專利名稱：生物學(xué)流體中供檢測(cè)新生兒敗血病用的生物標(biāo)志的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明關(guān)注使用全局蛋白質(zhì)組方法來(lái)鑒定并檢測(cè)生物學(xué)流體中的新生兒敗血病和新生兒敗血病相關(guān)并發(fā)癥的生物標(biāo)志。
背景技術(shù)：
敗血病是新生兒加強(qiáng)護(hù)理收治的新生兒的一項(xiàng)嚴(yán)重問題。它與死亡率、發(fā)病率升高、和住院期長(zhǎng)度延長(zhǎng)有關(guān)。如此，這些感染的人力和財(cái)政成本兩者都較高?？赡艿?“排除”或“疑似”)早期發(fā)作敗血癥仍然是新生兒加強(qiáng)護(hù)理病房(NICU)的最常見收治診斷。雖然早期發(fā)作敗血病的比率隨早產(chǎn)和低出生重量?jī)烧叩某潭榷黾?，但是尚未顯示特定的實(shí)驗(yàn)室測(cè)試足夠精確地容許鑒定患有“真實(shí)的”血流感染，并且因此需要用全程抗生素治療的患者。因此，抗生素使用是“經(jīng)證實(shí)的”敗血病的比率的許多倍，而且這些藥劑的過(guò)度使用促成新生兒加強(qiáng)護(hù)理病房中的抗性生物體的生長(zhǎng)(Clarke 2004)。另外，住院期的延長(zhǎng)不能測(cè)量地增加NICU的護(hù)理成本，而且提高來(lái)自隨后醫(yī)院獲得的微生物的醫(yī)院敗血癥的風(fēng)險(xiǎn)。美國(guó)衛(wèi)生與人類服務(wù)部疾病控制和預(yù)防中心將早期發(fā)作感染定義為在住院期間在生命的前72小時(shí)期間發(fā)生的感染，而晚期發(fā)作感染在該時(shí)間期后發(fā)生(Lopez 2002)。醫(yī)院感染相當(dāng)于晚期發(fā)作，或生命的前72小時(shí)后的感染(Craft 2001)。感染率可以規(guī)定為收治百分比、活產(chǎn)嬰兒百分比、或者按每1000患者日的感染數(shù)目計(jì)。早期發(fā)作感染率以約千分之二活產(chǎn)一致地運(yùn)行。因?yàn)?0%至30%的早產(chǎn)新生兒可以具有兩種或更多種醫(yī)院感染事件，所以每患者日的感染率可能給出晚期發(fā)作感染強(qiáng)度的更準(zhǔn)確的觀念，而每患者組 (收治、活產(chǎn)嬰兒、出生重量范圍、孕齡范圍)的比率給出發(fā)作或發(fā)生率的良好觀念。新生兒加強(qiáng)護(hù)理病房(Ni⑶)醫(yī)院或晚期發(fā)作感染率在過(guò)去十年里已經(jīng)升高 (Craft 2001, Zafar 2001)。每例收治形成醫(yī)院感染的新生兒的總數(shù)從6. 2% (Ferguson 1996)變化至33% (Hentschel 1999)，或者在以每1000患者日的總感染報(bào)告時(shí)，比率從 4. 8 (Ferguson 1996)變化至22 (Drews 1995)。血流感染(醫(yī)院敗血病)從3%變化至的收治(Ferguson 1996，Hentschel 1999，Bergerl998, Horbar 2001，Nagata 2002)。感染率的可變性取決于孕齡、為報(bào)告調(diào)查的嬰兒的分布、及特定的環(huán)境和護(hù)理實(shí)踐((Paynes 1996)。用于診斷真正的早期發(fā)作敗血病的黃金標(biāo)準(zhǔn)仍然是已知病原體的陽(yáng)性血液培養(yǎng)的發(fā)現(xiàn)。通常，在新生兒在臨床過(guò)程中具有下列至少兩項(xiàng)特征和ImL或更大體積的陽(yáng)性血液培養(yǎng)時(shí)，會(huì)認(rèn)為存在早期發(fā)作敗血病1)大于100. 4° F的發(fā)熱、分娩期間延長(zhǎng)的過(guò)早膜破裂(大于12小時(shí)持續(xù)時(shí)間)、 或推測(cè)的絨毛膜羊膜炎的母體史2)分娩時(shí)出現(xiàn)惡臭或化濃的羊水3)與敗血病一致的臨床發(fā)現(xiàn)，其可以包括下列任何體征低的5分鐘阿普加 (Apgar)評(píng)分(小于6)、蒼白、發(fā)紺、低血壓、呼吸急促、心動(dòng)過(guò)速、呼吸暫停、腹部膨脹、喂養(yǎng)不良、或嗜睡4)支持實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)，其包括CBC上的WBC計(jì)數(shù)< 8000/mm3或> ;35，000/mm3 ;I:T嗜中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)> 2 ；CRP > 8 ；或胸腔放射照片上的肺炎。這提出需要鑒定分娩時(shí)獲得的生物學(xué)流體內(nèi)的敗血病相關(guān)生物標(biāo)志，其能夠鑒定患有早期發(fā)作新生兒敗血病和新生兒敗血病相關(guān)并發(fā)癥的受試者以便于早期治療。新生兒敗血病及其相關(guān)發(fā)病率的風(fēng)險(xiǎn)降低可以較多地取決于有風(fēng)險(xiǎn)患者的較早期鑒定。發(fā)明概述在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種用于在哺乳動(dòng)物受試者中診斷新生兒敗血病的方法，包括(a)相對(duì)于正常的生物學(xué)流體或已知指明新生兒敗血病的生物學(xué)流體中的水平， 在自所述受試者獲得的生物學(xué)流體的樣品中測(cè)試一種或多種選自下組的蛋白質(zhì)的水平 C-反應(yīng)蛋白前體(SEQ ID N0:1)、白介素-1受體輔助蛋白前體(SEQ ID NO :2)、白介素-6 前體(SEQ ID NO 3)、白介素-1受體樣1前體(SEQ ID NO 4)、血清淀粉狀蛋白A蛋白前體 (SEQ ID NO 5)、CD5 抗原樣前體(SEQ ID NO 6)、β -2-微球蛋白前體(SEQ ID NO 7)、骨髓蛋白聚糖前體(SEQ ID NO :8)、硒結(jié)合蛋白1(SEQ ID NO :9)、脂多糖結(jié)合蛋白前體(SEQ ID NO :10)、硫酸軟骨素蛋白聚糖4前體(SEQ ID NO :11)、骨橋蛋白前體(SEQ ID NO 12), P⑶P解離抑制劑2(SEQ ID NO: 13)、碳酸酐酶2 (SEQ IDNO :14)、嗜中性粒細(xì)胞明膠酶關(guān)聯(lián)脂籠蛋白前體(SEQ ID NO 15)、膠原α -5 (IV)鏈前體(SEQ ID NO 16)、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子前體(SEQ ID NO 17)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子1前體(SEQ ID NO 18)、蛋白質(zhì)激酶C結(jié)合蛋白NELL2前體(SEQID NO 19)、Neudesin前體(SEQ ID NO 20)、蛋白質(zhì)二硫化物異構(gòu)酶前體(SEQID NO 21)、核糖核酸酶胰前體(SEQ ID NO :22)、δ樣蛋白前體(SEQ IDNO 23)、 嗜鉻粒蛋白-A前體(SEQ ID NO :24)、骨調(diào)蛋白前體(SEQ ID NO 25)、膠原α-2⑴鏈前體(SEQ ID NO 26)、原低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1前體(SEQID NO :27)、層粘連蛋白亞基 Y-I前體(SEQ ID NO 28)、層粘連蛋白亞基β-1前體(SEQ ID NO 29)、膠原α-I(II)鏈前體(SEQ ID NO :30)、金屬蛋白酶抑制劑1前體(SEQ ID NO :31)、蛋白FAM3C前體(SEQ ID NO 32)、α -輔肌動(dòng)蛋白-1 (SEQ ID NO 33)、F-肌動(dòng)蛋白加帽蛋白亞基α -1 (SEQ ID NO ；34)、氨肽酶N(SEQ ID NO :35)、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白1前體(SEQ ID NO :36)、細(xì)胞粘附分子 1 前體(SEQ ID NO 37)、組織蛋白酶 B 前體(SEQ ID NO 38)、Exostosin-2 (SEQ ID NO :39)、組織蛋白酶D前體(SEQ ID NO :40)、神經(jīng)源性基因座notch同系物蛋白3前體 (SEQ ID NO :41)、半胱氨酸蛋白酶抑制劑M前體(SEQ IDNO :42)、Noelin前體(SEQ ID N0: 43)、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白2前體(SEQID NO :44)、內(nèi)質(zhì)蛋白前體(SEQ ID NO :45)、原蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin 9型前體(SEQ ID NO :46)、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白復(fù)合物酸不穩(wěn)定性鏈前體(SEQ ID N0:47)、埃茲蛋白(SEQ ID NO :48)、肝型脂肪酸結(jié)合蛋白(SEQ ID NO :49)、可能的 G 蛋白偶聯(lián)受體 116 前體(SEQ ID NO 50) ,Seprase (SEQ ID NO :51)、癌蛋白誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄物3蛋白前體(SEQ ID NO :52)、缺氧上調(diào)型蛋白1前體(SEQ ID NO 53)、跨高爾基體網(wǎng)絡(luò)膜內(nèi)在蛋白2前體(SEQ IDNO 54)、轉(zhuǎn)酮酶(SEQ ID NO 55)、受體型酪氨酸蛋白質(zhì)磷酸酶F前體(SEQ IDNO 56)、細(xì)胞間粘附分子1前體(SEQ ID NO 57)、低密度脂蛋白受體前體(SEQID NO 58)、78kDa葡萄糖調(diào)節(jié)型蛋白前體(SEQ ID NO 59)、punc ell相鄰物前體(SEQ ID NO :60)、甘露糖基寡糖1，2-α -甘露糖苷酶IA(SEQ ID NO :61)、 丙酮酸激酶同工酶M1/M2(SEQ ID NO :62)、基質(zhì)金屬蛋白酶9 (SEQ IDNO :64)、α-1-酸性糖蛋白1(SEQ ID NO :65)、和應(yīng)激誘導(dǎo)的磷蛋白1 (SEQ IDNO 63)；并(b)若所述水平相對(duì)于所述正常的生物學(xué)流體中的水平顯示統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異，或者相對(duì)于所述已知指明新生兒敗血病的生物學(xué)流體中的水平不顯示統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異，則診斷出所述受試者患有新生兒敗血病。在某些實(shí)施方案中，方法包括測(cè)試任意組合的至少兩種、至少三種、至少四種、至少五種、至少六種、至少七種等的所列蛋白質(zhì)的水平。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，受試者是人患者。在某些實(shí)施方案中，生物學(xué)流體選自下組臍帶血、腦脊液、和新生兒血清。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，生物學(xué)流體是臍帶血。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在出生的M小時(shí)內(nèi)確定診斷。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用適合于測(cè)定所述蛋白質(zhì)水平的裝置來(lái)執(zhí)行測(cè)試。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)使用由合適的處理器執(zhí)行的軟件程序來(lái)實(shí)施測(cè)試。在某些實(shí)施方案中，程序包含在儲(chǔ)存于實(shí)體介質(zhì)上的軟件中。在某些其它實(shí)施方案中，實(shí)體介質(zhì)選自下組 ⑶-ROM、軟盤、硬盤、DVD、和與處理器關(guān)聯(lián)的存儲(chǔ)器。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法進(jìn)一步包括制備記錄診斷或測(cè)試結(jié)果的報(bào)告的步驟。在一個(gè)實(shí)施方案中，將報(bào)告記錄或儲(chǔ)存于實(shí)體介質(zhì)上。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，實(shí)體介質(zhì)是紙。在另一個(gè)實(shí)施方案中，實(shí)體介質(zhì)選自下組⑶-ROM、軟盤、硬盤、DVD、和與處理器關(guān)聯(lián)的存儲(chǔ)器。在某些其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法進(jìn)一步包括將所述診斷的結(jié)果與感興趣方通信的步驟。在一個(gè)實(shí)施方案中，感興趣方是患者或主治內(nèi)科醫(yī)生。在另一個(gè)實(shí)施方案中， 通信以書寫、通過(guò)電子郵件、或者通過(guò)電話進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方案中，方法包括測(cè)試蛋白質(zhì)胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白1前體(SEQ ID NO 36)、白介素-6前體(SEQ ID NO 3)、C-反應(yīng)蛋白前體(SEQ IDNO 1)、β-2-微球蛋白前體(SEQ ID NO :7)、組織蛋白酶B前體(SEQ ID NO :38)、半胱氨酸蛋白酶抑制劑M前體(SEQ ID NO :42)、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白2前體(SEQ ID NO :44)、基質(zhì)金屬蛋白酶 9 (SEQ ID NO :64)、金屬蛋白酶抑制劑1前體(SEQ ID NO :31)、和α-1-酸性糖蛋白1 (SEQ ID NO 65)的水平，并且若相對(duì)于正常的臍帶血，一種或多種所述測(cè)試蛋白質(zhì)在臍帶血樣品中顯示顯著差異，則診斷出所述受試者患有新生兒敗血病。在某些實(shí)施方案中，方法包括若相對(duì)于正常的臍帶血，所有所述測(cè)試蛋白質(zhì)在臍帶血樣品中顯示顯著差異，則診斷出所述受試者患有新生兒敗血病。在一個(gè)實(shí)施方案中，方法包括測(cè)試蛋白質(zhì)胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白1前體(SEQ ID NO 36)和白介素-6前體(SEQ ID NO 3)的水平，并且若相對(duì)于正常的臍帶血，一種或多種所述測(cè)試蛋白質(zhì)在臍帶血樣品中顯示顯著差異，則診斷出所述受試者患有新生兒敗血病。在其它實(shí)施方案中，方法包括測(cè)試蛋白質(zhì)胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白1前體(SEQ ID NO 36)和C-反應(yīng)蛋白前體(SEQ ID NO 1)的水平。在又一些其它實(shí)施方案中，方法包括測(cè)試蛋白質(zhì)胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白1前體(SEQ ID NO 36)和β_2_微球蛋白前體(SEQ IDNO 7)的水平。在又一些其它實(shí)施方案中，方法包括測(cè)試蛋白質(zhì)胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白1前體(SEQ ID NO 36)和組織蛋白酶B前體(SEQ ID NO 38)的水平。在又一些其它實(shí)施方案中，方法包括測(cè)試蛋白質(zhì)胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白1前體(SEQ ID Ν0:36)和半胱氨酸蛋白酶抑制劑M前體(SEQ IDNO 42)的水平。在又一些其它實(shí)施方案中，方法包括測(cè)試蛋白質(zhì)胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白1前體(SEQ ID NO 36)和胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白2前體(SEQ ID NO 44)的水平。在又一些其它實(shí)施方案中，方法包括測(cè)試蛋白質(zhì)胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白1前體(SEQ ID NO 36)和基質(zhì)金屬蛋白酶9 (SEQ IDNO 64)的水平。 在又一些其它實(shí)施方案中，方法包括測(cè)試蛋白質(zhì)胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白1前體(SEQ ID NO 36)和金屬蛋白酶抑制劑1前體(SEQ IDNO 31)的水平。在又一些其它實(shí)施方案中，方法包括測(cè)試蛋白質(zhì)胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白1前體(SEQ ID NO 36)和α 酸性糖蛋白 KSEQ ID NO 65)的水平。在某些實(shí)施方案中，通過(guò)免疫測(cè)定法、通過(guò)質(zhì)譜術(shù)、或者通過(guò)使用蛋白質(zhì)陣列來(lái)測(cè)定所列蛋白質(zhì)的水平。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了任一種或多種選自下組的蛋白質(zhì)在制造用于早期診斷受試者中的新生兒敗血病的生物學(xué)流體的蛋白質(zhì)組概況中的用途C-反應(yīng)蛋白前體 (SEQ ID NO :1)、白介素-1受體輔助蛋白前體(SEQ IDNO 2)、白介素-6前體(SEQ ID NO 3)、白介素-1受體樣1前體(SEQ ID NO 4)、血清淀粉狀蛋白A蛋白前體(SEQ ID NO :5)、 CD5抗原樣前體(SEQ ID NO :6)、β_2_微球蛋白前體(SEQ ID NO :7)、骨髓蛋白聚糖前體 (SEQ ID NO :8)、硒結(jié)合蛋白1 (SEQ ID NO :9)、脂多糖結(jié)合蛋白前體(SEQ ID Ν0:10)、硫酸軟骨素蛋白聚糖4前體(SEQ ID NO :11)、骨橋蛋白前體(SEQ ID N0:12)、P⑶P解離抑制劑2(SEQ ID NO: 13)、碳酸酐酶2 (SEQ ID NO :14)、嗜中性粒細(xì)胞明膠酶關(guān)聯(lián)脂籠蛋白前體(SEQ ID N0:15)、膠原α-5 (IV)鏈前體(SEQ ID NO :16)、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子前體(SEQ ID NO 17)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子1前體(SEQ IDNO 18)、蛋白質(zhì)激酶C結(jié)合蛋白NELL2 前體(SEQ ID NO: 19)、Neudesin前體(SEQ ID NO :20)、蛋白質(zhì)二硫化物異構(gòu)酶前體(SEQ ID NO :21)、核糖核酸酶胰前體(SEQ ID NO :22)、δ樣蛋白前體(SEQ ID Ν0:23)、嗜鉻粒蛋白-A前體(SEQ ID NO :24)、骨調(diào)蛋白前體(SEQ ID NO 25)、膠原α-2(1)鏈前體(SEQ IDNO :26)、原低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1前體(SEQ ID NO :27)、層粘連蛋白亞基γ-1前體(SEQ ID NO 28)、層粘連蛋白亞基β _1前體(SEQ ID NO 29)、膠原α -1 (II)鏈前體(SEQ ID NO 30)、金屬蛋白酶抑制劑1前體(SEQ ID NO 31)、蛋白FAM3C前體(SEQ ID NO 32)、 α-輔肌動(dòng)蛋白-1 (SEQ ID NO :33)、F_肌動(dòng)蛋白加帽蛋白亞基α-1 (SEQ ID NO :34)、氨肽酶N(SEQ ID NO 35)、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白1前體(SEQ ID NO 36)、細(xì)胞粘附分子1 前體(SEQ ID NO :37)、組織蛋白酶 B 前體(SEQ ID NO :38)、Exostosin_2 (SEQ ID NO :39)、 組織蛋白酶D前體(SEQ ID NO :40)、神經(jīng)源性基因座notch同系物蛋白3前體(SEQ IDNO 41)、半胱氨酸蛋白酶抑制劑M前體(SEQ ID NO :42)、Noelin前體(SEQ IDNO :43)、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白2前體(SEQ ID N0:44)、內(nèi)質(zhì)蛋白前體(SEQ ID N0:45)、原蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin 9型前體(SEQ IDNO :46)、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白復(fù)合物酸不穩(wěn)定性鏈前體(SEQ IDN0:47)、埃茲蛋白(SEQ ID NO :48)、肝型脂肪酸結(jié)合蛋白(SEQ ID NO :49)、可能的 G 蛋白偶聯(lián)受體 116 前體(SEQ ID NO 50), Seprase (SEQ ID NO :51)、癌蛋白誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄物3蛋白前體(SEQ ID NO 52)、缺氧上調(diào)型蛋白1前體(SEQID NO 53)、跨高爾基體網(wǎng)絡(luò)膜內(nèi)在蛋白2前體(SEQ ID NO 54)、轉(zhuǎn)酮酶(SEQID NO 55)、受體型酪氨酸蛋白質(zhì)磷酸酶F前體(SEQ ID NO 56)、細(xì)胞間粘附分子1前體(SEQ ID NO 57)、低密度脂蛋白受體前體(SEQ ID NO :58)、78kDa葡萄糖調(diào)節(jié)型蛋白前體(SEQ ID NO :59)、punc ell相鄰物前體(SEQ IDNO :60)、甘露糖基寡糖1，2-α-甘露糖苷酶IA (SEQ ID N0:61)、丙酮酸激酶同工酶M1/M2(SEQ ID NO :62)、基質(zhì)金屬蛋白酶9 (SEQ ID NO :64)、α-1-酸性糖蛋白KSEQ ID NO :65)、和應(yīng)激誘導(dǎo)的磷蛋白1 (SEQ ID NO :63)。在某些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)組概況包括任意組合的至少兩種、至少三種、至少四種、至少五種、至少六種、至少七種等所列蛋白質(zhì)水平的信息。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，受試者是人患者。在某些實(shí)施方案中，生物學(xué)流體選自下組臍帶血、新生兒血清和腦脊液。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，生物學(xué)流體是臍帶血。在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)組概況包含所述蛋白質(zhì)水平的信息，且其中若相對(duì)于正常的生物學(xué)流體，一種或多種所述測(cè)試蛋白質(zhì)在生物學(xué)流體樣品中顯示顯著差異，則做出所述受試者患有新生兒敗血病的診斷。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在出生的M小時(shí)內(nèi)確定診斷。在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)組概況包含蛋白質(zhì)胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白1前體 (SEQ ID NO 36)、白介素-6 前體(SEQ ID NO :3)、C_ 反應(yīng)蛋白前體(SEQID Ν0:1)、β-2_ 微球蛋白前體(SEQ ID NO 7)、組織蛋白酶B前體(SEQ IDNO 38)、半胱氨酸蛋白酶抑制劑M前體(SEQ ID NO :42)、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白2前體(SEQ ID NO :44)、基質(zhì)金屬蛋白酶 9 (SEQ ID NO :64)、金屬蛋白酶抑制劑1前體(SEQ ID NO :31)、和α-1-酸性糖蛋白1 (SEQ ID NO 65)水平的信息，且其中若相對(duì)于正常的生物學(xué)流體，一種或多種所述測(cè)試蛋白質(zhì)在生物學(xué)流體樣品中顯示顯著差異，則做出所述受試者患有新生兒敗血病的診斷。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，若相對(duì)于正常的生物學(xué)流體，所有所述測(cè)試蛋白質(zhì)在生物學(xué)流體樣品中顯示顯著差異，則做出所述受試者患有新生兒敗血病的診斷。在某些實(shí)施方案中，通過(guò)免疫測(cè)定法、通過(guò)質(zhì)譜術(shù)、或者通過(guò)使用蛋白質(zhì)陣列來(lái)測(cè)定所列蛋白質(zhì)的水平。在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種免疫測(cè)定試劑盒，其包含用于檢測(cè)一種或多種選自下組的蛋白質(zhì)的抗體和試劑C-反應(yīng)蛋白前體(SEQ ID NO :1)、白介素-1受體輔助蛋白前體(SEQ ID NO :2)、白介素-6前體(SEQ ID NO :3)、白介素-1受體樣1前體(SEQ ID NO :4)、血清淀粉狀蛋白A蛋白前體(SEQ IDNO :5)、CD5抗原樣前體(SEQ ID NO :6)、 β-2-微球蛋白前體(SEQ ID NO :7)、骨髓蛋白聚糖前體(SEQ ID NO :8)、硒結(jié)合蛋白1 (SEQ ID NO 9)、脂多糖結(jié)合蛋白前體(SEQ ID NO 10)、硫酸軟骨素蛋白聚糖4前體(SEQ ID NO 11)、骨橋蛋白前體(SEQ ID NO: 12)、P⑶P解離抑制劑2 (SEQ ID NO 13)、碳酸酐酶2 (SEQ ID NO :14)、嗜中性粒細(xì)胞明膠酶關(guān)聯(lián)脂籠蛋白前體(SEQ ID N0:15)、膠原α-5 (IV)鏈前體(SEQ ID NO :16)、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子前體(SEQ ID NO :17)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子1前體(SEQ ID NO: 18)、蛋白質(zhì)激酶C結(jié)合蛋白NELL2前體(SEQ ID NO 19)、Neudesin前體 (SEQ ID NO 20)、蛋白質(zhì)二硫化物異構(gòu)酶前體(SEQ ID NO 21)、核糖核酸酶胰前體(SEQ ID NO 22)、δ樣蛋白前體(SEQ ID NO 23)、嗜鉻粒蛋白-A前體(SEQ ID NO 24)、骨調(diào)蛋白前體(SEQ IDNO 25)、膠原α -2(1)鏈前體(SEQ ID NO 26)、原低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1 前體(SEQ ID NO :27)、層粘連蛋白亞基Y-I前體(SEQ ID NO :28)、層粘連蛋白亞基β-1前體(SEQ ID NO 29)、膠原α -1 (II)鏈前體(SEQ ID NO 30)、金屬蛋白酶抑制劑1前體(SEQ ID NO :31)、蛋白 FAM3C 前體(SEQ ID NO :32)、α -輔肌動(dòng)蛋白-1 (SEQ ID N0:33)、F_ 肌動(dòng)蛋白加帽蛋白亞基α-1 (SEQ ID NO :34)、氨肽酶N(SEQ ID NO :35)、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白1前體(SEQ ID NO 36)、細(xì)胞粘附分子1前體(SEQ ID NO 37)、組織蛋白酶B前體(SEQ ID NO :38)、Exostosin-2(SEQ ID NO :39)、組織蛋白酶 D 前體(SEQ ID NO :40)、神經(jīng)源性基因座notch同系物蛋白3前體(SEQ ID NO :41)、半胱氨酸蛋白酶抑制劑M前體(SEQ ID NO 42) ,Noelin前體(SEQ ID NO 43)、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白2前體(SEQ ID NO 44)、內(nèi)質(zhì)蛋白前體(SEQ ID N0:45)、原蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin 9型前體(SEQ ID NO :46)、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白復(fù)合物酸不穩(wěn)定性鏈前體(SEQ ID NO :47)、埃茲蛋白(SEQ ID NO :48)、肝型脂肪酸結(jié)合蛋白(SEQ ID NO :49)、可能的G蛋白偶聯(lián)受體116前體(SEQ IDNO 50), Seprase (SEQ ID NO :51)、癌蛋白誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄物 3 蛋白前體(SEQ IDNO 52)、缺氧上調(diào)型蛋白1前體(SEQ ID NO :53)、跨高爾基體網(wǎng)絡(luò)膜內(nèi)在蛋白2前體(SEQ ID NO: 54)、轉(zhuǎn)酮酶(SEQ ID NO 55)、受體型酪氨酸蛋白質(zhì)磷酸酶F前體(SEQ ID NO: 56)、細(xì)胞間粘附分子1前體(SEQ ID NO :57)、低密度脂蛋白受體前體(SEQ ID NO :58)、78kDa葡萄糖調(diào)節(jié)型蛋白前體(SEQ IDNO 59)、punc ell相鄰物前體(SEQ ID NO 60)、甘露糖基寡糖1，2-α-甘露糖苷酶IA (SEQ ID NO :61)、丙酮酸激酶同工酶Μ1/Μ2 (SEQ ID NO :62)、基質(zhì)金屬蛋白酶9 (SEQ ID NO 64), α-1-酸性糖蛋白1 (SEQ ID NO :65)、和應(yīng)激誘導(dǎo)的磷蛋白 1(SEQ ID NO 63)。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種免疫測(cè)定試劑盒，其包含用于檢測(cè)一種或多種選自下組的蛋白質(zhì)的抗體和試劑胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白1前體(SEQ ID Ν0:36)、白介素-6前體(SEQ ID NO :3)、C-反應(yīng)蛋白前體(SEQ IDNO :1)、β -2-微球蛋白前體(SEQ ID NO 7)、組織蛋白酶B前體(SEQ ID NO 38)、半胱氨酸蛋白酶抑制劑M前體(SEQ ID NO 42)、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白2前體(SEQ ID NO :44)、基質(zhì)金屬蛋白酶9 (SEQ ID NO: 64)、金屬蛋白酶抑制劑1前體(SEQ ID NO 31)、和α -1-酸性糖蛋白1 (SEQ ID NO 65)。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫測(cè)定試劑盒包含用于檢測(cè)所有所列蛋白質(zhì)的抗體和試劑。在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一份報(bào)告，其包含測(cè)試的結(jié)果和/或基于測(cè)試的診斷，包括(a)相對(duì)于正常的生物學(xué)流體或已知指明新生兒敗血病的生物學(xué)流體中的水平， 在自所述受試者獲得的生物學(xué)流體的樣品中測(cè)試一種或多種選自下組的蛋白質(zhì)的水平 C-反應(yīng)蛋白前體(SEQ ID NO :1)、白介素-1受體輔助蛋白前體(SEQ ID NO: 2)、白介素-6 前體(SEQ ID NO 3)、白介素-1受體樣1前體(SEQ ID NO 4)、血清淀粉狀蛋白A蛋白前體 (SEQ ID NO 5)、CD5 抗原樣前體(SEQ ID NO 6)、β -2-微球蛋白前體(SEQ ID NO 7)、骨髓蛋白聚糖前體(SEQ ID NO 8)、硒結(jié)合蛋白1 (SEQ ID NO 9)、脂多糖結(jié)合蛋白前體(SEQID NO :10)、硫酸軟骨素蛋白聚糖4前體(SEQ ID NO :11)、骨橋蛋白前體(SEQID Ν0 12), P GDP 解離抑制劑2(SEQ ID NO :13)、碳酸酐酶2 (SEQ ID NO :14)、嗜中性粒細(xì)胞明膠酶關(guān)聯(lián)脂籠蛋白前體(SEQ ID NO 15)、膠原α -5 (IV)鏈前體(SEQ ID NO 16)、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子前體 (SEQ ID Ν0:17)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子1前體(SEQ ID NO 18)、蛋白質(zhì)激酶C結(jié)合蛋白 NELL2前體(SEQ IDNO 19)、Neudesin前體(SEQ ID NO :20)、蛋白質(zhì)二硫化物異構(gòu)酶前體 (SEQ IDNO 21)、核糖核酸酶胰前體(SEQ ID NO 22)、δ樣蛋白前體(SEQ ID NO 23)、嗜鉻粒蛋白-A前體(SEQ ID NO 24)、骨調(diào)蛋白前體(SEQ ID NO 25)、膠原α -2(1)鏈前體(SEQ ID NO :26)、原低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1前體(SEQ IDNO :27)、層粘連蛋白亞基γ-1前體(SEQ ID NO 28)、層粘連蛋白亞基β _1前體(SEQ ID NO 29)、膠原α -1 (II)鏈前體(SEQ ID NO 30)、金屬蛋白酶抑制劑1前體(SEQ ID NO 31)、蛋白FAM3C前體(SEQ ID NO 32)、α-輔肌動(dòng)蛋白-KSEQID NO :33)、F-肌動(dòng)蛋白加帽蛋白亞基a-l(SEQ ID NO :34)、氨肽酶 N(SEQ IDNO 35)、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白1前體(SEQ ID NO 36)、細(xì)胞粘附分子1前體(SEQ ID NO :37)、組織蛋白酶 B 前體(SEQ ID NO :38)、Exostosin-2 (SEQID NO :39)、組織蛋白酶D前體(SEQ ID NO 40)、神經(jīng)源性基因座notch同系物蛋白3前體(SEQ ID NO 41)、半胱氨酸蛋白酶抑制劑M前體(SEQ ID N0:42)、Noelin前體(SEQ ID NO :43)、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白2前體(SEQ IDNO :44)、內(nèi)質(zhì)蛋白前體(SEQ ID N0:45)、原蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶/keXin9型前體(SEQ ID NO :46)、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白復(fù)合物酸不穩(wěn)定性鏈前體(SEQ ID N0:47)、埃茲蛋白(SEQ ID NO :48)、肝型脂肪酸結(jié)合蛋白(SEQID NO :49)、可能的 G 蛋白偶聯(lián)受體 116 前體(SEQ ID NO 50) ,Seprase (SEQ IDNO :51)、癌蛋白誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄物3蛋白前體(SEQ ID NO 52)、缺氧上調(diào)型蛋白1前體(SEQ ID NO 53)、跨高爾基體網(wǎng)絡(luò)膜內(nèi)在蛋白2前體(SEQ ID NO 54)、轉(zhuǎn)酮酶(SEQ ID NO 55)、受體型酪氨酸蛋白質(zhì)磷酸酶F前體(SEQ ID NO 56)、細(xì)胞間粘附分子1前體(SEQ ID NO 57)、低密度脂蛋白受體前體(SEQ IDNO :58)、78kDa葡萄糖調(diào)節(jié)型蛋白前體(SEQ ID NO :59)、punc ell相鄰物前體(SEQ ID NO :60)、甘露糖基寡糖1，2-α-甘露糖苷酶IA (SEQ ID Ν0:61)、丙酮酸激酶同工酶M1/M2(SEQ ID NO :62)、基質(zhì)金屬蛋白酶9 (SEQ ID NO :64)、α-1-酸性糖蛋白 KSEQ ID NO :65)、和應(yīng)激誘導(dǎo)的磷蛋白1 (SEQ ID NO 63)；并(b)若所述水平相對(duì)于所述正常的生物學(xué)流體中的水平顯示統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異，或者相對(duì)于所述已知指明新生兒敗血病的生物學(xué)流體中的水平不顯示統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異，則診斷出所述受試者患有新生兒敗血病。
在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種實(shí)體介質(zhì)，其儲(chǔ)存測(cè)試的結(jié)果和/或基于測(cè)試的診斷，包括(a)相對(duì)于正常的生物學(xué)流體或已知指明新生兒敗血病的生物學(xué)流體中的水平，在自所述受試者獲得的生物學(xué)流體的樣品中測(cè)試一種或多種選自下組的蛋白質(zhì)的水平C-反應(yīng)蛋白前體(SEQ ID NO :1)、白介素-1受體輔助蛋白前體(SEQ ID N0:2)、白介素-6前體(SEQ ID NO 3)、白介素-1受體樣1前體(SEQ ID NO 4)、血清淀粉狀蛋白A蛋白前體(SEQ ID NO 5)、CD5抗原樣前體(SEQ ID NO 6)、β _2_微球蛋白前體(SEQ ID NO 7)、骨髓蛋白聚糖前體(SEQ ID NO :8)、硒結(jié)合蛋白1 (SEQ ID NO :9)、脂多糖結(jié)合蛋白前體 (SEQ ID NO 10)、硫酸軟骨素蛋白聚糖4前體(SEQ ID NO 11)、骨橋蛋白前體(SEQ ID NO 12)、P⑶P解離抑制劑2 (SEQ ID NO 13)、碳酸酐酶2 (SEQ IDNO :14)、嗜中性粒細(xì)胞明膠酶關(guān)聯(lián)脂籠蛋白前體(SEQ ID NO 15)、膠原α -5 (IV)鏈前體(SEQ ID NO 16)、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子前體(SEQ ID NO 17)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子1前體(SEQ ID NO :18)、蛋白質(zhì)激酶C 結(jié)合蛋白NELL2前體(SEQID NO :19)、Neudesin前體(SEQ ID NO 20)、蛋白質(zhì)二硫化物異構(gòu)酶前體(SEQID NO :21)、核糖核酸酶胰前體(SEQ ID NO :22)、δ樣蛋白前體(SEQ IDNO 23)、嗜鉻粒蛋白-A前體(SEQ ID NO 24)、骨調(diào)蛋白前體(SEQ ID NO 25)、膠原α -2(1)鏈前體(SEQ ID NO 26)、原低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1前體(SEQID NO :27)、層粘連蛋白亞基Y -1前體(SEQ ID NO 28)、層粘連蛋白亞基β _1前體(SEQ ID NO 29)、膠原α -1 (II) 鏈前體(SEQ ID NO 30)、金屬蛋白酶抑制劑1前體(SEQ ID NO 31)、蛋白FAM3C前體(SEQ ID Ν0:32)、α-輔肌動(dòng)蛋白-1 (SEQ ID NO :33)、F-肌動(dòng)蛋白加帽蛋白亞基α-1 (SEQ ID NO :34)、氨肽酶N(SEQ ID NO :35)、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白1前體(SEQ ID NO :36)、細(xì)胞粘附分子 1 前體(SEQ ID NO 37)、組織蛋白酶B 前體(SEQ ID NO 38) ,Exostosin-2 (SEQ ID NO :39)、組織蛋白酶D前體(SEQ ID NO :40)、神經(jīng)源性基因座notch同系物蛋白3前體(SEQ ID NO :41)、半胱氨酸蛋白酶抑制劑M前體(SEQ IDNO :42)、Noelin前體(SEQ ID NO: 43)、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白2前體(SEQID NO :44)、內(nèi)質(zhì)蛋白前體(SEQ ID N0:45)、原蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin 9型前體(SEQ ID NO :46)、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白復(fù)合物酸不穩(wěn)定性鏈前體(SEQ ID N0:47)、埃茲蛋白(SEQ ID NO :48)、肝型脂肪酸結(jié)合蛋白(SEQ ID NO :49)、可能的 G 蛋白偶聯(lián)受體 116 前體(SEQ ID NO 50) ,Seprase (SEQ ID NO :51)、癌蛋白誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄物3蛋白前體(SEQ ID NO :52)、缺氧上調(diào)型蛋白1前體(SEQ ID NO 53)、跨高爾基體網(wǎng)絡(luò)膜內(nèi)在蛋白2前體(SEQ IDNO 54)、轉(zhuǎn)酮酶(SEQ ID NO 55)、受體型酪氨酸蛋白質(zhì)磷酸酶F前體(SEQ IDNO 56)、細(xì)胞間粘附分子1前體(SEQ ID NO 57)、低密度脂蛋白受體前體(SEQID NO 58)、78kDa葡萄糖調(diào)節(jié)型蛋白前體(SEQ ID NO 59)、punc ell相鄰物前體(SEQ ID NO :60)、甘露糖基寡糖1，2-α -甘露糖苷酶IA(SEQ ID NO :61)、 丙酮酸激酶同工酶M1/M2(SEQ ID NO :62)、基質(zhì)金屬蛋白酶9 (SEQ IDNO :64)、α-1-酸性糖蛋白1(SEQ ID NO :65)、和應(yīng)激誘導(dǎo)的磷蛋白1 (SEQ IDNO 63)；并(b)若所述水平相對(duì)于所述正常的生物學(xué)流體中的水平顯示統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異，或者相對(duì)于所述已知指明新生兒敗血病的生物學(xué)流體中的水平不顯示統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異，則診斷出所述受試者患有新生兒敗血病。附圖簡(jiǎn)述

圖1描繪了臍帶血DIGE分析㈧對(duì)照(紅色)對(duì)疑似敗血病(SS)(綠色)DIGE 凝膠。(B)對(duì)照(紅色)對(duì)經(jīng)確認(rèn)的敗血病(⑶)(綠色)DIGE凝膠。沒有差異表達(dá)的點(diǎn)表現(xiàn)為黃色。(C)疑似敗血病(SQ對(duì)對(duì)照間的差異表達(dá)的點(diǎn)。(D)經(jīng)確認(rèn)的敗血病(CS)對(duì)對(duì)照間的差異表達(dá)的點(diǎn)。以紅色突出顯示的點(diǎn)測(cè)定為下調(diào)大于等于2倍，而以綠色突出顯示的點(diǎn)測(cè)定為上調(diào)大于等于2倍。圖2描繪了將來(lái)自對(duì)照、疑似敗血病(SQ、和經(jīng)確認(rèn)的敗血病(⑶)新生兒受試者的臍帶血蛋白質(zhì)的譜計(jì)數(shù)加載入GeneMaths軟件中以進(jìn)行差異表達(dá)顯現(xiàn)。蛋白質(zhì)使用以 200次迭代的歐幾里得(Euclidean)距離學(xué)習(xí)分級(jí)聚類，并在圖2A中顯示。還顯示了上調(diào) (圖2B)和下調(diào)的蛋白質(zhì)(圖2C)的選定的亞簇。相應(yīng)標(biāo)記了選定的亞簇在圖2A中的位置。發(fā)明詳述I.定義除非另有定義，本文中所使用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員的通常理解具有相同的意義。Singleton 等，Dictionary ofMicrobiology and Molecular Biology第2版，J.Wiley&Sons(New York，NY1994)給本領(lǐng)域技術(shù)人員提供了本申請(qǐng)中所使用的許多術(shù)語(yǔ)的一般指導(dǎo)。術(shù)語(yǔ)“新生兒敗血病”在本文中用于描述新生兒的血液感染，并且包括與此類感染有關(guān)的所有并發(fā)癥。新生兒敗血病相關(guān)的并發(fā)癥包括但不限于呼吸窘迫綜合征(RDS)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)并發(fā)癥例如腦室周圍出血和腦室周圍白質(zhì)軟化、智力低下、大腦性癱瘓 (CP)、失能和死亡。術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)組”在本文中用于描述給定時(shí)間的生物學(xué)樣品中的顯著分?jǐn)?shù)的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組的概念與基因組從根本上不同。雖然基因組實(shí)質(zhì)上是靜態(tài)的，但是蛋白質(zhì)組響應(yīng)內(nèi)部和外部事件而不斷變化。
術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)組概況”用于指給定時(shí)間的生物學(xué)樣品例如生物學(xué)流體中的多種蛋白質(zhì)的表達(dá)樣式的呈現(xiàn)。蛋白質(zhì)組概況可以例如以質(zhì)譜呈現(xiàn)，但是也包括基于蛋白質(zhì)的任何物理化學(xué)或生物化學(xué)特性的其它呈現(xiàn)。如此，蛋白質(zhì)組概況可以例如基于蛋白質(zhì)的電泳特性的差異，如通過(guò)二維凝膠電泳，例如通過(guò)2-D PAGE所測(cè)定的，而且可以例如以二維電泳凝膠中的多個(gè)點(diǎn)呈現(xiàn)。即使在沒有明確鑒定的蛋白質(zhì)的情況中，差異表達(dá)譜可以具有重要的診斷價(jià)值。 然后，可以例如通過(guò)免疫印跡來(lái)檢測(cè)單一蛋白質(zhì)點(diǎn)，使用蛋白質(zhì)陣列來(lái)檢測(cè)多個(gè)點(diǎn)或蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組概況通常呈現(xiàn)或含有范圍可以為幾個(gè)峰至呈現(xiàn)50或更多個(gè)峰的復(fù)雜譜的信息。如此，例如，蛋白質(zhì)組概況可以含有或呈現(xiàn)至少2、或至少5或至少10或至少15、或至少20、或至少25、或至少30、或至少35、或至少40、或至少45、或至少50、或至少60、或至少65、或至少70、或至少75、或至少80、或至少85、或至少85、或至少90、或至少95、或至少 100、或至少125、或至少150、或至少175、或至少200種蛋白質(zhì)。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“生物學(xué)流體”指自人或其它動(dòng)物衍生的液體材料。生物學(xué)流體包括但不限于臍帶血、新生兒血清、腦脊液(CSF)、宮頸-陰道流體(CVF)、羊水、血清、血漿、尿液、腦脊液、母乳、粘液、唾液、和汗液?！盎颊唔憫?yīng)”可以使用指明對(duì)患者的益處的任何終點(diǎn)來(lái)評(píng)估，包括但不限于⑴至少在某種程度上抑制病理學(xué)狀況的進(jìn)展，(2)預(yù)防病理學(xué)狀況，(3)至少在某種程度上減輕一種或多種與病理學(xué)狀況有關(guān)的癥狀；(4)治療后的存活長(zhǎng)度延長(zhǎng)；和/或( 治療后給定時(shí)間點(diǎn)的死亡率降低。術(shù)語(yǔ)“治療/處理”指治療性處理和防范性或預(yù)防性措施兩者，其中目的是預(yù)防或減緩(減輕)靶定的病理學(xué)狀況或病癥。需要治療的對(duì)象包括那些已經(jīng)患有病癥的對(duì)象及那些傾向于患有病癥的對(duì)象或那些要預(yù)防病癥的對(duì)象。如本文中所使用的，任何特定蛋白質(zhì)的名稱包括所有片段、前體、和天然存在的變體，諸如可變剪接和等位變體和同等型，及命名的蛋白質(zhì)的可溶形式，以及其它物種中的天然序列同系物(包括所有天然存在的變體)。如此，例如，在敘述測(cè)試觸珠蛋白前體 (Swiss-Prot登錄號(hào)P00738)水平時(shí)，該敘述明確包括測(cè)試以Swiss-Prot登錄號(hào)P00738 所列的蛋白質(zhì)的任何片段、前體、或天然存在的變體，及其非人同系物和其天然存在的變體 (若受試者是非人的話)。II.詳細(xì)描述本發(fā)明關(guān)注通過(guò)對(duì)生物學(xué)流體，諸如臍帶血的蛋白質(zhì)組分析來(lái)早期、可靠和非侵入性測(cè)試新生兒敗血病和/或新生兒敗血病相關(guān)并發(fā)癥的方法和手段。本發(fā)明進(jìn)一步關(guān)注鑒定新生兒敗血病的生物標(biāo)志。在另一個(gè)方面，本發(fā)明關(guān)注蛋白質(zhì)在制備或制造作為用于早期測(cè)定新生兒敗血病的手段的蛋白質(zhì)組概況中的用途。本發(fā)明利用本領(lǐng)域中公知的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，如記載于例如下列教科書，在此通過(guò)提及而明確收錄其內(nèi)容Proteome Research :NewFrontiers in Functional Genomics(Principles and Practice)， Μ. R.Wilkins 等編，Springer Verlag,1007 ；2-D Proteome Analysis Protocols， Andrew L Link 編，Humana Press，1999 ；Proteome Research Two-Dimensional Gel Electrophoresisand Identification Methods(Principles and Practice)，T· Rabilloud 編，SpringerVerlag，2000 ；Proteome Research :Mass Spectrometry (Principlesand Practice)，P. James 編，Springer Verlag,2001 ；Introduction to Proteomics， D.C.Liebler編，Humana Press,2002 ；Proteomics in Practice :A Laboratory Manual of ProteomeAnalysis, R. Westermeier 等編，John Wiley&Sons, 2002。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)可與本文中所描述的方法和材料相似或等同的許多方法和材料，它們可以在本發(fā)明的實(shí)踐中使用。實(shí)際上，本發(fā)明決不受限于所描述的方法和材料。1.物綱本喊汰廁S聽碰·g依照本發(fā)明，可以使用本領(lǐng)域中已知的多種方法來(lái)實(shí)施對(duì)生物學(xué)流體的蛋白質(zhì)組學(xué)分析。生物學(xué)流體包括例如臍帶血、新生兒血清、腦脊液(CSF)、宮頸-陰道流體(CVF)、 羊水、血清、血漿、尿液、腦脊液、母乳、粘液、唾液、和汗液。通常，比較來(lái)自不同來(lái)源的樣品，諸如正常的生物學(xué)流體(正常樣品)和測(cè)試生物學(xué)流體(測(cè)試樣品)的蛋白質(zhì)樣式(蛋白質(zhì)組圖譜)以檢測(cè)疾病中上調(diào)或下調(diào)的蛋白質(zhì)。 然后，可以切出這些蛋白質(zhì)以鑒定和完全表征，例如使用肽質(zhì)量指紋法和/或質(zhì)譜術(shù)和測(cè)序法來(lái)進(jìn)行，或者可以直接使用正常的和/或疾病特異的蛋白質(zhì)組圖譜來(lái)診斷感興趣的疾病，或者以確認(rèn)疾病的存在或缺失。在比較分析中，重要的是以完全相同的方式處理正常樣品和測(cè)試樣品，以便正確地呈現(xiàn)蛋白質(zhì)的相對(duì)水平或多度，并獲得精確的結(jié)果?？偟鞍踪|(zhì)的需要量會(huì)取決于所使用的分析技術(shù)，而且本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定。存在于生物學(xué)樣品中的蛋白質(zhì)通常依照其Pl和分子量通過(guò)二維凝膠電泳0-DE)來(lái)分開。蛋白質(zhì)首先使用等電聚焦(一維凝膠電泳)通過(guò)其電荷來(lái)分開。此步驟可以例如使用商品化的固定化PH梯度(IPG)條來(lái)實(shí)施。 第二維是正常的SDS-PAGE分析，其中使用聚焦的IPG條作為樣品。2-DE分離后，可以用常規(guī)的染料，如考馬斯藍(lán)或銀染色來(lái)顯現(xiàn)蛋白質(zhì)，并使用已知的技術(shù)和設(shè)備，諸如例如Bio-Rad GS800密度計(jì)和PDQUEST軟件(這兩者都是商品化的)來(lái)對(duì)其成像。然后，自凝膠切出個(gè)別的點(diǎn)，將其脫色，并進(jìn)行胰蛋白酶消化?？梢酝ㄟ^(guò)質(zhì)譜術(shù)(MQ分析肽混合物?；蛘撸梢岳缤ㄟ^(guò)毛細(xì)管高壓液相層析(HPLC)分離肽，并可以通過(guò)MS個(gè)別地或集合地對(duì)其分析。質(zhì)譜儀由離子源、質(zhì)量分析儀、離子檢測(cè)儀、和數(shù)據(jù)獲得單元構(gòu)成。首先，將肽在離子源中離子化。然后，將離子化的肽依照其質(zhì)荷比在質(zhì)量分析儀中分離，并檢測(cè)分開的離子。已經(jīng)在蛋白質(zhì)分子中廣泛使用質(zhì)譜術(shù)，特別是自基質(zhì)輔助激光解吸離子化/飛行時(shí)間(MALDI-T0F)和電噴射離子化(ESI)法的發(fā)明以來(lái)。有數(shù)種型式的質(zhì)譜儀，包括例如 MALDI-T0F和三或四極-T0F，或與ESI偶聯(lián)的離子阱質(zhì)量分析儀。如此，例如，Q_Tof_2質(zhì)譜儀利用直交飛行時(shí)間分析儀，其容許同時(shí)檢測(cè)在完全質(zhì)譜范圍間的離子。關(guān)于進(jìn)一步的詳情，參見例如 Chemusevich 等，J. Mass Spectrom. 36 :849-865(2001)。若想要的話，可以通過(guò)本領(lǐng)域中已知的技術(shù)，諸如質(zhì)譜術(shù)的某些變型，或埃德曼(Edman)降解來(lái)測(cè)定肽片段和最終它們來(lái)源的蛋白質(zhì)的氨基酸序列。2.新生兒敗血病的早期檢測(cè)新生兒敗血病(定義為新生兒的血液感染)難以在臨床上診斷。盡管在新生兒護(hù)理上有進(jìn)展，但是來(lái)自新生兒敗血病的死亡率和發(fā)病率仍然較高(Stoll 2002)。新生兒敗血病是新生兒發(fā)病(包括神經(jīng)發(fā)育結(jié)果不良和新生兒死亡)的一項(xiàng)重要貢獻(xiàn)因素。新生兒敗血病相關(guān)并發(fā)癥包括例如呼吸窘迫綜合征(RDS)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)并發(fā)癥、大腦性癱瘓(CP)、失能和死亡。
新生兒敗血病的最高比率在低出生重量(LBW)嬰兒、那些在出生時(shí)具有受抑制的呼吸功能的嬰兒、和那些具有母體產(chǎn)期風(fēng)險(xiǎn)因素的嬰兒中發(fā)生。早期發(fā)作新生兒敗血病的風(fēng)險(xiǎn)因素包括產(chǎn)科并發(fā)癥，包括早產(chǎn)分娩、過(guò)早膜破裂、母體出血，其原因是例如前置胎盤、胎盤早期脫離、羊水、胎盤、尿道或子宮內(nèi)膜的感染、毒血癥、急促分娩(precipitous delivery)、和分娩期間頻繁的陰道檢查。延長(zhǎng)的住院期和受污染的醫(yī)院設(shè)備是晚期發(fā)作新生兒敗血病的常見原因。能引起新生兒敗血病的生物體包括下列非限制性例子凝固酶陰性葡萄球菌(staphylococci)包括表皮葡萄球菌(S.印idermidis)、溶血葡萄球菌(S. haemolyticus)、人葡萄球菌(S. hominis)、沃氏葡萄球菌(S. warneri)、腐生葡萄球菌(S. saprophyticus)、科氏葡萄球菌(S. cohnii)、和頭狀葡萄球菌(S. capitis)、B群葡萄球菌、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、獎(jiǎng)腸球菌(Enterococcus fecalis) 和屎腸球菌(E. faecium)、單核細(xì)胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、大腸桿菌(Escherichia coli)、銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)、流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)、牛鏈球菌(Sti^ptococcusbovis)、α -溶血性鏈球菌、肺炎鏈球菌 (Streptococcus pneumoniae)、腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitides)禾口淋病炎奈瑟氏球菌(N. gonorrhoeae)。通常，引起早期發(fā)作新生兒敗血病的生物體是產(chǎn)時(shí)由于自宮頸的上行性感染、自母親經(jīng)胎盤或者隨胎兒通過(guò)產(chǎn)道而獲得的。不幸地，由于非特異性且微小的早期體征，新生兒敗血病的診斷是困難的。新生兒敗血病的體征和癥狀包括例如體溫變化、呼吸問題、腹瀉、低血糖、運(yùn)動(dòng)減少、吮吸減少、 發(fā)作(seizure)、心率緩慢、腹部區(qū)域腫脹、嘔吐、和黃疸。用于診斷新生兒敗血病的黃金標(biāo)準(zhǔn)是血液培養(yǎng)；然而，即使在存在敗血病的強(qiáng)臨床指標(biāo)時(shí)及即使在后來(lái)通過(guò)尸體檢查證明細(xì)菌感染的情況中也發(fā)生陰性血液培養(yǎng)(Kaufman D，F(xiàn)airchild KD, Clin Microbiol Rev. 2004Jul ； 17 (3) :638-80)。此外，常常難以在新生兒，尤其是早產(chǎn)新生兒中獲得足夠的血液樣品。鑒于其快速進(jìn)展和高死亡率，通常施用快速的經(jīng)驗(yàn)抗生素療法，直到血液培養(yǎng)結(jié)果。初始療法可以包括氨芐青霉素或青霉素G和氨基糖苷，例如慶大霉素、或頭孢噻肟。鑒于與新生兒敗血病有關(guān)的陰性結(jié)果及在目前用于檢測(cè)新生兒敗血病的可用手段上缺乏信心，抗生素治療的使用不僅是常見的，而且是延長(zhǎng)的，這促成新生兒病原體中的藥物抗性。 因此，用于新生兒敗血病和新生兒敗血病相關(guān)并發(fā)癥的早期、可靠的且非侵入性的標(biāo)志物的開發(fā)是必要的，以容許治療和干預(yù)優(yōu)化新生兒的結(jié)果，并使?jié)撛诓槐匾目股氐氖褂没蜓娱L(zhǎng)使用最小化。3.使用生物學(xué)流體中的生物標(biāo)志來(lái)早期檢測(cè)并診斷新生兒敗血病在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了使用蛋白質(zhì)組方法使用生物學(xué)流體諸如臍帶血中鑒定的生物標(biāo)志來(lái)診斷新生兒敗血病和新生兒敗血病相關(guān)并發(fā)癥的可靠的非侵入性方法。在某些實(shí)施方案中，與新生兒敗血病相關(guān)的生物標(biāo)志是用于早期和晚期發(fā)作中樞神經(jīng)系統(tǒng) (CNS)并發(fā)癥的預(yù)測(cè)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，生物標(biāo)志是用于腦室周圍出血和/或腦室周圍白質(zhì)軟化的預(yù)測(cè)物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，生物標(biāo)志是用于智力低下的預(yù)測(cè)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明容許在樣品收集的約30分鐘和M小時(shí)內(nèi)檢測(cè)新生兒敗血病和新生兒敗血病相關(guān)并發(fā)癥生物標(biāo)志。在某些實(shí)施方案中，在樣品收集的約30分鐘和48小時(shí)內(nèi)診斷早期發(fā)作新生兒敗血病和/或相關(guān)并發(fā)癥。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在樣品收集的約48小時(shí)內(nèi)診斷早期發(fā)作新生兒敗血病和/或相關(guān)并發(fā)癥。在又一個(gè)實(shí)施方案中，在樣品收集的約M小時(shí)內(nèi)診斷早期發(fā)作新生兒敗血病和/或相關(guān)并發(fā)癥。在又一個(gè)實(shí)施方案中，在樣品收集的約12小時(shí)內(nèi)診斷早期發(fā)作新生兒敗血病和/或相關(guān)并發(fā)癥。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在樣品收集的約4小時(shí)內(nèi)診斷早期發(fā)作新生兒敗血病和/或相關(guān)并發(fā)癥。在其它實(shí)施方案中，在樣品收集的約2小時(shí)內(nèi)診斷早期發(fā)作新生兒敗血病和/或相關(guān)并發(fā)癥。 在一個(gè)實(shí)施方案中，在樣品收集的約1小時(shí)內(nèi)診斷早期發(fā)作新生兒敗血病和/或相關(guān)并發(fā)癥。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在樣品收集的約30分鐘內(nèi)診斷早期發(fā)作新生兒敗血病和/或相關(guān)并發(fā)癥。在某些其它實(shí)施方案中，在出生的約30分鐘和48小時(shí)內(nèi)診斷早期發(fā)作新生兒敗血病和/或相關(guān)并發(fā)癥。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在出生的約48小時(shí)內(nèi)診斷早期發(fā)作新生兒敗血病和/或相關(guān)并發(fā)癥。在又一個(gè)實(shí)施方案中，在出生的約M小時(shí)內(nèi)診斷早期發(fā)作新生兒敗血病和/或相關(guān)并發(fā)癥。在又一個(gè)實(shí)施方案中，在出生的約12小時(shí)內(nèi)診斷早期發(fā)作新生兒敗血病和/或相關(guān)并發(fā)癥。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在出生的約4小時(shí)內(nèi)診斷早期發(fā)作新生兒敗血病和/或相關(guān)并發(fā)癥。在其它實(shí)施方案中，在出生的約2小時(shí)內(nèi)診斷早期發(fā)作新生兒敗血病和/或相關(guān)并發(fā)癥。在一個(gè)實(shí)施方案中，在出生的約1小時(shí)內(nèi)診斷早期發(fā)作新生兒敗血病和/或相關(guān)并發(fā)癥。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在出生的約30分鐘內(nèi)診斷早期發(fā)作新生兒敗血病和/或相關(guān)并發(fā)癥。如前文所記錄的，在本發(fā)明的語(yǔ)境中，術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)組概況”用于指給定時(shí)間的生物學(xué)樣品例如生物學(xué)流體中的多種蛋白質(zhì)的表達(dá)樣式的呈現(xiàn)。蛋白質(zhì)組概況可以例如呈現(xiàn)為質(zhì)譜，但是也包括基于蛋白質(zhì)的任何物理化學(xué)或生物化學(xué)特性的其它呈現(xiàn)。雖然有可能鑒定生物學(xué)流體的蛋白質(zhì)組中存在的所有或一些蛋白質(zhì)并對(duì)它們測(cè)序，但是這對(duì)于依照本發(fā)明生成的蛋白質(zhì)組概況的診斷用途是不必要的。特定疾病的診斷可以基于正常蛋白質(zhì)組概況與存在要診斷的疾病或病理學(xué)狀況時(shí)在相同情況下獲得的相同生物學(xué)流體的蛋白質(zhì)組概況之間的特征性差異(獨(dú)特的表達(dá)標(biāo)記(expression signature)).獨(dú)特的表達(dá)標(biāo)記可以是測(cè)試或參照生物學(xué)樣品的蛋白質(zhì)組概況內(nèi)以統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著方式與自相同類型的來(lái)源獲得的相應(yīng)的正常生物學(xué)樣品的蛋白質(zhì)組概況不同的任何獨(dú)特的特征或基序。例如，如果蛋白質(zhì)組概況以質(zhì)譜形式呈現(xiàn)，那么獨(dú)特的表達(dá)標(biāo)記通常是與相應(yīng)的正常樣品的質(zhì)譜在定性或定量上不同的峰或峰組合。如此，可以認(rèn)為質(zhì)譜中的新峰或新峰組合的出現(xiàn)，或者質(zhì)譜中的現(xiàn)有峰或現(xiàn)有峰組合的幅度或形狀的任何統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著變化，或者現(xiàn)有峰的消失是獨(dú)特的表達(dá)標(biāo)記。在比較自哺乳動(dòng)物受試者獲得的測(cè)試樣品的蛋白質(zhì)組概況與包含病理學(xué)母體或胎兒狀況特征性的獨(dú)特表達(dá)標(biāo)記的參照樣品的蛋白質(zhì)組概況時(shí)，若其與參照樣品共享獨(dú)特的表達(dá)標(biāo)記，則哺乳動(dòng)物受試者診斷為患有此類病理學(xué)狀況?？梢酝ㄟ^(guò)比較自要診斷的受試者獲得的生物學(xué)流體的蛋白質(zhì)組概況與以相同方式獲得并處理的相同種類的正常的生物學(xué)流體的蛋白質(zhì)組概況來(lái)診斷特定的病理學(xué)母體/ 胎兒狀況。若測(cè)試樣品的蛋白質(zhì)組概況與正常樣品的蛋白質(zhì)組概況基本上相同，則認(rèn)為受試者沒有主題病理學(xué)母體/胎兒狀況。若測(cè)試樣品的蛋白質(zhì)組概況相對(duì)于正常樣品的蛋白質(zhì)組概況顯示獨(dú)特的表達(dá)標(biāo)記，則受試者診斷為患有所討論的母體/胎兒狀況?；蛘?另外，可以比較測(cè)試樣品的蛋白質(zhì)組概況與參照樣品的蛋白質(zhì)組概況，所述參照樣品自獨(dú)立診斷為患有所討論的病理學(xué)母體/胎兒狀況的受試者的生物學(xué)流體獲得。在此情況中，若測(cè)試樣品的蛋白質(zhì)組概況與參照樣品的蛋白質(zhì)組概況共享代表獨(dú)特的表達(dá)標(biāo)記的至少一種特征，或特征組合，則受試者診斷為患有病理學(xué)狀況。用于比較蛋白質(zhì)組概況的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法是本領(lǐng)域中公知的。例如，在質(zhì)譜的情況中， 蛋白質(zhì)組概況以沿著該譜的水平軸的關(guān)鍵質(zhì)量/電荷(M/Z)位置處的峰幅度值定義。因而， 特征性蛋白質(zhì)組概況可以例如以由給定M/Z值處的譜幅度的組合形成的樣式表征?？梢酝ㄟ^(guò)用合適的算法匹配測(cè)試樣品的蛋白質(zhì)組概況(樣式)與參照或正常樣品的蛋白質(zhì)組概況(樣式)來(lái)確定特征性表達(dá)標(biāo)記的存在或缺失，或兩種概況的實(shí)質(zhì)同一性。用于分析蛋白質(zhì)組樣式的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法披露于例如Petricoin III等，The Lancet 359:572-77(2002)； Issaq 等，Biochem Biophys Commun 292:587-92(2002) ；Ball 等，Bioinformaticsl8 395-404(2002)；及 Li 等，Clinical Chemistry Journal,48 :1296-1304(2002)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，以蛋白質(zhì)陣列或免疫測(cè)定法形式實(shí)施本發(fā)明的診斷測(cè)試ο4.蛋白質(zhì)陣列在最近數(shù)年中，蛋白質(zhì)陣列作為用于檢測(cè)蛋白質(zhì)、監(jiān)測(cè)其表達(dá)水平、及調(diào)查蛋白質(zhì)相互作用和功能的有力手段已經(jīng)獲得廣泛認(rèn)可。在可以使用自動(dòng)化手段同時(shí)實(shí)施大量測(cè)定時(shí)，它們實(shí)現(xiàn)高通量蛋白質(zhì)分析。在微陣列或芯片形式(其最初開發(fā)用于DNA陣列)中，可以在使用材料最少而產(chǎn)生大量數(shù)據(jù)的情況中實(shí)施此類測(cè)定。雖然如上文所描述的通過(guò)2D凝膠電泳和質(zhì)譜術(shù)的蛋白質(zhì)組分析是非常有效的， 但是它不總是提供需要的高靈敏度，而且這可能漏掉以低多度表達(dá)的許多蛋白質(zhì)。在其高效率外，蛋白質(zhì)微陣列提供改善的靈敏度。通過(guò)使用本領(lǐng)域中公知的多種共價(jià)和非共價(jià)附著化學(xué)來(lái)將蛋白質(zhì)固定化于固體表面，諸如玻璃、硅、微孔、硝酸纖維素、PVDF膜、和微珠上，從而形成蛋白質(zhì)陣列。固體支持物在綴合規(guī)程前后應(yīng)當(dāng)是化學(xué)穩(wěn)定的，容許良好的點(diǎn)形態(tài)學(xué)，展現(xiàn)最小的非特異性結(jié)合，不應(yīng)在檢測(cè)系統(tǒng)中促成背景，而且應(yīng)當(dāng)與不同檢測(cè)系統(tǒng)相容。一般地，蛋白質(zhì)微陣列使用通常用于讀取DNA陣列的相同檢測(cè)方法。類似地，與讀取DNA微陣列所使用的相同的儀器可適用于蛋白質(zhì)陣列。如此，可以用經(jīng)熒光標(biāo)記的來(lái)自兩種不同來(lái)源諸如正常的和患病的生物學(xué)流體的蛋白質(zhì)來(lái)探查捕捉陣列(例如抗體陣列)。在此情況中，讀數(shù)基于熒光信號(hào)變化，其作為靶蛋白表達(dá)水平變化的反映。備選的讀數(shù)包括但不限于熒光共振能量轉(zhuǎn)移、表面等離振子共振、滾環(huán)DNA擴(kuò)增、質(zhì)譜術(shù)、共振光散射、和原子力顯微術(shù)。關(guān)于進(jìn)一步的詳情，參見例如Zhou H 等，Trends Biotechnol. 19 :S34-9(2001)； Zhu 等，Current Opin. Chem. Biol. 5 :40-45(2001) ；Wilson 禾口 Nock，Angew Chem Int Ed Engl 42 :494-500(2003)；及 Schweitzer 禾口 Kingsmore， CurrOpin Biotechnol 13 14-9(2002)。生物分子陣列還披露于2002年6月18日公告的美國(guó)專利No. 6，406，921，在此通過(guò)提及而其全部公開內(nèi)容明確收錄。5.免疫測(cè)定法也可以以本領(lǐng)域中公知的多種免疫測(cè)定形式來(lái)實(shí)施本發(fā)明的診斷方法。有兩類主要的免疫測(cè)定法，即同質(zhì)的和異質(zhì)的。在同質(zhì)免疫測(cè)定法中，抗原與抗體間的免疫學(xué)反應(yīng)和檢測(cè)兩者都在同質(zhì)反應(yīng)中實(shí)施。異質(zhì)免疫測(cè)定法包括至少一個(gè)分離步驟，其容許區(qū)別反應(yīng)產(chǎn)物與未反應(yīng)的試劑。
ELISA是一種異質(zhì)免疫測(cè)定法，其自20世紀(jì)70年代早期起已經(jīng)在實(shí)驗(yàn)室實(shí)踐中獲得廣泛使用?？梢允褂迷摐y(cè)定法來(lái)檢測(cè)各種形式的抗原。在“三明治式”形式中，將所測(cè)定的抗原保持在兩種不同抗體間。在此方法中，首先用固相抗體包被固體表面。然后，添加含有抗原(即診斷蛋白質(zhì))的測(cè)試樣品，或含有所測(cè)量抗原的組合物，并讓抗原與結(jié)合的抗體起反應(yīng)。洗掉任何未結(jié)合的抗原。然后，讓已知量的經(jīng)酶標(biāo)記的抗體與結(jié)合的抗原起反應(yīng)。在反應(yīng)后洗掉任何過(guò)量的未結(jié)合的經(jīng)酶連接的抗體。然后，添加該測(cè)定法中使用的酶的底物，并且底物與酶之間的反應(yīng)產(chǎn)生顏色變化。可見的顏色變化的量是綴合有特定酶的結(jié)合抗體的直接測(cè)量，并且因此測(cè)試樣品中存在的抗原。ELISA也可以作為競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定法使用。在競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定法形式中， 將含有要測(cè)定的抗原的測(cè)試標(biāo)本與精確量的經(jīng)酶標(biāo)記的抗原混合，并且這兩者都競(jìng)爭(zhēng)對(duì)附著于固體表面的抗抗原抗體的結(jié)合。洗掉過(guò)量的游離的經(jīng)酶標(biāo)記的抗原，之后添加酶底物。源自酶_底物相互作用的顏色強(qiáng)度的量是所測(cè)試的樣品中的抗原量的測(cè)量。同質(zhì)免疫測(cè)定法包括例如酶倍增免疫測(cè)定技術(shù)(EMIT)，其通常包括包含要測(cè)量的一種或多種化合物的生物學(xué)樣品、要測(cè)量的化合物的經(jīng)酶標(biāo)記的分子、結(jié)合要測(cè)量的化合物的一種或多種特異性抗體、和特定酶顯色底物。在典型的EMIT中，將過(guò)量的特異性抗體添加至生物學(xué)樣品。若生物學(xué)樣品含有要檢測(cè)的蛋白質(zhì)，則此類蛋白質(zhì)結(jié)合抗體。然后，將測(cè)量量的相應(yīng)的經(jīng)酶標(biāo)記的蛋白質(zhì)添加至混合物。用添加的經(jīng)酶標(biāo)記的蛋白質(zhì)的分子占據(jù)沒有被樣品中的蛋白質(zhì)分子占據(jù)的抗體結(jié)合位點(diǎn)。因此，因?yàn)閮H游離的經(jīng)酶標(biāo)記的蛋白質(zhì)可以對(duì)底物起作用，所以酶活性被降低。 從無(wú)色轉(zhuǎn)化成有色形式的底物量確定混合物中留下的游離酶的量。要在樣品中檢測(cè)的高濃度蛋白質(zhì)引起較高的吸光度讀數(shù)。樣品中較少的蛋白質(zhì)導(dǎo)致較小的酶活性和因此較低的吸光度讀數(shù)。在抗原_酶復(fù)合物被抗體結(jié)合時(shí)使酶標(biāo)記物失活使EMIT成為獨(dú)特的系統(tǒng)，使測(cè)試能夠在沒有如用其它免疫測(cè)定法所必需的分開結(jié)合的與未結(jié)合的化合物的情況中實(shí)施。本發(fā)明的一部分還是一種免疫測(cè)定試劑盒。在一個(gè)方面，本發(fā)明包括三明治式免疫測(cè)定試劑盒，其包含捕捉抗體和檢測(cè)抗體。捕捉抗體和檢測(cè)抗體可以是單克隆或多克隆的。在另一個(gè)方面，本發(fā)明包括診斷試劑盒，其包含側(cè)流裝置，諸如免疫層析條 (ICS)測(cè)試，其使用免疫流層析進(jìn)行。側(cè)流裝置采用側(cè)流測(cè)定技術(shù)，如一般記載于美國(guó)專利 No. 4，943，522 ；4，861，711 ；4，857，453 ；4，855，240 ；4，775，636 ；4，703，017 ；4，361，537 ； 4，235，601 ；4, 168，146 ；4, 094，647的，通過(guò)提及而將每篇的全部?jī)?nèi)容收錄。在又一個(gè)方面， 免疫測(cè)定試劑盒可以在分開的容器中包含例如(a)對(duì)診斷特定母體/胎兒狀況，諸如新生兒敗血病中使用的多肽具有結(jié)合特異性的單克隆抗體；(b)和抗抗體免疫球蛋白?？梢岳么嗣庖邷y(cè)定試劑盒來(lái)實(shí)施本文中所提供的各種方法?？梢砸约s0. OOlmg至約100克，且更優(yōu)選的是約0. Olmg至約1克的量提供單克隆抗體和抗抗體免疫球蛋白。抗抗體免疫球蛋白可以是多克隆免疫球蛋白、蛋白A或蛋白G或其功能性片段，其可以在使用前通過(guò)本領(lǐng)域中已知的方法來(lái)標(biāo)記。診斷試劑盒在必要的情況中可以進(jìn)一步包含用于降低測(cè)試中的背景干擾的試劑、用于提高信號(hào)的試劑、用于組合和內(nèi)插標(biāo)志物數(shù)值以產(chǎn)生感興趣的臨床結(jié)果的預(yù)測(cè)的軟件和算法、用于進(jìn)行測(cè)試的裝置、校正曲線和圖、標(biāo)準(zhǔn)化曲線和圖等。測(cè)試試劑盒可以以任何合適的方式包裝，通常具有單個(gè)容器中的所有元件及一張用于實(shí)施測(cè)試的印刷指令。
6.診斷和治療方法本發(fā)明的診斷方法是對(duì)于開業(yè)內(nèi)科醫(yī)生做出快速治療決定(其對(duì)于新生兒的存活常常是至關(guān)重要的)有價(jià)值的工具。如此，例如，若新生兒顯示新生兒敗血病的癥狀，或者在其它方面有新生兒敗血病的風(fēng)險(xiǎn)，則采用即刻步驟以治療狀況并改善新生兒存活的機(jī)會(huì)是重要的測(cè)量或獲得本文中所鑒定的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平后，通常將測(cè)定結(jié)果、發(fā)現(xiàn)、診斷、 預(yù)測(cè)和/或治療推薦記錄，并與例如技術(shù)人員、內(nèi)科醫(yī)生和/或患者通信。在某些實(shí)施方案中，會(huì)使用計(jì)算機(jī)來(lái)將此類信息與感興趣方，諸如患者和/或主治內(nèi)科醫(yī)生通信。在一些實(shí)施方案中，會(huì)在與接收結(jié)果或診斷通信的國(guó)家或管轄區(qū)域不同的國(guó)家或管轄區(qū)域?qū)嵤y(cè)定法或分析測(cè)定結(jié)果。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在完成測(cè)定法并產(chǎn)生診斷和/或預(yù)測(cè)后盡快將基于本文中所呈現(xiàn)的一種或多種生物標(biāo)志在測(cè)試受試者中的表達(dá)水平的診斷、預(yù)測(cè)和/或治療推薦與受試者通信。本文中所描述的方法中鑒定并量化的一種或多種生物標(biāo)志可以包含在一組或多組中。構(gòu)成組的生物標(biāo)志的數(shù)目可以包括1種生物標(biāo)志、2種生物標(biāo)志、3種生物標(biāo)志、4種生物標(biāo)志、5種生物標(biāo)志、6種生物標(biāo)志、7種生物標(biāo)志、8種生物標(biāo)志、9種生物標(biāo)志、 10種生物標(biāo)志、11種生物標(biāo)志、12種生物標(biāo)志、13種生物標(biāo)志、14種生物標(biāo)志、15種生物標(biāo)志、16種生物標(biāo)志、17種生物標(biāo)志、18種生物標(biāo)志、19種生物標(biāo)志、20種生物標(biāo)志等。受試者的治療內(nèi)科醫(yī)生可以將結(jié)果和/或相關(guān)信息與受試者通信。或者，可以通過(guò)任何通信手段， 包括書寫(諸如通過(guò)提供書面報(bào)告)、電子形式的通信(諸如電子郵件)、或電話來(lái)將結(jié)果直接與測(cè)試受試者通信?？梢酝ㄟ^(guò)使用計(jì)算機(jī)(諸如在電子郵件通信的情況中)來(lái)便于通信。在某些實(shí)施方案中，可以產(chǎn)生含有診斷測(cè)試結(jié)果和/或自測(cè)試得到的結(jié)論和/或基于測(cè)試的治療推薦的通信，并使用電信熟練技術(shù)人員會(huì)熟悉的計(jì)算機(jī)硬件和軟件的組合來(lái)將其自動(dòng)投遞至受試者。健康護(hù)理導(dǎo)向性通信系統(tǒng)的一個(gè)例子記載于美國(guó)專利No. 6，283，761， 通過(guò)提及而將其全部?jī)?nèi)容收入本文；然而，本發(fā)明不限于利用此特定通信系統(tǒng)的方法。在本發(fā)明方法的某些實(shí)施方案中，可以在不同(例如外國(guó))管轄區(qū)域?qū)嵤┧谢蛞恍┓椒ú襟E， 包括樣品的測(cè)定、疾病的診斷、和測(cè)定結(jié)果或診斷的通信。為了便于診斷，可以將本發(fā)明的本文中所呈現(xiàn)的一種或多種生物標(biāo)志的參照和/ 或受試者生物標(biāo)志概況或表達(dá)水平在顯示裝置上顯示，以電子形式包含，或者包含在機(jī)器可讀介質(zhì)(諸如但不限于模擬磁帶，如VCR、CD-ROM、DVD-ROM、USB閃存介質(zhì)等可讀的)中。 此類機(jī)器可讀介質(zhì)還可以含有別的測(cè)試結(jié)果，諸如但不限于臨床參數(shù)和傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室風(fēng)險(xiǎn)因素的測(cè)量?；蛘?另外，機(jī)器可讀介質(zhì)還可以包含受試者信息，諸如醫(yī)學(xué)史和任何相關(guān)的家族史。從以下非限制性實(shí)施例看，本發(fā)明的進(jìn)一步的詳情會(huì)是顯而易見的。通過(guò)提及而將貫穿整個(gè)公開內(nèi)容所引用的所有參考文獻(xiàn)及其中所引用的參考文獻(xiàn)明確收入本文。實(shí)施例1 使用全局蛋白質(zhì)組方法來(lái)鑒定新生兒敗血病的臍帶血生物標(biāo)志實(shí)驗(yàn)方法樣品收集分析來(lái)自20-34周妊娠的自發(fā)早產(chǎn)產(chǎn)程中的82名婦女的前瞻觀察分組的臍帶血樣品。早期發(fā)作新生兒敗血病定義為分娩的72小時(shí)內(nèi)的陽(yáng)性新生兒血液培養(yǎng)。在 82名受試者中，71名在小于34周時(shí)分娩，且5名新生兒已經(jīng)確認(rèn)新生兒敗血病(新生兒血液培養(yǎng)陽(yáng)性)，而8名新生兒具有疑似敗血病(血液培養(yǎng)陰性，提示感染的臨床癥狀)的診斷。臍帶血清的免疫消減使用IgY_12LC2蛋白質(zhì)組分配系統(tǒng)(BeckmanCoulter， Fullerton,CA)來(lái)將用于2-DLC實(shí)驗(yàn)的血清樣品消減12種最豐富的蛋白質(zhì)(清蛋白、IgG、 IgA, IgM, α-l抗胰蛋白酶、轉(zhuǎn)鐵蛋白、觸珠蛋白、α-l酸性糖蛋白、α _2巨球蛋白、血纖蛋白原、載脂蛋白A-I和Α-ΙΙ)。將合適的級(jí)分收集，濃縮，并與IOmM Tris (ρΗ 8.4)緩沖液交換。使用DC蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒(Bio-Rad，Hercules，CA)來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。差別凝膠電泳(DIGE)蛋白質(zhì)測(cè)定法后，用CyDye DIGE Fluor最小染料(GE Lifesciences)以400pm濃度的染料標(biāo)記50 μ g蛋白質(zhì)。分別使用不同染料(Cy5、Cy3、Cy2) 來(lái)標(biāo)記對(duì)照、疑似敗血病(SS)、或經(jīng)確認(rèn)的敗血病(CS)臍帶血血清(CBS)樣品。將經(jīng)標(biāo)記的蛋白質(zhì)在含有0. 5%兩性電解質(zhì)的IEF緩沖液中溶解，并于室溫再水合至24cm IPG條(ρΗ 4-7)上達(dá)12小時(shí)。再水合后，將IPG條進(jìn)行等電聚焦達(dá)約10小時(shí)以達(dá)到總共64000伏* 小時(shí)。首先，通過(guò)用含有DTT的緩沖液平衡15分鐘來(lái)將IPG條中聚焦的蛋白質(zhì)還原，然后用含有2. 5% IAA的緩沖液來(lái)烷基化。還原和烷基化步驟后，將IPG條加載至梯度(8 16%)聚丙烯酰胺凝膠(24x20cm)上，并以85V進(jìn)行SDS-PAGE達(dá)18小時(shí)以第二維解析蛋白質(zhì)。電泳后，以設(shè)置于600的PMT電壓使用合適的激光和濾器在Typhoon 9400掃描儀(GE Lifesciences)中掃描凝膠。使用選定的顏色來(lái)覆蓋不同通道中的圖像，并使用ImageQuant TL軟件(v7. 0，GE Lifesciences)來(lái)顯現(xiàn)差別。將原始掃描圖像文件加載入Phoretix 2D Evolution(NonlinearDynamics)中，并對(duì)經(jīng)確認(rèn)的和疑似的敗血病對(duì)對(duì)照產(chǎn)生差別圖譜。2-DLC樣品加工蛋白質(zhì)測(cè)定法后，用胰蛋白酶消化Img樣品部分，并用強(qiáng)陽(yáng)離子交換(SCX)層析來(lái)分離所得的肽。將樣品干燥，并在105 μ L含有0. 2Μ NH4HCO3和0. 3% Rapigest (Waters, Milford，ΜΑ)的消化緩沖液(ρΗ 8.5)中溶解。如下將半胱氨酸殘基還原并烷基化，即于50°C在12. 5yL 0. IM DTT中溫育45分鐘，接著在7 μ L 0. 5Μ碘乙酰胺中暗室再溫育30分鐘。通過(guò)添加4 μ L0. IM CaCl2和酶與底物比率33 1的測(cè)序級(jí)胰蛋白酶 (Trypsin Gold,Promega)于37°C將蛋白質(zhì)消化2小時(shí)。通過(guò)添加60 μ L 0. 2Μ HCl來(lái)使消化停止，并使用C18S印Pak Plus筒(Waters，Milford，MA)來(lái)純化所得的肽。使用100x2. Imm 聚磺乙基 A 柱(The Nest Group, Southborough, ΜΑ)來(lái)實(shí)施 SCX 層析。流動(dòng)相A含有IOmM磷酸鉀(ρΗ 3)和25%乙腈(ACN)。流動(dòng)相B是相同的，只是它含有350mM KCl0加載并在流動(dòng)相A中清洗后，在45分鐘里使用線性梯度0-50% B，接著在 15分鐘里使用線性梯度50-100% B，接著以100% A清洗20分鐘來(lái)洗脫肽。收集總共95 個(gè)一分鐘級(jí)分，并通過(guò)真空離心來(lái)將其干燥，并通過(guò)在100 μ L 0. TFA中搖動(dòng)來(lái)再溶解。 使用96孔旋轉(zhuǎn)柱，Vydac C18硅石(The Nest Group，Southborough，ΜΑ)來(lái)使肽級(jí)分脫鹽。 將經(jīng)脫鹽的級(jí)分合并成35個(gè)級(jí)分，蒸發(fā)，并在20 μ L 5%甲酸(FA)中溶解以進(jìn)行LC-MS/MS 分析。LC-MS/MS分析使用Agilent 1100系列毛細(xì)管LC系統(tǒng)和LTQ離子阱質(zhì)譜儀 (Thermo Electron, San Jose, CA, USA)通過(guò)LC/MS來(lái)分析每個(gè)級(jí)分的一部分，所述質(zhì)譜儀具有裝備有34號(hào)金屬針試劑盒(ThermoFinnigan，San Jose, CA)的Ion Max電噴射源。以 20 μ L/分鐘將樣品應(yīng)用于阱筒，然后使用含有0. FA的流動(dòng)相A將其轉(zhuǎn)換至0. 5x250mm Zorbax SB-C18柱(Agilent Technologies,Palo Alto,CA,USA)上。使用Bioworks Browser軟件(第3. GlThermoFirmi gan,San Jose, CA)從原始數(shù)據(jù)產(chǎn)生質(zhì)譜文件。自所有LC-MS/ MS分析產(chǎn)生總共1，195，238個(gè)串聯(lián)質(zhì)譜。肽和蛋白質(zhì)鑒定針對(duì)含有為人亞種選擇的Swiss-Prot (第54. 2版)數(shù)據(jù)庫(kù)的正向和反向輸入(誘餌蛋白質(zhì))的復(fù)合蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)搜索串聯(lián)質(zhì)譜。使用X ！串聯(lián)(Fenyo 2003)搜索引擎來(lái)實(shí)施所有搜索，所述搜索引擎配置為使用母離子和碎片離子的質(zhì)量公差 1. SDa和0. 4Da、酶胰蛋白酶特異性、對(duì)半胱氨酸殘基的固定的脲甲基修飾、和數(shù)處潛在的體內(nèi)和體外修飾。使用 Scaffold 軟件(第 1. 6 版，Proteome Software, Portland, OR)中執(zhí)行的概率性蛋白質(zhì)鑒定算法(Nesvizhskii 2003)來(lái)將所有樣品中的肽和蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果匯編在一起以產(chǎn)生全面的臍帶血蛋白質(zhì)組。認(rèn)為具有大于等于0.8的概率的肽鑒定結(jié)果有可能存在于樣品中。認(rèn)為具有至少兩個(gè)獨(dú)特的肽鑒定結(jié)果的蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果存在于臍帶血中。無(wú)標(biāo)記物量化與蛋白質(zhì)匹配的串聯(lián)質(zhì)譜的總數(shù)(譜計(jì)數(shù))是用于評(píng)估其在復(fù)雜的混合物中的多度的無(wú)標(biāo)記物、靈敏的、且半定量的測(cè)量(Liu2004)。使用兩個(gè)復(fù)雜的樣品間的蛋白質(zhì)譜計(jì)數(shù)的差別來(lái)量化其相對(duì)表達(dá)(01d2005)。在此研究中，考慮在一份樣品中具有至少兩個(gè)獨(dú)特肽鑒定結(jié)果的臍帶血蛋白質(zhì)用于無(wú)標(biāo)記物量化。將具有共享的譜計(jì)數(shù)的同源蛋白質(zhì)(序列同源性大于50% )組合成單一輸入。將非同源物共享的譜計(jì)數(shù)歸入具有最高數(shù)目的譜匹配的蛋白質(zhì)(奧克姆氏剃刀(Occam's razor))。使用進(jìn)行對(duì)照與CS新生兒受試者間的獨(dú)立配對(duì)比較的安排蛋白質(zhì)的譜計(jì)數(shù)來(lái)量化蛋白質(zhì)的相對(duì)表達(dá)(Gravett 2007，Nagalla 2007，Pereira 2007，Zybailov 2006)。認(rèn)為在配對(duì)比較中具有小于等于 0. 05的ρ值的蛋白質(zhì)是樣品間顯著差異表達(dá)的。使用Old等2005中所描述的等式來(lái)量化差異表達(dá)的蛋白質(zhì)的倍數(shù)表達(dá)變化(FC)。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)用固相三明治式免疫測(cè)定法來(lái)測(cè)量用于檢測(cè)敗血病的10種候選生物標(biāo)志。可用的商業(yè)抗體和抗原購(gòu)自多個(gè)廠家以準(zhǔn)備免疫測(cè)定法。使用已知數(shù)量的重組蛋白或由制造商提供的標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)形成標(biāo)準(zhǔn)曲線，以為樣品濃度提供參照。一式三份實(shí)施所有測(cè)定法，并且測(cè)定法間和測(cè)定法內(nèi)變異系數(shù)范圍為3-7%。進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)以比較經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化的來(lái)自沒有敗血病的受試者和患有經(jīng)確認(rèn)的敗血病的受試者的樣品的ELISA值。為了呈現(xiàn)，我們將平均對(duì)數(shù)值轉(zhuǎn)化回到初始單位(調(diào)和均值)，并應(yīng)用Bonferroni校正以解決多重比較?；趤?lái)自個(gè)別蛋白質(zhì)比較的結(jié)果，我們使用邏輯回歸模型來(lái)評(píng)估2、3或4種蛋白質(zhì)的數(shù)種不同組合的分類性能?；趤?lái)自每個(gè)多蛋白質(zhì)模型的風(fēng)險(xiǎn)得分來(lái)計(jì)算接收器運(yùn)行特征(ROC)曲線。使用 SAS軟件(v9. 1)來(lái)計(jì)算描述和推論統(tǒng)計(jì)學(xué)；使用定制的STATA模塊來(lái)產(chǎn)生并比較ROC曲線 (Pepe2003)。對(duì)ELISA數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析將沒有敗血病的對(duì)照受試者(η = 77)，和患有經(jīng)確認(rèn)的敗血病的受試者(η = 5)中通過(guò)ELISA實(shí)驗(yàn)測(cè)量的臍帶血中的候選蛋白質(zhì)生物標(biāo)志濃度進(jìn)行對(duì)照轉(zhuǎn)化 ，之后將它們進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。使用單因素方差分析(ANOVA)檢驗(yàn)來(lái)實(shí)施對(duì)照對(duì)敗血病間的經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化的蛋白質(zhì)濃度的獨(dú)立配對(duì)比較。為了呈現(xiàn)，我們將平均對(duì)數(shù)值轉(zhuǎn)化回到初始單位(調(diào)和均值)，并應(yīng)用Bonferroni校正以解決多重比較。基于來(lái)自個(gè)別蛋白質(zhì)比較的結(jié)果，我們使用邏輯回歸模型來(lái)評(píng)估2、3或4種蛋白質(zhì)的數(shù)種不同組合的分類性能。基于來(lái)自每個(gè)多蛋白質(zhì)模型的風(fēng)險(xiǎn)得分來(lái)計(jì)算接收器運(yùn)行特征(ROC)曲線。
使用SAS軟件(v9. 1)來(lái)計(jì)算描述和推論統(tǒng)計(jì)學(xué)；使用定制的STATA模塊來(lái)產(chǎn)生并比較ROC曲線(P印e 2003)。 結(jié)果新生兒敗血病中的臍帶血蛋白質(zhì)組的蛋白質(zhì)組變化2維凝膠電泳分析將來(lái)自對(duì)照、疑似敗血病(SS)、和經(jīng)確認(rèn)的敗血病(CS)受試者的臍帶血(CB)進(jìn)行親和純化以除去高多度血清蛋白質(zhì)。分別用Cy5、Cy3、和Cy2染料標(biāo)記來(lái)自對(duì)照、SSjP CS受試者的經(jīng)消減的CBS。將經(jīng)標(biāo)記的樣品在2D凝膠上解析。圖IA和IB分別顯示了來(lái)自對(duì)照(紅色) 對(duì)SS (綠色)和對(duì)照(紅色)對(duì)CS (綠色)的CBS的DIGE凝膠圖像。使用Phoretix 2D Evolution軟件來(lái)測(cè)定在SS對(duì)對(duì)照(圖1C)和CS對(duì)對(duì)照(圖1D)間差異表達(dá)的點(diǎn)?；诳偟狞c(diǎn)體積(volume)來(lái)標(biāo)準(zhǔn)化差別圖譜(圖IC和1D)中的點(diǎn)強(qiáng)度。差別圖譜中下調(diào)大于等于2倍的點(diǎn)以紅色突出顯示，而上調(diào)大于等于2倍的點(diǎn)以綠色突出顯示。結(jié)論2_D凝膠分析鑒定新生兒敗血病受試者的臍帶血中的多種蛋白質(zhì)的差異表達(dá)。臍帶血蛋白質(zhì)組自所有2-DLC質(zhì)譜術(shù)實(shí)驗(yàn)鑒定具有至少兩個(gè)獨(dú)特肽(ρ大于等于 0.8)匹配的總共670種蛋白質(zhì)。依照譜計(jì)數(shù)的降低次序來(lái)對(duì)臍帶血蛋白質(zhì)分級(jí)，并在補(bǔ)充的表1(第5欄)中顯示。使用來(lái)自DAVID生物信息學(xué)資源(Dermis 2003)的基因本體論 (Gene Ontology, GO)注釋來(lái)實(shí)施臍帶血蛋白質(zhì)組的功能注釋。具有代謝(21 %)、免疫應(yīng)答(10% )、轉(zhuǎn)運(yùn)(10% )、和發(fā)育(7% )功能的蛋白質(zhì)構(gòu)成大部分的臍帶血蛋白質(zhì)組。新生兒敗血病的臍帶血蛋白質(zhì)組中的差異表達(dá)蛋白質(zhì)的聚類與蛋白質(zhì)匹配的 MS/MS譜的總數(shù)與其在復(fù)雜的混合物中的多度直接相關(guān)(Liu 2004)。使用GeneMaths軟件 (第1.5版，Applied Maths, Austin, TX)來(lái)顯現(xiàn)對(duì)照、SSjP CS受試者間在CB上的全局蛋白質(zhì)表達(dá)變化。將在一份樣品中具有至少兩個(gè)蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果(P大于等于0.8)的蛋白質(zhì)的譜計(jì)數(shù)個(gè)別地進(jìn)行均值標(biāo)準(zhǔn)化，并通過(guò)GeneMaths軟件分析。使用具有200次模擬的歐幾里得距離學(xué)習(xí)方法來(lái)對(duì)在樣品間具有相似表達(dá)變化的蛋白質(zhì)分級(jí)聚類(圖2A)。圖2B和圖2C中分別顯示了具有在CS和對(duì)照樣品中上調(diào)的蛋白質(zhì)的代表性蛋白質(zhì)簇。結(jié)論使用分級(jí)聚類來(lái)顯現(xiàn)臍帶血蛋白質(zhì)組表明新生兒敗血病受試者中過(guò)表達(dá)的蛋白質(zhì)的特定簇。通過(guò)2維液相層析和串聯(lián)質(zhì)譜術(shù)(2D LC-MS-MS)鑒定的新生兒敗血病的臍帶血生物標(biāo)志將來(lái)自對(duì)照和經(jīng)確認(rèn)的敗血病(CS)樣品的CB樣品進(jìn)行基于2-DLC的串聯(lián)質(zhì)譜術(shù)， 接著為無(wú)標(biāo)記物量化。認(rèn)為以小于等于0. 05的ρ值和大于等于士2. 0的倍數(shù)變化通過(guò)無(wú)標(biāo)記物量化的CB蛋白是對(duì)照和新生兒敗血病受試者間顯著差異表達(dá)的(表1)。使用生物信息學(xué)收獲器來(lái)實(shí)施表1中的差異表達(dá)的蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能注釋。下文表1列出了對(duì)照和新生兒敗血病樣品間的差異表達(dá)的臍帶血蛋白質(zhì)及其Swiss-Prot登錄號(hào)、描述、倍數(shù)變化、和P值、蛋白質(zhì)依照其生物學(xué)功能來(lái)分組。表1 新生兒敗血病的臍帶血生物標(biāo)志
權(quán)利要求
1.一種用于在哺乳動(dòng)物受試者中診斷新生兒敗血病的方法，包括(a)相對(duì)于正常的生物學(xué)流體或已知指明新生兒敗血病的生物學(xué)流體中的水平，在自所述受試者獲得的生物學(xué)流體的樣品中測(cè)試一種或多種選自下組的蛋白質(zhì)的水平胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白1前體(SEQ ID NO 36)、白介素-6前體(SEQ ID NO 3)、C-反應(yīng)蛋白前體(SEQ ID NO :1)、β-2-微球蛋白前體(SEQ ID NO :7)、組織蛋白酶B前體(SEQ ID NO :38)、半胱氨酸蛋白酶抑制劑M前體(SEQ ID NO :42)、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白2前體(SEQ ID NO :44)、基質(zhì)金屬蛋白酶9 (SEQ ID NO :64)、金屬蛋白酶抑制劑1前體(SEQ ID Ν0:31)、和 α-1-酸性糖蛋白 KSEQ ID NO 65)；并(b)若所述水平相對(duì)于所述正常的生物學(xué)流體中的水平顯示統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異，或者相對(duì)于所述已知指明新生兒敗血病的生物學(xué)流體中的水平不顯示統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異，則診斷出所述受試者患有新生兒敗血病。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述受試者是人患者。
3.權(quán)利要求2的方法，包括若相對(duì)于正常的臍帶血，所有所述測(cè)試蛋白質(zhì)在臍帶血樣品中顯示顯著差異，則診斷出所述受試者患有新生兒敗血病。
4.權(quán)利要求2的方法，其中通過(guò)免疫測(cè)定法來(lái)測(cè)定所述水平。
5.權(quán)利要求2的方法，其中通過(guò)質(zhì)譜術(shù)來(lái)測(cè)定水平。
6.權(quán)利要求2的方法，其中使用蛋白質(zhì)陣列來(lái)測(cè)定水平。
7.權(quán)利要求1-6中任-項(xiàng)的方法，其另外包括測(cè)試一種或多種選自下組的蛋白質(zhì)白介素-1受體輔助蛋白前體(SEQ ID NO 2)、白介素-1受體樣1前體(SEQ ID NO 4)、血清淀粉狀蛋白A蛋白前體(SEQ ID NO 5)、⑶5抗原樣前體(SEQ ID NO 6)、骨髓蛋白聚糖前體(SEQ ID NO 8)、硒結(jié)合蛋白1 (SEQ ID NO 9)、脂多糖結(jié)合蛋白前體(SEQ ID NO 10)、硫酸軟骨素蛋白聚糖4前體(SEQ ID NO :11)、骨橋蛋白前體(SEQ ID N0:12)、P⑶P解離抑制劑2(SEQ ID NO :13)、碳酸酐酶2 (SEQ ID NO :14)、嗜中性粒細(xì)胞明膠酶關(guān)聯(lián)脂籠蛋白前體(SEQ ID N0:15)、膠原α-5 (IV)鏈前體(SEQ ID NO :16)、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子前體(SEQ ID NO: 17)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子1前體(SEQ ID NO :18)、蛋白質(zhì)激酶C結(jié)合蛋白NELL2 前體(SEQ ID NO 19)、Neudesin前體(SEQ ID NO :20)、蛋白質(zhì)二硫化物異構(gòu)酶前體(SEQ ID NO 21)、核糖核酸酶胰前體(SEQ ID NO 22)、δ樣蛋白前體(SEQ ID NO 23)、嗜鉻粒蛋白-Α前體(SEQ ID NO 24)、骨調(diào)蛋白前體(SEQ ID NO 25)、膠原α -2(1)鏈前體(SEQ ID NO :26)、原低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1前體(SEQ ID NO :27)、層粘連蛋白亞基Y _1前體 (SEQ IDNO :28)、層粘連蛋白亞基β-1前體(SEQ ID NO :29)、膠原α-1 (II)鏈前體(SEQ ID NO 30)、蛋白 FAM3C 前體(SEQ ID NO 32)、α -輔肌動(dòng)蛋白-1 (SEQ ID NO 33)、F-肌動(dòng)蛋白加帽蛋白亞基α-1 (SEQ ID NO :34)、氨肽酶N(SEQ ID NO :35)、細(xì)胞粘附分子1前體(SEQ ID NO 37)、Exostosin-2(SEQ ID NO :39)、組織蛋白酶D前體(SEQ ID NO :40)、神經(jīng)源性基因座notch同系物蛋白3前體(SEQ ID NO 41) ,Noelin前體(SEQ ID NO 43)、內(nèi)質(zhì)蛋白前體(SEQ ID NO 45)、原蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin 9型前體(SEQ ID NO 46)、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白復(fù)合物酸不穩(wěn)定性鏈前體(SEQ ID N0:47)、埃茲蛋白(SEQ ID NO 48)、肝型脂肪酸結(jié)合蛋白(SEQ ID NO :49)、可能的G蛋白偶聯(lián)受體116前體(SEQ ID N0 50)、Seprase (SEQ ID NO :51)、癌蛋白誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄物3蛋白前體(SEQ IDNO 52)、缺氧上調(diào)型蛋白1前體(SEQ ID NO 53)、跨高爾基體網(wǎng)絡(luò)膜內(nèi)在蛋白2前體(SEQ ID NO 54)、轉(zhuǎn)酮酶(SEQ ID NO :55)、受體型酪氨酸蛋白質(zhì)磷酸酶F前體(SEQ ID NO :56)、細(xì)胞間粘附分子 1前體(SEQ IDNO :57)、低密度脂蛋白受體前體(SEQ ID NO :58)、78kDa葡萄糖調(diào)節(jié)型蛋白前體(SEQ ID N0:59)、punc ell相鄰物前體(SEQ ID NO :60)、甘露糖基寡糖1，2-α -甘露糖苷酶IA(SEQ ID Ν0:61)、丙酮酸激酶同工酶M1/M2(SEQ ID NO :62)、和應(yīng)激誘導(dǎo)的磷蛋白 1(SEQ ID NO 63)。
8.權(quán)利要求2的用途，其中蛋白質(zhì)組概況包含蛋白質(zhì)胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白1前體(SEQ ID NO :36)、白介素-6 前體(SEQ ID NO 3)、C-反應(yīng)蛋白前體(SEQ ID NO :1)、 β-2-微球蛋白前體(SEQ ID NO :7)、組織蛋白酶B前體(SEQ ID NO :38)、半胱氨酸蛋白酶抑制劑M前體(SEQ ID NO :42)、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白2前體(SEQ ID NO 44)、基質(zhì)金屬蛋白酶9 (SEQ ID NO :64)、金屬蛋白酶抑制劑1前體(SEQ ID NO :31)、和α-l-酸性糖蛋白1(SEQ ID NO :65)水平的信息，且其中若相對(duì)于正常的生物學(xué)流體，一種或多種所述測(cè)試蛋白質(zhì)在所述生物學(xué)流體樣品中顯示顯著差異，則做出所述受試者患有新生兒敗血病的診斷。
9.權(quán)利要求8的用途，其中若相對(duì)于正常的生物學(xué)流體，所有所述測(cè)試蛋白質(zhì)在所述生物學(xué)流體樣品中顯示顯著差異，則做出所述受試者患有新生兒敗血病的診斷。
10.權(quán)利要求8的用途，其中通過(guò)免疫測(cè)定法來(lái)測(cè)定所述水平。
11.權(quán)利要求8的用途，其中通過(guò)質(zhì)譜術(shù)來(lái)測(cè)定所述水平。
12.權(quán)利要求8的用途，其中使用蛋白質(zhì)陣列來(lái)測(cè)定所述水平。
13.一種免疫測(cè)定試劑盒，其包含用于檢測(cè)一種或多種選自下組的蛋白質(zhì)的抗體和試劑胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白1前體(SEQ ID N0:36)、白介素-6前體(SEQ ID NO :3)、 C-反應(yīng)蛋白前體(SEQ ID NO :1)、β-2-微球蛋白前體(SEQ ID NO :7)、組織蛋白酶B前體 (SEQ ID NO :38)、半胱氨酸蛋白酶抑制劑M前體(SEQ ID NO :42)、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白2前體(SEQ ID NO :44)、基質(zhì)金屬蛋白酶9 (SEQ ID NO :64)、金屬蛋白酶抑制劑1前體 (SEQ ID Ν0:31)、禾口 α-1-酸性糖蛋白 1 (SEQ ID NO :65)。
14.權(quán)利要求13的免疫測(cè)定試劑盒，其包含用于檢測(cè)所有所述蛋白質(zhì)的抗體和試劑。
15.一份報(bào)告，其包含測(cè)試的結(jié)果和/或基于測(cè)試的診斷，包括(a)相對(duì)于正常的生物學(xué)流體或已知指明新生兒敗血病的生物學(xué)流體中的水平，在自所述受試者獲得的生物學(xué)流體的樣品中測(cè)試一種或多種選自下組的蛋白質(zhì)的水平胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白1前體(SEQ ID NO 36)、白介素-6前體(SEQ ID NO 3)、C-反應(yīng)蛋白前體(SEQ ID NO :1)、β-2-微球蛋白前體(SEQ ID NO :7)、組織蛋白酶B前體(SEQ ID NO :38)、半胱氨酸蛋白酶抑制劑M前體(SEQ ID NO :42)、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白2前體(SEQ ID NO :44)、基質(zhì)金屬蛋白酶9 (SEQ ID NO :64)、金屬蛋白酶抑制劑1前體(SEQ ID Ν0:31)、和 α-1-酸性糖蛋白 KSEQ ID NO 65)；并(b)若所述水平相對(duì)于所述正常的生物學(xué)流體中的水平顯示統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異，或者相對(duì)于所述已知指明新生兒敗血病的生物學(xué)流體中的水平不顯示統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異，則診斷出所述受試者患有新生兒敗血病。
16.一種實(shí)體介質(zhì)，其儲(chǔ)存測(cè)試的結(jié)果和/或基于測(cè)試的診斷，包括(a)相對(duì)于正常的生物學(xué)流體或已知指明新生兒敗血病的生物學(xué)流體中的水平，在自所述受試者獲得的生物學(xué)流體的樣品中測(cè)試一種或多種選自下組的蛋白質(zhì)的水平胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白1前體(SEQ ID NO 36)、白介素-6前體(SEQ ID NO 3)、C-反應(yīng)蛋白前體(SEQ ID NO :1)、β-2-微球蛋白前體(SEQ ID NO :7)、組織蛋白酶B前體(SEQ ID NO :38)、半胱氨酸蛋白酶抑制劑M前體(SEQ ID NO :42)、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白2前體(SEQ ID NO :44)、基質(zhì)金屬蛋白酶9 (SEQ ID NO :64)、金屬蛋白酶抑制劑1前體(SEQ ID Ν0:31)、和 α-1-酸性糖蛋白 KSEQ ID NO 65)；并(b)若所述水平相對(duì)于所述正常的生物學(xué)流體中的水平顯示統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異，或者相對(duì)于所述已知指明新生兒敗血病的生物學(xué)流體中的水平不顯示統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異，則診斷出所述受試者患有新生兒敗血病。
全文摘要
本發(fā)明關(guān)注使用全局蛋白質(zhì)組方法來(lái)鑒定并檢測(cè)新生兒敗血病的生物學(xué)流體生物標(biāo)志。
文檔編號(hào)G01N33/68GK102334033SQ201080009549
公開日2012年1月25日 申請(qǐng)日期2010年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月27日
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