專利名稱：抗cd的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗CD20單克隆抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)基因，由所述基因編碼的多肽，含有所述基因的載體及所述的基因和多肽在制備用于B淋巴細(xì)胞瘤的治療和診斷的藥物中的應(yīng)用。具體地，本發(fā)明的重鏈和輕鏈可變區(qū)基因來(lái)自抗CD20單克隆抗體HI47。
B淋巴細(xì)胞瘤是一種常見的血液系統(tǒng)疾病，其發(fā)病率約為2／10000，按此估計(jì)，我國(guó)每年約有兩萬(wàn)多病例。目前對(duì)B淋巴細(xì)胞瘤的治療方法主要有化療，放療和生物輔助治療三種療法，生物治療作為輔助療法主要用于化療替代、聯(lián)合應(yīng)用治療、微量殘留腫瘤細(xì)胞的殺傷和早期潛在轉(zhuǎn)移灶的治療，提高病人的愈后質(zhì)量。CD20是B淋巴細(xì)胞表面膜蛋白，CD20與Ca2+離于在B淋巴細(xì)胞跨膜運(yùn)輸密切相關(guān)，CD20對(duì)B淋巴細(xì)胞的分化和增殖起調(diào)節(jié)作用(BubienJK，Zhou LJ，Bell PD，et a1J．Cell Biol．1993，121(5)1121-1132；Golay JT，Clark EA，Beverley PC，et alJ Immuno1．1985；1353795)。CD20作為治療B淋巴細(xì)胞瘤靶點(diǎn)有如下優(yōu)點(diǎn)首先，CD20只在前-B淋巴細(xì)胞，未成熟B淋巴細(xì)胞，成熟B淋巴細(xì)胞，激活B淋巴細(xì)胞表達(dá)，而在其他組織以及多能B淋巴干細(xì)胞，漿細(xì)胞不表達(dá)(Stashenko PNadler LM，Hardv R，et al．J．Immun，1980；1251678-1685；Nadler LM，Karsmeyer SJ，Anderson KC，et alClin．Invest．1984；74332-340；Stashenko PNadler LM，Hardy R，et al．Proc．Natl．Acad．Sci．USA 1981；783848-3852；Rosenthal P，Rimm IJ，Umiel T，et al．J．Immunol．1983；131232-237)。其次，CD20和抗CD20抗體結(jié)合后不發(fā)生內(nèi)吞作用，因而細(xì)胞表面CD20數(shù)量并不因?yàn)榭贵w的結(jié)合而減少(Liu AY，Robinson RJr，Murvay ED，et al．J．Immunol．1987；1393521)。第三，CD20比較暴露，不為其它表面分子所掩蓋，因而容易接近(Einleld DA，Brown JP，Vakebtube MA，et al．EMBOJ．1988；7711)。第四，在人體血清中無(wú)游離的CD20存在(EinleldDA，Brown JP，Valentine MA，et al．EMBOJ．1988；7711)。
抗CD20單克隆抗體的研究已有十多年的歷史，早在80年代抗CD20抗體IF5、B1已用于臨床實(shí)驗(yàn)，但收效甚微，直至1997年才取得突破性的進(jìn)展。是年美國(guó)FDA批準(zhǔn)抗CD20嵌合抗體Rituxan應(yīng)用于B淋巴細(xì)胞瘤的臨床治療，療效顯著，毒副作用小(Magic bulletsat lastFinally-approval of a monoclonal antibody for the treatment ofcancer．Cancer Biotherapy & Radio pharmaceuticals 1997；14(4)223-225)。不同的抗CD20抗體和CD20結(jié)合后引起的效應(yīng)不同，有的可使B淋巴細(xì)胞從G0期進(jìn)入G1期，引起B(yǎng)淋巴細(xì)胞的活化；有的抑制B淋巴細(xì)胞的活化?？笴D20抗體主要是通過(guò)抗體依賴性細(xì)胞毒作用(ADDC)、補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒作用(CDDC)以及抗體和B淋巴細(xì)胞的結(jié)合等三種機(jī)制殺傷B淋巴細(xì)胞瘤。
HI47(IgG3)是中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所于1990研制成功的抗CD20鼠源性單克隆抗體，第四屆國(guó)際人類白細(xì)胞分化抗原會(huì)議將HI47命名為CD20+X，HI47的組織反應(yīng)性和IF5、B1略有不同(楊希峰、沈德誠(chéng)、金宇光等，HI47一種抗成熟B細(xì)胞單克隆抗體制備、鑒定及其生物學(xué)特性研究；上海免疫學(xué)雜志，199010(2)65-68)。HI47能抑制SAC誘導(dǎo)的B淋巴細(xì)胞DNA、RNA的合成，而對(duì)Anti-IgM和PMA引起B(yǎng)細(xì)胞活化及細(xì)胞系的增殖無(wú)明顯作用，HI47使SAC激活的B細(xì)胞HI抗原表達(dá)明顯減少，但對(duì)PMA激活細(xì)胞HI抗原表達(dá)沒(méi)有明顯影響(楊希峰、沈德誠(chéng)、陳障等，HI47(CD20)單克隆抗體對(duì)B細(xì)胞活化增殖的影響；中國(guó)免疫學(xué)雜志，19917(1)21-24)。這與Tedder等報(bào)道的相反(Tedder TF et al．Eur J Immunol．1986；16881)，這些結(jié)果預(yù)示HI47的作用位點(diǎn)與B1的作用位點(diǎn)不同。HI47的抑制活性是抗體的特異性作用。
人體對(duì)鼠源性抗體的免疫反應(yīng)(HAMA反應(yīng))是鼠源性抗體應(yīng)用于臨床治療的主要障礙，且鼠源性抗體不能介導(dǎo)人的ADDC、CDDC反應(yīng)?？贵w的人源化和嵌合抗體的構(gòu)建可大大降低鼠源性抗體的免疫原性。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種抗CD20單克隆抗體輕鏈可變區(qū)基因和重鏈可變區(qū)基因及其表達(dá)產(chǎn)物，兩者重組后表達(dá)產(chǎn)生的嵌合抗CD20抗體及其Fab片段，能降低鼠源性抗CD20抗體的免疫原性。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于抗CD20嵌合抗體及其Fab片段在制備用于B淋巴細(xì)胞瘤的治療和診斷的藥物中的應(yīng)用。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種抗CD20單克隆抗體輕鏈可變區(qū)基因和重鏈可變區(qū)基因，其中，所述的重鏈可變區(qū)基因全長(zhǎng)為366bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO3所示。所述的輕鏈可變區(qū)基因全長(zhǎng)為318bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO2所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ IDNO4所示。
我們采用噬菌體抗體展示技術(shù)，成功地克隆到抗CD20單克隆抗體HI47的輕重鏈可變區(qū)基因，并將得到的抗CD20單克隆抗體輕重鏈可變區(qū)基因克隆到Fab表達(dá)載體中，構(gòu)建嵌合抗CD20抗體的Fab片段，降低了鼠源性抗CD20抗體的免疫原性。并能在大腸桿菌中進(jìn)行高效分泌性表達(dá)，分泌性表達(dá)抗體能提高抗CD20基因工程抗體的產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本，利于工業(yè)化生產(chǎn)。Fab片段和全抗體相比具有以下優(yōu)點(diǎn)首先，F(xiàn)ab較全抗體分子量小，且穿透力比較強(qiáng)，其次，F(xiàn)ab可在大腸桿菌中表達(dá)，利于工業(yè)化生產(chǎn)，生產(chǎn)成本低。
以下參照附圖及實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明。其中

圖1示出抗CD20嵌合抗體Fab片段的構(gòu)建。
圖2示出抗CD20嵌合抗體Fab片段分離純化產(chǎn)物的SDS-PAGE分析結(jié)果，其中泳道1為非還原條件下的純化前的產(chǎn)物，泳道2為非還原條件下的純化后的產(chǎn)物，泳道3為還原條件下的純化前的產(chǎn)物，泳道4為還原條件下的純化后的產(chǎn)物。
圖3示出抗CD20嵌合抗體Fab片段與HI47單克隆抗體競(jìng)爭(zhēng)性免疫熒光抑制實(shí)驗(yàn)FACS測(cè)定結(jié)果。
實(shí)施例1抗CD20單克隆抗體HI47輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)基因的克隆應(yīng)用RT-PCR方法從抗CD20抗體雜交瘤細(xì)胞株HI47(楊希峰等，上海免疫學(xué)雜志，第10卷第2期，1990年)中克隆抗CD20抗體輕重鏈可變區(qū)基因。具體操作如下抗CD20抗體輕重鏈可變區(qū)基因克隆RT-PCR擴(kuò)增抗CD20抗體輕重鏈可變區(qū)基因1)總RNA提取采取異硫氰酸胍一步法(Chomczynski P，SacchiN，Anal．Biochem．1987，162156)。簡(jiǎn)言之，將107個(gè)抗CD20單克隆抗體雜交瘤HI47細(xì)胞，依次加入溶液D(儲(chǔ)備液(50ml)異硫氰酸胍23．8g，0．75mol／L檸檬酸鈉(PH 7．0)2．2ml，10％十二烷基氨酸鈉3．3ml，加雙蒸水至溶液體積為50ml；溶液D10ml儲(chǔ)備液中加入72μl 2-巰基乙醇)，3M NaAc，苯酚，氯仿異戊醇混勻，冰浴10分鐘后離心，上清加入等體積異丙醇，-20℃放置1小時(shí)，離心，取沉淀溶于溶液D中，再加入等體積的異丙醇，-20℃放置1小時(shí)，離心，棄上清，用70％乙醇洗沉淀，用DEPC處理過(guò)的ddH2O溶解沉淀。
2)逆轉(zhuǎn)錄取2μg總RNA置于0．5ml Eppendorf管中，依次加入600ng隨機(jī)引物、4×dNTP各10nmol、RNasin 20μl，于65℃水浴5-10分鐘，然后加入200U的M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，37℃水浴放置1小時(shí)，轉(zhuǎn)移至70℃水浴放置10分鐘。
3)PCR擴(kuò)增抗CD20單克隆抗體輕重鏈可變區(qū)基因輕鏈可變區(qū)基因PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(100μl)逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物10μl，10mM dNTP 2μl，10×PCR緩沖液10μl，Taq DNA聚合酶 2U，購(gòu)于Pharmacia公司的重組噬菌體抗體系統(tǒng)的輕鏈擴(kuò)增引物1、2各2μl，加水至終體積100μl。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5分鐘后，再進(jìn)行30循環(huán)的PCR擴(kuò)增(94℃變性1分鐘，55℃退火2分鐘，72℃延伸2分鐘)，最后于72℃延伸10分鐘。
重鏈可變區(qū)基因PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(100μl)逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物10μl，10mM dNTP 2μl，10×PCR緩沖液10μl，Taq DNA聚合酶2U，購(gòu)于Pharmacia公司的重組噬菌體抗體系統(tǒng)的重鏈擴(kuò)增引物1、2各2μl，加水至終體積100μl。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5分鐘后，再進(jìn)行30循環(huán)的PCR擴(kuò)增(94℃變性1分鐘，55℃退火2分鐘，72℃延伸2分鐘)，最后于72℃延伸10分鐘。
用編碼接頭(GGGGS)3的寡核苷酸序列連接所獲得的輕重鏈可變區(qū)基因，連接的輕重鏈基因經(jīng)酶切后組裝到單鏈抗體表達(dá)載體pCANTAB 5E相應(yīng)的酶切位點(diǎn)中。采用電穿孔法將組裝好的單鏈抗體(ScFv)表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株TG1(本發(fā)明人所在實(shí)驗(yàn)室保存)，建立一個(gè)重組噬菌體抗體庫(kù)。用ELISA法對(duì)抗體庫(kù)篩選，獲得幾株分泌抗CD20單鏈抗體的克隆株。經(jīng)核酸測(cè)序，免疫球蛋白(IgG)一級(jí)結(jié)構(gòu)中特征氨基酸同源分析，證明我們克隆的基因是目的基因。實(shí)施例2抗CD20嵌合抗體Fab片段的構(gòu)建以生物活性最好的抗CD20單鏈抗體克隆為模板來(lái)進(jìn)行Fab片段的組裝，其組裝過(guò)程簡(jiǎn)要說(shuō)明如下(見圖1)用PCR法從抗CD20單鏈抗體(ScFv)表達(dá)載體擴(kuò)增重鏈可變區(qū)(VH)、輕鏈可變區(qū)(VL)基因，用瓊脂糖電泳分離純化VH、VL基因。分別以MluI+ApaI、Mlul+StyI消化后分別重組到pYZH、pYZL載體(pYZH載體含有人免疫球蛋白γ1鏈CH1，為本發(fā)明人所在實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，pYZL載體含有人免疫球蛋白K鏈CL，為本發(fā)明人所在實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建)相應(yīng)的內(nèi)切酶位點(diǎn)中，用所得的重組子pYZHcd20、pYZLcd20轉(zhuǎn)化大腸桿菌16C9菌株(本發(fā)明人所在實(shí)驗(yàn)室保存)，擴(kuò)增培養(yǎng)后提取pYZHcd20、pYZLcd20，分別以MluI+NheI、SpeI+SphI消化pYZLcd20、pYZHcd20，瓊脂糖電泳分離純化含VL、VH基因的相應(yīng)DNA片段，將這兩個(gè)片段和經(jīng)MluI+SphI消化Fab表達(dá)載體pYZF(本發(fā)明人所在實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建)所得的載體片段連接成抗CD20嵌合抗體Fab片段表達(dá)載體pYZFcd20。實(shí)施例3抗CD20嵌合抗體Fab片段在大腸桿菌中可溶性表達(dá)及分析將實(shí)施例2獲得的載體pYZFcd20轉(zhuǎn)化大腸桿菌16C9菌株，挑取單菌落接種5ml含氨芐青霉素50μg／ml的2×YT培養(yǎng)基(蛋白胨16g／L，酵母膏10g／L，氯化鈉5g／L，pH7．4)，37℃，200rpm，振蕩培養(yǎng)6小時(shí)。6000rpm離心10分鐘收集菌體，將菌體重新懸浮于20ml含氨芐青霉素50μg／ml的AP5培養(yǎng)基(每升培養(yǎng)基含酪素酸水解物11g，酵母膏0．6g，MgSO40．19g，葡萄糖1．5g，NH4Cl 1．07g，KCl3．73g，NaCl 1．2g，1M三乙醇胺pH 7．4 120ml)，30℃，250rpm，振蕩培養(yǎng)20小時(shí)。6000rpm，4℃，離心10分鐘收集菌體，將菌體于-20℃凍存1小時(shí)，化凍后加1ml細(xì)菌周質(zhì)腔蛋白提取液(三羥甲基氨基甲烷25mM，乙二胺四乙酸1mM，苯甲基磺酰氟0．1mM，蔗糖20％(W／V)，氯化鈉200mM，pH7．5)，混勻，于4℃輕搖1小時(shí)，爾后4℃，12000rpm，離心20分鐘，取上清，用ProteinG柱(GIBCO BRL)分離純化Fab片段。SDS-PAGE分析
按分子克隆實(shí)驗(yàn)操作指南(J．Sambrook，E．F．Fritsch，T．Maniatis等編著，金冬雁等譯)881頁(yè)上的方法配制12％的SDS聚丙烯酰胺凝膠。將上述經(jīng)ProteinG柱分離純化的Fab片段樣品與樣品緩沖液混合，100℃水浴3分鐘。按次序上樣，安排已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)物。電泳開始時(shí)電壓為8v／cm，染料進(jìn)入分離膠后，將電壓增加到15v／cm繼續(xù)電泳直到染料抵達(dá)分離膠底部，斷開電源。取下凝膠，用至少5倍體積的染色液(將25g考馬斯亮藍(lán)溶解于90ml甲醇∶水(1∶1)和10ml冰醋酸溶液中制成的溶液)浸泡凝膠，置脫色搖床上室溫緩慢旋轉(zhuǎn)3-4小時(shí)。換掉染色液，用脫色液(7％乙酸、5％甲醇溶液)浸泡凝膠，緩慢搖動(dòng)4-8小時(shí)，其間換3-4次脫色液，直到滿意為止，將脫色后的凝膠照相。Fab分離純化產(chǎn)物SDS-PAGE分析見圖2，從圖2可見在非還原條件下(2道)Fab的分子量約為48kDa，與預(yù)期的分子量相同，而在還原條件下(4道)，輕重鏈之間的二硫鍵斷裂，輕重鏈分開，因此在48kDa處的電泳帶消失。表明處于48kDa處為Fab產(chǎn)物。實(shí)施例4競(jìng)爭(zhēng)性免疫熒光抑制實(shí)驗(yàn)將1×106daudi細(xì)胞(CD20+，CD3-，本發(fā)明人所在實(shí)驗(yàn)室保存)懸于30μl濃度為60μg／ml的HI47單克隆抗體溶液，在4℃下孵育1小時(shí)。2000rpm，4℃離心10分鐘，棄上清，PBS洗細(xì)胞3次，將細(xì)胞重懸于30μl濃度為40μg／ml的實(shí)施例3所述Protein G純化的Fab的溶液，4℃放置1小時(shí)，2000rpm，4℃離心10分鐘，棄上清，PBS洗細(xì)胞3次，將細(xì)胞重懸于30μl按校價(jià)稀釋好的羊抗鼠IgG-FITC的溶液，4℃放置1小時(shí)，2000rpm，4℃離心10分鐘，棄上清，PBS洗細(xì)胞3次，F(xiàn)ACS測(cè)定。同時(shí)以抗CD3鼠源性抗體為陰性對(duì)照，以抗CD20的HI47鼠源性單克隆抗體為陽(yáng)性對(duì)照，同樣進(jìn)行FACS測(cè)定。
抗CD20嵌合抗體Fab片段與HI47單克隆抗體競(jìng)爭(zhēng)性抑制實(shí)驗(yàn)FACS測(cè)定結(jié)果見圖3，當(dāng)加入Fab時(shí)，陽(yáng)性峰向左偏移，表明抗CD20嵌合抗體Fab片段能競(jìng)爭(zhēng)性抑制HI47與CD20的結(jié)合，即Fab與CD20特異結(jié)合。
序列表SEQ ID NO1的信息序列長(zhǎng)度366bp序列類型核酸分子類型cDNA序列描述SEQ ID NO11 CAGGTGAAGC TGCAGCAGTC AGGGGCTGAG CTGGTGAAGC CTGGGGCCTC AGTGAAGATG61 TCCTGCAAGG CTTCTGGCTA CACATTTATC AGTTACAATA TGCACTGGGT AAAGCAGACA121CCTGGACAGG GCCTGGAATG GATTGGAGGT ATTTATCCAG GAAATGGTGA TACTTCCTAC181AATCAGAAAT TCAAAGGCAA GGCCACATTG ACTGCAGACA AATCCTCCAG CGCAGCCTAC241ATGCAGCTCA GCAGCCTGAC ATCTGAGGAC TCTGCGGTCT ATTACTGTGC AAGATGGAAC301TATGGTAACT TCGGGGGGGG TACTATGGAC TACTGGGGCC AAGGGATCAC GGTCACCGTC361TCCTCASEQ ID NO2的信息序列長(zhǎng)度318bp序列類型核酸分子類型cDNA序列描述SEQ ID NO21 GACATCGAGC TCACTCAGTC TCCAGCAATC CTGTCTGCAT CTCCAGGGGA GAAGGTCACA61 ATGACTTGCA GGGCCAGCTC AAGTGTAAGT TACATGCTCT GGTACCAGCA GAAGCCAGGA121TCCTCCCCCA AACCCTGGAT TTATGCCACA TCCCACCTGG CTTCTGGAGT CCCTACTCGC181TTCAGTGGCA GTGGGTCTGG GACCTCTTAC TCTCTCACAA TCAGCAGAGT GGAGGCTGAA241GATGCTGCCA CTTATTACTG CCAGCAGTGG ACTAGTAACC CACCCACGTT CGGTGCTGGG301ACCAAGCTGG AGCTGAAASEQ ID NO3的信息序列長(zhǎng)度122個(gè)氨基酸殘基序列類型氨基酸分子類型肽序列描述SEQ ID NO31 Q V K L Q Q S G A E L V K P G A S V K M S C K A S G Y T F I31 S Y N M H W V K Q T P G Q G L E W I G G I Y P G N G D T S Y61 N Q K F K G K A T L T A D K S S S A A Y M Q L S S L T S E D91 S A V Y Y C A R W N Y G N F G G G T M D Y W G Q G I T V T V121 S SSEQ ID NO4的信息序列長(zhǎng)度108個(gè)氨基酸殘基序列類型氨基酸分子類型肽序列描述SEQ ID NO41 D I E L T Q S P A I L S A S P G E K V T M T C R A S S S V S31Y M L W Y Q Q K P G S S P K P W I Y A T S H L A S G V P T R61F S G S G S G T S Y S L T I S R V E A E D A A T Y Y C Q Q W91T S N P P T F G A G T K L E L K R A
權(quán)利要求
1.一種抗CD20抗體的重鏈可變區(qū)基因，其具有SEQ ID NO1的序列。
2.由權(quán)利要求1的基因編碼的多肽，其具有SEQ ID NO3的序列。
3.一種抗CD20抗體的輕鏈可變區(qū)基因，其具有SEQ ID NO2的序列。
4.由權(quán)利要求3的基因編碼的多肽，其具有SEQ ID NO4的序列。
5.一種表達(dá)載體，其含有權(quán)利要求1的抗CD20抗體的重鏈可變區(qū)基因及權(quán)利要求3的抗CD20抗體的輕鏈可變區(qū)基因。
6.如權(quán)利要求5的表達(dá)載體，其為pYZFcd20。
7.如權(quán)利要求5或6的表達(dá)載體所表達(dá)的多肽。
8.權(quán)利要求7所述的多肽在制備用于B淋巴細(xì)胞瘤的治療和診斷的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了抗CD
文檔編號(hào)A61K39/395GK1292418SQ99121728
公開日2001年4月25日 申請(qǐng)日期1999年10月10日 優(yōu)先權(quán)日1999年10月10日
發(fā)明者楊純正, 朱禎平, 熊冬生, 許元富, 彭暉, 賴增祖, 邵曉楓, 范冬梅, 徐晨 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)血液學(xué)研究所血液病醫(yī)院