專(zhuān)利名稱：用于藥靶診斷、預(yù)后和鑒別的單細(xì)胞基因表達(dá)的制作方法
用于藥靶診斷、預(yù)后和鑒別的單細(xì)胞基因表達(dá)交叉參考本申請(qǐng)要求保護(hù)2009年1月20日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No. 61/205，485的利益， 該申請(qǐng)?jiān)诖艘鰠⒖?。政府?quán)力本發(fā)明是在國(guó)家癌癥研究所授予的聯(lián)邦基金TO4CA1265M的政府支持下完成的。 政府在本發(fā)明中具有一定權(quán)利。
背景技術(shù)：
近年，基因表達(dá)模式的分析提供了改善很多疾病的診斷和風(fēng)險(xiǎn)層化的方法。例如， 未監(jiān)管的全局基因表達(dá)模式(glottal gene expression pattern)的分析已經(jīng)在分子水平鑒別出癌的不同亞型，其通過(guò)基因表達(dá)的廣泛不同區(qū)分基于標(biāo)準(zhǔn)診斷方法認(rèn)為同質(zhì)的疾病。這樣的分子亞型經(jīng)常與不同的臨床結(jié)果相關(guān)。全局基因表達(dá)模式還可用于檢查與臨床行為相關(guān)的特征以產(chǎn)生預(yù)后標(biāo)志。同很多疾病一樣，癌通常不是由單一的明確的原因引起的，而可以被視為多種疾病，每一種均由不同的信息路徑偏離引起，其最終導(dǎo)致明顯相似的病理表現(xiàn)型。在癌癥、癌前或相對(duì)于相同組織類(lèi)型的正常細(xì)胞而言低轉(zhuǎn)移潛能的細(xì)胞中差異表達(dá)的多核苷酸的鑒別可提供診斷工具的基礎(chǔ)，通過(guò)提供候選試劑的靶點(diǎn)有助于藥物的發(fā)現(xiàn)，并進(jìn)一步可用于鑒別對(duì)于被治療的癌的類(lèi)型更加合適的癌治療的治療靶點(diǎn)。差異表達(dá)的基因產(chǎn)物的鑒別也推進(jìn)對(duì)復(fù)雜疾病的進(jìn)展和性質(zhì)的理解，而且其對(duì)鑒別引起與例如轉(zhuǎn)移或炎癥表現(xiàn)型的發(fā)展相關(guān)的表現(xiàn)型的遺傳因子是關(guān)鍵的。在不同階段和不同細(xì)胞類(lèi)型差異表達(dá)的基因產(chǎn)物的鑒別既可提供早期的診斷試驗(yàn)，還可進(jìn)一步作為治療的靶點(diǎn)。另外，差異表達(dá)的基因產(chǎn)物可以是鑒別調(diào)節(jié)其活性(如其表達(dá)、生物活性等等)的化療制劑的篩選試驗(yàn)的基礎(chǔ)。早期疾病診斷對(duì)于阻止疾病的進(jìn)展和降低發(fā)病率非常重要。分析患者樣本以鑒別基因表達(dá)模式提供了更特異的合理的疾病治療的基礎(chǔ)，其可產(chǎn)生與傳統(tǒng)治療相比更少的副作用。而且，確認(rèn)損害對(duì)患者具有較小的風(fēng)險(xiǎn)(如腫瘤是良性的)可避免不必要的治療。簡(jiǎn)言之，疾病相關(guān)細(xì)胞中基因表達(dá)模式的鑒別可提供治療、診斷、預(yù)后、治療測(cè)定 (therametrics)等等的基礎(chǔ)。作為另一個(gè)例子，感染性疾病引起組織和器官的損傷，導(dǎo)致特定生物體的發(fā)病率和死亡率。在A型流感感染的例子中，最常見(jiàn)的住院和死亡的原因是肺組織感染。可是，在單細(xì)胞水平，并不知道流感感染的確切的細(xì)胞，以及修復(fù)損傷的肺的細(xì)胞。這樣的知識(shí)有助于鑒別用于干擾的治療靶點(diǎn)，如預(yù)防病毒感染的新藥，減少發(fā)病率的新療法。許多腫瘤含有混合群的與其用于生長(zhǎng)和存活的信號(hào)通路相關(guān)的不同的癌細(xì)胞。由于這些癌細(xì)胞對(duì)特定治療的反應(yīng)不同，癌干細(xì)胞特定群的抗性導(dǎo)致了細(xì)胞毒的放療和化療后的復(fù)發(fā)。因此，臨床治療的失敗部分歸因于癌細(xì)胞特定群對(duì)治療的抗性。治療不久后經(jīng)常觀察到的腫瘤的初期縮小僅反應(yīng)了癌細(xì)胞某一亞群相對(duì)的敏感性，其可包括腫瘤容積，對(duì)長(zhǎng)期的存活并不重要。因此，評(píng)價(jià)治療反應(yīng)和預(yù)后的最重要的臨床變量不是絕對(duì)的腫瘤大小，而是治療后殘存的癌細(xì)胞特定群的絕對(duì)數(shù)。如果人們能夠鑒別這些腫瘤中癌細(xì)胞不同群使用的信號(hào)通路的不同，那么人們就可以設(shè)計(jì)靶向細(xì)胞的每個(gè)群的治療。通過(guò)靶向所有的群，人們可以通過(guò)使用影響不同群的藥物治療來(lái)消除腫瘤。作為另一個(gè)例子，炎癥性腸疾病導(dǎo)致腸正常結(jié)構(gòu)的破壞，從而引起諸如腹瀉、出血和吸收不良的問(wèn)題。這些問(wèn)題是由正常的腸道粘膜內(nèi)襯破壞引起的。結(jié)腸的粘膜內(nèi)襯由隱窩組成，其中杯形細(xì)胞、干細(xì)胞和祖細(xì)胞在隱窩基部，而包括腸細(xì)胞和杯形細(xì)胞的成熟細(xì)胞位于隱窩的頂部?；加醒装Y性腸疾病時(shí)，不清楚哪一細(xì)胞群受損傷以及修復(fù)損傷粘膜需要的信號(hào)通路。使用少量細(xì)胞精確確定疾病損傷中細(xì)胞的數(shù)量和表現(xiàn)型的方法對(duì)于預(yù)后、診斷鑒別可被特定治療靶向的多種疾病的信號(hào)通路具有重要意義，所述疾病包括炎癥性腸疾病、 感染、癌、自體免疫性疾病如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和感染。本發(fā)明解決此問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了單細(xì)胞基因表達(dá)概要和/或轉(zhuǎn)錄組分析使用的組合物和方法。本文提供的一種方法是鑒別異質(zhì)性實(shí)體腫瘤樣本中不同細(xì)胞群的方法，包括從腫瘤中隨機(jī)分隔單獨(dú)的細(xì)胞至分離的位置；對(duì)在分離的位置中的單獨(dú)分割的細(xì)胞的多種基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析；進(jìn)行聚類(lèi)分析以鑒別一個(gè)或多個(gè)不同的細(xì)胞群。在某些例子中，分隔前單獨(dú)的細(xì)胞沒(méi)有被富集?？梢栽谥辽?000個(gè)單獨(dú)的細(xì)胞上同時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析?？梢允褂煤怂岱治鲞M(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析。分離的位置可以在平面基質(zhì)上。在某些具體實(shí)施方案中，在微流體系統(tǒng)中進(jìn)行隨機(jī)分隔。轉(zhuǎn)錄組分析可包括分析表達(dá)的RNA、非表達(dá)的RNA或二者。轉(zhuǎn)錄組分析可以是全轉(zhuǎn)錄組分析。轉(zhuǎn)錄組分析可以包括使用一單套引物對(duì)擴(kuò)增RNA，在一些具體實(shí)施方案中，該引物對(duì)是非巢式引物。轉(zhuǎn)錄組分析可以在單獨(dú)的細(xì)胞全部或亞類(lèi)上同時(shí)或基本上實(shí)時(shí)進(jìn)行。一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞群可以是正常的干細(xì)胞、正常的祖細(xì)胞、正常的成熟細(xì)胞、炎癥細(xì)胞、癌細(xì)胞、癌干細(xì)胞或非致癌的干細(xì)胞。本文進(jìn)一步提供了分析受試者異質(zhì)性腫瘤活組織檢查樣本的方法，包括從活組織檢查樣本中隨機(jī)分隔細(xì)胞至分離的位置；進(jìn)行單獨(dú)分隔的細(xì)胞的至少50個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄組分析；及使用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來(lái)鑒別一個(gè)或多個(gè)腫瘤的特征。可不事先富集細(xì)胞類(lèi)型而進(jìn)行執(zhí)行步驟。鑒別出的特征可以是癌細(xì)胞存在、不存在或數(shù)目。鑒別出的特征還可以是干細(xì)胞、早期祖細(xì)胞、初始分化的祖細(xì)胞、后期分化的祖細(xì)胞或成熟細(xì)胞的存在、不存在或數(shù)目。 鑒別出的特征還可以是治療劑消除一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞的有效性。鑒別出的特征還可以是信號(hào)路徑的活性，例如，癌干細(xì)胞、分化的癌細(xì)胞、成熟的癌細(xì)胞或其組合的特定路徑。本文公開(kāi)的方法可進(jìn)一步包括使用特征診斷受試者患癌或癌階段的步驟。本文公開(kāi)的另一種方法是鑒別疾病狀態(tài)細(xì)胞利用的信號(hào)路徑的方法，包括從異質(zhì)性樣本中隨機(jī)分隔細(xì)胞；在分隔的細(xì)胞上進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析；使用轉(zhuǎn)錄組分析鑒別至少一個(gè)疾病狀態(tài)的細(xì)胞；將至少一個(gè)疾病狀態(tài)的細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組分析與以下細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行比較a)非疾病狀態(tài)細(xì)胞；b)不同的疾病狀態(tài)細(xì)胞；以及c)疾病狀態(tài)干細(xì)胞；和鑒別下列細(xì)胞中表達(dá)的信號(hào)通路⑴疾病狀態(tài)細(xì)胞，(ii)疾病狀態(tài)干細(xì)胞，以及(iii)任選地不同疾病狀態(tài)細(xì)胞中，但不是非疾病狀態(tài)細(xì)胞中，從而鑒別疾病狀態(tài)細(xì)胞利用的信號(hào)路徑。疾病狀態(tài)是癌、潰瘍性結(jié)腸炎或炎癥性腸疾病。在某些具體實(shí)施方案中，所述疾病狀態(tài)細(xì)胞的生存需要該信號(hào)通路。本公開(kāi)還提供了用于診斷受試者具有病狀的方法，包括從異質(zhì)性樣本中隨機(jī)分隔細(xì)胞；在分隔的細(xì)胞上進(jìn)行第一次轉(zhuǎn)錄組分析；通過(guò)比較來(lái)自至少一個(gè)疾病狀態(tài)細(xì)胞的第一次轉(zhuǎn)錄組分析與來(lái)自非疾病狀態(tài)細(xì)胞的第二次轉(zhuǎn)錄組分析，使用轉(zhuǎn)錄組分析鑒別至少一個(gè)疾病狀態(tài)細(xì)胞，從而診斷所述受試者中與疾病狀態(tài)細(xì)胞相關(guān)的病狀的存在與否。疾病狀態(tài)可以是乳腺癌、結(jié)腸癌、潰瘍性結(jié)腸炎或炎癥性腸疾病。轉(zhuǎn)錄組分析可包括分析表達(dá)的 RNA、非表達(dá)的RNA或二者。轉(zhuǎn)錄組分析可以是全轉(zhuǎn)錄組分析。本文提供的另一種方法是用于篩選治療劑的方法，包括將具有疾病狀態(tài)細(xì)胞的第一受試者暴露于一個(gè)或多個(gè)測(cè)試制劑；從受試者目標(biāo)區(qū)域獲得異質(zhì)性腫瘤活組織檢查樣本；在來(lái)自異質(zhì)性腫瘤活組織檢查樣本的至少一個(gè)單個(gè)細(xì)胞上進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，其中，活組織檢查樣本包括一個(gè)或多個(gè)疾病狀態(tài)細(xì)胞；和將轉(zhuǎn)錄組分析與來(lái)自以下二者之一的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行比較(i)不具有疾病狀態(tài)細(xì)胞的第二受試者；或(ii)所述暴露步驟前的第一受試者； 以及鑒別影響來(lái)自試驗(yàn)區(qū)域細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組使其更像第二受試者或暴露前的第一受試者的轉(zhuǎn)錄組的試劑。病狀可以是乳腺癌、結(jié)腸癌、潰瘍性結(jié)腸炎或炎癥性腸疾病。治療劑可以是抗體或抗體片段、小分子、核酸(例如siRNA)、RNA、DNA、RNA-DNA嵌合體、蛋白質(zhì)或多肽。本公開(kāi)還提供了確定治療劑治療疾病的潛在有效性的方法，包括分離疾病狀態(tài)細(xì)胞的第一群至單獨(dú)的位置，其中單獨(dú)的位置包括單獨(dú)的細(xì)胞；確定來(lái)自至少一個(gè)單獨(dú)的細(xì)胞的至少一個(gè)核酸或蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，從而生成疾病狀態(tài)表達(dá)標(biāo)記；將疾病狀態(tài)細(xì)胞的第二群暴露于一種制劑；分離疾病狀態(tài)細(xì)胞的第二群至單獨(dú)的位置，其中單獨(dú)的位置包括單獨(dú)的細(xì)胞；確定來(lái)自第二群的至少一個(gè)單獨(dú)的細(xì)胞的至少一個(gè)核酸或蛋白質(zhì)的表達(dá)水平；和將來(lái)自第二群的單獨(dú)的細(xì)胞的表達(dá)水平與疾病狀態(tài)表達(dá)標(biāo)記比較，從而確定制劑治療疾病的有效性。暴露步驟可在體內(nèi)進(jìn)行。在一些例子中，第一群和第二群分離自一個(gè)受試者，例如人。疾病可以是癌、潰瘍性結(jié)腸炎或炎癥性腸疾病。核酸或蛋白質(zhì)可以是癌細(xì)胞標(biāo)記物、癌干細(xì)胞標(biāo)記物或二者。表達(dá)水平可以是mRNA的表達(dá)水平。在一些具體實(shí)施方案中，確定mRNA表達(dá)水平包括檢測(cè)10個(gè)或更多個(gè)核酸的表達(dá)或不表達(dá)。表達(dá)水平也可以是蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。分離步驟可以包括將細(xì)胞群暴露于特異性結(jié)合在單獨(dú)的細(xì)胞上存在的蛋白質(zhì)的抗體。本文進(jìn)一步提供了確定受試者對(duì)治療劑反應(yīng)的可能性的方法，包括從受試者分離細(xì)胞群至單獨(dú)的位置，其中單獨(dú)的位置包括單獨(dú)的細(xì)胞和其中至少一個(gè)單獨(dú)的細(xì)胞是疾病狀態(tài)細(xì)胞；確定來(lái)自至少一個(gè)疾病狀態(tài)的單獨(dú)的細(xì)胞的至少一個(gè)核酸或蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，其中核酸或蛋白質(zhì)是治療劑的靶標(biāo)；和基于至少一個(gè)核酸或蛋白質(zhì)的表達(dá)水平確定受試者反應(yīng)的可能性。表達(dá)水平可以是mRNA的表達(dá)水平。在某些具體實(shí)施方案中，確定mRNA 的表達(dá)水平包括檢測(cè)10個(gè)或更多個(gè)核酸的表達(dá)或不表達(dá)。表達(dá)水平還可以是蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。分離步驟可以包括將細(xì)胞群暴露于特異性結(jié)合存在于單獨(dú)的細(xì)胞上的蛋白質(zhì)的抗體。治療劑可以是抗癌劑。本文詳述的另一種方法提供了利用單獨(dú)的細(xì)胞的基因表達(dá)預(yù)后或診斷的方法，包括步驟從異質(zhì)性樣本中分離細(xì)胞至分別的可定地址的位置；裂解單獨(dú)的細(xì)胞，并將得到的裂解物分成至少2個(gè)部分；擴(kuò)增由此單獨(dú)的細(xì)胞獲得的mRNA或cDNA ；確定一個(gè)裂解物部分的基因表達(dá)概況，其中基因表達(dá)概況提供了亞群的信息；并在靶亞群中的至少一個(gè)細(xì)胞上進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析。在某些方法中，分析了至少I(mǎi)O2或至少I(mǎi)O3個(gè)單獨(dú)的細(xì)胞?？筛鶕?jù)至少一個(gè)細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)分類(lèi)細(xì)胞。通過(guò)本文公開(kāi)的方法分析的細(xì)胞可以是干細(xì)胞，例如造血干細(xì)胞。初始樣本可以包括少于IO6或少于IO5個(gè)細(xì)胞?？梢愿鶕?jù)⑶34和Thyl的表達(dá)的至少一個(gè)分類(lèi)細(xì)胞。在某些具體實(shí)施方案中，確定了至少一個(gè)或至少五(5)個(gè)與造血干細(xì)胞相關(guān)的基因的表達(dá)。轉(zhuǎn)錄組分析可以是全轉(zhuǎn)錄組分析。本文進(jìn)一步提供了分類(lèi)干細(xì)胞的方法，包括步驟(a)從樣本中獲得干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組概況；和(b)將獲得的轉(zhuǎn)錄組概況與參考的干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組概況比較。轉(zhuǎn)錄組概況可以包括從至少大約5個(gè)干細(xì)胞相關(guān)蛋白質(zhì)得到的數(shù)據(jù)組。被分析的干細(xì)胞可以是癌干細(xì)胞、造血干細(xì)胞、腸干細(xì)胞、白血病干細(xì)胞或肺干細(xì)胞。被分析的樣本可包括來(lái)自癌的細(xì)胞，例如乳腺癌或結(jié)腸癌。轉(zhuǎn)錄組概況分析還可以包括另外的步驟從干細(xì)胞樣本中提取mRNA ；定量對(duì)應(yīng)于干細(xì)胞特異序列的一個(gè)或多個(gè)mRNA種類(lèi)的水平；和將一個(gè)或多個(gè)mRNA種類(lèi)的水平與參考樣本中所述mRNA種類(lèi)的水平相比較。本文還提供了收集轉(zhuǎn)錄組相關(guān)數(shù)據(jù)的方法，包括步驟使用本文所述的任何方法收集轉(zhuǎn)錄組相關(guān)的數(shù)據(jù)，將所述數(shù)據(jù)傳送至計(jì)算機(jī)。將計(jì)算機(jī)連至測(cè)序儀。傳送后可將轉(zhuǎn)錄組相關(guān)的數(shù)據(jù)儲(chǔ)存，例如可將數(shù)據(jù)保存于可從計(jì)算機(jī)中提取的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)上。數(shù)據(jù)可從計(jì)算機(jī)傳送至遠(yuǎn)處，如經(jīng)由因特網(wǎng)。


本專(zhuān)利或申請(qǐng)文件包含至少一個(gè)彩圖。帶有彩圖的本專(zhuān)利或?qū)＠暾?qǐng)公布的復(fù)制件可通過(guò)請(qǐng)求和支付必要的費(fèi)用從專(zhuān)利局獲得。圖1、從N0D/SCID小鼠異種移植的人結(jié)直腸癌組織(腫瘤#4m6)純化的人“結(jié)直腸癌干細(xì)胞”(EpCAMhigh)的實(shí)時(shí)PCR的單細(xì)胞基因表達(dá)分析。在第一個(gè)實(shí)驗(yàn)中(組A)，分析16個(gè)單細(xì)胞的5個(gè)基因的表達(dá)，每一個(gè)細(xì)胞基因組合進(jìn)行27個(gè)重復(fù)；在此實(shí)驗(yàn)中，單獨(dú)的單細(xì)胞的每個(gè)mRNA制備物用在反應(yīng)基質(zhì)的3個(gè)連續(xù)的行，每一個(gè)基因特異的引物組用在 9個(gè)連續(xù)的列，僅有的一處例外為前3列不加引物；以使用色度的3x9個(gè)斑塊可視化每個(gè)單個(gè)的細(xì)胞的基因表達(dá)水平。在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中(組B)，進(jìn)行相似的方法，其中分析16個(gè)單細(xì)胞的16個(gè)基因的表達(dá)，每個(gè)細(xì)胞基因組合進(jìn)行9個(gè)重復(fù)；在此第二個(gè)情況中，單獨(dú)的單細(xì)胞的每個(gè)mRNA制備物用在反應(yīng)基質(zhì)的3個(gè)連續(xù)的行，每一個(gè)基因特異的引物組用在3個(gè)連續(xù)的列，從而可以以使用色度的3x3個(gè)斑塊可視化每個(gè)單個(gè)的細(xì)胞的基因表達(dá)水平。在兩種情況中，試驗(yàn)顯示了每一組重復(fù)中的高水平的可重復(fù)性和一致性。圖2、人“結(jié)直腸癌干細(xì)胞”(來(lái)自異種移植#8m3的EpCAMhigh/CD166+細(xì)胞)的實(shí)時(shí) PCR的單細(xì)胞基因表達(dá)分析。在此圖中，每一行鑒別一個(gè)單細(xì)胞，每一列鑒別一個(gè)不同的基因。使用色碼描繪基因表達(dá)的強(qiáng)度，其中深紅色表示較強(qiáng)強(qiáng)度，深綠色表示較弱強(qiáng)度。分析清楚地顯示基于其轉(zhuǎn)錄組的所有組成，EpCAMhigh/⑶166+腫瘤細(xì)胞可被細(xì)分為不同的亞組。 最重要的是，顯示同等的和同時(shí)的高水平的編碼結(jié)腸上皮的終末分化標(biāo)記物(如細(xì)胞角蛋白20、⑶66a/CEACAMl、碳酸酐酶II、MUC2、三葉因子3)的基因的表達(dá)的細(xì)胞亞組不表達(dá)或低水平表達(dá)編碼候選腸干細(xì)胞標(biāo)記物的基因或已知的干細(xì)胞功能必需的基因(如hTERT、 LGR5、生存素)，并且反之亦然。
圖3A-B、a 從攜帶有乳腺腫瘤的N0D/SCID小鼠的肺細(xì)胞中純化 MTICirESA+HI-。上面的組門(mén)控(gated) HI-Dapilviable譜系)，下面左側(cè)的組門(mén)控ESA+ 細(xì)胞以用于在下面右側(cè)的組中進(jìn)一步門(mén)控⑶對(duì)虹，細(xì)胞。b =HIFla, Snail2、Zeb2、上皮細(xì)胞鈣粘蛋白、波形蛋白(Vimentin)、VEGFC, CCR7、Lox、Cox2在MTIC和非TIC中的mRNA水平的實(shí)時(shí)PCR分析。圖4、比較初始TIC和MTIC的微RNA (miRs)水平的實(shí)時(shí)PCR分析的CT值。圖5A-5D、作為乳腺癌的非致癌癌細(xì)胞標(biāo)記物的⑶66a。圖6、18個(gè)細(xì)胞樣品的幾千個(gè)CNV的拷貝數(shù)變體分析。幾個(gè)可能與基因組的不穩(wěn)定性相關(guān)并導(dǎo)致改變的多能性干細(xì)胞性狀。圖7、單細(xì)胞分析設(shè)備、原理。圖8、干細(xì)胞關(guān)聯(lián)基因表達(dá)的基因集合富集分析。在乳腺癌干細(xì)胞(CSC)和它們的非致癌性后代(NTG)中分析由自我更新的正常的HSC、源自粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞祖細(xì)胞(GMP) 的白血病干細(xì)胞，而不是由非自我更新的正常的GMP表達(dá)的基因。如預(yù)期的一樣，這些基因在CSC基因表達(dá)標(biāo)記中顯著地過(guò)度表示。表示了過(guò)表達(dá)基因的熱圖。圖9、“在硅中”分類(lèi)分離細(xì)胞罕見(jiàn)亞群的簡(jiǎn)圖。通過(guò)FACS將如造血干細(xì)胞的細(xì)胞群分類(lèi)至96孔板，包含單細(xì)胞。裂解細(xì)胞將裂解物分為2個(gè)部分。一部分裂解物用于分析一組基因的表達(dá)，允許根據(jù)轉(zhuǎn)錄而不是表面蛋白質(zhì)的表達(dá)表征細(xì)胞。利用該信息，將選定的裂解物和/或從類(lèi)似細(xì)胞收集的裂解物進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組分析。圖10、通過(guò)計(jì)算機(jī)收集、儲(chǔ)存和傳送數(shù)據(jù)的圖示表示。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的方法利用原發(fā)性細(xì)胞(primary cell)的單細(xì)胞基因表達(dá)概況表征細(xì)胞群，用于疾病診斷、對(duì)特定治療干預(yù)的敏感性、預(yù)后的應(yīng)用以及新藥靶的鑒別。異質(zhì)性細(xì)胞樣本被分為空間獨(dú)立的單個(gè)細(xì)胞，任選地可根據(jù)目標(biāo)性質(zhì)(可能包括表面標(biāo)記物)將其分類(lèi)，然后將其裂解、擴(kuò)增內(nèi)容物、單獨(dú)地分析目標(biāo)基因的表達(dá)。因此，分析的細(xì)胞根據(jù)單獨(dú)的細(xì)胞的遺傳標(biāo)記得到分類(lèi)。這樣的分類(lèi)允許對(duì)檢測(cè)樣本的細(xì)胞成分的準(zhǔn)確評(píng)價(jià)。傳統(tǒng)的用于診斷目的的分析單細(xì)胞的方法包括使用庫(kù)爾特計(jì)數(shù)器和流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)給定類(lèi)型的細(xì)胞數(shù)?？墒牵@些測(cè)量典型地基于使用針對(duì)表面標(biāo)記物的抗體，并不能在 mRNA水平測(cè)定基因表達(dá)或蛋白質(zhì)表達(dá)。存在前面的單細(xì)胞PCR分析的例子，但這些例子在很少數(shù)量的細(xì)胞和或基因上進(jìn)行，以提供有用的診斷信息或提供區(qū)分一個(gè)組織中細(xì)微的或相關(guān)的細(xì)胞亞群的能力。病理學(xué)家使用的組織染色的方法存在相似的缺陷，且強(qiáng)烈地依賴于病理學(xué)家的定性判斷。而且，這些測(cè)量局限于檢測(cè)少數(shù)的參數(shù)。然而，本發(fā)明的方法允許檢測(cè)至少10、至少15、至少20、至少50、至少100、至少200、至少300、至少400、至少500或更多不同的參數(shù)，其中參數(shù)包括mRNA表達(dá)、基因表達(dá)，蛋白質(zhì)表達(dá)和進(jìn)一步包括與mRNA、基因和/或蛋白質(zhì)表達(dá)結(jié)合的細(xì)胞表面標(biāo)記物。在進(jìn)一步描述發(fā)明之前，應(yīng)該理解本發(fā)明不局限于下面描述的特定的具體實(shí)施方案，因?yàn)榭梢杂刑囟ň唧w實(shí)施方案的變化，其仍落在附加的權(quán)利要求的范圍內(nèi)。還應(yīng)當(dāng)理解使用的術(shù)語(yǔ)是為了描述特定的具體實(shí)施方案，而不是為了限制。在該說(shuō)明書(shū)和附加的權(quán)利要求中，除非文中另外明確指出，單數(shù)形式“一個(gè)”、“一個(gè)”和“這個(gè)”包括復(fù)數(shù)形式。
在提供了數(shù)值范圍時(shí)，應(yīng)當(dāng)理解，除非文中另外明確指出，每一個(gè)插入值，至下限的單位的十分之一(tenth)、在該范圍的上限和下限之間以及在該所述范圍內(nèi)任何其他描述的或介入的值均包括在本發(fā)明內(nèi)。這些較小范圍的上限和下限可以獨(dú)立地包括在較小范圍內(nèi)，也可以包括在本發(fā)明中，服從于所述范圍內(nèi)的特定的排除限。當(dāng)所述范圍包括一個(gè)或兩個(gè)限值時(shí)，排除一個(gè)或兩個(gè)這些被包括的限值的范圍也可以包括在本發(fā)明中。除非另外定義，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與本發(fā)明所述領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的意義相同。盡管在發(fā)明的實(shí)踐和實(shí)驗(yàn)中可以使用與本文所述的方法、設(shè)備和材料相似或等同的任何方法、設(shè)備和材料，現(xiàn)在描述說(shuō)明性的方法、設(shè)備和材料。本文提及的所有出版物通過(guò)引用并入本文中，以用于描述和公開(kāi)這些出版物中描述的發(fā)明的主題內(nèi)容，這些內(nèi)容可能與現(xiàn)在描述的發(fā)明相關(guān)地應(yīng)用。將細(xì)胞鑒別和分類(lèi)為群和亞群本公開(kāi)涉及鑒別細(xì)胞群和亞群并使用群和/或亞群診斷、預(yù)后和/或鑒別如疾病的病狀的治療靶點(diǎn)分類(lèi)方法。疾病可以包括任何種類(lèi)的癌(包括但不局限于實(shí)體瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、白血病)、炎癥性腸疾病、潰瘍性結(jié)腸炎、自體免疫性疾病、炎癥性疾病和感染性疾病。本公開(kāi)還提供了用于實(shí)施所述主題方法的制劑和試劑盒，如用于檢測(cè)本文描述的任何生物標(biāo)記物的抗體和核酸探針，或調(diào)節(jié)本文的生物標(biāo)記物的制劑。所述方法還可以確定用于特定癌治療的適當(dāng)水平。單細(xì)胞的分離提供了用于疾病診斷或預(yù)后應(yīng)用的單細(xì)胞基因表達(dá)概況，以及鑒別新藥靶點(diǎn)的研究工具。目標(biāo)疾病包括但不局限于免疫介導(dǎo)的功能障礙、癌等等。在本發(fā)明的方法中，異質(zhì)性細(xì)胞混合物，如腫瘤的針刺活組織檢查樣本、炎癥性損傷的活組織檢查樣本、滑液、脊髓抽出液等，被隨機(jī)地或以某種順序分為空間獨(dú)立的單細(xì)胞，如加入到多孔平板、微列陣、微流體儀或玻片。然后將細(xì)胞裂解，內(nèi)容物擴(kuò)增，單獨(dú)地分析目標(biāo)基因的表達(dá)。因此被分析的細(xì)胞根據(jù)個(gè)別細(xì)胞的遺傳標(biāo)記被分類(lèi)。這樣的分類(lèi)允許精確地評(píng)估被檢測(cè)樣本的細(xì)胞成分，該評(píng)估可以發(fā)現(xiàn)用途，例如用于確定腫瘤中癌干細(xì)胞的特性和數(shù)目；用于確定免疫相關(guān)細(xì)胞的特性和數(shù)目，例如T細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞、B細(xì)胞等等的數(shù)目和特異性。在某些具體實(shí)施方案中，被分析的細(xì)胞樣本是初始樣本，其可被新鮮地分離、冰凍等。可是，被分析的細(xì)胞可以是培養(yǎng)的細(xì)胞。通常樣本是細(xì)胞的異質(zhì)性混合物，包括大量的不同細(xì)胞類(lèi)型、不同群或不同亞群，如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、 19、20或更多的細(xì)胞類(lèi)型、群或亞群。在某些具體實(shí)施方案中，樣本是來(lái)自實(shí)體瘤、白血病、 淋巴瘤等的癌樣本，其可是活組織檢查樣本，如針刺活組織檢查樣本等，擴(kuò)散的腫瘤和白血病的血液樣本，等等。樣本可以獲自診斷之前，可以獲自治療過(guò)程中，等等。為了從組織中分離細(xì)胞，使用適當(dāng)?shù)娜芤阂员惴稚⒒驊腋?。這樣的溶液通常是平衡的鹽溶液，如普通鹽水、PBS、Hank’ s平衡鹽溶液等，合宜地補(bǔ)充有胎牛血清或其他天然存在的因子，以及低濃度的可接受的緩沖液，通常5-25mM。合宜的緩沖液包括HEPES、磷酸緩沖液、乳酸鹽緩沖液等?？梢栽谌魏魏线m的保持細(xì)胞的生命力的培養(yǎng)基中收集分離的細(xì)胞， 通常在收集管的底部有血清墊。可以商購(gòu)到不同的培養(yǎng)基并且可以根據(jù)細(xì)胞的特性使用， 包括通常補(bǔ)充有胎牛血清的dMEM、HBSS、dPBS、RPMI、Iscove介質(zhì)，等等。在某些具體實(shí)施方案中，樣本中的細(xì)胞在微列陣上被分離。例如，高度整合的肝細(xì)胞微列陣系統(tǒng)可以利用每一個(gè)足夠大以恰好適合單細(xì)胞的微孔(參見(jiàn)Tokimitsu等人 (2007)Cytometry PartA 71k 1003 :1010 ；禾口 Yamamura等人(2005)Analytical Chemistry 77 8050 ；上述文獻(xiàn)的每一個(gè)均特別地通過(guò)引用并入本文)。事先富集目標(biāo)細(xì)胞，一例如通過(guò)FACS或其他分離方法一是任選的并且在一些具體實(shí)施方案中，來(lái)自樣本的細(xì)胞被分離至分離的位置，事先不進(jìn)行任何分離或富集。例如，來(lái)自樣本(如血樣、活組織檢查樣本、實(shí)體瘤)的細(xì)胞可以被單獨(dú)地分離至不同的位置。典型地，對(duì)于實(shí)體瘤樣本，樣本被機(jī)械地、 化學(xué)地和/或酶法地分離(如通過(guò)用胰蛋白酶或超聲處理)。來(lái)自樣本的細(xì)胞可被放置在任何細(xì)胞分類(lèi)儀上(如微流體細(xì)胞分類(lèi)儀)，從而使單獨(dú)的細(xì)胞在如平板表面的可定地址的位置被分離。平板表面可以有凹痕、障礙或其他可以保證單獨(dú)的細(xì)胞分離的特征。然后可以根據(jù)本文的方法分析分離的細(xì)胞。優(yōu)選地，細(xì)胞可以被分離至不同的位置，其中每個(gè)位置含有1或0個(gè)細(xì)胞。任選的，例如通過(guò)流式細(xì)胞儀分類(lèi)細(xì)胞后將細(xì)胞分離。例如，可以使用FACS分類(lèi)或大小差異分類(lèi)以根據(jù)細(xì)胞表面存在的一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記物增加至少1000、10000、100000 或更多倍的目標(biāo)細(xì)胞的初始濃度。任選地，可根據(jù)細(xì)胞表面標(biāo)記物，特別是目標(biāo)群或亞群的標(biāo)記物的存在和/或不存在分類(lèi)這樣的細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞被分離至不同的位置用于分析時(shí)，可以使用微流體分類(lèi)儀、通過(guò)流式細(xì)胞儀、顯微鏡等分類(lèi)細(xì)胞。微制造的熒光激活的細(xì)胞分類(lèi)儀在Fu等人(1999)NatUre Biotechnology 17 :1109 和 Fu 等人 Q002)Anal. Chem. 74 :2451-2457 中被描述了，二者的每一篇均通過(guò)引用并入本文?？梢酝ㄟ^(guò)使用多層軟蝕刻技術(shù)(multilayer soft lithography)的整合的微制造的細(xì)胞分類(lèi)儀分類(lèi)樣本。該整合的細(xì)胞分類(lèi)儀可以包含各種微流體功能，包括蠕動(dòng)泵、減震器、開(kāi)關(guān)閥和輸入和輸出孔，以協(xié)調(diào)的和自動(dòng)的方式進(jìn)行細(xì)胞分類(lèi)。該整合的細(xì)胞分類(lèi)儀上的控制閥的有效體積可以是如IpL—樣小，且光學(xué)探詢 (optical interrogation)的容積可如IOOfL —樣小。與傳統(tǒng)的FACS儀相比，微流體FACS 提供更高的靈敏度、無(wú)交叉污染和更低的成本。單個(gè)的細(xì)胞可以被分離至不同的位置(如96孔板或微列陣地址)以用于進(jìn)一步的分析和/或操作。例如，包含造血干細(xì)胞(HSC)的細(xì)胞群利用能夠從成熟細(xì)胞中區(qū)分HSC 的抗體通過(guò)FACS分析被分類(lèi)。細(xì)胞被分類(lèi)至96孔板，利用恰當(dāng)?shù)姆椒呀猓⑼ㄟ^(guò)qPCR、 微列陣分析和/或測(cè)序分析裂解物。用于單細(xì)胞分離的設(shè)備包括微流體細(xì)胞分類(lèi)儀，其從細(xì)胞碎片中分離活細(xì)胞，并從單細(xì)胞懸液中分類(lèi)細(xì)胞。微流體設(shè)備可以與來(lái)源于1、2、3、4、5或更多不同的表面標(biāo)記的熒光信號(hào)聯(lián)合應(yīng)用(如針對(duì)目標(biāo)群或亞群的標(biāo)記物的標(biāo)記的抗體)，將它們放在獨(dú)立的箱中用于隨后的遺傳分析。其他的上游步驟，例如消化腫瘤或細(xì)胞培養(yǎng)以獲得細(xì)胞懸液并用熒光表面標(biāo)記物染色可以并入該系統(tǒng)。待分析細(xì)胞的數(shù)量取決于樣本的異質(zhì)性，以及目標(biāo)細(xì)胞在樣本中的期待頻率。通常分析至少大約IO2個(gè)細(xì)胞、至少大約103、至少切103、至少大約104、至少大約IO5至少大約106、至少大約107、至少大約108、至少大約109、至少大約 101Q、至少大約1011、至少大約1012、至少大約1013、至少大約1014、至少大約IO15或更多個(gè)細(xì)胞。在一些例子中，單細(xì)胞分析儀(SCAD)是按標(biāo)準(zhǔn)尺寸制造的并且可以以整體的全自動(dòng)的方式進(jìn)行以下步驟1)消化組織。將組織放置在設(shè)備的輸入部分。適當(dāng)?shù)拿副灰朐O(shè)備中并被流入以進(jìn)行細(xì)胞外基質(zhì)消化以獲得細(xì)胞懸液。幻從細(xì)胞碎片中分離活細(xì)胞，例如通過(guò)微流體“超材料”(metamaterial)流入被消化的樣本懸液，其允許根據(jù)顆粒大小分開(kāi)流體流?；萌旧Ｈ芜x地，在微流體儀的間隔內(nèi)使用恰當(dāng)?shù)谋砻鏄?biāo)記物染色被過(guò)濾的單細(xì)胞懸液。使用多達(dá)5個(gè)不同標(biāo)記物的染色對(duì)獲得癌細(xì)胞高純度的群是有用的。4)分類(lèi)。被染色的單細(xì)胞懸液流入微流體儀的下一個(gè)間隔以從剩余的細(xì)胞中分類(lèi)出癌細(xì)胞。在實(shí)施例中描述了分類(lèi)儀的多種具體實(shí)施方案。表汰概況可單獨(dú)地裂解被分類(lèi)的細(xì)胞以進(jìn)行細(xì)胞的遺傳的(RNA、DNA)和/或蛋白質(zhì)成分的分析。mRNA可以在寡-dT珠子的柱子上捕獲，在珠子上逆轉(zhuǎn)錄，處理離開(kāi)芯片，轉(zhuǎn)移至肉眼可見(jiàn)的孔等。任選地，DNA或RNA在分析前被預(yù)擴(kuò)增。預(yù)擴(kuò)增可以是全基因組或轉(zhuǎn)錄組， 或其部分(如，目標(biāo)基因/轉(zhuǎn)錄物)?？蓪⒍嗪塑账針颖巨D(zhuǎn)移至芯片以用于分析(如通過(guò) qRT-PCR)并確定表達(dá)概況。術(shù)語(yǔ)“表達(dá)概況”被寬范地使用以包括表達(dá)的蛋白質(zhì)和/或表達(dá)的核酸。核酸樣本包括大量的或一群不同的核酸，其可包括單個(gè)的細(xì)胞的目標(biāo)表現(xiàn)型的決定性基因的表達(dá)信息。核酸樣本可以包括RNA或DNA核酸，如mRNA、cRNA、cDNA等等。可以通過(guò)任何合宜的方式生成表達(dá)概況，以確定兩個(gè)樣本間的差異基因表達(dá)，如mRNA、標(biāo)記的mRNA、擴(kuò)增的mRNA、 cDNA等的定量雜交，定量PCR等等。分析受試者或患者樣本，如細(xì)胞或其收集物，如組織。 可通過(guò)任何本領(lǐng)域中公知的合宜的方法收集樣本。另外，可收集腫瘤樣本，并檢測(cè)腫瘤樣本以確定其在正常和疾病細(xì)胞間治療導(dǎo)致不同死亡的相對(duì)效果。目標(biāo)基因/蛋白質(zhì)是發(fā)現(xiàn)有預(yù)測(cè)性的基因/蛋白質(zhì)，包括本文提供的基因/蛋白質(zhì)，其中表達(dá)概況可以包括5、10、20、 25,50,100或更多的(包括所有的)列出的基因/蛋白質(zhì)的表達(dá)數(shù)據(jù)?？梢砸匀绫绢I(lǐng)域中已知的數(shù)個(gè)不同的方式制備樣本，如從單細(xì)胞分離mRNA，其中如差異表達(dá)領(lǐng)域中已知的用分離的mRNA擴(kuò)增、使用，以制備cDNA、cRNA等(例如，參見(jiàn) Marcus等人Anal Chem(2006) ；78 (9) :3084-89)?？蓮氖茉囌咧惺斋@的任何組織(如損傷或腫瘤組織)制備樣本。樣本的分析可用于任何目的(如診斷、預(yù)后、分類(lèi)、跟蹤和/或開(kāi)發(fā)治療)。在分析前可培養(yǎng)細(xì)胞。使用任何傳統(tǒng)的規(guī)程從初始的核酸樣本生成表達(dá)概況。盡管已知許多不同的產(chǎn)生表達(dá)概況的方式，如用在差異基因表達(dá)分析領(lǐng)域中的那些，一個(gè)代表性的和合宜類(lèi)型的生成表達(dá)概況的規(guī)程是定量PCR (QPCR或QT-PCR)?？衫萌魏慰色@得的進(jìn)行QPCR的方法，例如，如 Valera 等人 J Neurooncol (2007) 85 (1) :1_10 中所述的。從被分析樣本中獲得表達(dá)概況后，可將表達(dá)概況與參照或?qū)φ盏母艣r比較，以做出診斷、預(yù)后、藥物有效性的分析或其他需要的分析。提供或可通過(guò)經(jīng)驗(yàn)的方法獲得參照或?qū)φ崭艣r。將得到的表達(dá)概況與單一的參照/對(duì)照概況相比較以獲得被分析的細(xì)胞/組織表現(xiàn)型相關(guān)的信息。另外可選擇地，可將得到的表達(dá)概況與兩個(gè)或更多個(gè)不同的參照/對(duì)照概況比較以獲得更深一步的關(guān)于被分析的細(xì)胞/組織的表現(xiàn)型的信息。例如，可以將得到的表達(dá)概況與一個(gè)陽(yáng)性和陰性參照概況比較，以獲得關(guān)于細(xì)胞/組織是否具有目標(biāo)表現(xiàn)型的確定信息。差異數(shù)值的確定或分析，即兩個(gè)概況之間表達(dá)的不同，可使用任何傳統(tǒng)的方法進(jìn)行，其中很多方法是列陣領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，如通過(guò)比較表達(dá)概況的數(shù)字圖像，通過(guò)比較表達(dá)數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫(kù)等等。描述比較表達(dá)概況的方式的專(zhuān)利包括但不局限于美國(guó)專(zhuān)利 6，308，170和6，228，575，其公開(kāi)在此通過(guò)引用并入本文。本文中也描述了比較表達(dá)概況的方法。然后可進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析步驟，以獲得基因的組的加權(quán)貢獻(xiàn)。例如，可以如Tibshirani 等人(2002) P. N. A. S. 99 :6567-6572中描述的最近縮小形心分析(nearest shrunken centroids analysis)計(jì)算每一類(lèi)的形心，然后計(jì)算指定的表達(dá)概況和每一圖心間的平均平方距離，用類(lèi)內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)偏差標(biāo)準(zhǔn)化。分類(lèi)可以被概率地定義，其中截?cái)嘀?Cut-off)可以根據(jù)經(jīng)驗(yàn)產(chǎn)生。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，可用大約0. 4的概率區(qū)分休眠的和誘導(dǎo)的患者，更通常的用大約0. 5 的概率，并且也可以用大約0. 6或更高的概率?！案摺备怕士梢允侵辽俅蠹s0. 75，至少大約 0. 7，至少大約0. 6，或至少大約0. 5。“低”概率可以不超過(guò)大約0. 25，不超過(guò)0. 3，或不超過(guò)0. 4。在很多具體實(shí)施方案中，上面獲得的關(guān)于被分析細(xì)胞/組織的信息可被用來(lái)預(yù)測(cè)宿主、受試者或患者是否應(yīng)用目標(biāo)療法治療以優(yōu)化其劑量。細(xì)胞群和亞群的鑒定在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，例如，患有上皮樣癌，包括但不局限于乳腺癌和結(jié)腸癌，根據(jù)癌干細(xì)胞標(biāo)記物(如CD66a)表達(dá)的癌干細(xì)胞的鑒定可以鑒別CSC。有一種既具自我更新又具分化能力的致癌癌細(xì)胞的亞群。這些致癌細(xì)胞負(fù)責(zé)腫瘤的維持，也產(chǎn)生大量非正常分化的不具致癌性的后代，因此符合癌干細(xì)胞的定義。致癌潛能包含在差異表達(dá)本發(fā)明的標(biāo)記物的癌細(xì)胞的亞群中。如本文所示，在陽(yáng)性表達(dá)癌干細(xì)胞標(biāo)記物的細(xì)胞群中具有異質(zhì)性，如其中CD66陰性(CD66_)的細(xì)胞富含癌干細(xì)胞(致癌性)，而CD66a+的細(xì)胞無(wú)致癌性。群中這樣的異質(zhì)性的檢測(cè)能夠確定亞群。本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識(shí)到可以分析代表基因、轉(zhuǎn)錄物和/或蛋白質(zhì)的多種序列。 這樣的序列可以確定和/或區(qū)分樣本中的細(xì)胞表現(xiàn)型?？梢砸詷颖局械哪繕?biāo)群或亞群的多個(gè)方面為基礎(chǔ)選擇標(biāo)記物或標(biāo)記物組，例如， 組織來(lái)源(如神經(jīng)的對(duì)上皮的)或疾病狀態(tài)(如癌對(duì)非癌)?？墒褂帽疚闹忻枋龅姆椒ù_定用來(lái)區(qū)分細(xì)胞群(如從正常細(xì)胞區(qū)分癌干細(xì)胞)的其他序列，如通過(guò)檢測(cè)目標(biāo)群的基因中的變化(如上調(diào)或下調(diào))。用于從另一群中區(qū)分一個(gè)群的核酸可以如群間所比較的上調(diào)或下調(diào)的。例如，癌細(xì)胞與正常細(xì)胞相比、干細(xì)胞與分化的細(xì)胞相比和癌干細(xì)胞與分化的癌細(xì)胞相比，某些核酸的表達(dá)上調(diào)或下調(diào)。在某些例子中，基因的上調(diào)或下調(diào)可被用于區(qū)分大群中的亞群。例如，某些核酸僅在正常細(xì)胞、正常細(xì)胞和癌干細(xì)胞或僅在癌干細(xì)胞中表達(dá)。當(dāng)與另一個(gè)群或亞群、與已知表達(dá)水平或標(biāo)準(zhǔn)表達(dá)水平的特定核酸相比時(shí)核酸被上調(diào)或下調(diào)。另外可選擇地，分析多基因表達(dá)時(shí)，可以通過(guò)減去平均值和每個(gè)基因獨(dú)立地除以標(biāo)準(zhǔn)偏差創(chuàng)制熱圖，并且基于與平均值的偏差程度分配數(shù)值。例如，+/"I的值可以代表與平均值的2. 5-3的標(biāo)準(zhǔn)偏差。此類(lèi)分析可進(jìn)一步被細(xì)化，這樣在“+/_3”范圍內(nèi)的基因可被用于群集不同類(lèi)型的群(如癌指定的值是“+3”，正常細(xì)胞指定的值是“_3”，因此群集算法可以將其區(qū)分)。上調(diào)的基因可以具有“ + ”值。在某些例子中，可以使用差異表達(dá)的核酸組合作為特定群或亞群的概況。概況可包含任何數(shù)量的差異表達(dá)的核酸和/或蛋白質(zhì)，例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50或更多的核酸和/或蛋白質(zhì)。在某些例子
中，用于鑒別目標(biāo)群或亞群的核酸可以在目標(biāo)的和非目標(biāo)的群或非目標(biāo)的亞群中相似地表達(dá)。這樣的相似表達(dá)的核酸通常與其他差異表達(dá)的核酸聯(lián)合應(yīng)用以鑒別目標(biāo)群或亞群。本文描述的方法可被用于分析來(lái)自任何來(lái)源(如活組織檢查樣本、正常組織、實(shí)體瘤等)的異質(zhì)性細(xì)胞群。這樣的方法可被用于分離和分析任何細(xì)胞群，例如較大異質(zhì)性群或亞群中的目標(biāo)群，異質(zhì)性群或亞群中靶細(xì)胞、癌或其他干細(xì)胞的存在，或完整的異質(zhì)性群。發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)記物本文公開(kāi)的方法可以確定與細(xì)胞群或亞群(如正常細(xì)胞、癌細(xì)胞、疾病狀態(tài)細(xì)胞) 相關(guān)的新的標(biāo)記物。標(biāo)記物可以包括任何生物標(biāo)記物，包括但不局限于DNA、RNA和蛋白質(zhì)。 在某些例子中，用于細(xì)胞群的標(biāo)記物是正常不表達(dá)在指定細(xì)胞的基因或mRNA(例如祖細(xì)胞或表達(dá)分化標(biāo)記物的細(xì)胞表達(dá)干細(xì)胞基因或也表達(dá)分化標(biāo)記物的細(xì)胞表達(dá)增殖基因)。典型地，評(píng)估多于一個(gè)的標(biāo)記物，例如 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、 20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000 或更多個(gè)標(biāo)記物。標(biāo)記物是表達(dá)的RNA時(shí)，可以確定轉(zhuǎn)錄組的任何部分，直至和包括全轉(zhuǎn)錄組。在某種靶細(xì)胞群或亞群中核酸表達(dá)模式的分析可導(dǎo)致鑒定出將目標(biāo)群或亞群與其他的細(xì)胞群或亞群分開(kāi)的新的標(biāo)記物。例如，當(dāng)獨(dú)特的表面標(biāo)記物蛋白質(zhì)在目標(biāo)群或亞群中表達(dá)時(shí)，可開(kāi)發(fā)結(jié)合所述標(biāo)記物的抗體，以用于分離和/或鑒別相同的或其他個(gè)體中的該群或亞群的細(xì)胞(如通過(guò)FACS)。群或亞群特定標(biāo)記物的鑒別包括細(xì)胞群或亞群不存在的某些標(biāo)記物，其可以用于陰性選擇。可以使用本文描述的方法確定群或亞群中標(biāo)記物的存在，并可用該標(biāo)記物的存在定義細(xì)胞群。被分析細(xì)胞的群或亞群中的mRNA顯示某些基因在正常和癌細(xì)胞中差異表達(dá)。差異表達(dá)可以包括增加或降低的轉(zhuǎn)錄物水平、轉(zhuǎn)錄的缺乏和/或改變的表達(dá)調(diào)節(jié)(如對(duì)刺激物反應(yīng)的不同表達(dá)模式)。用作細(xì)胞群或亞群的標(biāo)記物的mRNA或其他標(biāo)記物還可以包括存在于該細(xì)胞群或亞群(如癌細(xì)胞和癌干細(xì)胞，但不是正常細(xì)胞)中的突變。本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識(shí)到這樣的標(biāo)記物可代表來(lái)自被測(cè)的單個(gè)個(gè)體的細(xì)胞群和/或可代表許多個(gè)體的標(biāo)記物。在一些例子中，表達(dá)的mRNA被翻譯成蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)可通過(guò)任何寬范圍的蛋白質(zhì)檢測(cè)方法檢測(cè)(如免疫測(cè)定、蛋白質(zhì)印記等等)。其他可被檢測(cè)的標(biāo)記物包括微RNA(microRNA)。在一些例子中，微RNA的表達(dá)水平可作為細(xì)胞群的標(biāo)記物，其中與類(lèi)似細(xì)胞群相比，該細(xì)胞群特定微RNA的表達(dá)增加或降低大約 1. 5,1. 6,1. 7,1. 8,1. 9,2. 0,2. 1,2. 2,2. 3,2. 4,2. 5,2. 6,2. 7,2. 8,2. 9,3. 0 或更多倍。細(xì)胞群和亞群中轉(zhuǎn)錄組的確定為了獲得關(guān)于通過(guò)本發(fā)明的任何方法(如從群中FACS分離細(xì)胞，隨后部分轉(zhuǎn)錄分析)分離的細(xì)胞的進(jìn)一步的信息，進(jìn)一步分析細(xì)胞是有利的。在某些例子中，從樣本中分離的單個(gè)的細(xì)胞(如通過(guò)個(gè)別細(xì)胞的分離，有或無(wú)事前富集)被裂解，收集目標(biāo)核酸(如基因組DNA、mRNA等等)。如本文中所述，基因或基因的組的轉(zhuǎn)錄分析可被用于將分離的細(xì)胞分類(lèi)成其表達(dá)概況表現(xiàn)相似性的組(如癌干細(xì)胞對(duì)非干細(xì)胞)。不局限于理論，這樣的信息表明功能的不同，因?yàn)榧?xì)胞轉(zhuǎn)錄的基因與其功能密切相關(guān)。一旦細(xì)胞被組織成類(lèi)似細(xì)胞的組(如表現(xiàn)相似或相同轉(zhuǎn)錄概況的那些細(xì)胞)，就可以進(jìn)一步在轉(zhuǎn)錄組水平上分析單個(gè)的細(xì)胞的裂解物和/或含有收集的類(lèi)似細(xì)胞的核酸的裂解物。在某些例子中，裂解物(單細(xì)胞或類(lèi)似細(xì)胞的集合)被用于方法學(xué)(如高通量測(cè)序)，以定義每個(gè)細(xì)胞和/或類(lèi)似細(xì)胞集合的轉(zhuǎn)錄組的部分。通過(guò)個(gè)別細(xì)胞的結(jié)果與其他類(lèi)似細(xì)胞的結(jié)果比較和/或組合，可以在群水平上分析來(lái)自個(gè)別細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組信息。也可以使用來(lái)自類(lèi)似細(xì)胞集合的轉(zhuǎn)錄組信息定義這樣的集合的轉(zhuǎn)錄特征?？梢砸赃@樣一種方法研究任何細(xì)胞群，例如包含干細(xì)胞的細(xì)胞群。在一些具體實(shí)施方案中，細(xì)胞包括干細(xì)胞，所述干細(xì)胞包括胚胎干細(xì)胞，包括但不局限于癌干細(xì)胞、造血干細(xì)胞(HSC)和間質(zhì)干細(xì)胞的成體干細(xì)胞，和誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞。通常，細(xì)胞群是異質(zhì)的群(如臨床樣本)?？梢愿鶕?jù)任何相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)(如表面蛋白質(zhì)的表達(dá))使用本文中的方法 (如FACS分類(lèi))分離較大細(xì)胞群中的目標(biāo)亞群。在一些具體實(shí)施方案中，區(qū)分這樣的被分類(lèi)的細(xì)胞，以使每個(gè)被分類(lèi)的群含有10個(gè)或更少的細(xì)胞，5個(gè)或更少的細(xì)胞，4個(gè)細(xì)胞，3個(gè)細(xì)胞，2個(gè)細(xì)胞或1個(gè)細(xì)胞。在某些具體實(shí)施方案中，裂解細(xì)胞并將其分成2個(gè)或更多個(gè)部分。進(jìn)一步分析裂解物的一部分(如分析一小組基因以檢測(cè)表達(dá))以檢測(cè)和/或區(qū)分較大異質(zhì)群中的亞群。 進(jìn)一步分析表明處于目標(biāo)亞群中的細(xì)胞(如造血干細(xì)胞)的裂解物?？梢苑治鰡蝹€(gè)的細(xì)胞的裂解物或來(lái)自類(lèi)似細(xì)胞的集合的裂解物?？苫?、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、 35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000 或更多個(gè)基因的表達(dá)相似性確定“類(lèi)似細(xì)胞”群?？蛇M(jìn)一步分析目標(biāo)細(xì)胞和細(xì)胞群或亞群。細(xì)胞群或亞群可包括含有原始樣本的部分的細(xì)胞，例如含有1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%或更多的原始樣本的細(xì)胞。通過(guò)使用本文中描述的方法，可從異質(zhì)性樣本中分離目標(biāo)細(xì)胞群或亞群，使得被分離的群或亞群可以不含 51%,52%,53%,54%,55%,56%,57%,58%,59%,60%,61%,62%, 63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%, 78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的不是目標(biāo)群或亞群的成員的細(xì)胞。由于是從原始群分離的細(xì)胞制備裂解物，可以通過(guò)從類(lèi)似細(xì)胞收集裂解物完成類(lèi)似細(xì)胞群的研細(xì)胞、群和/或亞群的進(jìn)一步分析可包括全轉(zhuǎn)錄組的分析。在一些例子中，裂解物包括為了分析而擴(kuò)增(如cDNA)或直接被分析(如mRNA測(cè)序、微列陣分析)的mRNA?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域中的任何已知方法進(jìn)行mRNA的擴(kuò)增(如體外轉(zhuǎn)錄、連接PCR cDNA擴(kuò)增)。在某些具體實(shí)施方案中，可在微流體儀中，或使用微流體儀進(jìn)行mRNA的擴(kuò)增?？赏ㄟ^(guò)測(cè)序平臺(tái)， 如可從 Illumina(RNAIeq)和 Helicos (Digital Gene Expression 或 “DGE”)商購(gòu)的那些測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組的分析。在某些具體實(shí)施方案中，測(cè)序目標(biāo)多核苷酸。可通過(guò)傳統(tǒng)的使用例如Sanger型測(cè)序的凝膠電泳為基礎(chǔ)的方法對(duì)目標(biāo)核酸測(cè)序。另外可選擇的，可通過(guò)使用一些“次世代”方法完成測(cè)序。這樣的“次世代”測(cè)序方法包括但不局限于商業(yè)提供的那些 l)454/Roche Lifescience，包括但不局限于在 Margulies 等人 Nature ^00 437 376-380 (2005)；和美國(guó)專(zhuān)利 Nos. 7，244，559 ；7，335，762 ；7，211，390 ；7，244，567 ； 7，264，929 ；7，323，305 中描述的方法和設(shè)備；2)Helicos Biosciences Corporation (Cambridge, ΜΑ)，如在美國(guó)申請(qǐng)系列 No. 11/167046 和美國(guó)專(zhuān)利 Nos. 7501245 ；7491498 ； 7，276，720 ；以及美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi) Nos. US20090061439 ；US20080087826 ；US20060286566 ；US20060024711 ；US20060024678 ；US20080213770 ；和 US20080103058 中描述的；3) Applied Biosystems (如 SOLiD 測(cè)序)；4) Dover Systems (如 Polonator G. 007 測(cè)序)；5) Illumina，如美國(guó)專(zhuān)利 Nos. 5，750，341 ；6，306，597 和 5，969，119 中描述的；以及 6) Pacific Biosciences,如美國(guó)專(zhuān)利 Nos. 7，462，452 ；7，476，504 ；7，405，281 ；7，170，050 ；7，462，468 ； 7, 476, 503 ；7, 315, 019 ；7, 302, 146 ；7, 313, 308 ；美國(guó)申請(qǐng)公開(kāi) Nos. US20090029385 ； US20090068655 ；US20090024331和US20080206764中所描述的。所有的文獻(xiàn)通過(guò)引用并入本文。這樣的方法和設(shè)備在此處以實(shí)施例的方式提供，但并不意味著限制。由于多個(gè)原因，可以進(jìn)行可以進(jìn)一步鑒定不同細(xì)胞亞群的全轉(zhuǎn)錄組分析，包括但不局限于1)檢測(cè)可以揭露亞群的獨(dú)特的生物學(xué)性質(zhì)的基因活性和/或調(diào)控其發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子；幻定位和/或鑒定可用于純化亞群的表面標(biāo)記物(如通過(guò)FACS分類(lèi))；和幻檢測(cè)和/或鑒定從綜合群中區(qū)分亞群(如癌干細(xì)胞對(duì)正常組織)的細(xì)胞基因和/或基因產(chǎn)物， 以作為疾病潛在的藥靶。群和/或亞群的分析(如通過(guò)轉(zhuǎn)錄組的分析)可允許細(xì)化分離屬于亞群的細(xì)胞的技術(shù)。例如，當(dāng)方法揭露了亞群特異的表面抗原時(shí)，可使用通過(guò)任何可獲得的抗體合成方法開(kāi)發(fā)的抗體從異質(zhì)性群中(如患者樣本)分離這樣的細(xì)胞。另外，可用轉(zhuǎn)錄組概況開(kāi)發(fā)可被用于從其他群(如來(lái)自相同或不同患者的樣本)鑒別細(xì)胞的基因表達(dá)組。診斷和預(yù)后本發(fā)明可用于任何病狀，包括癌、炎癥性疾病、自體免疫性疾病和感染的預(yù)防、治療、檢測(cè)或研究。癌的例子包括前列腺、胰腺、結(jié)腸、腦、肺、乳腺、骨和皮膚癌。炎癥性病狀的例子包括腸激惹綜合征和潰瘍性結(jié)腸炎。自體免疫性疾病的例子包括克羅恩病、狼瘡和格雷夫斯病。例如，本發(fā)明用于下列疾病的預(yù)防、治療、檢測(cè)或研究胃腸癌，如肛門(mén)、結(jié)腸、食道、膽囊、胃、肝和直腸的癌；生殖泌尿系癌如陰莖、前列腺和睪丸的癌；婦科的癌，如卵巢、宮頸、子宮內(nèi)膜、子宮、輸卵管、陰道和陰戶的癌；頭和頸的癌，如咽下的、喉的、口咽的癌，唇、嘴和口腔癌，唾液腺的癌，消化道的癌和竇癌；轉(zhuǎn)移癌；肉瘤；皮膚癌；尿道癌，包括膀胱、腎和尿道癌；內(nèi)分泌系統(tǒng)癌，如甲狀腺、垂體和腎上腺和胰島的癌；以及兒科的癌。本發(fā)明還提供了優(yōu)化治療的方法，其首先通過(guò)分類(lèi)樣本中的單獨(dú)的細(xì)胞，然后基于分類(lèi)的信息，選擇適當(dāng)?shù)寞煼?、劑量、治療模式等等，其?yōu)化了傳送抗增殖處理至非目的細(xì)胞的間的差別，同時(shí)降低了不需要的毒性。通過(guò)選擇減小不需要的毒性而同時(shí)提供有效的抗增殖活性的治療而優(yōu)化了治療。可選擇僅僅影響樣本中亞類(lèi)細(xì)胞的治療。在某些例子中，選擇影響樣本中少于大約5 %、少于大約1 %、少于大約0. 5 %、少于大約0. 2 %、少于大約0. 1%、少于大約0. 05%、少于大約0. 02%、少于大約0. 01%或更少的細(xì)胞的治療。病狀的標(biāo)記可以指在表明存在病狀的單細(xì)胞中的一個(gè)或多個(gè)基因或蛋白質(zhì)的表達(dá)模式。癌干細(xì)胞標(biāo)記指其表達(dá)為癌干細(xì)胞表現(xiàn)型指征的一個(gè)或多個(gè)基因和/或蛋白質(zhì)的表達(dá)模式。自體免疫或炎性細(xì)胞標(biāo)記指其表達(dá)為自體免疫或炎性細(xì)胞標(biāo)記指征的基因和/ 或蛋白質(zhì)。標(biāo)記可以從全部或部分資料組獲得，通常標(biāo)記包括來(lái)自至少大約5個(gè)基因和/ 或蛋白質(zhì)、至少大約10個(gè)基因和/或蛋白質(zhì)、至少大約15個(gè)基因和/或蛋白質(zhì)、至少大約 20個(gè)基因和/或蛋白質(zhì)、至少大約25個(gè)基因和/或蛋白質(zhì)、至少大約50個(gè)基因和/或蛋白質(zhì)、至少大約75個(gè)基因和/或蛋白質(zhì)、至少大約100個(gè)基因和/或蛋白質(zhì)、至少大約150 個(gè)基因和/或蛋白質(zhì)、至少大約200個(gè)基因和/或蛋白質(zhì)、至少大約300個(gè)基因和/或蛋白質(zhì)、至少大約400個(gè)基因和/或蛋白質(zhì)、至少大約500個(gè)基因和/或蛋白質(zhì)或更多個(gè)基因和 /或蛋白質(zhì)的基因和/或蛋白質(zhì)的表達(dá)信息。當(dāng)使用資料組的亞類(lèi)時(shí)，亞類(lèi)可以包括上調(diào)的基因、下調(diào)的基因或其組合。患者樣本的臨床應(yīng)用分析盡管下面的描述主要聚焦于癌干細(xì)胞，本文描述的方法可被用于分離和/或分析任何細(xì)胞群，包括但不局限于任何組織的正常細(xì)胞(如正常干細(xì)胞、正常祖細(xì)胞和正常的成熟細(xì)胞)、病毒感染的細(xì)胞、炎癥性細(xì)胞、祖細(xì)胞、癌細(xì)胞(如致癌細(xì)胞、非致癌細(xì)胞、癌干細(xì)胞和分化的癌細(xì)胞)、疾病狀態(tài)細(xì)胞(如癌細(xì)胞、炎癥性腸疾病細(xì)胞、潰瘍性結(jié)腸炎細(xì)胞等)、微生物(細(xì)菌、真菌、原生生物)細(xì)胞等。因此，提供的使用癌干細(xì)胞(CSC)的細(xì)節(jié)是可對(duì)任何疾病狀態(tài)或病狀進(jìn)行的分析的舉例。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，患者樣本中CSC的數(shù)量可相對(duì)于癌細(xì)胞總數(shù)而確定。例如，分離來(lái)自活組織檢查樣本的細(xì)胞，分析作為癌細(xì)胞的指征的一個(gè)或多個(gè)mRNA 和/或蛋白質(zhì)的表達(dá)并定量表現(xiàn)了 CSC表現(xiàn)型的細(xì)胞。另外可選擇地，收集到的特定的CSC 群或亞群的數(shù)據(jù)可被用于開(kāi)發(fā)群或亞群的親和性(如抗體)篩選，并且這樣的親和性篩選可被用于定量細(xì)胞的數(shù)量。典型地，較大的CSC百分比指示具有癌表現(xiàn)型的細(xì)胞的持續(xù)自我更新的潛能?？杀容^患者樣本中的CSC數(shù)量與陽(yáng)性和/或陰性參照樣本，如患者樣本如血液樣本、緩和期患者樣本等等。在一些具體實(shí)施方案中，在治療期間定量CSC，其中癌細(xì)胞數(shù)和這樣的CSC細(xì)胞的百分比在治療過(guò)程之前、期間或隨后定量。合乎需要的，靶向癌干細(xì)胞的治療導(dǎo)致患者樣本中CSC總數(shù)和/或百分比的降低?？赏ㄟ^(guò)其與特定標(biāo)記物相關(guān)的表現(xiàn)型和/或其功能的表現(xiàn)型鑒別CSC。在一些具體實(shí)施方案中，通過(guò)將細(xì)胞結(jié)合至對(duì)目標(biāo)標(biāo)記物特異的試劑鑒別和/或分離CSC。待分析的細(xì)胞可以是有活力的細(xì)胞，或可以是被固定或被包埋的細(xì)胞。患者樣本中CSC的存在可以是癌(如白血病、乳腺癌、前列腺癌)階段的指征。另外，CSC的檢測(cè)可被用于監(jiān)控對(duì)治療的反應(yīng)以及輔助預(yù)后?？赏ㄟ^(guò)定量具有干細(xì)胞表現(xiàn)型的細(xì)胞確定CSC的存在。除了細(xì)胞表面表現(xiàn)型的測(cè)定外，定量樣本中具有“干細(xì)胞”特征的細(xì)胞可是很有用的，其可通過(guò)功能標(biāo)準(zhǔn)被確定，如自我更新能力、體內(nèi)生成腫瘤的能力，如在異種移植模型中等等。用于本發(fā)明方法中的臨床樣本可從多種來(lái)源獲得，特別是血液，盡管在一些例子中，可以使用如骨髓、淋巴、腦脊液、滑液等等的樣本。樣本可包括活組織檢查樣本，或含有細(xì)胞的其他臨床樣本。一些樣本包括實(shí)體瘤或其部分。在分析細(xì)胞團(tuán)的情況下，可通過(guò)本領(lǐng)域已知的適當(dāng)?shù)姆椒?如酶消化、物理分離)分離這樣的細(xì)胞團(tuán)?？赏ㄟ^(guò)離心、沖洗、密度分級(jí)分離、血漿分離置換法、親和性選擇、淘選、FACS、用Hypaque離心等等在分析前分離這樣的樣本，通常使用單核部分(PBMC)。以這種方式，可如本文中所述的分析來(lái)自樣本(如實(shí)體瘤)的單個(gè)細(xì)胞的差異基因表達(dá)和/或轉(zhuǎn)錄組分析。一旦得到樣本，其可被直接應(yīng)用、冰凍或短時(shí)間的維持在恰當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中?？墒褂枚喾N培養(yǎng)基來(lái)維持細(xì)胞?？赏ㄟ^(guò)任何合宜的程序獲得樣本，如活組織檢查、抽血、靜脈穿刺等等。在一些具體實(shí)施方案中，樣本將包括至少大約IO2個(gè)細(xì)胞，更通常的至少大約103、 IO4UO5或更多的細(xì)胞。典型地，樣本來(lái)自人類(lèi)患者，盡管可以使用動(dòng)物模型，如馬科、牛族、 豬、犬科、貓科、嚙齒目如小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠、靈長(zhǎng)目動(dòng)物等等。
可以使用適當(dāng)?shù)娜芤悍稚⒒驊腋〖?xì)胞樣本。這樣的溶液通常是平衡鹽溶液，如正常鹽水、PBS、Hank氏平衡鹽溶液，等等，方便地添加了胎牛血清或其他天然存在的因子，以及低濃度的可接受的緩沖液，通常濃度為5-25mM。合宜的緩沖液包括HEPES、磷酸緩沖液、 乳酸鹽緩沖液等。可使用傳統(tǒng)的方法進(jìn)行細(xì)胞染色分析。提供精確的計(jì)數(shù)的技術(shù)包括熒光活化細(xì)胞分揀器，其具有變化程度的摻雜，如多顏色頻道(multiple color channel)、低角度和鈍頭光散射檢測(cè)頻道、阻抗頻道等。通過(guò)使用與死亡細(xì)胞相關(guān)的染料(如碘化丙啶)針對(duì)死亡細(xì)胞選擇細(xì)胞。親和性試劑可以是上述細(xì)胞表面分子的特異受體或配體。除抗體試劑外，可以使用肽-MHC抗原和T細(xì)胞受體對(duì)；肽配體和受體；效應(yīng)器和受體分子等?？贵w和T細(xì)胞受體可以是單克隆或多克隆的，且可以通過(guò)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、被免疫的動(dòng)物、永生化的人或動(dòng)物B細(xì)胞、用編碼抗體或T細(xì)胞受體的DNA載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞等產(chǎn)生?？贵w制備的細(xì)節(jié)和其用作特異結(jié)合成員的合適性是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。一個(gè)方法是使用抗體作為親和性試劑。方便地，這些抗體可與分離使用的標(biāo)記結(jié)合。標(biāo)記包括任何本領(lǐng)域已知的任何標(biāo)記，包括但不局限于允許直接分離的磁珠、可用結(jié)合至支撐物的抗生物素蛋白或抗生物素蛋白鏈菌素除去的生物素、可與熒光活化細(xì)胞分揀器使用的熒光染料等等，以允許方便地進(jìn)行特定細(xì)胞類(lèi)型的分離。有用的熒光染料包括藻膽蛋白，如藻紅蛋白和藻藍(lán)蛋白，熒光素和德克薩斯紅。經(jīng)常用不同的熒光染料標(biāo)記每一個(gè)抗體，以允許對(duì)于每種標(biāo)記物的獨(dú)立分揀?？蓪⒖贵w加入細(xì)胞懸液中，孵育足以結(jié)合可利用的細(xì)胞表面抗原的一段時(shí)間。孵育通常至少大約5分鐘，且通常少于大約30分鐘。希望反應(yīng)混合物中具有足夠的抗體濃度， 使得分離的效率不受缺少抗體的限制。通過(guò)滴定確定適當(dāng)?shù)臐舛取＜?xì)胞在其中被分離的介質(zhì)是任何可維持細(xì)胞生活力的介質(zhì)?？杀焕玫囊环N培養(yǎng)基是含有0. 1%至0. 5% BSA的磷酸緩沖鹽水?？缮藤?gòu)到各種培養(yǎng)基，并根據(jù)細(xì)胞的性質(zhì)使用，包括Dulbecco' s Modified Eagle培養(yǎng)基(dMEM)、Hank，S基礎(chǔ)鹽溶液(HESS) ,Dulbecco' s磷酸鹽緩沖的鹽水(dPBS)、 RPMI、Iscove' s介質(zhì)、含有5mMEDTA的PBS等，通常補(bǔ)充有胎牛血清、BSA、HSA等。然后可根據(jù)如上所述的細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)定量標(biāo)記的細(xì)胞?？赏ㄟ^(guò)使用恰當(dāng)?shù)难堇[方案、AI系統(tǒng)、統(tǒng)計(jì)比較等完成獲自患者樣本的示差祖細(xì)胞分析(differential progenitor analysis)和參照的示差祖細(xì)胞分析的比較。來(lái)自正常細(xì)胞、來(lái)自相似疾病組織的細(xì)胞等的參照的示差祖細(xì)胞分析的比較可提供疾病階段的指示?？删庉媴⒄盏氖静钭婕?xì)胞分析的數(shù)據(jù)庫(kù)。特別的感興趣的分析追蹤如處于疾病的慢性期和前白血病階段的患者，以便在早期階段觀察到疾病的加速。本發(fā)明的方法通過(guò)臨床癥狀發(fā)生前加速的檢測(cè)，從而允許進(jìn)行早期治療干預(yù)，如啟動(dòng)化療、增加化療劑量、改變化療藥物的選擇等。腫瘤分類(lèi)和患者分層還提供了優(yōu)化治療的方法，其通過(guò)首先分類(lèi)，并且基于該信息選擇恰當(dāng)?shù)寞煼?、劑量、治療模式等，其?yōu)化了傳遞抗增殖治療至不期望的靶細(xì)胞間的差異，同時(shí)減小了不期望的毒性。通過(guò)選擇減小不期望的毒性同時(shí)提供有效的抗增殖活性的治療來(lái)優(yōu)化治療。在一個(gè)方面，本公開(kāi)提供了分類(lèi)損傷如腫瘤損傷、免疫紊亂樣本等的方法，因此根據(jù)單細(xì)胞(包括CSC)基因表達(dá)標(biāo)記將患者分組或“分層”。例如，被分類(lèi)為具有高的癌干細(xì)胞百分比的腫瘤具有更高的轉(zhuǎn)移和死亡風(fēng)險(xiǎn)，因而可以比更良性類(lèi)型的腫瘤更有攻勢(shì)地對(duì)其進(jìn)行治療。因此，患者樣本中存在的群或亞群的分析可被用于鑒別疾病狀態(tài)、監(jiān)控治療模式和/或開(kāi)發(fā)治療方法?？扇缟纤龇诸?lèi)用于臨床試驗(yàn)的潛在患者收集物中的每一個(gè)患者的樣本。然后可以選擇具有相似分類(lèi)的損傷的患者使其參與其中需要異質(zhì)性患者群的治療的調(diào)查或臨床試驗(yàn)?？蓪⒒颊叩姆诸?lèi)用于評(píng)估異質(zhì)性患者群中治療的有效性。因此，比較個(gè)體的表達(dá)概況和群的概況的疾病分類(lèi)可允許選擇或設(shè)計(jì)期望對(duì)特定患者或患者群(即具有相同類(lèi)型癌的患者組)的安全有效的藥物或其他治療模式?？梢曰?、2、3、4、5、6、7、8、9，10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19，20、25、30、35、40、45、50或更多核酸和/或蛋白質(zhì)的表達(dá)(或其缺少)進(jìn)行分類(lèi)。診斷、預(yù)后、治療評(píng)估(Therametrics)和失調(diào)處理本文中描述的分類(lèi)方法以及其基因產(chǎn)物和相應(yīng)的基因和基因產(chǎn)物對(duì)作為可檢測(cè)疾病途徑(如致癌途徑、炎癥途徑等)的最早期變化，和/或監(jiān)控各種治療和預(yù)防干預(yù)的效力的遺傳或生物化學(xué)標(biāo)記物(如在血液或組織中)具有特別的意義。分期是被醫(yī)生用來(lái)描述患者中癌狀態(tài)是如何進(jìn)展的方法。分期幫助醫(yī)生確定預(yù)后、計(jì)劃治療以及評(píng)估這樣的治療的結(jié)果。癌類(lèi)型不同，分期系統(tǒng)也不同，但其通常涉及以下的“ M”系統(tǒng)癌類(lèi)型，用T代表；癌是否轉(zhuǎn)移到附近的淋巴結(jié)，用N代表；癌是否轉(zhuǎn)移到身體的更遠(yuǎn)的部位，用M代表。一般而言，如果癌僅在初期損傷區(qū)被檢測(cè)到，而沒(méi)有傳播到任何淋巴結(jié)，被稱為I期。如果僅傳播到最近的淋巴結(jié)，被稱為II期。在III期，癌通常傳播到在接近初期損傷位點(diǎn)的近端中的淋巴結(jié)。已經(jīng)傳播到身體遠(yuǎn)處部分，如肝、骨、腦或其他部位的癌稱為IV期，是最晚期的一種。本文中描述的方法可通過(guò)鑒別癌的進(jìn)攻性，如轉(zhuǎn)移的潛能以及身體不同區(qū)域的存在有助于細(xì)調(diào)分期的方法。因此，可利用具有標(biāo)記高轉(zhuǎn)移潛能癌的分類(lèi)的II期癌將邊界II 期腫瘤變?yōu)镮II期腫瘤，調(diào)整更有攻勢(shì)的治療。相反地，標(biāo)記低轉(zhuǎn)移潛能的多核苷酸的存在允許更保守的腫瘤分期。例如，通過(guò)本文所述的方法分析來(lái)自II期患者的乳腺癌活組織檢查樣本。乳腺癌可能被依據(jù)從患者細(xì)胞確定的表達(dá)概況分類(lèi)為具有高轉(zhuǎn)移潛能。因此，治病的醫(yī)生可利用這樣的信息，比他或她沒(méi)有獲得進(jìn)一步的分類(lèi)時(shí)更有進(jìn)攻性地治療患者。特定標(biāo)記物表達(dá)的確定還可以提供藥物治療潛在靶點(diǎn)的信息(如來(lái)自表達(dá)藥物靶點(diǎn)的患者的致癌細(xì)胞)。治療方法的開(kāi)發(fā)和鑒別本文中描述的方法和組合物可被用于新的治療劑的開(kāi)發(fā)或鑒別和/或細(xì)化現(xiàn)存的療法。例如，通過(guò)使用單細(xì)胞分析，可分析靶細(xì)胞群(如癌干細(xì)胞、癌干細(xì)胞和分化的癌細(xì)胞、或分化的癌細(xì)胞)的表達(dá)概況，以檢測(cè)治療劑的潛在靶點(diǎn)。潛在的靶點(diǎn)包括但不局限于特定的生物標(biāo)記物和錯(cuò)誤調(diào)節(jié)的途徑。目標(biāo)靶點(diǎn)可以包括目標(biāo)細(xì)胞群特異的標(biāo)記物或途徑。在一個(gè)例子中，可如本文中描述的分析目標(biāo)群或亞群細(xì)胞的核酸表達(dá)，以檢測(cè)可以是治療靶向的新的生物標(biāo)記物。例如，在癌干細(xì)胞和/或分化的癌細(xì)胞中廣泛表達(dá)的特定細(xì)胞表面分子可研究作為潛在治療劑(如抗體或其他結(jié)合部分-潛在地與毒素或其他此類(lèi)效應(yīng)物連接-具有對(duì)表面分子的特異性)的靶點(diǎn)。在其他的例子中，可分析靶細(xì)胞群的涉及疾病過(guò)程的錯(cuò)誤調(diào)節(jié)的途徑(如癌細(xì)胞中丟失細(xì)胞周期機(jī)制的調(diào)控)。途徑包括但不局限于基因表達(dá)的激活子和/或抑制子，特定的基因和/或基因的組的表達(dá)以及更復(fù)雜的總體的途徑。靶向這樣的錯(cuò)誤調(diào)節(jié)的治療劑可潛在地影響靶細(xì)胞，以改變與靶細(xì)胞相關(guān)的核酸的表達(dá)。治療劑誘導(dǎo)的改變的表達(dá)可導(dǎo)致核酸的上調(diào)或下調(diào)。在某些例子中，用一個(gè)或多個(gè)治療劑的細(xì)胞和/或受試者的治療可引起類(lèi)似非疾病狀態(tài)細(xì)胞中表達(dá)的核酸的表達(dá)(如治療引起類(lèi)似非致癌細(xì)胞中細(xì)胞周期相關(guān)的基因的表達(dá))。通過(guò)使用本文中描述的方法和組合物，可以分析靶細(xì)胞群一個(gè)或多個(gè)核酸改變的表達(dá)。新的和/或細(xì)化的治療劑的開(kāi)發(fā)可包括分析靶細(xì)胞群(如結(jié)腸癌干細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞等)，以確定與“正常”細(xì)胞相比顯示改變的表達(dá)概況的核酸。可通過(guò)將分離的靶細(xì)胞群暴露于候選制劑并檢測(cè)暴露后的基因的改變的表達(dá)，利用這樣的細(xì)胞篩選影響這些和/或其他核酸表達(dá)的潛在治療劑。利用本文描述的方法分析影響某些細(xì)胞表現(xiàn)型的化合物的效果，包括但不局限于基因表達(dá)、途徑功能(如細(xì)胞周期、TERT途徑、氧化應(yīng)激途徑)，和或細(xì)胞類(lèi)型或形態(tài)學(xué)。因此，除了或替代分析化合物作為治療劑的潛能，還可以分析影響這樣的表現(xiàn)型特征的化合物。例如，可進(jìn)行暴露于一個(gè)或多個(gè)試驗(yàn)化合物的靶群(如正常結(jié)腸細(xì)胞、正常乳腺細(xì)胞、 癌細(xì)胞、干細(xì)胞、癌干細(xì)胞等)中基因表達(dá)的改變的分析，以分析試驗(yàn)化合物對(duì)基因表達(dá)或其他所需表現(xiàn)型(如標(biāo)記物表達(dá)、細(xì)胞生命力)的影響。這樣的分析對(duì)多種目的是有用的， 例如細(xì)胞周期研究或已知或未知途徑的分析。待分析其潛在治療價(jià)值的制劑可以是任何化合物，小分子，蛋白質(zhì)，脂質(zhì)，碳水化合物，核酸或其他適于治療應(yīng)用的制劑。可將分離的靶群細(xì)胞暴露于潛在治療劑的庫(kù)(如抗體庫(kù)、小分子庫(kù))，以確定其對(duì)基因表達(dá)和/或細(xì)胞生命力的影響。在某些例子中，候選治療劑將特異地靶向目標(biāo)細(xì)胞群。例如，經(jīng)由單細(xì)胞分析，揭露了存在于靶細(xì)胞(如癌干細(xì)胞和/或分化的癌細(xì)胞)中的突變的存在，一種候選治療劑可靶向該突變。在某些例子中，可將處理的細(xì)胞暴露于單細(xì)胞分析，以確定候選治療劑對(duì)一個(gè)或多個(gè)目標(biāo)基因表達(dá)的效果和 /或?qū)D(zhuǎn)錄組的效果。在本發(fā)明的其他具體實(shí)施方案中，通過(guò)特異地結(jié)合靶群或亞群上存在的標(biāo)記物或標(biāo)記物組合，制劑被靶向疾病狀態(tài)細(xì)胞群或亞群。在某些具體實(shí)施方案中，制劑包括標(biāo)記物或標(biāo)記物組合特異的抗體或其抗原結(jié)合衍生物，任選地其與細(xì)胞毒部分連接?？捎眠@樣的方法排除患者中的靶群或亞群(如排除癌干細(xì)胞群)。治療劑篩選分析表達(dá)標(biāo)記物或標(biāo)記物組合的細(xì)胞(如疾病狀態(tài)細(xì)胞)可被用于體外分析和篩選， 以檢測(cè)對(duì)分化的癌細(xì)胞和/或癌干細(xì)胞有活性的因子和化療制劑。特別感興趣的是對(duì)人細(xì)胞有活性的制劑的篩選分析。大量的分析可用于此目的，包括用于蛋白質(zhì)結(jié)合的免疫分析；細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和功能活性的確定；因子的產(chǎn)生；等等(參見(jiàn)，如Balis“2002)J Nat'1 Cancer Inst 94 :2 ;78)。在其他的具體實(shí)施方案中，對(duì)應(yīng)于本發(fā)明的標(biāo)記物和標(biāo)記物組合的分離的多核苷酸被用于藥物篩選分析中。在生物活性制劑、抗增殖藥物等的篩選分析中，標(biāo)記物或靶細(xì)胞組合物與目標(biāo)制劑接觸，通過(guò)監(jiān)控細(xì)胞上的如標(biāo)記物的表達(dá)、細(xì)胞的生命力等輸出參數(shù)評(píng)價(jià)制劑的效果；或結(jié)合效果或?qū)Χ嚯牡拿笇W(xué)的或受體活性的效力。例如，已知具有“癌干細(xì)胞”表達(dá)概況的乳腺癌細(xì)胞組合物被暴露于試驗(yàn)制劑并且如本文中所述的方法單獨(dú)地分析被暴露的細(xì)胞，以確定與未治療的細(xì)胞相比試驗(yàn)制劑是否改變了表達(dá)概況。本文中描述的或通過(guò)本文中描述的方法產(chǎn)生的任何分離的細(xì)胞群可被新鮮地分離、培養(yǎng)、遺傳改變等。細(xì)胞可以是環(huán)境誘導(dǎo)的克隆培養(yǎng)的變體如，分開(kāi)成獨(dú)立的培養(yǎng)物并在不同的條件下生長(zhǎng)，例如具有或不具有藥物；存在或不存在細(xì)胞因子或其組合物。細(xì)胞對(duì)制劑(如肽、siRNA、小分子等)，特別是藥學(xué)制劑的反應(yīng)方式(包括反應(yīng)時(shí)限)是細(xì)胞生理狀態(tài)的重要反映。參數(shù)是可以定量的細(xì)胞成分，特別是例如在高通量系統(tǒng)中可精確測(cè)量的成分。參數(shù)可以是任何細(xì)胞成分或細(xì)胞產(chǎn)物，其包括細(xì)胞表面決定簇、受體、蛋白質(zhì)或其構(gòu)象的或翻譯后的修飾物、脂質(zhì)、碳水化合物、有機(jī)的或無(wú)機(jī)的分子、如mRNA或DNA等的核酸，或衍生于這樣的細(xì)胞成分或其組合物的部分。例如，在一個(gè)具體實(shí)施方案中，如本文中描述的分離的細(xì)胞與一個(gè)或多個(gè)制劑接觸，并確定目標(biāo)核酸的表達(dá)水平?？蛇M(jìn)一步分析改變檢測(cè)的核酸表達(dá)的制劑的治療潛力，例如其中細(xì)胞顯示出與非疾病狀態(tài)細(xì)胞更相似的表達(dá)模式。盡管大多數(shù)參數(shù)(如mRNA或蛋白質(zhì)的表達(dá))提供了定量的讀出，在一些例子中，可接受半定量或定性的結(jié)果。讀出可包括單一確定的數(shù)值，或可包括平均值、中間值或偏差值等等。典型地，從相同分析的多重態(tài)獲得每一參數(shù)的參數(shù)讀出數(shù)值的范圍?？勺冃允穷A(yù)期的，通過(guò)使用帶有用于提供單一數(shù)值的普通統(tǒng)計(jì)方法的標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法獲得試驗(yàn)參數(shù)組的每一個(gè)的數(shù)值范圍。用于篩選的目標(biāo)試劑包括包含多種化學(xué)類(lèi)別的已知的或未知的化合物，主要是有機(jī)物分子，其可包括有機(jī)金屬的分子、遺傳序列等。本發(fā)明的一個(gè)重要方面是評(píng)估候選藥物，包括毒性試驗(yàn)等。除了復(fù)雜的生物制劑，候選制劑包括含有結(jié)構(gòu)反應(yīng)必須的功能基團(tuán)的有機(jī)分子， 所述功能基團(tuán)特別是氫鍵，且典型地包括至少一個(gè)胺基、羰基、羥基或羧基，經(jīng)常是至少兩個(gè)功能性的化學(xué)基團(tuán)。候選制劑可以包括碳環(huán)或雜環(huán)結(jié)構(gòu)和/或具有一個(gè)或多個(gè)上述功能基團(tuán)取代的芳香族的或多芳香族的結(jié)構(gòu)。候選制劑還可以被發(fā)現(xiàn)在生物分子中，包括肽、多核苷酸、糖類(lèi)、脂肪酸、類(lèi)固醇、嘌呤、嘧啶，或其衍生物、結(jié)構(gòu)類(lèi)似物或組合物。在一些例子中，試驗(yàn)化合物可以具有已知的功能(如減輕氧化應(yīng)激)，但其可通過(guò)未知的機(jī)制起作用或作用于未知的靶點(diǎn)。包括具有藥學(xué)活性的藥物，遺傳活性的分子等。目標(biāo)化合物包括化療制劑、激素或激素拮抗劑等。適于本發(fā)明的藥物制劑的例子是如下描述的那些"The Pharmacological Basis of Therapeutics, " Goodman禾口Gilman,McGraw_Hi 11,New York,New York, (1996), 第九版，在Water, Salts and Ions ；Drugs Affecting Renal Function and Electrolyte Metabolism ；Drugs Affecting Gastrointestinal Function ；Chemotherapy of Microbial Diseases ；Chemotherapy of Neoplastic Diseases ；Dlugs Acting on Blood-Folming organs ；Hormones and Holmone Antagonists ;Vitamins, Dermatology ；禾口 Toxicology 章， 上述所有內(nèi)容通過(guò)引用并入本文。還包括毒素和生物的和化學(xué)的戰(zhàn)劑(warfare agent)，例如參見(jiàn) Somani :S. Μ. (Ed. ), “ Chemical Warfare Agents, " Academic Press, New York, 1992)。試驗(yàn)化合物包括上述所有類(lèi)的分子，且可進(jìn)一步包括未知內(nèi)容的樣本。目標(biāo)是獲自天然來(lái)源如植物、真菌、細(xì)菌、原生生物或動(dòng)物的天然存在的化合物的復(fù)雜混合物。盡管許多樣本包括溶液中的化合物，也可以分析可溶于適當(dāng)溶劑中的固體樣本。目標(biāo)樣本包括如地下水、海水、礦泉水等的環(huán)境樣本，如由谷物、組織樣本等制備的裂解物的生物樣本；如在藥物制備期間的時(shí)程中的制備期間樣本；以及為分析制備的化合物庫(kù)；等等(如被分析潛在治療價(jià)值的化合物，即藥物候選)。樣本或化合物還可以包括另外的成分，例如，影響離子強(qiáng)度、pH、總蛋白質(zhì)濃度等的成分。另外，可處理樣本以實(shí)現(xiàn)至少部分分級(jí)或濃縮。如果在意要降低化合物的降解，可將生物樣本儲(chǔ)存在如氮、冰凍或其組合的條件下。使用的樣本容積足以允許可測(cè)量的檢測(cè)， 如從大約0. Iml至Iml的生物樣本是足夠的。包括候選制劑的化合物可獲自很廣泛的來(lái)源，包括合成的或天然的化合物的庫(kù)。 例如，存在許多方法來(lái)隨機(jī)的和定向地合成大量有機(jī)化合物，包括生物分子，包括隨機(jī)化的寡核苷酸和寡肽的表達(dá)。另外可選擇地，細(xì)菌、真菌、植物和動(dòng)物提取物形式的天然化合物的庫(kù)是可獲得的或容易制備的。另外，可以容易地通過(guò)傳統(tǒng)的化學(xué)、物理和生物化學(xué)方式修飾天然的或合成產(chǎn)生的庫(kù)和化合物，且可被用于生成組合庫(kù)?？蓪?duì)已知的藥物制劑進(jìn)行定向的或隨機(jī)的化學(xué)修飾，如?；?、烷化、酯化、酰胺化等，以生成結(jié)構(gòu)類(lèi)似物。通過(guò)將制劑加入至少一個(gè)和通常多個(gè)細(xì)胞樣本篩選制劑的生物活性，通常與缺少制劑的細(xì)胞結(jié)合。測(cè)量對(duì)制劑反應(yīng)的參數(shù)的變化，并且通過(guò)與如在存在和不存在制劑時(shí)，用其他制劑獲得的等等參照培養(yǎng)物比較來(lái)評(píng)估結(jié)果。制劑可以以溶液或速溶形式加入到培養(yǎng)中的細(xì)胞培養(yǎng)基中。制劑可以細(xì)流、間斷的或連續(xù)的加入流通(flow-through)系統(tǒng)，或另外可選擇地，單一地或遞增地向另外的靜態(tài)溶液添加化合物彈丸。在流通系統(tǒng)中，使用兩種流體，其中一個(gè)是生理中性溶液，另一個(gè)是加入了測(cè)試化合物的相同溶液。第一種流體通過(guò)細(xì)胞，隨后是第二種流體。在單一溶液的方法中，將測(cè)試化合物彈丸加入到圍繞細(xì)胞的培養(yǎng)基的容積中。培養(yǎng)介質(zhì)組分的總濃度在加入彈丸時(shí)不應(yīng)當(dāng)有顯著的改變，或者在流通方法中在兩溶液之間。一些制劑的配方不包括額外的成分，如可顯著影響總配方的防腐劑。因此，這樣的配方基本上由生物活性化合物和生理上可接受的載體如水、醇、DMSO等組成?？墒牵绻衔锸遣痪呷軇┑囊后w，配方可基本上由化合物本身組成。可以以不同的制劑濃度平行地進(jìn)行多個(gè)分析，以得到對(duì)不同濃度的不同反應(yīng)。如本領(lǐng)域已知的，確定制劑的有效濃度典型地使用來(lái)自1 10或其他對(duì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)稀釋得到的濃度范圍。如果需要，用第二系列的稀釋進(jìn)一步細(xì)化濃度。典型地，這些濃度之一作為陰性對(duì)照，即0濃度或低于制劑的檢測(cè)水平或在或低于不能引起表現(xiàn)型可檢測(cè)的變化的制劑濃度。可利用多種方法定量存在的選定標(biāo)記物。為了測(cè)定存在的分子的量，傳統(tǒng)的方法是用可檢測(cè)的部分標(biāo)記分子，該可檢測(cè)的部分可以是熒光的、發(fā)光的、放射活性的、酶活性的等，特別是特異地結(jié)合具有高親和性參數(shù)的分子。熒光部分是容易獲得的用于實(shí)際上標(biāo)記任何生物分子、結(jié)構(gòu)或細(xì)胞類(lèi)型。免疫熒光部分不僅僅定向結(jié)合特異的蛋白質(zhì)，還結(jié)合特異的構(gòu)象體、切割產(chǎn)物或如磷酸化的位點(diǎn)修飾物。如通過(guò)使其作為綠色熒光蛋白嵌合體在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)(綜述參見(jiàn)Jones等人(1999)Trends Biotechnol 17(12) :477-81)，可將單個(gè)的肽和蛋白質(zhì)工程化為自體熒光。因此，可遺傳修飾抗體以提供作為其結(jié)構(gòu)部分的熒光染料。依賴于選擇的標(biāo)記，可通過(guò)使用熒光標(biāo)記外的物質(zhì)，使用如放射免疫分析(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附分析 (ELISA)的免疫分析技術(shù)，同源酶免疫分析，以及相關(guān)的非酶技術(shù)測(cè)量參數(shù)。核酸，特別是信使RNA的定量也有興趣作為參數(shù)。這些可通過(guò)依賴于核酸核苷序列的雜交技術(shù)測(cè)量。技術(shù)包括聚合酶鏈反應(yīng)以及基因列陣技術(shù)。參見(jiàn),例如Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel 等人編，John Wiley & Sons，New York, NY, 2000 ；Freeman 等人(1999) Biotechniques 26(1) :112-225 ；Kawamoto φ Λ (1999)Genome Res 9 (12) : 1305—12 ；禾口 Chen 等人(1998)Genomics 51(3) :313_24。表汰概況的數(shù)據(jù)庫(kù)和數(shù)據(jù)分析本發(fā)明還提供了癌干細(xì)胞和其他細(xì)胞類(lèi)型基因表達(dá)概況的數(shù)據(jù)庫(kù)及其應(yīng)用。典型地，這樣的數(shù)據(jù)庫(kù)包括來(lái)自多種細(xì)胞亞群的表達(dá)概況，所述細(xì)胞亞群如癌干細(xì)胞、癌非干細(xì)胞、癌細(xì)胞對(duì)應(yīng)的正常部分、疾病狀態(tài)細(xì)胞(如炎癥性腸細(xì)胞、潰瘍性結(jié)腸炎細(xì)胞)、病毒感染的細(xì)胞、早期祖細(xì)胞、初始分化的祖細(xì)胞、后期分化的祖細(xì)胞以及成熟細(xì)胞?？梢砸远喾N介質(zhì)提供表達(dá)概況及其數(shù)據(jù)庫(kù)以輔助其應(yīng)用?！敖橘|(zhì)”指含有本發(fā)明的表達(dá)概況信息的產(chǎn)品。本發(fā)明的數(shù)據(jù)庫(kù)可被記錄在計(jì)算機(jī)可讀的介質(zhì)，如任何可被計(jì)算機(jī)讀取并直接進(jìn)入的介質(zhì)。這樣的介質(zhì)包括但不局限于磁性存儲(chǔ)介質(zhì)，如軟盤(pán)、硬盤(pán)存儲(chǔ)介質(zhì)和磁帶；光存儲(chǔ)介質(zhì)，如CD-ROM ；電存儲(chǔ)介質(zhì)如RAM和ROM ；及這些類(lèi)別的雜合，如磁/光存儲(chǔ)介質(zhì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地理解如何使用任何已存在的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)來(lái)生成含有本發(fā)明數(shù)據(jù)庫(kù)信息錄制物的產(chǎn)品?！颁浿啤敝甘褂萌魏伪绢I(lǐng)域已知的這樣的方法，將信息存儲(chǔ)在計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)的方法?？梢曰谟糜谶M(jìn)入存儲(chǔ)信息的手段選擇任何合宜的數(shù)據(jù)存儲(chǔ)結(jié)構(gòu)。多種數(shù)據(jù)處理程序和格式可被用于存儲(chǔ)，如word處理的文本文件、數(shù)據(jù)庫(kù)格式等。如本文中所用，“基于計(jì)算機(jī)的系統(tǒng)”指用于分析本發(fā)明信息的硬件設(shè)備、軟件設(shè)備和數(shù)據(jù)存儲(chǔ)設(shè)備。本發(fā)明的基于計(jì)算機(jī)的系統(tǒng)的最小的硬件包括中央處理器(CPU)、輸入設(shè)備、輸出設(shè)備和數(shù)據(jù)存儲(chǔ)設(shè)備。本領(lǐng)域技術(shù)人員能容易地理解任何目前可獲得的基于計(jì)算機(jī)的系統(tǒng)均適用于本發(fā)明。數(shù)據(jù)存儲(chǔ)設(shè)備可以包括任何包含如上所述的本發(fā)明信息的錄制物的產(chǎn)品，或可進(jìn)入此產(chǎn)品的內(nèi)存訪問(wèn)設(shè)備。輸入和輸出設(shè)備的多種結(jié)構(gòu)格式可被用于在本發(fā)明的基于計(jì)算機(jī)的系統(tǒng)中輸入和輸出信息。這樣的呈現(xiàn)為本領(lǐng)域技術(shù)人員提供了含在試驗(yàn)表達(dá)概況中的相似性排序和鑒別該相似性程度?？衫枚喾N方法分析數(shù)據(jù)組。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)化并標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)數(shù)據(jù)。例如，通過(guò)平均地居中每個(gè)基因的的表達(dá)數(shù)據(jù)生成比率(通過(guò)用指定列陣上每個(gè)基因的強(qiáng)度測(cè)量值除以穿過(guò)所有列陣的基因的平均強(qiáng)度)，(2)然后對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化(基于2)得到的比率，及 (3)然后中位數(shù)居中穿過(guò)列陣然后穿過(guò)基因的表達(dá)數(shù)據(jù)。對(duì)于cDNA微列陣數(shù)據(jù)，具有比參照頻道中的局部背景熒光信號(hào)至少大1. 5倍的熒光雜交信號(hào)的基因被認(rèn)為是足可以被檢測(cè)的。用每一個(gè)數(shù)據(jù)組中的平均值以及進(jìn)行的平均關(guān)聯(lián)聚類(lèi)將基因居中。也可以使用比例化的方法(scaled approach)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。例如，基因表達(dá)值的皮爾遜相關(guān)性可以提供反應(yīng)每個(gè)CSC信號(hào)的定量的數(shù)值。相關(guān)性數(shù)值越高，樣本越像參照的CSC表現(xiàn)型。可對(duì)任何細(xì)胞型進(jìn)行相似的相關(guān)性，包括正常細(xì)胞、祖細(xì)胞、自體免疫表現(xiàn)型細(xì)胞、炎癥表現(xiàn)型細(xì)胞、感染細(xì)胞、分化的癌細(xì)胞、正常干細(xì)胞、正常成熟細(xì)胞等。陰性相關(guān)性數(shù)值表明相反的行為?？筛鶕?jù)臨床目的將分類(lèi)的閾值從0向上或向下移。例如，為預(yù)測(cè)作為第一復(fù)發(fā)事件的轉(zhuǎn)移，可以-1至+1間的每個(gè)閾值，以0. 05增加的關(guān)聯(lián)度值計(jì)算敏感度和特異性，可以選擇給出了轉(zhuǎn)移預(yù)測(cè)的希望的敏感度的閾值，如80^^90^^95%等。為了提供顯著性次序，可確定錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)。首先，生成不同性數(shù)值的一組零分布。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，變換觀察到的概況的數(shù)值以產(chǎn)生沒(méi)機(jī)會(huì)得到的相關(guān)性系數(shù)的一系列分布，從而生成一組恰當(dāng)?shù)南嚓P(guān)性系數(shù)零分布(參見(jiàn)Tusher等人(2001)PNAS 98， 5118-21，通過(guò)引用并入本文)。按如下方式獲得零分布組互換所有可獲得的概況的每一個(gè)概況的數(shù)值；計(jì)算所有概況的配對(duì)相關(guān)性系數(shù)；計(jì)算該互換的相關(guān)性系數(shù)的概率密度函數(shù)；重復(fù)步驟N次，其中N是一個(gè)大數(shù)，通常為300。通過(guò)使用N分布，人們可以計(jì)算恰當(dāng)?shù)钠鋽?shù)值超過(guò)來(lái)自指定的顯著性水平下實(shí)驗(yàn)觀察到的相似性數(shù)值的分布的(相似度的)值的相關(guān)性系數(shù)的計(jì)數(shù)的測(cè)量值(均值、中位數(shù)等)。FDR是預(yù)期的錯(cuò)誤顯著的相關(guān)性的數(shù)目(從大于隨機(jī)數(shù)值組中選定的皮爾遜相關(guān)性的相關(guān)性估得)相對(duì)比經(jīng)驗(yàn)數(shù)據(jù)(顯著的相關(guān))中選定的皮爾遜相關(guān)性大的相關(guān)性的數(shù)目的比率。該截?cái)嗟?cut-off)相關(guān)性數(shù)值可應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)的概況之間的相關(guān)性。通過(guò)使用前面提到的分布，為顯著性選擇可信度水平。其被用于確定超過(guò)隨機(jī)獲得的結(jié)果的相關(guān)性系數(shù)的最低值。通過(guò)使用該方法，人們可獲得陽(yáng)性相關(guān)性、陰性相關(guān)性或二者的閾值。通過(guò)使用該閾值，使用者可過(guò)濾觀察到的配對(duì)相關(guān)性系數(shù)的值并去除沒(méi)超過(guò)閾值的那些。而且，可以得到指定閾值的假陽(yáng)性率的估計(jì)。對(duì)于每個(gè)單獨(dú)的“隨機(jī)相關(guān)性” 分布，人們可以發(fā)現(xiàn)有多少觀察超出閾值范圍。此步驟提供一系列的計(jì)數(shù)。系列的均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差提供了潛在假陽(yáng)性的平均數(shù)目及其標(biāo)準(zhǔn)偏差?？蓪?duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行非監(jiān)管的分層次的聚類(lèi)以揭露概況間的關(guān)系。例如，可進(jìn)行分層次的聚類(lèi)，其中皮爾遜相關(guān)性被用作聚類(lèi)度量。相關(guān)性矩陣的聚類(lèi)，如通過(guò)使用多維標(biāo)準(zhǔn)，增強(qiáng)了功能同源相似性和不同性的可視化。多維量表法(multidimensional scaling, MDS) 可被應(yīng)用在1、2、3維中?？稍谟布蜍浖蚱浣Y(jié)合中完成分析。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，提供了機(jī)器可讀的存儲(chǔ)介質(zhì)，該介質(zhì)包括用機(jī)器可讀數(shù)據(jù)編碼的數(shù)據(jù)存儲(chǔ)材料，使用用所述數(shù)據(jù)的使用說(shuō)明書(shū)編程的機(jī)器時(shí)，其能夠展示本發(fā)明的任何數(shù)據(jù)組和數(shù)據(jù)比較。這樣的數(shù)據(jù)可用于多種目的，例如藥物的發(fā)現(xiàn)、細(xì)胞成分間相互作用的分析等。在一些具體實(shí)施方案中， 本發(fā)明在程序控制的計(jì)算機(jī)上執(zhí)行的計(jì)算機(jī)程序中完成，所述計(jì)算機(jī)包括處理器、數(shù)據(jù)存儲(chǔ)系統(tǒng)(包括易變的和非易變的記憶和/或存儲(chǔ)元件)，至少一個(gè)輸入設(shè)備和至少一個(gè)輸出設(shè)備。應(yīng)用程序代碼輸入數(shù)據(jù)，以執(zhí)行上述功能并生成輸出信息。輸出信息以已知的方式被應(yīng)用到一個(gè)或多個(gè)輸出設(shè)備。例如，計(jì)算機(jī)可以是個(gè)人計(jì)算機(jī)、微型計(jì)算機(jī)或傳統(tǒng)設(shè)計(jì)的工作站。每一個(gè)程序可以高水平的程序的或目標(biāo)定向的程序語(yǔ)言完成以與計(jì)算機(jī)系統(tǒng)通訊?？墒?，如果需要，可以匯編或機(jī)器語(yǔ)言執(zhí)行程序。在任何情況下，語(yǔ)言可以是匯編的或翻譯的語(yǔ)言?？蓪⒚總€(gè)這樣的計(jì)算機(jī)程序存儲(chǔ)在普通的或特定目的的程序控制的計(jì)算機(jī)可讀的存儲(chǔ)介質(zhì)或設(shè)備上(如ROM或磁盤(pán))，當(dāng)利用計(jì)算機(jī)讀取存儲(chǔ)介質(zhì)或設(shè)備以進(jìn)行本文中所述的步驟時(shí)，用于配置和操作計(jì)算機(jī)。系統(tǒng)還可以被認(rèn)為以用計(jì)算機(jī)程序配置的計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)介質(zhì)被完成，其中如此配置的存儲(chǔ)介質(zhì)使計(jì)算機(jī)以特定的事先定義的方式操作， 以進(jìn)行本文中所述的功能?？墒褂糜糜谳斎牒洼敵龇椒ǖ亩喾N結(jié)構(gòu)格式在本發(fā)明基于計(jì)算機(jī)的系統(tǒng)中輸入和輸出信息。用于輸出方法的一種格式檢測(cè)與信任的概況具有不同程度相似性的數(shù)據(jù)組。 這樣的呈現(xiàn)為本領(lǐng)域技術(shù)人員提供了包含在試驗(yàn)?zāi)Ｊ街械南嗨菩苑旨?jí)和鑒別相似性程度。存儲(chǔ)和傳遞數(shù)據(jù)本文進(jìn)一步提供了通過(guò)計(jì)算機(jī)存儲(chǔ)和/或傳遞序列和其他通過(guò)本文中公開(kāi)的方法收集的數(shù)據(jù)的方法。任何計(jì)算機(jī)或計(jì)算機(jī)附件，包括但不局限于軟件和存儲(chǔ)設(shè)備，可以被用于實(shí)施本發(fā)明。使用者可直接或間接地將序列或其他數(shù)據(jù)(如轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù))輸入計(jì)算機(jī)。 另外，可以將任何用于測(cè)序DNA或分析DNA或分析轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的設(shè)備連接至計(jì)算機(jī)，從而使數(shù)據(jù)被傳送至計(jì)算機(jī)和/或計(jì)算機(jī)兼容的存儲(chǔ)設(shè)備。數(shù)據(jù)可被存儲(chǔ)在計(jì)算機(jī)或適當(dāng)?shù)拇鎯?chǔ)設(shè)備上(如CD)?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域熟知的方法(如因特網(wǎng)、地面郵件、航空郵件)將數(shù)據(jù)從一臺(tái)計(jì)算機(jī)發(fā)送至另一臺(tái)計(jì)算機(jī)或數(shù)據(jù)收集點(diǎn)。因此，通過(guò)本文中描述的方法收集的數(shù)據(jù)可在任何點(diǎn)或地理位置被收集，并被發(fā)送至任何地理位置。在圖10中描述了一個(gè)示例的方法。在此實(shí)施例中，使用者向測(cè)序儀中提供了一個(gè)樣本。通過(guò)連接至計(jì)算機(jī)的測(cè)序儀收集和/或分析數(shù)據(jù)。計(jì)算機(jī)上的軟件允許數(shù)據(jù)收集和 /或分析。數(shù)據(jù)可被存儲(chǔ)、展示(通過(guò)顯示器或其他相似的設(shè)備)和/或傳送到其他位置。 如圖10中所示，計(jì)算機(jī)被連至因特網(wǎng)，因特網(wǎng)可被利用以傳送數(shù)據(jù)至遠(yuǎn)程使用者(如醫(yī)生、 科學(xué)家或分析者)使用的手提設(shè)備。應(yīng)當(dāng)了解在傳送前可存儲(chǔ)和/或分析數(shù)據(jù)。在某些具體實(shí)施方案中，可收集原始數(shù)據(jù)并將其傳送至分析和/或存儲(chǔ)數(shù)據(jù)的遠(yuǎn)方使用者。如圖10 中所示，可通過(guò)因特網(wǎng)傳送，但是也可以通過(guò)衛(wèi)星或其他連接傳送?？蛇x擇的，數(shù)據(jù)可存儲(chǔ)在計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)上(如CD、記憶存儲(chǔ)設(shè)備)，可將介質(zhì)發(fā)送給終端使用者(如通過(guò)郵件)。 遠(yuǎn)方的使用者可以在相同或不同的地理位置，包括但不局限于建筑物、城市、州、國(guó)家或大陸。制劑和試劑盒還提供了用于實(shí)施上述一個(gè)或多個(gè)方法的制劑及其試劑盒。該制劑和其試劑盒可以非常不同。目標(biāo)制劑包括特異地設(shè)計(jì)用于生成上述表現(xiàn)型決定基因的表達(dá)概況的制劑。 例如，制劑可以包括已知在靶群或亞群中差異表達(dá)的基因的引物組(如用于檢測(cè)致癌的乳腺癌細(xì)胞的制劑包括用于擴(kuò)增和檢測(cè)CD49f、CD24和/或EPCAM表達(dá)的引物和探針)。用于生成靶細(xì)胞群和亞群的表達(dá)概況的特異地定制的一類(lèi)制劑是被設(shè)計(jì)為選擇性擴(kuò)增這樣的基因的基因特異性引物的集合，其用于定量PCR或其他定量的方法。在美國(guó)專(zhuān)利No. 5，994，076中描述了基因特異性引物及其使用方法，其公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用并入本文。特別感興趣的是基因特異性引物的集合，其具有至少5個(gè)基因、通常多種這些基因，如至少 10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000 個(gè)基因或更多基因的引物?；蛱禺愋砸锛峡蓛H包括與靶群或亞群相關(guān)的基因的引物 (如突變、已知的錯(cuò)誤調(diào)節(jié)的基因等)，或它們可包括另外的基因的引物(如管家基因、對(duì)照)。本發(fā)明的試劑盒可包括上述基因特異性引物集合。試劑盒可進(jìn)一步包括用于一個(gè)或多個(gè)表現(xiàn)型統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的軟件包，還可以包括用于計(jì)算易感性的可能性的參照數(shù)據(jù)庫(kù)。試劑盒可包括用于多種方法中的制劑，如用于生成靶核酸的引物，dNTP和/或rNTP(可以是事先混合的或是單獨(dú)的)，一個(gè)或多個(gè)獨(dú)特標(biāo)記的dNTP和/或rNTP，如生物素標(biāo)記的或Cy3 或Cy5標(biāo)記的dNTP，具有不同散射光譜的金或銀顆粒，或其他合成后標(biāo)記制劑，如熒光染料的化學(xué)活性的衍生物，酶，如逆轉(zhuǎn)錄酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶等，不同的緩沖介質(zhì)，如雜交和洗滌緩沖液，預(yù)制的探針列陣、標(biāo)記的探針純化制劑和成分，如離心柱(spin column)等， 信號(hào)生成和檢測(cè)制劑，如抗生蛋白鏈菌素-堿性磷酸酶結(jié)合物、化學(xué)熒光或化學(xué)發(fā)光底物寸。除了上面的成分，該試劑盒進(jìn)一步包括實(shí)施所述方法的說(shuō)明書(shū)。這些說(shuō)明書(shū)可以多種形式存在于所述試劑盒中，其一個(gè)或多個(gè)可存在于試劑盒中。這些說(shuō)明書(shū)存在其中的一個(gè)形式是在適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)或底物上的打印的信息，如在試劑盒的包裝中，在包裝插入件中的其上印有信息的一張或多張紙。其他的方式可以是計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，如其上記錄信息的軟盤(pán)、⑶等。可存在的其他方式可以是通過(guò)因特網(wǎng)可使用以進(jìn)入遠(yuǎn)端地點(diǎn)的信息的網(wǎng)址。 任何合宜的方式可存在于試劑盒中。上述分析方法可作為計(jì)算機(jī)可執(zhí)行的說(shuō)明書(shū)程序被包括以進(jìn)行本發(fā)明的不同方面。上述的任何技術(shù)可通過(guò)裝在計(jì)算機(jī)或其他信息電器或數(shù)碼設(shè)備中的軟件部分方法進(jìn)行。當(dāng)如此啟動(dòng)時(shí)，然后計(jì)算機(jī)、電器或設(shè)備可執(zhí)行上述技術(shù)，以上述方式輔助與多種基因相關(guān)的數(shù)值組的分析，或比較這樣的相關(guān)的數(shù)值?？蓮墓潭ǖ慕橘|(zhì)裝載軟件部分或通過(guò)通訊介質(zhì)如因特網(wǎng)或其他類(lèi)型的計(jì)算機(jī)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)入軟件部分。上述特征包含在一個(gè)或多個(gè)可通過(guò)一個(gè)或多個(gè)運(yùn)行這樣的程序的計(jì)算機(jī)執(zhí)行的計(jì)算機(jī)程序中。實(shí)施例通過(guò)例舉但非限制的方式提供下述實(shí)施例。實(shí)施例1 單細(xì)胞中基因表達(dá)的分析。鼠乳腺CSC的顯著部分包含相對(duì)低水平的R0S，因此假設(shè)與其N(xiāo)TC對(duì)應(yīng)物相比，這些細(xì)胞可表達(dá)增強(qiáng)水平的ROS防御。單細(xì)胞基因表汰分析。為了進(jìn)行單細(xì)胞基因表達(dá)試驗(yàn)，我們使用qPCRDynamicArray微流體芯片(Fluidigm)。 利用FACS將富含 MMTV-Wnt-lThyl+CD24+Lin-CSC 的單個(gè)細(xì)胞(TG)禾口 “Not Thyl+CD24+” Lin” 非致癌(NTC) 細(xì)胞分類(lèi)至含 PCR 混合物(CellsDirect, Invitrogen)和 RNase 抑制劑(Superaseln, Invitrogen)的96孔平板。低滲裂解后，我們加入RT-qPCR酶(Superscript 11IRT/ Platinum Taq, Invitrogen)和含有目標(biāo)基因(Gclm-Mm00514996_ml，Gss_Mm00515065_ml， Foxol-Mm00490672_ml, Foxo4-Mm00840140-gl, HiflaMm00468875_ml, Epas 1-Mm00438717_ ml)的低濃度分析物的集合物(引物/探針)的混合物。22個(gè)PCR循環(huán)(每個(gè)循環(huán) 950C 15秒；60°C 4分鐘)預(yù)擴(kuò)增后，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄(50°C 15分鐘，95°C 2分鐘)。平行地進(jìn)行總RNA對(duì)照。從每個(gè)細(xì)胞中得到的擴(kuò)增的cDNA被插入具有Taqman qPCR混合物(Applied Biosystems)的芯片樣品入口。單獨(dú)的分析(引物/探針)被插入芯片分析入口(每一個(gè)重復(fù)2次)。將芯片裝入芯片裝載機(jī)(Nanoflex，F(xiàn)luidigm) 1小時(shí)，然后將其移至讀取器 (Biomark, Fluidigm)用于熱循環(huán)和熒光定量。為了除去低質(zhì)量的基因分析，我們放棄了 qPCR曲線顯示為非指數(shù)增加的基因分析。為了除去低質(zhì)量的細(xì)胞(如死亡細(xì)胞)，我們放棄了不表達(dá)管家基因Actb (β肌動(dòng)蛋白)和Hprtl (次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶1)的細(xì)胞。這導(dǎo)致了由來(lái)自全部7個(gè)芯片類(lèi)型(chip-run)的248個(gè)(109個(gè)致癌的和139個(gè)非致癌的)細(xì)胞組成的單細(xì)胞基因表達(dá)數(shù)據(jù)組。計(jì)算兩個(gè)樣本柯?tīng)柲缌_夫-斯米諾夫 (Kolmogorov-Smirnov,K-S)統(tǒng)計(jì)量以測(cè)試兩個(gè)群中的基因是否差異表達(dá)。通過(guò)變換樣本標(biāo)記(即TG對(duì)NTG)和比較來(lái)自變換的零分布中的那些實(shí)際的K-S統(tǒng)計(jì)量，我們產(chǎn)生了 ρ值。 進(jìn)一步通過(guò)邦弗朗尼校正(Bonferroni correction)糾正ρ值，以調(diào)整多假設(shè)測(cè)試。實(shí)施例2使用SINCE-PCR分析和定量人“結(jié)直腸癌干細(xì)胞”(Co-CSC)，其是一種基于“單細(xì)胞基因表達(dá)分析”的新的方法。SINCE-PCR方法允許鑒別、表征和定量人結(jié)直腸癌組織中的“癌干細(xì)胞”，其具有先前不能實(shí)現(xiàn)的純度和分辨率程度?？梢允强芍掳┑幕蚰[瘤起始細(xì)胞的癌干細(xì)胞是當(dāng)移植到免疫缺陷小鼠時(shí)具有形成腫瘤能力的癌細(xì)胞的亞群。目前癌干細(xì)胞群在乳腺、腦、頭和頸、 胰腺和結(jié)腸癌中被鑒別到。“癌干細(xì)胞”的精確的功能性定義和定量對(duì)于人癌的診斷、預(yù)后、 分類(lèi)和治療靶向具有幾個(gè)重要的含意。我們描述了用于鑒別、分析和定量人結(jié)直腸癌組織中“癌干細(xì)胞”的新方法，其基于利用實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(實(shí)時(shí)PCR)的單細(xì)胞基因表達(dá)分析。我們鑒別了一組新的基因， 其協(xié)同的和差異表達(dá)可被用作“標(biāo)記”來(lái)鑒別相同腫瘤組織中得不同癌細(xì)胞亞組。這組新的基因包括所有上皮細(xì)胞通常的管家基因(EpCAM、β肌動(dòng)蛋白、GAPDH)，干細(xì)胞生物學(xué)相關(guān)的基因(hTERT、LGR5、存活素)，以及涉及正常結(jié)腸上皮的不同細(xì)胞譜系相關(guān)的組織特異的分化路徑(碳酸酐酶II、MUC2、三葉因子3)和分化階段(細(xì)胞角蛋白20、⑶66a/CEACAMl) 的基因?；谶@組基因的表達(dá)模式，從人結(jié)直腸癌組織純化并作為單細(xì)胞被個(gè)別分析的上皮細(xì)胞可被“分類(lèi)”和聚類(lèi)到不同的組，其對(duì)應(yīng)于更晚期或不太晚期的分化階段(如在人結(jié)腸隱窩頂部末端分化的細(xì)胞對(duì)位于人結(jié)腸隱窩底部的更不成熟的細(xì)胞)，和結(jié)腸上皮的不同分化譜系(如杯狀細(xì)胞、腸細(xì)胞、未成熟細(xì)胞)?？梢哉麄€(gè)群的百分比將每組定量。我們將此分析生物組織的細(xì)胞成分的方法和方法學(xué)命名為“SINCR-PCR” (單細(xì)胞表達(dá)-聚合酶鏈反應(yīng))。我們的發(fā)現(xiàn)基于一些觀察。通過(guò)流式細(xì)胞儀從新鮮收集的實(shí)體瘤組織直接富集的人“結(jié)直腸癌干細(xì)胞”是可重復(fù)的并在單細(xì)胞水平上穩(wěn)健地被分析(圖1)。在人結(jié)腸癌異體移植物中，利用實(shí)時(shí)PCR的單細(xì)胞基因表達(dá)分析表明EpCAM-/ ⑶44+和EpCAM-/V⑶166+癌細(xì)胞都可被進(jìn)一步再分類(lèi)為以干細(xì)胞生物學(xué)和分化過(guò)程中涉及的不同組基因的一致的和差異的表達(dá)為特征的不同的細(xì)胞亞型，EpCAM-/⑶44+和EpCAM-/ VCD166+癌細(xì)胞已知被富集“結(jié)直腸癌干細(xì)胞”群。更有趣的是，展示高水平的編碼已知結(jié)腸上皮的末端分化標(biāo)記物(如細(xì)胞角蛋白20、⑶66a/CEACAMl碳酸酐酶II、MUC2、三葉因子 3)的基因的細(xì)胞亞型不表達(dá)或表達(dá)低水平的編碼候選腸干細(xì)胞標(biāo)記物的基因或已知干細(xì)胞功能(如hTERT、LGR5、生存素)必須的基因，相反亦然。這表明EpCAM/⑶44+/⑶166+癌細(xì)胞含有特征為不同分化階段的不同細(xì)胞亞型(圖2)。當(dāng)利用熒光活化細(xì)胞分類(lèi)(FACS)術(shù)純化并再注入免疫缺陷N0D/SCID小鼠時(shí)， CD44+/CD66a+和CD44+/CD66anewl”細(xì)胞展示基本上不同的致癌特性，其中CD44+/CD66anegl°w 群表現(xiàn)為具有最高的致癌能力的一種(表4)。這表明，在EpCAM+/CD44+細(xì)胞群中，以編碼分化標(biāo)記物如⑶66a/CEACAMI的基因高水平表達(dá)為特征的細(xì)胞亞型(即更“成熟”的細(xì)胞亞型)通常相對(duì)缺乏致癌能力。另一方面，以缺乏或低水平表達(dá)分化標(biāo)記物如⑶66a/CEACAMI為特征的細(xì)胞亞型(即更“不成熟”的細(xì)胞亞型)富含在“結(jié)直腸癌干細(xì)胞”內(nèi)容物中。表1、基于與EpCAM和/或⑶44聯(lián)合的⑶66a/CEACAMI表達(dá)的人結(jié)腸癌細(xì)胞的致
癌特性。
實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤來(lái)源3Liniwg分類(lèi)的群15細(xì)胞劑量腫瘤成Se實(shí)驗(yàn)代碼1)UM#4m4CD44neg10,0002/10PD69-CD44+/CD66a+4501/3CD44+/CD66aneg-l0W2502/32)UM#4m6CD44neg10,0001/5PD85CD44+/CD66a+5000/2CD44+/CD66anes-low1,0003/33)UM#4m4CD44neg10,0000/5PD107CD44+/CD66a+1,0000/1CD44+/CD66aneg-l0W1,0003/44)SU29mlCD44neg7,0000/5PD88-CD44+/CD66a+1,0000/5CD44+/CD66ane§"Iow2,0001/51,0000/55)SU43搬游EpCAM7CD44neg12,0000/5PD79EpCAM+/CD44+/CD66a+3000/1EpCAM+/CD44+/CD66aneg-low 1,0001/3a對(duì)于每一個(gè)實(shí)驗(yàn)，如下報(bào)道了用作癌細(xì)胞純化源的腫瘤異體移植物的連續(xù)的體內(nèi)傳代ml表示從原發(fā)腫瘤移植物獲得的第一輪腫瘤，m2是從ml的移植物獲得的第二輪腫瘤，m3是從m2移植物獲得的第三輪腫瘤，如此持續(xù)地繼續(xù)；初始的表示直接從手術(shù)標(biāo)本獲得的原發(fā)腫瘤。b所有被分類(lèi)的群被認(rèn)為是譜系標(biāo)記物陰性(LinMg)，在N0D/SCID小鼠中建立的人腫瘤異體移植物的情況下，其包括小鼠CD45和小鼠H2-Kd，在原發(fā)人腫瘤的情況下 (在此情況下EpCAM作為陽(yáng)性上皮選擇標(biāo)記物)，其包括人⑶3和⑶45。c腫瘤成活被報(bào)道為得到的腫瘤數(shù)/注射的數(shù)量；過(guò)了 5周后沒(méi)有看到腫瘤塊認(rèn)為腫瘤成活不成功。實(shí)施例2 帶有肺轉(zhuǎn)移的人乳腺癌異體移植模型的生成和成像將患者來(lái)源的乳腺癌樣本(大塊或TIC)正位移植至NOD-SCID小鼠的乳腺脂肪墊。生成6個(gè)異體移植的腫瘤模型(1個(gè)ER+、1個(gè)Her2+、4個(gè)3陰性ER-PR-Her2_)。所有4 個(gè)3陰性異體移植物全部發(fā)展了自發(fā)的肺微轉(zhuǎn)移，其被IHC染色(即H&E)、增殖標(biāo)記物Ki67 和波形蛋白(VimentimVim)染色證明。這些數(shù)據(jù)表明移植到免疫缺陷小鼠上時(shí)，乳腺腫瘤細(xì)胞或TIC能夠適應(yīng)小鼠的微環(huán)境而重演伴有自發(fā)肺轉(zhuǎn)移的人腫瘤生長(zhǎng)和進(jìn)展。為了幫助小鼠中人乳腺癌和轉(zhuǎn)移的動(dòng)力學(xué)的和半定量成像，移植后4天利用 PHRuKRi慢病毒(moi50)用螢火蟲(chóng)熒光素酶-EGFP融合基因轉(zhuǎn)導(dǎo)乳腺TIC，用弱的生物發(fā)光信號(hào)可檢測(cè)到初始位點(diǎn)的TIC。并且一個(gè)月后，原發(fā)腫瘤(在L4和R2乳腺脂肪墊)和肺轉(zhuǎn)移物都能利用位于斯坦福的小動(dòng)物成像中心的fenogen IVIS 200系統(tǒng)檢測(cè)和成像。我們觀察到與信號(hào)強(qiáng)度相關(guān)良好的腫瘤大小或細(xì)胞數(shù)。具有轉(zhuǎn)移的異體移植腫瘤的生成和生物發(fā)光成像為我們提供了證實(shí)此建議中人乳腺癌MTIC中miRNA功能的值得歡呼的可行性。實(shí)施例3 人乳腺M(fèi)TIC的微列陣和實(shí)時(shí)PCR分析從乳腺癌初始位點(diǎn)或胸腔積液分離人乳腺原發(fā)腫瘤發(fā)生細(xì)胞(TIC)或轉(zhuǎn)移TIC (MTIC) (CD44+CD24-/l0WESA+譜系_)。一旦在異體移植模型中檢測(cè)到肺轉(zhuǎn)移，則用 Blenzyme (Roche)分裂肺，并用小鼠HI和人CD44、CDM和ESA染色細(xì)胞以純化MTIC群 (⑶44+CDM-a°wESA+H2K_，圖8a)，移植到小鼠乳腺脂肪墊后其以200-1000個(gè)分類(lèi)的細(xì)胞的 5/8的比率生長(zhǎng)正位腫瘤。如微列陣分析和實(shí)時(shí)PCR所示，HIFl α和HIFl調(diào)節(jié)的靶基因與包括Snail、^A2、 波形蛋白、上皮細(xì)胞鈣粘蛋白、L0X、C0X2、VEGF等的非致癌腫瘤細(xì)胞相比，在MTIC中差異地表達(dá)(圖8B)。利用免疫組化染色確認(rèn)了 HIFl α、波形蛋白和⑶44的共區(qū)域化。實(shí)施例4:微RNA分析通過(guò)微RNA篩選，鑒別了分離自肺的親代乳腺癌干細(xì)胞和轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞的差異表達(dá)概況。例如，與原發(fā)乳腺TIC相比，在肺MTIC中有較高的miR-lOa表達(dá)和較低的miR-490、 miR-199a等的水平。如圖4中的3次重復(fù)的實(shí)時(shí)PCR所示，肺MTIC對(duì)原發(fā)TIC的平均CT 值比較:miR-10a (-7. 9)、miR-490 (+3. 0)和 miR_199a (+12. 9)。NR3 被用作內(nèi)控。數(shù)據(jù)表明與乳腺癌原發(fā)TIC相比，MTIC中miR-lOa上調(diào)了多達(dá)27. 9倍，miR_199a下調(diào)了 212. 9倍。實(shí)施例5 作為乳腺癌非致癌癌細(xì)胞標(biāo)記物的⑶66a當(dāng)大多數(shù)細(xì)胞為⑶時(shí)，基于⑶44和⑶66a分類(lèi)乳腺癌細(xì)胞。然后將細(xì)胞移植到N0D/SCID小鼠的乳腺脂肪墊并監(jiān)控腫瘤生長(zhǎng)。如圖5中所示，利用生物發(fā)光成像， ⑶44/⑶66a-細(xì)胞顯示高的移植率和高生長(zhǎng)率。⑶66+細(xì)胞顯示較低的和延遲的腫瘤生長(zhǎng)率，腫瘤尺寸小很多，并顯示與CD66-起源的腫瘤相比相似的流式(flow)概況。在圖fe中，基于⑶44和⑶66a標(biāo)記物表示流式概況。⑶66-⑶44+和⑶66+⑶44+ 細(xì)胞被分類(lèi)用于體內(nèi)致癌分析(100個(gè)細(xì)胞或1000個(gè)細(xì)胞移植至N0D/SLID小鼠的乳腺脂肪墊的Zid或41h)。如IOb所示，從100個(gè)⑶66-細(xì)胞來(lái)源的8個(gè)移植物中的5個(gè)生長(zhǎng)腫瘤而從100個(gè)⑶66+細(xì)胞來(lái)源的8個(gè)中的2個(gè)生長(zhǎng)。對(duì)于1000個(gè)細(xì)胞，從⑶66-細(xì)胞注射來(lái)源的8個(gè)中的8個(gè)生長(zhǎng)但從CD66+細(xì)胞來(lái)源的8個(gè)中僅3個(gè)生長(zhǎng)腫瘤。與可觸知的腫瘤的生長(zhǎng)率相比，CD66+細(xì)胞比那些來(lái)自CD66-的細(xì)胞具有較低和較小的大小(圖5c)。在圖 5d中，100K的⑶66-⑶44+或⑶66+⑶44+細(xì)胞在注射前被螢火蟲(chóng)熒光素酶-EGFP慢病毒感染。來(lái)自CD66+細(xì)胞的生物發(fā)光信號(hào)比來(lái)自起始的CD66-細(xì)胞的那些高(第13天)。但是 1個(gè)月或2個(gè)月后，CD66a-細(xì)胞顯現(xiàn)出顯性的生物發(fā)光信號(hào)并在最后生長(zhǎng)出可觸知的腫瘤 (第68天)。實(shí)施例6 用于鑒別和測(cè)量癌干細(xì)胞頻率的基因列表的優(yōu)化此時(shí)用于鑒別正常干細(xì)胞和癌干細(xì)胞二者的多數(shù)標(biāo)記物與重要的干細(xì)胞功能不相關(guān)。它們的表達(dá)與分離時(shí)干細(xì)胞存在于其中的特定的微環(huán)境有關(guān)。因此，用于鑒別干細(xì)胞的普通標(biāo)記物的利用可隨著其被收集的位置而變化。我們的方法已經(jīng)鑒別了重要干細(xì)胞功能的標(biāo)記物。由于自我更新是典型的干細(xì)胞的特征，我們把我們的努力集中于自我更新路徑上。在每一個(gè)各自的組織中，我們均鑒別了多種被正常的HSC、源自祖細(xì)胞的白血病干細(xì)胞和人上皮癌干細(xì)胞，但不是被非自我更新細(xì)胞高度表達(dá)的基因。在初始結(jié)果中描述的此基因組分析鑒別了以前認(rèn)為與干細(xì)胞自我更新
29相關(guān)的大量基因。相似地，我們鑒別了乳腺癌干細(xì)胞和非致癌性癌細(xì)胞差異表達(dá)的候選微 RNA。證據(jù)證明這些基因和微RNA中的幾個(gè)具有重要的干細(xì)胞功能，這些基因的功能對(duì)hESC 和iPSC自我更新和維持也非常重要。為了制造能夠測(cè)量在腫瘤細(xì)胞群中的癌干細(xì)胞頻率的設(shè)備，需要優(yōu)化用于鑒別癌干細(xì)胞的基因列表。如圖IB中所示，我們?cè)诖朔矫娈a(chǎn)生了巨大的進(jìn)步，鑒別了作為癌干細(xì)胞標(biāo)記物端粒酶以及與自我更新過(guò)程相關(guān)聯(lián)的一些基因。端粒酶成分TERT僅僅在具有未成熟表現(xiàn)型的結(jié)腸癌細(xì)胞中表達(dá)。而且，TERT不能用一些hESC和iPSC系的分化有效地下調(diào)。分析了正常的和癌性的結(jié)腸上皮細(xì)胞二者的與隱窩細(xì)胞成熟和自我更新關(guān)聯(lián)的基因的表達(dá)。自我更新基因列表擴(kuò)展超出TERT以最大化細(xì)胞是干細(xì)胞的置信度。測(cè)量在我們對(duì)正常和癌干細(xì)胞分析中鑒別的基因的表達(dá)。因?yàn)榘└杉?xì)胞可潛在地來(lái)自逃避了擴(kuò)展限制的干細(xì)胞或逃避了限制其可進(jìn)行的有絲分裂數(shù)量的計(jì)數(shù)機(jī)制的祖細(xì)胞，候選基因是源自祖細(xì)胞和人乳腺癌干細(xì)胞的正常鼠HSC、鼠白血病干細(xì)胞表達(dá)的那些。在該表中被鑒別的最上方的、與干細(xì)胞的維持都相關(guān)聯(lián)的候選基因包括BMI1，-IDI，IGFBP3, HOX家族成員 H0XA3，H0XA5，MEIS1，ETS1，ETS2，RUNX2和STAT3。我們要證實(shí)這些基因中的哪些基因與癌干細(xì)胞自我更新有關(guān)。為此目的，我們將使用體外和體內(nèi)技術(shù)系統(tǒng)地測(cè)試我們的候選基因在癌干細(xì)胞自我更新中的作用。調(diào)節(jié)自我更新的基因的表達(dá)與上皮細(xì)胞特異的基因表達(dá)有關(guān)，包括成熟標(biāo)記物， 如角蛋白和腸粘蛋白。其將允許確定分析中的細(xì)胞不是活組織檢查樣本中正常細(xì)胞污染物。其表達(dá)被自我更新基因BMI I下調(diào)的腫瘤抑制基因的突變?cè)试S早期祖細(xì)胞自我更新。 這些基因常在結(jié)腸癌中突變，因此自我更新的結(jié)腸癌干細(xì)胞既來(lái)自正常干細(xì)胞又來(lái)自早期結(jié)腸祖細(xì)胞。而且，致癌突變將通過(guò)結(jié)腸癌細(xì)胞改變基因的表達(dá)。因此，在正常結(jié)腸上皮干細(xì)胞和其惡性對(duì)應(yīng)物之間存在至少一些與早期隱窩細(xì)胞成熟關(guān)聯(lián)的基因的表達(dá)的不同，其使得能夠彼此區(qū)分這兩種自我更新的細(xì)胞群。我們鑒別了癌干細(xì)胞和非致癌的癌細(xì)胞中的37個(gè)差異表達(dá)的miRNAS。一些miRNA 簇在正常組織干細(xì)胞中被下調(diào)，而在癌干細(xì)胞中不被下調(diào)；而且，一些miRNA，如miR-200c 和miR-183的表達(dá)抑制體外胚胎癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，消除其在體內(nèi)的腫瘤形成能力，并抑制體外乳腺癌細(xì)胞的集落形成。這些miRNA和我們鑒別的其他簇提供了連接乳腺癌干細(xì)胞和正常干細(xì)胞生物學(xué)的分子連接。這些在致癌細(xì)胞中可被持續(xù)地上調(diào)或下調(diào)的微RNA的表達(dá)在單細(xì)胞中從未分化和分化的hESC和iPSC被探查。本質(zhì)上，通過(guò)不同于多能干細(xì)胞如Tra和 SSEA亞型的細(xì)胞表面標(biāo)記物將未分化的細(xì)胞分類(lèi)，評(píng)估其miRNA表達(dá)，重編排(!^plating) 體內(nèi)的有效性和群參數(shù)(以胚胎性癌、混合的胚胎性癌/分化的細(xì)胞指數(shù)(％EC比分化的) 和分化的細(xì)胞的形式的畸胎瘤分析的結(jié)果)。分化觀天后，通過(guò)胚胎體產(chǎn)物獲得分化的胚胎干細(xì)胞群，并通過(guò)SSENTRA標(biāo)記物的陽(yáng)性和陰性選擇進(jìn)行分類(lèi)。我們將檢測(cè)被分類(lèi)群中的單細(xì)胞的1)指示癌干細(xì)胞的微RNA概況2)基因表達(dá)概況(下)，和3)移植/畸胎瘤分析的結(jié)果。我們期待這些群中的“對(duì)抗分化”的細(xì)胞將形成惡性胚胎癌衍生物并在單細(xì)胞中共表達(dá)分化和未分化細(xì)胞的標(biāo)記物。實(shí)施例7 在單細(xì)胞水平的基因表達(dá)概況在多能細(xì)胞群中，即使在分化21天后，我們?nèi)杂^察到不能下調(diào)關(guān)鍵的致癌標(biāo)記物如TERT的細(xì)胞系(參見(jiàn)圖6)。另外，我們觀察到大約50%的我們的iPSC系在分化狀態(tài)不能下調(diào)外源的和內(nèi)源的多能標(biāo)記物。本質(zhì)上，這提示了我們預(yù)測(cè)為致癌傾向結(jié)果的分化和自我更新間的“分子戰(zhàn)爭(zhēng)(molecular war)”。我們將通過(guò)以下步驟優(yōu)化鑒別hESC和iPSC 細(xì)胞培養(yǎng)物中惡性細(xì)胞的基因列表1)分析相對(duì)于未分化的hESC和IPSC和人胚胎分裂球，在EC(胚胎瘤)細(xì)胞中過(guò)表達(dá)的基因，幻交叉引用基因列表以包括來(lái)自Aim 1(用于鑒別癌干細(xì)胞)的那些，和幻加入分化的體細(xì)胞和生殖細(xì)胞系(后者保留對(duì)抗分化的多能干細(xì)胞)的基因。然后，我們將使用免疫缺陷小鼠實(shí)驗(yàn)來(lái)根據(jù)基于單細(xì)胞基線基因表達(dá)診斷的惡性潛能評(píng)估亞群的致癌能力。CNV分析。染色體變異與多能人干細(xì)胞群中的不穩(wěn)定相關(guān)，具有通常觀察到的染色體缺失和獲得?？墒牵瑤缀鯖](méi)有研究論述精細(xì)結(jié)構(gòu)、高通量方法以評(píng)估多位點(diǎn)的拷貝數(shù)。我們建議采納我們的技術(shù)在獨(dú)立來(lái)源的多能干細(xì)胞系中評(píng)估基因組范圍的CNV數(shù)；CNV的變化反映了亞染色體的不穩(wěn)定。開(kāi)始，我們?cè)O(shè)計(jì)了特異的用于加至我們的基因/基因座列表的識(shí)別橫過(guò)基因組的重復(fù)的探針組，包括我們的實(shí)驗(yàn)室事先觀察到的那些(圖6)。在其初始設(shè)計(jì)中，SCAD可容納多至1000個(gè)標(biāo)記物的分析。CNV分析可商業(yè)購(gòu)得并可與hESCsliPSC 中的基因組的不穩(wěn)定性相關(guān)。實(shí)施例8 設(shè)計(jì)鑒別和定量癌干細(xì)胞的自動(dòng)化設(shè)備設(shè)計(jì)自動(dòng)化設(shè)備以鑒別癌干細(xì)胞并以細(xì)胞表面表現(xiàn)型和基因表達(dá)的組合為基礎(chǔ)計(jì)算其在腫瘤中的頻率。通過(guò)使用本文中所述的優(yōu)化的標(biāo)記物/遺傳分析，使用相似的策略，以單細(xì)胞中分化的和未分化的狀態(tài)的標(biāo)記物的共表達(dá)為基礎(chǔ)，鑒別具有惡性潛能的細(xì)胞。該設(shè)備將制得胚胎體或腫瘤針刺活組織檢查樣本的單細(xì)胞懸液，分離細(xì)胞亞群(上皮的、分化的、未分化的)，然后進(jìn)行成百上千個(gè)單細(xì)胞的qRT-PCR，并測(cè)量腫瘤或多能細(xì)胞培養(yǎng)物的干細(xì)胞含量。這樣的全自動(dòng)設(shè)備將消除目前癌干細(xì)胞流式細(xì)胞分類(lèi)所需的勞動(dòng)密集型步驟，允許真正的不用手的(hand-off)、床邊的診斷工具，其需要少于100，000個(gè)細(xì)胞以分離足夠用于定量癌干細(xì)胞的PCR分析的癌細(xì)胞。微流體芯片技術(shù)所具有的自動(dòng)操作、有效性和低成本將使得個(gè)體化、快速的遺傳診斷變?yōu)榭赡?。本系統(tǒng)的核心是微流體細(xì)胞分類(lèi)儀。該設(shè)備從碎片(壞死的細(xì)胞和其他顆粒)分離活的細(xì)胞(上皮細(xì)胞或培養(yǎng)的多能細(xì)胞或其產(chǎn)物)，使用來(lái)自多達(dá)5個(gè)不同的表面標(biāo)記物的熒光信號(hào)從單細(xì)胞懸液中分類(lèi)出細(xì)胞，并將其放在單獨(dú)的小箱中以用于隨后的遺傳研究。其他的上游步驟，如消化腫瘤或細(xì)胞培養(yǎng)物以獲得細(xì)胞懸液以及用熒光表面標(biāo)記物染色細(xì)胞，也可以包括在本系統(tǒng)內(nèi)。系統(tǒng)被如何用于腫瘤分析如下所述一旦獲得了活組織檢查樣本，醫(yī)生將會(huì)將樣本放在此系統(tǒng)的輸入部分。通過(guò)利用用戶友好的計(jì)算機(jī)界面，醫(yī)生將設(shè)立分類(lèi)和遺傳分析的必要參數(shù)如表面標(biāo)記物的數(shù)目和類(lèi)型，所需PCR循環(huán)的數(shù)目等，并且機(jī)器將進(jìn)行其余的不要人的干預(yù)的步驟?；谙惹白C明的技術(shù)，該系統(tǒng)將允許至少30個(gè)細(xì)胞/秒的分類(lèi)處理量。單細(xì)胞分析設(shè)備(SCAD)可以是模塊化的(圖7)并以整體的全自動(dòng)的方式進(jìn)行以下步驟1)消化組織將組織放置在設(shè)備輸入部分。向設(shè)備中引入適當(dāng)?shù)拿覆⒘魅胍赃M(jìn)行細(xì)胞外基質(zhì)的消化以得到細(xì)胞懸液。2)從碎片中分離活細(xì)胞懸液典型地含有平均大小為 10至15微米的活細(xì)胞，而碎片物質(zhì)的平均大小大約為5微米。與活細(xì)胞相比，有時(shí)候死物質(zhì)的量相對(duì)高，因此濾除死物質(zhì)對(duì)有效分離細(xì)胞是重要的。通過(guò)將消化的組織懸液流入允許根據(jù)顆粒大小分開(kāi)流體流的微流體“超材料”，我們完成了此步驟。幻染色通過(guò)在微流體設(shè)備不同的間隔使用適當(dāng)?shù)谋砻鏄?biāo)記物染色過(guò)濾的單細(xì)胞懸液。使用多達(dá)5個(gè)不同標(biāo)記物的染色在獲得高純度癌細(xì)胞群中是有用的。4)分類(lèi)被染色的單細(xì)胞懸液流入微流體設(shè)備的下一個(gè)間隔，以從其余的細(xì)胞中分類(lèi)出癌細(xì)胞。泊松統(tǒng)計(jì)和蒙特卡洛模擬表明，在99% 的置信水平內(nèi)，為了能夠檢測(cè)癌干細(xì)胞中2倍的變化，僅僅需要分類(lèi)2，000至20，000個(gè)癌細(xì)胞。目前，使用流式細(xì)胞術(shù)不能有效地分類(lèi)這樣小數(shù)量的細(xì)胞，因?yàn)镕ACS所需要的初始樣本大小為大約100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞。我們使用基于微流體的不確定地循環(huán)密封的、分離的小容積環(huán)境中的分類(lèi)實(shí)現(xiàn)此目的，所述環(huán)境不浪費(fèi)細(xì)胞?；诹黧w的微流體細(xì)胞分類(lèi)儀已經(jīng)證實(shí)了具有接近50個(gè)細(xì)胞/秒處理量的微流體細(xì)胞分類(lèi)儀，其中細(xì)胞以高速流過(guò)激光束(參見(jiàn)Di Carlo等人，Lab Chip 2006 ；6 1445-1449)，檢測(cè)和分析散射的光。更快的電子學(xué)和更有效的成像設(shè)備允許以數(shù)量級(jí)的幅度改善處理量，其將分類(lèi)時(shí)間降低至少于10分鐘。平行分類(lèi)以在可被獨(dú)立定址的密集的、2D列陣的微流體間隔上捕獲細(xì)胞為基礎(chǔ)開(kāi)發(fā)細(xì)胞分類(lèi)儀(上述圖7B和圖7C)。細(xì)胞被流入分類(lèi)儀列陣并被微制造的籠狀體捕獲。 這樣的籠狀體以前被證實(shí)在自由流動(dòng)的懸液中具有超過(guò)50%的單細(xì)胞捕獲效率(Di Carlo 等人，上述)。當(dāng)所有籠狀體被填滿后，微流體閥門(mén)被關(guān)閉，使用定制設(shè)計(jì)的計(jì)算機(jī)控制的光、以鑒別致癌細(xì)胞所需的全部5種熒光顏色成像列陣。該新的芯片還允許相差成像，其可以證實(shí)對(duì)研究細(xì)胞形態(tài)學(xué)是有用的。被鑒別的致癌細(xì)胞被流入下一個(gè)模塊用于裂解，而剩下的細(xì)胞被流出芯片。這種新的細(xì)胞分類(lèi)儀允許用非常小的初始細(xì)胞數(shù)進(jìn)行工作，因?yàn)榧?xì)胞可被循環(huán)許多次且因此不被浪費(fèi)。目前的微流體芯片技術(shù)允許我們?cè)?x 3cm面積上放置接近10，000個(gè)這些組件，其可被使用目前技術(shù)水平的成像器(如被Fluidigm Biomark 系統(tǒng)所使用的一個(gè))快速地詢問(wèn)(單攝)。此細(xì)胞分類(lèi)儀具有接近30個(gè)細(xì)胞/秒的處理量。與基于流體的細(xì)胞分類(lèi)儀相反，使用平行分類(lèi)設(shè)備的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是分類(lèi)和PCR期間的成像可通過(guò)相同的成像器進(jìn)行，因此允許我們將熒光和形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)與個(gè)體細(xì)胞的遺傳數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)。細(xì)胞裂解和mRNA捕獲被分類(lèi)的癌干細(xì)胞被流入下一個(gè)模塊用于在單獨(dú)的小室中裂解?？梢栽诤衞ligo-dT小珠的柱上捕獲mRNA，如通常所述的在小珠上逆轉(zhuǎn)錄 (Marcus等人，Anal Chem2006 ；78 :3084-3089)并通過(guò)開(kāi)發(fā)用于Heliscope的新基因測(cè)序規(guī)程加工出(process off)芯片，或可被轉(zhuǎn)移至宏觀的孔(微升范圍)并混合目前的規(guī)程后預(yù)擴(kuò)增基因的組的試劑。預(yù)擴(kuò)增的樣本被轉(zhuǎn)移至與Fluidigm Dynamic列陣芯片相似的模塊用于qRT-PCR并確定真正的癌干細(xì)胞含量。基于正常乳腺和血干細(xì)胞以及結(jié)腸、頭和頸和乳腺癌干細(xì)胞的分析，我們鑒別了一個(gè)新的單細(xì)胞分析，其第一次使精確地并明確地鑒別和計(jì)數(shù)活組織檢查樣本及培養(yǎng)的多能干細(xì)胞群中的癌干細(xì)胞成為可能。作為原理的證據(jù)，我們將此分析用于單個(gè)結(jié)腸癌細(xì)胞的分析。為此目的，我們使用FACS從兩個(gè)不同患者建立的早期傳代異體移植物分類(lèi) ⑶66+CD44系結(jié)腸癌細(xì)胞。這些標(biāo)記物允許腫瘤中結(jié)腸癌干細(xì)胞(CoCSC)大約3_5倍的富集。我們推測(cè)用這些標(biāo)記物分離的癌細(xì)胞僅僅部分富集了 CoCSC。單細(xì)胞基因表達(dá)分析及隨后的致癌性研究證明實(shí)際上CD66+CD44+系細(xì)胞是CoCSC和非致癌細(xì)胞的混合物，此分析能用于更精確地鑒別活組織檢查樣本中CoCSC的頻率。單細(xì)胞分析揭示了是正常結(jié)腸隱窩的提示的結(jié)腸癌細(xì)胞的分級(jí)發(fā)育結(jié)構(gòu)。值得注意地，我們發(fā)現(xiàn)結(jié)腸腫瘤中的大多數(shù)未成熟細(xì)胞表達(dá)TERT，其是一種對(duì)腫瘤的長(zhǎng)期維持是重要的端粒酶復(fù)合物的成分。標(biāo)記正常結(jié)腸干細(xì)胞的LGR5的表達(dá)也被限制在未成熟的細(xì)胞。相反地，成熟結(jié)腸隱窩細(xì)胞表達(dá)的基因 (包括MUC2、‘ CK20、CA-2以及特別地⑶66a)被不共表達(dá)未成熟細(xì)胞標(biāo)記物，最顯著的是 TERT的細(xì)胞表達(dá)。這表明這些細(xì)胞像正常成熟的上皮隱窩細(xì)胞一樣，在其進(jìn)行廣泛的有絲分裂的能力上具有限制性。事實(shí)上，我們已經(jīng)將⑶66a+(分化的結(jié)腸癌細(xì)胞)和⑶66a"‘ 結(jié)腸癌細(xì)胞移植至免疫缺陷小鼠。CD66a'細(xì)胞形成腫瘤(6次注射中的5次)而CD66+細(xì)胞不形成(5次注射中的0次)。相似地，在被檢測(cè)的2個(gè)人乳腺癌腫瘤中，當(dāng)在免疫缺陷小鼠模型中檢測(cè)時(shí)，⑶66ew細(xì)胞被富集了癌干細(xì)胞。這些結(jié)果證明單細(xì)胞基因表達(dá)分析使活組織檢查樣本和培養(yǎng)物中的癌干細(xì)胞的鑒別和定量成為可能。實(shí)施例9 在血液和乳腺上皮組織二者中，被正常干細(xì)胞和癌干細(xì)胞分享的基因表達(dá)標(biāo)記近年來(lái)漸漸明確癌干細(xì)胞可來(lái)自不同的細(xì)胞間隔。一些可能來(lái)自失去干細(xì)胞池?cái)U(kuò)增限制的突變干細(xì)胞。其他的來(lái)自失去正常限制其能進(jìn)行的有絲分裂數(shù)目的計(jì)數(shù)機(jī)制的更分化的早期祖細(xì)胞。當(dāng)然，來(lái)自干細(xì)胞或祖細(xì)胞的癌或白血病干細(xì)胞的許多標(biāo)記物是不同的?？墒牵豢紤]來(lái)源的細(xì)胞，干細(xì)胞將保持自我更新的能力。我們認(rèn)為原因可能是在來(lái)自干細(xì)胞分隔或部分分化的后代的癌干細(xì)胞中調(diào)節(jié)自我更新的一些路徑被其彼此地以及與正常HSC分享。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，我們分析了被正常小鼠HSC和來(lái)自祖細(xì)胞(即自我更新群)而非來(lái)自正常祖細(xì)胞(即非自我更新群)的鼠白血病干細(xì)胞表達(dá)的基因是否也被人乳腺癌干細(xì)胞而非其非致癌的相應(yīng)物表達(dá)。顯著地，人癌干細(xì)胞，而不是其非致癌相應(yīng)物， 過(guò)表達(dá)這些基因(圖8)。我們還生成了 2個(gè)其他的基因列表，以鑒別其他潛能的候選i) 被乳腺癌干細(xì)胞和正常乳腺干細(xì)胞表達(dá)的，而非被非致癌的癌細(xì)胞或成熟乳腺上皮祖細(xì)胞表達(dá)的基因；ii)被正常人HSC和人乳腺癌干細(xì)胞表達(dá)而非被人血祖細(xì)胞或非致癌乳腺細(xì)胞表達(dá)的基因。這些基因的許多與自我更新和癌相關(guān)聯(lián)。這些包括胰島素生長(zhǎng)因子結(jié)合配偶體 IGFBP3、HOX 家族成員 H0XA3、H0XA5、MElSl 以及轉(zhuǎn)錄因子如 ETS1、ETS2、RUNX2 和 STAT3。 檢測(cè)了轉(zhuǎn)錄因子STAT3是否真正是癌干細(xì)胞調(diào)節(jié)子。STAT3在ES細(xì)胞和HSC細(xì)胞的維持中均起作用。小鼠和人乳腺癌干細(xì)胞的基因?qū)W分析都揭示許多STAT3激活的轉(zhuǎn)錄物被癌干細(xì)胞過(guò)表達(dá)。其次，當(dāng)我們檢測(cè)乳腺腫瘤的免疫化學(xué)分析時(shí)，趨向于在癌和蛋白質(zhì)浸入邊緣濃縮的STAT3陽(yáng)性細(xì)胞在腫瘤內(nèi)部的看似更分化的細(xì)胞中沒(méi)被發(fā)現(xiàn)。最后，存在STAT3的小分子抑制劑。這樣的抑制劑可在癌干細(xì)胞模型中檢測(cè)。檢測(cè)了 STAT3抑制劑葫蘆素對(duì)鼠乳腺癌干細(xì)胞的克隆形成能力的效果。簡(jiǎn)言之(a short)，M小時(shí)暴露于該抑制劑降低了克隆數(shù)的 50% (ρ < 0. 02，t檢驗(yàn))。這些結(jié)果表明STAT3至少在一些乳腺癌干細(xì)胞中起重要作用。目標(biāo)第二基因是MEISl。MEISl優(yōu)選被正常血和乳腺干細(xì)胞、白血病干細(xì)胞和乳腺癌干細(xì)胞表達(dá)。遺傳研究表明MEISl的表達(dá)是正常血干細(xì)胞及其白血病相應(yīng)物自我更新和維持都絕對(duì)需要的。MEISl可調(diào)節(jié)乳腺癌干細(xì)胞的更新。正常和癌干細(xì)胞都表達(dá)的特別感興趣的候選基因包括CAV1、GAS1、MAP4K4(激酶) MYLK (激酶)、PTK2 (激酶)、DAPKl (激酶),LATS (激酶)、F0SL2、AKT3 (激酶)、PTPRC (酪氨酸硫酸酶)、MAFF(癌基因)、RRAS2(RAS 相關(guān)的)、NFKB、R0B01、IL6ST (激活 STAT3) ,CRlMU PLS3、S0X2、CXCL14、ETSU ETS2、MEISl和STAT3,以及CD47。癌干細(xì)胞但非正常干細(xì)胞過(guò)表達(dá)的目標(biāo)候選基因包括RGS4、CAV2、MAF (癌基因)WT1 (癌基因)、SNAI2、FGFR2、MEIS2、 101、103、ID4 和 FOXCl。實(shí)施例10 造血干細(xì)胞的全轉(zhuǎn)錄組分析在此實(shí)施例中，我們尋找使用造血干細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組分析。此實(shí)施例的一般性概括在圖9中顯示。在本實(shí)施例中，從測(cè)試受試者中分離懷疑包含造血干細(xì)胞的細(xì)胞群。然后通過(guò)將細(xì)胞群暴露于已知造血干細(xì)胞標(biāo)記物(如CD34、Thyl等)的熒光抗體制備細(xì)胞，用于FACS分析。將細(xì)胞分類(lèi)至96-孔平板，使每一孔含有不超過(guò)一個(gè)單細(xì)胞。裂解分離的單細(xì)胞，將裂解物分成2部分。第一部分用于利用實(shí)時(shí)PCR的單細(xì)胞基因表達(dá)分析，基本上如實(shí)施例1中所描述的，通過(guò)使用允許根據(jù)表達(dá)(如⑶34+、⑶19-、 ⑶17-)的水平或存在區(qū)分HSC和非HSC的基因的選擇。在鑒定群中的HSC后，匯集來(lái)自鑒別為HSC的單細(xì)胞的裂解物。通過(guò)使用標(biāo)準(zhǔn)方法擴(kuò)增總mRNA來(lái)創(chuàng)制cDNA庫(kù)。然后使用如文本中描述的那些中的任何“次世代”方法測(cè)序cDNA。然后分析被測(cè)序的轉(zhuǎn)錄組以確定是否存在獨(dú)特的基因和/或表面標(biāo)記物。鑒定HSC獨(dú)特的表面標(biāo)記物后，利用商業(yè)可獲得的技術(shù)制備特異性結(jié)合表面標(biāo)記物的抗體。確認(rèn)抗體的特異性和有效性(如結(jié)合至分離的和/或重組的蛋白質(zhì))。然后用熒光的部分標(biāo)記抗體。然后可使用抗新發(fā)現(xiàn)的表面抗原的抗體在其他細(xì)胞群(如來(lái)自相同或不同受試者)上進(jìn)行FACS分類(lèi)和/或分析。實(shí)施例11 治療劑的分析在此實(shí)施例中，進(jìn)行候選治療劑的選擇。如上所述，分離靶細(xì)胞，如結(jié)腸癌干細(xì)胞和結(jié)腸癌細(xì)胞(分化的)，并在單細(xì)胞水平進(jìn)行分析。使用事先鑒別的靶細(xì)胞特異的標(biāo)記物從活組織檢查樣本中分離靶細(xì)胞(如使用靶細(xì)胞特異的抗體和/或靶細(xì)胞特異核酸的熒光標(biāo)記的FACS分離)。靶細(xì)胞被分離至含有單細(xì)胞的可定地址的位置。然后將被分離的細(xì)胞暴露于候選治療劑(如抗體、連接毒素的抗體、小分子)的庫(kù)。然后收集細(xì)胞并分析基因表達(dá)模式和/ 或細(xì)胞活力。成功的候選治療劑可以是靶向要死亡的細(xì)胞的那些。另外可選擇地，候選治療劑可改變與來(lái)自非疾病狀態(tài)細(xì)胞的表達(dá)模式相比已知被錯(cuò)誤調(diào)節(jié)(如上調(diào)或下調(diào))的基因的表達(dá)。將靶細(xì)胞暴露于候選治療劑可以引起核酸表達(dá)模式的改變，其更接近地類(lèi)似于正常(即非疾病狀態(tài))細(xì)胞的模式。然后將有希望殺傷或改變靶細(xì)胞的候選治療劑暴露于正常細(xì)胞以確定其作為治療劑的潛在用途(如，如果候選試劑殺傷靶細(xì)胞和正常細(xì)胞，則排除其作為可用試劑的可能)。
3權(quán)利要求
1.一種鑒別異質(zhì)性實(shí)體腫瘤樣本中不同細(xì)胞群的方法，其包括 從所述腫瘤隨機(jī)分隔單獨(dú)的細(xì)胞至分離的位置；在分離的位置中進(jìn)行單獨(dú)被分隔的細(xì)胞的多個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄組分析；和進(jìn)行聚類(lèi)分析以鑒別一個(gè)或多個(gè)不同的細(xì)胞群。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述單獨(dú)的細(xì)胞在所述分隔前不被富集。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的轉(zhuǎn)錄組分析在至少1000個(gè)單獨(dú)的細(xì)胞上同時(shí)進(jìn)行。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的轉(zhuǎn)錄組分析通過(guò)使用核酸分析進(jìn)行。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的分離的位置是在平面基質(zhì)上。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的隨機(jī)分隔在微流體系統(tǒng)中進(jìn)行。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的轉(zhuǎn)錄組分析包括分析表達(dá)的RNA、非表達(dá)的 RNA或二者。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的轉(zhuǎn)錄組分析是全轉(zhuǎn)錄組分析。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的轉(zhuǎn)錄組分析包括使用一單套引物對(duì)擴(kuò)增RNA。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述引物對(duì)是非巢式引物。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)錄組分析同時(shí)地或基本實(shí)時(shí)地在所述單獨(dú)的細(xì)胞的全部或亞類(lèi)上進(jìn)行。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞群是正常干細(xì)胞、正常祖細(xì)胞、正常成熟細(xì)胞、炎癥性細(xì)胞、癌細(xì)胞、癌干細(xì)胞或非致癌的干細(xì)胞。
13.一種分析來(lái)自受試者的異質(zhì)性腫瘤活組織檢查樣本的方法，其包括 隨機(jī)地將來(lái)自活組織檢查樣本的細(xì)胞分隔至分離的位置中；在單獨(dú)分隔的細(xì)胞的至少50個(gè)基因上進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析；和使用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來(lái)鑒別所述腫瘤的一個(gè)或多個(gè)特征。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中不事先富集細(xì)胞類(lèi)型而完成進(jìn)行步驟。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中特征是癌細(xì)胞的存在、不存在或數(shù)目。
16.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中特征是干細(xì)胞、早期祖細(xì)胞、初始分化的祖細(xì)胞、后期分化的祖細(xì)胞或成熟細(xì)胞的存在、不存在或數(shù)目。
17.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中特征是治療劑消除一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞的有效性。
18.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，進(jìn)一步包括使用所述特征診斷所述受試者患有癌或癌階段。
19.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中特征是信號(hào)路徑的活性。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述信號(hào)路徑是癌干細(xì)胞、分化的癌細(xì)胞、成熟癌細(xì)胞或其組合特異的。
21.一種鑒別疾病狀態(tài)細(xì)胞使用的信號(hào)路徑的方法，其包括 從異質(zhì)性樣本隨機(jī)分隔細(xì)胞；在所述分隔的細(xì)胞上進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析； 使用轉(zhuǎn)錄組分析來(lái)鑒別至少一種疾病狀態(tài)細(xì)胞；將所述至少一種疾病狀態(tài)細(xì)胞的所述轉(zhuǎn)錄組分析與以下細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行比較a)非疾病狀態(tài)細(xì)胞；b)不同的疾病狀態(tài)細(xì)胞；和c)疾病狀態(tài)干細(xì)胞；和鑒別在以下細(xì)胞中表達(dá)的信號(hào)路徑⑴疾病狀態(tài)細(xì)胞，(ii)疾病狀態(tài)干細(xì)胞和(iii) 任選地不同疾病狀態(tài)細(xì)胞但不是非疾病狀態(tài)細(xì)胞，從而鑒別疾病狀態(tài)細(xì)胞使用的信號(hào)路徑。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述的疾病狀態(tài)是癌、潰瘍性結(jié)腸炎或炎癥性腸疾病。
23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述的信號(hào)路徑是所述疾病狀態(tài)細(xì)胞生存所需要的。
24.一種診斷受試者具有病狀的方法，其包括， 從異質(zhì)性樣本隨機(jī)分隔細(xì)胞；對(duì)被分隔的細(xì)胞進(jìn)行第一次轉(zhuǎn)錄組分析；通過(guò)將來(lái)自至少一種疾病狀態(tài)細(xì)胞的所述第一次轉(zhuǎn)錄組分析與來(lái)自非疾病狀態(tài)細(xì)胞的第二次轉(zhuǎn)錄組分析進(jìn)行比較，使用轉(zhuǎn)錄組分析來(lái)鑒別至少一種疾病狀態(tài)細(xì)胞，從而診斷所述受試者中與所述疾病狀態(tài)細(xì)胞相關(guān)的病狀的存在或不存在。
25.根據(jù)權(quán)利要求M所述的方法，其中所述疾病狀態(tài)是乳腺癌、結(jié)腸癌、潰瘍性結(jié)腸炎或炎癥性腸疾病。
26.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)錄組分析包括分析表達(dá)的RNA、非表達(dá)的 RNA或二者。
27.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)錄組分析是全轉(zhuǎn)錄組分析。
28.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述疾病狀態(tài)細(xì)胞是乳腺癌干細(xì)胞。
29.—種篩選治療劑的方法，其包括將具有疾病狀態(tài)細(xì)胞的第一受試者暴露于一個(gè)或多個(gè)檢測(cè)試劑； 從受試者目標(biāo)區(qū)域獲得異質(zhì)性腫瘤活組織檢查樣本；在至少一個(gè)來(lái)自所述異質(zhì)性腫瘤活組織檢查樣本的單獨(dú)的細(xì)胞上進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，其中所述的活組織檢查樣本包括一個(gè)或多個(gè)疾病狀態(tài)細(xì)胞；和將所述轉(zhuǎn)錄組分析與來(lái)自下述受試者的一個(gè)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行比較(i)不具有疾病狀態(tài)細(xì)胞的第二受試者；或( )所述暴露步驟前的第一受試者；和鑒別影響來(lái)自試驗(yàn)區(qū)域的細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組使其更像第二受試者或暴露前的第一受試者的那些細(xì)胞的制劑。
30.一種確定治療劑治療疾病的潛在有效性的方法，其包括將疾病狀態(tài)細(xì)胞的第一群分離至單獨(dú)的位置，其中所述單獨(dú)的位置包含一個(gè)單獨(dú)的細(xì)胞；確定來(lái)自至少一個(gè)所述單獨(dú)的細(xì)胞的至少一個(gè)核酸或蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，從而產(chǎn)生疾病狀態(tài)表達(dá)標(biāo)記；將疾病狀態(tài)細(xì)胞的第二群暴露于制劑；將所述疾病狀態(tài)細(xì)胞的第二群分離至單獨(dú)的位置，其中所述單獨(dú)的位置包含一個(gè)單獨(dú)的細(xì)胞；確定來(lái)自所述第二群的至少一個(gè)所述單獨(dú)的細(xì)胞的至少一個(gè)核酸或蛋白質(zhì)的表達(dá)水平；和將來(lái)自所述第二群的所述單獨(dú)的細(xì)胞的所述表達(dá)水平與所述疾病狀態(tài)表達(dá)標(biāo)記進(jìn)行比較，從而確定所述制劑治療所述疾病的有效性。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述暴露步驟在體內(nèi)進(jìn)行。
32.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述第一群和所述第二群從一個(gè)受試者分離而來(lái)。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述受試者是人。
34.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述疾病是癌、潰瘍性結(jié)腸炎或炎癥性腸疾病。
35.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述核酸或所述蛋白質(zhì)是癌干細(xì)胞標(biāo)記物。
36.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述表達(dá)水平是mRNA表達(dá)水平。
37.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中確定所述mRNA表達(dá)水平包括檢測(cè)10個(gè)或更多的核酸的表達(dá)或不表達(dá)。
38.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述表達(dá)水平是蛋白質(zhì)表達(dá)水平。
39.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述分離步驟包括將所述細(xì)胞的群暴露于特異性結(jié)合在所述單獨(dú)的細(xì)胞上存在的蛋白質(zhì)的抗體。
40.一種確定受試者對(duì)治療劑反應(yīng)可能性的方法，其包括將來(lái)自受試者的細(xì)胞的群分離至單獨(dú)的位置，其中所述單獨(dú)的位置包括單獨(dú)的細(xì)胞并且其中至少一個(gè)所述單獨(dú)的細(xì)胞是疾病狀態(tài)細(xì)胞；確定來(lái)自至少一個(gè)所述疾病狀態(tài)的單獨(dú)的細(xì)胞的至少一個(gè)核酸或蛋白質(zhì)的表達(dá)水平， 其中所述核酸或蛋白質(zhì)是治療劑的靶標(biāo)；和基于所述至少一個(gè)核酸或蛋白質(zhì)的表達(dá)水平確定受試者反應(yīng)的可能性。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中所述表達(dá)水平是mRNA表達(dá)水平。
42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中確定所述mRNA表達(dá)水平包括檢測(cè)10個(gè)或更多個(gè)核酸的表達(dá)或不表達(dá)。
43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中所述表達(dá)水平是蛋白質(zhì)表達(dá)水平。
44.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中所述分離步驟包括將所述細(xì)胞的群暴露于特異性結(jié)合在所述單獨(dú)的細(xì)胞上存在的蛋白質(zhì)的抗體。
45.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中所述治療劑是抗癌劑。
全文摘要
提供了通過(guò)分析從單細(xì)胞分析中得到的一組基因的表達(dá)診斷和預(yù)后疾病的方法。分類(lèi)允許優(yōu)化治療，以及確定是否進(jìn)行特定的治療，以及如何優(yōu)化劑量、選擇治療等等。單細(xì)胞分析還提供了靶向疾病狀態(tài)細(xì)胞中的突變和/或途徑的治療的鑒定和開(kāi)發(fā)。
文檔編號(hào)G01N33/53GK102333891SQ201080009805
公開(kāi)日2012年1月25日 申請(qǐng)日期2010年1月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月20日
發(fā)明者A·萊拉, M·F·克拉克, M·迪恩, P·D·達(dá)勒巴, S·R·夸克, T·卡利斯基, 劉慧萍, 王建斌 申請(qǐng)人:利蘭·斯坦福青年大學(xué)托管委員會(huì)