBiology)，第2章(格林出版社和威力出版社(GreenePublishingandWiley-Interscience)，紐約)。參見，薩姆布魯克等人(1989)分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)(第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約)。分離的蛋白質(zhì)及其變體和片段殺有害生物蛋白也涵蓋于本發(fā)明之內(nèi)。“殺有害生物蛋白”是指具有SEQIDNO:5-26中所列出的氨基酸序列的一種蛋白。還提供了它的片段、生物活性部分以及變體，并且它們可以用于實(shí)踐本發(fā)明的方法。“分離的蛋白”或“重組的蛋白”被用于指代一種蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)不再存在于它的自然環(huán)境中(例如，在體外或在重組體細(xì)菌或植物宿主細(xì)胞中)?！捌巍被颉吧锘钚圆糠帧卑ㄒ韵露嚯钠?，這些多肽片段包含與SEQIDNO:5-26中列出的氨基酸序列足夠地一致的氨基酸序列，并且展示出殺有害生物活性。殺有害生物蛋白的生物活性部分可以是以下多肽，該多肽的長(zhǎng)度例如為10、25、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350個(gè)、或更多個(gè)氨基酸。可以通過(guò)重組技術(shù)制備這樣的生物活性部分，并且對(duì)它們的殺有害生物活性進(jìn)行評(píng)估。用于測(cè)量殺有害生物活性的方法在本領(lǐng)域是熟知的。參見例如查普拉(Czapla)和朗(Lang)(1990)經(jīng)濟(jì)昆蟲學(xué)雜志(J.Econ.Entomol.)83:2480-2485；安德魯斯(Andrews)等人(1988)生物化學(xué)雜志(Biochem.J.)252:199-206；馬羅內(nèi)(Marrone)等人(1985)經(jīng)濟(jì)昆蟲學(xué)雜志(J.ofEconomicEntomology)78:290-293；以及美國(guó)專利號(hào)5,743,477，所有這些文獻(xiàn)都通過(guò)引用以其全文結(jié)合在此。如在此所使用的，一個(gè)片段包含SEQIDNO:5-26的至少8個(gè)連續(xù)的氨基酸。然而，本發(fā)明涵蓋了其他片段，如在長(zhǎng)度大于約10、20、30、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350個(gè)、或更多個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)中的任何片段?！白凅w”是指具有與SEQIDNO:5-26中任一項(xiàng)的氨基酸序列至少約60％、65％、約70％、75％、約80％、85％、約90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％一致的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或多肽。變體還包括由與SEQIDNO:1-4的核酸分子或其互補(bǔ)物在嚴(yán)格條件下雜交的核酸分子編碼的多肽。變體包括由于誘變而在氨基酸序列方面不同的多肽。由本發(fā)明所涵蓋的變體蛋白是生物活性的，即它們繼續(xù)具有所希望的天然蛋白的生物活性，即保留了殺有害生物活性。在一些實(shí)施例中，這些變體相對(duì)于天然蛋白具有改進(jìn)的活性。用于測(cè)量殺有害生物活性的方法在本領(lǐng)域是熟知的。參見例如查普拉(Czapla)和朗(Lang)(1990)經(jīng)濟(jì)昆蟲學(xué)雜志(J.Econ.Entomol.)83:2480-2485；安德魯斯(Andrews)等人(1988)生物化學(xué)雜志(Biochem.J.)252:199-206；馬羅內(nèi)(Marrone)等人(1985)經(jīng)濟(jì)昆蟲學(xué)雜志(J.ofEconomicEntomology)78:290-293；以及美國(guó)專利號(hào)5,743,477，所有這些文獻(xiàn)都通過(guò)引用以其全文結(jié)合在此。細(xì)菌基因(如本發(fā)明的axmi基因)在開放閱讀框的起始附近常常具有多個(gè)甲硫氨酸起始密碼子。經(jīng)常，在這些起始密碼子中的一個(gè)或多個(gè)處的翻譯起始將導(dǎo)致一種功能蛋白的產(chǎn)生。這些起始密碼子可以包括ATG密碼子。然而，細(xì)菌(如，芽孢桿菌)還將該密碼子GTG識(shí)別為一個(gè)起始密碼子，并且在GTG密碼子上起始翻譯的蛋白質(zhì)在第一個(gè)氨基酸上包括一個(gè)甲硫氨酸。在少數(shù)情況下，細(xì)菌系統(tǒng)中的翻譯可以在TTG密碼子處啟動(dòng)，盡管在這種情況下TTG編碼一個(gè)甲硫氨酸。此外，常常不首先確定這些密碼子中的哪一些在細(xì)菌中自然地使用。因此，應(yīng)當(dāng)理解，使用這些可替代的甲硫氨酸密碼子之一也可能導(dǎo)致殺有害生物蛋白的產(chǎn)生。這些殺有害生物蛋白涵蓋于本發(fā)明之中，并且可以在本發(fā)明的這些方法中使用。應(yīng)當(dāng)理解的是當(dāng)在植物中表達(dá)時(shí)將有必要將替代起始密碼子改變?yōu)锳TG以用于正確的翻譯。在本發(fā)明的不同實(shí)施例中，殺有害生物蛋白包括從在此披露的全長(zhǎng)核苷酸序列中推導(dǎo)出的氨基酸序列、以及由于使用替代的下游起始位點(diǎn)而比這些全長(zhǎng)序列更短的氨基酸序列。因此，本發(fā)明的核苷酸序列和/或包含本發(fā)明的核苷酸序列的載體、宿主細(xì)胞以及植物(以及制備和使用本發(fā)明的核苷酸序列的方法)可以包含編碼與SEQIDNO:6、7、8、9、10、12、13、14、16、17、18、19、21、22、23、24、25和26相應(yīng)的氨基酸序列的核苷酸序列。還涵蓋了針對(duì)本發(fā)明的多肽、或它們的變體或片段的抗體。用于產(chǎn)生抗體的方法在本領(lǐng)域是熟知的(參見，例如哈洛(Harlow)和拉內(nèi)(Lane)(1988)抗體：實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(Antibodies:ALaboratoryManual)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，紐約；美國(guó)專利號(hào)4,196,265)。因此，本發(fā)明一方面涉及與本發(fā)明的蛋白或肽分子中的一種或多種以及它們的同源物、融合物或片段特異性結(jié)合的抗體、單鏈抗原結(jié)合分子、或其他蛋白。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施例中，該抗體與具有SEQIDNO:5-26中列出的氨基酸序列的蛋白或其片段特異性地結(jié)合。在另一個(gè)實(shí)施例中，該抗體與包含選自SEQIDNO:5-26中列出的氨基酸序列的一個(gè)氨基酸序列的融合蛋白或其片段特異性地結(jié)合。本發(fā)明的抗體可以用于定量地或定性地檢測(cè)本發(fā)明的蛋白或肽分子、或者檢測(cè)這些蛋白的翻譯后修飾。如在此所使用的，如果一種抗體或肽與本發(fā)明的一種蛋白或肽分子的結(jié)合不被非相關(guān)分子的存在競(jìng)爭(zhēng)性地抑制，則將這種結(jié)合稱為“特異性地結(jié)合”。本發(fā)明的抗體可以被包含在一個(gè)試劑盒中，該試劑盒用于檢測(cè)本發(fā)明的蛋白或肽分子。本發(fā)明進(jìn)一步包括一種檢測(cè)本發(fā)明的蛋白或肽分子(特別是由SEQIDNO:5-26中列出的氨基酸序列編碼的一種蛋白，包括能夠特異性結(jié)合到本發(fā)明的抗體的變體或片段)的方法，該方法包括使一種樣品與本發(fā)明的抗體接觸，并且確定該樣品是否含有本發(fā)明的蛋白或肽分子。用于利用抗體來(lái)檢測(cè)感興趣的蛋白或肽的方法是本領(lǐng)域中已知的。改變或改進(jìn)的變體應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，可以通過(guò)不同的方法來(lái)改變一種殺有害生物蛋白的DNA序列，并且這些改變可以導(dǎo)致編碼以下蛋白質(zhì)的DNA序列，這些蛋白質(zhì)具有不同于由本發(fā)明的一種殺有害生物蛋白編碼的氨基酸序列的那些。這種蛋白可以按照不同的方式進(jìn)行改變，包括SEQIDNO:5-26的一個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基酸置換、缺失、截短、以及插入，包括多達(dá)約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約15、約20、約25、約30、約35、約40、約45、約50、約55、約60、約65、約70、約75、約80、約85、約90、約100、約105、約110、約115、約120、約125、約130、約135、約140、約145、約150、約155個(gè)、或更多個(gè)氨基酸置換、缺失或插入。用于此類操作的方法在本領(lǐng)域內(nèi)通常是己知的。例如，通過(guò)在DNA中的突變可以制備一種殺有害生物蛋白的氨基酸序列變體。這還可以通過(guò)幾種誘變形式之一和/或在定向進(jìn)化中來(lái)完成。在某些方面，在該氨基酸序列中所編碼的改變將基本上不影響該蛋白的功能。這樣的變體將具有所希望的殺有害生物活性。然而，應(yīng)當(dāng)理解，可以通過(guò)使用這樣的技術(shù)改進(jìn)殺有害生物蛋白對(duì)本發(fā)明的這些組合物所賦予的殺有害生物活性的能力。例如，可以在以下宿主細(xì)胞中表達(dá)一種殺有害生物蛋白，這些宿主細(xì)胞在DNA復(fù)制過(guò)程中顯示出高比率的堿基錯(cuò)摻，如XL-1Red(Stratagene公司，拉荷亞(LaJolla)，加利福尼亞州)。在這樣的菌株中繁殖之后，可以分離出DNA(例如通過(guò)制備質(zhì)粒DNA，或通過(guò)由PCR進(jìn)行擴(kuò)增并且將得到的PCR片段克隆到載體中)，在非誘變菌株中培養(yǎng)這些殺有害生物蛋白突變體，并且鑒定具有殺有害生物活性的經(jīng)突變的基因，例如通過(guò)進(jìn)行一項(xiàng)對(duì)殺有害生物活性進(jìn)行測(cè)試的測(cè)定。通常，在攝食測(cè)定中混合并使用了這種蛋白。參見，例如馬羅內(nèi)等人(1985)經(jīng)濟(jì)昆蟲學(xué)雜志78:290-293。這樣的測(cè)定可包括使植物與一種或多種有害生物接觸，并且確定該植物的存活和/或引起有害生物死亡的能力。導(dǎo)致毒性增加的突變的實(shí)例見于史涅夫(Schnepf)等人(1998)微生物學(xué)與分子生物學(xué)評(píng)論(Microbiol.Mol.Biol.Rev.)62:775-806?？商娲?，可以在氨基或羧基的末端上對(duì)多種蛋白質(zhì)的蛋白序列進(jìn)行改變，而基本上不影響活性。這可以包括通過(guò)現(xiàn)代分子方法所引入的插入、缺失、或改變，這些方法如PCR，包括PCR擴(kuò)增，這些PCR擴(kuò)增借助于將編碼氨基酸的序列包括到在PCR擴(kuò)增中所使用的寡核苷酸之中而改變或延長(zhǎng)了該編碼蛋白的序列?？商娲兀尤氲牡鞍仔蛄锌梢园ㄍ暾木幋a蛋白的序列，如在本領(lǐng)域內(nèi)通常用于產(chǎn)生蛋白融合物的那些序列。這樣的融合蛋白常常用于(1)增加感興趣的蛋白的表達(dá)；(2)引入結(jié)合結(jié)構(gòu)域、酶活性、或表位以促進(jìn)蛋白純化、蛋白檢測(cè)、或本領(lǐng)域已知的其他實(shí)驗(yàn)用途；或(3)將蛋白的分泌或翻譯靶向亞細(xì)胞器，如革蘭氏陰性菌的壁膜間隙，或真核細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，后者常常導(dǎo)致蛋白的糖基化。本發(fā)明的變體核苷酸和氨基酸序列還涵蓋了由誘變和致重組操作程序(如DNA改組)所衍生的序列。使用這樣的操作，可以將一個(gè)或多個(gè)不同的殺有害生物蛋白編碼區(qū)用于創(chuàng)造出一種具有所希望的性質(zhì)的新殺有害生物蛋白。按照這種方式，從包括以下序列區(qū)域的相關(guān)序列多核苷酸的種群中產(chǎn)生重組多核苷酸的文庫(kù)，這些序列區(qū)域具有基本的序列一致性并且可以在體外或體內(nèi)進(jìn)行同源重組。例如，使用這種方法，可以將編碼一個(gè)感興趣的結(jié)構(gòu)域的序列基序在本發(fā)明的一個(gè)殺有害生物基因與其他已知的殺有害生物基因之間進(jìn)行改組，以獲得編碼一種蛋白質(zhì)的新基因，該蛋白質(zhì)具有一種改進(jìn)的感興趣的性質(zhì)，例如一種增加的殺昆蟲活性。用于這樣的DNA改組的策略在本領(lǐng)域內(nèi)是己知的。參見例如施特默爾(Stemmer)(1994)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊91:10747-10751；施特默爾(1994)自然(Nature)370:389-391；卡莫瑞(Crameri)等人(1997)自然生物技術(shù)(NatureBiotech.)15:436-438；摩爾(Moore)等人(1997)分子生物學(xué)雜志272:336-347；張(Zhang)等人(1997)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊94:4504-4509；卡莫瑞等人(1998)自然391:288-291；以及美國(guó)專利號(hào)5,605,793和5,837,458。結(jié)構(gòu)域交換或改組是針對(duì)產(chǎn)生改變的殺有害生物蛋白的另一種機(jī)制?？稍跉⒂泻ι锏鞍字g交換結(jié)構(gòu)域，從而導(dǎo)致具有改進(jìn)的殺有害生物活性或靶標(biāo)譜的雜合或嵌合毒素。用于產(chǎn)生重組蛋白和測(cè)試它們的殺有害生物活性的方法在本領(lǐng)域是熟知的(參見，例如，納莫夫(Naimov)等人(2001)應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)(Appl.Environ.Microbiol.)67:5328-5330；戴馬格德(deMaagd)等人(1996)應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)62:1537-1543；格(Ge)等人(1991)生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)266:17954-17958；史涅夫等人(1990)生物化學(xué)雜志265:20923-20930；蘭格(Rang)等人(1999)應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)65:2918-2925)。載體本發(fā)明的殺有害生物序列可以被提供在用于在感興趣的植物中表達(dá)的表達(dá)盒中。關(guān)于“植物表達(dá)盒”是指DNA構(gòu)建體，該構(gòu)建體能夠?qū)е乱环N蛋白質(zhì)在一種植物細(xì)胞中從一個(gè)開放閱讀框中的表達(dá)。典型地，這些構(gòu)建體包括啟動(dòng)子和編碼序列。經(jīng)常，這樣的構(gòu)建體還將包括3'非翻譯區(qū)。這樣的構(gòu)建體可以包括“信號(hào)序列”或“前導(dǎo)序列”，以促進(jìn)該肽的共翻譯成或翻譯后運(yùn)輸至某些細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)，如葉綠體(或其他質(zhì)體)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、或高爾基體。關(guān)于“信號(hào)序列”是指是已知或懷疑導(dǎo)致跨過(guò)該細(xì)胞膜的共翻譯或翻譯后肽運(yùn)輸?shù)男蛄?。在真核生物中，這典型地涉及分泌到高爾基體內(nèi)，其中具有某些產(chǎn)生的糖基化。細(xì)菌的殺昆蟲毒素經(jīng)常被合成為原毒素，它們是在該目標(biāo)有害生物的腸中被蛋白水解激活(常(Chang)(1987)酶學(xué)方法(MethodsEnzymol.)153:507-516)。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，信號(hào)序列位于天然序列中，或可以衍生自本發(fā)明的一個(gè)序列。關(guān)于“前導(dǎo)序列”是指當(dāng)被翻譯時(shí)導(dǎo)致足以觸發(fā)該肽鏈的共翻譯運(yùn)輸至一個(gè)亞細(xì)胞器的氨基酸序列的任何序列。因此，這包括通過(guò)進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)、進(jìn)入液泡、質(zhì)體(包括葉綠體、線粒體)等中來(lái)對(duì)運(yùn)輸和/或糖基化進(jìn)行靶向的前導(dǎo)序列。關(guān)于“植物轉(zhuǎn)化載體”是指一種DNA分子，該分子對(duì)于有效轉(zhuǎn)化一個(gè)植物細(xì)胞而言是必需的。這種分子可以由一個(gè)或多個(gè)植物表達(dá)盒組成，或可以被組織到超過(guò)一個(gè)的“載體”DNA分子中。例如，二元載體是植物轉(zhuǎn)化載體，它們利用兩個(gè)非連續(xù)DNA載體來(lái)編碼用于植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化的所有需求的順式和反式作用功能(海倫斯(Hellens)和姆林內(nèi)克斯(Mullineaux)(2000)植物科學(xué)趨勢(shì)(TrendsinPlantScience)5:446-451)?！拜d體”是指用于在不同的宿主細(xì)胞之間進(jìn)行轉(zhuǎn)移的核酸構(gòu)建體?！氨磉_(dá)載體”是指一種載體，該載體具有將異源的DNA序列或片段結(jié)合、整合到一種外源細(xì)胞中并在其中表達(dá)該異源DNA序列或片段的能力。該盒將包括與本發(fā)明的一個(gè)序列可操作地連接的5'和3'調(diào)節(jié)序列。關(guān)于“可操作地連接”是指在一個(gè)啟動(dòng)子與一個(gè)第二序列之間的功能性連接，其中該啟動(dòng)子序列引發(fā)并介導(dǎo)了相應(yīng)于該第二序列的DNA序列的轉(zhuǎn)錄。一般來(lái)說(shuō)，可操作地連接是指所連接的核酸序列是連續(xù)的，并且當(dāng)需要接合兩個(gè)蛋白質(zhì)編碼區(qū)時(shí)，是連續(xù)的并且處于同一讀碼框中。該盒可以另外地包括至少一種有待共轉(zhuǎn)化到生物中的另外的基因?？商娲?，可以在多個(gè)表達(dá)盒上提供這種或這些另外的基因。在不同實(shí)施例中，本發(fā)明的核苷酸序列被可操作地連接至啟動(dòng)子，例如植物啟動(dòng)子?！皢?dòng)子”是指一個(gè)核酸序列，該核酸序列發(fā)揮作用以指導(dǎo)下游編碼序列的轉(zhuǎn)錄。該啟動(dòng)子連同其他轉(zhuǎn)錄和翻譯的調(diào)節(jié)性核酸序列(也被稱為“控制序列”)是感興趣的DNA序列的表達(dá)所必需的。這種表達(dá)盒配備有多個(gè)限制位點(diǎn)，這些限制位點(diǎn)用于插入該殺有害生物序列以便處于這些調(diào)節(jié)區(qū)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)之下。該表達(dá)盒將以5'至3'的轉(zhuǎn)錄方向包括一個(gè)轉(zhuǎn)錄和翻譯的起始區(qū)(即，一個(gè)啟動(dòng)子)、一種本發(fā)明的DNA序列、以及在植物中發(fā)揮作用的一個(gè)翻譯和轉(zhuǎn)錄的終止區(qū)(即，終止區(qū))。該啟動(dòng)子對(duì)于該植物宿主和/或本發(fā)明的DNA序列而言可以是天然的或類似的、或外源的或異源的。另外地，該啟動(dòng)子可以是天然序列或可替代地是一個(gè)合成序列。在該啟動(dòng)子對(duì)于該植物宿主而言是“天然的”或“同源的”的情況下，它是指該啟動(dòng)子是在該啟動(dòng)子所引入的天然植物中被發(fā)現(xiàn)的。在啟動(dòng)子對(duì)于本發(fā)明的DNA序列而言是“外源的”或“異源的”的情況下，它是指該啟動(dòng)子對(duì)于可操作地連接的本發(fā)明的DNA序列而言不是天然的或天然存在的啟動(dòng)子。該終止區(qū)對(duì)于轉(zhuǎn)錄起始區(qū)而言可以是天然的，對(duì)于可操作地連接的感興趣的DNA序列而言可以是天然的，對(duì)于該植物宿主而言可以是天然的，或可以衍生自另一種來(lái)源(即，對(duì)于該啟動(dòng)子、該感興趣的DNA序列、該植物宿主、或它們的任何組合而言是外源的或異源的)。方便的終止區(qū)可以獲自根瘤土壤桿菌(A.tumefaciens)的Ti質(zhì)粒，如章魚堿合成酶和胭脂堿合成酶的終止區(qū)。還參見，喬瑞諾(Guerineau)等人(1991)分子遺傳學(xué)與普通遺傳學(xué)(Mol.Gen.Genet.)262:141-144；普勞德富特(Proudfoot)(1991)細(xì)胞(Cell)64:671-674；桑斯法岡(Sanfacon)等人(1991)基因與發(fā)育(GenesDev.)5:141-149；摩根(Mogen)等人(1990)植物細(xì)胞(PlantCell)2:1261-1272；芒羅(Munroe)等人(1990)基因(Gene)91:151-158；巴拉斯(Ballas)等人(1989)核酸研究(NucleicAcidsRes.)17:7891-7903；以及喬希(Joshi)等人(1987)核酸研究15:9627-9639)。在適當(dāng)情況下，可以針對(duì)在轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中的增加的表達(dá)來(lái)優(yōu)化這種或這些基因。即，可以使用宿主細(xì)胞偏愛的密碼子來(lái)合成這些基因以用于改進(jìn)的表達(dá)，或者能以宿主偏愛的密碼子使用頻率使用密碼子來(lái)合成這些基因。通常，該基因的GC含量會(huì)增加。參見，例如，坎貝爾(Campbell)和哥瑞(Gowri)(1990)植物生理學(xué)(PlantPhysiol.)92:1-11，它討論了宿主偏愛的密碼子使用。在本領(lǐng)域中用于合成植物偏好基因的多種方法是可獲得的。參見例如美國(guó)專利號(hào)5,380,831和5,436,391、美國(guó)專利公開號(hào)20090137409、以及莫里(Murray)等人(1989)核酸研究17:477-498，它們通過(guò)引用結(jié)合在此。在一個(gè)實(shí)施例中，將殺有害生物蛋白靶向葉綠體而用于表達(dá)。按照這種方式，在該殺有害生物蛋白未直接被插到該葉綠體中時(shí)，該表達(dá)盒將另外地包括編碼轉(zhuǎn)運(yùn)肽的核酸以便將該殺有害生物蛋白導(dǎo)向該葉綠體。這些轉(zhuǎn)運(yùn)肽在本領(lǐng)域是已知的。參見例如，馮穧海耶(VonHeijne)等人(1991)植物分子生物學(xué)導(dǎo)報(bào)(PlantMol.Biol.Rep.)9:104-126；克里克(Clark)等人(1989)生物化學(xué)雜志264:17544-17550；岱拉-喬帕(Della-Cioppa)等人(1987)植物生理學(xué)84:965-968；羅默(Romer)等人(1993)生物化學(xué)和生物物理研究通訊(Biochem.Biophys.Res.Commun.)196:1414-1421；以及沙阿(Shah)等人(1986)科學(xué)(Science)233:478-481。可以針對(duì)在葉綠體中的表達(dá)來(lái)優(yōu)化被靶向該葉綠體的殺有害生物基因，以便考慮在該植物細(xì)胞核與這種細(xì)胞器之間在密碼子使用方面的差異。按照這種方式，可以使用葉綠體偏愛的密碼子來(lái)合成感興趣的核酸。參見，例如，美國(guó)專利號(hào)5,380,831，該專利通過(guò)引用結(jié)合在此。植物轉(zhuǎn)化本發(fā)明的方法涉及將核苷酸構(gòu)建體引入到植物中。關(guān)于“引入”是指按照以下方式將該核苷酸構(gòu)建體給予該植物，該方式使得該構(gòu)建體獲得接近該植物的一個(gè)細(xì)胞的內(nèi)部的途徑。本發(fā)明的方法不需要使用將一個(gè)核苷酸構(gòu)建體引入植物中的一種具體方法，只需要該核苷酸構(gòu)建體獲得接近該植物的至少一個(gè)細(xì)胞的內(nèi)部的途徑。用于將核苷酸構(gòu)建體引入到植物中的方法是本領(lǐng)域已知的，這些方法包括但不限于：穩(wěn)定轉(zhuǎn)化法、瞬時(shí)轉(zhuǎn)化法、以及病毒介導(dǎo)法。關(guān)于“植物”是指整個(gè)植物、植物器官(例如，葉子、莖、根等)、種子、植物細(xì)胞、繁殖體、胚以及它們的子代。植物細(xì)胞可以是分化的或未分化的(例如，愈傷組織、懸浮培養(yǎng)細(xì)胞、原生質(zhì)體、葉細(xì)胞、根細(xì)胞、韌皮部細(xì)胞、花粉)?！稗D(zhuǎn)基因植物”或“轉(zhuǎn)化的植物”或“穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的”植物或細(xì)胞或組織是指已經(jīng)將外源的核酸序列或DNA片段結(jié)合或整合到該植物細(xì)胞中的植物。這些核酸序列包括外源的、或不存在于該未轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞中的那些序列、以及可以是內(nèi)源的、或存在于該未轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞中的那些序列。“異源的”通常是指以下核酸序列，這些核酸序列對(duì)于它們所在的細(xì)胞或天然基因組的一部分而言不是內(nèi)源的，并且已經(jīng)通過(guò)感染、轉(zhuǎn)染、顯微注射、電穿孔、微粒轟擊、或類似方法添加到該細(xì)胞中。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)了在此披露的新穎的毒素序列中的一種或多種。在不同實(shí)施例中，該轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)一步包括一種或多種另外的昆蟲抗性基因(例如，Cry1，如Cry1A、Cry1B、Cry1C、Cry1D、Cry1E、以及Cry1F家族的成員；Cry2，如Cry2A家族的成員；Cry9，如Cry9A、Cry9B、Cry9C、Cry9D、Cry9E、以及Cry9F家族的成員；等)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，轉(zhuǎn)基因植物可以包括賦予一種感興趣的農(nóng)藝性狀的任何基因。通過(guò)在本領(lǐng)域內(nèi)已知的幾種技術(shù)之一可以實(shí)現(xiàn)植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。可以對(duì)本發(fā)明的殺有害生物基因進(jìn)行修飾以便在植物細(xì)胞中獲得或增強(qiáng)表達(dá)。典型地，表達(dá)這種蛋白質(zhì)的一個(gè)構(gòu)建體將包括一個(gè)驅(qū)動(dòng)該基因的轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子、以及一個(gè)允許轉(zhuǎn)錄終止和多腺苷酸化的3'非翻譯區(qū)。這樣的構(gòu)建體的組織在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的。在一些情況下，可能有用的是將該基因工程化使得所得到的肽被分泌、或者以其他方式靶向在植物細(xì)胞中。例如，該基因可以被工程化以包括信號(hào)肽來(lái)促進(jìn)該肽轉(zhuǎn)移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。還可以優(yōu)選使該植物表達(dá)盒工程化以包括內(nèi)含子，使得該內(nèi)含子的mRNA加工是表達(dá)所需要的。典型地，這種“植物表達(dá)盒”將被插入一種“植物轉(zhuǎn)化載體”中。這種植物轉(zhuǎn)化載體可以包括對(duì)于實(shí)現(xiàn)植物轉(zhuǎn)化所需要的一個(gè)或多個(gè)DNA載體。例如，利用包括超過(guò)一個(gè)連續(xù)DNA區(qū)段的植物轉(zhuǎn)化載體在本領(lǐng)域內(nèi)是一種常見的實(shí)踐。在本領(lǐng)域內(nèi)，這些載體經(jīng)常被稱為“二元載體”。二元載體連同具有輔助質(zhì)粒的載體是大多常用于土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化的，其中達(dá)到有效轉(zhuǎn)化所需要的DNA區(qū)段的大小和復(fù)雜性是相當(dāng)大的，并且有利的是將多種功能在分開的DNA分子上分開。二元載體典型地包括質(zhì)粒載體，該質(zhì)粒載體包括對(duì)于T-DNA轉(zhuǎn)移所需要的順式作用序列(如左邊界和右邊界)、被工程化以便能夠在一個(gè)植物細(xì)胞中表達(dá)的一個(gè)選擇標(biāo)記、以及一個(gè)“感興趣的基因”(一個(gè)被工程化以便能夠在植物細(xì)胞中表達(dá)的基因，對(duì)于它而言轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)生是所希望的)。在這種質(zhì)粒載體上還存在著細(xì)菌復(fù)制所需要的序列。這些順式作用序列以如下方式進(jìn)行排列以便允許有效轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中并在其中進(jìn)行表達(dá)。例如，該選擇標(biāo)記基因以及該殺有害生物基因位于該左邊界與右邊界之間。經(jīng)常，一個(gè)第二質(zhì)粒載體包括介導(dǎo)T-DNA從土壤桿菌轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中的反式作用因子。這種質(zhì)粒經(jīng)常包括這些毒性功能(Vir基因)，這些毒性功能允許由土壤桿菌感染植物細(xì)胞，并且通過(guò)在邊界序列上的切割以及vir介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移來(lái)轉(zhuǎn)移DNA，如在本領(lǐng)域中所理解(海倫斯和姆林內(nèi)克斯(2000)植物科學(xué)趨勢(shì)5:446-451)。幾種類型的土壤桿菌屬菌株(例如，LBA4404、GV3101、EHA101、EHA105、等)可以用于植物轉(zhuǎn)化。該第二質(zhì)粒載體是通過(guò)其他方法(如微粒轟擊、顯微注射、電穿孔、聚乙二醇、等)轉(zhuǎn)化這些植物所不需要的。通常，植物轉(zhuǎn)化法類涉及將異源DNA轉(zhuǎn)移到目標(biāo)植物細(xì)胞(例如，未成熟或成熟的胚、懸浮培養(yǎng)物、未分化的愈傷組織、原生質(zhì)體，等等)中，之后跟隨應(yīng)用一個(gè)最大閾值水平的合適選擇(取決于這種選擇標(biāo)記基因)，以便從一群未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞團(tuán)中回收這些轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。典型地將外植體轉(zhuǎn)移到一種新鮮供應(yīng)的相同培養(yǎng)基中并將其常規(guī)培養(yǎng)。隨后，在被置于補(bǔ)充有一種最大閾值水平的選擇試劑的再生培養(yǎng)基上之后，這些轉(zhuǎn)化的細(xì)胞分化成芽。然后，將這些芽轉(zhuǎn)移到一種選擇性生根培養(yǎng)基中用于回收已生根的芽或小植株。隨后，轉(zhuǎn)基因小植株生長(zhǎng)成成熟植物并產(chǎn)生能育種子(例如，日江井(Hiei)等人(1994)植物雜志(ThePlantJournal)6:271-282；石田(Ishida)等人(1996)自然生物技術(shù)(NatureBiotechnology)14:745-750)。典型地將外植體轉(zhuǎn)移到一種新鮮供應(yīng)的相同培養(yǎng)基中并將其常規(guī)培養(yǎng)。用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的技術(shù)和方法的一般說(shuō)明可見于艾爾絲(Ayres)和帕克(Park)(1994)植物科學(xué)的關(guān)鍵性評(píng)論(CriticalReviewsinPlantScience)13:219-239以及柏木妮(Bommineni)和裘哈爾(Jauhar)(1997)Maydica42:107-120。因?yàn)檫@種轉(zhuǎn)化的材料包括多個(gè)細(xì)胞；轉(zhuǎn)化的和未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞二者都存在于受試的靶標(biāo)愈傷組織或細(xì)胞組織或組群的任何部分中。殺死未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞并允許轉(zhuǎn)化的細(xì)胞進(jìn)行增殖的能力導(dǎo)致了轉(zhuǎn)化的植物培養(yǎng)物。經(jīng)常，去除未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的能力是快速回收轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞以及成功產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的一個(gè)限制。轉(zhuǎn)化方案以及用于將核苷酸序列引入到植物中的方案可依據(jù)靶向用于轉(zhuǎn)化的植物或植物細(xì)胞的類型(即，單子葉或雙子葉)而變化。轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)生可以通過(guò)幾種方法之一來(lái)進(jìn)行，包括但不限于：顯微注射、電穿孔、直接基因轉(zhuǎn)移、通過(guò)土壤桿菌將異源DNA引入植物細(xì)胞中(土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化)、用粘附于粒子上的異源外源DNA來(lái)轟擊植物細(xì)胞、射彈粒子加速(ballisticparticleacceleration)、氣溶膠束轉(zhuǎn)化(aerosolbeamtransformation)(美國(guó)公開申請(qǐng)?zhí)?0010026941；美國(guó)專利號(hào)4,945,050；國(guó)際公開號(hào)WO91/00915；美國(guó)公開申請(qǐng)?zhí)?002015066)、Lec1轉(zhuǎn)化、以及用于轉(zhuǎn)移DNA的不同的其他非粒子直接介導(dǎo)法。用于葉綠體轉(zhuǎn)化的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是己知的。參見，例如，什瓦布(Svab)等人(1990)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊87:8526-8530；什瓦布和馬利加(Maliga)(1993)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊90:913-917；什瓦布和馬利加(1993)歐洲分子生物學(xué)雜志(EMBOJ.)12:601-606。該方法依靠將含有一種選擇標(biāo)記的DNA的粒子槍遞送到質(zhì)體基因組中并且通過(guò)同源重組將該DNA靶向該質(zhì)體基因組中。另外，質(zhì)體轉(zhuǎn)化可以通過(guò)一個(gè)核編碼的以及質(zhì)體指導(dǎo)的RNA聚合酶的組織偏愛的表達(dá)、通過(guò)沉默的攜帶質(zhì)體的轉(zhuǎn)基因的反式激活來(lái)完成。這種系統(tǒng)已經(jīng)報(bào)道于麥克布賴德(McBride)等人(1994)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊91:7301-7305。在將異源外源DNA整合到植物細(xì)胞中之后，然后在該培養(yǎng)基中應(yīng)用一種最大閾值水平的合適選擇以殺死這些未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，并且通過(guò)定期轉(zhuǎn)移到一種新鮮培養(yǎng)基中來(lái)分離和增殖這些從這種選擇處理中存活的假定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。通過(guò)連續(xù)傳代和使用合適的選擇進(jìn)行攻擊，鑒定并增殖了這些用該質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。然后，可以使用分子和生物化學(xué)的方法來(lái)證實(shí)整合到該轉(zhuǎn)基因植物的基因組中的感興趣的異源基因的存在。已轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可以根據(jù)常規(guī)方法長(zhǎng)成植物。參見，例如，麥考密克(McCormick)等人(1986)植物細(xì)胞報(bào)告(PlantCellReports)5:81-84。然后，可以使這些植物生長(zhǎng)，并且用相同的轉(zhuǎn)化的品系或不同的品系進(jìn)行授粉，并且鑒定出這種得到的具有所希望的表型特征的組成型表達(dá)的雜合體?？梢允箖纱蚋啻L(zhǎng)以確保所希望的表型特征的表達(dá)被穩(wěn)定地維持并遺傳，然后收獲種子以確保已經(jīng)獲得了所希望的表型特征的表達(dá)。按照這種方式，本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)化的種子(也被稱為“轉(zhuǎn)基因種子”)，該種子具有本發(fā)明的核苷酸構(gòu)建體，例如被穩(wěn)定地結(jié)合到它們的基因組中的本發(fā)明的表達(dá)盒。植物轉(zhuǎn)化的評(píng)估在將異源外源DNA引入到植物細(xì)胞中之后，通過(guò)不同的方法來(lái)證實(shí)異源基因在植物基因組中的轉(zhuǎn)化或整合，這些方法例如對(duì)與該整合的基因相關(guān)聯(lián)的核酸、蛋白質(zhì)以及代謝產(chǎn)物的分析。PCR分析是在移植到土壤中之前的早期階段篩選轉(zhuǎn)化的細(xì)胞、組織或芽中所結(jié)合基因的存在的一種快速方法(薩姆布魯克和拉塞爾(2001)分子克隆：實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約)。PCR是使用對(duì)感興趣的基因或土壤桿菌載體背景等特異的寡核苷酸引物類來(lái)進(jìn)行?？梢酝ㄟ^(guò)基因組DNA的DNA印跡分析來(lái)證實(shí)植物類轉(zhuǎn)化(薩姆布魯克和拉塞爾，2001，上文)。一般而言，從該轉(zhuǎn)化體中提取了總DNA，用合適的限制酶進(jìn)行消化，在瓊脂糖凝膠中進(jìn)行分級(jí)，并且轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素或尼龍膜上。然后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)，用例如放射性標(biāo)記32P的目標(biāo)DNA片段來(lái)探測(cè)該膜或“印跡”以證實(shí)引入的基因整合到該植物基因組中(薩姆布魯克和拉塞爾，2001，上文)。在RNA印跡分析中，從該轉(zhuǎn)化體的特定組織中分離RNA，在甲醛瓊脂糖凝膠中進(jìn)行分級(jí)，并且根據(jù)在本領(lǐng)域內(nèi)是常規(guī)的標(biāo)準(zhǔn)操作來(lái)印跡到尼龍濾膜上(薩姆布魯克和拉塞爾，2001，上文)。然后，通過(guò)在本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法、通過(guò)將該濾膜與衍生自一種殺有害生物基因的放射性探針進(jìn)行雜交來(lái)測(cè)試由該殺有害生物基因所編碼的RNA的表達(dá)(薩姆布魯克和拉塞爾，2001，同上)。使用與存在于殺有害生物蛋白上的一種或多種表位結(jié)合的抗體，可以對(duì)轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡、生物化學(xué)測(cè)定、以及類似測(cè)定，以便通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)操作來(lái)證實(shí)由該殺有害生物基因所編碼的蛋白質(zhì)的存在(薩姆布魯克和拉塞爾，2001，上文)。植物中的殺有害生物活性在本發(fā)明的另一方面，可以產(chǎn)生表達(dá)一種具有殺有害生物活性的殺有害生物蛋白的轉(zhuǎn)基因植物。以上通過(guò)實(shí)例來(lái)說(shuō)明的方法可用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物，但產(chǎn)生這些轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的方式對(duì)于本發(fā)明而言不是至關(guān)重要的。可以依據(jù)實(shí)驗(yàn)者的判斷來(lái)使用在本領(lǐng)域內(nèi)已知或說(shuō)明的方法，如土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、生物射彈轉(zhuǎn)化、以及非粒子介導(dǎo)法?？梢酝ㄟ^(guò)在本領(lǐng)域內(nèi)所說(shuō)明的普通方法來(lái)分離表達(dá)一種殺有害生物蛋白的植物，這些方法例如通過(guò)愈傷組織的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)化的愈傷組織的選擇、以及從此類轉(zhuǎn)基因愈傷組織中再生出能育的植物類。在此類方法中，可以使用任何基因作為選擇標(biāo)記，只要它在植物細(xì)胞中的表達(dá)賦予了鑒定或選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的能力。已經(jīng)開發(fā)了多種與植物細(xì)胞一起使用的標(biāo)記物，如對(duì)于氯霉素、氨基糖甙G418、潮霉素、以及類似物的抗性。編碼參與葉綠體代謝的產(chǎn)物的其他基因也可以用作選擇標(biāo)記。例如，提供對(duì)于植物除草劑(如草甘磷、溴苯腈、或咪唑琳酮)的抗性的基因可以具有特別的用途。這樣的基因已經(jīng)被報(bào)道(斯托克(Stalker)等人(1985)生物化學(xué)雜志263:6310-6314(溴苯腈抗性腈水解酶基因)；以及薩塔西瓦姆(Sathasivan)等人(1990)核酸研究18:2188(AHAS咪唑啉酮抗性基因)。另外，在此披露的這些基因作為評(píng)估細(xì)菌細(xì)胞或植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化的標(biāo)記是有用的。用于檢測(cè)在植物、植物器官(例如，葉子、莖、根、等)、種子、植物細(xì)胞、繁殖體、胚或它們的子代中轉(zhuǎn)基因的存在的方法是本領(lǐng)域內(nèi)所熟知的。在一個(gè)實(shí)施例中，通過(guò)測(cè)試殺有害生物活性來(lái)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因的存在?？梢葬槍?duì)殺有害生物活性來(lái)測(cè)試表達(dá)一種殺有害生物蛋白的能育植物，并且選擇顯示出最佳活性的植物以用于進(jìn)一步的育種。在本領(lǐng)域內(nèi)對(duì)有害生物活性進(jìn)行測(cè)定的方法是可供使用的。通常，在攝食測(cè)定中混合并使用了這種蛋白。參見，例如馬羅內(nèi)等人(1985)經(jīng)濟(jì)昆蟲學(xué)雜志78:290-293。本發(fā)明可以用于轉(zhuǎn)化任何植物種類，包括但不限于單子葉植物和雙子葉植物。感興趣的植物的實(shí)例包括但不限于：玉米(玉蜀黍)、高梁、小麥、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒、馬鈴薯、棉花、水稻、大豆、甜菜、甘蔗、煙草、大麥、以及油菜、蕓苔屬植物、苜蓿、黑麥、粟、紅花、花生、甘薯、木薯、咖啡、椰子、菠蘿、柑桔屬的樹、可可、茶、香蕉、鱷梨、無(wú)花果、番石榴、芒果、橄欖、番木瓜、腰果、澳洲堅(jiān)果、杏仁、燕麥、蔬菜、觀賞性植物、以及針葉樹。蔬菜包括但不限于：番茄、萵苣、青豆、利馬豆、豌豆，以及甜瓜屬(genusCurcumis)的成員，如黃瓜、網(wǎng)紋甜瓜、以及甜瓜。觀賞性植物包括但不限于：杜鵑花屬、繡球?qū)佟⒛鹃葘?、薔薇屬、郁金香、水仙屬、碧冬茄屬、康乃馨、一品紅、以及菊花。優(yōu)選地，本發(fā)明的植物是農(nóng)作物植物(例如，玉米、高梁、小麥、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒、馬鈴薯、棉花、水稻、大豆、甜菜、甘蔗、煙草、大麥、油菜、等)。在有害生物控制方面的用途在有害生物控制或工程化處理其他生物中用于采用多種菌株作為殺有害生物劑的總體方法在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的，這些菌株包括本發(fā)明的一種核苷酸序列或它的一種變體。參見，例如，美國(guó)專利號(hào)5,039,523和EP0480762A2。包括本發(fā)明的核苷酸序列或它的變體的芽孢桿菌菌株、或已經(jīng)被遺傳改變而包括本發(fā)明的殺有害生物基因和蛋白質(zhì)的微生物可以用于保護(hù)農(nóng)業(yè)作物以及產(chǎn)品免受有害生物的侵害。在本發(fā)明的一個(gè)方面，用以下試劑來(lái)處理一種產(chǎn)生毒素(殺有害生物劑)的生物的完整的(即，未裂解的)細(xì)胞，當(dāng)這些細(xì)胞被施用到一種或多種目標(biāo)有害生物的環(huán)境中時(shí)這些試劑延長(zhǎng)了在該細(xì)胞中產(chǎn)生的毒素的活性?？商娲兀ㄟ^(guò)將殺有害生物基因引入到細(xì)胞宿主中來(lái)產(chǎn)生該殺有害生物劑。該殺有害生物基因的表達(dá)直接或間接地導(dǎo)致了該殺有害生物劑的細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生和維持。在本發(fā)明的一個(gè)方面，然后在以下條件下對(duì)這些細(xì)胞進(jìn)行處理，當(dāng)該細(xì)胞被施用到一種或多種靶標(biāo)有害生物的環(huán)境時(shí)這些條件延長(zhǎng)了在該細(xì)胞中產(chǎn)生的毒素的活性。得到的產(chǎn)物保留該毒素的毒性。然后，可以按照常規(guī)技術(shù)來(lái)配制這些天然膠囊化的殺有害生物劑，以用于施用到寄宿著一種靶標(biāo)有害生物的環(huán)境(例如，土壤、水、以及植物的葉)。參見，例如EPA0192319以及其中所引用的文獻(xiàn)?？商娲兀膳渲票磉_(dá)本發(fā)明的一種基因的這些細(xì)胞，例如以便允許得到的材料作為一種殺有害生物劑的施用。本發(fā)明的活性成分通常以組合物的形式進(jìn)行施用，并且可以同時(shí)或相繼地與其他化合物一起施用到有待處理的作物區(qū)域或植物中。這些化合物可以是肥料、除草劑、冷凍保護(hù)劑(cryoprotectants)、表面活性劑、洗滌劑、殺有害生物肥皂(pesticidalsoaps)、休眠噴灑油(dormantoils)、聚合物、和/或定時(shí)釋放或生物可降解載體制劑，這些制劑允許在單次施用該制劑之后對(duì)目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行長(zhǎng)期給藥。它們還可以是選擇性除草劑、化學(xué)殺昆蟲劑、殺病毒劑、殺微生物劑、殺變形蟲劑、殺有害生物劑、殺真菌劑、殺細(xì)菌劑、殺線蟲劑、殺軟體動(dòng)物劑、或這些制劑中的幾種的混合物，如果希望的話，與其他農(nóng)業(yè)上可接受的載體、表面活性劑或在制劑領(lǐng)域內(nèi)通常采用的促進(jìn)施用的佐劑一起。合適的載體和佐劑可以是固體或液體，并且相應(yīng)于在配制技術(shù)中常常采用的物質(zhì)，例如天然的或再生的礦物質(zhì)、溶劑、分散劑、濕潤(rùn)劑、增粘劑、粘合劑或肥料。同樣地，可將這些制劑制備成可食用的“誘餌”或塑造成有害生物“陷阱”以允許由一種目標(biāo)有害生物來(lái)攝食或攝取該殺有害生物制劑。施用本發(fā)明的一種活性成分或本發(fā)明的一種農(nóng)業(yè)化學(xué)組合物(該組合物包括由本發(fā)明的細(xì)菌菌株所產(chǎn)生的這些殺有害生物蛋白中的至少一種)的方法包括葉施用、種子涂覆和土壤施用。施用次數(shù)以及施用率取決于由相應(yīng)的有害生物所侵染的強(qiáng)度?？梢詫⒃摻M合物配制成一種粉末、塵劑、小丸、顆粒、噴霧劑、乳液、膠體、溶液、或類似劑型，并且可以通過(guò)以下常規(guī)方法來(lái)制備該組合物，這些方法例如將包括該多肽的細(xì)菌細(xì)胞的培養(yǎng)物脫水、凍干、均質(zhì)化、提取、過(guò)濾、離心、沉降、或濃縮。在包括至少一種這種殺有害生物多肽的所有此類組合物中，該多肽可以按照按重量計(jì)從約1％至約99％的濃度而存在。可以在一個(gè)給定的區(qū)域內(nèi)通過(guò)本發(fā)明的這些方法來(lái)殺死鱗翅目、半翅目、雙翅目、或鞘翅目有害生物或減少其數(shù)目，或者可以將它們預(yù)防性地施用到一個(gè)環(huán)境區(qū)域內(nèi)以防止被一種易受影響的有害生物的侵染。優(yōu)選地，這種有害生物攝取、或接觸一個(gè)殺有害生物有效量的該多肽。關(guān)于“殺有害生物有效量”是指該殺有害生物劑能夠引起至少一種有害生物的死亡、或明顯減少有害生物的生長(zhǎng)、攝食、或正常生理發(fā)育的量。這個(gè)量值將取決于以下因素而變化：例如，有待控制的特定的目標(biāo)害蟲，由待處理的特定的環(huán)境、地點(diǎn)、植物、作物、或農(nóng)業(yè)場(chǎng)所，環(huán)境條件，以及施用在殺有害生物上有效的多肽組合物的方法、速率、濃度、穩(wěn)定性、以及數(shù)量。這些制劑還可以根據(jù)氣候條件、環(huán)境因素、和/或施用頻率和/或有害生物侵染的嚴(yán)重度而變化?？赏ㄟ^(guò)將該細(xì)菌細(xì)胞、晶體、和/或孢子懸浮物、或分離的蛋白組分與所希望的農(nóng)業(yè)上可接受的載體配制在一起來(lái)制備所說(shuō)明的殺有害生物劑組合物。在施用之前，可以用合適的手段(如凍干、冷凍干燥、干燥的，或在水性載體、介質(zhì)或合適的稀釋劑，如鹽水或其他緩沖液中)配制這些組合物。這些經(jīng)配制的組合物可以處于以下形式：粉劑或顆粒材料、或在油(植物性或礦物性)中的懸浮體、或水或油/水乳液、或作為可濕性粉末、或與適合于農(nóng)業(yè)施用的任何其他載體材料相組合。適合的農(nóng)業(yè)載體可以是固體或液體并且在本領(lǐng)域是熟知的。術(shù)語(yǔ)農(nóng)業(yè)上“可接受的載體”涵蓋了所有佐劑、惰性組分、分散劑、表面活性劑、增粘劑、粘合劑、等等，它們?cè)跉⒂泻ι飫┡渲萍夹g(shù)中是常用的；這些對(duì)于殺有害生物劑配制領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言是熟知的。這些制劑可以與一種或多種固體或液體佐劑相混合，并且通過(guò)不同的手段進(jìn)行制備，例如通過(guò)使用常規(guī)的配制技術(shù)將這種殺有害生物組合物與合適的佐劑進(jìn)行均勻地混合、摻合和/或研磨。合適的制劑和施用方法說(shuō)明于美國(guó)專利號(hào)6,468,523中，該文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合在此?！坝泻ι铩卑ǖ幌抻冢豪ハx、真菌、細(xì)菌、線蟲、螨、蜱、以及類似物。昆蟲有害生物包括選自以下目的昆蟲：鞘翅目、雙翅目、膜翅目、鱗翅目、食毛目、同翅目、半翅目、直翅目、纓翅目、革翅目、等翅目、虱目、蚤目、毛翅目、等等，特別是鞘翅目、鱗翅目、以及雙翅目。鞘翅目包括肉食亞目(Adephaga)和多食亞目(Polyphaga)。肉食亞目包括步甲總科(Caraboidea)和豉甲總科(Gyrinoidea)，而多食亞目包括牙甲總科(Hydrophi1oidea)、隱翅甲總科(Staphylinoidea)、花螢總科(Cantharoidea)、郭公蟲總科(Cleroidea)、叩頭蟲總科(Elateroidea)、花甲總科(Dascilloidea)、泥甲總科(Dryopoidea)、九甲總科(Byrrhoidea)、扁甲總科(Cucujoidea)、蕪菁總科(Meloidea)、花蚤總科(Mordelloidea)、擬步甲總科(Tenebrionoidea)、長(zhǎng)蝽總科(Bostrichoidea)、金龜總科(Scarabaeoidea)、天?？偪?Cerambycoidea)、葉甲總科(Chrysomeloidea)以及象甲總科(Curculionoidea)。步甲總科包括虎甲科(Cicindelidae)、步甲科(Carabidae)、以及龍虱科(Dytiscidae)。豉甲總科包括豉甲科(Gyrinidae)。牙甲總科包括牙甲科(Hydrophilidae)。隱翅甲總科包括葬甲科(Silphidae)和隱翅甲科(Staphylinidae)?；ㄎ灴偪瓢ɑㄎ灴?Cantharidae)和螢科(Lampyridae)。郭公蟲總科包括郭公蟲科(C1eridae)和皮蝽科(Dermestidae)。叩頭蟲總科包括叩頭蟲科(Elateridae)和吉丁蟲科(Buprestidae)。扁甲總科包括瓢蟲科(Coccinellidae)。芫菁總科包括蕪菁科(Meloidae)。擬步甲總科包括擬步甲科(Tenebrionidae)。金龜總科包括黑蛻科(Passalidae)和金龜科(Scarabaeidae)。天?？偪瓢ㄌ炫？?Cerambycidae)。葉甲總科包括葉甲科(Chrysomelidae)。象甲總科包括象甲科(Curculionidae)和小蝽科(Scolytidae)。雙翅目包括長(zhǎng)角亞目(Nematocera)、短角亞目(Brachycera)、以及環(huán)裂亞目(Cyclorrhapha)。長(zhǎng)角亞目包括大蚊科(Tipulidae)、毛蠓科(Psychodidae)、蚊科(Culicidae)、蠓科(Ceratopogonidae)、搖蚊科(Chironomidae)、蚋科(Simuliidae)、毛蚊科(Bibionidae)、以及癭蚊科(Cecidomyiidae)。短角亞目包括水虻科(Stratiomyidae)、虻科(Tabanidae)、劍虻科(Therevidae)、食蟲虻科(Asilidae)、擬食蟲虻科(Mydidae)、蜂虻科(Bombyliidae)、以及長(zhǎng)足虻科(Dolichopodidae)。環(huán)裂亞目包括無(wú)縫組(Aschiza)和有縫組(Schizophora)。無(wú)縫組包括蚤蠅科(Phoridae)、蚜蠅科(Syrphidae)和眼蠅科(Conopidae)。有縫組包括無(wú)瓣類(Acalyptratae)和有瓣類(Calyptratae)。無(wú)瓣類包括斑蠅科(Otitidae)、實(shí)蠅科(Tephritidae)、潛蠅科(Agromyzidae)、以及果蠅科(Drosophilidae)。有瓣類包括虱蠅科(Hippoboscidae)、狂蠅科(Oestridae)、寄蠅科(Tachinidae)、花蠅科(Anthomyiidae)、蠅科(Muscidae)、麗蠅科(Calliphoridae)、以及麻蠅科(Sarcophagidae)。鱗翅目包括鳳蝶科(Papilionidae)、粉蝶科(Pieridae)、灰蝶科(Lycaenidae)、蛺蝶科(Nymphalidae)、斑蝶科(Danaidae)、眼蝶科(Satyridae)、弄蝶科(Hesperiidae)、天蛾科(Sphingidae)、天蠶蛾科(Saturniidae)、尺娥科(Ceometridae)、燈娥科(Arctiidae)、夜蛾科(Noctuidae)、毒蛾科(Lymantriidae)、透翅蛾科(Sesiidae)、以及谷蛾科(Tineidae)。線蟲包括寄生線蟲，例如根結(jié)線蟲、胞囊線蟲、以及根腐線蟲，包括異皮線蟲屬、根結(jié)線蟲屬、以及球異皮線蟲屬；特別是胞囊線蟲的成員，包括但不限于：大豆異皮線蟲(Heteroderaglycines)(大豆胞囊線蟲)；甜菜異皮線蟲(甜菜胞囊線蟲)；燕麥異皮線蟲(Heteroderaavenae)(燕麥胞囊線蟲)；以及馬鈴薯金線蟲(Globoderarostochiensis)以及馬鈴薯白線蟲(Globoderapailida)(馬鈴薯胞囊線蟲)。根腐線蟲包括短體線蟲屬。半翅類有害生物(其包括指定為半翅目、同翅目、或異翅亞目的物種)包括但不限于草盲蝽屬，如西方無(wú)澤盲蝽(豆莢草盲蝽)、牧草盲蝽(美國(guó)牧草盲蝽)、和綠盲蝽(伊利蘇斯草盲蝽(Lyguselisus)；蚜蟲，例如碧桃蚜(greenpeachaphid)(桃蚜(Myzuspersicae))、棉花蚜蟲(棉蚜)、櫻桃蚜蟲或黑櫻桃蚜蟲(黑櫻桃蚜(Myzuscerasi))、大豆蚜蟲(大豆蚜(AphisglycinesMatsumura))；褐飛虱(稻褐飛虱)、以及稻青大葉蟬(黑尾葉蟬屬)；和蝽象，例如綠色蝽象(喜綠蝽)、棕色大理石紋蝽象(茶翅蝽)、南方綠色蝽象(南方綠椿象)、稻蝽象(美洲稻蝽)、森林紅蝽(紅足真蝽(Pentatomarufipes))、歐洲蝽象(砂棗潤(rùn)蝽(Rhaphigasternebulosa))、以及盾椿象耳蝽(Troilusluridus)。針對(duì)主要農(nóng)作物的本發(fā)明的昆蟲有害生物包括：玉米：玉米螟(Ostrinianubilalis)、歐洲玉米螟(Europeancornborer)；小地老虎(Agrotisipsilon)、黑地老虎(blackcutworm)；谷實(shí)夜娥(Helicoverpazea)、棉鈴蟲(cornearworm)；草地夜娥(Spodopterafrugiperda)、秋夜蛾(fallarmyworm)；西南玉米稈草螟(Diatraeagrandiosella)、西南玉米螟(southwesterncornborer)；南美玉米苗斑螟(Elasmopalpuslignosellus)，小玉米稈螟(lessercornstalkborer)；小蔗稈草螟(Diatraeasaccharalis)，小蔗稈草螟(surgarcaneborer)；玉米根葉甲(Diabroticavirgifera)、西方玉米根螟(westerncornrootworm)；長(zhǎng)角葉甲巴氏亞種(Diabroticalongicornisbarberi)、北方玉米根螟(northerncornrootworm)；黃瓜十一星葉甲食根亞種(Diabroticaundecimpunctatahowardi)，南方玉米根螟(southerncornrootworm)；梳爪叩頭蟲屬(Melanotusspp.)、金針蟲(wireworms)；北方圓頭犀金龜(Cyclocephalaborealis)、北方圓頭犀金龜(蠐螬)；南方圓頭犀金龜(Cyclocephalaimmaculata)，南方圓頭犀金龜(蠐螬)；日本弧麗金龜(Popilliajaponica)，日本金龜子；玉米銅色跳甲(Chaetocnemapulicaria)、玉米跳甲；玉米隱啄象(Sphenophorusmaidis)，玉米谷象；玉米縊管蚜(Rhopa1osiphummaidis)，玉米葉蚜蟲；玉米根蚜(Anuraphismaidiradicis)，玉米根蚜蟲；美洲谷長(zhǎng)蝽(Blissusleucopterusleucopterus)，高粱長(zhǎng)蝽；赤脛黑蝗(Melanoplusfemurrubrum)，紅脛蝗蟲(redleggedgrasshopper)；血黑蝗(Melanoplussanguinipes)，遷徙蝗蟲；玉米種蠅(Hylemyaplatura)，種蠅；玉米斑潛蠅(Agromyzaparvicornis)，玉米斑潛蠅；玉米黃薊馬(Anaphothripsobscrurus)，草薊馬；竊蟻(Solenopsismilesta)，竊蟻；二斑葉螨(Tetranychusurticae)，兩斑葉螨(twospottedspidermite)；高粱：斑禾草螟(Chilopartellus)、高粱螟；草地夜蛾、秋夜蛾；谷實(shí)夜娥、棉鈴蟲；南美玉米苗斑螟、小玉米稈螟；粒肽臟切夜娥(Feltiasubterranea)、顆粒地老虎(granulatecutworm)；長(zhǎng)毛食葉然金龜(Phyllophagacrinita)、蠐螬；偽金針蟲屬(Eleodesspp.)、叩頭蟲屬(Conoderusspp.)、以及Aeolus屬，蠐螬；黑角負(fù)泥蟲(Oulemamelanopus)、谷類葉甲；玉米銅色跳甲、玉米跳甲；玉米隱啄象、玉米谷象；玉米縊管蚜、玉米葉蚜；美甘蔗偽毛蚜(Siphaf1ava)、黃甘蔗蚜；美洲谷長(zhǎng)蝽、高粱長(zhǎng)蝽；高粱癭蚊(Contariniasorghicola)、粱瘓蚊(sorghummidge)；朱砂葉螨(Tetranychuscinnabarinus)、朱砂葉螨；二斑葉蹣(Tetranychusurticae)、二斑葉蹣；小麥：一點(diǎn)黏蟲(Pseuda1etiaunipunctata)、黏蟲；草地夜蛾、秋夜蛾；南美玉米苗斑螟、小玉米稈螟；西方灰地老虎(Agrotisorthogonia)、西方地老虎；南美玉米苗斑螟、小玉米稈螟；黑角負(fù)泥蟲、谷類葉甲；三葉草葉象(Hyperapunctata)、三葉草葉象；黃瓜十一星葉甲食根亞種、南方玉米根螟；俄羅斯小麥蚜蟲；麥二叉蚜(Schizaphisgraminum)、麥二叉蚜；麥長(zhǎng)管蚜(Macrosiphumavenae)、麥長(zhǎng)管蚜；赤脛黑蝗、赤脛黑蝗；異黑蝗(Melanoplusdifferentia1is)、異黑蝗；血黑蝗、遷徙蝗蟲；小麥癭蚊(Mayetioladestructor)、小麥癭蚊(Hessianfly)；麥紅吸漿蟲(Sitodiplosismosellana)、麥蛆(wheatmidge)；美洲桿蠅(Meromyzaamericana)、美洲麥稈黃潛蠅(wheatstemmaggot)；麥疫種蠅(Hylemyacoarctata)、麥種蠅(wheatbulbfly)；煙褐花薊馬(Frankliniellafusca)、煙草薊馬；麥莖蜂(Cephusductus)、麥莖蜂；曲葉螨(Aceriatulipae)、小麥曲葉螨(wheatcurlmite)；向日葵：向日葵芽卷葉蛾(Suleimahelianthana)，向日葵芽蛾；向日葵同斑螟(Homoeosomaelectellum)，向日葵蛾；向日葵葉甲(zygogrammaexclamationis)，向日葵甲蟲；胡蘿卜利犀金龜(Bothyrusgibbosus)，胡蘿卜甲蟲；向日葵籽癭蚊(Neolasiopteramurtfeldtiana)，向日葵籽蠓；棉花：煙芽夜蛾(Heliothisvirescens)，棉花蚜蟲；谷實(shí)夜蛾，棉鈴蟲；甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)，甜菜夜蛾；紅鈴麥蛾(Pectinophoragossypiella)，粉色棉鈴蟲；棉鈴象(Anthonomusgrandis)，棉子象鼻蟲；棉蚜(Aphisgossypii)，棉花蚜蟲；棉序盲蝽(Pseudatomoscelisseriatus)，棉花跳盲蝽；溫室粉虱(Trialeurodesabutilonea)，帶狀翅白粉虱(bandedwingedwhitefly)；美國(guó)牧草盲蝽(Lyguslineolaris)，tarnishedplantbug；赤脛黑蝗，紅脛蝗蟲；異黑蝗，異黑蝗；煙薊馬(Thripstabaci)，洋蔥薊馬；煙褐花薊馬，煙薊馬；朱砂葉螨，朱砂葉螨；二斑葉螨，二斑葉螨；稻：小蔗桿草螟、甘蔗螟；草地夜娥、秋夜娥；谷實(shí)夜娥、棉鈴蟲；葡萄鞘葉甲(Colaspisbrunnea)、葡萄鞘葉甲；稻水象(Lissorhoptrusoryzophilus)、稻水象；米象(Sitophilusoryzae)、米象；二條黑尾葉蟬(Nephotettixnigropictus)、米葉蟬；美洲谷長(zhǎng)蝽、高粱長(zhǎng)蝽；擬緣蝽(Acrosternumhilare)、綠蝽；大豆：大豆夜娥(Pseudoplusiaincludens)，大豆尺夜娥(soybeanlooper)；黎豆夜蛾，夜蛾科；苜蓿綠夜娥(Plathypenascabra)，苜蓿綠夜娥；玉米螟，歐洲玉米螟；小地老虎，黑地老虎；甜菜夜娥，甜菜夜娥；煙芽夜娥，棉花蚜蟲；谷實(shí)夜娥，棉鈴蟲；墨西哥大豆瓢蟲(Epilachnavarivestis)，墨西哥大豆瓢蟲；桃蚜(Myzuspersicae)，桃蚜；蠶豆微葉蟬(Empoascafabae)，馬鈴薯葉蟬；擬緣蝽，綠蝽；赤脛黑蝗，赤脛黑蝗；異黑蝗，異黑蝗；玉米種蠅，玉米種蠅；大豆薊馬(Sericothripsvariabilis)，大豆薊馬；煙薊馬，洋洋蔥薊馬；草莓葉螨(Tetranychusturkestani)，草莓葉螨；二斑葉螨，二斑葉螨；大麥：玉米螟、歐洲玉米螟；小地老虎、黑地老虎；麥二叉蚜、麥二叉蚜(greenbug)；美洲谷長(zhǎng)蝽、高粱長(zhǎng)蝽；擬緣蝽、綠蝽；煙草蝽(Euschistusservus)、茶色蝽；灰地種蠅(Deliaplatura)、種蠅；小麥癭蚊、小麥癭蚊；潛巖螨(Petrobialatens)、麥長(zhǎng)腿蜘蛛；油籽油菜：甘藍(lán)蚜(Brevicorynebrassicae)、卷心菜蚜；蔬菜黃條跳甲(Phyllotretacruciferae)、跳甲；蓓帶夜蛾(Mamestraconfigurata)、貝莎夜蛾(Berthaarmyworm)；菜蛾(Plutellaxylostella)、小菜蛾；地種蠅屬(Deliassp.)、根蛆。線蟲包括寄生線蟲，例如根結(jié)線蟲、胞囊線蟲、以及根腐線蟲，包括異皮線蟲屬、根結(jié)線蟲屬、以及球異皮線蟲屬；特別是胞囊線蟲的成員，包括但不限于：大豆異皮線蟲(Heteroderaglycines)(大豆胞囊線蟲)；甜菜異皮線蟲(甜菜胞囊線蟲)；燕麥異皮線蟲(Heteroderaavenae)(燕麥胞囊線蟲)；以及馬鈴薯金線蟲(Globoderarostochiensis)以及馬鈴薯白線蟲(Globoderapailida)(馬鈴薯胞囊線蟲)。根腐線蟲包括短體線蟲屬。用于增加植物產(chǎn)量的方法提供了用于增加植物產(chǎn)量的方法。這些方法包括提供表達(dá)一種編碼在此披露的殺有害生物多肽序列的多核苷酸的植物或植物細(xì)胞并且在被有害生物侵染(或者易受到該有害生物侵染)的田地中使該植物或其種子生長(zhǎng)，所述多肽具有針對(duì)該有害生物的殺有害生物活性。在一些實(shí)施例中，該多肽具有針對(duì)一種鱗翅目、鞘翅目、雙翅目、半翅目、或者線蟲有害生物的殺有害生物活性，并且所述田地被一種鱗翅目、半翅目、鞘翅目、雙翅目、或線蟲有害生物侵染。如在此所定義的，該植物的“產(chǎn)量”是指由該植物所產(chǎn)生的生物質(zhì)的品質(zhì)和/或數(shù)量。關(guān)于“生物質(zhì)”是指任何經(jīng)測(cè)量的植物產(chǎn)物。生物質(zhì)產(chǎn)生的增加是在所測(cè)量的植物產(chǎn)物的產(chǎn)量方面的任何改進(jìn)。增加植物產(chǎn)量具有幾種商業(yè)應(yīng)用。例如，增加植物葉生物質(zhì)可以增加用于人或動(dòng)物消費(fèi)的葉菜的產(chǎn)量。另外，增加葉生物質(zhì)可以用于增加植物衍生的藥學(xué)或工業(yè)產(chǎn)物的生產(chǎn)。產(chǎn)量的增加可以包括與一種不表達(dá)該殺有害生物序列的植物相比任何統(tǒng)計(jì)顯著性增加，包括但不限于：產(chǎn)量的至少1％的增加、至少3％的增加、至少5％的增加、至少10％的增加、至少20％的增加、至少30％、至少50％、至少70％、至少100％或更大的增加。在多種特定方法中，植物產(chǎn)量由于植物表達(dá)在此披露的一種殺有害生物蛋白而獲得改進(jìn)的有害生物抗性而增加。該殺有害生物蛋白的表達(dá)導(dǎo)致有害生物侵染或攝食的能力減小。還可以用一種或多種化學(xué)成分來(lái)處理植物，這些化學(xué)成分包括一種或多種除草劑、殺昆蟲劑、或殺真菌劑。示例性的化學(xué)成分包括：水果/蔬菜類除草劑：莠去津、除草定、敵草隆、草甘膦、利谷隆、嗪草酮、西瑪津、氟樂(lè)靈、吡氟禾草靈、草丁膦、氯吡嘧磺隆(Gowan)、百草枯、戊炔草胺、烯禾啶、氟丙嘧草酯、氯吡嘧磺隆、三嗪茚草胺(Indaziflam)；果實(shí)/蔬菜類殺昆蟲劑：涕滅威、蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuriengiensis)、甲萘威(Carbaryl)、克百威(Carbofuran)、毒死蜱(Chlorpyrifos)、氯氰菊酯(Cypermethrin)、溴氰菊酯(Deltamethrin)、阿維菌素(Abamectin)、氟氯氰菊酯/β-氟氯氰菊酯、高氰戊菊酯、λ-氟氯氰菊酯、滅螨醌、聯(lián)苯肼酯、甲氧蟲酰肼、雙苯氟脲、環(huán)蟲酰肼、噻蟲啉、呋蟲胺、嘧螨酯、螺螨酯、γ-氟氯氰菊酯、螺甲螨酯、多殺菌素、氯蟲酰胺、氰蟲酰胺、殺鈴脲、螺蟲乙酯、吡蟲啉、氟蟲酰胺、硫雙威(Thiodicarb)、氰氟蟲腙、砜蟲啶、丁氟螨酯、腈吡螨酯(Cyanopyrafen)、噻蟲胺、噻蟲嗪、乙基多殺菌素(Spinotoram)、硫雙威(Thiodicarb)、氟啶蟲酰胺、甲硫威、因滅汀-苯甲酸鹽(Emamectin-benzoate)、茚蟲威、苯線磷、吡丙醚、苯丁錫氧化物；水果/蔬菜殺真菌劑：唑嘧菌胺、嘧菌酯、苯噻菌胺酯、啶酰菌胺、克菌丹、多菌靈、百菌清、銅、氰霜唑、環(huán)氟菌胺、霜脲氰、環(huán)丙唑醇、環(huán)丙嘧啶、苯醚甲環(huán)唑、烯酰嗎啉、二噻農(nóng)、咪唑菌酮、環(huán)酰菌胺、氟啶胺、咯菌腈、氟吡菌胺、氟吡菌酰胺、氟嘧菌酯、氟唑菌酰胺(Fluxapyroxad)、滅菌丹、乙膦酸、異菌脲、異丙菌胺、先正達(dá)(Isopyrazam)、醚菌酯(Kresoxim-methyl)、代森錳鋅、雙炔酰菌胺、甲霜靈(Metalaxyl)/精甲霜靈(mefenoxam)、代森聯(lián)、苯菌酮、腈菌唑、戊菌唑、吡噻菌胺、啶氧菌酯、霜霉威(Propamocarb)、丙環(huán)唑、丙森鋅、丙氧喹啉、丙硫菌唑、唑菌胺酯、嘧霉胺、喹氧靈、螺環(huán)菌胺(Spiroxamine)、硫、戊唑醇、甲基硫菌靈(Thiophanate-methyl)、肟菌酯(Trifloxystrobin)；谷類除草劑：2.4-D、酰嘧磺隆、溴草腈、唑草酮-E、綠麥隆、氯磺隆、炔草酸-P、二氯吡啶酸、麥草畏、禾草靈-M、吡氟酰草胺、精惡唑禾草靈、雙氟磺草胺、氟酮磺隆-NA、氟噻草胺、氟啶嘧磺隆-M、氟草煙(Fluroxypyr)、呋草酮、草甘膦、碘甲磺隆、碘苯腈、異丙隆、MCPA、甲基二磺隆、甲磺隆、二甲戊樂(lè)靈、唑啉草酯、丙苯磺隆、芐草丹、啶磺草胺、磺酰磺隆、噻吩磺隆、三甲苯草酮、醚苯磺隆、苯磺隆、氟樂(lè)靈、三氟甲磺??；谷類殺真菌劑：嘧菌酯、聯(lián)苯吡菌胺(Bixafen)、啶酰菌胺、多菌靈、百菌清、環(huán)氟菌胺、環(huán)丙唑醇、環(huán)丙嘧啶、醚菌胺、氟環(huán)唑、苯銹啶、丁苯嗎啉、氟吡菌酰胺、氟嘧菌酯、喹唑菌酮、氟唑菌酰胺(Fluxapyroxad)、先正達(dá)、醚菌酯、葉菌唑、苯菌酮、吡噻菌胺、啶氧菌酯、咪鮮胺、丙環(huán)唑、丙氧喹啉、丙硫菌唑、唑菌胺酯、喹氧靈、螺環(huán)菌胺、戊唑醇、甲基硫菌靈、肟菌酯；谷類殺昆蟲劑：樂(lè)果、λ-氯氟氰菊酯、溴氰菊酯、α-氯氰菊酯、β-氟氯氰菊酯、聯(lián)苯菊酯、吡蟲啉、噻蟲胺、噻蟲嗪、噻蟲啉、啶蟲脒、呋蟲胺、毒死蜱、抗蚜威、甲硫威、砜蟲啶；玉米除草劑：莠去津、甲草胺、溴苯腈、乙草胺、麥草畏、二氯吡啶酸、(S-)二甲酚噻草胺、草銨膦、草甘膦、異噁唑草酮、(S-)異丙甲草胺、甲基磺草酮、煙嘧磺隆、氟嘧磺隆、砜嘧磺隆、磺草酮、甲酰胺磺隆、苯吡唑草酮、環(huán)磺酮(Tembotrione)、嘧啶肟草醚、酮脲磺草吩酯、氟噻草胺、吡咯磺隆(Pyroxasulfon)；玉米殺昆蟲劑：克百威、毒死蜱、聯(lián)苯菊酯、氟蟲腈、吡蟲啉、λ-氯氟氰菊酯、七氟菊酯、特丁磷、噻蟲嗪、噻蟲胺、螺甲螨酯、氟蟲酰胺、殺鈴脲、氯蟲酰胺、溴氰菊酯、硫雙威、β-氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、聯(lián)苯菊酯、氯芬奴隆(Lufenuron)、丁基嘧啶磷、乙蟲腈、氰蟲酰胺、噻蟲啉、啶蟲脒、呋蟲胺、阿維菌素；玉米殺真菌劑：嘧菌酯、聯(lián)苯吡菌胺、啶酰菌胺、環(huán)丙唑醇、醚菌胺、氟環(huán)唑、種衣酯、氟吡菌酰胺、氟嘧菌酯、氟唑菌酰胺、先正達(dá)、葉菌唑、吡噻菌胺、啶氧菌酯、丙環(huán)唑、丙硫菌唑、唑菌胺酯、戊唑醇、肟菌酯；水稻除草劑：丁草胺、敵稗、四唑嘧磺隆、芐嘧磺隆、氰氟草酯、殺草隆、四唑酰草胺、咪唑磺隆、苯噻草胺、去稗安、吡嘧磺隆、稗草畏、二氯喹啉酸、禾草丹、茚草酮、氟噻草胺、四唑酰草胺、氯吡嘧磺隆、去稗安、苯并雙環(huán)酮、環(huán)酯草醚、五氟磺草胺、雙草醚、稻思達(dá)、乙氧嘧磺隆、丙草胺、硝草酮、特糠酯酮(Tefuryltrione)、惡草酮、精惡唑禾草靈、吡丙醚(Pyrimisulfan)；水稻殺昆蟲劑：二嗪農(nóng)、仲丁威、丙硫克百威、噻嗪酮、呋蟲胺、氟蟲腈、吡蟲啉、異丙威、噻蟲啉、環(huán)蟲酰肼、噻蟲胺、乙蟲腈、氟蟲酰胺、氯蟲酰胺、溴氰菊酯、啶蟲脒、噻蟲嗪、氰蟲酰胺、多殺菌素、乙基多殺菌素、因滅汀-苯甲酸鹽、氯氰菊酯、毒死蜱、醚菊酯、克百威、丙硫克百威、砜蟲啶；水稻殺真菌劑：嘧菌酯、多菌靈、環(huán)丙酰菌胺、雙氯氰菌胺、苯醚甲環(huán)唑、敵瘟磷、嘧菌腙、慶大霉素、己唑醇、惡霉靈、異稻瘟凈(IBP)、稻瘟靈、異噻菌胺、春日霉素(Kasugamycin)、代森錳鋅、苯氧菌胺、肟醚菌胺、戊菌隆、噻菌靈、丙環(huán)唑、丙森鋅、咯喹酮、戊唑醇、甲基硫菌靈、噻酰菌胺、三環(huán)唑、肟菌酯、有效霉素(Validamycin)；棉花除草劑：敵草隆、伏草隆、MSMA、乙氧氟草醚、撲草凈、氟樂(lè)靈、唑草酮、烯草酮、丁基吡氟禾草靈、草甘膦、噠草伏、二甲戊樂(lè)靈、嘧硫苯甲酸鈉、三氟啶磺隆、得殺草、草銨膦、丙炔氟草胺、塞苯??；棉花殺昆蟲劑：乙酰甲胺磷、涕滅威、毒死蜱、氯氰菊酯、溴氰菊酯、阿維菌素、啶蟲脒、因滅汀-苯甲酸鹽、吡蟲啉、茚蟲威、λ-氯氟氰菊酯、多殺菌素、硫雙威、γ-氯氟氰菊酯、螺甲螨酯、啶蟲丙醚、氟啶蟲酰胺氟蟲雙酰胺、殺鈴脲、氯蟲酰胺、β-氟氯氰菊酯、螺蟲乙酯、噻蟲胺、噻蟲嗪、噻蟲啉、呋蟲胺、氟蟲雙酰胺、氰蟲酰胺、多殺菌素、乙基多殺菌素、γ氯氟氰菊酯、4-[[(6-氯吡啶-3-基))甲基](2,2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮、硫雙威、阿維菌素、氟啶蟲酰胺、啶蟲丙醚、螺甲螨酯、砜蟲啶；棉花殺真菌劑：嘧菌酯、聯(lián)苯吡菌胺、啶酰菌胺、多菌靈、百菌清、銅、環(huán)丙唑醇、苯醚甲環(huán)唑、醚菌胺、氟環(huán)唑、咪唑菌酮、氟啶胺、氟吡菌酰胺、氟嘧菌酯、氟唑菌酰胺、異菌脲、先正達(dá)、異噻菌胺、代森錳鋅、代森錳、苯氧菌胺、吡噻菌胺、啶氧菌酯、甲基代森鋅、丙硫菌唑、唑菌胺酯、五氯硝基苯、戊唑醇、氟醚唑、甲基硫菌靈、肟菌酯；大豆除草劑：甲草胺、滅草松、氟樂(lè)靈、氯嘧磺隆、氯酯磺草胺、精惡唑禾草靈、氟磺胺草醚、丁基吡氟禾草靈、草甘膦、甲氧咪草煙、滅草喹、咪草煙、(S-)異丙甲草胺、嗪草酮、二甲戊樂(lè)靈、得殺草、草銨膦；大豆殺昆蟲劑：λ-氟氯氰菊酯、滅多蟲、吡蟲啉、噻蟲胺、噻蟲嗪、噻蟲啉、啶蟲脒、呋蟲胺、氟蟲酰胺、氯蟲酰胺、氰蟲酰胺、多殺菌素、乙基多殺菌素、因滅汀-苯甲酸鹽、氟蟲腈、乙蟲腈、溴氰菊酯、β-氟氯氰菊酯、γ和λ氯氟氰菊酯、4-[[(6-氯吡啶-3-基))甲基](2,2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮、螺蟲乙酯、螺螨酯、殺鈴脲、氟啶蟲酰胺、硫雙威、β-氟氯氰菊酯；大豆殺真菌劑：嘧菌酯、聯(lián)苯吡菌胺、啶酰菌胺、多菌靈、百菌清、酮、環(huán)丙唑醇、苯醚甲環(huán)唑、醚菌胺、氟環(huán)唑、氟啶胺、氟啶胺、氟吡菌酰胺、氟嘧菌酯、粉唑醇、氟唑菌酰胺、先正達(dá)、異菌脲、異噻菌胺、代森錳鋅、代森錳、葉菌唑、苯氧菌胺、腈菌唑、吡噻菌胺、啶氧菌酯、丙環(huán)唑、甲基代森鋅、丙硫菌唑、唑菌胺酯、五氯硝基苯、戊唑醇、氟醚唑、甲基硫菌靈、肟菌酯；甜菜除草劑：殺草敏、甜安寧、乙氧氟草黃、甜菜寧、野麥畏、二氯吡啶酸、丁基吡氟禾草靈、環(huán)草定、苯嗪草酮、喹草酸、噻草酮、三氟啶磺隆、得殺草、精喹禾靈；甜菜殺昆蟲劑類：吡蟲啉、可尼丁、噻蟲嗪、噻蟲啉、啶蟲脒、呋蟲胺、溴氰菊酯、β-氟氯氰菊酯、γ/λ三氯氟氰菊酯、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2,2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮、七氟菊酯、氯蟲酰胺、Cyaxypyr、氟蟲腈、克百威；卡諾拉(Canola)除草劑：二氯吡啶酸、禾草靈、丁基吡氟禾草靈、草銨膦、草甘膦、吡草胺、氟樂(lè)靈、胺苯磺隆、喹草酸、精喹禾靈、烯草酮、得殺草；卡諾拉殺真菌劑：嘧菌酯、聯(lián)苯吡菌胺、啶酰菌胺、多菌靈、環(huán)丙唑醇、苯醚甲環(huán)唑、醚菌胺、氟環(huán)唑、氟啶胺、氟啶胺、氟吡菌酰胺、氟嘧菌酯、氟硅唑、氟唑菌酰胺、異菌脲、先正達(dá)、甲哌鎓氯、葉菌唑、苯氧菌胺、多效唑(Paclobutrazole)、吡噻菌胺、啶氧菌酯、咪鮮胺、丙硫菌唑、唑菌胺酯、戊唑醇、甲基硫菌靈、肟菌酯、烯菌酮；卡諾拉殺昆蟲劑：克百威、噻蟲啉、溴氰菊酯、吡蟲啉、噻蟲胺、噻蟲嗪、啶蟲脒、呋蟲胺(Dinetofuran)、β-氟氯氰菊酯、γ-和λ-氯氟氰菊酯、τ-氟胺氰菊酯(Fluvaleriate)、乙蟲腈、多殺菌素、乙基多殺菌素、氟蟲酰胺、氯蟲酰胺、氰蟲酰胺(Cyazypyr)、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2,2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮。通過(guò)說(shuō)明而不是通過(guò)限制來(lái)提供以下實(shí)例。實(shí)驗(yàn)性實(shí)例實(shí)例1.從蘇云金桿菌中發(fā)現(xiàn)新穎殺有害生物基因使用以下步驟從細(xì)菌菌株ATX47307和ATX65002中鑒定新穎的殺有害生物基因：·從該菌株中制備總的DNA?？偟腄NA含有基因組DNA和染色體外DNA。染色體外的DNA包括以下各項(xiàng)的一些或全部的混合物：不同尺寸的質(zhì)粒、噬菌體染色體、其他未表征的染色體外的分子。·對(duì)該DNA進(jìn)行測(cè)序。通過(guò)新一代測(cè)序方法對(duì)總的DNA進(jìn)行測(cè)序?！ねㄟ^(guò)同源性和/或其他計(jì)算分析來(lái)鑒定推定的毒素基因?！ぎ?dāng)需要時(shí)，通過(guò)幾種PCR或克隆策略中的一種(例如TAIL-PCR)來(lái)對(duì)感興趣的基因進(jìn)行序列最終處理。表1.從菌株ATX47307中鑒定的新穎基因Axmi477.2和Axmi477.3代表從相對(duì)于Axmi477的下游起始位點(diǎn)編碼的蛋白。表2.從菌株ATX47307中鑒定的新穎基因Axmi482.2、Axmi482.3和Axmi482.4代表從相對(duì)于Axmi482的下游起始位點(diǎn)編碼的蛋白。表3.從菌株ATX65002中鑒定的新穎基因Axmi486.2、Axmi486.3、Axmi486.4和Axmi486.5代表從相對(duì)于Axmi486的下游起始位點(diǎn)編碼的蛋白。表4.從菌株ATX65002中鑒定的新穎基因Axmi525.2、Axmi525.3、Axmi525.4、Axmi525.5、Axmi525.6和Axmi525.7代表從相對(duì)于Axmi525的下游起始位點(diǎn)編碼的蛋白。實(shí)例2.殺有害生物活性的測(cè)定本發(fā)明的核苷酸序列可以針對(duì)它們產(chǎn)生殺有害生物蛋白的能力來(lái)進(jìn)行測(cè)試。經(jīng)常通過(guò)多種方式來(lái)評(píng)定一種殺有害生物蛋白充當(dāng)針對(duì)一種有害生物的殺有害生物劑的能力。在本領(lǐng)域內(nèi)熟知的一種方法是進(jìn)行一項(xiàng)攝食測(cè)定。在這項(xiàng)攝食測(cè)定中，將這種有害生物暴露于一種包括有待測(cè)試的化合物的樣品或?qū)φ諛悠贰＝?jīng)常，這是通過(guò)將有待測(cè)試的材料、或此類材料的一種合適的稀釋物置于該有害生物將攝取的材料(如，人工餌料)上來(lái)進(jìn)行。有待測(cè)試的材料可以由液體、固體、或漿料構(gòu)成?？蓪⒂写郎y(cè)試的材料置于表面上，并接著允許其干燥?？商娲?，可將有待測(cè)試的材料與一種溶化的人工餌料進(jìn)行混合，并且隨后將它們分配到測(cè)定小室中。測(cè)定小室可以是例如一個(gè)杯子、一個(gè)皿、或一個(gè)微量滴定板的一個(gè)孔。用于吸吮性有害生物(suckingpest)(例如，蚜蟲)的測(cè)定可以涉及通過(guò)一個(gè)分隔物將測(cè)試材料與昆蟲分開，這種分隔物理想地是可以被這種吸吮性昆蟲的吸吮式口器刺穿以便允許攝取這種測(cè)試材料的部分。經(jīng)常將這種測(cè)試材料與一種攝食刺激物(如蔗糖)相混合，以便促進(jìn)該測(cè)試化合物的攝取。其他類型的測(cè)定可以包括將這種測(cè)試材料顯微注射到這種有害生物的口或腸內(nèi)，以及形成轉(zhuǎn)基因的植物，之后測(cè)試這種有害生物攝食該轉(zhuǎn)基因植物的能力。植物測(cè)試可涉及分離被正常地消耗的植物部分，例如放在葉上的小籠，或分離在包括昆蟲的籠中的整個(gè)植物。測(cè)試有害生物的其他方法和手段在本領(lǐng)域是已知的，并且可見于例如羅伯森(Robertson)和普雷斯勒(Preisler)編著(1992)使用節(jié)肢動(dòng)物的殺有害生物劑生物測(cè)定(Pesticidebioassayswitharthropods)，CRC，波卡拉頓(BocaRaton)，佛羅里達(dá)州(FL)。可替代地，在期刊節(jié)肢動(dòng)物管理測(cè)試(ArthropodManagementTests)以及經(jīng)濟(jì)昆蟲學(xué)雜志中、或通過(guò)與美國(guó)昆蟲學(xué)學(xué)會(huì)(EntomologicalSocietyofAmerica，ESA)的會(huì)員的討論一般性地描述了這些測(cè)定。在一些實(shí)施例中，將編碼在此披露的這些殺有害生物蛋白的毒素區(qū)域的DNA區(qū)域克隆到大腸桿菌表達(dá)載體pMAL-C4x中，位于編碼麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)的malE基因后面。這些框內(nèi)融合物導(dǎo)致大腸桿菌內(nèi)的MBP-Axmi融合蛋白表達(dá)。對(duì)于大腸桿菌內(nèi)的表達(dá)，用多個(gè)單獨(dú)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21*DE3。將多個(gè)單一菌落接種到補(bǔ)充有羧芐青霉素和葡萄糖的LB中，并且在37℃下生長(zhǎng)過(guò)夜。次日，用1％的過(guò)夜培養(yǎng)物接種新鮮的培養(yǎng)基并且37℃下生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。隨后，在20℃下用0.3mMIPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)物。將每個(gè)細(xì)胞沉淀懸浮于20mMTris-Cl緩沖液、pH7.4+200mMNaCl+1mMDTT+蛋白酶抑制劑中并且進(jìn)行超聲處理。由SDS-PAGE進(jìn)行的分析可以用于證實(shí)融合蛋白的表達(dá)。隨后，將總的無(wú)細(xì)胞提取物上樣于連接至快速蛋白液相色譜(FPLC)的直鏈淀粉柱中，以親和純化MBP-axmi融合蛋白。用10mM麥芽糖溶液將結(jié)合的融合蛋白從該樹脂中洗脫出來(lái)。隨后用Xa因子抑或胰蛋白酶切割純化的融合蛋白，以便從Axmi蛋白中除去氨基末端MBP標(biāo)簽?？梢酝ㄟ^(guò)SDS-PAGE確定蛋白的切割和溶解度。實(shí)例3.表達(dá)和純化表達(dá)Axmi477(其在此列出為SEQIDNO:8)、Axmi482(其在此列出為SEQIDNO:13)、Axmi486(其在此列出為SEQIDNO:16)、和Axmi525(其在此列出為SEQIDNO:26)的截短變體并且測(cè)試生物活性。使用II融合DNA聚合酶與在3’端摻入AscI接頭的引物，將這些基因從其各自的菌株中進(jìn)行PCR擴(kuò)增。用AscI消化擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物并將其連接到pMalC4X載體中。將這些克隆通過(guò)測(cè)序證實(shí)并轉(zhuǎn)化到Bl21感受態(tài)細(xì)胞中。將各自的單一菌落接種到LB培養(yǎng)基中并在37℃下生長(zhǎng)直到到達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，并且在20℃下使用0.5mMIPTG持續(xù)誘導(dǎo)18小時(shí)。在室溫下以1:50比率用Xa因子(FactorXa)將純化的蛋白消化過(guò)夜。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案，將純化的蛋白提交到對(duì)選定昆蟲有害生物進(jìn)行的生物測(cè)定。這些結(jié)果示于表5-8中。表5.對(duì)于Axmi477的死亡率和矮化評(píng)分有害生物組矮化評(píng)分死亡率百分比菜蛾(DBM)4100黎豆夜蛾(VBC)4100西南玉米稈草螟(SWCB)3.525小蔗稈草螟(SCB)3.50煙芽夜蛾(Hv)475谷實(shí)夜蛾(Hz)225玉米螟(ECB)325草地夜娥(FAW)10甜菜夜蛾(BAW)30小地老虎(BCW)40大豆夜蛾(SBL)4100表6.對(duì)于Axmi482的死亡率和矮化評(píng)分有害生物組矮化評(píng)分死亡率百分比菜蛾(DBM)4100黎豆夜蛾(VBC)475西南玉米稈草螟(SWCB)450小蔗稈草螟(SCB)30煙芽夜蛾(Hv)10谷實(shí)夜蛾(Hz)40玉米螟(ECB)31草地夜娥(FAW)30表7.對(duì)于Axmi486的死亡率和矮化評(píng)分有害生物組矮化評(píng)分死亡率百分比菜蛾(DBM)4100黎豆夜蛾(VBC)437西南玉米稈草螟(SWCB)3.550小蔗稈草螟(SCB)2.525煙芽夜蛾(Hv)3.50谷實(shí)夜蛾(Hz)30大豆夜蛾(SBL)10表8.對(duì)于Axmi525的死亡率和矮化評(píng)分有害生物組矮化評(píng)分死亡率百分比草地夜娥(FAW)10％煙芽夜蛾(Hv)1.50％谷實(shí)夜蛾(Hz)30％黎豆夜蛾(VBC)442％南方灰翅夜蛾(SAW)3.270％菜蛾(DBM)4100％西南玉米稈草螟(SWCB)483％南方玉米螟(SCB)466％矮化得分：0-無(wú)活性1-不均勻矮化2-輕度均勻矮化3–強(qiáng)均勻矮化4–嚴(yán)重均勻矮化實(shí)例4.用于植物表達(dá)的基因的運(yùn)載本發(fā)明的編碼區(qū)是與用于在植物中表達(dá)的適當(dāng)?shù)膯?dòng)子和終止子序列相連的。這樣的序列在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的，并且可以包括用于在單子葉植物中表達(dá)的水稻肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子或玉米泛素啟動(dòng)子，用于在雙子葉植物中表達(dá)的擬南芥屬UBQ3啟動(dòng)子或CaMV35S啟動(dòng)子、以及nos或PinII終止子。用于生產(chǎn)并證實(shí)啟動(dòng)子-基因-終止子構(gòu)建體的技術(shù)在本領(lǐng)域內(nèi)也是熟知的。在本發(fā)明的一個(gè)方面，設(shè)計(jì)并產(chǎn)生了合成的DNA序列。這些合成序列具有相對(duì)于親本序列有所改變的核苷酸序列，但是編碼與親本序列基本一致的蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的另一方面，設(shè)計(jì)這些合成基因的修飾變體以使得將得到的肽靶向一種植物細(xì)胞器，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或質(zhì)外體。已知導(dǎo)致融合蛋白靶向植物細(xì)胞器的肽序列在本領(lǐng)域是已知的。例如，來(lái)自白羽扇豆的酸性磷酸酶基因的N末端區(qū)域(IDGI:14276838，米勒等人(2001)植物生理學(xué)(PlantPhysiology)127:594-606)在本領(lǐng)域是已知導(dǎo)致異源蛋白的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向的。如果得到的融合蛋白在C末端還包括一個(gè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)保留序列，該內(nèi)質(zhì)網(wǎng)保留序列包括肽N末端-賴氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-亮氨酸(即，“KDEL”基序，SEQIDNO:27)，則該融合蛋白將被靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。如果這種融合蛋白在C末端缺少一個(gè)靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的序列，則該蛋白將被靶向該內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，但最終將被隔離在質(zhì)外體中。因此，這個(gè)基因編碼一種融合蛋白，該融合蛋白包括了來(lái)自白羽扇豆的酸性磷酸酶基因的N末端31個(gè)氨基酸(IDGI:14276838，米勒等人，2001，同上文)，它們與本發(fā)明的氨基酸序列的N末端相融合，并且在C末端上與KDEL序列(SEQIDNO:27)相融合。因此，預(yù)測(cè)得到的蛋白一旦表達(dá)于一種植物細(xì)胞中時(shí)就被靶向到該植物的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。將以上說(shuō)明的植物表達(dá)盒與一種合適的、輔助轉(zhuǎn)化的細(xì)胞和組織的選擇的植物可選擇標(biāo)記相組合，并且將其連接到植物轉(zhuǎn)化載體中。這些可以包括來(lái)自土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化的二元載體、或用于氣溶膠或生物射彈轉(zhuǎn)化的簡(jiǎn)單的質(zhì)粒載體。實(shí)例5.使用在此說(shuō)明的殺有害生物蛋白基因進(jìn)行的玉米細(xì)胞的轉(zhuǎn)化在授粉后8至12天收集玉米穗。將胚與穗進(jìn)行分離，并且那些大小為0.8-1.5mm的胚是優(yōu)選用于轉(zhuǎn)化的。將胚以盾片側(cè)向上的方式置于在一種適當(dāng)?shù)姆跤囵B(yǎng)基中，如DN62A5S培養(yǎng)基(3.98g/LN6鹽；1mL/L(的1000x母液)N6維生素類；800mg/LL-天冬酰胺；100mg/L肌醇；1.4g/LL-脯氨酸；100mg/L酪蛋白氨基酸；50g/L蔗糖；1mL/L(的1mg/mL母液)2,4-D)。然而，除DN62A5S以外的培養(yǎng)基和鹽類是適合的并且在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的。將這些胚在黑暗中25℃下孵育過(guò)夜。然而，本質(zhì)上不需要將這些胚孵育過(guò)夜。將所得到的外植體轉(zhuǎn)移至網(wǎng)眼方陣(30-40個(gè)/平板)，轉(zhuǎn)移至滲透培養(yǎng)基上并保持約30-45分鐘，隨后轉(zhuǎn)移至一個(gè)聚束平板(beamingplate)上(參見，例如，PCT公開號(hào)WO/0138514和美國(guó)專利號(hào)5,240,842)。在植物細(xì)胞中將被設(shè)計(jì)為本發(fā)明基因的DNA構(gòu)建體加速進(jìn)入植物組織中，這是使用一種氣溶膠束加速器、使用基本上如PCT公開號(hào)WO/0138514中所說(shuō)明的條件進(jìn)行的。在聚束之后，將胚在滲透培養(yǎng)基上孵育約30分鐘，并且將其置于孵育培養(yǎng)基上25℃下黑暗中過(guò)夜。為了避免不適當(dāng)?shù)仄茐慕?jīng)聚束的外植體，它們?cè)谵D(zhuǎn)移至恢復(fù)培養(yǎng)基之前被孵育至少24小時(shí)。然后，將胚在25℃下在黑暗中擴(kuò)散到恢復(fù)期培養(yǎng)基上，持續(xù)約5天，隨后轉(zhuǎn)移至一種選擇培養(yǎng)基中。將外植體在選擇培養(yǎng)基中孵育達(dá)到8周，這取決于所利用的特定選擇的性質(zhì)和特征。在選擇期之后，將得到的愈傷組織轉(zhuǎn)移至胚成熟培養(yǎng)基中，直至觀察到成熟的體細(xì)胞胚的形成。然后，將得到的成熟的體細(xì)胞胚置于低光照下，并且通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法來(lái)引發(fā)再生過(guò)程。允許這些得到的芽在生根培養(yǎng)基上生根，并且將得到的植物轉(zhuǎn)移至育苗盆(nurserypot)中并繁殖成轉(zhuǎn)基因植物。材料DN62A5S培養(yǎng)基用1NKOH/1NKCl將該溶液的pH調(diào)整至pH5.8，加入高達(dá)3g/L的濃度的結(jié)冷膠(Gelrite)(西格瑪)，并將該培養(yǎng)基高壓滅菌。在冷卻至50℃之后，加入2ml/L的5mg/ml硝酸銀母液(植物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室)。實(shí)例6.通過(guò)土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化將本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞中穗最好在授粉之后8至12天進(jìn)行收集。將胚與穗進(jìn)行分離，并且那些大小為0.8-1.5mm的胚是優(yōu)選用于轉(zhuǎn)化的。將胚以盾片側(cè)向上的方式置于在一種適當(dāng)?shù)姆跤囵B(yǎng)基中，并且在25℃下在黑暗中孵育過(guò)夜。然而，本質(zhì)上不需要將這些胚孵育過(guò)夜。將這些胚與一種土壤桿菌屬菌株進(jìn)行接觸，該菌株包括了這些適當(dāng)?shù)妮d體用于Ti質(zhì)粒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，持續(xù)約5至10分鐘，并接著將其置于共培養(yǎng)基上持續(xù)約3天(25℃下黑暗中)。在共培養(yǎng)之后，將外植體轉(zhuǎn)移到恢復(fù)期培養(yǎng)基中，持續(xù)約5天(25℃下、黑暗中)。將外植體在選擇培養(yǎng)基中孵育達(dá)到8周，這取決于所利用的特定選擇的性質(zhì)和特征。在選擇期之后，將得到的愈傷組織轉(zhuǎn)移至胚成熟培養(yǎng)基中，直至觀察到成熟的體細(xì)胞胚的形成。然后，將得到的成熟的體細(xì)胞胚置于低光照下，并且如本領(lǐng)域內(nèi)所已知地引發(fā)再生過(guò)程。在本說(shuō)明書中提到的所有公開文件和專利申請(qǐng)對(duì)于本發(fā)明所涉及的領(lǐng)域的普通技術(shù)人員的技術(shù)水平而言是指示性的。所有公開物和專利申請(qǐng)均通過(guò)引用結(jié)合在此，其程度如同每個(gè)單獨(dú)的公開物或?qū)＠暾?qǐng)被確切地并單獨(dú)地指明通過(guò)引用而被結(jié)合。盡管本發(fā)明在上文中出于理解清楚的目的、通過(guò)展示和實(shí)例已經(jīng)相當(dāng)詳細(xì)地進(jìn)行說(shuō)明，應(yīng)當(dāng)清楚是可以在所附的權(quán)利要求書的范圍內(nèi)實(shí)行某些改變和修飾。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3