本專利申請要求2014年1月2日提交的美國臨時專利申請序列號61/923,183、2014年10月20日提交的美國臨時專利申請序列號62/066,034、以及2014年10月30日提交的美國臨時專利申請序列號62/072,893中的每一個的優(yōu)先權，這些臨時專利申請中的每一個的全部內(nèi)容以引用的方式并入本文。

背景

癌癥免疫療法涉及由患者的免疫系統(tǒng)進行的對癌癥細胞的攻擊。T淋巴細胞的調(diào)節(jié)和活化取決于由T細胞受體進行的信號傳導并且還取決于遞送正或負信號以用于活化的共信號傳導受體。由T細胞進行的免疫應答受共刺激性和抑制性信號平衡(稱為免疫檢查點)控制。

使用免疫檢查點抑制劑的免疫療法是革命性的癌癥療法。例如，在某些黑色素瘤患者中，抗CTLA4和抗PD1抗體為轉(zhuǎn)移性環(huán)境中的長期疾病控制提供非凡的機會。

概述

本發(fā)明涵蓋以下發(fā)現(xiàn)：對癌癥免疫療法的有利反應的可能性可以被預測。本發(fā)明進一步包括以下發(fā)現(xiàn)：癌癥細胞可具有導致新表位的體細胞突變，該新表位可由患者的免疫系統(tǒng)識別為非自身的。對癌癥樣品中的一個或多個新表位的鑒定可用于確定哪些癌癥患者可能有利地響應于免疫療法，具體地來說是使用免疫檢查點調(diào)節(jié)劑的治療。

在一些實施方案中，本發(fā)明提供用于將受試者鑒定為可能響應于使用免疫檢查點調(diào)節(jié)劑的治療的方法。

在一些實施方案中，方法包括以下步驟：在來自受試者的癌癥樣品中檢測體細胞突變，以及將受試者鑒定為使用免疫檢查點調(diào)節(jié)劑的治療的候選者。在一些實施方案中，受試者被鑒定為可能有利地響應于使用免疫檢查點調(diào)節(jié)劑的治療。

在一些實施方案中，檢測體細胞突變包括對來自癌癥樣品的一個或多個外顯子組進行測序。在一些實施方案中，體細胞突變包括由T細胞識別的新表位。

在一些實施方案中，新表位與不具有突變的對應表位相比具有更大的對主要組織相容性復合體(MHC)分子的結(jié)合親和力。

在一些實施方案中，體細胞突變包括新表位，所述新表位包含在不具有體細胞突變的相同細胞類型中不表達的四聚體。

在一些實施方案中，新表位與感染劑共享共有序列。在一些實施方案中，新表位與細菌共享共有序列。在一些實施方案中，新表位與病毒共享共有序列。

在一些實施方案中，體細胞突變包括包含表1的四聚體的新表位。

在一些實施方案中，癌癥樣品為或包括黑色素瘤。

在一些實施方案中，免疫檢查點調(diào)節(jié)劑與以下的一種或多種相互作用：細胞毒性T-淋巴細胞抗原4(CTLA4)、程序性死亡1(PD-1)或其配體、淋巴細胞活化基因-3(LAG3)、B7同源物3(B7-H3),B7同源物4(B7-H4)、吲哚胺(2,3)-雙加氧酶(IDO)、腺苷A2a受體、軸突素(neuritin)、B-淋巴細胞和T-淋巴細胞弱化子(BTLA)、殺傷免疫球蛋白樣受體(KIR)、含T細胞免疫球蛋白和粘蛋白結(jié)構域的蛋白質(zhì)3(TIM-3)、誘導型T細胞共刺激分子(ICOS)、CD27、CD28、CD40、CD137或其組合

在一些實施方案中，免疫檢查點調(diào)節(jié)劑為或包括抗體或抗原結(jié)合片段。在一些實施方案中，免疫檢查點調(diào)節(jié)劑為伊匹單抗。在一些實施方案中，免疫檢查點調(diào)節(jié)劑為或包括替西木單抗。在一些實施方案中，免疫檢查點調(diào)節(jié)劑為或包括納武單抗。在一些實施方案中，免疫檢查點調(diào)節(jié)劑為或包括拉姆單抗(lambrolizumab)。在一些實施方案中，免疫檢查點調(diào)節(jié)劑為或包括派姆單抗。

在一些實施方案中，本發(fā)明提供用于將受試者鑒定為可能響應于使用免疫檢查點調(diào)節(jié)劑的治療的方法。在一些實施方案中，本發(fā)明提供用于將受試者鑒定為可能響應于使用免疫檢查點調(diào)節(jié)劑的治療的方法，其中受試者先前從未使用癌癥免疫療法治療過。

在一些實施方案中，本發(fā)明提供用于在來自受試者的癌癥樣品中檢測體細胞突變以及將受試者鑒定為使用免疫檢查點調(diào)節(jié)劑的治療的較差候選者的方法。

在一些實施方案中，本發(fā)明提供用于將受試者鑒定為如果施用免疫檢查點調(diào)節(jié)劑，則可能遭受一種或多種自身免疫并發(fā)癥的方法。

在一些實施方案中，自身免疫并發(fā)癥為或包括小腸結(jié)腸炎、肝炎、皮炎(包括毒性表皮壞死溶解)、神經(jīng)病和/或內(nèi)分泌病。在一些實施方案中，自身免疫并發(fā)癥為或包括甲狀腺功能減退癥。

在一些實施方案中，本發(fā)明提供用于確定受試者患有包含體細胞突變的癌癥以及對于受試者選擇包含免疫檢查點調(diào)節(jié)劑的癌癥治療的方法，其中體細胞突變包括包含來自表1的四聚體的新表位。

在一些實施方案中，本發(fā)明提供用于使用免疫檢查點調(diào)節(jié)劑治療受試者的方法，其中受試者先前被鑒定為患有具有一個或多個體細胞突變的癌癥，其中一個或多個體細胞突變包括由T細胞識別的新表位。

在一些實施方案中，本發(fā)明提供用于改進使用免疫檢查點調(diào)節(jié)劑的癌癥療法的功效的方法，所述方法包括以下步驟：對于療法接受選擇被鑒定為患有具有一個或多個體細胞突變的癌癥的受試者，所述一個或多個體細胞突變包括由T細胞識別的新表位。

在一些實施方案中，本發(fā)明提供通過施用免疫檢查點調(diào)節(jié)劑治療癌癥的方法的改進，其中改進包括向被鑒定為患有具有一個或多個體細胞突變的癌癥的受試者施用療法，所述一個或多個體細胞突變包括由T細胞識別的新表位。在一些實施方案中，在CTLA-4阻斷(例如，通過伊匹單抗或替西木單抗)治療之后觀察到長期臨床益處。

在一些實施方案中，本發(fā)明提供用于治療選自由癌瘤、肉瘤、骨髓瘤、白血病或淋巴瘤組成的組的癌癥的方法，方法包括以下步驟：向被鑒定為患有具有一個或多個體細胞突變的癌癥的受試者施用免疫檢查點調(diào)節(jié)劑療法，所述一個或多個體細胞突變包括由T細胞識別的新表位。在一些實施方案中，癌癥為黑色素瘤。在一些實施方案中，癌癥為非小細胞肺癌(NSCLC)。

附圖簡述

下列圖僅為說明目的而給出，并且并非意在進行限制。

圖1(由圖1A至圖1C組成)示出成對的治療前和治療后掃描，該掃描來自具有療法的長期臨床益處的患者(圖1A，1/2/2011和8/26/2013)；(圖1B，9/6/2011和1/14/2013)以及不具有益處/進行性疾病的患者(圖1C，8/13/2009和1/9/2010)。

圖2(由圖2A至圖2I組成)示出來自具有伊匹單抗治療的不同臨床益處的患者的腫瘤突變景觀(mutational landscape)。圖2A示出通過臨床益處分類的突變負荷(mutational load)。圖2B示出突變負荷與伊匹單抗益處之間的關系。LB，長期臨床益處組；NB，最小益處或無益處組；p＝0.01(對于具有與不具有長期臨床益處的患者之間的中值突變負荷差異比較中值的曼-惠特尼雙尾t-檢驗)。圖2C示出通過臨床亞組得到的轉(zhuǎn)換(Ti)和顛換(Tv)率。圖2D示出發(fā)現(xiàn)組和驗證組中的核苷酸變化。突變譜與先前黑色素瘤基因組研究一致。19圖2E描繪發(fā)現(xiàn)組中具有大于或小于100個非同義編碼突變/外顯子組的患者的總存活率的Kaplan-Meier曲線(由對數(shù)秩檢驗得到p＝0.041)。圖2F示出突變負荷與伊匹單抗益處之間的關系。LB，長期臨床益處組；NB，最小益處或無益處組；p＝0.01(對于具有與不具有長期臨床益處的患者之間的中值突變負荷差異比較中值的曼-惠特尼雙尾t-檢驗)。圖2G描繪發(fā)現(xiàn)組中具有大于或小于100個非同義編碼突變/外顯子組的患者的總存活率的Kaplan-Meier曲線(由對數(shù)秩檢驗得到p＝0.041)。圖2H描繪驗證組中具有大于或小于100個非同義編碼突變/外顯子組的患者的總存活率的Kaplan-Meier曲線(由對數(shù)秩檢驗得到p＝0.010)。圖2I示出通過臨床亞組得到的轉(zhuǎn)換(Ti)和顛換(Tv)率。

圖3(由圖3A至圖3H組成)示出新表位標記定義了伊匹單抗臨床益處。候選新表位通過補充方法中所述的突變分析來鑒定。圖3A示出由發(fā)現(xiàn)組(n＝25)中具有長期臨床益處(LB)或具有最小臨床益處或無臨床益處(NB)的患者共享的候選四肽新表位的熱圖。每行表示一種新表位。紅線指示與反應相關的四肽標記。精確的四肽、染色體基因座以及其中存在它們的野生型和突變型九聚體列于表4和圖19中。圖3B示出對于驗證組(n＝15)的相同信息。圖3C通過排除分離的未響應腫瘤的正新表位標記(藍線)或負新表位標記(紅線)示出發(fā)現(xiàn)組的Kaplan-Meier曲線。對于具有標記的患者與不具有標記的那些患者，由對數(shù)秩檢驗得到P<0.0001。圖3D示出對于驗證組的相同數(shù)據(jù)。由對數(shù)秩得到p＝0.049。圖3E示出由發(fā)現(xiàn)組(n＝25)中具有長期臨床益處(LB)或具有最小臨床益處或無臨床益處(NB)的患者共享的候選四肽新表位的熱圖。每行表示一種新表位。紅線指示與反應相關的四肽標記。精確的四肽、染色體基因座以及其中存在它們的野生型和突變型九聚體列于表4和圖19中。圖3F示出對于驗證組(n＝15)的相同信息。圖3G通過排除分離的未響應腫瘤的正新表位標記(藍線)或負新表位標記(紅線)示出發(fā)現(xiàn)組的Kaplan-Meier曲線。對于具有標記的患者與不具有標記的那些患者，由對數(shù)秩檢驗得到P<0.0001。圖3H示出對于驗證組的相同數(shù)據(jù)。由對數(shù)秩得到p＝0.049。

圖4(由圖4A至圖4F組成)示出活化來自伊匹單抗治療的患者的T細胞的新表位。圖4A示出作為基因組位置函數(shù)的新表位產(chǎn)生多樣性。作為基因組位置函數(shù)對來自三個代表性LB患者的新表位進行作圖。標記的候選新表位可通過不同基因來產(chǎn)生。沿著x軸對新表位的染色體位置進行作圖。峰高指示發(fā)現(xiàn)組和驗證組中有多少患者共享氨基酸序列。圖4B示出剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)的實例四肽子串。在每種情況下，含有突變的九聚體被預測為結(jié)合患者特異性HLA并且由患者特異性HLA呈遞。圖4C示出對TESPFEQHI與野生型肽TKSPFEQHI的多功能T細胞應答。圖4D示出對TESPFEQHI與野生型肽TKSPFEQHI的雙重陽性(IFN-γ和TNF-α)CD8+T細胞應答以及隨時間推移IFN-γ+T細胞的增加。圖4E示出對GLEREGFTF與野生型肽GLERGGFTF的雙重陽性(IFN-γ和TNF-α)CD8+T細胞應答，并且示出相對于基線，在開始用伊匹單抗治療24周之后肽特異性T細胞的增加。圖4F示出人巨細胞病毒立即早期表位的實例四肽子串。在每種情況下，含有突變的九聚體被預測為結(jié)合患者特異性HLA并且由患者特異性HLA呈遞。

圖5示出發(fā)現(xiàn)組的分析流程，其中排除了具有小于或等于10倍覆蓋度的突變，并且使用整合基因組學查看器(IGV)手動查看具有小于35倍覆蓋度的候選者。

圖6(由圖6A至圖6D組成)示出每個臨床亞組中最常見突變的基因的代表性列表。候選突變通過諸如Ion Torrent測序或MiSeq的正交測序方法來驗證。圖6A描繪發(fā)現(xiàn)組和驗證組中反復突變的基因的代表性列表。圖6B描繪發(fā)現(xiàn)組和驗證組中的突變類型在整個樣品中的分布。圖6C描繪發(fā)現(xiàn)組和驗證組中反復突變的基因的代表性列表。圖6D描繪發(fā)現(xiàn)組和驗證組中的突變類型在整個樣品中的分布。

圖7(由圖7A至圖7F組成)示出長期益處和最小益處或無益處患者的驅(qū)動物(driver)和突變負荷。圖7A示出發(fā)現(xiàn)組中每個臨床組腫瘤中的已知黑色素瘤驅(qū)動基因的突變發(fā)生。圖7B描繪驗證組中每個臨床組腫瘤中的已知黑色素瘤驅(qū)動基因的突變。圖7C示出驗證組中每個樣品的外顯子錯義突變數(shù)。圖7D示出驗證組中每個樣品的中值外顯子錯義突變的比較。圖7E描繪患者亞組的突變負荷，所述患者亞組為不具有放射照相疾病跡象(NED)、具有大于6個月的疾病控制(出現(xiàn)在所有患者而非一個患者中)、具有小于6個月的疾病控制以及不具有反應(NR)。對于具有NED的患者與不具有反應的那些患者之間的差異，P＝0.03(比較中值的曼-惠特尼雙尾t-檢驗)。圖7F描繪患者亞組的突變負荷，所述患者亞組為不具有放射照相疾病跡象(NED)、具有大于6個月的疾病控制(出現(xiàn)在所有患者而非一個患者中)、具有小于6個月的疾病控制以及不具有反應(NR)。對于具有NED的患者與不具有反應的那些患者之間的差異，P＝0.03(比較中值的曼-惠特尼雙尾t-檢驗)。

圖8示出新表位分析流程。針對預測的野生型和突變體執(zhí)行所有步驟。MHC I類預測通過NetMHCv3.4和/或RANKPEP進行。通過掩蓋HLA特異性氨基酸的IEDB程序進行T細胞免疫原性預測(http://tools.immunepitope.org/immunogenicity/)。

圖9(由圖9A至圖9C組成)示出來自發(fā)現(xiàn)組治療前和治療后的患者的代表性掃描。圖9A示出來自不具有放射照相疾病跡象的一個患者的兩個部位(5/1/08和5/30/13)。圖9B示出來自具有大于6個月臨床益處的患者的掃描。上方是來自9/6/11和1/14/13。下方是來自9/19/07和1/15/09。圖9C示出來自對療法不具有反應的患者的掃描。上方是5/27/10和12/21/10。下方是3/3/11和11/18/11。

圖10(由圖10A至圖10K組成)示出肽分析、發(fā)現(xiàn)和驗證。圖10A示出在發(fā)現(xiàn)組中的所有樣品中，突變型肽與對應的野生型肽相比更可能結(jié)合MHC I類。圖10B示出在驗證組中的所有樣品中，突變型肽與對應的野生型肽相比更可能結(jié)合MHC I類。圖10C和圖10D示出LB組和NB組中常見四肽中的氨基酸的頻率。每個字母的高度反映在所述位置處的給定氨基酸的頻率。在NB組中未看到位置3和位置4處的苯丙氨酸(F)。圖10E示出通過臨床組得到的包含子串的四肽的已知抗原。保守性四肽新表位包含在體外具有T細胞活化跡象的來自感染性病原體的抗原子串。圖10F示出MART-1和EKLS子串。圖10G示出在發(fā)現(xiàn)組中的所有樣品中，突變型肽與對應的野生型肽相比更可能結(jié)合MHC I類。圖10H示出在驗證組中的所有樣品中，突變型肽與對應的野生型肽相比更可能結(jié)合MHC I類。圖10I和圖10J示出LB組和NB組中常見四肽中的氨基酸的頻率。每個字母的高度反映在所述位置處的給定氨基酸的頻率。圖10K示出通過臨床組布置的包含子串的四肽的已知抗原。保守性四肽新表位包含在體外具有T細胞活化跡象的來自感染性病原體的抗原子串。

圖11示出在第60周血液樣品中在肽庫A、B和C中檢測到的多功能CD8T細胞應答。對來自患者CR1509、CR9699和CR9306的冷凍PBMC進行解凍并且分別使用方法中所述的肽庫A、B和C重新刺激。使用以下條件在第10天進行細胞內(nèi)細胞因子染色(ICS)：無刺激(陰性對照)、葡萄球菌腸毒素B(SEB，陽性對照)以及對應的肽庫。CD8+IFN-γ+、CD8+IFN-γ+TNF-α+以及CD8+IFN-γ+CD107a+T細胞的代表性點狀圖示于圖11A(對于患者CR1509的庫A)、圖11B(對于患者CR9699的庫B)以及圖11C(對于患者CR9306的庫C)中。圖11D示出與野生型GLERGGFTF相比，在用突變型肽GLEREGFTF刺激時CD8+IFN-γ、TNF-α、CD-107a以及MIP-1β雙重陽性細胞的百分比。

圖12描繪模擬的流程圖，以便測試標記將由實際數(shù)據(jù)的排列或模擬數(shù)據(jù)集的不同數(shù)據(jù)集產(chǎn)生的這種無效假設。

圖13證實突變型肽或野生型肽都沒有在三個健康供體中引發(fā)CD8+IFN-γ反應。

圖14證實新抗原產(chǎn)生可以是基因組位置的函數(shù)。作為基因組位置函數(shù)對來自三個代表性LB患者的新抗原進行作圖。在不同基因中產(chǎn)生標記的候選新表位。沿著x軸對新表位的染色體位置進行作圖。峰高指示發(fā)現(xiàn)組和驗證組中有多少患者共享氨基酸序列。通過整個基因組中各種基因中的突變來編碼四肽。

圖15描繪針對驗證組的外顯子組分析流程。

圖16描繪針對LCA(白細胞共同抗原)、CD8以及FOXP3染色的腫瘤活檢物。根據(jù)圖16A，與具有長期益處的那些患者(LB；F-J)相比，在不具有臨床益處的那些患者(NB；A-E)中不存在用以下染色的細胞的百分比的顯著差異：LCA(B、G，200倍放大，箭頭尖端標記了陽性細胞)、CD8(C、H，200倍放大，箭頭尖端標記了陽性細胞)或FOXP3(D、I，200倍放大，箭頭尖端標記了陽性細胞)。來自NB患者和LB患者的腫瘤示出壞死(E、J，100倍放大)并且表現(xiàn)出壞死的腫瘤的百分比在組間(O)顯著不同(P＝0.034)，然而，這個發(fā)現(xiàn)取決于包括單一離群值(不包括時P＝0.683)。根據(jù)圖16B，與NB相比，在LB組中存在CD8:FOXP3比率(C)的顯著增加(P＝0.028)。在LB組中LCA(白細胞共同抗原)看起來更高，但不是統(tǒng)計學顯著的。

圖17描繪驗證組中的患者的詳細特征。

圖18描繪針對發(fā)現(xiàn)組和驗證組的每種腫瘤的非同義外顯子突變。

圖19描繪反應標記的四肽的背景、基因以及基因座。

圖20描繪存在于來自TCGARNA-seq數(shù)據(jù)集的反應標記中的引起四肽的編碼突變的基因的表達。在排除不具有表達的腫瘤之后，針對每個基因顯示平均SEM值。如果基因不在任何樣品中表達，則顯示零。

圖21描繪每個患者樣品的樣品部位、樣品大小以及活檢物類型。

定義

為了更加容易地理解本發(fā)明，以下對某些術語進行定義。本領域技術人員將理解，對于某些術語的定義可提供在本說明書的其他地方和/或從上下文看將為清楚的。

施用：如本文所用，術語“施用”是指向受試者施用組合物。施用可以通過任何適當?shù)耐緩?。例如，在一些實施方案中，施用可以是支氣?包括通過支氣管滴注)、經(jīng)頰、腸內(nèi)、真皮間、動脈內(nèi)、真皮內(nèi)、胃內(nèi)、骨髓內(nèi)、肌肉內(nèi)、鼻內(nèi)、腹膜內(nèi)、鞘內(nèi)、靜脈內(nèi)、心室內(nèi)、經(jīng)粘膜、經(jīng)鼻、經(jīng)口、直腸、皮下、舌下、局部、氣管(包括通過氣管內(nèi)滴注)、經(jīng)皮、陰道以及玻璃體施用。

親和力：如本領域所知，“親和力”是關于特定配體結(jié)合至其配合物的緊密性的量度。親和力可以不同方式來測量。在一些實施方案中，通定量測定來測量親和力。在一些此類實施方案中，結(jié)合配合物濃度可以被固定為超過配體濃度以便模擬生理條件。替代地或另外地，在一些實施方案中，結(jié)合配合物濃度和/或配體濃度可以改變。在一些此類實施方案中，可將親和力與可比條件(濃度)下的參考進行比較。

氨基酸：如本文所用，術語“氨基酸”在其廣義上來說，是指任何可以合并至多肽鏈中的化合物和/或物質(zhì)。在一些實施方案中，氨基酸具有一般結(jié)構H2N-C(H)(R)-COOH。在一些實施方案中，氨基酸是天然存在的氨基酸。在一些實施方案中，氨基酸是合成氨基酸；在一些實施方案中，氨基酸是d-氨基酸；在一些實施方案中，氨基酸是l-氨基酸?！皹藴拾被帷笔侵钙毡榈卦谔烊淮嬖诘碾闹邪l(fā)現(xiàn)的二十種標準l-氨基酸中的任何一種?！胺菢藴拾被帷笔侵赋龢藴拾被嵋酝獾娜魏伟被?，不管它是合成制備或是從天然來源獲得。如本文所用，“合成氨基酸”涵蓋化學修飾的氨基酸，包括但不限于鹽、氨基酸衍生物(如酰胺)、和/或取代。包括肽中的羧基端和/或氨基端氨基酸在內(nèi)的氨基酸可以通過甲基化、酰胺化、乙?；?、保護基和/或被可以改變肽的循環(huán)半衰期而不會不利地影響其活性的其他化學基團取代來修飾。氨基酸可以參與二硫鍵。氨基酸可包含一種或翻譯后修飾，諸如與一個或多個化學實體(例如，甲基、醋酸根、乙酰基、磷酸根、甲酸基部分、類異戊二烯基團、硫酸根、聚乙二醇部分、脂質(zhì)部分、碳水化合物部分、生物素部分等)相聯(lián)。術語“氨基酸”可與“氨基酸殘基”互換使用，并且可意指游離氨基酸和/或肽的氨基酸殘基。從術語所使用的上下文顯而易知它是指游離氨基酸還是肽的殘基。

抗體試劑：如本文所用，術語“抗體試劑”是指特異性結(jié)合至特定抗原的試劑。在一些實施方案中，此術語涵蓋具有足以賦予特異性結(jié)合的免疫球蛋白結(jié)構元件的任何多肽。合適的抗體試劑包括，但不限于人抗體、靈長類動物源化的抗體、嵌合抗體、雙特異性抗體、人源化的抗體、軛合的抗體(即，軛合或融合至其他蛋白質(zhì)、放射性標記、細胞毒素的抗體)、小型模塊免疫藥物(“SMIPs^TM”)、單鏈抗體、卵形抗體以及抗體片段。如本文所用，術語“抗體試劑”還包括完整單克隆抗體、多克隆抗體、單結(jié)構域抗體(例如，鯊單結(jié)構域抗體(例如，IgNAR或其片段))、由至少兩個完整抗體形成的多特異性抗體(例如雙特異性抗體)以及抗體片段，只要它們表現(xiàn)出希望的生物活性。在一些實施方案中，此術語涵蓋訂書肽。在一些實施方案中，此術語涵蓋一種或多種抗體樣結(jié)合肽模擬物。在一些實施方案中，此術語涵蓋一種或多種抗體樣結(jié)合支架蛋白。在一些實施方案中，此術語涵蓋單體或adnectin。在許多實施方案中，抗體試劑為或包括其氨基酸序列包括由本領域技術人員識別為互補決定區(qū)(CDR)的一個或多個結(jié)構元件的多肽；在一些實施方案中，抗體試劑為或包括其氨基酸序列包括與參考抗體中所存在的CDR基本上相同的至少一個CDR(例如，至少一個重鏈CDR和/或至少一個輕鏈CDR)的多肽。在一些實施方案中，所包括的CDR與參考CDR基本上相同，其中與參考CDR相比，所包括的CDR在序列上相同或含有1-5之間的氨基酸取代。在一些實施方案中，所包括的CDR與參考CDR基本上相同，其中所述包括的CDR顯示出與參考CDR的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一些實施方案中，所包括的CDR與參考CDR基本上相同，其中包括的CDR顯示出與參考CDR的至少96％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一些實施方案中，所包括的CDR與參考CDR基本上相同，其中與參考CDR相比，所包括的CDR內(nèi)的至少一個氨基酸被缺失、添加或取代，但所包括的CDR具有以另外的方式與參考CDR的氨基酸序列相同的氨基酸序列。在一些實施方案中，所包括的CDR與參考CDR基本上相同，其中與參考CDR相比，所包括的CDR內(nèi)的1-5個氨基酸被缺失、添加或取代，但所包括的CDR具有以另外的方式與參考CDR相同的氨基酸序列。在一些實施方案中，所包括的CDR與參考CDR基本上相同，其中與參考CDR相比，所包括的CDR內(nèi)的至少一個氨基酸被取代，但所包括的CDR具有以另外的方式與參考CDR的氨基酸序列相同的氨基酸序列。在一些實施方案中，所包括的CDR與參考CDR基本上相同，其中與參考CDR相比，所包括的CDR內(nèi)的1-5個氨基酸被缺失、添加或取代，但所包括的CDR具有以另外的方式與參考CDR相同的氨基酸序列。在一些實施方案中，抗體試劑為或包括其氨基酸序列包括由本領域技術人員識別為免疫球蛋白可變結(jié)構域的結(jié)構元件的多肽。在一些實施方案中，抗體試劑為具有結(jié)合結(jié)構域的多肽蛋白，所述結(jié)合結(jié)構域與免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構域同源或很大程度上同源。

抗體多肽：如本文所用，可互換使用的術語“抗體多肽”或“抗體”或“其抗原結(jié)合片段”是指能夠結(jié)合至表位的多肽。在一些實施方案中，抗體多肽為全長抗體，并且在一些實施方案中，為小于全長但包括至少一個結(jié)合位點(包含具有抗體“可變區(qū)”的結(jié)構的至少一個并且優(yōu)選地至少兩個序列)。在一些實施方案中，術語“抗體多肽”涵蓋具有結(jié)合結(jié)構域的任何蛋白，所述結(jié)合結(jié)構域與免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構域同源或很大程度上同源。在具體實施方案中，“抗體多肽”涵蓋具有顯示出與免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構域至少99％同一性的結(jié)合結(jié)構域的多肽。在一些實施方案中，“抗體多肽”為具有結(jié)合結(jié)構域的任何蛋白，該結(jié)合結(jié)構域顯示出與免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構域(例如參考免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構域)至少70％、80％、85％、90％或95％同一性。所包括的“抗體多肽”可具有與存在于天然來源中的抗體的氨基酸序列相同的氨基酸序列。根據(jù)本發(fā)明的抗體多肽可通過任何可用的手段來制備，這些手段包括例如從天然來源或抗體文庫中分離、在宿主系統(tǒng)中或使用宿主系統(tǒng)重組產(chǎn)生、化學合成等或其組合。抗體多肽可為單克隆或多克隆的?？贵w多肽可為任何免疫球蛋白類別的成員，包括任何人類別：IgG、IgM、IgA、IgD以及IgE。在某些實施方案中，抗體可為IgG免疫球蛋白類別的成員。如本文所用，術語“抗體多肽”或“抗體的特征部分”可互換使用并且是指擁有結(jié)合至感興趣表位的能力的抗體的任何衍生物。在某些實施方案中，“抗體多肽”為保留至少絕大部分的全長抗體的特異性結(jié)合能力的抗體片段?？贵w片段的實例包括，但不限于Fab、Fab’、F(ab’)₂、scFv、Fv、dsFv雙抗體以及Fd片段。替代地或另外地，抗體片段可包含例如由二硫鍵連接在一起的多個鏈。在一些實施方案中，抗體多肽可為人抗體。在一些實施方案中，抗體多肽可為人源化的。人源化的抗體多肽包括含有最少來源于非人免疫球蛋白的序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或抗體多肽(諸如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗體的其他抗原結(jié)合子序列)。通常，人源化的抗體為人免疫球蛋白(接受者抗體)，其中來自接受者的互補決定區(qū)(CDR)的殘基被來自諸如小鼠、大鼠或兔的非人物種(供體抗體)的CDR的具有希望特異性、親和力和能力的殘基置換。在具體實施方案中，根據(jù)本發(fā)明所使用的抗體多肽結(jié)合至免疫檢查點分子上的特定表位。

抗原：“抗原”為抗體結(jié)合至其上的分子或?qū)嶓w。在一些實施方案中，抗原為或包括多肽或其部分。在一些實施方案中，抗原為由抗體識別的感染劑的一部分。在一些實施方案中，抗原為引發(fā)免疫應答的試劑；和/或(ii)由T細胞受體結(jié)合的試劑(例如，當由MHC分子呈遞時)或在暴露于或施用至生物體時被結(jié)合至抗體(例如，由B細胞產(chǎn)生)的試劑。在一些實施方案中，抗原在生物體中引發(fā)體液應答(例如，包括產(chǎn)生抗原特異性抗體)；替代地或另外地，在一些實施方案中，抗原在生物體中引發(fā)細胞應答(例如，包括其受體特異性地與抗原相互作用的T細胞)。本領域技術人員將了解，特定抗原可在目標生物體的一個或若干個成員(例如，小鼠、兔、靈長類動物、人)中，但非目標生物體物種的所有成員中引發(fā)免疫應答。在一些實施方案中，抗原在目標生物體物種的至少約25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的成員中引發(fā)免疫應答。在一些實施方案中，抗原結(jié)合至抗體和/或T細胞受體，并且可以或可以不在生物體中誘導特定的生理反應。在一些實施方案中，例如，抗原可在體外結(jié)合至抗體和/或T細胞受體，無論這種相互作用是否在體內(nèi)發(fā)生。通常，抗原可為或包括任何化學實體，諸如例如小分子、核酸、多肽、碳水化合物、脂質(zhì)、聚合物(在一些實施方案中，除了生物聚合物以外(例如，除了核酸或氨基酸聚合物以外))等。在一些實施方案中，抗原為或包括多肽。在一些實施方案中，抗原為或包括聚糖。本領域技術人員將了解，通常，抗原可以分離或純的形式提供，或替代地可以粗制形式提供(例如，連同其他材料一起，例如在諸如含抗原來源的細胞提取物或其他相對粗制的制品的提取物中)。在一些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明利用的抗原以粗制的形式提供。在一些實施方案中，抗原為或包括重組抗原。

近似：如本文所用，當應用到一種或多種感興趣的值時，術語“近似”或“約”是指類似于規(guī)定的參考值的值。在某些實施方案中，術語“近似”或“約”是指在所規(guī)定的參考值的任一方向上的(大于或小于)25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小范圍內(nèi)的值范圍，除非另外規(guī)定或以另外的方式從上下文顯而易見(除了這樣的數(shù)值將超過可能值的100％)。

組合療法：如本文所用的術語“組合療法”是指其中以重疊方案施用兩種或更多種不同的藥物試劑以使得受試者同時曝露于這兩種試劑的那些情況。當用于組合療法時，兩種或更多種不同的試劑可被同時或分開地施用。這種組合施用可包括以相同劑型同時施用兩種或更多種試劑，以分開的劑型同時施用以及分開施用。即，兩種或更多種試劑可以相同劑型配制在一起并且同時施用。替代地，兩種或更多種試劑可被同時施用，其中試劑存在于分開的制劑中。在另一個替代方案中，可在第一試劑施用之后立即施用一種或多種另外的試劑。在分開施用的方案中，兩種或更多種試劑可相隔幾分鐘或幾小時或幾天施用。

可比：術語“可比”在本文中用于描述彼此足夠類似以允許比較獲得的結(jié)果或觀察到的現(xiàn)象的兩組(或更多組)條件、情況、個體或群體。在一些實施方案中，多組可比條件、情況、個體或群體的特征為多種大致上相同特征和一種或少數(shù)不同特征。本領域普通技術人員將了解，多組情況、個體或群體在特征為以下時是彼此可比的：足夠數(shù)目和類型的大致上相同特征以保證得出以下合理結(jié)論：在不同組情況、個體或群體下或使用不同組情況、個體或群體獲得的結(jié)果或觀察到的現(xiàn)象的差異是由那些不同特征的變化引起或指示那些不同特征的變化。本領域技術人員將了解，本文使用的相對語言(例如，增強、活化、降低、抑制等)將通常是指在可比條件下進行的比較。

共有序列：如本文所用，術語“共有序列”是指引發(fā)或驅(qū)動生理現(xiàn)象(例如，免疫應答)的核心序列。本領域技術人員將理解，與感染劑的抗原共享“共有序列”的癌癥細胞共享影響抗原與MHC分子的結(jié)合親和力(直接地或變構地)和/或促進由T細胞受體進行的識別的氨基酸序列的一部分。在一些實施方案中，共有序列為四肽。在一些實施方案中，共有序列為九肽。在一些實施方案中，共有序列的長度為四個與九個氨基酸之間。在一些實施方案中，共有序列的長度為大于九個氨基酸。

診斷信息：如本文所用，診斷信息或用于診斷的信息為有用于以下的任何信息：確定患者是否患有疾病或病狀和/或?qū)⒓膊』虿罘诸惖奖硇头秶蛉魏尉哂嘘P于疾病或病狀的預后或可能對疾病或病狀的治療(一般治療或任何特定治療)有反應的顯著性的范圍中。類似地，診斷是指提供任何類型的診斷信息，包括但不限于，受試者是否可能患有疾病或病狀(諸如癌癥)、如在受試者中表現(xiàn)出的疾病或病狀的狀態(tài)、階段或特征、關于腫瘤的性質(zhì)或分類的信息、關于預后的信息和/或有用于選擇適當治療的信息。治療的選擇可包括特定治療劑(例如，化療劑)或其他治療形式諸如外科手術、放射等的選擇、關于是否拒絕或遞送療法的選擇、關于給藥方案(例如，特定治療劑或治療劑組合的一種或多種劑量的頻率或水平)的選擇等。

給藥方案：如本文所用的術語“給藥方案”(或“治療方案”)為通常按時間周期分開而單獨向受試者施用的一組單位劑量(通常多于一個)。在一些實施方案中，給定治療劑具有可涉及一個或多個劑量的推薦給藥方案。在一些實施方案中，給藥方案包括多個劑量，其各自彼此相隔時長相同的時期；在一些實施方案中，給藥方案包括多個劑量，并且個別劑量相隔至少兩種不同時期。在一些實施方案中，在整個患者群體中施用時，給藥方案為或與希望的治療結(jié)果相關。

有利反應：如本文所用，術語有利反應是指癥狀減少、全部或部分消退或疾病生理學的其他改進。當特定疾病、病癥或病狀的一種或多種癥狀在幅度(例如，強度、嚴重性等)和/或頻率上減少時，癥狀減少。出于清楚的目的，延遲特定癥狀的發(fā)作被認為是降低所述癥狀的頻率的一種形式。許多具有較小腫瘤的癌癥患者不具有癥狀。并非意在本發(fā)明僅限于其中癥狀消除的情況。本發(fā)明確切地涵蓋使得一種或多種癥狀減少(并且因此受試者的病狀“改進”)，雖然沒有完全消除的治療。在一些實施方案中，當特定治療方案在整個相關群體中施用時顯示出統(tǒng)計學顯著的作用時建立有利反應；可以不需要特定個體中的具體結(jié)果展示。因此，在一些實施方案中，當特定治療方案的施用與相關希望的作用相關時，認為特定治療方案具有有利反應。

同源性：如本文所用，術語“同源性”是指聚合物分子之間例如核酸分子(例如，DNA分子和/或RNA分子)之間和/或多肽分子之間的總體相關性。在一些實施方案中，如果聚合物分子的序列為至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％相同，則認為它們是彼此“同源的”。在一些實施方案中，如果聚合物分子的序列為至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％相似，則認為它們是彼此“同源的”。

同一性：如本文所用，術語“同一性”是指聚合物分子之間例如核酸分子(例如，DNA分子和/或RNA分子)之間和/或多肽分子之間的總體相關性。兩個核酸序列的同一性百分比的計算例如可通過出于最佳比對目的對準兩個序列來進行(例如，為了最佳對準可在第一核酸序列和第二核酸序列中的一個或兩個中引入間隙并且出于比對目的可忽視不相同的序列)。在某些實施方案中，出于比對目的對準的序列的長度為參照序列長度的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或基本上100％。然后比較對應核苷酸位置上的核苷酸。當?shù)谝恍蛄兄械奈恢帽慌c第二序列中的對應位置相同的核苷酸占據(jù)時，則分子在所述位置上相同。兩個序列之間的同一性百分比為將出于兩個序列最佳對準而需要引入的間隙的數(shù)目和每個間隙的長度考慮在內(nèi)，序列共有的相同位置數(shù)的函數(shù)?？墒褂脭?shù)學算法來完成序列比對和兩個序列之間同一性百分比的確定。例如，可以使用并入ALIGN程序(版本2.0)中的Meyers和Miller的算法(CABIOS,1989,4:11-17)，使用PAM120權重殘基表、12的空位長度罰分以及4的空位罰分來確定兩個核苷酸序列之間的同一性百分比?；蛘呖墒褂肎CG軟件包中的GAP程序、使用NWSgapdna.CMP矩陣確定兩個核苷酸序列之間的同一性百分比。

免疫檢查點調(diào)節(jié)劑：如本文所用，術語“免疫檢查點調(diào)節(jié)劑”是指直接或間接地與免疫檢查點相互作用的試劑。在一些實施方案中，免疫檢查點調(diào)節(jié)劑例如通過刺激用于T細胞活化的正信號來增加免疫效應子應答(例如，細胞毒性T細胞應答)。在一些實施方案中，免疫檢查點調(diào)節(jié)劑例如通過抑制用于T細胞活化的負信號(例如去抑制)來增加免疫效應子應答(例如，細胞毒性T細胞應答)。在一些實施方案中，免疫檢查點調(diào)節(jié)劑與用于T細胞無反應性的信號相互作用。在一些實施方案中，免疫檢查點調(diào)節(jié)劑降低、去除或防止對一種或多種抗原的免疫耐受性。

長期益處：通常，術語“長期益處”是指例如在施用感興趣的特定治療或療法之后觀察到的、維持臨床相關的時間周期的希望的臨床結(jié)果。僅為了給出一個實例，在一些實施方案中，癌癥療法的長期益處為或包括(1)沒有疾病跡象(“NED”，例如在放射照相評估后)和/或(2)疾病體積穩(wěn)定或減小。在一些實施方案中，臨床相關的時間周期為至少1個月、至少2個月、至少3個月、至少4個月、至少5個月或更多。在一些實施方案中，臨床相關的時間周期為至少6個月。在一些實施方案中，臨床相關的時間周期為至少1年。

標記物：如本文所用的標記物是指其存在或水平為特定腫瘤或其轉(zhuǎn)移性疾病的特征的試劑。例如，在一些實施方案中，所述術語是指作為特定腫瘤、腫瘤子類、腫瘤階段等的特征的基因表達產(chǎn)物。替代地或另外地，在一些實施方案中，特定標記物的存在或水平與例如可為特定腫瘤類別的特征的特定信號傳導途徑的活性(或活性水平)相關。標記物的存在或不存在的統(tǒng)計學顯著性可取決于特定標記物而變化。在一些實施方案中，標記物的檢測是高度特異性的，因為它反映了具有特定子類的腫瘤的高可能性。此種特異性可以敏感性為代價得到(即，即使腫瘤為預期表達標記物的腫瘤，也可出現(xiàn)陰性結(jié)果)。相反地，具有高度敏感性的標記物與具有較低敏感性的那些標記物相比特異性較差。根據(jù)本發(fā)明，有用的標記物不需要100％準確區(qū)分特定子類的腫瘤。

調(diào)節(jié)劑：術語“調(diào)節(jié)劑”用于指存在于系統(tǒng)中的實體，在所述系統(tǒng)中，與在調(diào)節(jié)劑不存在時的另外可比條件下觀察到的活性的水平和/或性質(zhì)相比，觀察到感興趣的活性與所述活性的水平和/或性質(zhì)的變化相關。在一些實施方案中，調(diào)節(jié)劑為活化劑，其中與在調(diào)節(jié)劑不存在時的另外可比條件下觀察到的活性相比，在調(diào)節(jié)劑存在下活性增加。在一些實施方案中，調(diào)節(jié)劑為抑制劑，其中與在調(diào)節(jié)劑不存在時的另外可比條件相比，在調(diào)節(jié)劑存在下活性降低。在一些實施方案中，調(diào)節(jié)劑直接地與其活性為感興趣的目標實體相互作用。在一些實施方案中，調(diào)節(jié)劑間接地(即，直接使用與目標實體相互作用的中間體試劑)與其活性為感興趣的目標實體相互作用。在一些實施方案中，調(diào)節(jié)劑影響感興趣的目標實體的水平；替代地或另外地，在一些實施方案中，調(diào)節(jié)劑影響感興趣的目標實體的活性而不影響目標實體的水平。在一些實施方案中，調(diào)節(jié)劑影響感興趣的目標實體的水平和活性，以使得觀察到的活性差異不完全由觀察到的水平差異解釋或與觀察到的水平差異一致。

新表位：“新表位”在本領域中被理解成是指在暴露于或發(fā)生特定事件(例如，特定疾病、病癥或病狀的發(fā)展或進展，例如感染、癌癥、癌癥階段等)之后在受試者中出現(xiàn)或形成的表位。如本文所用，新表位為其存在和/或水平與暴露于或發(fā)生事件相關的新表位。在一些實施方案中，新表位為針對表達所述新表位(例如，在相關水平下)的細胞觸發(fā)免疫應答的新表位。在一些實施方案中，新表位為觸發(fā)殺死或以另外的方式破壞表達該新表位(例如，在相關水平下)的細胞的免疫應答的新表位。在一些實施方案中，觸發(fā)新表位的相關事件為或包括細胞中的體細胞突變。在一些實施方案中，新表位并沒有在非癌癥細胞中表達至一定水平和/或以觸發(fā)和/或支持免疫應答(例如，足以靶向表達新表位的癌癥細胞的免疫應答)的方式在非癌癥細胞中表達。

無益處：如本文所用，短語“無益處”用于指不存在可檢測的臨床益處(例如，響應于感興趣的特定療法或治療的施用)。在一些實施方案中，不存在臨床益處是指不存在統(tǒng)計學顯著的特定疾病、病癥或病狀的任何特定癥狀或特征的變化。在一些實施方案中，不存在臨床益處是指持續(xù)僅短時間周期諸如例如小于約6個月、小于約5個月、小于約4個月、小于約3個月、小于約2個月、小于約1個月或更少的疾病、病癥或病狀的一種或多種癥狀或特征的變化。

患者：如本文所用，術語“患者”或“受試者”是指例如出于實驗、診斷、預防、美容和/或治療目的向其施用或可施用提供的組合物的任何生物體。通常的患者包括動物(例如，哺乳動物諸如小鼠、大鼠、兔、非人靈長類動物和/或人)。在一些實施方案中，患者為人。在一些實施方案中，患者遭受或易感一種或多種病癥或病狀。在一些實施方案中，患者表現(xiàn)出病癥或病狀的一種或多種癥狀。在一些實施方案中，患者經(jīng)診斷患有一種或多種病癥或病狀。在一些實施方案中，病癥或病狀為或包括癌癥或存在一種或多種腫瘤。在一些實施方案中，病癥或病狀為轉(zhuǎn)移性癌癥。

多肽：如本文所用，“多肽”，一般來說，為通過肽鍵彼此連接的至少兩個氨基酸的串。在一些實施方案中，多肽可包括至少3-5個氨基酸，所述氨基酸各自經(jīng)由至少一個肽鍵來連接至其他氨基酸。本領域普通技術人員將了解，多肽有時包括“非天然”氨基酸或仍然能夠任選地合并至多肽鏈中的其他實體。

預后和預測信息：如本文所用，術語預后和預測信息可互換使用來指可用于指示不存在或存在治療中的疾病或病狀進程的任何方面的任何信息。此種信息可包括但不限于，患者的平均壽命預期、患者將幸存給定時間量(例如，6個月、1年、5年等)的可能性、患者將治愈疾病的可能性、患者的疾病將響應于特定療法的可能性(其中反應可以任何各種方式進行定義)。預后和預測信息包括在診斷信息的寬范圍之內(nèi)。

蛋白質(zhì)：如本文所用，術語“蛋白質(zhì)”是指多肽(即通過肽鍵彼此連接的至少兩個氨基酸的串)。蛋白質(zhì)可包含除了氨基酸以外的部分(例如，可為糖蛋白、蛋白聚糖等)，和/或可以另外的方式加工或修飾。本領域的普通技術人員將了解，“蛋白質(zhì)”可為由細胞產(chǎn)生的完整多肽鏈(具有或不具有信號序列)，或可為其特征部分。本領域普通技術人員將了解，蛋白質(zhì)有時可包括例如由一個或多個二硫鍵連接或通過其他方式相聯(lián)的大于一個多肽鏈。多肽可含有L-氨基酸、D-氨基酸或兩者并且可含有在本領域中已知的任何各種氨基酸修飾或類似物。有用的修飾包括，例如末端乙?；?、酰胺化、甲基化等。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)可包含天然氨基酸、非天然氨基酸、合成氨基酸以及其組合。術語“肽”通常用于指長度小于約100個氨基酸、小于約50個氨基酸、小于20個氨基酸或小于10個氨基酸的多肽。

參考樣品：如本文所用，參考樣品可包括但不限于以下的任何或所有：一個細胞或多個細胞、組織的一部分、血液、血清、腹水、尿液、唾液以及其他體液、分泌物或排泄物。術語“樣品”還包括通過加工這樣一種樣品衍生的任何材料。衍生的樣品可包括從樣品中提取或通過使樣品受到諸如mRNA的擴增或逆轉(zhuǎn)錄的技術獲得的核苷酸分子或多肽。

反應：如本文所用，對治療的反應可指由于治療或與治療相關而發(fā)生的受試者的病狀的任何有益改變。此種改變可包括穩(wěn)定病狀(例如，預防將在不存在治療的情況下發(fā)生的惡化)、改善病狀的癥狀和/或改進用于治愈病狀的前景等。所述改變可指患者的反應或腫瘤的反應。腫瘤或患者反應可根據(jù)各種各樣的標準(包括臨床標準和客觀標準)來測量。用于評估反應的技術包括但不限于：臨床檢查、正電子發(fā)射斷層攝影術、胸部X-射線CT掃描、MRI、超聲、內(nèi)窺鏡檢查、腹腔鏡檢查、獲自受試者的樣品中腫瘤標記物的存在或水平、細胞學和/或組織學。許多這些技術嘗試確定腫瘤的大小或以另外的方式確定總腫瘤負擔。用于評估對治療的反應的方法和準則討論于Therasse等,“New guidelines to evaluate the response to treatment in solid tumors”,歐洲癌癥研究和治療組織、美國國家癌癥研究所、加拿大國家癌癥研究所，美國國立癌癥研究所雜志(J.Natl.Cancer Inst.),2000,92(3):205-216中?？梢匀魏芜m當方式選擇精確的反應標準，條件是當比較腫瘤和/或患者組時，基于用于確定反應速率的相同或可比標準評估待比較的組。本領域普通技術人員將能夠選擇適當標準。

樣品：如本文所用，獲自受試者的樣品可包括但不限于以下的任何或所有：一個細胞或多個細胞、組織的一部分、血液、血清、腹水、尿液、唾液以及其他體液、分泌物或排泄物。術語“樣品”還包括通過加工這樣一種樣品衍生的任何材料。衍生的樣品可包括從樣品中提取或通過使樣品受到諸如mRNA的擴增或逆轉(zhuǎn)錄的技術獲得的核苷酸分子或多肽。

特異性結(jié)合：如本文所用，術語“特異性結(jié)合”或“對......有特異性”或“特異于”是指目標實體(例如，目標蛋白質(zhì)或多肽)與結(jié)合劑(例如，抗體，諸如提供的抗體)之間的相互作用(通常非共價的)。如普通技術人員將理解，如果在替代相互作用存在下相互作用是有利的，則認為相互作用是“特異性的”。在許多實施方案中，相互作用通常取決于存在目標分子諸如由結(jié)合分子識別的抗原決定簇或表位的特定結(jié)構特征。例如，如果抗體對表位A是特異性的，則在含有游離的標記的A和其上的抗體的反應中，含有表位A的多肽的存在或游離的未標記的A的存在將會降低結(jié)合至抗體的標記的A的量。應理解，特異性不需要是絕對的。例如，本領域眾所周知的是許多抗體與除了目標分子中存在的那些以外的其他表位交叉反應。取決于待使用抗體的應用，此種交叉反應性可以是可接受的。在具體實施方案中，對受體酪氨酸激酶有特異性的抗體具有小于10％的與結(jié)合至蛋白酶抑制劑(例如，ACT)的受體酪氨酸激酶的交叉反應性。本領域普通技術人員將能夠選擇具有足夠程度的特異性的抗體來在任何給定的應用(例如，用于檢測目標分子，用于治療目的等)中適當?shù)貓?zhí)行?？稍诹硗獾囊蛩氐谋尘跋聦μ禺愋赃M行評價，諸如結(jié)合分子對目標分子的親和力與結(jié)合分子對其他目標(例如，競爭者)的親和力。如果結(jié)合分子對目標分子表現(xiàn)出高親和力，

癌癥的階段:如本文所用，術語“癌癥的階段”是指癌癥推進的水平的定性或定量評估。用于確定癌癥的階段的標準包括但不限于腫瘤的大小和轉(zhuǎn)移(例如，局部或遠處)的程度。

受試者：如本文所用，術語“受試者”或“患者”是指例如出于實驗、診斷、預防和/或治療目的基于其可使用或施用本發(fā)明的實施方案的任何生物體。通常的受試者包括動物(例如哺乳動物，諸如小鼠、大鼠、兔、非人靈長類動物和人；昆蟲；蠕蟲等)。

基本上：如本文所用，術語“基本上”是指展現(xiàn)總體或接近總體范圍或程度的感興趣特征或性質(zhì)的定性情況。生物領域普通技術人員將理解，生物和化學現(xiàn)象很少(如果曾發(fā)生)達到完全和/或進行至完全或達成或避免絕對結(jié)果。因此，本文使用術語“基本上”來獲得在許多生物現(xiàn)象和化學現(xiàn)象中固有的潛在完全性缺乏。

遭受：“遭受”疾病、病癥或病狀(例如，癌癥)的個體已診斷具有和/或表現(xiàn)出疾病、病癥或病狀的一種或多種癥狀。在一些實施方案中，遭受癌癥的個體患有癌癥，但沒有展現(xiàn)出癌癥的任何癥狀和/或尚未被診斷具有癌癥。

易感：“易感”疾病、病癥或病狀(例如，癌癥)的個體處于發(fā)展疾病、病癥或病狀的危險。在一些實施方案中，易感疾病、病癥或病狀的個體沒有展現(xiàn)出疾病、病癥或病狀的任何癥狀。在一些實施方案中，易感疾病、病癥或病狀的個體尚未被診斷具有疾病、病癥和/或病狀。在一些實施方案中，易感疾病、病癥或病狀的個體為展現(xiàn)出與疾病、病癥或病狀的發(fā)展相關的病狀的個體。在一些實施方案中，發(fā)展疾病、病癥和/或病狀的危險為基于群體的危險。

目標細胞或目標組織：如本文所用，術語“目標細胞”或“目標組織”是指受本文描述的并且待治療的病狀影響的任何細胞、組織或生物體，或其中表達包括在本文描述的病狀中的蛋白質(zhì)的任何細胞、組織或生物體。在一些實施方案中，目標細胞、目標組織或目標生物體包括其中存在可檢測量的免疫檢查點信號傳導和/或活性的那些細胞、組織或生物體。在一些實施方案中，目標細胞、目標組織或目標生物體包括其中展現(xiàn)出疾病相關的病理學、癥狀或特征的那些細胞、組織或生物體。

治療方案：如本文所用，術語“治療方案”是指用于部分或完全減輕、改善、緩和、抑制、預防特定疾病、病癥和/或病狀、延遲其發(fā)作、減少其嚴重性和/或降低其一種或多種癥狀或特征的發(fā)生率的任何方法。所述治療方案包括被設計成達到特定作用，例如減少或消除有害病狀或疾病諸如癌癥的一種治療或一系列治療。治療可包括同時、依次或在不同時間下，例如相同或不同時間量下施用一種或多種組合物。替代地或另外地，治療可包括暴露于放射、化療劑、激素療法或外科手術。另外，“治療方案”可包括遺傳方法，諸如基因療法、基因消融或其他已知減少特定基因的表達或基因衍生的mRNA的翻譯的方法。

治療劑：如本文所用，短語“治療劑”是指當向受試者施用時具有治療作用和/或引發(fā)希望的生物和/或藥理學作用的任何試劑。

治療有效量：如本文所使用，術語“治療有效量”是指在適用于任何醫(yī)學治療的合理益處/風險比下，對經(jīng)過治療的受試者給予治療作用的試劑(例如，免疫檢查點調(diào)節(jié)劑)的量。治療作用可以是客觀的(即，通過一些測試或標記物可測量的)或主觀的(即，受試者給出作用的指示或感覺作用)。具體地來說，“治療有效量”是指有效于治療、改善或預防希望的疾病或病狀，或諸如通過改善與疾病相關的癥狀、預防或延遲疾病的發(fā)作和/或還減輕疾病的癥狀的嚴重性或頻率來展現(xiàn)出可檢測的治療作用或預防作用的治療劑或組合物的量。治療有效量通常是以可包括多個單位劑量的給藥方案來施用。對于任何特定治療劑，治療有效量(和/或有效給藥方案內(nèi)的適當單位劑量)可例如取決于施用途徑、與其他藥劑的組合而變化。另外，用于任何特定患者的具體治療有效量(和/或單位劑量)可取決于各種因素，所述因素包括所治療的病癥和病癥的嚴重性；所用具體藥劑的活性；所用具體組合物；受試者的年齡、體重、一般健康狀況、性別和飲食；施用時間、施用途徑和/或所用具體融合蛋白質(zhì)的排泄或代謝速率；治療持續(xù)時間以及如醫(yī)學領域中所眾所周知的類似因素。

治療：如本文所用，術語“治療(treatment)”(還有“治療(treat)”或“治療(treating)”)是指對部分或完全減輕、改善、緩解、抑制特定疾病、病癥和/或疾狀(例如，癌癥)、延遲其發(fā)作、減少其嚴重性和/或降低其一種或多種癥狀、特征和/或病因的發(fā)生率的物質(zhì)(例如，提供的組合物)的任何施用。這種治療可以用于未顯示相關疾病、病癥和/或病癥的體征的受試者，和/或僅表現(xiàn)出疾病、病癥和/或病癥的早期體征的受試者。替代地或另外地，這種治療可以用于顯示相關疾病、病癥和/或病癥的一種或多種已確立體征的受試者。在一些實施方案中，治療可針對已經(jīng)診斷為患有相關疾病、病癥和/或疾患的受試者。在一些實施方案中，治療可針對受試者已知具有與患上相關疾病、病癥和/或疾患的風險增加統(tǒng)計相關的一個或多個易感性因素。

野生型：如本文所用，術語“野生型”具有它的在本領域中理解的含義，是指具有如在自然界中見于“正?！?與突變、患病、改變等相反)狀態(tài)或背景下的結(jié)構和/或活性的實體。本領域普通技術人員將了解，野生型基因和多肽常以多種不同形式(例如等位基因)存在。

某些實施方案的詳述

本發(fā)明涵蓋以下發(fā)現(xiàn)：由腫瘤突變形成的高突變負荷和體細胞新表位有助于免疫檢查點調(diào)節(jié)劑的抗腫瘤免疫應答。

此外，本公開確切地證實了癌癥細胞中的新表位與對MHC I類分子的結(jié)合親和力增加和/或由細胞毒性T細胞進行的識別改進相關聯(lián)。

此外，本發(fā)明提供了用于檢測存在于癌癥細胞中的體細胞新表位和/或建立此類新表位與對免疫療法的反應性之間或之中的關聯(lián)的方法。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了用于鑒定可能有利地響應于使用免疫療法(例如，使用免疫檢查點治療劑)的治療的癌癥患者和/或用于選擇患者接受此種免疫療法的方法和/或試劑。替代地或另外地，本發(fā)明提供了用于使用免疫檢查點調(diào)節(jié)劑治療患者的方法和/或試劑，所述患者已被鑒定為患有具有體細胞新表位的癌癥。

體細胞突變

體細胞突變包括非種系細胞中的DNA改變并且通常發(fā)生在癌癥細胞中。本文已發(fā)現(xiàn)，癌癥細胞中的某些體細胞突變引起新表位的表達，在一些實施方案中，氨基酸鏈從識別為“自身”轉(zhuǎn)換至“非自身”。根據(jù)本發(fā)明，具有“非自身”抗原的癌癥細胞可能引發(fā)針對癌癥細胞的免疫應答。針對癌癥細胞的免疫應答可通過免疫檢查點調(diào)節(jié)劑來增強。本發(fā)明教導了表達新表位的癌癥可以對使用免疫檢查點調(diào)節(jié)劑的療法更有反應。此外，本發(fā)明提供了用于通過容許鑒定和/或選擇特定患者接受(或避免)療法來改進癌癥療法的策略。本發(fā)明還提供了用于定義其存在指示特定的感興趣臨床結(jié)果(例如，對例如使用特定免疫檢查點調(diào)節(jié)劑的療法的反應性和/或發(fā)展療法的特定不希望的副作用的危險)的新表位或其組的技術。本發(fā)明定義和/或容許定義與對免疫檢查點調(diào)節(jié)劑療法具有有益(或不希望)的反應相關聯(lián)的一個或多個新表位“標記”。

在一些實施方案中，體細胞突變引起新抗原或新表位。此外，本公開證實了由體細胞突變引起的新表位的存在，其存在與對免疫檢查點調(diào)節(jié)劑療法有特定反應相關聯(lián)。在一些實施方案中，新表位為或包括四肽，該四肽有助于增加的對MHC I類分子的結(jié)合親和力和/或由免疫系統(tǒng)的細胞(即T細胞)識別為“非自身”。在一些實施方案中，體細胞突變引起包含表1中列出的四肽的新表位。在一些實施方案中，新表位與來自感染劑的抗原共享共有序列。

在一些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明感興趣的新表位標記為或包括其在腫瘤樣品中的存在與特定臨床結(jié)果相關的新表位或其組。本公開證實了這樣一種新表位標記的有效定義。在一些實施方案中，有用標記為或包括在表1中找到的共有四肽體細胞新表位的一個或多個；在一些實施方案中，有用標記為或包括在表2中加下劃線的四肽體細胞新表位的一個或多個；在一些實施方案中，有用標記為或包括在表2中找到的九聚體肽的一個或多個。在一些實施方案中，有用標記為或包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、7-、71、72、73、74、75或更多個新表位。在一些實施方案中，本公開提供了用于定義和/或檢測新表位標記的技術，并且具體地與免疫檢查點調(diào)節(jié)劑療法相關的那些技術。

此外，本公開證實了與免疫檢查點調(diào)節(jié)劑療法的特定反應或反應特征(例如，對療法的反應性或副作用的危險)相關聯(lián)的新表位和新表位標記的定義。在本文提出的具體實施例中，此種定義通過將來自第一多個腫瘤樣品的遺傳序列信息與獲自第二多個腫瘤樣品的遺傳序列信息進行比較來實現(xiàn)，所述第一多個含有共享對免疫檢查點調(diào)節(jié)劑療法的共同反應特征的樣品，所述第二多個含有不共享共同反應特征但以另外的方式與第一組的那些可比較的樣品，這樣使得比較定義了其存在與共同反應特征相關聯(lián)或相關的遺傳序列元件。本公開確切地證實了增加的突變負擔可與反應特征相關(例如，與對療法的反應性相關)，但也證實了這種單獨的突變負擔增加可能不足以預測反應特征。本公開證實了，當此類體細胞突變產(chǎn)生新表位時，可定義與反應特征相關聯(lián)的有用新表位標記。本公開提供了用于定義和利用此類標記的具體技術。

在一些實施方案中，包含新表位的癌癥細胞選自癌瘤、肉瘤、黑色素瘤、骨髓瘤、白血病或淋巴瘤。在一些實施方案中，包含新表位的癌癥細胞為黑色素瘤。在一些實施方案中，包含新表位的癌癥細胞為非小細胞肺癌。

表1.黑色素瘤中的示例性共有四肽體細胞新表位

表2.與對CTLA-4阻斷(例如，通過伊匹單抗治療)的反應相關聯(lián)的新表位組。

每個九聚體中的四肽新表位加下劃線表示。

免疫檢查點調(diào)節(jié)

免疫檢查點是指負責維持自身耐受性并且調(diào)節(jié)生理免疫應答的持續(xù)時間和幅度的免疫系統(tǒng)抑制性途徑。

某些癌癥細胞通過利用免疫檢查點途徑作為免疫抗性(具體地關于對腫瘤抗原有特異性的T細胞)的主要機制來旺盛生長。例如，某些癌癥細胞可過表達負責抑制細胞毒性T細胞應答的一種或多種免疫檢查點蛋白質(zhì)。因此，可施用免疫檢查點調(diào)節(jié)劑以克服抑制性信號并且容許和/或加強針對癌癥細胞的免疫攻擊。免疫檢查點調(diào)節(jié)劑可通過減少、抑制或消除由陰性免疫應答調(diào)節(jié)劑(例如CTLA4)劑進行的信號傳導來促進針對癌癥細胞的免疫細胞應答，或可刺激或增強免疫應答的陽性調(diào)節(jié)劑(例如CD28)的信號傳導。

可施用靶向免疫檢查點調(diào)節(jié)劑的免疫療法試劑以便促進靶向癌癥細胞的免疫攻擊。免疫療法試劑可以是或包括靶向免疫檢查點調(diào)節(jié)劑(例如，對免疫檢查點調(diào)節(jié)劑有特異性)的抗體試劑。免疫療法試劑的實例包括靶向以下的一個或多個的抗體試劑：CTLA-4、PD-1、PD-L1、GITR、OX40、LAG-3、KIR、TIM-3、CD28、CD40以及CD137。

抗體試劑的具體實例可包括單克隆抗體。靶向免疫檢查點調(diào)節(jié)劑的某些單克隆抗體是可用的。例如，伊匹單抗靶向CTLA-4；替西木單抗靶向CTLA-4；派姆單抗靶向PD-1等。

新表位的檢測

可使用任何各種已知的技術對癌癥進行篩選以檢測新表位。在一些實施方案中，在核酸水平上(例如，在DNA或RNA中)檢測新表位或其表達。在一些實施方案中，在蛋白質(zhì)水平上(例如，在包含來自癌癥細胞的多肽的樣品中，所述樣品可以是或包含多肽復合體或其他更高級的結(jié)構，此結(jié)構包括但不限于細胞、組織或器官)檢測新表位或其表達。

在一些具體實施方案中，通過全外顯子組測序來檢測一個或多個新表位。在一些實施方案中，通過免疫測定來檢測一個或多個新表位。在一些實施方案中，通過微陣列來檢測一個或多個新表位。在一些實施方案中，可使用大規(guī)模并行的外顯子組測序測序來檢測一個或多個新表位。在一些實施方案中，可通過基因組測序來檢測一個或多個新表位。在一些實施方案中，可通過RNA測序來檢測一個或多個新表位。在一些實施方案中，可通過標準DNA或RNA測序來檢測一個或多個新表位。在一些實施方案中，可通過質(zhì)譜法來檢測一個或多個新表位。

在一些實施方案中，可使用下一代測序在核酸水平上(DNA和/或RNA)檢測一個或多個新表位。在一些實施方案中，可使用基因組測序、基因組重新測序、靶向測序板、轉(zhuǎn)錄組記錄(RNA-Seq)、DNA-蛋白質(zhì)相互作用(ChIP-測序)和/或表觀基因組表征來檢測下一新表位或其表達。在一些實施方案中，可例如利用對患者的基因組的重新測序來檢測基因組變化。

在一些實施方案中，可使用諸如ELISA、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移(Western Tranfer)、免疫測定、質(zhì)譜法、微陣列分析等的技術來檢測一個或多個新表位。

除非另外定義，否則本文中所用的所有技術和科學術語均具有與本發(fā)明所屬領域普通技術人員通常所理解含義相同的含義。盡管在實踐或測試本發(fā)明時可以使用與本文所述的那些方法和材料類似或等效的方法和材料，但本文描述了合適的方法和材料。

治療方法

在一些實施方案中，本發(fā)明提供了用于鑒定可能有利地響應于使用免疫檢查點調(diào)節(jié)劑的治療的癌癥患者的方法。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了用于鑒定可能有利地響應于使用免疫檢查點調(diào)節(jié)劑的治療的癌癥患者并且使用免疫檢查點調(diào)節(jié)劑治療患者的方法。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了使用免疫檢查點調(diào)節(jié)劑治療先前已被鑒定為可能有利地響應于使用免疫檢查點調(diào)節(jié)劑的治療的癌癥患者的方法。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了用于鑒定不可能有利地響應于使用免疫檢查點調(diào)節(jié)劑的治療的癌癥患者并且不使用免疫檢查點調(diào)節(jié)劑治療患者的方法。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了用于鑒定如果施用免疫檢查點調(diào)節(jié)劑，則可能遭受一種或多種自身免疫并發(fā)癥的癌癥患者的方法。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了用于使用免疫抑制劑治療先前已被鑒定為如果使用免疫檢查點調(diào)節(jié)劑來治療，則可能遭受一種或多種自身免疫并發(fā)癥的癌癥患者的方法。在一些實施方案中，在免疫檢查點調(diào)節(jié)劑之前或同時向患者施用免疫抑制劑。

免疫檢查點調(diào)節(jié)劑的施用

根據(jù)本發(fā)明的某些方法，免疫檢查點調(diào)節(jié)劑被或已被施用至個體。在一些實施方案中，使用免疫檢查點調(diào)節(jié)劑的治療被用作單一治療。在一些實施方案中，使用免疫檢查點調(diào)節(jié)劑的治療與一種或多種其他療法組合使用。

本領域普通技術人員將了解，通常由政府管理機構諸如美國食品及藥物管理局來分析和批準適當?shù)闹苿?、適應癥以及給藥方案。例如，實施例5提出了伊匹單抗、抗CTL-4抗體的某些批準的給藥信息。在許多實施方案中，根據(jù)本發(fā)明根據(jù)這樣一種批準的方案來施用免疫檢查點調(diào)節(jié)劑。然而，本公開提供了用于鑒定、表征和/或選擇可希望被施用免疫檢查點調(diào)節(jié)劑的特定患者的某些技術。在一些實施方案中，相對于基于群體研究所推薦或批準的頻率和/或個體劑量，由本公開提供的觀點容許更高頻率和/或更大個體劑量給藥給定免疫檢查點調(diào)節(jié)劑(例如，由于對不希望作用的易感性降低和/或不希望作用的發(fā)生率或強度降低)，該群體研究包括如本文所述鑒定(例如，表達新表位)的個體和其他個體。在一些實施方案中，相對于基于群體研究所推薦或批準的頻率和/或個體劑量，由本公開提供的觀點容許降低的頻率和/或降低的個體劑量給藥給定免疫檢查點調(diào)節(jié)劑(例如，由于反應性增加)，該群體研究包括如本文所述鑒定(例如，表達新表位)的個體和其他個體。

在一些實施方案中，以藥物組合物施用免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)劑，該藥物組合物還包含生理學上可接受的載體或賦形劑。在一些實施方案中，藥物組合物為無菌的。在許多實施方案中，配制藥物組合物用于特定模式的施用。

合適的藥學上可接受的載劑包括但不限于水、鹽溶液(例如，NaCl)、鹽水、緩沖鹽水、醇、甘油、乙醇、阿拉伯膠、植物油、芐醇、聚乙二醇、明膠、碳水化合物(諸如乳糖、直鏈淀粉或淀粉)、糖(諸如甘露醇、蔗糖或其他)、右旋糖、硬脂酸鎂、滑石、硅酸、粘性石蠟、芳香油、脂肪酸酯、羥甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮等，以及其組合。必要時，藥物制劑可包含一種或多種輔助劑(例如，潤滑劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、潤濕劑、乳化劑、影響滲透壓的鹽、緩沖劑、著色劑、調(diào)味劑和/或芳香物質(zhì)等)，該助劑不會與活性化合物產(chǎn)生有害反應或干擾其活性。在一些實施方案中，使用適于靜脈內(nèi)施用的水溶性載劑。

在一些實施方案中，必要時，藥物組合物或藥劑可含有一定量(通常少量)的潤濕劑或乳化劑和/或pH緩沖劑。在一些實施方案中，藥物組合物可以是液體溶液、懸浮液、乳液、片劑、藥丸、膠囊、持續(xù)釋放制劑或散劑。在一些實施方案中，藥物組合物可用傳統(tǒng)粘合劑和載劑(諸如甘油三酯)配制為栓劑。經(jīng)口制劑可包括標準載劑諸如醫(yī)藥級甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、聚乙烯吡咯烷酮、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。

在一些實施方案中，藥物組合物可根據(jù)常規(guī)程序配制為適用于施用至人類的藥物組合物。例如，在一些實施方案中，用于靜脈內(nèi)施用的組合物通常為無菌等滲水性緩沖液中的溶液。必要時，組合物還可包含增溶劑和局部麻醉劑以減輕注射部位的疼痛。通常，成分被分開供應或以單位劑型混合在一起，例如呈在氣密性密封容器諸如指示活性劑的量的安瓿或藥囊中的干燥凍干粉末或無水濃縮物的形式。當組合物待通過輸注施用時，它可以用含有無菌藥用級水、鹽水或右旋糖/水的輸注瓶來分配。在組合物通過注射施用時，可以提供注射用無菌水或鹽水的安瓿以使得成分可以在施用之前混合。

在一些實施方案中，可以中性形式配制免疫檢查點調(diào)節(jié)劑；在一些實施方案中，可以鹽形式配制免疫檢查點調(diào)節(jié)劑。藥學上可接受的鹽包括由游離氨基形成的那些，諸如源自鹽酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的那些，以及由游離羧基形成的那些，諸如源自氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣、氫氧化鐵、異丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等的那些。

根據(jù)本發(fā)明使用的藥物組合物可通過任何適當途徑來施用。在一些實施方案中，靜脈內(nèi)施用藥物組合物。在一些實施方案中，皮下施用藥物組合物。在一些實施方案中，通過直接施用至目標組織諸如心臟或肌肉(例如，肌肉內(nèi))或神經(jīng)系統(tǒng)(例如，直接注入腦中；心室內(nèi)；鞘內(nèi))來施用藥物組合物。替代地或另外地，在一些實施方案中，胃腸外、經(jīng)皮或經(jīng)粘膜(例如，經(jīng)口或經(jīng)鼻)施用藥物組合物。必要時，可同時使用多于一種途徑。

免疫檢查點調(diào)節(jié)劑(或含有免疫檢查點調(diào)節(jié)劑的組合物或藥劑可單獨施用或與其他免疫檢查點調(diào)節(jié)劑結(jié)合施用。術語“與......結(jié)合”指示在另一種免疫檢查點調(diào)節(jié)劑之前、大約同時或之后施用第一免疫檢查點調(diào)節(jié)劑。例如，可將第一免疫檢查點調(diào)節(jié)劑混合到含有一種或多種不同免疫檢查點調(diào)節(jié)劑的組合物中，并且因此同時施用；替代地，可在沒有混合的情況下同時施用試劑(例如，通過在靜脈管線上“搭載”遞送試劑，通過所述遞送還施用免疫檢查點調(diào)節(jié)劑或反之亦然)。在另一個實例中，可分開(例如，不混合)施用免疫檢查點調(diào)節(jié)劑，但在施用免疫檢查點調(diào)節(jié)劑的短時間范圍內(nèi)(例如，24小時內(nèi))。

在一些實施方案中，向使用免疫檢查點調(diào)節(jié)劑治療的受試者施用一種或多種免疫抑制劑。在一些實施方案中，施用一種或多種免疫抑制劑來減少、抑制或防止不希望的自身免疫應答(例如，小腸結(jié)膜炎、肝炎、皮炎(包括毒性表皮壞死溶解)、神經(jīng)病和/或內(nèi)分泌病)，例如，甲狀腺功能減退癥。示例性免疫抑制劑包括類固醇、抗體、免疫球蛋白融合蛋白等。在一些實施方案中，免疫抑制劑抑制B細胞活性(例如利妥昔單抗)。在一些實施方案中，免疫抑制劑為誘餌多肽抗原。

在一些實施方案中，以治療有效量(例如，給藥量和/或根據(jù)在向相關群體施用時示出足以治療癌癥的給藥方案，所述治療諸如通過改善與癌癥相關的癥狀、預防或延遲癌癥的發(fā)作和/或還減輕癌癥癥狀的嚴重性或頻率來實現(xiàn))施用免疫檢查點調(diào)節(jié)劑(或含有免疫檢查點調(diào)節(jié)劑的組合物或藥劑)。在一些實施方案中，在使用免疫檢查點調(diào)節(jié)劑(包括例如，CTLA-4阻斷劑諸如伊匹單抗或替西木單抗和/或其他試劑)治療之后觀察到長期臨床益處。本領域普通技術人員將了解，將在治療上有效于給定患者中的癌癥治療的劑量可至少一定程度取決于癌癥的性質(zhì)和程度，并且可通過標準臨床技術來確定。在一些實施方案中，可任選采用一種或多種體外或體內(nèi)測定來幫助鑒定最佳劑量范圍。在一些實施方案中，在治療給定個體中待采用的特定劑量可取決于施用途徑、癌癥程度和/或鑒于患者的情況在醫(yī)師的判斷中認為相關的一種或多種其他因素。在一些實施方案中，可從來源于體外或動物模型測試系統(tǒng)的劑量-反應曲線中推出有效劑量(例如，由美國衛(wèi)生和人類服務部、食品及藥物管理局以及藥品評價與研究中心在“Guidance for Industry:Estimating Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers”,Pharmacology and Toxicology,July 2005中所述。

在一些實施方案中，免疫檢查點調(diào)節(jié)劑的治療有效量可為例如大于約0.01mg/kg、大于約0.05mg/kg、大于約0.1mg/kg、大于約0.5mg/kg、大于約1.0mg/kg、大于約1.5mg/kg、大于約2.0mg/kg、大于約2.5mg/kg、大于約5.0mg/kg、大于約7.5mg/kg、大于約10mg/kg、大于約12.5mg/kg、大于約15mg/kg、大于約17.5mg/kg、大于約20mg/kg、大于約22.5mg/kg或大于約25mg/kg體重。在一些實施方案中，治療有效量可為約0.01-25mg/kg、約0.01-20mg/kg、約0.01-15mg/kg、約0.01-10mg/kg、約0.01-7.5mg/kg、約0.01-5mg/kg、約0.01-4mg/kg、約0.01-3mg/kg、約0.01-2mg/kg、約0.01-1.5mg/kg、約0.01-1.0mg/kg、約0.01-0.5mg/kg、約0.01-0.1mg/kg、約1-20mg/kg、約4-20mg/kg、約5-15mg/kg、約5-10mg/kg體重。在一些實施方案中，治療有效量為約0.01mg/kg、約0.05mg/kg、約0.1mg/kg、約0.2mg/kg、約0.3mg/kg、約0.4mg/kg、約0.5mg/kg、約0.6mg/kg、約0.7mg/kg、約0.8mg/kg、約0.9mg/kg、約1.0mg/kg、約1.1mg/kg、約1.2mg/kg、約1.3mg/kg、約1.4mg/kg、約1.5mg/kg、約1.6mg/kg、約1.7mg/kg、約1.8mg/kg、約1.9mg/kg、約2.0mg/kg、約2.5mg/kg、約3.0mg/kg、約4.0mg/kg、約5.0mg/kg、約6.0mg/kg、約7.0mg/kg、約8.0mg/kg、約9.0mg/kg、約10.0mg/kg、約11.0mg/kg、約12.0mg/kg、約13.0mg/kg、約14.0mg/kg、約15.0mg/kg、約16.0mg/kg、約17.0mg/kg、約18.0mg/kg、約19.0mg/kg、約20.0mg/kg體重或更多。在一些實施方案中，治療有效量不大于約30mg/kg、不大于約20mg/kg、不大于約15mg/kg、不大于約10mg/kg、不大于約7.5mg/kg、不大于約5mg/kg、不大于約4mg/kg、不大于約3mg/kg、不大于約2mg/kg或不大于約1mg/kg體重或更少。

在一些實施方案中，對于特定個體施用的劑量取決于個體的需要隨時間推移而變化(例如，增加或減少)。

在又另一個實施方案中，可在療程開始時給予治療組合物的負荷劑量(例如，初始較高的劑量)，接著施用減少的維持劑量(例如，后續(xù)較低劑量)的治療組合物。

不希望受任何理論約束，考慮到負荷劑量可清除掉組織中(例如，肝臟中)不希望的材料(例如，脂肪材料和/或腫瘤細胞等)的初始(和在一些情況下大塊的)積累，并且維持給藥可延遲、減少或防止初始清除之后脂肪材料的聚積。

將了解，可通過任何可用的方法諸如本文所舉例說明的那些和本領域已知的那些來確定負荷劑量和維持劑量的量、間隔和治療持續(xù)時間。在一些實施方案中，負荷劑量的量為約0.01-1mg/kg、約0.01-5mg/kg、約0.01-10mg/kg、約0.1-10mg/kg、約0.1-20mg/kg、約0.1-25mg/kg、約0.1-30mg/kg、約0.1-5mg/kg、約0.1-2mg/kg、約0.1-1mg/kg或約0.1-0.5mg/kg體重。在一些實施方案中，維持劑量的量為約0-10mg/kg、約0-5mg/kg、約0-2mg/kg、約0-1mg/kg、約0-0.5mg/kg、約0-0.4mg/kg、約0-0.3mg/kg、約0-0.2mg/kg、約0-0.1mg/kg體重。在一些實施方案中，以常規(guī)間隔向個體施用負荷劑量，持續(xù)給定時間周期(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多個月)和/或給定劑量數(shù)(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30或更多次劑量)，接著是維持給藥。在一些實施方案中，維持劑量在0-2mg/kg、約0-1.5mg/kg、約0-1.0mg/kg、約0-0.75mg/kg、約0-0.5mg/kg、約0-0.4mg/kg、約0-0.3mg/kg、約0-0.2mg/kg或約0-0.1mg/kg體重的范圍內(nèi)。在一些實施方案中，維持劑量為約0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8或2.0mg/kg體重。在一些實施方案中，施用維持給藥持續(xù)1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多個月。在一些實施方案中，施用維持給藥持續(xù)1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多年。在一些實施方案中，無限地施用維持給藥(例如，持續(xù)生命期)。

取決于癌癥的性質(zhì)和程度并且取決于正在進行的工作，可作為一次劑量施用或以每隔一段時間施用治療有效量的免疫檢查點調(diào)節(jié)劑。如本文所用，在“間隔”下施用指示周期性地(如與一次劑量區(qū)別)施用治療有效量。可通過標準臨床技術來確定間隔。在一些實施方案中，兩月一次、每月一次、每月兩次、三周一次、兩周一次、每周一次、每周兩次、每周三次或每日一次施用免疫檢查點調(diào)節(jié)劑。對于單個個體的施用間隔不必是固定的間隔，但可取決于個體的需要和恢復速率隨時間推移而變化。

如本文所用，術語“兩月一次”意指每兩個月施用一次(即，每兩個月一次)；術語“每月一次”意指每個月施用一次；術語“三周一次”意指每三周施用一次(即，每三周一次)；術語“兩周一次”意指每兩周施用一次(即，每兩周一次)；術語“每周一次”意指每周施用一次；并且術語“每日一次”意指每天施用一次。

本發(fā)明另外地涉及藥物組合物，該藥物組合物包含處于具有標簽的容器(例如，用于靜脈內(nèi)施用的小瓶、瓶、袋、注射器等)中的如本文所述的免疫檢查點調(diào)節(jié)劑，該標簽含有用于施用組合物以用于治療癌癥的說明書。

實施例

提供以下實施例以便對本領域普通技術人員描述如何做出和使用本發(fā)明的方法與組合物，并且不意圖限制發(fā)明人就其發(fā)明所認為的范圍。

綜述

免疫檢查點阻斷為新的治療范例，其在患有轉(zhuǎn)移性黑色素瘤、非小細胞肺癌以及其他腫瘤類型的患者中引起雙重抗腫瘤作用，但是什么決定患者將是否響應仍不清楚。^1-5這是癌癥免疫療法領域中最關鍵的未解答的問題之一。完全人單克隆抗體伊匹單抗和替西木單抗阻斷細胞毒性T-淋巴細胞抗原4(CTLA-4)，從而引起T細胞活化。^4,6派姆單抗為靶向編程性細胞死亡1(PD-1)受體作為轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的治療的藥物。許多研究已確立了伊匹單抗結(jié)果與外周血液淋巴細胞計數(shù)、抗原特異性免疫、T細胞活化的標記物、^7,8“炎性”微環(huán)境^9-12以及高頻率TCR克隆型維持之間的相關性。⁶⁹

然而，未知的是，腫瘤的遺傳圖譜是否指出對CTLA-4阻斷(例如，通過伊匹單抗)的反應。腫瘤遺傳景觀、突變負荷以及來自治療的益處之間和之中的關系是研究的主題。由非同義黑色素瘤突變引起的免疫原性在小鼠模型中示出，¹³并且對人黑色素瘤腫瘤的抗原多樣性進行計算機建模。¹⁴效應子和輔助T細胞功能以及調(diào)節(jié)性T細胞缺失是抗CTLA-4功效所必要的，^15-17如已觀察到調(diào)節(jié)性T細胞缺失¹⁸但在特異性HLA類型與臨床益處之間未觀察到關聯(lián)那樣。²⁶黑色素瘤與任何實體瘤相比具有最大的突變負擔(每兆堿基0.5至大于100個突變)。^19-20研究表明體細胞突變可引起新表位^21,22，并且這些可充當臨床前模型中和患者中的新抗原。^23-25伊匹單抗反應通過腫瘤細胞基因組來指出的假設是相關的。先前研究證實了特異性HLA類型與伊匹單抗反應之間缺少關聯(lián)。²⁶這個研究調(diào)查研究了腫瘤的遺傳景觀是否決定對CTLA-4阻斷(例如，通過使用諸如伊匹單抗或替西木單抗的試劑的治療)的臨床反應。¹⁸

為了探究這個假設，對于發(fā)現(xiàn)組，我們對來自25個伊匹單抗治療的患者的腫瘤和匹配正常血液的DNA進行全外顯子組測序(表3)，接著另外的39種腫瘤作為驗證，該患者中的五個用替西木單抗治療。我們發(fā)現(xiàn)較高的突變負擔與來自CTLA-4阻斷(例如，通過伊匹單抗或替西木單抗)的強臨床益處相關，但單獨地不足以預測強臨床益處。相反，具有來自CTLA-4阻斷的臨床益處的患者的腫瘤中的突變含有共享的體細胞新表位。這里，我們證實了對免疫檢查點抑制的臨床反應的遺傳基礎并且定義了基于對療法反應的新表位景觀。

閱讀本公開，本領域技術人員將了解，本文包括的特定實例是代表性的并非限制性的。例如，查看如下詳細提供的黑色素瘤中的伊匹單抗反應的數(shù)據(jù)，本領域技術人員表示出概念證據(jù)并且確立了新表位突變標記可預測對免疫檢查點調(diào)節(jié)劑的反應。閱讀本公開，本領域普通技術人員將了解并且理解，方法在整個癌癥和免疫檢查點調(diào)節(jié)劑療法中是廣泛適用的。

實施例1.具有對伊匹單抗的多樣臨床結(jié)果的來自患者的黑色素瘤的突變景觀

本實施例說明了癌癥遺傳景觀的分析，并且證實了其在定義有利地或較差地響應于免疫檢查點調(diào)節(jié)劑的患者的有用標志中的有效性。實施例特別舉例說明了使用CTLA-4阻斷(例如伊匹單抗)治療的黑色素瘤患者的分析，并且定義了此類患者中的示例性遺傳特征。

使用CTLA-4阻斷劑治療的黑色素瘤患者展示了總存活率優(yōu)勢和多樣的反應。^1,27-29基線患者特征描述于表3中。

表3.發(fā)現(xiàn)組和驗證組中的患者的臨床特征

在這個研究中包括具有或不具有長期臨床益處的患者。這里，我們將長期臨床益處定義為(1)患者無放射照相疾病(NED)(來自單獨的CTLA-4阻斷劑或使用切除分離的穩(wěn)定或未響應病灶)；或(2)患者具有持續(xù)>6個月的穩(wěn)定或減小的疾病體積的跡象。我們將不存在臨床益處定義為在開始治療之后在每次掃描時腫瘤生長(無益處或反應)，或持續(xù)<6個月的暫時臨床益處或反應(最小益處)(代表性掃描，圖1A-1C和圖9A-9C)。

為了確定來自CTLA-4阻斷劑的反應的遺傳景觀，我們使用全外顯子組測序分析了腫瘤和匹配血液DNA。在發(fā)現(xiàn)組中，我們產(chǎn)生6.4GB的映射序列，其中超過90％的目標序列覆蓋至至少10倍深度并且平均外顯子組覆蓋率為103倍(圖5)。驗證組的結(jié)果描繪于圖15中。樣品之中的寬范圍突變負擔(圖2A和圖2B)和頻發(fā)突變和驅(qū)動突變(圖6A和圖6C)與文獻一致。^30-34

在發(fā)現(xiàn)組和驗證組中，存在類似的轉(zhuǎn)換與顛換比率(圖2C、圖2I)、以及突變類型和核苷酸變化(圖2D以及圖6B和圖6D)。¹⁹在整個得到益處的響應者或患者中沒有基因被普遍突變。在每個組中觀察到已知的、頻發(fā)的黑色素瘤驅(qū)動基因中的突變(圖7A和圖7B)，并且在具有驅(qū)動突變多樣性的黑色素瘤中看到反應。³⁵

實施例2.與治療功效相關聯(lián)的體細胞新表位

本實施例證實了體細胞新表位與使用免疫檢查點調(diào)節(jié)劑的治療功效相關聯(lián)，并且此外定義了與對特定示例性調(diào)節(jié)劑(即，伊匹單抗)的反應相關的新表位標記。

突變負擔與臨床益處相關，但單獨不足以預測結(jié)果

我們假設，轉(zhuǎn)移性黑素瘤樣品中的突變負擔增加可與對CTLA-4阻斷(例如，對使用諸如伊匹單抗、替西木單抗等的試劑的治療)的反應相關。在發(fā)現(xiàn)組中，在從CTLA-4阻斷劑中具有長期臨床益處(LB)的患者與具有最小臨床益處或無臨床益處(NB)的患者之間存在突變負荷的顯著差異(圖2B，曼惠特尼檢驗，p＝0.013)，并且在驗證組中也存在顯著差異(圖7C和圖7D，曼惠特尼檢驗，p＝0.009)。在發(fā)現(xiàn)組中，突變負荷與改進的總存活率相關(圖2E，對數(shù)秩檢驗，p＝0.041)，并且在驗證組中，趨向于改進的存活率(圖2E和圖2H)。后面的組包括從以另外的方式實現(xiàn)全身性疾病控制的患者中切除的八個未響應腫瘤，這可混淆突變負荷與存活率之間的關系。另外的細分成四個臨床范圍表明了發(fā)現(xiàn)組中的劑量-反應(圖7E)。這些數(shù)據(jù)表明高突變負荷與來自CTLA-4阻斷劑(例如，伊匹單抗)的臨床益處相關，但單獨不足以賦予臨床反應，因為存在不響應的具有高突變負擔的腫瘤。

響應的腫瘤共同的體細胞新表位與抗CTLA-4功效相關聯(lián)

伊匹單抗活性需要MHC I類呈遞和細胞毒性T細胞識別。¹⁵因為單獨突變負荷不能解釋對伊匹單抗的臨床反應，我們假設特定腫瘤新抗原的存在可能解釋改變的治療反應。為了鑒定此類新表位，結(jié)合MHC I類結(jié)合預測、T細胞受體結(jié)合建模、患者特異性HLA類型以及表位同源性分析開發(fā)了現(xiàn)有技術生物信息流程(圖8和方法)。

由MHC I類進行的腫瘤抗原呈遞是由T細胞進行的識別的關鍵。^36,37我們創(chuàng)建了計算機算法來將所有非同義錯義突變翻譯成突變型肽和野生型肽(NASeek，方法和圖8)。我們使用患者特異性HLA類型，檢查了體細胞新表位子集將是否改變肽-MHC結(jié)合的強度。我們首先比較了所有突變型肽與野生型肽的總抗原性趨勢。有趣的是，總的來說預測突變型肽比對應的野生型肽以更高的親和力結(jié)合MHC I類(圖10A和圖10B，圖10F和圖10G)。

使用預測結(jié)合至MHC I類的僅有肽串(IC50≤500nM)，我們搜索了集中在四肽上的由多種腫瘤共享的保守性氨基酸段。這些被用于建模基因組系統(tǒng)發(fā)生中，因為它們相對不頻繁地發(fā)生在蛋白質(zhì)中并且通常反映功能。³⁸我們使用標準機器學習、等級聚類以及標記衍生方法來鑒定共有序列。我們鑒定了許多由響應者共享的，但在未響應者中完全不存在的四肽序列。(圖3A和圖3B)。在最近公開的里程碑論文中，顯示短氨基酸子串在由T細胞受體(TCR)識別的抗原上包含保守區(qū)。³⁹通過共有四肽驅(qū)動表位的TCR識別，并且交叉反應的TCR表位內(nèi)的四肽是必需的并且足以驅(qū)動抗原性和T細胞增殖。這有力證明了這種多肽長度足以驅(qū)動由TCR進行的識別。^40-42

四肽可形成由MHC I類分子呈遞至T細胞的九肽的核心，或可被橫向定位。⁴³四肽被用于建?；蚪M系統(tǒng)發(fā)生中，因為它們相對不頻繁地發(fā)生在蛋白質(zhì)中并且通常反映功能。我們使用發(fā)現(xiàn)組來從候選新表位中產(chǎn)生預測性標記。每個組共同的四肽(候選新表位)包括在發(fā)現(xiàn)組中具有臨床益處的101個排他共享的患者之中。在驗證組中也獨立地觀察到這個結(jié)果(圖3A、圖3B、圖3E和圖3F以及圖12)。這個組定義了與來自CTLA-4阻斷(例如，通過伊匹單抗)的益處相關的新表位標記(圖3A和圖3B，紅線)，這是高度統(tǒng)計學顯著的(p<0.001，費歇爾精確檢驗)。

重要地，共享的四肽新表位并非簡單地由更高的突變負荷產(chǎn)生。例如，在發(fā)現(xiàn)組中，具有最大突變數(shù)的NB患者(未響應者)(具有1028個突變的SD7357)不共享任何四肽標記(圖3A)。這個觀點再次在驗證組中進行了說明，其中甚至具有大于1000個突變的腫瘤(NR9521和NR4631)不能響應(圖3B和圖7C)。使用五種不同模型的模擬測試證實了我們的標記是高度統(tǒng)計學顯著的，并且不可能單獨由偶然得到(對于方法a-d，p<0.001并且對于方法e，p+0.002)(圖12)。高突變負荷看起來增加了可能性，但不保證形成與益處相關聯(lián)的新表位。共有分析揭示新表位不是隨機的。在受益組中構成四肽的氨基酸頻率與在未受益組中觀察到的那些不同(圖10C、圖10D、圖10I和圖10J)。

來源于發(fā)現(xiàn)組的新表位標記與驗證組中的存活率強烈相關(圖3C和圖3D，p<0.0001)，并且在區(qū)分結(jié)果方面比突變負荷更有效(圖2D、圖2B、圖2E、圖2H)。我們分析了使用伊匹單抗治療的一個獨立群組的黑色素瘤患者(n＝15)，對于所述患者我們得到組織和匹配血液并且在這個獨立組中驗證了標記(圖3D)。

這些四肽由整個基因組中的多樣基因中的突變編碼(圖4A、圖14、圖19以及表4)。使用來自The Cancer Genome Atlas(TCGA)的RNASeq數(shù)據(jù)，我們證實了具有我們體細胞新表位的基因被廣泛地表達在黑色素瘤中。在一些情況下，由體細胞突變引起的氨基酸變化導致四肽其自身的變化。在其他情況下，如所述的，突變氨基酸獨立于四肽和改變的MHC結(jié)合。^38,40,44-46

另外，使用免疫表位數(shù)據(jù)庫(IEDB)分析了每個臨床組共同的候選新表位。這是實驗驗證、公開并且精選的抗原的最全面數(shù)據(jù)庫，并且被用來開發(fā)算法以便以高準確度鑒定抗原。²³我們發(fā)現(xiàn)，相比于其他臨床組，受益者共同的候選新表位對應于多更多的IEDB中的病毒抗原和細菌抗原(圖10E、圖10K)。

表4：反應標記中四肽的背景、基因以及基因座

4聚體＝常見四肽氨基酸序列。Mut＝突變位置。WTSeq＝預測的野生型9氨基酸肽。MTSeq＝預測的突變型9氨基酸肽。

例如，表5和圖21中呈現(xiàn)的分析證實了四肽子串ESSA由受益組中的患者共享(還參見圖4F)并且對應于人巨細胞病毒立即早期表位(MESSAKRKMDPDNPD)。另外，四肽子串LLKK可由LB組中的患者共享；這個子串對應于剛地弓形蟲顆?？乖木_抗原性部分(RSFKDLLKK，圖4B)。^47,48這些數(shù)據(jù)表明具有來自CTLA-4阻斷的強臨床益處的患者(例如，具有對伊匹單抗和替西木單抗的強反應的患者)中的新表位可類似于來自T細胞適合識別的病原體的表位。

使用全外顯子組測序方法，我們表征了整個預測的抗原肽空間(參見方法)。如我們研究所進一步驗證，我們“重新發(fā)現(xiàn)”了由T細胞識別的黑色素瘤抗原(MART-1，又稱為MelanA)，一種實驗驗證的黑色素細胞抗原(圖10F)。^37,49-51EKLS由完全和長期響應者共享，構成MART-1MHC II類表位的核心氨基酸，并且磷酸絲氨酸部分對于T細胞受體(TCR)識別是關鍵的。^51,52

表5.樣品部位、大小以及類型

實施例3.免疫原性肽的體外分析

本實施例證實了免疫原性肽的體外驗證。

即使在專家手中，將下一代測序變換成肽預測的體外驗證也被證明是具有挑戰(zhàn)性的，其中公開的驗證率很低。²⁴體外測定受到以下阻礙：患者材料缺乏、保存細胞對冷凍/解凍過程的敏感性、患者材料內(nèi)抗新抗原T細胞的頻率低以及在不存在復雜體內(nèi)免疫原性微環(huán)境的情況下T細胞體外的敏感性非常低。

我們的系統(tǒng)嘗試通過整合多種高通量方法來優(yōu)化預測(圖8)?；谖覀兊念A測算法，我們產(chǎn)生了肽庫并且對于我們得到足夠淋巴細胞的患者進行了T細胞活化測定(參見方法)。對于5個患者中的3個，觀察到陽性庫(圖11A-11C)。我們對于具有適當外周血單核細胞(PBMC)的患者鑒定了精確的肽。與其野生型對應部分TKSPFEQHI相比，我們通過患者CR9306發(fā)現(xiàn)對肽TESPFEQHI的多功能T細胞應答(圖4C)。在開始治療之后60周，這個應答達到頂峰(圖4D)。在健康供體中不存在T細胞應答(圖13)。與對于TKSPFEQHI的18323nM相比，這種肽對于B4402具有472nM的預測MHC I類親和力。ESPF為存在于反應標記中的常見四肽，并且為丁型肝炎病毒大Δ表位p27(PESPFA和ESPFAR)的子串(位置176-179)。^53,54TESPFEQHI由FAM3C(c.A577G；p.K193E)中的突變引起，一種在黑色素瘤中高度表達的基因。

我們還發(fā)現(xiàn)，與野生型GLERGGFTF相比，肽GLEREGFTF在患者CR0095中引發(fā)多功能T細胞應答(圖4E和圖11D)。在治療后24周，這個應答達到頂峰(圖4E)。GLEREGFTF由CSMD1(c.G10337A；p.G3446E)中的突變產(chǎn)生，其也在黑色素瘤中高度表達并且與已知類鼻疽桿菌抗原(IEDB參考ID:1027043)具有80％同源性。重要地，T細胞活化的缺乏可以不排除給定新抗原，因為體外測定全部限于如上所述的敏感性。

實施例4.用于實施例1-3的材料和方法

本實施例提供了在實施例1-3中用于本文提出的工作的詳細材料和方法。

我們從使用伊匹單抗治療的黑色素瘤患者中獲得腫瘤組織。這些樣品來自經(jīng)歷長期益處(LB)或最小益處/無益處(NB)的經(jīng)過伊匹單抗治療的患者。對這些腫瘤和匹配正常血液進行全外顯子組測序。鑒定并且表征了體細胞突變和從這些突變中產(chǎn)生的候選體細胞新抗原。

患者數(shù)據(jù)

通過兩個研究人員獨立地查看圖表來分配臨床亞組和對于發(fā)現(xiàn)組和驗證組的其他參數(shù)。將總存活率計算為死亡或責難日與抗CTLA4療法(在發(fā)現(xiàn)組中為伊匹單抗或在驗證組中為伊匹單抗或替西木單抗)的第一劑量之間的差異。發(fā)現(xiàn)組中的所有患者都具有階段IV黑色素瘤并且在2006與2012年之間被治療；在2007與2012年之間收集樣品。驗證組中的患者在2006至2013年被治療；并且在2005與2013年之間收集樣品。使用商用伊匹單抗(Yervoy)或臨床試驗治療患者，包括NCT00796991、NCT00495066、NCT00920907、NCT00324155、NCT00162123、NCT0140045、NCT00289640；NCT00495066、NCT00636168、NCT01515189、NCT00086489以及NCT00471887?；颊咭?或10mg/kg接受伊匹單抗的不同劑量和方案，并且2個患者使用達卡巴嗪或維羅非尼共同治療(參見圖17)。驗證組中的四個患者使用10mg/kgx6劑量(1個患者)或15mg/kgx4劑量(3個患者)下的替西木單抗治療。這4個患者中有3個具有階段IIIC疾病；所包括的所有其他患者具有階段M1a-c。包括具有分離自冷凍組織以用于分析的DNA的患者，患者接受至少2次劑量的伊匹單抗并且在第一次治療之后至少12周時具有一種放射照相評估。LB組中的兩個患者具有被切除的分離的病灶，以便使他們稱為無疾病的。在訓練組中對一種進展的病灶(CR7623)進行測序。在驗證組中，8種腫瘤代表來自以另外的方式具有長期益處的患者的未響應病灶。這些包括CRNR4941、LSDNR1650、CRNR2472、LSDNR1120、CRNR0244、LSDNR9298、LSDNR3086以及PR03803。進展的所有腫瘤都作為“無益處”腫瘤經(jīng)歷分子分析。

在研究中產(chǎn)生的患者數(shù)據(jù)被組裝成一系列表格，所述表格詳細描述了以下內(nèi)容：驗證組中的患者的臨床特征；發(fā)現(xiàn)組中的患者的詳細臨床特征；發(fā)現(xiàn)組突變列表；對于由突變產(chǎn)生的預測的肽通過NetMHCv3.4具有小于500nm的結(jié)合親和力的基因座；用于標記的TCGA RNASeq；對于反應標記中的四肽的背景、基因以及基因座；驗證組突變列表；發(fā)現(xiàn)組和驗證組的HLA類型；以及樣品部位、大小以及類型。

DNA分離和全外顯子組測序

使用每種批準的機構審查委員會(IRB)方案的書面知情同意書來獲得原發(fā)性腫瘤樣品和匹配正常樣本(外周血)。所有樣本都是清楚可見病灶的切除活檢物或切除物。所有樣品都含有高腫瘤細胞性質(zhì)。在外科手術切除或活檢之后將樣本急速冷凍在液氮中，并且在-80℃下儲存。制備用蘇木精和曙紅染色的節(jié)段，并且通過皮膚病學者來證實診斷。使用QIAamp DNA微型試劑盒和QIAamp DNA血液微型試劑盒(Qiagen)來提取DNA。

使用SureSelect Human All Exon 50MB試劑盒(Agilent)進行外顯子捕獲。在HiSeq 2000平臺(Illumina)上對富集的外顯子組文庫進行測序至>100X覆蓋率(MSKCC Genomics Core and Broad Institute,Cambridge,MA)。進行比對、基本質(zhì)量分數(shù)重新校準以及重復讀取除去，排除種系變體、注釋突變并且如先前所述評價插入/缺失(圖9A)。⁷⁰排除具有腫瘤覆蓋率≤10X的樣品。使用整合基因組學查看器(IGV)v2.1手動查看中值置信度讀取(11-34X)。⁷¹對于候選突變的測序的驗證率為10X及以上覆蓋率的97％。⁷⁰使用費歇爾檢驗來比較臨床組之間的中值突變數(shù)。

通過RSEM和對于表達所述基因的腫瘤所計算的平均表達來歸一化TCGA RNASeq基因表達(參見圖18)。

HLA分型

在MSKCC HLA分型實驗室或紐約血液中心中，通過低至中間分辨率聚合酶鏈式反應-序列特異性引物(PCR-SSP)方法或通過高分辨率基于SeCore HLA序列的分型方法(HLA-SBT)(Invitrogen)來進行HLA分型。ATHLATES(http://www.braodinstitute.org/scientific-community/science/projects/viral-genomics/athlates)⁷²也用于HLA分型和確認。

免疫原性分析

創(chuàng)建了稱為NAseek的生物信息工具。這個程序執(zhí)行兩個功能：翻譯每個突變周圍的段以及比較所得的肽之間的同源性。首先，NAseek翻譯外顯子組中的所有突變，所以對于預測的野生型和突變型產(chǎn)生17個氨基酸的串，其中氨基酸由位于中心的突變產(chǎn)生。為了評價MHC I類結(jié)合，使用滑動窗口方法將含有完全響應者共同的四肽的野生型和突變型九聚體輸入到患者特異性HLA類型的NetMHC v3.4(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/)或RANK PEP(http://imed.med.ucm.es/Tools/rankpep.html)中。我們使用了滑動窗口方法以及九肽中的改變的氨基酸的位置。這些程序得到預測的MHC I類結(jié)合強度。然后對于彼此的相似性評估預測為由患者特異性MHC I類呈遞的九聚體。使用具有缺省參數(shù)的Weblogo(http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi)執(zhí)行氨基酸頻率的對數(shù)作圖。字母的高度反映在所述位置處的對應氨基酸的相對頻率。為了進一步縮小用于體外測試的預測的九聚體，還使用具有患者特異性HLA類型的IEDB免疫原性預測物評價了九聚體對T細胞受體的假定結(jié)合(http://tools.immuneepitope.org/immunogenicity/)或CTLPred(http://www.imtech.res.in/raghava/ctlpred/)。

為了評價T細胞活化和對已知病原體的抗原的同源性，使用免疫表位數(shù)據(jù)庫(www.iedb.org)來分析保守性四肽并且對于智人宿主中的陽性T細胞應答被評估為數(shù)據(jù)庫中免疫原的子串。我們排除了不具有預測的T細胞應答或排他性地抗自身或變應原性質(zhì)的肽。從含有具有長期益處的患者共同的肽的九聚體中產(chǎn)生“新抗原標記”(參見表4和圖19)。相對于NB組，對于LB組進行共享四肽的總數(shù)的卡方檢驗。使用非監(jiān)督的等級聚類接著是邏輯回歸的標準標記衍生方法被用于確定僅基于發(fā)現(xiàn)組數(shù)據(jù)的預測模型。模型基于所有四肽必須在發(fā)現(xiàn)組中存在至少兩次的核心規(guī)則，并且存在小于三次的任何四肽必須包含在體外示出引發(fā)T細胞應答的已知抗原的共同子串。然后將最佳擬合標記應用至驗證組。

我們進行了嚴格的模擬/排列測試來證實新抗原標記高度不可能由偶然產(chǎn)生。為了評估所發(fā)現(xiàn)的標記是由于偶然產(chǎn)生的無效假設，評價了5個相異的模擬模型，三個模型具有新數(shù)據(jù)集并且兩個模型使用我們數(shù)據(jù)集的排列。使用以下來執(zhí)行模擬：(a)從SwissProt數(shù)據(jù)庫中抽取的九聚體、(b)來自TCGA黑色素瘤數(shù)據(jù)集的突變、(c)隨機產(chǎn)生的九聚體、(d)在我們數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)的突變的重新分布以及(e)預測為在我們數(shù)據(jù)集中呈現(xiàn)的每種九聚體內(nèi)的9個氨基酸的重新排序。在每個模擬中，隨機分布九聚體，并且與我們的數(shù)據(jù)成比例(例如，如果實際樣品具有預測為結(jié)合MHC I類的150個九聚體，則“虛擬”樣品被分配150個九聚體)。然后通過應用在應用至這個虛擬數(shù)據(jù)集的實際數(shù)據(jù)上使用的相同迭代模型，并且重復這個過程1,000次、記錄大于實際標記的標記頻率以確定p值來進行模擬測試。P值被計算為具有正確分類的臨床群組分離的更大標記的迭代除以1,000次迭代的比例。

細胞內(nèi)細胞因子染色(ICS)

在IRB批準的機構協(xié)議下，在多個時間點下收集來自5個使用伊匹單抗治療的黑色素瘤患者的外周血單核細胞(PBMC)。合成從全外顯子組/轉(zhuǎn)錄物組分析中鑒定的對于這些患者的候選新抗原肽(GenScript Piscataway,NJ)。將2.5x10⁶個患者PBMC樣品與2.5x10⁶個輻照的自體PBMC加上30至50個肽的庫一起培養(yǎng)，每個庫處于補充有細胞因子IL-15(10ng/ml)和IL-2(10IU/ml)的10％人血清庫(PHS)RPMI 1640培養(yǎng)基中。每隔一天置換培養(yǎng)基并且在第10天收獲細胞。⁷³在布雷菲德菌素A和莫能菌素(BD Bioscience)存在下，通過添加新抗原肽來重新刺激細胞持續(xù)6小時。然后使用以下抗體對細胞進行染色：Pacific Blue-CD3(克隆OKT3)、APC-AF750-CD8(克隆SK1,eBioscience)以及ECD-CD4(克隆SFC12T4D11,Beckman Coulter)。在后續(xù)洗滌和透化時，使用以下抗體對細胞進行染色：PE-Cy5-CD107a(克隆H4A3)、APC-IL-2(克隆MQ1-17H12)、PE-MIP-1β(克隆D21-1351)、FITC-IFN-γ(克隆B27)(BD Pharmingen)以及PE-Cy7-TNF-α(克隆MAB11eBioscience)。使用CYAN流式細胞分析儀和Summit軟件(Dako Cytomation California Inc.,Carpinteria,CA)來獲取數(shù)據(jù)。使用FlowJo軟件v9.7.5(TreeStar,Inc.)來進行流式分析。當可行時，將相對于無刺激對照而引起誘導細胞因子應答的庫去卷積成其組分單個肽。對于單個肽重復以上過程并且與對應預測的野生型九聚體進行比較。葡萄球菌腸毒素B(SEB)充當T細胞應答的陽性對照。

免疫組織化學

使用Aperio載片掃描儀掃描免疫組織化學的和蘇木精與曙紅染色的載片。在鑒定包含在載片商的所有壞死區(qū)域之后，使用Aperio成像軟件確定腫瘤壞死百分比。使用對于每種情況手動校準和驗證的Aperio圖像分析算法(細胞核和細胞質(zhì)v9)，由皮膚病學者在不知情的情況下定量免疫染色的載片。對代表三個代表區(qū)總和的每種情況最小3000個細胞進行計數(shù)，其中結(jié)果被報道為使用限于腫瘤區(qū)域的計數(shù)所計數(shù)的免疫染色陽性細胞/總細胞。使用以下抗體對節(jié)段進行染色：LCA(1ng/μl,DAKO,克隆2B11+PD7/26)、CD8(0.5ng/μl,DAKO,克隆C8/144B)以及Foxp3(2.5ng/μl,Abcam,克隆236A/E7)。

統(tǒng)計方法

使用曼-惠特尼檢驗來比較臨床組(分別為發(fā)現(xiàn)組和驗證組中的LB和NB)之間的非同義外顯子突變負擔。使用對數(shù)秩檢驗來比較發(fā)現(xiàn)組和驗證組中總存活率的Kaplan-Meier曲線。如上所述，在以下無效假設的情況下使用模擬測試：所有四肽等同地有助于臨床益處以便確定我們發(fā)現(xiàn)的大小的標記是否由偶然發(fā)生。

實施例5.使用伊匹單抗治療

本實施例提供了使用抗體免疫療法(伊匹單抗)治療癌癥(黑色素瘤)的說明書，如由美國食品及藥物管理局對于轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的治療所批準。在一些實施方案中，在伊匹單抗治療之后觀察到長期臨床益處。根據(jù)本發(fā)明，在本實施例中列出的方案在一些實施方案中可被希望地施用至一個或多個被鑒定為具有體細胞突變的受試者。

YERVOY^TM(伊匹單抗)注射液，靜脈內(nèi)輸注初始美國批準：2011

警告：免疫介導的不良反應

參見完整盒裝警告的全部處方信息。

YERVOY可由于T細胞活化和增殖而導致嚴重和致命的免疫介導的不良反應。這些免疫介導的反應可涉及任何器官系統(tǒng)；然而，最常見的嚴重免疫介導的不良反應為小腸結(jié)腸炎、肝炎、皮炎(包括毒性表皮壞死溶解)、神經(jīng)病以及內(nèi)分泌病。大部分這些免疫介導的反應最初在治療過程中表現(xiàn)；然而，小部分在施用YERVOY的幾周至幾個月后發(fā)生。

對于嚴重的免疫介導的反應永久停止YERVOY并且開始全身性高劑量皮質(zhì)類固醇療法。(2.2)

對于小腸結(jié)腸炎、皮炎、神經(jīng)病以及內(nèi)分泌病的體征和癥狀評估患者并且評價臨床化學性質(zhì)，包括在基線時和在每次劑量前的肝臟功能測試和甲狀腺功能測試。(5.1,5.2,5.3,5.4,5.5)

---------------------------適應癥和用法---------------------------

YERVOY為指定用于治療不可切除或轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的人細胞毒性T淋巴細胞抗原4(CTLA-4)阻斷抗體。(1)

------------------------劑量和施用-------------------------------

每3周經(jīng)過90分鐘靜脈內(nèi)施用YERVOY 3mg/kg，持續(xù)總共四次劑量。(2.1)

對于嚴重的不良反應永久停止。(2.2)

全部處方信息

警告：免疫介導的不良反應

YERVOY可由于T細胞活化和增殖而導致嚴重和致命的免疫介導的不良反應。這些免疫介導的反應可涉及任何器官系統(tǒng)；然而，最常見的嚴重免疫介導的不良反應為小腸結(jié)腸炎、肝炎、皮炎(包括毒性表皮壞死溶解)、神經(jīng)病以及內(nèi)分泌病。大部分這些免疫介導的反應最初在治療過程中表現(xiàn)；然而，小部分在施用YERVOY的幾周至幾個月后發(fā)生。

對于嚴重的免疫介導的反應永久停止YERVOY并且開始全身性高劑量皮質(zhì)類固醇療法。[參見劑量和施用(2.2)]

對于小腸結(jié)腸炎、皮炎、神經(jīng)病以及內(nèi)分泌病的體征和癥狀評估患者并且評價臨床化學性質(zhì)，包括在基線時和在每次劑量前的肝臟功能測試和甲狀腺功能測試。[參見警告和預防措施(5.1,5.2,5.3,5.4,5.5)]

1適應癥和用法

YERVOY(伊匹單抗)被指定用于治療不可切除或轉(zhuǎn)移性黑色素瘤。

2劑量和施用

2.1推薦給藥

YERVOY的推薦劑量為每3周經(jīng)過90分鐘靜脈內(nèi)施用的3mg/kg，持續(xù)總共四次劑量。

2.2推薦劑量變更

對于任何中等的免疫介導的不良反應或?qū)τ诎Y狀性內(nèi)分泌病拒絕安排劑量的YERVOY。對于全部或部分解決不良反應(等級0-1)的患者以及每天接受小于7.5mg強的松或等效物的患者，每3周以3mg/kg的劑量恢復YERVOY直到施用所有4個計劃的劑量或從第一次劑量開始16周為止，無論哪個先發(fā)生。

對于任何以下情況，永久停止YERVOY：

·持續(xù)的中等不良反應或不能將皮質(zhì)類固醇劑量降低至每天7.5mg強的松或等效物。

·在從第一次劑量施用開始16周內(nèi)不能完成全部的療程。

·嚴重或威脅生命的不良反應，包括任何以下情況：

具有腹痛、發(fā)熱、腸梗阻或腹膜體征的結(jié)腸炎；解便頻率增加(在基線上7次或更多次)、糞便失禁、大于24小時的靜脈內(nèi)補水需要、胃腸道出血以及胃腸道穿孔

天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)或丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)>5倍正常值上限或總膽紅素>3倍正常值上限

斯-約二氏綜合癥、毒性表皮壞死溶解、或由全厚度皮膚潰瘍并發(fā)的皮疹、或壞死性、大皰性或出血性表現(xiàn)

嚴重的運動和感覺神經(jīng)病、格-巴綜合癥或重癥肌無力

涉及任何器官系統(tǒng)的嚴重的免疫介導的反應(例如，腎炎、肺炎、胰腺炎、非感染性心肌炎)

對局部免疫抑制療法沒有反應的免疫介導的眼病

2.3制備和施用

·不要搖晃產(chǎn)品。

·在施用前對于顆粒物和變色視覺上檢查胃腸外藥物產(chǎn)品。丟棄如果溶液為渾濁的、存在明顯變色(溶液可能具有淺黃色)或存在除了半透明接近白的無定形顆粒以外的外來顆粒物的小瓶。

溶液的制備

·在制備輸注液之前允許小瓶在室溫下靜置約5分鐘。

·取出需要體積的YERVOY并且轉(zhuǎn)移到靜脈內(nèi)袋中。

·使用0.9％氯化鈉注射液USP或5％葡萄糖注射液USP進行稀釋來制備具有在1mg/mL至2mg/mL范圍內(nèi)最終濃度的稀釋溶液。通過輕微倒置來混合稀釋溶液。

·在冷藏(2℃至8℃，36℉至46℉)下或在室溫(20℃至25℃，68℉至77℉)下，儲存稀釋溶液不大于24小時。

·丟棄YERVOY的部分使用過的小瓶或空小瓶。

施用說明書

·不要將YERVOY與其他醫(yī)藥產(chǎn)品混合或作為具有其他醫(yī)藥產(chǎn)品的輸注液施用。

·在每次劑量之后，使用0.9％氯化鈉注射液USP或0.5％葡萄糖注射液USP沖洗靜脈管線。

·通過含有無菌、無熱原、低蛋白質(zhì)結(jié)合在線過濾器的靜脈管線，在90分鐘內(nèi)施用稀釋溶液。

3劑型和優(yōu)勢

50mg/10mL(5mg/mL)。200mg/40mL(5mg/mL)。

4禁忌癥

無。

5警告和預防措施

YERVOY可由于T細胞活化和增殖而導致嚴重和致命的免疫介導的反應。

等同性

應理解，雖然本發(fā)明已結(jié)合其發(fā)明詳述進行了描述，但以上描述意圖說明且并非限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍是由所附權利要求書來限定。其他方面、優(yōu)勢和改進在以下權利要求書范圍內(nèi)。

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