一種檢測人血清雜合輕鏈抗體的方法及試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種檢測人血清雜合輕鏈抗體的試劑盒，屬于臨床檢驗學領域。
【背景技術】
[0002]在過去的十多年里，眾多的實驗證實，IgG4分子可以能夠在體內(nèi)外通過“半分子交換”(Fab arm exchange)的方式形成雙特異性抗體，這種過程包括不同的IgG4分子的重-輕鏈對之間的交換、絞鏈區(qū)二硫鍵的重新生成，能夠產(chǎn)生一種同時具有兩種不同的抗原結合域的免疫球蛋白?？贵w的絞鏈區(qū)第228位絲氨酸和CH3區(qū)第409位精氨酸以及血清還原型谷胱甘肽(GSH)對于這種抗體分子間的交換是必不可少的。人體內(nèi)免疫球蛋白輕鏈有兩種，分別是kappa和lambda，編碼兩條輕鏈的基因在染色體上的位置分別位于2pl2_pll和22qll，經(jīng)典免疫學理論認為:一個天然的Ig分子兩條輕鏈總是相同的，不存在同時含有kappa和lambda輕鏈的雜合抗體分子，因此可以根據(jù)輕鏈的型別分為kappa或lambda鏈的抗體分子。但IgG4抗體的獨特的半分子交換的特性表明，含kappa輕鏈的IgG4分子可以與含lambda輕鏈的IgG4分子通過“半分子交換”作用產(chǎn)生既含有kappa又含有l(wèi)ambda輕鏈的雜合抗體，體內(nèi)可以存在同時具有kappa和lambda型的雜合抗體分子。
[0003]自身免疫性胰腺炎(Autoimmune pancreatitis, AIP)是一種慢性胰腺炎癥性疾病，以阻塞性黃疸為特征性臨床表現(xiàn)，胰腺組織活檢伴有大量淋巴漿細胞浸潤和組織纖維化，也稱為淋巴漿細胞性硬化性胰腺炎。自身免疫性胰腺炎的典型血清學特征是IgG4水平明顯增高，因此，又被稱為IgG4相關性胰腺炎。血清IgG4水平是自身免疫性胰腺炎的診斷標準之一。在臨床上，AIP病人和胰腺癌病人有許多共同的臨床表現(xiàn)，如無痛性黃疸、體重減輕、新發(fā)糖尿病、胰腺腫物的形成，這給兩者的鑒別診斷帶來很多困難，明確診斷AIP可以避免不必要的胰腺切除手術，同時對疾病治療和預后具有重要意義。目前尚未有研宄報道自身免疫性胰腺炎患者體內(nèi)是否存在雜合輕鏈抗體IgG4。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種檢測人血清雜合輕鏈抗體的試劑盒。
[0005]本發(fā)明要解決的另一個技術問題是提供上述試劑盒的應用。
[0006]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術方案:
[0007]一種檢測人血清雜合輕鏈抗體的試劑盒，由以下試劑組成:
[0008](I)抗人lambda輕鏈抗體包被微孔板；
[0009](2)免疫標記的抗人kappa輕鏈抗體；
[0010](3)洗滌液(PBST):含 0.05% 吐溫-20 的 PBS 溶液；
[0011](4)稀釋液:含體積百分比為20%的小牛血清的PBST ；
[0012](5)底物液:3'，3'，5'，5'，-四甲基聯(lián)苯胺；
[0013](6)標準參考血清:人為規(guī)定20例健康人等體積混合血清雜合抗體濃度為IAU/ml ；
[0014](7)陰性對照液:體積百分比為20%的小牛血清的PBST ；
[0015](8)終止液:0.5M硫酸。
[0016]所述(I)抗人lambda輕鏈抗體包被微孔板的包被條件是:每個微孔加入100 μ L濃度為1-10 μ g/ml的抗人lambda輕鏈抗體溶液，4°C包被過夜。
[0017]所述(2)免疫標記為酶標記、熒光素標記或生物素標記。
[0018]所述酶標記為辣根過氧化物酶標記或堿性磷酸酶標記。
[0019]所述(2)免疫標記的抗人kappa輕鏈抗體使用濃度為100 μ L/孔。
[0020]所述(6)標準參考血清為20例健康人等體積混合血清，定義此標準參考血清雜合抗體濃度為lAU/ml。
[0021]所述的試劑盒在檢測雜合輕鏈抗體中的應用。例如用于檢測人工合成的kappa和lambda雜合輕鏈抗體的含量，這類人工合成的kappa/lambda雜合輕鏈抗體可能作為診斷試劑或治療藥物用于未來的醫(yī)學研宄和/或藥物開發(fā)。
[0022]所述的試劑盒在檢測kappa/lambda雜合輕鏈抗體中的應用，尤指檢測天然雜合輕鏈抗體中的應用。本試劑盒可以定量檢測那些在患者血清中含有此類雜合輕鏈抗體的疾病，尤其是當該雜合抗體被證明為某疾病的檢測指標物質(zhì)時，可極大提高檢測效率。
[0023]所述的試劑盒在檢測自身免疫性胰腺炎的應用，尤指所述的試劑盒用于制備檢測自身免疫性胰腺炎的試劑的應用。由于IgG4分子獨特的半分子交換的特性，我們推測AIP患者體內(nèi)同時帶有kappa輕鏈和lambda輕鏈的雜合輕鏈抗體分子水平明顯增高，而這種升高的雜合輕鏈抗體可以作為AIP與胰腺癌鑒別診斷的全新血清學標志物。經(jīng)過大量研宄，本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)，在自身免疫性胰腺炎患者的血清中雜合輕鏈抗體水平明顯增高。通過對自身免疫性胰腺炎患者血清，胰腺癌血清，疾病對照血清和健康對照血清進行檢測發(fā)現(xiàn)，雜合輕鏈抗體在自身免疫性胰腺炎患者中的水平明顯高于胰腺癌組和對照組(疾病對照和健康對照)，并具有統(tǒng)計學意義。因此，本發(fā)明人所發(fā)現(xiàn)雜合輕鏈抗體可以看作是存在于自身免疫性胰腺炎患者血清中的一種新型指標，且這類新型指標能夠作為診斷自身免疫性胰腺炎和鑒別診斷胰腺癌的新的血清學標志。
[0024]所述試劑盒用于鑒別診斷自身免疫性胰腺炎與胰腺癌的應用，尤指所述試劑盒用于制備鑒別診斷自身免疫性胰腺炎與胰腺癌的試劑的應用。
[0025]本發(fā)明試劑盒的簡要檢測程序為:
[0026](I)采用抗人lambda包被微孔板作為固相抗原；
[0027](2)加入稀釋血清樣本進行溫育；
[0028](3)加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗人kappa輕鏈抗體；
[0029]⑷加顯色底物；
[0030](5)終止讀數(shù)。
[0031]本發(fā)明的優(yōu)點:本發(fā)明提供了一種雙抗體夾心法的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，使用方便，操作簡單，特異性強，安全，可用于定量檢測雜合輕鏈抗體及鑒別診斷自身免疫性胰腺炎和胰腺癌。
[0032]下面結合附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明進行說明，以使公眾更好地理解本
【發(fā)明內(nèi)容】
及應用，并不以任何方式造成對本發(fā)明的限定。凡依照本發(fā)明公開內(nèi)容所做的任何等同替換，均屬于本發(fā)明保護范圍。
【附圖說明】
[0033]圖1為【背景技術】所述的人體內(nèi)同時具有kappa和lambda型的雜合抗體分子。
[0034]圖2為雜合輕鏈抗體在自身免疫性胰腺炎患者、胰腺癌患者、疾病對照患者和正常然血清中的分布圖，圖中AIP表示自身免疫性胰腺炎患者血清，Pca表示胰腺癌患者血清，DC表示疾病對照患者血清，HC表示健康人血清。
[0035]圖3為實施例2中各濃度下的標準血清和對應的吸光度得到的擬合曲線。
【具體實施方式】
[0036]以下為實施例中涉及的主要材料和試劑:
[0037]抗人lambda輕鏈抗體，Sigma，美國
[0038]辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗人kappa抗體，Abeam,沙特
[0039]十二水磷酸氫二鈉(Na2HPO4.12H20)，北京化學試劑公司，中國
[0040]二水磷酸二氫鈉(NaH2PO4.2H20)，北京化學試劑公司，中國
[0041]磷酸二氫鉀(KH2PO4)，北京化學試劑公司，中國
[0042]氯化鈉(NaCl)，北京化學試劑公司，中國
[0043]氯化鉀(KCl)，北京化學試劑公司，中國
[0044]碳酸氫鈉(NaHCO3)，北京化學試劑公司，中國
[0045]碳酸鈉(Na2CO3)，北京化學試劑公司，中國
[0046]小牛血清，GIBC0，新西蘭
[0047]96孔酶標板，Nunc,丹麥
[0048]吐溫_20 (Tween-20)，SIGMA,美國
[0049]3' ,3' ,5' ,5'，-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，SIGMA，美國
[0050]抗體測定溶液配制
[0051](I)碳酸鹽包被緩沖液！Na2CO30.795g，NaHCO3L 465g，去離子水400mL，充分溶解后用IM HCl調(diào)節(jié)pH值至9.6，加入去離子水定容至500mL，保存于室溫。
[0052](2)磷酸鹽緩沖(PBS)溶液:NaCl 8g，Na2HPO4.12H20 3.63g，KCl 0.2g，KH2PO40.24g，去離子水800mL，充分溶解后用IM HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.4，加去離子水定容至1L，高壓滅菌后保存。
[0053](3)洗滌緩沖液