專(zhuān)利名稱(chēng)：：診斷、預(yù)后或監(jiān)測(cè)eb病毒(ebv)相關(guān)癌癥的方法和試劑盒的制作方法診斷、預(yù)后或監(jiān)測(cè)EB病毒(EBV)相關(guān)癌癥的方法和試劑盒發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明通常涉及通過(guò)一企測(cè)和/或定量腫瘤相關(guān)DNA序列it斷、預(yù)后或監(jiān)測(cè)個(gè)體癌癥的方法和試劑盒。具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明涉及通過(guò)4企測(cè)和/或定量尿中EBVDNA序列診斷、預(yù)后或監(jiān)測(cè)EB病毒(Epstein-Barrvirus,EBV)相關(guān)癌癥的方法和試劑盒。
背景技術(shù)：
：EB病毒(EBV)是普遍存在的人類(lèi)皰滲病毒，首先發(fā)現(xiàn)其與非洲型伯基特氏淋巴瘤(Burkitt，slymphoma,BL)相關(guān)。隨后，還發(fā)現(xiàn)EBV感染與鼻咽癌(nasopharyngealcarcinoma,NPC)密切相關(guān)。已經(jīng)證明，可以在采集于中國(guó)南方的幾乎所有NPC組織中^r測(cè)到EBV基因組(Chenetal.,Intervirology.36(2):91-8(1993);Dickensetal"JClinPathol.45(5):396-7(1992))。與這些結(jié)果一致，我們已經(jīng)證明，可以在96%NPC患者的血漿中檢測(cè)到EBVDNA,但僅在7%的健康個(gè)體中檢測(cè)到非常低濃度的EBVDNA(Loetal.,CancerRes.59(6):1188-91(1999))。而且，血漿EBVDNA的水平，無(wú)i侖是治療前測(cè)量的(Loetal.,CancerRes.60(24):6878-81(2000)),或治療后測(cè)量的(Chanetal"JNatlCancerInst.94(21):1614-9(2002》,都對(duì)預(yù)測(cè)總生存率和無(wú)病生存率是有^介值的。同樣，循環(huán)的EBVDNA也可用于^r測(cè)和監(jiān)測(cè)其他EBV相關(guān)惡性肺瘤，如淋巴瘤(Leietal.,BrJHaematol.lll(l):239-46(2000))和胃癌(Loetal.,ClinCancerRes.7(7):1856-9(2001))。盡管這種血漿檢驗(yàn)(plasmatest)可用于檢測(cè)NPC,且是相對(duì)無(wú)風(fēng)險(xiǎn)的操作，但它仍然導(dǎo)致患者的疼痛和焦慮。然而，本領(lǐng)域并未公開(kāi)尿樣中短EBV相關(guān)核酸序列的檢測(cè)和定量以及其用途。因此，需要開(kāi)發(fā)診斷、預(yù)后和/或監(jiān)測(cè)EBV相關(guān)癌癥的替代檢驗(yàn)。發(fā)明概述我們令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，循環(huán)的無(wú)細(xì)胞EB病毒(EBV)DNA可穿過(guò)腎屏障，并且作為NPC和其他EBV相關(guān)惡性胂瘤的肺瘤標(biāo)志，可在尿中檢測(cè)到。本發(fā)明的第一方面提供了診斷個(gè)體EBV相關(guān)癌癥的方法。所述方法包括(a)獲得個(gè)體的尿樣；以及(b)檢測(cè)尿樣中EBV相關(guān)核酸序列，其中尿樣中存在EBV相關(guān)核酸序列，表示個(gè)體患有EBV相關(guān)癌癥。本發(fā)明的第二方面提供了用于個(gè)體EBV相關(guān)癌癥預(yù)后的方法。所述方法包括(a)獲得個(gè)體的尿樣；以及(b)檢測(cè)尿樣中EBV相關(guān)核酸序列，其中尿樣中存在EBV相關(guān)核酸序列，表示EBV相關(guān)癌癥的不良預(yù)后。本發(fā)明的第三方面提供了監(jiān)測(cè)個(gè)體EBV相關(guān)癌癥的方法。所述方法包括(a)獲得不同時(shí)間點(diǎn)的個(gè)體尿樣；以及(全測(cè)和/或定量尿樣中EBV相關(guān)核酸序列，其中尿樣中存在EBV相關(guān)核酸序列或EBV相關(guān)核酸序列水平升高，表示EBV相關(guān)癌癥的進(jìn)展，而尿樣中缺少EBV相關(guān)核酸序列或EBV相關(guān)核酸序列水平降低則表示EBV相關(guān)癌癥的抑制。在本發(fā)明方法的具體實(shí)施方案中，在EBV相關(guān)癌癥的治療過(guò)程中進(jìn)行步驟(a),尿樣中缺少EBV相關(guān)核酸序列或EBV相關(guān)核酸序列水平降低，表示治療有效。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，上述方法還包括分析尿樣中EBV相關(guān)核酸序列大小的步驟以排除假陽(yáng)性情況。在這些情況中，尿樣中檢測(cè)和/或定量的EBV相關(guān)核酸序列可能不是來(lái)自循環(huán)的EBV相關(guān)核酸片段，且是相對(duì)完整的。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，上述EBV相關(guān)核酸序列來(lái)自EBV基因組5amHI-W區(qū)的至少一個(gè)DNA片段或其至少一個(gè)RNA轉(zhuǎn)錄本。優(yōu)選地，DNA片^:或RNA轉(zhuǎn)錄本小于180個(gè)核苷酸。本發(fā)明的第四方面提供了用于個(gè)體EBV相關(guān)癌癥診斷或預(yù)后的試劑盒。所述試劑盒包含a)用于從個(gè)體尿樣中提取核酸的第一單元；以及b)用于4企測(cè)提取的核酸中EBV相關(guān)核酸序列的第二單元，其中第二單元包含用于擴(kuò)增EBV基因組5amHI-W區(qū)的至少一個(gè)片4爻的至少一對(duì)引物。本發(fā)明的第五方面提供了監(jiān)測(cè)個(gè)體EBV相關(guān)癌癥的試劑盒。所述試劑盒包含a)多個(gè)用于從個(gè)體的尿樣中提取核酸的第一單元；以及b)多個(gè)用于4企測(cè)和/或定量才是耳又的核酸中EBV相關(guān)核酸序列的第二單元，其中第二單元包含用于擴(kuò)增EBV基因組5amHI-W區(qū)的至少一個(gè)片段的至少一對(duì)引物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的試劑盒還包含從個(gè)體獲得尿樣的裝置。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，上述EBV相關(guān)核酸是DNA。在其他實(shí)施方案中，其是RNA。在本發(fā)明一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，EBV相關(guān)癌癥是鼻咽癌(NPC)、天然殺傷細(xì)胞淋巴瘤(NK-淋巴瘤)或胃癌。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，EBV相關(guān)癌癥是鼻咽癌。通過(guò)以示例的方式顯示和描述的本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案的下述說(shuō)明，本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將變得更為顯而易見(jiàn)。附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明圖1顯示依據(jù)尿EBVDNA的可4企測(cè)性，NPC患者的血漿EBVDNA的濃度；以及圖2顯示在具有可檢測(cè)的尿EBVDNA的NPC患者中血漿EBVDNA和尿EBVDNA水平之間的相關(guān)性，其中(a):尿EBVDNA濃度表示為拷貝/mL尿，以及(b):尿EBVDNA濃度表示為拷貝/mmol尿肌氨酸酐。發(fā)明的詳細(xì)描述除非另有說(shuō)明，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員所通常理解的涵義。如上文所述，本發(fā)明的方法可用于診斷或預(yù)測(cè)EBV相關(guān)癌癥，如鼻咽癌(NPC)。在這些方法中，首先從個(gè)體獲得尿樣，隨后進(jìn)行尿樣中EBVDNA序列的檢測(cè)和/或定量。也公開(kāi)了監(jiān)測(cè)個(gè)體EBV相關(guān)癌癥的方法。所述方法包括下述步驟(a)獲得不同時(shí)間點(diǎn)的個(gè)體尿樣；以及(b)檢測(cè)和/或定量尿樣中EBVDNA序列。尿樣中EBVDNA序列水平的差異作為EBV相關(guān)癌癥的發(fā)展的指征。例如，尿樣中存在EBVDNA序列或EBVDNA序列水平升高，表示EBV相關(guān)癌癥的進(jìn)展，而尿樣中缺少EBVDNA序列或EBVDNA序列水平降低，則表示EBV相關(guān)癌癥的抑制。這種方法特別適用于評(píng)估EBV相關(guān)癌癥治療的效率。員應(yīng)當(dāng)理解的是，該步驟在某些情況下不是必須的，在所述情況下，已經(jīng)提前獲得尿樣，例如，在采樣中心(samplingcenter)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，尿樣中EBVDNA序列的檢測(cè)或定量包括如下步驟(l)從尿樣中提取DNA;(2)擴(kuò)增提取的DNA中EBVDNA序列；以及(3)檢測(cè)和/或定量擴(kuò)增的EBVDNA序列。如本文所用的，短語(yǔ)"EBVDNA序列"指EB病毒(EBV)基因組(GenBank登錄號(hào)AJ507799)的片段，并且通常是基因組DNA降解的產(chǎn)物。特別是，本發(fā)明的EBVDNA序列包含EBV基因組SawHI-W區(qū)的至少一個(gè)片l殳。本文所用的SamHI陽(yáng)W區(qū)指Jonesetal.，NucleicAcidsRes.11:3919-3937(1983)中公開(kāi)的EBV基因組的重復(fù)5amHI醫(yī)W限制片段?？梢岳斫猓^長(zhǎng)的DNA序列以較低的速率穿過(guò)腎屏障。因此，為了提高檢測(cè)的靈敏度，本發(fā)明所選的EBVDNA序列的大小不超過(guò)180bp。優(yōu)選，本發(fā)明靶標(biāo)DNA序列的大小不超過(guò)76bp。本文所用術(shù)語(yǔ)"擴(kuò)增(amplifying)"或"擴(kuò)增(amplification)"意指EBVDNA序列其他拷貝的產(chǎn)生，通常利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或本領(lǐng)域7>知的其他技術(shù)進(jìn)行?？梢岳肞CR擴(kuò)增EBVDNA序列單拷貝，達(dá)到可以由幾種不同方法4企測(cè)的水平。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟(2)和步驟(3)通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR(Q-PCR)進(jìn)行。本文所用術(shù)語(yǔ)"實(shí)時(shí)定量PCR"或"Q-PCR"指基于連續(xù)地光學(xué)監(jiān)測(cè)熒光PCR反應(yīng)進(jìn)程的方法。在這種系統(tǒng)中，除了常夫見(jiàn)PCR所用的一對(duì)擴(kuò)增引物外，還包括雙標(biāo)記的熒光雜交#:針。一種熒光染料作為報(bào)道分子(如FAM),且其發(fā)射譜由第二熒光染料(如TAMRA)淬滅。在PCR的延伸階段，T叫DNA聚合酶的5，到3，的核酸外切酶活性從探針中切割報(bào)道分子，因此將其從淬滅劑中釋放，導(dǎo)致焚光增加。熒光隨后用于監(jiān)測(cè)擴(kuò)增過(guò)程并測(cè)定最初模板DNA的量。我們的研究發(fā)現(xiàn)，健康個(gè)體的尿中可以偶爾攜帶EBVDNA。為了排除這些假陽(yáng)性情況，本發(fā)明的方法還包括分析尿樣中存在的EBVDNA序列大小的步驟。在一些實(shí)施方案中，分析EBVDNA序列的大小通過(guò)兩次或多次PCR檢測(cè)或Q-PCR檢測(cè)進(jìn)行。這些檢測(cè)使用不同大小的擴(kuò)增子。因?yàn)檩^長(zhǎng)的DNA序列以較低的速率穿過(guò)腎屏障，因此當(dāng)使用更大的擴(kuò)增子時(shí)，在相同的擴(kuò)增循環(huán)后，將獲得濃度低得多的最終擴(kuò)增產(chǎn)物。如果利用不同大小的擴(kuò)增子(如59bp和76bp),靶向EBVDNA序列的兩種或多種PCR檢測(cè)或Q-PCR檢測(cè)產(chǎn)生相似量的最終擴(kuò)增產(chǎn)物，則存在于尿樣中的EBVDNA序列可能不是來(lái)自穿過(guò)腎屏障的循環(huán)EBVDNA。排除這些情況使本發(fā)明的方法對(duì)于NPC和其他EBV相關(guān)惡性腫瘤的診斷、預(yù)后或監(jiān)測(cè)具更高的可靠性?？蛇x地，我們可以以常失見(jiàn)方式分析大于180bp的EBV基因組片段是否存在于尿樣中。因?yàn)榇笥?80bp的DNA片段難以穿過(guò)腎屏障，因此個(gè)體尿樣中存在大于180bp的EBV基因組片段可用于將所述個(gè)體從患有EBV相關(guān)癌癥的患者中排除。如先前所述，血漿EBVDNA濃度可用于i貪斷、預(yù)測(cè)或監(jiān)測(cè)NPC和其他EBV相關(guān)惡性肺瘤。本發(fā)明公開(kāi)了在血漿和尿EBVDNA濃度之間存在良好的相關(guān)性，即血漿EBVDNA濃度可以通過(guò)定量尿EBVDNA濃度測(cè)定。因此，尿中EBVDNA序列濃度的檢測(cè)，是診斷、預(yù)測(cè)或監(jiān)測(cè)NPC和其他EBV相關(guān)惡性肺瘤的血漿纟全測(cè)的優(yōu)良替代方案。根據(jù)本發(fā)明，個(gè)體尿樣中存在EBVDNA序列可用于指示EBV相關(guān)癌癥，包括EBV相關(guān)癌癥的發(fā)展進(jìn)程。根據(jù)本發(fā)明，個(gè)體尿樣中存在EBVDNA序列也可以作為EBV相關(guān)癌癥的不良預(yù)測(cè)因素，用于預(yù)測(cè)個(gè)體總生存率或復(fù)發(fā)的可能性。當(dāng)追蹤患有EBV相關(guān)癌癥的個(gè)體尿樣中EBV序列的水平一段時(shí)間后，該水平的趨勢(shì)反映了癌癥的發(fā)展。通常，水平升高表示癌癥的進(jìn)展。尿中EBV序列水平的趨勢(shì)也可以用于評(píng)估EBV相關(guān)癌癥治療的有效性。尿樣中缺少EBVDNA序列或EBVDNA序列的水平降低是治療有效的優(yōu)良指征。上文將EBVDNA作為EBV相關(guān)核酸的i兌明性實(shí)例。本領(lǐng)域4支術(shù)人員公知的是，存在與EBV相關(guān)的其他類(lèi)型核酸，如RNA。因此，在某些實(shí)施方案中，用于EBV相關(guān)癌癥診斷、預(yù)后和監(jiān)測(cè)的方法，包括檢測(cè)EBV相關(guān)RNA,如人類(lèi)個(gè)體尿樣中EB編碼的小RNA(Epstein-BarrencodedsmallRNA,EBER)。此外本發(fā)明公開(kāi)了用于個(gè)體EBV相關(guān)癌癥的診斷或預(yù)后的試劑盒。該試劑盒包含a)用于從尿樣中提取DNA的第一單元；以及b)用于檢測(cè)和/或定量提取的DNA中EBVDNA序列的第二單元，其中第二單元包含用于擴(kuò)增EBV基因組萬(wàn)amHI-W區(qū)的至少一個(gè)片段的至少一對(duì)引物。本發(fā)明還公開(kāi)了監(jiān)測(cè)個(gè)體EBV相關(guān)癌癥的試劑盒。該試劑盒包含a)多個(gè)用于從尿樣中提取DNA的第一單元；以及b)多個(gè)用于才企測(cè)和/或定量提取的DNA中EBVDNA序列的第二單元，其中第二單元包含擴(kuò)增EBV基因組5a附HI-W區(qū)的至少一個(gè)片段的至少一對(duì)引物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的試劑盒還包含用于從個(gè)體獲得尿樣的裝置。如果需要，試劑盒還可以包含使用試劑盒的說(shuō)明書(shū)。通常，試劑盒的第二單元還包含Q-PCR檢測(cè)的探針。為了排除上文提到的假陽(yáng)性情況，試劑盒優(yōu)選包含不同大小擴(kuò)增子的引物。例如，試劑盒包含擴(kuò)增180bpEBVDNA序列的一對(duì)引物，以及擴(kuò)增76bpEBVDNA序列的另一對(duì)引物。監(jiān)測(cè)EBV相關(guān)癌癥的本發(fā)明的試劑盒，特別用于評(píng)估EBV相關(guān)癌癥治療的有效性，因?yàn)槟驑又腥鄙貳BVDNA序列或EBVDNA序列水平降低，可以作為治療有效的指征。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，通過(guò)利用反轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測(cè)或?qū)崟r(shí)定量反轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Q-RT-PCR)檢測(cè)，本發(fā)明的試劑盒也可以用于4企測(cè)和/或定量尿樣中EBVRNA序列，進(jìn)行個(gè)體EBV相關(guān)癌癥的診斷、預(yù)后或監(jiān)測(cè)。僅以說(shuō)明而非限制的方式，提供下述實(shí)施例。實(shí)施例募集44名NPC患者以及70名健康對(duì)照個(gè)體。首先從個(gè)體尿樣和血漿樣品中提取DNA,隨后，如下文所述，利用靶向EBV基因組5amHI-W區(qū)(Lo1999etal.)的定量實(shí)時(shí)PCR，擴(kuò)增提取的DNA的EBVDNA。尿和血漿中DNA片段的提取將來(lái)自每個(gè)研究個(gè)體的10ml尿收集于含有EDTA的試管中。將尿樣在4°C下1,600g離心10分鐘。用0.45的過(guò)濾器過(guò)濾上清液，除去任何殘余的細(xì)胞。利用WizardPlusMiniprepDNA純化試劑盒(WizardPlusMiniprepDNAPurificationKit,Promega,Madison,WI),從尿樣中提耳又DNA。將經(jīng)過(guò)濾的上清液與15mL6M的異石克氰酸胍(guanidineisothiocyanate,GITC)完全混合。向每個(gè)樣品中加入1mlDNA純化試劑盒中的樹(shù)脂懸浮液，隨后于室溫下在滾軸混合器(Rollermixer)上將混合物完全混合2小時(shí)。隨后利用30mL注射器，使尿-樹(shù)脂混合物流經(jīng)試劑盒中提供的小型柱(minicolumn)。隨后使2ml洗滌液流經(jīng)小型柱。通過(guò)簡(jiǎn)單離心清除剩余的洗滌液。向小型柱中加入100微升H20，用于洗脫DNA片段。從血漿中提取DNA片段的方法，在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的，如Loetal.CancerRes.60(24):6878-81(2000)所述的利用QIAamp血液試劑盒(QIAampBloodKit,Qiagen，Hilden,Germany)的方法。簡(jiǎn)而言之，根據(jù)本領(lǐng)域已經(jīng)建立的實(shí)驗(yàn)方案，從患者獲得血漿樣品。將樣品存儲(chǔ)于-20°C，直到進(jìn)一步處理。利用QIAamp血液試劑盒(Qiagen,Hilden,Germany),采用制造商推薦的"血液和體液實(shí)驗(yàn)方案"，從血漿樣品中提取DNA。每個(gè)柱利用總計(jì)400-800血漿樣品，進(jìn)行DNA提取。記載準(zhǔn)確的樣品量，用于計(jì)算把標(biāo)DNA濃度。50/d的終洗脫體積用于從提取柱中洗脫DNA。EBVDNA片段的檢測(cè)和定量尿EBVDNA的濃度通過(guò)都耙向EBV基因組5amHI-W區(qū)的兩次實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)測(cè)定。兩種PCR檢測(cè)的擴(kuò)增子大小為76bp和59bp。76bp擴(kuò)增子才企測(cè)所用的引物為5，-CCCAACACTCCACCACACC-3，(SEQIDNO.l)和5，-TCTTAGGAGCTGTCCGAGGG-3，(SEQIDNo.2)。59bp擴(kuò)增子檢測(cè)所用的引物為5，-CCCAGGCACACACTACACACA-3，(SEQIDNo.3)和5，-TCTTAGGAGCTGTCCGAGGG-3，(SEQIDNo.4)。76bp和59bp擴(kuò)增子檢測(cè)所用的熒光探針?lè)謩e為5，-(FAM)-CACACACTACACACACCCACCCGTCTC-(TAMRA)-3'(SEQIDNo.5)和5，-(FAM)-CACCCGTCTCAGGG-(MGB)-3，(SEQIDNo.6)。PCR反應(yīng)設(shè)置為50的反應(yīng)體積。每個(gè)反應(yīng)含有5|iL10x的緩沖液A;300nM的每種擴(kuò)增引物；25nM相應(yīng)熒光4笨針；4mMMgCl2;均為200的dATP、dCTP和dGTP;400)iMdUTP;1,25單位的AmpliTaqGold;以及0.5單位的AmpErase尿嘧咬N-糖基化酶。用10)al提取的尿DNA作為模板。兩個(gè)PCR系統(tǒng)使用相同的熱模式(thermalprofile),即50。C,2min;950C,10min，隨后40個(gè)循環(huán)的95°C15s以及56。C1min。利用從EBV陽(yáng)性細(xì)胞系Namawa提取的DNA作為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)每個(gè)分析并行運(yùn)行才交準(zhǔn)曲線(xiàn)。Namalwa是二倍體細(xì)胞系，每個(gè)細(xì)胞含有兩個(gè)完整的EBV基因組。每個(gè)樣品分析兩次，隨后取平均值，進(jìn)行分析。尿EBVDNA的數(shù)量可以表示為濃度/單位體積尿。例如拷貝/mL尿，或表示為數(shù)量/尿樣中另一種物質(zhì)的量，以校準(zhǔn)尿的濃度，例如拷貝/mmol肌氨酸酐。尿樣中存在EBV或EBV的水平為NPC的有用臨床標(biāo)志分別利用76bp和59bp檢測(cè)，在NPC患者的10(23%)和22(50%)個(gè)尿樣中檢測(cè)到EBVDNA(表1)。59bp檢測(cè)的更高檢測(cè)率表明，更短的DNA分子更易于過(guò)濾通過(guò)腎屏障，并且可在尿中檢測(cè)到。與我們之前的結(jié)果一致，可在幾乎所有來(lái)自NPC患者的血漿樣品中檢測(cè)到EBVDNA。如表1所示，來(lái)自NPC患者的41(93%)個(gè)血漿樣品可以利用59bp檢測(cè)或76bp檢測(cè)進(jìn)行檢測(cè)。耙標(biāo)片段大小的進(jìn)一步減少可進(jìn)一步增加EBV相關(guān)核酸4企測(cè)的靈敏度。表1:利用59bp和76bp檢測(cè)，NPC患者的尿EBVDNA的檢出率<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>作為對(duì)照，也分析了70名健康個(gè)體。利用76bp檢測(cè)，在3名(40/。)個(gè)體的血漿中，EBVDNA是可以4企測(cè)的(表2)。它們的血漿EBVDNA濃度為13拷貝/mL,17拷貝/mL和22拷貝/mL。當(dāng)與44名NPC患者的血漿EBVDNA水平(中間值950拷貝/mL)相比時(shí)，這些水平相對(duì)較低。在這三名對(duì)照個(gè)體的尿中，檢測(cè)不到EBVDNA。表2:利用59bpEBVDNA檢測(cè)，NPC患者和健康對(duì)照個(gè)體的尿EBVDNA的<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>假陽(yáng)性情況評(píng)估的排除令人吃驚的是，在血漿檢測(cè)不到EBVDNA的兩名健康個(gè)體的尿中，檢測(cè)到了EBVDNA,濃度為227拷貝/mL和1,280,000拷貝/mL。用76bp和180bp大小的擴(kuò)增子大小，采用靶向EBV基因組5awHI-W區(qū)的兩種實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)，分析了這兩個(gè)尿樣。利用所述兩種檢測(cè)，這兩名個(gè)體的尿EBVDNA濃度相對(duì)恒定。對(duì)于前者前一個(gè)體而言，利用76bp和180bp檢測(cè)，尿EBVDNA濃度分別為333拷貝/mL和243拷貝/mL。對(duì)于后者后一個(gè)體而言，利用76bp和180bp檢測(cè)，尿EBVDNA分別為1,220,000拷貝/mL和1,073,000拷貝/mL。相反，對(duì)于在59bp和76bp兩種檢測(cè)中均檢測(cè)到尿EBVDNA的NPC患者而言，濃度的平均下降(mediandrop)為93.5%。利用180bp檢測(cè)，在44名NPC患者的尿中，未檢測(cè)到尿EBVDNA。利用兩種不同大小的PCR檢測(cè)，兩名健康個(gè)體相對(duì)恒定的尿EBVDNA濃度表明，他們尿中檢測(cè)到的EBVDNA分子與NPC患者尿中檢測(cè)到的EBVDNA相比是相對(duì)完整的。一種可能的解釋是，兩名對(duì)照個(gè)體的尿中存在完整的病毒顆粒，其可能來(lái)自活性病毒復(fù)制。診斷上，尿EBVDNA的大小可包括于分析中，以增加尿EBVDNA分析的特異性。血漿濃度和尿EBVDNA濃度之間的相關(guān)性利用76bp實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)，分析NPC患者的血漿EBVDNA濃度。具可^r測(cè)和不可^r測(cè)的尿EBVDNA的患者的平均血漿EBVDNA濃度分別為2054拷貝/mL和511拷貝/mL(pO.0001,曼-惠特尼檢驗(yàn)(Mann-Whitneytest))。在具有可^r測(cè)的尿EBVDNA的患者中，血漿EBVDNA濃度在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著更高。結(jié)果顯示于圖1中。對(duì)于具有可才企測(cè)的尿EBVDNA患者，我們研究了在血槳濃度和尿EBVDNA濃度之間是否存在任何相關(guān)性。在血漿濃度和尿EBVDNA濃度之間，存在顯著的正相關(guān)性(r=0.684,p<0.0001,斯皮爾曼相關(guān)性(Spearmancorrelation);圖2a)。因?yàn)镋BVDNA尿濃度受患者水合狀態(tài)的影響，我們用肌氨酸酐的尿濃度校正了EBVDNA的尿濃度，并以拷貝/mmol肌氨酸酐表示EBVDNA的濃度。當(dāng)用尿肌氨酸酐濃度才交正尿EBVDNA濃度時(shí)，血漿濃度和尿EBVDNA的濃度之間的正相關(guān)性變得更加顯著(r:0.748,p<0.0001，斯皮爾曼相關(guān)性；圖2b)。尿才羊中存在EBVDNA或EBVDNA水平是預(yù)后的有用標(biāo)志在平均追蹤8個(gè)月后，44名NPC患者中有三名出現(xiàn)了臨床復(fù)發(fā)。所有三名患者在治療前尿中具有可^r測(cè)的EBVDNA。相反，具有不可檢測(cè)的尿EBVDNA的22名患者中沒(méi)有人出現(xiàn)臨床復(fù)發(fā)。因?yàn)榫哂锌刹湃珳y(cè)的尿EBVDNA的患者具有顯著更高的血漿EBVDNA水平，預(yù)期也可以將尿EBVDNA作為治療后生存率的預(yù)后標(biāo)志，因?yàn)橐阎哐獫{EBVDNA水平是治療后疾病復(fù)發(fā)的不良預(yù)后因素。可以預(yù)期，存活概率中的差異隨著追蹤期限的增加會(huì)變得更為突出。應(yīng)當(dāng)理解，盡管結(jié)合詳細(xì)的說(shuō)明對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，但上述說(shuō)明意在示例而非限制本發(fā)明的范圍。本說(shuō)明書(shū)引用的和/或列于申請(qǐng)數(shù)據(jù)頁(yè)中的所有上述的美國(guó)專(zhuān)利、美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)出版物、美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)、國(guó)外專(zhuān)利、國(guó)外專(zhuān)利申請(qǐng)以及非專(zhuān)利出版物，通過(guò)引用的方式以其整體并入本文。參考文獻(xiàn)Chan,ATC,Lo,YMD,Zee,B,Chan,LYS,etal.(2002)PlasmaEpstein-BarrvimsDNAandresidualdiseaseafterradiotherapyforundifferentiatednasopharyngealcarcinoma(未分"f匕鼻口因癌力文射治療后血漿EB病毒DNA和殘留病).JNatlCancerInst94(21):1614-9.Chen,CL，Wen,WN，Chen,JY,Hsu,MM,etal.(1993)DetectionofEpstein-BarrvirusgenomeinnasopharyngealcarcinomabyinsituDNAhybridization(通過(guò)原位DNA雜交檢測(cè)鼻咽癌中EB病毒基因組).Intervirology;36(2):91-8.Dickens,P,Srivastava,G,Loke,SL，Chan,CW,etal,(1992)Epstein-BarrvirusDNAinnasopharyngealcarcinomasfromChinesepatientsinHongKong(香港中國(guó)患者鼻咽癌中的EB病毒DNA).JClinPathol;45(5):396-7.Jones,MDandGriffin,BE.(1983)ClusteredrepeatsequencesinthegenomeofEpstein-Barrvirus(EB病毒基因組中成簇的重復(fù)序列)NucleicAcidsRes;11:3919-3937.Lei,KI,Chan,LYS,Chan,WY,Johnson,PJ,etal.(2000)Quantitativeanalysisofcirculatingcell-freeEpstein-Barrvirus(EBV)DNAlevelsinpatientswithEBV-associatedlymphoidmalignancies(患有EBV相關(guān)淋巴惡性胂瘤的患者中循環(huán)的無(wú)細(xì)胞EB病毒(EBV)DNA水平的定量分析).BrJHaematol11l(l):239-46.Lo,YMD，Chan,ATC,Chan,LYS,Leung,SF,etal.(2000)Molecularprognosticationofnasopharyngealcarcinomabyquantitativeanalysisofcirculatin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)測(cè)的試劑盒。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101622362SQ200880006051公開(kāi)日2010年1月6日申請(qǐng)日期2008年1月30日優(yōu)先權(quán)日2007年2月26日發(fā)明者盧煜明,陳君賜申請(qǐng)人:香港中文大學(xué)