本發(fā)明涉及高分辨率分型HLA基因的方法和試劑盒。
背景技術(shù)：
：人類(lèi)白細(xì)胞抗原(HLA)系統(tǒng)是人類(lèi)基因組中最多態(tài)的領(lǐng)域之一。至今，已經(jīng)鑒定了HLAI類(lèi)和II類(lèi)基因座的超過(guò)10533個(gè)等位基因，并且這個(gè)數(shù)字還在增長(zhǎng)。即使該系統(tǒng)是研究最廣泛的領(lǐng)域之一，但就HLA基因分型而論，這種水平的多態(tài)性仍然是個(gè)挑戰(zhàn)。在許多醫(yī)學(xué)指征例如移植、HLA相關(guān)疾病的研究或個(gè)體識(shí)別方面，都要常規(guī)進(jìn)行HLA分型。特別是在移植的情況下，需要高分辨率HLA分型來(lái)實(shí)現(xiàn)供體和受體之間盡可能最佳的組織相容性并從而降低移植物抗宿主病的風(fēng)險(xiǎn)和死亡率。當(dāng)前，一些廣泛使用的用于經(jīng)典HLAI類(lèi)和II類(lèi)基因座(HLA-A、-B、-C、DR、-DQ和-DP)分型的分子方法是利用序列特異性寡核苷酸雜交(SSO)或序列特異性引發(fā)(SSP)和基于序列分型(SBT)的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)分型方法。然而，縱然這些方法提供了高分辨率分型，但基因分型歧義在許多情況下仍然是個(gè)問(wèn)題。由于不能質(zhì)詢(xún)所有多態(tài)位置，或者當(dāng)兩種或更多種不同的等位基因組合產(chǎn)生同樣的序列(順式/反式歧義)時(shí)，產(chǎn)生歧義的等位基因比對(duì)。由于記載的HLA等位基因的數(shù)量較大并且迅速增長(zhǎng)，分辨這些歧義需要昂貴和費(fèi)力的方法。最近，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了利用下一代測(cè)序(next-generationsequencing)(NGS)的新的HLA分型策略。與常規(guī)HLA分型方法相比，這些基于NGS的技術(shù)明顯減少了基因分型歧義(Danzer等，BMCGenomics.2013Apr4；14:221)。然而，為了徹底解決相位歧義的問(wèn)題和檢測(cè)全部多態(tài)性例如單核苷酸多態(tài)性(SNP)或可以導(dǎo)致無(wú)效等位基因的插入缺失，有必要擴(kuò)增并測(cè)序全HLA基因座(Shiina等，TissueAntigens.2012Oct；80(4):305-16)并且，迄今為止，該過(guò)程的復(fù)雜性以及運(yùn)行成本阻止了這些方法在臨床實(shí)驗(yàn)室中的應(yīng)用。因此，非常需要開(kāi)發(fā)新的基于NGS的HLA分型策略，其更簡(jiǎn)單、更快速并且更成本有效，并因此可在臨床實(shí)驗(yàn)室中常規(guī)使用。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明目的在于提供一種改進(jìn)的高分辨率HLA分型方法，其在高達(dá)8位的分辨率水平上無(wú)歧義地分辨HLAI類(lèi)(HLA-A、-B、-C)和II類(lèi)(HLA-DRB1、-DRB3、-DRB4、-DRB5、-DQA1、-DQB1和-DPB1)等位基因并且對(duì)常規(guī)用于臨床實(shí)驗(yàn)室而言足夠簡(jiǎn)單和成本有效。因此，在第一個(gè)方面，本發(fā)明涉及測(cè)定DNA樣品的HLA基因型的方法，所述方法包括a)在反應(yīng)容器中，使所述DNA樣品與包含一組擴(kuò)增引物的擴(kuò)增反應(yīng)混合物接觸，所述引物包含SEQIDNO：1至14中所示的全序列或在它們的5’端缺失一至五個(gè)——1、2、3、4或5個(gè)核苷酸的截短形式或者由所述全序列或截短形式組成；b)利用引物依賴(lài)性DNA擴(kuò)增反應(yīng)擴(kuò)增靶序列，從而產(chǎn)生擴(kuò)增子；和c)測(cè)定所述擴(kuò)增子的序列。所述方法的步驟a)還可以包括-在不同的反應(yīng)容器中，使所述DNA樣品與包含一組擴(kuò)增引物的擴(kuò)增反應(yīng)混合物接觸，所述引物包含SEQIDNO：19至24中所示的序列或在它們的5’端缺失一至五個(gè)核苷酸的截短形式或者由所述序列或截短形式組成并靶向HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4和HLA-DRB5基因；和/或-在不同的反應(yīng)容器中，使所述DNA樣品與包含一組擴(kuò)增引物的擴(kuò)增反應(yīng)混合物接觸，所述引物包含SEQIDNO：25至28中所示的序列或在它們的5’端缺失一至五個(gè)核苷酸的截短形式或者由所述序列或截短形式組成并靶向HLA-DPB1基因；和/或-在不同的反應(yīng)容器中，使所述DNA樣品與包含一組擴(kuò)增引物的擴(kuò)增反應(yīng)混合物接觸，所述引物包含SEQIDNO：29至32中所示的序列或在它們的5’端缺失一至五個(gè)核苷酸的截短形式或者由所述序列或截短形式組成并靶向HLA-DQB1基因；和/或-在不同的反應(yīng)容器中，使所述DNA樣品與包含一組擴(kuò)增引物的擴(kuò)增反應(yīng)混合物接觸，所述引物包含SEQIDNO：33至36中所示的序列或在它們的5’端缺失一至五個(gè)核苷酸的截短形式或者由所述序列或截短形式組成并靶向HLA-DQA1基因；和/或-在不同的反應(yīng)容器中，使所述DNA樣品與包含一組擴(kuò)增引物的擴(kuò)增反應(yīng)混合物接觸，所述引物包含SEQIDNO：13和14中所示的序列或在它們的5’端缺失一至五個(gè)核苷酸的截短形式并靶向HLA-A基因；和/或-在不同的反應(yīng)容器中，使所述DNA樣品與包含一組擴(kuò)增引物的擴(kuò)增反應(yīng)混合物接觸，所述引物包含SEQIDNO：15至17中所示的序列或在它們的5’端缺失一至五個(gè)核苷酸的截短形式并靶向HLA-B基因；和/或-在不同的反應(yīng)容器中，使所述DNA樣品與包含一組擴(kuò)增引物的擴(kuò)增反應(yīng)混合物接觸，所述引物包含SEQIDNO：15和18中所示的序列或在它們的5’端缺失一至五個(gè)核苷酸的截短形式并靶向HLA-C基因。在所述方法的步驟b)中，每個(gè)反應(yīng)容器中的靶序列可以利用統(tǒng)一的熱循環(huán)方案(profile)擴(kuò)增。特別是，退火溫度可以在55至65℃范圍內(nèi)。優(yōu)選地，所述引物依賴(lài)性DNA擴(kuò)增反應(yīng)是PCR反應(yīng)。在所述方法的步驟c)中，所述擴(kuò)增子的序列可以利用下一代測(cè)序法測(cè)定。所述方法還可以包括將所述測(cè)定的擴(kuò)增子序列與已知HLA類(lèi)型的DNA序列比較。在另一個(gè)方面，本發(fā)明還涉及用于測(cè)定DNA樣品的HLA基因型的試劑盒，所述試劑盒包含一組擴(kuò)增引物，所述引物包含SEQIDNO：1至14中所示的全序列或在它們的5’端缺失一至五個(gè)核苷酸的截短形式或者由所述全序列或截短形式組成。所述試劑盒還可以包含-一組擴(kuò)增引物，其包含SEQIDNO：19至24中所示的全序列或在它們的5’端缺失一至五個(gè)核苷酸的截短形式或者由所述全序列或截短形式組成；和/或-一組擴(kuò)增引物，其包含SEQIDNO：25至28中所示的全序列或在它們的5’端缺失一至五個(gè)核苷酸的截短形式或者由所述全序列或截短形式組成；和/或-一組擴(kuò)增引物，其包含SEQIDNO：29至32中所示的全序列或在它們的5’端缺失一至五個(gè)核苷酸的截短形式或者由所述全序列或截短形式組成；和/或-一組擴(kuò)增引物，其包含SEQIDNO：33至36中所示的全序列或在它們的5’端缺失一至五個(gè)核苷酸的截短形式或者由所述全序列或截短形式組成；和/或-一組擴(kuò)增引物，其包含SEQIDNO：15至18中所示的全序列或在它們的5’端缺失一至五個(gè)核苷酸的截短形式或者由所述全序列或截短形式組成。附圖說(shuō)明圖1.從用以下混合物的PCR反應(yīng)得到的PCR產(chǎn)物的電泳凝膠：(i)CL1F7和CL1R7引物(HLA-A基因座)；(ii)CL1F8、CL1R8和CL1R9引物(HLA-B基因座)；(iii)CL1F8和CL1R10引物(HLA-C基因座)；(iv)CL2F1、CL2F2、CL2R1至CL2R3和CL2R12引物(HLA-DRB1、-DRB3、-DRB4、-DRB5基因座)；(v)CL2F8、CL2F9、CL2R8和CL2R9引物(HLA-DQA1基因座)；(vi)CL2F6、CL2F7、CL2R6和CL2R7引物(HLA-DQB1基因座)；(vii)CL2F4、CL2F5、CL2R4和CL2R5引物(HLA-DPB1基因座)；或(viii)CL1F1至CL1F7和CL1R1至CL1R7引物(HLA-A、B和C基因座)。圖2.利用本發(fā)明的方法對(duì)88個(gè)樣品的HLA-A、-B、-C、-DRB1、-DQA1、-DQB1和–DPB1分型的結(jié)果。PCR擴(kuò)增反應(yīng)在相同的裝置中利用相同的循環(huán)方案進(jìn)行。在高達(dá)8-位的分辨率水平(也參見(jiàn)表2)下沒(méi)有任何歧義地比對(duì)HLA-A、-B、-C、-DRB1、-DQA1、-DQB1和–DPB1等位基因，只需要五個(gè)PCR反應(yīng)容器。圖3.從用SEQIDNO：37和SEQIDNO：38(HLA-DQB1基因座)的引物混合物的PCR反應(yīng)得到的PCR產(chǎn)物的電泳凝膠。具體實(shí)施方式基于發(fā)明人對(duì)HLA系統(tǒng)多態(tài)性和臨床實(shí)踐約束的堅(jiān)實(shí)認(rèn)識(shí)，他們開(kāi)發(fā)了比當(dāng)前已知的基于NGS的方法更簡(jiǎn)單、更快速和更成本有效的新的HLA分型方法。本發(fā)明人鑒定了不同的擴(kuò)增引物組，所述擴(kuò)增引物以最高的分辨率水平?jīng)]有歧義地顯著減少為了得到用于廣泛HLA分型的適當(dāng)?shù)臄U(kuò)增子所需要的擴(kuò)增反應(yīng)數(shù)量，其至少包括A、B和C基因座以及任選的DRB1、DRB3、DRB4、DRB5、DQA1、DQB1和DPB1基因座。選擇所述擴(kuò)增引物以覆蓋基因座A、B、C、DQA1和DQB1基因的從5'非翻譯區(qū)(UTR)到3'UTR以及DRB1、DRB3、DRB4、DRB5和DPB1基因的從內(nèi)含子1到3’UTR的全基因。所述擴(kuò)增反應(yīng)可以在高水平的多重性和統(tǒng)一的熱循環(huán)方案下進(jìn)行，從而減少所需要的反應(yīng)容器以及熱循環(huán)儀的數(shù)量。如在試驗(yàn)章節(jié)中所說(shuō)明，本發(fā)明的方法在高達(dá)8位的分辨率水平下沒(méi)有任何歧義地完全分辨HLAI類(lèi)(HLA-A、-B、-C)和II類(lèi)(HLA-DRB1、-DRB3、-DRB4、-DRB5、-DQA1、-DQB1和-DPB1)等位基因并且允許檢測(cè)新的HLA等位基因以及無(wú)效等位基因。這些結(jié)果證明了這種方法在臨床實(shí)驗(yàn)室執(zhí)行高通量和高分辨率HLA分型中克服了當(dāng)前的局限。定義術(shù)語(yǔ)“等位基因”，用在本文中時(shí)，是指遺傳基因座的替代形式之一。用在本文中時(shí)，術(shù)語(yǔ)“基因座”是指具體的基因或等位基因在染色體上的位置。術(shù)語(yǔ)“基因型”用在本文中時(shí)，是指在個(gè)體中或在來(lái)自所述個(gè)體的樣品中包含的基因或多個(gè)基因的等位基因的描述。表述“測(cè)定HLA基因型”用在本文中時(shí)是指測(cè)定在受試者的個(gè)體等位基因中存在的HLA多態(tài)性。術(shù)語(yǔ)“DNA樣品”是指從受試者獲得的含有人類(lèi)基因組DNA的樣品。用在本文中時(shí)，術(shù)語(yǔ)“受試者”是指人類(lèi)，包括成人、兒童和胎兒期的人類(lèi)。術(shù)語(yǔ)“擴(kuò)增引物”用在本文中時(shí)是指寡核苷酸，其能夠與靶核酸或“模板”選擇性雜交、更特別是能夠退火到與待擴(kuò)增的靶序列相鄰的DNA區(qū)域選擇性雜交，并為由聚合酶例如DNA聚合酶催化的與模板互補(bǔ)的多核苷酸的模板引導(dǎo)合成(聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增)提供起始點(diǎn)。所述引物優(yōu)選是單鏈寡脫氧核糖核苷酸。擴(kuò)增引物通常長(zhǎng)度15至40個(gè)核苷酸，優(yōu)選長(zhǎng)度15至30個(gè)核苷酸。所述擴(kuò)增引物可以包含與目標(biāo)HLA序列互補(bǔ)的區(qū)域和與目標(biāo)HLA序列不互補(bǔ)的區(qū)域。在這種情況下，所述與目標(biāo)HLA序列互補(bǔ)的區(qū)域長(zhǎng)度至少15個(gè)核苷酸。引物經(jīng)常作為合成分子獲得并且可以設(shè)計(jì)有寬范圍的分子修飾，特別是在它們的5’-或3’-端。用在本文中時(shí)，短語(yǔ)“與......選擇性雜交”是指擴(kuò)增引物只與特殊的核苷酸序列以比與其他核苷酸序列更高的親合性、例如在更嚴(yán)格的條件下結(jié)合、雙鏈化或雜交。本領(lǐng)域技術(shù)人員將領(lǐng)會(huì)，核苷酸之間的特異性雜交通常依靠互補(bǔ)的核苷酸序列之間的Watson-Crick配偶鍵。術(shù)語(yǔ)“擴(kuò)增引物組”用在本文中時(shí)是指至少兩個(gè)擴(kuò)增引物，即至少一個(gè)正向引物和至少一個(gè)反向引物。術(shù)語(yǔ)“正向引物”和“反向引物”按本領(lǐng)域中的理解用來(lái)指示用于擴(kuò)增雙鏈核酸的兩條鏈的引物組。用在本文中時(shí)，術(shù)語(yǔ)“5'截短形式”是指包含至少15個(gè)核苷酸的引物，并且其中，與參比序列、例如SEQIDNO：1至36發(fā)布的序列之一相比，在5'端缺失一或若干個(gè)核苷酸。在具體實(shí)施方式中，術(shù)語(yǔ)“5'截短形式”是指包含至少15個(gè)核苷酸的引物，并且其中，與所述參比序列相比，在5’端缺失1、2、3、4或5個(gè)核苷酸，優(yōu)選1、2或3個(gè)核苷酸，更優(yōu)選1或2個(gè)核苷酸。術(shù)語(yǔ)“引物依賴(lài)性DNA擴(kuò)增反應(yīng)”，用在本文中時(shí)，是指需要聚合酶、與擴(kuò)增引物以及核苷酸退火的模板分子和適當(dāng)?shù)沫h(huán)境條件的核酸分子酶促增長(zhǎng)過(guò)程。擴(kuò)增技術(shù)的實(shí)例包括但不限于，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、修改的PCR技術(shù)和連接酶鏈反應(yīng)(LCR)。通常，所述片段由與待擴(kuò)增的片段的5'末端和3'末端雜交的正向引物和反向引物限定。引物延伸反應(yīng)的條件和試劑是本領(lǐng)域公知的(參見(jiàn)，例如，Sambrook等《分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(MolecularCloning，ALaboratoryManual)，第三版，ColdSpringHarborLaboratoryPress，2000，和Ausubel等《分子生物學(xué)現(xiàn)行方案》(CurrentProtocolsinMolecularBiology)，JohnWiley&Sons，NY，1998)。擴(kuò)增反應(yīng)可以包括熱循環(huán)或可以等溫進(jìn)行。優(yōu)選地，所述引物依賴(lài)性DNA擴(kuò)增反應(yīng)是聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。優(yōu)選地，PCR在熱循環(huán)儀中進(jìn)行。術(shù)語(yǔ)“聚合酶鏈反應(yīng)”或“PCR”用在本文中時(shí)是指利用熱穩(wěn)定的DNA聚合酶和一組擴(kuò)增引物在周期反應(yīng)中擴(kuò)增DNA序列的方法，在所述周期反應(yīng)中，引物的退火、子代DNA鏈的合成和雙鏈體的變性各自在不同溫度下進(jìn)行。因?yàn)樗鲂潞铣傻腄NA鏈可以隨后充當(dāng)相同引物序列的附加模板，連續(xù)回合的引物退火、鏈伸長(zhǎng)和解離產(chǎn)生靶序列的迅速擴(kuò)增。用在本文中時(shí)，術(shù)語(yǔ)“擴(kuò)增反應(yīng)混合物”是指包含進(jìn)行引物依賴(lài)性DNA擴(kuò)增反應(yīng)所需要的全部試劑的混合物。通常，這種混合物包含DNA聚合酶、一組擴(kuò)增引物、適當(dāng)?shù)木彌_液和dNTP。用在本文中時(shí)，術(shù)語(yǔ)“DNA聚合酶”是指擴(kuò)增引物在核酸模板中伸長(zhǎng)所必需的酶。技術(shù)人員可以基于聚合酶的特性例如效率、加工性或保真性來(lái)選擇適宜的聚合酶。優(yōu)選地，所述聚合酶是高保真性和熱穩(wěn)定的聚合酶。術(shù)語(yǔ)“擴(kuò)增子”或“擴(kuò)增產(chǎn)物”，用在本文中時(shí)，是指在一對(duì)擴(kuò)增引物內(nèi)跨越的DNA片段，該片段由DNA聚合酶指數(shù)性擴(kuò)增。擴(kuò)增子可以是單鏈或雙鏈的。表述“測(cè)定序列”用在本文中時(shí)，是指測(cè)定沿著多核苷酸長(zhǎng)度的每個(gè)位置處核苷酸堿基的同一性。任何測(cè)序方法可用于本發(fā)明。用在本文中時(shí)，術(shù)語(yǔ)“核酸分子”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”可互換地使用并且是指通過(guò)磷酸二酯鍵連接的核苷酸單體的單鏈或雙鏈聚合物，優(yōu)選DNA。用在本說(shuō)明書(shū)中時(shí)，術(shù)語(yǔ)“約”是指在給定值的±10％的數(shù)值范圍。例如“約20”包括20的±10％，并且是指從18到22。優(yōu)選地，術(shù)語(yǔ)“約”是指給定值的±5％數(shù)值范圍。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法是體外方法。HLA基因HLA-A、HLA-B和HLA-C是人類(lèi)MHCI類(lèi)細(xì)胞表面抗原呈遞蛋白的三種主要類(lèi)型。它們通過(guò)呈遞來(lái)源于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔的肽而在免疫系統(tǒng)中起著中心作用并且在幾乎所有的細(xì)胞中都表達(dá)。這些受體是異二聚體并且由重α鏈和輕鏈(由人類(lèi)基因組的單獨(dú)的區(qū)域編碼的不變的β2微球蛋白分子)組成。HLA-A基因(基因ID：3105)含有8個(gè)編碼外顯子，HLA-B基因(基因ID：3106)和HLA-C基因(基因ID：3107)含有7個(gè)編碼外顯子。HLAII類(lèi)分子是由均錨定在膜中的α鏈和β鏈組成的異二聚體。它們通過(guò)呈遞來(lái)源于細(xì)胞外蛋白質(zhì)的肽而在免疫系統(tǒng)中起著中心作用。II類(lèi)分子在抗原遞呈細(xì)胞(例如B淋巴細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞)中表達(dá)。HLA-DRB1(基因ID：3123)、HLA-DRB3(基因ID：3125)、HLA-DRB4(基因ID：3126)和HLA-DRB5(基因ID：3127)屬于HLAII類(lèi)β鏈旁系同源基因。所述異二聚體由α鏈(DRA)和β鏈(DRB)組成。所述β鏈大致26-28kDa并由6個(gè)外顯子編碼。HLA-DQA1(基因ID：3117)屬于HLAII類(lèi)α鏈旁系同源基因。所述異二聚體由α鏈(DQA)和β鏈(DQB)組成。所述α鏈大致33-35kDa并由4個(gè)編碼外顯子編碼。HLA-DQB1(基因ID：3119)屬于HLAII類(lèi)β鏈旁系同源基因。所述β鏈大致26-28kDa并由5個(gè)編碼外顯子編碼。HLA-DPB1(基因ID：3115)屬于HLAII類(lèi)β鏈旁系同源基因。所述異二聚體由α鏈(DPA)和β鏈(DPB)組成。所述β鏈大致26-28kDa并由5個(gè)編碼外顯子編碼。在第一方面，本發(fā)明因此涉及測(cè)定DNA樣品的HLA基因型的方法，所述方法包括a)在反應(yīng)容器中，使所述DNA樣品與包含一組擴(kuò)增引物的擴(kuò)增反應(yīng)混合物接觸，所述引物包含SEQIDNO：1至14中所示的全序列或其5'截短形式或者由所述全序列或截短形式組成；b)利用引物依賴(lài)性DNA擴(kuò)增反應(yīng)擴(kuò)增靶序列，從而產(chǎn)生擴(kuò)增子；和c)測(cè)定所述擴(kuò)增子的序列。用于本發(fā)明方法中的DNA樣品包含可以從任何合適的來(lái)源獲得的人類(lèi)基因組DNA或由其組成。通常，基因組DNA從血液樣品或頰拭子樣品獲得。優(yōu)選地，基因組DNA樣品從外周血單核細(xì)胞提取。許許多多方法是技術(shù)人員分離和提純基因組DNA樣品可利用的和公知的。適合提供可以用于擴(kuò)增反應(yīng)例如PCR或測(cè)序反應(yīng)的DNA樣品的任何方法都可用于本發(fā)明。優(yōu)選地，所述DNA樣品應(yīng)該不含可能抑制擴(kuò)增或測(cè)序反應(yīng)的任何蛋白質(zhì)或其他污染物。在步驟a)中，使所述DNA樣品在反應(yīng)容器中與包含一組擴(kuò)增引物的擴(kuò)增反應(yīng)混合物接觸。所述反應(yīng)中基因組DNA的量可在每50μL反應(yīng)5至500ngDNA之間變化。該量可容易由技術(shù)人員調(diào)節(jié)。優(yōu)選地，每50μL反應(yīng)使用約160ng基因組DNA或每20μL反應(yīng)使用80ng基因組DNA。在本發(fā)明的方法中，所述靶向HLA-A、HLA-B和HLA-C基因的擴(kuò)增引物組包含-至少下列正向引物：包含SEQIDNO：1中所示的全序列或其5'截短形式或者由所述全序列或截短形式組成的引物；包含SEQIDNO：2中所示的全序列或其5'截短形式或者由所述全序列或截短形式組成的引物；包含SEQIDNO：3中所示的全序列或其5'截短形式或者由所述全序列或截短形式組成的引物；包含SEQIDNO：4中所示的全序列或其5'截短形式或者由所述全序列或截短形式組成的引物；包含SEQIDNO：5中所示的全序列或其5'截短形式或者由所述全序列或截短形式組成的引物；包含SEQIDNO：6中所示的全序列或其5'截短形式或者由所述全序列或截短形式組成的引物；和包含SEQIDNO：13中所示的全序列或其5'截短形式或者由所述全序列或截短形式組成的引物；以及-至少下列反向引物：包含SEQIDNO：7中所示的全序列或其5'截短形式或者由所述全序列或截短形式組成的引物；包含SEQIDNO：8中所示的全序列或其5'截短形式或者由所述全序列或截短形式組成的引物；包含SEQIDNO：9中所示的全序列或其5'截短形式或者由所述全序列或截短形式組成的引物；包含SEQIDNO：10中所示的全序列或其5'截短形式或者由所述全序列或截短形式組成的引物；包含SEQIDNO：11中所示的全序列或其5'截短形式或者由所述全序列或截短形式組成的引物；包含SEQIDNO：12中所示的全序列或其5'截短形式或者由所述全序列或截短形式組成的引物；和包含SEQIDNO：14中所示的全序列或其5'截短形式或者由所述全序列或截短形式組成的引物。在具體實(shí)施方式中，所述靶向HLA-A、HLA-B和HLA-C基因的擴(kuò)增引物組包括包含SEQIDNO：1至14中所示的序列或由所述序列組成的引物。在優(yōu)選實(shí)施方式中，所述擴(kuò)增引物組包括由SEQIDNO：1至14中所示的序列組成的引物，即正向引物SEQIDNO：1、2、3、4、5、6和13以及反向引物SEQIDNO：7、8、9、10、11、12和14。本發(fā)明的方法也可以用于測(cè)定HLA-DRB1、–DRB3、-DRB4、-DRB5基因和/或HLA-DPB1基因和/或HLA-DQB1和/或HLA-DQA1的基因型和/或用于另外測(cè)定HLA-A、HLA-B和/或HLA-C的基因型。因此，在實(shí)施方式中，所述方法在步驟a)中還可以包括，-在不同的反應(yīng)容器中，使所述DNA樣品與包含一組擴(kuò)增引物的擴(kuò)增反應(yīng)混合物接觸，所述引物包含SEQIDNO：19至24中所示的序列或其5'截短形式或者由所述序列或截短形式組成并靶向HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4和HLA-DRB5基因，即，包含SEQIDNO：19中所示的全序列或其5'截短形式或者由所述全序列或截短形式組成的引物；包含SEQIDNO：20中所示的全序列或其5'截短形式或者由所述全序列或截短形式組成的引物；包含SEQIDNO：21中所示的全序列或其5'截短形式或者由所述全序列或截短形式組成的引物；包含SEQIDNO：21中所示的全序列或其5'截短形式或者由所述全序列或截短形式組成的引物；包含SEQIDNO：22中所示的全序列或其5'截短形式或者由所述全序列或截短形式組成的引物；包含SEQIDNO：23中所示的全序列或其5'截短形式或者由所述全序列或截短形式組成的引物；和包含SEQIDNO：24中所示的全序列或其5'截短形式或者由所述全序列或截短形式組成的引物；和/或-在不同的反應(yīng)容器中，使所述DNA樣品與包含一組擴(kuò)增引物的擴(kuò)增反應(yīng)混合物接觸，所述引物包含SEQIDNO：25至28中所示的序列或其5'截短形式或者由所述序列或截短形式組成并靶向HLA-DPB1基因，即，包含SEQIDNO：25中所示的全序列或其5'截短形式或者由所述全序列或截短形式組成的引物；包含SEQIDNO：26中所示的全序列或其5'截短形式或者由所述全序列或截短形式組成的引物；包含SEQIDNO：27中所示的全序列或其5'截短形式或者由所述全序列或截短形式組成的引物；和包含SEQIDNO：28中所示的全序列或其5'截短形式或者由所述全序列或截短形式組成的引物；和/或-在不同的反應(yīng)容器中，使所述DNA樣品與包含一組擴(kuò)增引物的擴(kuò)增反應(yīng)混合物接觸，所述引物包含SEQIDNO：29至32中所示的序列或其5'截短形式或者由所述序列或截短形式組成并靶向HLA-DQB1基因，即，包含SEQIDNO：29中所示的全序列或其5'截短形式或者由所述全序列或截短形式組成的引物；包含SEQIDNO：30中所示的全序列或其5'截短形式或者由所述全序列或截短形式組成的引物；包含SEQIDNO：31中所示的全序列或其5'截短形式或者由所述全序列或截短形式組成的引物；和包含SEQIDNO：32中所示的全序列或其5'截短形式或者由所述全序列或截短形式組成的引物；和/或-在不同的反應(yīng)容器中，使所述DNA樣品與包含一組擴(kuò)增引物的擴(kuò)增反應(yīng)混合物接觸，所述引物包含SEQIDNO：33至36中所示的序列或其5'截短形式或者由所述序列或截短形式組成并靶向HLA-DQA1基因，即，包含SEQIDNO：33中所示的全序列或其5'截短形式或者由所述全序列或截短形式組成的引物；包含SEQIDNO：34中所示的全序列或其5'截短形式或者由所述全序列或截短形式組成的引物；包含SEQIDNO：35中所示的全序列或其5'截短形式或者由所述全序列或截短形式組成的引物；和包含SEQIDNO：36中所示的全序列或其5'截短形式或者由所述全序列或截短形式組成的引物；和/或-在不同的反應(yīng)容器中，使所述DNA樣品與包含一組擴(kuò)增引物的擴(kuò)增反應(yīng)混合物接觸，所述引物包含SEQIDNO：13和14中所示的序列或其5'截短形式并靶向HLA-A基因，即，包含SEQIDNO：13中所示的全序列或其5'截短形式或者由所述全序列或截短形式組成的引物；和包含SEQIDNO：14中所示的全序列或其5'截短形式或者由所述全序列或截短形式組成的引物；和/或-在不同的反應(yīng)容器中，使所述DNA樣品與包含一組擴(kuò)增引物的擴(kuò)增反應(yīng)混合物接觸，所述引物包含SEQIDNO：15至17中所示的序列或其5'截短形式并靶向HLA-B基因，即，包含SEQIDNO：15中所示的全序列或其5'截短形式或者由所述全序列或截短形式組成的引物；包含SEQIDNO：16中所示的全序列或其5'截短形式或者由所述全序列或截短形式組成的引物；和包含SEQIDNO：17中所示的全序列或其5'截短形式或者由所述全序列或截短形式組成的引物；和/或-在不同的反應(yīng)容器中，使所述DNA樣品與包含一組擴(kuò)增引物的擴(kuò)增反應(yīng)混合物接觸，所述引物包含SEQIDNO：15和18中所示的序列或其5'截短形式組成并靶向HLA-C基因，即，包含SEQIDNO：15中所示的全序列或其5'截短形式或者由所述全序列或截短形式組成的引物；和包含SEQIDNO：18中所示的全序列或其5'截短形式或者由所述全序列或截短形式組成的引物。在這種實(shí)施方式中，每組擴(kuò)增引物可以包含-包含SEQIDNO：19至24中所示的序列或由所述序列組成的引物；或-包含SEQIDNO：25至28中所示的序列或由所述序列組成的引物；或-包含SEQIDNO：29至32中所示的序列或由所述序列組成的引物；或-包含SEQIDNO：33至36中所示的序列或由所述序列組成的引物；或-包含SEQIDNO：13和14中所示的序列或由所述序列組成的引物；或-包含SEQIDNO：15至17中所示的序列或由所述序列組成的引物；或-包含SEQIDNO：15和18中所示的序列或由所述序列組成的引物。任選地，在這種實(shí)施方式中，每組擴(kuò)增引物可以包含-由SEQIDNO：19至24中所示的序列組成的引物；或-由SEQIDNO：25至28中所示的序列組成的引物；或-由SEQIDNO：29至32中所示的序列組成的引物；或-由SEQIDNO：33至36中所示的序列組成的引物；或-由SEQIDNO：13和14中所示的序列組成的引物；或-由SEQIDNO：15至17中所示的序列組成的引物；或-由SEQIDNO：15和18中所示的序列組成的引物。擴(kuò)增引物在用于本發(fā)明時(shí)可以包含SEQIDNO：1至36中所示的全序列之一和在5’端和/或3’端處的一個(gè)或若干個(gè)附加核苷酸、優(yōu)選1至10個(gè)附加核苷酸、更優(yōu)選1、2、3、4或5個(gè)附加核苷酸，或者由其組成。擴(kuò)增引物也可以包含SEQIDNO：1至36中所示的序列之一的5’截短形式之一和在5’端和/或3’端處的一個(gè)或若干個(gè)附加核苷酸，或者由其組成。特別是，所述引物可以在3’端處包含與目標(biāo)HLA序列互補(bǔ)的附加核苷酸。所述引物可以在5’端處包含與目標(biāo)HLA序列互補(bǔ)或不互補(bǔ)的附加核苷酸。特別是，所述引物可以在SEQIDNO：1至36中所示的序列之一的5’端處包含1至10、即1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)附加核苷酸，優(yōu)選1、2、3、4或5個(gè)附加核苷酸。5’端處的附加核苷酸可以包括例如限制性位點(diǎn)或識(shí)別標(biāo)簽。與所述擴(kuò)增子一起形成序列的識(shí)別標(biāo)簽可用于標(biāo)記正在測(cè)試的每個(gè)個(gè)體(或樣品)的HLA擴(kuò)增子。識(shí)別標(biāo)簽通常長(zhǎng)度從4至10個(gè)核苷酸，優(yōu)選長(zhǎng)度從4至5個(gè)核苷酸。在具體實(shí)施方式中，包含SEQIDNO：1至36中所示的全序列之一或其5'截短形式的引物，包含(i)在5'端處的一至五個(gè)附加核苷酸和/或在3'端處的一至五個(gè)附加核苷酸，或(ii)在5'端處的一至十個(gè)附加核苷酸。在更具體的實(shí)施方式中，擴(kuò)增引物在用于本發(fā)明時(shí)可以包含SEQIDNO：1至36中所示的全序列之一和在5’端處的一個(gè)或若干個(gè)附加核苷酸、優(yōu)選1至10個(gè)附加核苷酸、更優(yōu)選1、2、3、4或5個(gè)附加核苷酸，或者由其組成。例如，HLA-DQB1基因可以利用一組擴(kuò)增引物擴(kuò)增，其中SEQIDNO：30的引物被SEQIDNO：37的引物、即在5’端處有四個(gè)附加核苷酸的SEQIDNO：30的引物代替，和/或其中SEQIDNO：31的引物被SEQIDNO：38的引物、即在5’端處有六個(gè)附加核苷酸的SEQIDNO：31的引物代替。因此，任選地，在本發(fā)明的方法中，SEQIDNO：30的引物可以被SEQIDNO：37的引物代替，和/或SEQIDNO：31的引物可以被SEQIDNO：38的引物代替。當(dāng)引物長(zhǎng)度增加或減小時(shí)，應(yīng)該考慮參數(shù)例如G/C含量、防止內(nèi)部二級(jí)結(jié)構(gòu)和引物二聚體以及熔融溫度(Tm)。所述反應(yīng)容器可以是任何合適的容器，優(yōu)選可用于熱循環(huán)儀的PCR管(例如0.2mL或0.5mL)。所述擴(kuò)增反應(yīng)混合物的含量可以根據(jù)步驟b)中所使用的擴(kuò)增反應(yīng)類(lèi)型進(jìn)行調(diào)適。在具體實(shí)施方式中，所述混合物包含熱穩(wěn)定的DNA聚合酶和適當(dāng)?shù)木彌_液(通常具有所述DNA聚合酶)、一組擴(kuò)增引物、和dNTP。優(yōu)選所述DNA聚合酶是高保真DNA聚合酶，即出錯(cuò)率小于10-5，更優(yōu)選小于10-6。合適的可用DNA聚合酶的實(shí)例包括但不限于，激烈火球菌(Pyrococcusfuriosus)(Pfu)DNA聚合酶(Stratagene)、PhusionTMDNA聚合酶(NewEnglandBiolabs)、高保真TaqDNA聚合酶(LifeTechnologies)、PfuUltraTM(Stratagene)、或MyFiTMDNA聚合酶(Bioline)。在本發(fā)明方法的步驟b)中，HLA靶序列利用引物依賴(lài)性DNA擴(kuò)增反應(yīng)擴(kuò)增，從而產(chǎn)生擴(kuò)增子。由本發(fā)明人鑒定的擴(kuò)增引物組允許在僅僅五個(gè)不同的反應(yīng)容器中利用統(tǒng)一的熱循環(huán)方案來(lái)擴(kuò)增(i)HLA-A、-B、-C，(ii)-DRB1、-DRB3、-DRB4、-DRB5，(iii)-DPB1，(iv)-DQB1和(v)-DQA1。所述HLA擴(kuò)增子可以利用任何類(lèi)型的擴(kuò)增反應(yīng)獲得。優(yōu)選所述引物依賴(lài)性DNA擴(kuò)增反應(yīng)是聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)并優(yōu)選在熱循環(huán)儀中進(jìn)行。優(yōu)選地，所有的引物依賴(lài)性DNA擴(kuò)增反應(yīng)在同一熱循環(huán)儀中進(jìn)行。然而，每個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)也可以獨(dú)立地進(jìn)行。所述熱循環(huán)方案包括初始變性步驟以完全熔化所述模板，即樣品中包含的基因組DNA。這種初始變性在95℃下持續(xù)至少1分鐘，優(yōu)選高達(dá)3min。在此初始變性后，進(jìn)行25至40個(gè)周期，每個(gè)周期由DNA變性、退火反應(yīng)和伸長(zhǎng)/延伸反應(yīng)組成。DNA變性通常在94℃至96℃進(jìn)行15至30sec。最佳退火溫度取決于擴(kuò)增引物組。本發(fā)明方法中使用的引物被設(shè)計(jì)成在相同的溫度下有效退火到靶序列上。優(yōu)選地，所述退火溫度在55至65℃的范圍內(nèi)，更優(yōu)選在58至62℃的范圍內(nèi)，更加優(yōu)選是60℃。在具體實(shí)施方式中，所述擴(kuò)增引物選自由SEQIDNO：1至36中所示的全序列組成的引物，并且所述退火溫度在55至65℃的范圍內(nèi)，優(yōu)選在58至62℃的范圍內(nèi)，更優(yōu)選是60℃。延伸溫度取決于所使用的DNA聚合酶。通常，該溫度是約72℃。然而，有些DNA聚合酶可能需要調(diào)節(jié)。延伸時(shí)間取決于擴(kuò)增子的長(zhǎng)度和聚合酶的速度，并且可以容易地由技術(shù)人員確定。優(yōu)選地，所述伸長(zhǎng)反應(yīng)在72℃進(jìn)行約1至5分鐘。任選地，擴(kuò)增產(chǎn)物可以在測(cè)序之前提純和/或定量。如有必要，濃度可以調(diào)節(jié)。在本發(fā)明方法的步驟c)中，測(cè)定在步驟b)中獲得的擴(kuò)增子的序列?？梢允褂萌魏我阎臏y(cè)序方法來(lái)測(cè)定擴(kuò)增子的序列，例如桑格(Sanger)法或下一代測(cè)序(NGS)法。用在本文中時(shí)，術(shù)語(yǔ)“NGS法”是指并行化測(cè)序過(guò)程的任何高通量測(cè)序技術(shù)，同時(shí)產(chǎn)生數(shù)千或數(shù)百萬(wàn)序列。優(yōu)選地，所述序列利用NGS法測(cè)定。NGS法的實(shí)例包括但不限于，焦磷酸測(cè)序(RocheDiagnostics)、Illumina(Solexa，MIseq,NextSeq500)測(cè)序或SOLiD測(cè)序(AppliedBiosystems)、Iontorrent(LifeTechnology)。所有這些方法是技術(shù)人員公知的并且根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)可以很容易進(jìn)行。所述序列可以利用合適的軟件分析，優(yōu)選能夠?yàn)V出可以與靶序列共同擴(kuò)增的相關(guān)序列讀取(例如其他不想要的HLA基因)的軟件。所述軟件可用于將序列合并在一起，以與HLA序列數(shù)據(jù)庫(kù)比較和提出每個(gè)基因座的基因型。一旦已經(jīng)獲得所述相關(guān)DNA序列，則通過(guò)利用合適的軟件(例如MPS或Omixon)將所述序列與已知HLA類(lèi)型的DNA序列、優(yōu)選與HLA序列數(shù)據(jù)庫(kù)(例如IMGT/HLA數(shù)據(jù)庫(kù)或dbMHC數(shù)據(jù)庫(kù))比較，在每個(gè)基因座處基于所述可利用的序列進(jìn)行基因型比對(duì)。也可以檢測(cè)無(wú)效等位基因以及新等位基因。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及測(cè)定DNA樣品的HLA基因型的試劑盒，其包含一組擴(kuò)增引物，所述引物包含SEQIDNO：1至14中所示的全序列或其5’截短形式或者由所述全序列或截短形式組成。在優(yōu)選實(shí)施方式中，所述試劑盒包含一組由SEQIDNO：1至14中所示的序列組成的擴(kuò)增引物。在具體實(shí)施方式中，所述試劑盒還包含-一組擴(kuò)增引物，其包含SEQIDNO：19至24中所示的全序列或其5’截短形式或者由所述全序列或截短形式組成；和/或-一組擴(kuò)增引物，其包含SEQIDNO：25至28中所示的全序列或其5’截短形式或者由所述全序列或截短形式組成；和/或-一組擴(kuò)增引物，其包含SEQIDNO：29至32中所示的全序列或其5’截短形式或者由所述全序列或截短形式組成；和/或-一組擴(kuò)增引物，其包含SEQIDNO：33至36中所示的全序列或其5’截短形式或者由所述全序列或截短形式組成；和/或-一組擴(kuò)增引物，其包含SEQIDNO：15至18中所示的全序列或其5’截短形式或者由所述全序列或截短形式組成。在另一種具體實(shí)施方式中，所述試劑盒還包含-一組由SEQIDNO：19至24中所示的序列組成的擴(kuò)增引物；和/或-一組由SEQIDNO：25至28中所示的序列組成的擴(kuò)增引物；和/或-一組由SEQIDNO：29至32中所示的序列組成的擴(kuò)增引物；和/或-一組由SEQIDNO：33至36中所示的序列組成的擴(kuò)增引物；和/或-一組由SEQIDNO：15至18中所示的序列組成的擴(kuò)增引物。任選地，在本發(fā)明的試劑盒中，SEQIDNO：30的引物可以被SEQIDNO：37的引物代替，和/或SEQIDNO：31的引物可以被SEQIDNO：38的引物代替。上文對(duì)本發(fā)明方法描述的所有的引物序列變體和長(zhǎng)度也是在這個(gè)方面中預(yù)期的。任選地，所述試劑盒還可以包含DNA聚合酶和/或dNTP和/或緩沖液和/或測(cè)序試劑和/或提取基因組DNA所需要的試劑和/或提供使用這種試劑盒的指南的散頁(yè)說(shuō)明書(shū)。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的試劑盒在測(cè)定DNA樣品的HLA基因型中的應(yīng)用。本發(fā)明的其他方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的實(shí)施例中描述，所述實(shí)施例應(yīng)該被認(rèn)為是說(shuō)明性而不是限制性的。實(shí)施例人類(lèi)基因組DNA樣品從外周血細(xì)胞根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法、例如使用商業(yè)試劑盒(例如DNA全血試劑盒，Kurabo)并遵循制造商的說(shuō)明書(shū)獲得。選擇一組擴(kuò)增引物以覆蓋基因座A、B、C、DQA1和DQB1基因的從5'UT到3'UT區(qū)域以及DRB1、DRB3、DRB4、DRB5和DPB1基因的從內(nèi)含子1到3’UT區(qū)域的全基因。下面表1中描述了所述引物的序列和在人類(lèi)基因組上的位置。各引物的相應(yīng)位置由表1中指出的所述引物的3’末端和所述外顯子的末端之間的長(zhǎng)度決定。CLx_Fx引物是正向引物和CLx_Rx引物是反向引物。表1：擴(kuò)增引物所有經(jīng)典的I類(lèi)基因，即HLA-A、B和C都利用下列引物混合物在相同的PCR反應(yīng)中擴(kuò)增：CL1F1至CL1F7和CL1R1至CL1R7。就HLAII類(lèi)基因座而論，HLA-DRB1、DRB3、DRB4和DRB5基因座利用下列引物組在相同的PCR反應(yīng)中擴(kuò)增：CL2F1和CL2F2+CL2R1至R3和CL2R12。因而，從以相同的條件進(jìn)行的僅僅兩個(gè)PCR反應(yīng)，就獲得了完全的HLA-A、-B、-C、-DRB1、-DRB3、-DRB4、-DRB5分型。此外，HLA-DQA1、-DQB1和-DPB1基因座利用下列引物組擴(kuò)增：-HLA-DQA1基因座利用CL2F8和CL2F9+CL2R8和CL2R9擴(kuò)增；-HLA-DQB1基因座利用CL2F6和CL2F7+CL2R6和CL2R7擴(kuò)增；和-HLA-DPB1基因座利用CL2F4和CL2F5+CL2R4和CL2R5擴(kuò)增。由此從以相同的條件進(jìn)行的僅僅五個(gè)PCR反應(yīng)，就獲得了完全的HLA-A、-B、-C、-DRB1、-DRB3、-DRB4、-DRB5、-DQA1、-DQB1和-DPB1分型。另外，每個(gè)I類(lèi)基因座單獨(dú)和專(zhuān)門(mén)地用下列引物組擴(kuò)增：-基因座HLA-A：CL1F7和CL1R7,-基因座HLA-B：CL1F8和CL1R8+CL1R9，和-基因座HLA-C：CL1F8和CL1R10。唯一的試驗(yàn)PCR條件如下：在95℃下3min的步驟后，36個(gè)下述的周期-在96℃變性20sec-在60℃退火30sec-在72℃伸長(zhǎng)5min。所述PCR反應(yīng)在20μl的總體積中進(jìn)行，所述總體積含有0.1μL的25μM各引物、2μl的dNTP(2mM)、80ngDNA、2U長(zhǎng)范圍PCR酶(MyFiTMDNA聚合酶，Bioline)和1X相應(yīng)反應(yīng)緩沖液。這些PCR條件通過(guò)PCR產(chǎn)物在凝膠上的對(duì)照來(lái)驗(yàn)證。為了說(shuō)明，圖1上呈現(xiàn)了用上述各引物混合物擴(kuò)增的八種DNA的實(shí)施例。為了證實(shí)PCR產(chǎn)物的特異性，本發(fā)明人利用所謂的下一代測(cè)序方法測(cè)序了這些PCR產(chǎn)物。為了這個(gè)目的，在迄今可利用的不同的NGS技術(shù)之中，他們選擇使用Illumina系統(tǒng)。利用上述引物組分析88個(gè)樣品的HLA-A、-B、-C、-DRB1、-DQB1、-DQA1和-DPB1基因座。使用來(lái)自Illumina的XTDNA試劑盒，遵循使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行文庫(kù)制備。該步驟之后接著是利用XTIndex試劑盒的標(biāo)簽步驟，然后是利用來(lái)自Illumina(MiSeqSystem)的MISeqReagent納米試劑盒V2的最終測(cè)序步驟(300個(gè)周期)。所述序列由CONEXIOGenomics的MPSV1軟件和OMIXON軟件分析。全部88個(gè)樣品獲得的基因組結(jié)果沒(méi)有任何歧義(圖2)。如表2中以10個(gè)實(shí)施例組結(jié)果所說(shuō)明的，本發(fā)明的方法還可以提供高達(dá)8位的高水平分辨率。表2：10個(gè)DNA樣品的HLA-A、-B、-C、-DRB1、-DQB1、-DQA1和–DPB1基因座以高達(dá)8位的分辨率水平的基因分型名稱(chēng)HLA-AHLA-AHLA-BHLA-B1113061961A*26:01:01A*30:01:01B*07:05:01B*13:02:011113062191A*02:01:01:01A*32:01:01B*07:02:01B*08:01:011113062201A*03:01:01:01A*25:01:01B*07:02:01B*18:01:01:021113062211A*02:01:01:01A*32:01:01B*40:01:02B*40:01:021113062221A*01:01:01:01A*02:01:01:01B*08:01:01B*27:05:021113062231A*25:01:01A*68:01:01:02B*18:01:01:02B*44:02:01:011113061161A*02:01:01:01A*24:02:01:01B*39:06:02:01B*51:01:01:011113062251A*02:01:01:01A*24:02:01:01B*35:08:01B*44:02:01:011113062591A*02:01:01:01A*03:01:01:01B*07:02:01B*44:02:01:011113062691A*01:01:01:01A*24:02:01:01B*08:01:01B*15:24名稱(chēng)HLA-CHLA-CHLA-DRB1HLA-DRB11113061961C*06:02:01:01C*15:05:02DRB1*01:01:01DRB1*07:01:01:011113062191C*07:01:01:01C*07:02:01:03DRB1*15:01:01:01DRB1*15:01:01:011113062201C*07:02:01:03C*12:03:01:01DRB1*15:01:01:01DRB1*15:01:01:011113062211C*03:04:01:01C*03:04:01:01DRB1*04:05:01DRB1*08:221113062221C*02:02:02C*07:01:01:01DRB1*03:01:01:01DRB1*13:01:011113062231C*07:04:01C*12:03:01:01DRB1*01:01:01DRB1*15:01:01:011113061161C*05:01:01:02C*07:02:01:03DRB1*08:01:01DRB1*15:01:01:011113062251C*04:01:01:01C*05:01:01:02DRB1*04:01:01DRB1*11:04:011113062591C*05:01:01:02C*07:02:01:03DRB1*01:01:01DRB1*15:01:01:011113062691C*03:03:01C*07:01:01:01DRB1*04:01:01DRB1*11:01:01名稱(chēng)HLA-DQB1HLA-DQB1HLA-DQA11113061961DQB1*02:02:01DQB1*05:01:01:01DQA1*01:01:011113062191DQB1*06:02:01DQB1*06:02:01DQA1*01:02:011113062201DQB1*06:02:01DQB1*06:02:01DQA1*01:02:011113062211DQB1*03:02:01DQB1*04:02:01DQA1*03:01:011113062221DQB1*02:01:01DQB1*06:03:01DQA1*01:03:011113062231DQB1*05:01:01:01DQB1*06:02:01DQA1*01:01:011113061161DQB1*04:02:01DQB1*06:02:01DQA1*01:02:011113062251DQB1*03:01:01:01DQB1*03:01:01:01DQA1*03:03:011113062591DQB1*05:01:01:01DQB1*06:02:01DQA1*01:02:011113062691DQB1*03:01:01:01DQB1*03:01:01:01DQA1*03:03:01名稱(chēng)HLA-DQA1HLA-DPB1HLA-DPB11113061961DQA1*02:01DBB1*11:01:01DPB1*17:011113062191DQA1*04:01:02DBB1*03:01:01DPB1*04:01:01:011113062201DQA1*04:01:02DPB1*02:01:02DPB1*04:01:01:011113062211DQA1*04:01:02DPB1*01:01:01DPB1*02:01:021113062221DQA1*05:01:01DPB1*04:01:01:01DPB1*04:01:01:011113062231DQA1*04:01:02DPB1*04:01:01:01DPB1*04:01:01:011113061161DQA1*04:01:02DPB1*03:01:01DPB1*04:01:011113062251DQA1*05:05:01DPB1*02:01:02DPB1*02:01:021113062591DQA1*04:01:02DPB1*04:01:01:01DPB1*04:01:01:011113062691DQA1*05:05:01DPB1*04:01:01:01DPB1*14:01所有這些結(jié)果與以前通過(guò)SBT(來(lái)自Celera的8K6003，8K6103，8K6204，8K6303，8K6501試劑)和/或SSP技術(shù)方法得到的結(jié)果一致并且可用于除了DQA1之外的所有基因座。在另一個(gè)試驗(yàn)中，幾個(gè)樣品的HLA-DQB1基因座利用下列引物組擴(kuò)增：正向引物：AGACCCAGSTACATCAGATCCATCAGGTC(SEQIDNO：37)，對(duì)應(yīng)于在SEQIDNO：30的5’端有四個(gè)附加核苷酸的引物CL2F7，和反向引物：ATTATGCGTGACAGCCACTGTAGGACT(SEQIDNO：38)，對(duì)應(yīng)于在SEQIDNO：31的5’端有六個(gè)附加核苷酸的引物CL2R6。所述PCR反應(yīng)在20μl的總體積中進(jìn)行，所述總體積含有0.1μL的25μM各引物、2μl的dNTP(2mM)、80ngDNA、2U長(zhǎng)范圍PCR酶(MyFiTMDNA聚合酶，Bioline)和1X相應(yīng)反應(yīng)緩沖液。所述PCR產(chǎn)物在電泳凝膠上對(duì)照(圖3)。這些樣品的序列如上所述獲得和分析，并以高達(dá)8位的分辨率水平提供HLA-DQB1基因座的基因分型。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3